WO2014065606A1 - 오스모틴 조성물 및 ｇａｂａ ｂ 수용체 단백질 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 신경질환 치료제 - Google Patents

오스모틴 조성물 및 ｇａｂａ ｂ 수용체 단백질 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 신경질환 치료제 Download PDF

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김명옥
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경상대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a neurological disease therapeutic agent, and more particularly, to a neurological disease therapeutic agent comprising GABA B receptor protein expression or activity inhibitor and osmotin as an active ingredient.
  • GABA (gamma-aminobutyric acid) B receptors are widely distributed in the central nervous system and regulate neuronal activity, and are particularly associated with degenerative brain diseases and pathophysiological disorders.
  • overexpression of the GABA B receptor can be attributed to Down syndrome (Tyler K. et al., J. Neurophysiol. , 97: 892-900, 2007), and atypical collusion (Stewart LS, et al., Epilepsy Behav. , 14 (4): 577-81, 2009), Alzheimer (Palop JJ, et al., Neuron, 55: 697-711, 2007; Williams C., et al., PLoS One. , 4 (3): e4936, 2009 ), Depression (Slattery DA., Et al., J. Pharmacol. Exp. Ther ., 312 (1): 290-6, 2004), and the like.
  • the present invention aims to provide various therapeutic agents for preventing and treating neurological diseases caused by GABA B receptor aberration by identifying molecular biological mechanisms related to GABA B receptors.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • compositions for the prevention and treatment of neurological diseases containing osmotin (gammo-aminobutyric acid) B receptor protein activity or expression inhibitors.
  • the neurological disease may be caused by GABA B receptor overexpression and may be atypical colonization, Alzheimer's, depression, or degenerative brain disease.
  • the GABA B receptor protein activity inhibitor may be a compound, peptide, peptide mimetics, aptamer or antibody that complementarily binds to GABA B receptor protein.
  • Compounds that antagonize by complementarily binding to the GABA B receptor protein are pentylenetetrazole, phaclofen, 2-Hydroxysaclofen, and saclofen ), SCH-50911 (CAS # 160415-07-6, 2-[(2S) -5,5-dimethylmorpholin-2-yl] acetic acid (2-[(2S) -5,5-dimethylmorpholin-2- yl] acetic acid)), CGP-35348 (CAS # 123690-79-9, 3-aminopropyl (diethoxymethyl) phosphinic acid), CGP-52432 (CAS # 139667- 74-6, 3-([(3,4-dichlorophenyl) methyl] amino] propyl) diethoxymethyl) phosphinic acid (3-([(3,4-Dichlorophenyl) methyl] amino] propyl) diethoxymethyl) phosphinic acid )), CGP-55845 (
  • the GABA B receptor protein expression inhibitor may be antisense nucleotides, short interfering RNAs or short hairpin RNAs that complementarily bind to the mRNA of the GABA B receptor genes.
  • composition according to an embodiment of the present invention may preferably include an osmotin and GABA B receptor protein expression or activity inhibitor in an amount of 0.1 to 50% by weight based on the total weight of the composition.
  • it may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function as the expression or activity inhibitory substance of the GABA B receptor protein, but preferably does not exceed the content of the active ingredient.
  • composition may be administered orally or parenterally during clinical administration, and intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intrauterine dural injection, intravascular examination or intrathoracic injection during parenteral administration. It can be administered by injection and can be used in the form of a general pharmaceutical formulation.
  • Each oral composition according to one embodiment of the present invention further comprises an inert ingredient, including a pharmaceutically acceptable carrier.
  • compositions according to one embodiment of the present invention may be combined with pharmaceutical carriers according to conventional pharmaceutical preparation techniques.
  • the carrier can take a wide variety of forms depending on the preparation desired, for example, for oral or parenteral administration (including intravenous administration).
  • composition according to an embodiment of the present invention may be administered at a dose of 0.1 mg / kg to 1 g / kg, more preferably at a dose of 0.1 mg / kg to 500 mg / kg.
  • the dosage may be appropriately adjusted according to the age, sex and condition of the patient.
  • a method for treating neurological disease comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of an osmotin and GABA B receptor protein expression or inhibitor.
  • the neurological disease may be caused by GABA B receptor overexpression, and may be atypical colonization, Alzheimer's, depression, or degenerative brain disease.
  • FIG. 1 is a graph (FIG. 1A) confirming the GABA B receptor expression inhibitory effect of the composition according to an embodiment of the present invention through Western blot and a graph calculating the density of the Western blot band (FIG. 1B).
  • Figure 2 is a graph showing the effect of inhibiting the expression of the PKA protein, which is a lower signaling step of the GABA B receptor of the composition according to an embodiment of the present invention (Fig. 2A) and a graph of the density of the western blot band ( 2B).
  • Figure 3 is a figure confirming the effect of inhibiting the expression of p-CREB protein, a lower signaling step of GABA B receptor of the composition according to an embodiment of the present invention (Fig. 3A) and the density of the western blot bands It is a graph (FIG. 3B).
  • an "antisense nucleotide” binds (hybridizes) the complementary sequencing of DNA, immature-mRNA, or mature mRNA, as defined by the Watson-click base pair, to disrupt the flow of genetic information as a protein in DNA. It is.
  • the nature of antisense nucleotides specific to the target sequence makes them exceptionally multifunctional. Since antisense nucleotides are long chains of monomeric units they can be easily synthesized for the target RNA sequence. Many recent studies have demonstrated the utility of antisense nucleotides as a biochemical means for studying target proteins (Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst. , 81: 1539-1544, 1999).
  • antisense nucleotides can be considered as a new type of inhibitor because of recent advances in nucleotide synthesis and in the field of nucleotide synthesis that exhibit improved cell adsorption, target binding affinity and nuclease resistance.
  • Peptide Minetics refers to the inhibition of the activity of GABA B receptor proteins as peptides or non-peptides that inhibit the binding domain of GABA B receptor proteins.
  • the major residues of the non-hydrolyzable peptide analogs are the ⁇ -turn dipeptide core (Nagai et al. Tetrahedron. Lett. , 26: 647, 1985), keto-methylene pseudopeptides (Ewenson et al. J. Med. Chem. , 29: 295, 1986; and Ewenson et al ., In Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co.
  • siRNA molecule refers to a siRNA molecule in which the sense RNA and the antisense RNA form a double-stranded RNA molecule, wherein the sense RNA comprises a nucleic acid sequence identical to the target sequence of consecutive nucleotides of some of the GABA B receptor mRNAs. It is preferable.
  • the siRNA molecule is preferably composed of a sense sequence consisting of 10 to 30 bases selected from the base sequence of the GABA B receptor gene and an antisense sequence complementarily binding to the sense sequence, but not limited thereto. Any double-stranded RNA molecule having a sense sequence capable of complementarily binding to the base sequence of the B receptor gene can be used.
  • the antisense sequence has a sequence complementary to the sense sequence.
  • an “antibody” can be used, either prepared through the injection of anti-GABA B receptor or purchased commercially.
  • the antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, fragments capable of binding epitopes, and the like.
  • Polyclonal antibodies can be produced by conventional methods of injecting the GABA B receptor into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody.
  • Such polyclonal antibodies can be purified by any method known in the art and can be made from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cattle, dogs and the like.
  • Monoclonal antibodies can be prepared using any technique that provides for the production of antibody molecules through the culture of continuous cell lines.
  • Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B-cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (Kohler G). et al ., Nature , 256: 495-497, 1975; Kozbor D et al J. Immunol. Methods , 81: 31-42, 1985; Cote RJ et al ., Proc . Natl . Acad . Sci ., 80: 2026-2030, 1983; And Cole SP et al ., Mol . Cell . Biol ., 62: 109-120, 1984).
  • antibody fragments containing specific binding sites for the GABA B receptor can be prepared.
  • F (ab ') 2 fragments can be prepared by digesting antibody molecules with pepsin, and Fab fragments can be prepared by reducing the disulfide bridges of F (ab') 2 fragments.
  • the Fab expression library can be made smaller to quickly and easily identify monoclonal Fab fragments with the desired specificity (Huse WD). et al., Science 254: 1275-1281, 1989).
  • the antibody can be bound to a solid substrate to facilitate subsequent steps such as washing or separation of the complex.
  • Solid substrates include synthetic resins, nitrocellulose, glass substrates, metal substrates, glass fibers, microspheres and microbeads.
  • the synthetic resins include polyester, polyvinyl chloride, polystyrene, polypropylene, PVDF and nylon.
  • “Aptamer” is a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) that has its own stable tertiary structure and which is capable of binding to target molecules with high affinity and specificity. Aptamers have been developed since the first development of the aptamer excavation technology, called Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (Ellington, AD and Szostak, JW., Nature 346: 818-822, 1990). Many aptamers have been unearthed that can bind to various target molecules. Aptamers are often compared to single antibodies because of their inherent high affinity (usually pM levels) and their specificity to bind to target molecules, particularly as "chemical antibodies,” and thus have high potential as alternative antibodies.
  • a "pharmaceutically acceptable carrier” is a term that refers to a composition, specifically an ingredient other than the active substance of the pharmaceutical composition.
  • pharmaceutically acceptable carriers include binders, disintegrants, diluents, fillers, glidants, solubilizers or emulsifiers and salts.
  • FIG. 1 is a graph (FIG. 1A) confirming the GABA B receptor expression inhibitory effect of the composition according to an embodiment of the present invention through Western blot and a graph calculating the density of the Western blot band (FIG. 1B).
  • Overexpression of the GABA B receptor protein is known to mediate a variety of neurological disorders, but the exact mechanism of this is unknown. Accordingly, the present inventors have attempted to implement a prophylactic and therapeutic effect of a disease mediated by overexpression of the GABA B receptor protein through a mechanism associated with GABA B receptor overexpression and a composition capable of inhibiting the GABA B receptor overexpression.
  • osmotin the effect of inhibiting neuronal cell death is known through conventional studies by the present inventors (Korean Patent Publication 2011-0085260), but the effect of inhibiting GABA B receptor overexpression is not known.
  • pentylenetetrazole it is known to be used to prepare an epileptic animal model characterized by a decrease in GABA A receptor expression as a general epileptic (O. Carter Snead III, et al ., J. Neurosci , 20 (16): 6218-6224, 2000), the effect of which is associated with the inhibition of expression of GABA B receptor proteins is unknown.
  • composition comprising osmotin and pentylenetetrazole can be used for the prevention and treatment of neurological diseases caused by GABA B receptor protein overexpression, as well as the osmotin and pentylenetetrazole separately. It is the first demonstration that synergistic effects of two compounds combined compared to treatment.
  • Figure 2 is a graph showing the effect of inhibiting the expression of the PKA protein, which is a lower signaling step of the GABA B receptor of the composition according to an embodiment of the present invention (Fig. 2A) and a graph of the density of the western blot band ( 2B).
  • the inventors have identified the expression of PKA proteins, known as substeps of the GABA B receptor.
  • the expression of PKA protein was observed to decrease in the order of osmotin (O), osmotin + pentylene tetrazole (O + PTZ), and pentylene tetrazole (PTZ).
  • Figure 3 is a figure confirming the effect of inhibiting the expression of p-CREB protein, a lower signaling step of GABA B receptor of the composition according to an embodiment of the present invention (Fig. 3A) and the density of the western blot bands It is a graph (FIG. 3B).
  • the present inventors observed the expression of p-CREB protein, which is known as a lower level of GABA B receptor, but osmotin (O), pentylenetetrazole (PTZ), and osmotin + pentylenetetrazole No significant difference was observed between the (O + PTZ) groups.
  • Cortical and hippocampal tissues of GD 17.5 day old embryos obtained from pregnant female Sprague Dawley rats sacrificed in Example 1 were isolated.
  • the isolated cerebral cortex and hippocampal tissue were treated with 0.25% trypsin EDTA for 20 minutes, and physically separated tissues by cell pipetting in Hank's buffer of pH 7.4 containing no cold calcium and magnesium After centrifugation, centrifugation was performed. Cells pelleted by centrifugation were planted at a rate of 1 ⁇ 10 6 cells / ml on plate and chamber slides coated with 0.02 g / l poly-lysine.
  • the medium was heat-inactivated 10% FBS (fetal bovine serum), 1 mM pyruvate, 4.2 mM sodium bicarbonate, 20 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid ), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) with 0.3 g / l bovine serum albumin, 50 U / ml penicillin, and 50 mg / l streptomycin. Cells were incubated at 37 ° C. with 5% CO 2 moisture.
  • FBS fetal bovine serum
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • the culture medium was added to 100 ⁇ M cytosine ⁇ -D-Arabino Furanoside (Sigma, USA) for 12 hours. After 12 hours, the medium was replaced with the aforementioned medium.
  • cerebral cortex and hippocampal neurons were treated with 100 mM ethanol treated group (E, negative control group), osmotin 0.08 ⁇ M treated group (O, positive control group), 20 mM pentylenetetrazole treated group (PTZ, Treatment with drugs was divided into experimental group 1), 0.08 ⁇ M osmotin + 20 mM pentylenetetrazole treated group (O + PTZ, experimental group 2), 0.08 ⁇ M osmotin + 100 mM ethanol treated group (O + E, comparative group 1). (See Table 1). All drugs were commonly treated for 24 hours in cell culture.
  • Osmotin contained in the composition according to an embodiment of the present invention was isolated from the salt-adapted tobacco culture cells (Nicotiana tabacum L. var. Wisconsin 38) with more than 99% purity (Yun et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 94 (13): 7082-7, 1997; Yun DJ, et al , Mol . Cell . , 1 (6): 807-17, 1998).
  • Examples 1 and 2 to demonstrate the effects of treating and preventing abnormal epilepsy and cognitive disorders caused by GABAB receptor overexpression of the composition containing osmotin and pentylenetetrazole according to an embodiment of the present invention.
  • the drugs described in Table 1 were treated for 24 hours. Thereafter, expression of the GABA1B receptor was confirmed by Western blot.
  • Example 2 cerebral cortex and hippocampal cells cultured in Example 2 were homogenized using a cell lysis buffer (Cell signaling # 9803) containing a protease inhibitor PMSF 100 mM. Protein samples were placed on ice for 20 minutes and then sonicated (15 seconds on / 10 seconds off cycles) for 4 minutes. Thereafter, centrifugation was performed at 12,000 g for 10 minutes, and after this was repeated twice, only the supernatant containing protein was obtained.
  • Cell signaling # 9803 Cell signaling # 9803
  • PMSF protease inhibitor
  • Protein concentration was measured using a Bio-Hard (Hercules, CA) protein assay sample, was added at 30 ⁇ g protein / lane ratio, and measured by spectrophotometry at 595 nm.
  • the soluble fraction (30 ⁇ g) was then added to a 12% SDS-polyacrylamide gel [30% Acrylamide, 1% Bis, 1 M Tris, 10% SDS, 10% APS and TEMED. ], At which time two gels were repeatedly separated. One gel from which the protein was separated was stained using Comassie Blue, and the other gel was separated from the nitrocellulose membrane by transfer buffer [48 mM Tris, 39 mM glycine, 20% MeOH]. and 0.037% SDS] was used for 1 hour at 90V constant.
  • the nitrocellulose membrane was then buffered with TBS (Tris-buffered saline) buffer containing blocking solution [0.1% (v / v) Tween 20 and 6% (w / v) skim milk powder to prevent nonspecific binding of the antibody. ].
  • TBS Tris-buffered saline
  • the blocked membrane reacted with rabbit-polyclonal IgG GABAB1, or rabbit-derived anti-rabbit GABAB1R antibody (1: 1000, Abcam Limited, UK) for 24 hours at 4 ° C. to induce an immune response.
  • goat anti-mouse and goat anti-rabbit IgG HRP (1: 10000, Bio-Rad) bound to horseradish peroxidase (HRP) were reacted at room temperature for 2 hours. Thereafter, proteins were detected by chemiluminescence using ECL detection reagents (Amersham Pharmacia Biotech, Western blotting detection reagents), and ECL detection was performed according to the protocol described in Amers
  • the inventors analyzed the density of the bands observed by Western blot using a computer-based sigma gel system (SPSS Inc. Chicago, USA) using a density meter, and the concentration of the bands was mean ⁇ standard error (SEM). ).
  • SEM standard error
  • composition containing osmotin and pentylenetetrazole may exhibit useful therapeutic effects in epilepsy, such as atypical seizure, which may be caused by overexpression of GABABR. To prove that it is.
  • composition comprising osmotin and pentylenetetrazole according to an embodiment of the present invention is useful for treating and preventing atypical colonic seizures caused by GABA receptor overexpression, following GABAB1R protein expression inhibition, substeps thereof Inhibition of the expression of the PKA protein and pCREB protein was observed.

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Abstract

본 발명은 GABA(gamma-aminobutyric acid) B 수용체 단백질의 과발현에 의하여 유발되는 신경질환의 예방 및 치료효과를 제공하기 위하여, 오스모틴(osmotin)과 GABA B 수용체 단백질 활성 또는 발현 억제제를 함유하는, 신경질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

Description

오스모틴 조성물 및 ＧＡＢＡ Ｂ 수용체 단백질 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 신경질환 치료제
본 발명은 신경질환 치료제에 관한 것으로서, 더 상세하게는 GABA B 수용체 단백질 발현 또는 활성 억제제와 오스모틴을 유효성분으로 포함하는 신경질환 치료제에 관한 것이다.
GABA(gamma-aminobutyric acid) B 수용체는 중추신경계 내에 폭 넓게 분포하면서 신경 활동을 조절하며, 특히 퇴행성 뇌 질환 및 병태생리학적 장애와 밀접한 관련이 있다. 예를 들어, GABA B 수용체의 과발현은 다운 증후군(Tyler K. et al., J. Neurophysiol., 97:892-900, 2007), 비정형 결신발작(Stewart LS, et al., Epilepsy Behav., 14(4):577-81, 2009), 알츠하이머(Palop JJ, et al., Neuron, 55: 697-711, 2007; Williams C., et al., PLoS One., 4(3):e4936, 2009), 우울증(Slattery DA., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 312(1):290-6, 2004) 등에 관련된다는 것이 알려져 있다.
그러나 상술한 신경질환에 있어서, GABA B 수용체와 관련한 분자생물학적인 기작은 밝혀진 바가 없다. 본 발명은 GABA B 수용체와 관련된 분자생물학적인 기작을 규명함으로써, GABA B 수용체 이상 발현에 의하여 유발되는 다양한 신경질환 예방 및 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 오스모틴(osmotin)과 GABA(gamma-aminobutyric acid) B 수용체 단백질 활성 또는 발현 억제제를 함유하는, 신경질환의 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.
상기 신경질환은 GABA B 수용체 과발현에 의하여 유발될 수 있으며, 비정형 결신발작, 알츠하이머, 우울증, 또는 퇴행성 뇌질환일 수 있다.
상기 GABA B 수용체 단백질 활성 억제제는 GABA B 수용체 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 또는 항체일 수 있다.
상기 GABA B 수용체 단백질에 상보적으로 결합하여 길항작용을 하는 화합물은 펜틸렌테트라졸(pentylenetetrazole), 파클로펜(phaclofen), 2-하이드록시사클로펜(2-Hydroxysaclofen), 사클로펜(saclofen), SCH-50911(CAS# 160415-07-6, 2-[(2S)-5,5-디메틸몰폴린-2-일]아세트산(2-[(2S)-5,5-dimethylmorpholin-2-yl]acetic acid)), CGP-35348(CAS# 123690-79-9, 3-아미노프로필(디에톡시메틸)포스핀산(3-aminopropyl(diethoxymethyl)phosphinic acid)), CGP-52432(CAS# 139667-74-6, 3-([(3,4-디클로로페닐)메틸]아미노]프로필) 디에톡시메틸)포스핀산(3-([(3,4-Dichlorophenyl)methyl]amino]propyl) diethoxymethyl)phosphinic acid)), CGP-55845(CAS# 149184-22-5, 또는 (2S)-3-([(1S)-1-(3,4-디클로로페닐)에틸]아미노-2-하이드록시프로필)(페닐메틸)포스핀산((2S)-3-([(1S)-1-(3,4-Dichlorophenyl)ethyl]amino-2-hydroxypropyl)(phenylmethyl)phosphinic acid))일 수 있다.
상기 GABA B 수용체 단백질 발현 억제제는 GABA B 수용체 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴크렐오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)일 수 있다.
이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 바람직하게는 오스모틴과 GABA B 수용체 단백질의 발현 또는 활성억제제를 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 추가로 GABA B 수용체 단백질의 발현 또는 활성 억제 물질과 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다.
상기 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 비경구 투여시 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 조사 또는 흉부내 주사에 의해 투여되 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 각각의 경구용 조성물은 제약상 허용되는 담체를 비롯한 불활성 성분을 추가로 포함한다.
실제 사용에 있어서, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물은 통상적인 제약 조제 기술에 따른 제약 담체와 조합될 수 있다. 담체는, 예를 들어 경구 또는 (정맥내 투여를 비롯한) 비경구 투여에 바람직한 제조에 따라 광범위하게 다양한 형태를 지닐 수 있다.
아울러, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
아울러, 본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 오스모틴 및 GABA B 수용체 단백질의 발현 또는 활성억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경질환의 치료방법이 제공된다.
상기 치료방법에 있어서, 상기 신경질환은 GABA B 수용체 과발현에 의하여 유발될 수 있으며, 비정형 결신발작, 알츠하이머, 우울증, 또는 퇴행성 뇌질환일 수 있다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, GABA B 수용체의 과발현에 의하여 유발되는 신경질환의 예방 및 치료효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 GABA B 수용체 발현 억제 효과를 웨스턴 블랏을 통하여 확인한 그림(도 1A) 및 웨스턴 블랏 밴드의 밀도를 계산한 그래프(도 1B)이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 GABA B 수용체의 하위 신호전달 단계인 PKA 단백질의 발현 억제 효과를 웨스턴 블랏을 통하여 확인한 그림(도 2A) 및 웨스턴 블랏 밴드의 밀도를 계산한 그래프(도 2B)이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 GABA B 수용체의 하위 신호전달 단계인 p-CREB 단백질의 발현 억제 효과를 웨스턴 블랏을 통하여 확인한 그림(도 3A) 및 웨스턴 블랏 밴드의 밀도를 계산한 그래프(도 3B)이다.
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 “안티센스 뉴클레오티드”는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 “펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)”는 GABA B 수용체 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드로서 GABA B 수용체 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기로는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al. Tetrahedron. Lett., 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al. J. Med. Chem., 29:295, 1986; 및 Ewenson et al., in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al. in Peptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 126:419 1985) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988)을 사용하여 생성할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 “siRNA 분자”는 센스 RNA와 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하고, 이때 센스 RNA가 GABA B 수용체 mRNA 중 일부의 연속 뉴클레오티드의 표적 서열과 동일한 핵산 서열을 포함하는 siRNA 분자인 것이 바람직하다. 상기 siRNA 분자는 GABA B 수용체 유전자의 염기서열 내에서 선택되는 10개 내지 30개의 염기로 구성되는 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정된 것은 아니며, GABA B 수용체 유전자의 염기서열을 대상으로 상보적으로 결합할 수 있는 센스 서열을 가진 이중가닥 RNA 분자라면 모두 사용 가능하다. 상기 안티센스 서열은 센스 서열과 상보적인 서열을 가지는 것이 가장 바람직하다.
본 문서에서 사용되는 “항체”는 항-GABA B 수용체의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 다클론 항체는 상기 GABA B 수용체를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al ., Nature , 256: 495-497, 1975; Kozbor D et al ., J. Immunol. Methods , 81: 31-42, 1985; Cote RJ et al ., Proc . Natl . Acad . Sci ., 80: 2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al ., Mol . Cell . Biol ., 62: 109-120, 1984). 또한, 상기 GABA B 수용체에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게 하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989). 상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.
본 문서에서 사용되는 “앱타머(Aptamer)”는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 압타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 압타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후(Ellington, AD and Szostak, JW., Nature 346: 818-822, 1990), 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 앱타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특히 “화학 항체”라고 할 만큼 대체항체로서의 높은 가능성이 있다.
본 명세서에서 사용된 "제약상 허용된 담체"란 조성물, 구체적으로 의약 조성물의 활성 물질을 제외한 성분을 지칭하는 용어이다. 제약상 허용되는 담체의 예로는 결합제, 붕해제, 희석제, 충진제, 활택제, 가용화제 또는 유화제 및 염이 포함된다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 도면에 도시된 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 도면에 도시된 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 또한 설명의 편의를 위하여 도면에서는 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 GABA B 수용체 발현 억제 효과를 웨스턴 블랏을 통하여 확인한 그림(도 1A) 및 웨스턴 블랏 밴드의 밀도를 계산한 그래프(도 1B)이다. GABA B 수용체 단백질의 과발현은 다양한 신경질환을 매개한다는 것이 알려져 있으나, 그 정확한 기작에 대하여 밝혀진 바가 없다. 이에, 본 발명자는 GABA B 수용체 과발현과 관련된 기작 및 이를 억제할 수 있는 조성물을 통하여 GABA B 수용체 단백질의 과발현에 매개된 질환의 예방 및 치료 효과를 구현하고자 하였다. SD 랫트의 대뇌 피질 및 해마 조직으로부터 수득한 조직을 1차 배양한 후, 무처리군(C), 에탄올 처리군(E), 오스모틴 처리군(O), 펜틸렌테트라졸(P), 오스모틴+에탄올 처리군(O+E), 및 오스모틴+펜틸렌테트라졸 처리군(O+PTZ)으로 각 군에 따른 약물을 처리한 후, GABA B 수용체 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 이용하여 확인하였다. 그 결과, GABA B 수용체 단백질의 발현이 오스모틴과 펜틸렌테트라졸을 각각 처리하였을 때에 비하여, 오스모틴과 펜틸렌테트라졸을 함께 처리하였을 때 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 오스모틴의 경우 본 발명자의 종래 연구를 통하여 신경 세포 사멸억제 효과가 알려져 있으나(대한민국 공개특허 2011-0085260), GABA B 수용체 과발현 억제 효과는 알려져 있지 않다. 펜틸렌테트라졸의 경우, 일반적인 간질 유발물질로 GABA A 수용체 발현 감소를 특징으로 하는 간질 동물 모델을 제조하는데 이용된다는 것이 알려져 있으나(O.Carter Snead Ⅲ, et al., J. Neurosci., 20(16): 6218-6224, 2000), GABA B 수용체 단백질의 발현 억제와 관련되어서는 그 효과가 알려져 있지 않다. 즉, 상기 결과는 오스모틴과 펜틸렌테트라졸을 포함하는 조성물을 GABA B 수용체 단백질 과발현에 의하여 유발된 신경질환의 예방 및 치료에 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 오스모틴과 펜틸렌테트라졸 각각을 개별적으로 처리한 경우보다 두 화합물을 병용처리할 경우 상승효과가 있음을 최초로 입증한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 GABA B 수용체의 하위 신호전달 단계인 PKA 단백질의 발현 억제 효과를 웨스턴 블랏을 통하여 확인한 그림(도 2A) 및 웨스턴 블랏 밴드의 밀도를 계산한 그래프(도 2B)이다. 본 발명자는 GABA B 수용체 단백질 과발현에 의하여 유발되는 질환의 분자생물학적 기작을 규명하기 위하여, GABA B 수용체의 하위 단계로 알려진 PKA 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과, PKA 단백질의 발현은 오스모틴(O), 오스모틴+펜틸렌테트라졸(O+PTZ), 및 펜틸렌테트라졸(PTZ)의 순서로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 GABA B 수용체의 하위 신호전달 단계인 p-CREB 단백질의 발현 억제 효과를 웨스턴 블랏을 통하여 확인한 그림(도 3A) 및 웨스턴 블랏 밴드의 밀도를 계산한 그래프(도 3B)이다. 상기 도 2의 실험에 이어, 본 발명자는 GABA B 수용체의 하위 단계로 알려진 p-CREB 단백질의 발현을 관찰하였으나, 오스모틴(O), 펜틸렌테트라졸(PTZ) 및 오스모틴+펜틸렌테트라졸(O+PTZ) 군 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 동물사육
암컷(n=20) 스프래그 다우리(Sparague-Dawley) 랫트(250 g, 경상대학교, 신경생물학 실험실)는 온도가 조절되며, 명주기(6:00-20:00), 자유식이 조건에서 사육하였다. 수정된 날을 임신 0.5일로 계산하고, 임신 후 17.5일(GD 17.5일)째에 정맥으로 펜토바르비탈 나트륨(pentobarbital sodium)을 3 mg/100 g 체중의 비율로 투여한 후, 머리를 절단(decapitation)하여 희생시켰다.
실시예 2: 대뇌 피질 세포의 1차 배양(primary cell culture)
상기 실시예 1에서 희생시킨 임신 암컷 스프래그 다우리 랫트로부터 얻은 GD 17.5일 된 배아의 대뇌 피질 및 해마 조직을 분리하였다. 상기 분리된 대뇌 피질 및 해마 조직은 0.25% 트립신 EDTA를 20분 동안 처리하고, 차가운 칼슘과 마그네슘이 포함되지 않은 pH 7.4의 행크 버퍼(Hank’s buffer)에서 파이펫팅을 통하여 물리적으로 조직을 세포 단위로 분리시킨 후, 원심분리를 수행하였다. 원심분리를 통해서 펠렛화된 세포를 0.02 g/l 폴리-라이신(poly-lysine)을 이용하여 코팅된 플레이트(plate)와 챔버 슬라이드(chamber slide)에 1x106 세포/ml의 비율로 심었다.
이때, 배지는 열처리로 불활성시킨 10% FBS(fetal bovine serum), 1 mM 피루베이트(pyruvate), 4.2 mM 탄화수소나트륨(sodium bicarbonate), 20 mM HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 0.3 g/l 소혈청알부민(bovine serum albumin), 50 U/ml 페니실린(penicillin), 및 50 mg/l 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)을 이용하였다. 세포는 5% CO2 조건의 습기가 있는 37℃ 조건에서 배양되었다. 신경아교세포(Neuroglia)가 배양되지 못하도록, 100 μM 시토신 β-D-아라비노 퓨라노사이드 (cytosine β-D-Arabino Furanoside)(Sigma, USA)를 첨가한 배지에 12시간 동안 배양하였다. 12시간이 경과한 후, 상술한 배지로 교환하였다. 4일이 경과한 후, 대뇌피질 및 해마 신경세포는 100 mM 에탄올 처리군(E, 음성대조군), 오스모틴 0.08 μM 처리군(O, 양성대조군), 20 mM 펜틸렌테트라졸 처리군(PTZ, 실험군 1), 0.08 μM 오스모틴 + 20 mM 펜틸렌테트라졸 처리군(O+PTZ, 실험군 2), 0.08 μM 오스모틴 + 100 mM 에탄올 처리군(O+E, 비교군 1)으로 나누어 약물을 처리하였다(표 1 참조). 모든 약물은 공통적으로 세포 배양시 24시간 동안 처리하였다.
표 1 약물처리에 따른 실험군
처리 약물 및 처리량
대조군 무처리군 (C)
음성대조군 에탄올 100 mM 처리군(E)
양성대조군 오스모틴 0.08 M 처리군 (O)
실험군 1 펜틸렌테트라졸 20 mM 처리군(PTZ)
실험군 2 오스모틴 0.08 M + 펜틸렌테트라졸 20 mM 처리군(O+PTZ)
비교군 1 오스모틴 0.08 M + 에탄올 100 mM 처리군(O+E)
실시예 3: 오스모틴의 정제
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에 함유되는 오스모틴은 salt-adapted된 담배배양세포(Nicotiana tabacum L. var. Wisconsin 38)로부터 99%이상의 순도로 분리하였다(Yun et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA., 94(13): 7082-7, 1997; Yun DJ, et al , Mol . Cell ., 1(6): 807-17, 1998).
실험예 1: GABAB1R 단백질 발현 억제 효과
본 발명의 일 실시예에 따른 오스모틴과 펜틸렌테트라졸을 함유하는 조성물의 GABAB 수용체의 과발현으로 인하여 유발되는 이상간질, 인지관련 장애 치료 및 예방 효과를 입증하기 위하여, 상기 실시예 1, 2를 통하여 수득된 랫트의 대뇌 및 해마 세포를 배양한 후, 상기 표 1에 기재된 약물을 24시간 동안 처리하였다. 그 후, GABA1B 수용체의 발현을 웨스턴 블랏을 통하여 확인하였다.
우선, 상기 실시예 2에서 1차 배양된 대뇌 피질 및 해마 세포를 프로테아제 억제제인 PMSF 100 mM이 포함된 세포 용해 버퍼(Cell signaling #9803)를 이용하여 균질화하였다. 단백질 시료는 아이스 위에서 20분 동안 놓았다가, 4분 동안 초음파 처리(15초 on/10초 off 주기)하였다. 그 후, 12,000g에서 10분 동안 원심분리를 수행하였으며, 이를 2회 반복한 후, 단백질을 포함하는 상층액만을 수득하였다.
단백질의 농도는 바이오-래드(Hercules, CA) 단백질 분석시료를 이용하여 측정하였으며, 30 μg 단백질/레인(lane)의 비율로 넣은 후, 595 nm에서 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정되었다.
그 후, 용해성 분획물(30 μg)을 12% SDS-폴리아크릴아마이드 젤[30% 아크릴아마이드(Acrylamide), 1% 비스(Bis), 1 M 트리스(Tris), 10% SDS, 10% APS 및 TEMED]에서 분리시켰으며, 이때 젤 2개에 반복하여 분리시켰다. 상기 단백질이 분리된 젤 하나는 코마시 블루(Comassie Blue)를 이용하여 염색하였으며, 나머지 젤은 나이트로 셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인에 분리된 단백질을 트랜스퍼 버퍼[48 mM Tris, 39 mM glycine, 20% MeOH and 0.037% SDS]를 이용하여 1시간 동안 90V constant의 조건에서 이동시켰다. 그 후, 상기 나이트로 셀룰로오스 멤브레인은 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 블로킹 용액[0.1% (v/v) 트윈 20과 6%(w/v) 탈지분유가 함유된 TBS(Tris-buffered saline) 버퍼]과 반응시켰다. 상기 블로킹된 멤브레인은 래빗-다중클론성 IgG GABAB1, 또는 래빗-유래 안티-래빗 GABAB1R 항체(1:1000, Abcam Limited, UK)를 이용하여 4℃에서 24시간 동안 반응시켜 면역반응을 유발하였다. 항체를 제거한 후, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 염소 항-마우스와 염소 항-래빗 IgG HRP(1:10000, Bio-Rad)과 상기 나이트로셀룰로오스 멤브레인을 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, ECL 검출 시약(Amersham Pharmacia Biotech, Western blotting detection reagents)을 이용한 화학발광방법에 의하여 단백질을 검출하였으며, ECL 검출은 Amersham에 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다.
그 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이, GABAB1R 단백질 발현이 오스모틴과 펜틸렌테트라졸의 단일 성분을 처리할 때에 비하여, 상기 두 약물을 함께 처리하였을 때 현저하게 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이어, 본 발명자는 웨스턴 블랏 결과 관찰되는 밴드의 진하기 정도는 컴퓨터 기반의 시그마 겔 시스템(SPSS Inc. Chicago, USA)을 이용하여 밀도계로 분석하였으며, 밴드의 진하기 정도는 평균 ± 표준오차(SEM)의 수치로 나타냈다. 실험군 사이의 유의성을 분석하기 위하여, Tukey-Kramer 다중 비교 테스트에 따른 One-way ANOVA 분석을 수행하였다. 모든 실험에서, P<0.05 이하일 때 통계적 유의성이 있다고 판단하였다.
그 결과, 오스모틴과 펜틸렌테트라졸 단일 성분을 처리하였을 때 관찰되는 GABA1BR 단백질의 발현은 대조군(C)에 비하여 감소하였으나, 상기 실험군 사이의 발현정도는 유사하였으며, 오스모틴과 펜틸렌테트라졸을 함께 처리한 군은 단일 약물을 처리한 군에 비하여 약 7~8배 발현수준이 낮은 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 GABABR 의 과발현에 의하여 유발될 수 있는 비정형 결신발작(absence seizure)와 같은 간질에 있어서 본 발명의 일 실시예에 따른 오스모틴과 펜틸렌테트라졸을 포함하는 조성물이 유용한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 입증하는 것이다.
실험예 2: GABAB1R 하위 단계 단백질 발현 억제 효과
본 발명의 일 실시예에 따른 오스모틴과 펜틸렌테트라졸을 포함하는 조성물이 GABA 수용체 과발현에 의하여 유발되는 비정형 결신발작 치료 및 예방에 유용한지 확인하기 위하여, GABAB1R 단백질 발현 억제에 이어, 이의 하위 단계인 PKA 단백질 및 pCREB 단백질의 발현 억제 여부를 관찰하였다.
상기 실험예 1과 동일한 조건으로 세포를 배양하고 약물을 처리한 후, 웨스턴 블랏을 통하여 PKA 단백질의 발현 수준을 확인하였다. 웨스턴 블랏 실험 조건을 상기 실험예 1과 동일하며, 항체로 p-CREB 및 PKA-α 항체(1:1000, Santa Cruz, Cell signaling)를 이용하였다는 점만 상이하였다.
그 결과, 오스모틴과 펜틸렌테트라졸을 함께 처리한 군에서 GABA B 수용체 단백질의 발현 억제 효과와 달리, PKA 및 p-CREB 단백질의 발현은 단일 약물에 비하여 현저히 억제되는 경향을 나타내지 않았다. PKA의 경우, 오스모틴(O), 오스모틴+펜틸렌테트라졸(O+PTZ), 및 펜틸렌테트라졸(PTZ)의 순서로 발현이 감소하였으며, p-CREB의 경우 상술한 3개의 실험군 사이에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 오스모틴과 펜틸렌테트라졸을 포함하는 조성물에 의한 GABA B 수용체 과발현에 의하여 유도되는 신경질환의 치료에 매개되는 분자생물학적 기작에 대하여 연구가 더 요구됨을 의미한다.
본 발명은 상기 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (8)

  1. 오스모틴(osmotin)과 GABA(gamma-aminobutyric acid) B 수용체 단백질 활성 또는 발현 억제제를 함유하는, 신경질환의 예방 및 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신경질환은 GABA B 수용체 과발현에 의하여 유발되는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 GABA B 수용체 과발현에 의하여 유발되는 신경질환은 비정형 결신발작, 알츠하이머, 우울증, 또는 퇴행성 뇌질환인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 GABA B 수용체 단백질 활성 억제제는 GABA B 수용체 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 또는 항체인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 GABA B 수용체 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물은 펜틸렌테트라졸(pentylenetetrazole), 파클로펜(phaclofen), 2-하이드록시사클로펜(2-Hydroxysaclofen), 사클로펜(saclofen), SCH-50911(CAS# 160415-07-6), CGP-35348(CAS# 123690-79-9), CGP-52432(CAS# 139667-74-6), 또는 CGP-55845(CAS# 149184-22-5)인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 GABA B 수용체 단백질 발현 억제제는 GABA B 수용체 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴크렐오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)인, 조성물.
  7. 치료적으로 유효한 양의 오스모틴 및 GABA B 수용체 단백질의 발현 또는 활성억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경질환의 치료방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 신경질환은 GABA B 수용체 과발현에 의하여 유발될 수 있으며, 비정형 결신발작, 알츠하이머, 우울증, 또는 퇴행성 뇌질환인, 치료방법.
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