WO2024123061A1 - 자궁내막증 진단용 조성물 - Google Patents

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WO2024123061A1
WO2024123061A1 PCT/KR2023/019949 KR2023019949W WO2024123061A1 WO 2024123061 A1 WO2024123061 A1 WO 2024123061A1 KR 2023019949 W KR2023019949 W KR 2023019949W WO 2024123061 A1 WO2024123061 A1 WO 2024123061A1
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WO
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mir
mirna
endometriosis
clause
expression
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Application number
PCT/KR2023/019949
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English (en)
French (fr)
Inventor
조시현
임우석
이재훈
이인하
김세희
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for diagnosing endometriosis comprising as an active ingredient an agent that measures the level of miRNA.
  • Endometriosis is a disease that occurs when endometrial tissue, which should be inside the uterus, flows back through the fallopian tubes and implants in the pelvic cavity outside the uterus. It is a disease that occurs in about 10 to 15% of women of childbearing age. The main symptoms include severe menstrual pain and lower abdomen pain, and in particular, 30 to 50% of endometriosis patients suffer from infertility.
  • the cause of infertility in patients with endometriosis has not yet been clearly identified, but the lesions show chronic bleeding and an inflammatory response, and the inflammation stimulates the nerve endings in the pelvis, causing pain, the function of the fallopian tubes, the implantation function of the endometrium, and the ovum. It is reported that it affects the development process of the embryo and causes infertility.
  • Korea is the only country in the world with an ultra-low birth rate of 0.98, which is below 1.0 in 2018, and the very foundation of the country's existence is under threat.
  • the number of infertile people increased by an average of 3.1% per year from 148,892 in 2006 to 208,703 in 2017.
  • the domestic infertility rate was 13.2% (2015), which is very high compared to major developed countries such as the US 6.7%, the UK 8.6%, and Germany 8.0%.
  • the number of endometriosis patients also increased by 31.5% over 4 years from 84,583 in 2013 to 111,214 in 2017 during the same period, it can be assumed that infertility due to endometriosis is related to the birth rate.
  • endometriosis treatment can alleviate symptoms and prevent long-term recurrence through pharmacological treatment, thereby maintaining fertility in women of childbearing age and reducing the morbidity rate of infertility.
  • endometriosis Because there is no early diagnosis method for endometriosis, most patients take several years from the onset of initial symptoms to diagnosis, and the disease progresses to a severe condition, ultimately leading to surgical diagnosis and treatment. Surgical treatment in severe cases carries the risk of loss of fertility in women of childbearing age because there is a possibility of decreasing ovarian function after surgery. Additionally, accurate diagnosis in the early stages is essential for successful treatment of endometriosis.
  • the serum CA-125 test one of the existing diagnostic methods, has elevated serum CA-125 in some women with endometriosis, but it is not specific and has limitations such as low sensitivity and specificity. As such, the technology to accurately diagnose early-stage endometriosis is insufficient.
  • the present invention has made research efforts to overcome the limitations of conventional diagnosis and treatment, which make it difficult to effectively diagnose endometriosis.
  • differences in the expression of miRNAs in exosomes were discovered in endometrial cells isolated from healthy controls and endometriosis patients. Therefore, the present invention is expected to be widely used as a reliable diagnosis or new treatment for endometriosis by utilizing differences in the expression of miRNAs in exosomes.
  • the present inventors have made extensive research efforts to overcome the limitations of conventional diagnosis and treatment of endometriosis. As a result, while searching for new diagnostic targets in endometrial cells isolated from healthy controls and endometriosis patients, differences in the expression of miRNAs in exosomes were discovered, leading to the completion of the present invention.
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for diagnosing endometriosis containing as an active ingredient an agent that measures the level of miRNA.
  • the present invention is a composition for diagnosing endometriosis comprising as an active ingredient an agent for measuring the level of miRNA, wherein the miRNA is mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307- 5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587,
  • a composition for diagnosing endometriosis which is at least one selected from the group consisting of mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, and mir-639.
  • the present study made research efforts to overcome the difficulties in diagnosis and limitations in treatment of endometriosis. As a result, while searching for new diagnostic targets in endometrial cells isolated from healthy controls and endometriosis patients, differences in the expression of miRNAs in exosomes were confirmed. The present invention was completed by confirming that the expression of miRNA in exosomes isolated from endometriosis patients was significantly increased or decreased compared to healthy controls.
  • the miRNA is mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a- Consisting of 5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, and mir-639
  • the agent for measuring the level of the miRNA includes an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the miRNA; compound; Or a composition characterized in that it is an aptamer.
  • antibody refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction.
  • antibody refers to an antibody that specifically binds to a regulatory T cell specific protein or an extracellular domain thereof.
  • the antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.
  • the antibody can be easily produced using techniques well known in the art.
  • polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art, which include injecting the antigen of the biomarker protein into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody.
  • polyclonal antibodies can be produced from any animal, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cows, dogs, etc. Additionally, monoclonal antibodies can be produced using hybridoma methods or phage antibody library technology well known in the art. Antibodies prepared by the above method can be separated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. Additionally, the antibodies of the invention include intact forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of the antibody molecule.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment that possesses at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2, and Fv.
  • antigen-binding fragment refers to a fragment that possesses an antigen-binding function
  • examples of antigen-binding fragments include (i) the variable region (VL) of the light chain, the variable region (VH) of the heavy chain, and the constant region of the light chain.
  • Fab fragment consisting of (CL) and the first constant region of the heavy chain (CH1);
  • Fd fragment consisting of VH and CH1 domains;
  • an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single antibody;
  • dAb fragment consisting of VH domain;
  • isolated CDR regions F(ab')2 fragment, a bivalent fragment containing two linked Fab fragments;
  • scFv single-chain Fv molecule in which the VH domain and the VL domain are joined by a peptide linker to form an antigen binding site;
  • bispecific single-chain Fv dimers and diabodies, which are multivalent or multispecific fragments produced by gene fusion.
  • the antigen-binding fragment can be obtained as a Fab or F(ab')2 fragment using a proteolytic enzyme, for example, papain or pepsin, and can be produced through genetic recombination technology.
  • the antibodies of the present invention include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, bivalent and bispecific molecules, and minibodies. , domain antibodies, bispecific antibodies, antibody mimetics, unibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, or fragments thereof, but are limited thereto. That is not the case.
  • “monoclonal antibody” refers to an antibody molecule with a single molecular composition obtained from a substantially identical antibody population, and exhibits a single binding specificity and affinity for a specific epitope.
  • a “chimeric antibody” is an antibody in which the variable region of a mouse antibody and the constant region of a human antibody are recombined, and the immune response is greatly improved compared to a mouse antibody.
  • humanized antibody refers to an antibody in which the protein sequence of an antibody derived from a non-human species has been modified to be similar to an antibody variant naturally produced in humans.
  • the humanized antibody can be manufactured by recombining mouse-derived CDRs with FRs derived from a human antibody to prepare a humanized variable region, and then recombining this with the constant region of a desired human antibody.
  • binding refers to the affinity of the antibody or antibody composition for the antigen.
  • “specific binding” is typically separated from non-specific background binding when the dissociation constant (Kd) is less than 1 ⁇ 10 -5 M or less than 1 ⁇ 10 -6 M or less than 1 ⁇ 10 -7 M. can be distinguished.
  • Kd dissociation constant
  • Specific binding can be detected by methods known in the art, such as ELISA, SPR (Surface plasmon resonance), immunoprecipitation, coprecipitation, etc., and non-specific binding and specific binding can be distinguished. Include an appropriate control group for differentiation.
  • the “antibody or antigen-binding fragment” of the present invention may exist as a multimer, such as a dimer, trimer, tetramer, or pentamer, containing at least part of the antigen-binding ability of a monomer. These multimers also include homomultimers and heteromultimers. Antibody multimers have superior antigen-binding ability compared to monomers because they contain multiple antigen-binding sites. Antibody multimers also facilitate the production of multifunctional (bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) antibodies.
  • “Aptamer” of the present invention refers to an oligonucleic acid or peptide molecule.
  • the present invention is a kit for diagnosing endometriosis comprising as an active ingredient an agent for measuring the level of miRNA, wherein the miRNA is mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307- 5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587,
  • a diagnostic kit for endometriosis which is at least one selected from the group consisting of mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, and mir-639.
  • the “kit” of the present invention may be an RT-PCR kit, DNA chip kit, ELISA kit, protein chip kit, rapid kit, or multiple reaction monitoring (MRM) kit, or may be integrated with feminine products. It is not limited to this.
  • the feminine products are used as a term encompassing not only sanitary products such as sanitary napkins, menstrual cups, and tampons, but also various products that may be in demand related to the female cycle, such as tissues, panty liners, and cleaners. This may include household goods, various test kits such as pregnancy testers and ovulation testers, etc.
  • the diagnostic kit may further include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for the analysis method.
  • the reverse transcription polymerase reaction kit contains a pair of primers specific for the gene encoding the marker protein.
  • the primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of the gene, and may have a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp. It may also include primers specific to the nucleic acid sequence of the control gene.
  • a DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and reagents, agents, enzymes, etc. for producing a fluorescent label probe.
  • the substrate may also include cDNA or oligonucleotides corresponding to control genes or fragments thereof.
  • the diagnostic kit may include essential elements needed to perform ELISA.
  • ELISA kits contain antibodies specific for these proteins.
  • Antibodies are antibodies that have high specificity and affinity for a marker protein and almost no cross-reactivity to other proteins, and may be monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies. Additionally, ELISA kits may include antibodies specific for control proteins.
  • Other ELISA kits include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g. conjugated with antibodies) and their substrates or those capable of binding to antibodies. It may contain other substances, etc.
  • the mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p From the group consisting of mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, and mir-639 It is a kit that additionally includes one or more selected items.
  • the present invention is a method of providing information necessary for diagnosing endometriosis, including the step of measuring the level of miRNA in a biological sample isolated from an individual, wherein the miRNA is mir-10b -5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir -515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, and mir-639.
  • a method is provided, which is at least one selected from the group consisting of.
  • biological sample refers to any sample containing cells expressing miRNA obtained from mammals, including humans, and includes tissues, organs, cells, or cell culture fluid. Examples include blood, tissue, urine, mucus, saliva, tears, plasma, serum, sputum, spinal fluid, pleural fluid, nipple aspirate, lymphatic fluid, airway fluid, serous fluid, urogenital fluid, breast milk, lymphatic fluid, semen, cerebrospinal fluid, and organ systems.
  • the biological sample may include pure isolated nucleic acid, crude isolated nucleic acid, cell lysate containing nucleic acid, or cell-free nucleic acid.
  • the miRNA is mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a- Consisting of 5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, and mir-639 It is a method that additionally includes one or more selected from the group.
  • the method is mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a- If the expression level of 5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, or mir-587 is expressed higher than that of the normal control group, the individual is diagnosed as having endometriosis. It is a thing, a method.
  • the method determines that the individual has endometriosis when the expression level of mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, or mir-639 is expressed lower than that of the normal control group. It is a method to diagnose something that exists.
  • the biological sample includes uterine-derived tissue, uterine-derived cells, or uterine-derived blood (menstrual blood, etc.).
  • the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating endometriosis comprising a miRNA inhibitor as an active ingredient, wherein the miRNA inhibitor is mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307 -5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, or mir- It is a pharmaceutical composition that is an inhibitor of miRNA selected from the group consisting of 587.
  • a pharmaceutical composition refers to a composition administered for a specific purpose.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used to inhibit inflammatory substances, and may include a composition for this purpose and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention contains 0.1 to 100% by weight of an active ingredient corresponding to the pharmaceutical composition of the present invention based on the total weight of the composition.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, and calcium silicate. , cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating endometriosis comprising a miRNA activator as an active ingredient, wherein the miRNA activator includes mir-1299, mir-29a-3p, and mir-5196.
  • a pharmaceutical composition that is an activator of a miRNA selected from the group consisting of -5p, or mir-639.
  • the present invention includes the steps of (a) confirming overexpression of miRNA in a biological sample isolated from an individual compared to the control group; (b) administering a candidate substance for treating endometriosis to the sample; (c) re-confirming miRNA expression in the sample; And, (d) determining that the candidate material is effective in treating endometriosis when the expression of the miRNA decreases; wherein the miRNA is mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-
  • a method is provided, which is at least one miRNA selected from the group consisting of 5p, mir-563, or mir-587.
  • test material used while referring to the screening method of the present invention refers to an unknown substance used in screening to test whether it affects the activity or expression level of miRNA by adding it to a sample containing cells expressing miRNA.
  • the test substances include, but are not limited to, compounds, nucleotides, peptides, and natural extracts.
  • the step of measuring the expression level or activity of miRNA in a biological sample treated with a test substance can be performed by various expression level and activity measurement methods known in the art. As a result of the measurement, if the expression level or activity of miRNA is decreased, the test substance can be determined as a candidate for the treatment of endometriosis.
  • the term “reduction in activity or expression level” refers to a decrease in the expression level or unique function or expression level of a miRNA in vivo.
  • a decrease in activity includes not only a simple decrease in function but also an ultimate inhibition of activity due to a decrease in stability. Specifically, it may mean a state in which the activity or expression amount is reduced by more than 10% or 20%, more specifically, a decrease in activity or expression by more than 40%, and more specifically, a decrease in activity or expression by more than 60% compared to the control group.
  • the biological sample includes endometriosis tissue or endometriosis tissue-derived cells.
  • the present invention includes the steps of (a) confirming low expression of miRNA compared to the control group in an endometriosis tissue or cell sample isolated from an individual; (b) administering a candidate substance for treating endometriosis to the sample; (c) re-confirming miRNA expression in the sample; And, (d) determining that the candidate material is effective in treating endometriosis when the expression of the miRNA increases; wherein the miRNA is mir-1299, mir- A method is provided, which is at least one miRNA selected from the group consisting of 29a-3p, mir-5196-5p, or mir-639.
  • the biological sample includes uterine-derived tissue, uterine-derived cells, or uterine-derived blood (menstrual blood, etc.).
  • the present invention is a feminine product comprising an agent for measuring the level of miRNA, wherein the miRNA is mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, and miR-147a. , mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir Provided is a feminine product, which is at least one selected from the group consisting of -29a-3p, mir-5196-5p, and mir-639.
  • the feminine product may be a sanitary napkin, a menstrual cup, a tampon, a panty liner, a feminine cleanser, a pregnancy tester, or an ovulation tester.
  • the feminine care products may further include labeled secondary antibodies, chromophores, or enzymes conjugated with antibodies that can bind to an agent that measures the level of miRNA.
  • the present invention provides a composition for diagnosing endometriosis containing as an active ingredient an agent that measures the level of miRNA.
  • the present invention has made research efforts to overcome the difficulties in diagnosis and limitations in treatment of endometriosis. As a result, while searching for new diagnostic targets in endometrial cells isolated from healthy controls and endometriosis patients, differences in the expression of miRNAs in exosomes were confirmed. The present invention was completed by confirming that the expression of miRNA in exosomes isolated from endometriosis patients was significantly increased or decreased compared to healthy controls. It can be useful as a diagnosis and treatment for endometriosis.
  • Figure 1 shows the results of analyzing the effect of exosomes (EMS-Exo) derived from the blood of endometriosis patients on proliferation of uterine-derived cells, according to an embodiment of the present invention.
  • EMS-Exo exosomes
  • Figure 2 shows the results of separating and culturing endometrial cells from a control group and an endometriosis patient, respectively, according to an experimental example of the present invention, and exosomes were isolated from the sup of the cultured cells and analyzed by a miRNA array.
  • Figure 3 shows the differences in expression of various miRNAs confirmed by isolating the miRNAs in the exosomes after extracting exosomes from the blood of control and endometriosis patients, according to an experimental example of the present invention.
  • Figure 4 shows the results of ROC curve analysis of the usefulness of the miRNA discovered in the present invention as a composition for diagnosing endometriosis according to an embodiment of the present invention.
  • Endometrial cells from normal controls and endometriosis patients were isolated and cultured, exosomes were isolated from the supernatant of the cultured cells, and miRNA array analysis was performed. As a result, significantly increased exosomes and significantly decreased exosomes were confirmed in endometriosis patients compared to the normal control group.
  • mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a- 3p, mir-515-5p, mir-563, and mir-587 were confirmed to be expressed at increased levels compared to the normal control group, and mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, and mir-639 were confirmed to be expressed more than the normal control group. It was confirmed that contrast expression decreased.
  • Endometrial cells were collected from endometriosis patients and cultured using primary endometrial cell culture.
  • the collected tissue was aseptically placed in a mixture of DMEM/F12 (1:1) and 100U/mL of penicillin and streptomycin, transported to the laboratory, cut into small pieces, treated with 0.25% collagenase type B, and treated at 37''. After treatment in a shaking water bath for 1 hour at C, collagenase activity was stopped by adding twice the volume of 10% FBS, and the cell suspension was filtered through a filament nylon mesh and cultured in DMEM/F12 (1:1) medium.
  • exosomes were extracted by adjusting the pH of the obtained cell culture fluid and the patient's menstrual blood and abdominal fluid to 5.0.
  • exosomes were first extracted using an exosome extraction reagent, and to increase purity, exosomes were extracted a second time using an ultra-centrifuge.
  • nanoparticle tracking analysis was performed. NTA is a device that analyzes the size, distribution, and concentration of particles by visualizing the movement of particles in Brownian motion, and determines the specific size of exosomes. can be analyzed to check purity.
  • RNA isolation within exosomes was used after removing the lipid membrane, and the isolated proteins and RNA were quantified using micro-BCA and Nanodrop.
  • exosomes derived from the blood of endometriosis patients are referred to as EMS-Exo
  • exosomes derived from normal blood as a control group are referred to as CTL-Exo.
  • Effective biomarker candidates were selected through protein and genome profiling and bioinformatics analysis, and a micro-RNA seq array was performed in conjunction with a professional genome analysis company and genome analysis was performed.
  • Endometrial cells from normal controls and endometriosis patients were isolated and cultured, exosomes were isolated from the supernatant of the cultured cells, and miRNA array analysis was performed. As a result, significantly increased exosomes and significantly decreased exosomes were confirmed in endometriosis patients compared to the normal control group.
  • mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a- 3p, mir-515-5p, mir-563, and mir-587 were confirmed to be expressed at increased levels compared to the normal control group, and mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, and mir-639 were confirmed to be expressed more than the normal control group. It was confirmed that contrast expression decreased (Figure 2).
  • Exosomes were extracted from the blood of normal control subjects and endometriosis patients, the miRNAs in the exosomes were isolated, and differences in miRNA expression were analyzed using qRT-PCR.
  • the miRNA sequences for qRT-PCR are shown in Table 1 below.
  • miRNA Assay ID Sequence ID Mature miRNA sequence Hsa-miRNA-216a-5p 478490_mir SEQ ID NO: 1 UAACACUGUCUGGUAACGAUGU Hsa-miRNA-147a 478514_mir SEQ ID NO: 2 GUGUGUGGAAAUGCUUCUGC Hsa-miRNA-29a-3p 478587_mir SEQ ID NO: 3 UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA Hsa-miRNA-200a-3p 478490_mir SEQ ID NO: 4 UAACACUGUCUGGUAACGAUGU Hsa-miRNA-191-5p 477952_mir SEQ ID NO: 5 CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG Hsa-miRNA-10b-5p 478494_mir SEQ ID NO: 6 UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG Cel-miRNA-39-3p 478293_mir SEQ ID NO: 7 UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
  • miRNA AUC Cutoff value Sensitivity % Specificity % 95% CI P-value 216a-5p 0.7022 >2.6 47.37 78.95 0.5375-0.8669 0.0331 147a 0.7377 >2.95 50 88.89 0.5766-0.8988 0.0148 29a-3p 0.7647 ⁇ 0.85 88.24 64.71 0.5989-0.9305 0.0084 191-5p 0.7924 >1.2 76.47 64.70 0.6440-0.9407 0.0036 200a-3p 0.6814 - - - - 0.0558 10b-5p 0.5502 - - - - 0.6175
  • the present invention has made research efforts to overcome the limitations of conventional diagnosis and treatment, which make it difficult to effectively diagnose endometriosis. As a result, while searching for new diagnostic targets, differences in the expression of miRNAs in exosomes were discovered in endometrial cells isolated from healthy controls and endometriosis patients. Therefore, the present invention is expected to be widely used as a reliable diagnosis or new treatment for endometriosis by utilizing differences in the expression of miRNAs in exosomes.

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Abstract

본 발명은 miRNA의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 자궁내막증의 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명은 종래 자궁내막증이 갖고 있는 진단의 어려움 및 치료의 한계점을 극복하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 건강한 대조군과 자궁내막증 환자에서 분리한 자궁내막 세포에서 새로운 진단 타겟을 탐색하던 중 엑소좀 내 miRNA의 발현의 차이를 확인하였다. 건강한 대조군 보다 자궁내막증 환자에서 분리한 엑소좀 내 miRNA의 발현이 유의하게 증가 또는 감소함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. 자궁내막증의 진단 및 치료제로써, 유용하게 이용될 수 있다.

Description

자궁내막증 진단용 조성물
본 발명은 miRNA의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 자궁내막증 진단용 조성물에 관한 것이다.
자궁내막증이란 자궁 안에 있어야 할 자궁내막 조직이 나팔관을 역류하여 자궁 밖 골반강에 착상하여 발생하는 것으로 가임기 여성의 약 10 내지 15%에서 발생되는 질병이다. 주요 증상으로 심한 월경통과 하복부 통증 등이 있고 특히 자궁내막증 환자의 30 내지 50%는 난임이 동반하게 된다. 자궁내막증 환자에서 난임의 원인은 아직까지 명확히 규명되지 않았으나, 병변에서 만성 출혈과 염증 반응을 보이며, 염증은 골반내 신경 말단을 자극하여 통증을 유발하고 나팔관의 기능, 자궁내막의 착상 기능, 난자와 배아의 발달 과정에 영향을 미쳐 난임을 유발하는 것으로 보고되고 있다.
한국은 2018년 세계 유일 연간 출산율 1.0 이하인 0.98 명으로 초저출산 국가로 국가 존립 기반마저 위협받고 있는 실정이며, 난임자 수는 2006년 14만 8,892명에서 2017년 기준 20만 8,703명으로 연평균 3.1% 증가했고 국내 난임률은 13.2%(2015년)로, 미국 6.7%, 영국 8.6%, 독일 8.0% 등 주요 선진국과 비교해 볼 때 매우 높은 수준이다. 자궁내막증 환자 또한 같은 기간 2013년 84,583명에서 2017년 111,214명으로 4년간 31.5% 증가한 것을 고려하면 자궁내막증에 의한 난임이 출생률과 연관이 있음을 추측해볼 수 있다.
자궁내막증 치료는 초기의 경우 약물적 치료를 통하여 증상 완화와 장기간 재발을 억제하여 가임기 여성의 가임력을 유지시키고 난임으로의 이환률을 줄여줄 수 있다. 그러나 자궁내막증 조기 진단 방법이 없어 대부분 환자들은 초기 증상 발현부터 진단까지 수년간의 시간이 소요되고 있으며 중증인 상태로 진행되어 결국에는 수술적 진단 및 치료로 이어지고 있는 한계가 존재한다. 중증인 상태에서의 수술적 치료는 수술 후 난소의 기능을 감소시킬 가능성이 존재하기 때문에 가임기 여성의 경우 가임력 상실의 위험이 동반되는 실정이다. 또한, 자궁내막증의 성공적인 치료를 위해서는 초기 단계에서의 정확한 진단이 필수적으로 요구된다. 기존의 진단 방법 중의 하나인 혈청 CA-125 검사는 자궁내막증에 걸린 일부 여성에게서 혈청 CA-125가 상승하지만, 특이적인 것은 아니며 낮은 민감도 및 특이도를 가지는 한계가 존재한다. 이렇듯 초기 단계의 자궁내막증을 정확하게 진단할 수 있는 기술이 미흡한 실정이다.
따라서, 본 발명은 종래 자궁내막증의 효과적인 진단이 어려운 종래 진단 및 치료의 한계점을 극복하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 새로운 진단 타겟을 탐색하던 중 건강한 대조군과 자궁내막증 환자에서 분리한 자궁내막 세포에서 엑소좀 내 miRNA의 발현의 차이를 발견하였다. 따라서 본 발명은 엑소좀 내 miRNA의 발현의 차이를 이용하여 자궁내막증의 신뢰도 높은 진단 또는 새로운 치료제로 크게 이용될 것으로 기대된다.
본 발명자들은 종래 자궁내막증이 갖고 있는 진단 및 치료의 한계점을 극복하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 건강한 대조군과 자궁내막증 환자에서 분리한 자궁내막 세포에서 새로운 진단 타겟을 탐색하던 중 엑소좀 내 miRNA의 발현의 차이를 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 miRNA의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 자궁내막증의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 miRNA의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 자궁내막증의 진단용 조성물로서, 상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 자궁내막증의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발은 종래 자궁내막증이 갖고 있는 진단의 어려움 및 치료의 한계점을 극복하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 건강한 대조군과 자궁내막증 환자에서 분리한 자궁내막 세포에서 새로운 진단 타겟을 탐색하던 중 엑소좀 내 miRNA의 발현의 차이를 확인하였다. 건강한 대조군 보다 자궁내막증 환자에서 분리한 엑소좀 내 miRNA의 발현이 유의하게 증가 또는 감소함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 조성물이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 miRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 화합물; 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물이다.
본 발명에 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 조절 T 세포 특이적 단백질 또는 이의 세포 외 도메인에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 바이오마커 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 항원 결합 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변역역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역 (CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ⅱ) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (ⅲ) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (ⅶ) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (ⅷ) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) 등을 포함한다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소, 예를 들면 파파인 또는 펩신을 이용하는 경우 Fab 또는 F(ab')2의 단편을 얻을 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명의 상기 항체는 단일클론항체(monoclonal antibody), 다클론항체(polyclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 유니바디(unibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "단일클론항체"는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 일컫는 말로, 특정 항원 결정기(Epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명에서 "키메라 항체"는, 생쥐 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
본 발명에서 "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변 영역을 제조하고, 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서 "결합" 또는 "특이적 결합"은 본원 항체 또는 항체 조성물의 항원에 대한 친화도를 나타내는 것이다. 항원 항체 결합에서 "특이적 결합"은 전형적으로 해리상수(dissociation constant, Kd)가 1×10-5M 미만 또는 1×10-6M 미만 또는 1×10-7M 미만인 경우 비특이적인 배경 결합과 구분될 수 있다. 특이적 결합은 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 ELISA, SPR(Surface plasmon resonance), 면역침전(immunoprecipitation), 공침전(coprecipitation) 등의 방법으로 검출될 수 있으며, 비특이적 결합과 특이적 결합을 구분할 수 있는 적절한 대조군을 포함한다.
본 발명의 "항체 또는 항원 결합 단편"은 단량체의 항원 결합능의 적어도 일부를 포함하는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 다량체로 존재할 수 있다. 이러한 다량체는 또한 동종다량체, 또는 이종다량체를 포함하는 것이다. 항체 다량체는 다수의 항원 결합 부위를 포함하기 때문에 단량체와 비교하여 항원에 대한 결합능이 우수하다. 항체의 다량체는 또한 다기능성(bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) 항체 제작에도 용이하다.
본 발명의 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자를 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miRNA의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 자궁내막증의 진단용 키트로서, 상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 자궁내막증의 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 "키트"는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있고, 또는 여성용품과 일체화된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 때, 상기 여성용품은 생리대, 생리컵, 탐폰 등 생리용품뿐 아니라, 여성주기와 관련하여 수요가 발생할 수 있는 각종 물품을 포괄하는 용어로 사용되며, 예를 들어 티슈, 팬티라이너, 청결제 등의 생활용품, 임신테스터나 배란테스터 등의 각종 검사키트 등이 포함될 수 있다. 상기 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 암호화하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 상기 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 키트이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료 내 miRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁내막증(Endometriosis) 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 “생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, miRNA을 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함한다. 예를 들면 혈액, 조직, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합인 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니나 바람직하게는 자궁 유래 조직, 자궁 유래 세포, 또는 자궁 유래 혈액(생리혈 등)일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 순수하게 분리된 핵산, 조 분리된 핵산, 핵산을 포함하는 세포 파쇄물, 또는 세포 유리 핵산을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 방법이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 방법은 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, 또는 mir-587의 발현 수준이 정상 대조군보다 높게 발현되는 경우, 상기 개체가 자궁내막증이 있을 것으로 진단하는 것인, 방법이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 방법은 mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 또는 mir-639의 발현 수준이 정상 대조군보다 낮게 발현되는 경우, 상기 개체가 자궁내막증이 있을 것으로 진단하는 것인, 방법이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 자궁 유래 조직, 자궁 유래 세포, 또는 자궁 유래 혈액(생리혈 등)을 포함하는 것인, 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miRNA 억제제를 유효성분으로 포함하는 자궁내막증의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 miRNA 억제제는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, 또는 mir-587로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA의 억제제인 것인, 약학조성물이다.
본 발명에서 약학 조성물이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학 조성물은 염증활성 물질의 억제를 위해 사용되는 것이며, 이를 위한 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 약학 조성물에 상응하는 유효성분을 0.1 내지 100 중량%로 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miRNA 활성화제를 유효성분으로 포함하는 자궁내막증의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 miRNA 활성화제는 mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 또는 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA의 활성화제인 것인, 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 대조군에 비하여 miRNA의 과발현을 확인하는 단계; (b) 상기 시료에 자궁내막증 치료용 후보물질을 투여하는 단계; (c) 상기 시료에서 miRNA 발현을 재 확인하는 단계; 및, (d) miRNA 발현이 감소하는 경우에 상기 후보물질을 자궁내막증 치료 효과가 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 자궁내막증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법으로서, 상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, 또는 mir-587로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA인 것인, 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “후보물질”은 miRNA를 발현하는 세포를 포함하는 시료에 첨가되어 miRNA의 활성 또는 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 miRNA의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 발현량 및 활성 측정방법에 의해 수행될 수 있다. 측정 결과, miRNA의 발현량 또는 활성이 감소한 경우 상기 시험물질은 자궁내막증 치료용 후보물질로 판정될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “활성 또는 발현량의 감소”는 miRNA의 발현량 또는 생체 내 고유한 기능 또는 발현량이 감소하는 것을 의미한다. 활성(activity)의 감소는 단순한 기능(function)의 감소뿐 아니라 안정성(stability)의 감소로 기인한 궁극적인 활성 저해를 포함한다. 구체적으로는 대조군에 비하여 활성 또는 발현량이 10%, 또는 20% 이상 감소한 상태, 보다 구체적으로는 40% 이상 감소한 상태, 더욱 구체적으로는 60% 이상 감소한 상태를 의미할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 자궁내막증 조직 또는 자궁내막증 조직 유래 세포를 포함하는 것인, 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리된 자궁내막증 조직 또는 세포 시료에서 대조군에 비하여 miRNA의 저발현을 확인하는 단계; (b) 상기 시료에 자궁내막증 치료용 후보물질을 투여하는 단계; (c) 상기 시료에서 miRNA 발현을 재 확인하는 단계; 및, (d) miRNA 발현이 증가하는 경우에 상기 후보물질을 자궁내막증 치료 효과가 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 자궁내막증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법으로서, 상기 miRNA는 mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 또는 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA인 것인, 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 자궁 유래 조직, 자궁 유래 세포, 또는 자궁 유래 혈액(생리혈 등)을 포함하는 것인, 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 여성용품으로서, 상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 여성용품을 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 여성용품은 생리대, 생리컵, 탐폰, 팬티라이너, 여성용 청결제, 임신테스터, 또는 배란테스터인 것일 수 있다. 또한 상기 여성용품은 miRNA의 수준을 측정하는 제제와 결합 가능한 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 또는 항체와 컨주게이트된 효소를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 miRNA의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 자궁내막증의 진단용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 본 발명은 종래 자궁내막증이 갖고 있는 진단의 어려움 및 치료의 한계점을 극복하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 건강한 대조군과 자궁내막증 환자에서 분리한 자궁내막 세포에서 새로운 진단 타겟을 탐색하던 중 엑소좀 내 miRNA의 발현의 차이를 확인하였다. 건강한 대조군 보다 자궁내막증 환자에서 분리한 엑소좀 내 miRNA의 발현이 유의하게 증가 또는 감소함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. 자궁내막증의 진단 및 치료제로써, 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 자궁내막증 환자 혈액 유래의 엑소좀(EMS-Exo)이 자궁 유래 세포 증식에 미치는 효과를 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른, 대조군과 자궁내막증 환자에서 자궁내막 세포를 각각 분리 후 배양하여, 배양된 세포의 sup에서 엑소좀을 분리 후 miRNA array 분석 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실험예에 따른, 대조군과 자궁내막증 환자 혈액에서 엑소좀 추출 후 엑소좀 내 miRNA을 분리하여 확인한 다양한 miRNA의 발현차이를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 발굴한 miRNA의 자궁내막증 진단용 조성물로서 유용성을 ROC 곡선 분석으로 수행한 결과를 나타낸다.
정상 대조군과 자궁내막증 환자에서 자궁내막 세포를 각각 분리하고 배양하여, 배양된 세포의 상층액(supertant)에서 엑소좀을 분리 후, miRNA array분석을 진행하였다. 그 결과, 정상대조군 대비 자궁내막증 환자에서 유의적으로 증가한 엑소좀과 유의적으로 감소한 엑소좀을 확인하였다. mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, 및 mir-587는 정상대조군 보다 증가되어 발현됨을 확인했으며, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639는 정상 대조군 대비 발현이 감소하였음을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
[연구방법]
자궁내막증 임상 시료의 확보
수술로 자궁내막증을 확진 받는 환자로부터 시료를 채취하여 조직 및 자궁내막세포 배양을 통해서 실험에 이용하였다. 1개월에 약 5 내지 10 례 정도의 자궁내막증 및 난소 낭종 수술이 있으며 자궁내막증 및 대조군 샘플을 각각 약 100례 정도 확보하였다. 본 연구는 연세대학교 의과대학 평가위원회 (Institutional Review Board; IRB)의 승인을 얻어 모든 실험을 수행하였으며, 모든 샘플은 자궁내막증 환자로부터 서면 동의를 얻은 후 수집되었다. 질내 세균 채집용 키트인 OMNIGENE-vaginal swab kit(#OMR-130)를 사용하여 질 또는 자궁내막 시료를 수득하였고, 복강액은 직접 채취하여 멸균 튜브에 저장하여 준비하였다.
자궁내막증 유래 세포배양 확립
자궁내막증 환자의 자궁내막세포 채취 및 primary endometrial cell culture로 배양을 진행하였다. 채취한 조직을 DMEM/F12 (1:1) 및 100U/mL의 penicillin과 streptomycin을 혼합한 배지(media)에 무균적으로 담아서 실험실로 운반한 후 잘게 조각내어 0.25% collagenase type B를 처리하여 37'C에서 1시간 동안 shaking water bath에 처리한 다음 10% FBS를 두 배의 부피로 더하여 collagenase activity를 중지시키고 cell suspension을 filament nylon mesh에 걸러 DMEM/F12 (1:1) 배지에 배양하였다.
엑소좀 추출 및 엑소좀 내 단백질과 ncRNA 분리 정제
시료의 pH 조절을 통해 엑소좀 수득률이 증가하는 선행연구를 바탕으로 얻어진 세포 배양액과 환자의 월경혈 및 복강액의 pH를 5.0으로 조절하여 엑소좀을 추출하였다. 변형(modify)한 추출방법은 엑소좀 추출 reagent를 이용하여 엑소좀을 1차 추출하고 purity를 높이기 위하여 울트라 원심분리기(ultra-centrifuge)를 이용하여 2차 추출하였다. 추출한 엑소좀 purity 측정을 위하여 나노입자 추적분석(NTA, nanoparticle tracking analysis)을 진행하였고, NTA은 브라운 운동하는 입자의 움직임을 시각화하여 입자의 크기와 분포, 농도를 분석하는 장비로서 엑소좀의 특정크기를 분석할 수 있어 purity를 확인할 수 있다. 또한, 엑소좀 내 구성물질인 단백질과 RNA을 분리하기 위하여 lipid 막을 제거 후 엑소좀 내 단백질과 RNA isolation 전용 kit을 이용하며, 분리한 단백질과 RNA는 micro-BCA와 Nanodrop을 이용하여 정량하였다.
이하 자궁내막증 환자 혈액 유래의 엑소좀을 EMS-Exo, 대조군으로서 정상인 혈액 유래의 엑소좀을 CTL-Exo로 명명한다.
오믹스를 이용하여 단백질과 RNA profiling 및 유효 후보군 선별
단백질과 유전체 profiling 및 bioinformatics 분석으로 유효한 바이오마커 후보군을 선별하였으며, 전문 유전체 분석업체와 연계하여 micro-RNA seq array을 진행하고 유전체 분석을 진행하였다.
[연구결과]
결과 1. EMS-Exo가 자궁 유래 세포 증식에 미치는 효과 분석
EMS-Exo가 세포 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해 in vitro 자궁내막증 모델에 EMS-Exo와 CTL-Exo를 각각 20μg 처리하고, 24시간 동안 배양하고, 세포생존율을 CCK-8로 측정하였다(도 1). 그 결과, EMS-Exo 처리한 실험군에서 세포 형태가 더 조밀하게 나타났다. 또한 세포 생존율은 비히클 그룹 100% 기준 시, CTL-Exo 처리 그룹 103%, EMS-Exo 처리 그룹 118%로, EMS-Exo 처리가 CTL-Exo 처리에 비해 세포 생존이 크게 증가시키는 것으로 나타났다(n=3; **p<0.01, ***p<0.001). 이러한 결과는 EMS-Exo 처리가 자궁내막세포의 세포증식을 유도함을 시사한다.
결과 2. 자궁내막증 환자 내 miRNA array 분석
정상 대조군과 자궁내막증 환자에서 자궁내막 세포를 각각 분리하고 배양하여, 배양된 세포의 상층액(supertant)에서 엑소좀을 분리 후, miRNA array분석을 진행하였다. 그 결과, 정상대조군 대비 자궁내막증 환자에서 유의적으로 증가한 엑소좀과 유의적으로 감소한 엑소좀을 확인하였다. mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, 및 mir-587는 정상대조군 보다 증가되어 발현됨을 확인했으며, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639는 정상 대조군 대비 발현이 감소하였음을 확인하였다(도 2).
결과 3. 자궁내막증 환자 내 miRNA의 qRT-PCR 분석
정상 대조군과 자궁내막증 환자 혈액에서 엑소좀 추출하고 엑소좀 내 miRNA을 분리하여 qRT-PCR을 이용한 miRNA발현 차이를 분석하였다. qRT-PCR을 위한 miRNA 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
miRNA Assay ID Sequence ID Mature miRNA sequence
Hsa-miRNA-216a-5p 478490_mir 서열번호 1 UAACACUGUCUGGUAACGAUGU
Hsa-miRNA-147a 478514_mir 서열번호 2 GUGUGUGGAAAUGCUUCUGC
Hsa-miRNA-29a-3p 478587_mir 서열번호 3 UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA
Hsa-miRNA-200a-3p 478490_mir 서열번호 4 UAACACUGUCUGGUAACGAUGU
Hsa-miRNA-191-5p 477952_mir 서열번호 5 CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG
Hsa-miRNA-10b-5p 478494_mir 서열번호 6 UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG
Cel-miRNA-39-3p 478293_mir 서열번호 7 UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
그 결과, mir-200a-3p, mir-216a-5p, 및 mir-147a 엑소좀의 발현이 정상 대조군보다 유의하게 높게 증가되어 있음을 확인하였으며, mir-29a-3p 엑소좀은 정상대조군 대비 유의하게 감소되어 발현된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 히트맵 분석과 일치하였다(도 3).
결과 4. 자궁내막증에 대한 miRNA 마커의 진단 유용성 확인
본 발명에서 발굴한 miRNA가 자궁내막증 진단용 조성물로서 사용될 수 있는지 유용성을 확인하기 위해, ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선 분석을 수행하였다(도 4). ROC 곡선 분석에 따르면, 혈청 엑소좀 Hsa-miR-216a-5p, miR-147a, miR-29a-3p 및 miR-191-5p에 대한 곡선하면적(AUC)은 각각 0.7022 (95% CI: 0.5375-0.8669, P-value: 0.0331), 0.7377 (95% CI: 0.5766-0.8988, P-value: 0.0148), 0.7647 (95% CI: 0.5989-0.9305, P-value: 0.0084) 및 0.7361 (95% CI: 0.6440-0.9407, P-value: 0.0036)였고, 이는 자궁내막증과 CTL(정상) 사례를 구별할 수 있는 가능성을 나타낸다. 그러나 Hsa-miR-200a-3p 및 10b-5p에 대한 AUC는 각각 0.6814 (P-value: 0.0558) 및 0.5502 (P-value: 0.6175)였다(표 2).
miRNA AUC Cutoff
value 		Sensitivity
% 		Specificity
% 		95% CI P-value
216a-5p 0.7022 >2.6 47.37 78.95 0.5375-0.8669 0.0331
147a 0.7377 >2.95 50 88.89 0.5766-0.8988 0.0148
29a-3p 0.7647 <0.85 88.24 64.71 0.5989-0.9305 0.0084
191-5p 0.7924 >1.2 76.47 64.70 0.6440-0.9407 0.0036
200a-3p 0.6814 - - - -
 0.0558
10b-5p 0.5502 - - - -
 0.6175
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 종래 자궁내막증의 효과적인 진단이 어려운 종래 진단 및 치료의 한계점을 극복하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 새로운 진단 타겟을 탐색하던 중 건강한 대조군과 자궁내막증 환자에서 분리한 자궁내막 세포에서 엑소좀 내 miRNA의 발현의 차이를 발견하였다. 따라서 본 발명은 엑소좀 내 miRNA의 발현의 차이를 이용하여 자궁내막증의 신뢰도 높은 진단 또는 새로운 치료제로 크게 이용될 것으로 기대된다.
-서열번호 1(Hsa-miRNA-216a-5p)
UAACACUGUCUGGUAACGAUGU
-서열번호 2(Hsa-miRNA-147a)
GUGUGUGGAAAUGCUUCUGC
-서열번호 3(Hsa-miRNA-29a-3p)
UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA
-서열번호 4(Hsa-miRNA-200a-3p)
UAACACUGUCUGGUAACGAUGU
-서열번호 5(Hsa-miRNA-191-5p)
CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG
-서열번호 6(Hsa-miRNA-10b-5p)
UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG
-서열번호 7(Cel-miRNA-39-3p)
UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG

Claims (20)

  1. miRNA의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 자궁내막증의 진단용 조성물로서,
    상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 자궁내막증의 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 miRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 화합물; 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. miRNA의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 자궁내막증의 진단용 키트로서,
    상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 자궁내막증의 진단용 키트.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 키트.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 키트는 여성용품과 일체화된 것인, 키트.
  7. 개체로부터 분리된 생물학적 시료 내 miRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁내막증(Endometriosis) 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
    상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 방법은 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, 또는 mir-587의 발현 수준이 정상 대조군보다 높게 발현되는 경우, 상기 개체가 자궁내막증이 있을 것으로 진단하는 것인, 방법.
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 방법은 mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 또는 mir-639의 발현 수준이 정상 대조군보다 낮게 발현되는 경우, 상기 개체가 자궁내막증이 있을 것으로 진단하는 것인, 방법.
  11. 제 7항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 자궁 유래 조직, 세포, 또는 혈액을 포함하는 것인, 방법.
  12. miRNA 억제제를 유효성분으로 포함하는 자궁내막증의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 miRNA 억제제는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, 또는 mir-587로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA의 억제제인 것인, 약학조성물.
  13. miRNA 활성화제를 유효성분으로 포함하는 자궁내막증의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 miRNA 활성화제는 mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 또는 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 miRNA의 활성화제인 것인, 약학조성물.
  14. (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 대조군에 비하여 miRNA의 과발현을 확인하는 단계;
    (b) 상기 시료에 자궁내막증 치료용 후보물질을 투여하는 단계;
    (c) 상기 시료에서 miRNA 발현을 재 확인하는 단계; 및,
    (d) miRNA 발현이 감소하는 경우에 상기 후보물질을 자궁내막증 치료 효과가 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 자궁내막증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법으로서,
    상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, mir-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, 또는 mir-587로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA인 것인, 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 자궁 유래 조직, 세포, 또는 혈액을 포함하는 것인, 방법.
  16. (a) 개체로부터 분리된 자궁내막증 조직 또는 세포 시료에서 대조군에 비하여 miRNA의 저발현을 확인하는 단계;
    (b) 상기 시료에 자궁내막증 치료용 후보물질을 투여하는 단계;
    (c) 상기 시료에서 miRNA 발현을 재 확인하는 단계; 및,
    (d) miRNA 발현이 증가하는 경우에 상기 후보물질을 자궁내막증 치료 효과가 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 자궁내막증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법으로서,
    상기 miRNA는 mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 또는 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA인 것인, 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 자궁 유래 조직, 세포, 또는 혈액을 포함하는 것인, 방법.
  18. miRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 여성용품으로서,
    상기 miRNA는 mir-10b-5p, mir-1180-3p, mir-1307-5p, miR-147a, mir-191-5p, mir-200a-3p, mir-216a-5p, mir-4707-5p, mir-514a-3p, mir-515-5p, mir-563, mir-587, mir-1299, mir-29a-3p, mir-5196-5p, 및 mir-639로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 여성용품.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 여성용품은 생리대, 생리컵, 탐폰, 팬티라이너, 여성용 청결제, 임신테스터, 또는 배란테스터인 것인, 여성용품.
  20. 제 18항에 있어서,
    상기 여성용품은 miRNA의 수준을 측정하는 제제와 결합 가능한 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 또는 항체와 컨주게이트된 효소를 추가로 포함하는 것인, 여성용품.
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