KR102200605B1

KR102200605B1 - 기분 장애 예방 또는 치료를 위한 Npas4 유전자 및 이를 이용한 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102200605B1
Application number: KR1020190052980A
Authority: KR
Inventors: 고재원; 엄지원; 김승준
Original assignee: 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2021-01-11
Also published as: KR20200129223A

Abstract

기분 장애 예방 또는 치료를 위한 Npas4 유전자 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따르면, Npas4(neuronal PAS domain protein 4) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 기분 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 Npas4 유전자를 이용하여 기분장애의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

기분 장애 예방 또는 치료를 위한 Npas4 유전자 및 이를 이용한 스크리닝 방법 {Npas4 gene for treating or preventing mood disorders and screening methods using the same}

기분 장애 예방 또는 치료를 위한 Npas4 유전자 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

우울증은 감정을 조절하는 뇌의 기능에 변화가 생겨 '부정적인 감정'이 나타나는 병으로, 침체된 기분이 널리 퍼져 일상생활에서의 흥미나 기쁨을 상실한 상태로 자포자기, 절망, 무가치감, 자해 생각 등의 증상이 나타난다. 또한, 주의 집중 장애, 사고와 행동의 이상, 불면, 식욕부진 혹은 두통, 다른 형태의 국소 통증까지 현저한 신체 증상을 동반하기도 한다. 이러한 우울증은 특히 최근에 심각한 사회적 문제로 대두되고 있다.

우울증의 전 세계 1억명 이상이 앓고 있다고 보고되어 있으며, 평생유병률은 남성 5~12%, 여성 10~25% 정도로 높다. World Health Organization(WHO) 보고에 따르면 2020년에는 우울증이 허혈성 심장 질환에 이어 전 세계 유병율 2위의 질환이 될 것으로 예측되고 있어 우울증 치료의 필요성은 점차 커지고 있다.

현재 우울증의 원인으로 가장 널리 인정되고 있는 가설은 모노아민(monoamine)계의 불균형이다. 특히, 세로토닌(serotonin)과 노르에피네프린(norepinephrine)의 부족은 우울증 발병의 주요 원인으로 여겨지고 있다. 따라서, 우울증을 치료하기 위해 현재는 주로 위 물질들의 양을 늘려주는 방향으로 약물을 투여하고 있다(한국공개특허 10-2010-0030679 A). 그러나, 이러한 약물 치료는 기립성 저혈압, 변비, 입마름, 지연뇨, 성기능 장애 등의 부작용을 나타내게 된다. 또한, 약물 치료를 받은 환자들이 균일하지 못한 반응을 보이고 있어, 새로운 약물의 필요성이 점차 대두되고 있다.

일 양상은 Npas4(neuronal PAS domain protein 4) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 기분 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 기분 장애의 치료를 위한 후보물질을 접촉시킨 세포에서 Npas4(neuronal PAS domain protein 4) 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 Npas4 단백질의 발현 또는 활성 수준을 후보물질과 접촉시키지 않은 대조구 세포의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 기분 장애 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 Npas4(neuronal PAS domain protein 4) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 기분 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "예방(prevention)"은 상기 조성물의 투여로 기분 장애의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 용어, "치료(treatment)"는 질병을 앓거나 또는 질병이 발병할 위험이 있는 개체에게, 상기 개체의 상태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 질병 진행의 지연, 증상 발생의 지연 또는 증상 진행의 둔화 등을 포함한 효과를 제공하는 임의의 형태의 치료를 의미한다. 따라서, 상기 "치료" 및 "예방"은 증상의 치유 또는 완전한 제거를 의미하도록 의도되지 않는다.

상기 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

상기 약학적 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인, "기분 장애 (mood disorder)"는 2000년 (DSM-IV-TR) 및 2013년 (DSM-5)에 각각 발행된 정신 장애의 진단 및 통계 매뉴얼, 제4판 또는 제5판 (the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth or Fifth Editions)에서 기분 장애로 정의된 병태를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 기분 장애는 우울장애(depressive disorder)와 양극성장애(bipolar disorder)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어 주요 우울 장애, 지속성 우울 장애, 파괴적 기분조절부전 장애, 월경전 불쾌감 장애, 다른 의학적 상태로 인한 우울 장애, 물질 또는 약물치료로 유발된 우울 장애, 제1형 양극성 장애, 제2형 양극성 장애, 순환성 장애, 물질 또는 약물치료로 유발된 양극성 장애 또는 다른 의학적 상태로 인한 양극성 장애일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "Npas4(neuronal PAS domain protein 4) 단백질"11번 염색체의 11q13.2 밴드에 존재하는 Npas4 유전자에 의해 발현되는 단백질을 의미한다. 신경 세포의 활동은 포유류의 뇌에서 흥분성 및 억제성 시냅스의 발달과 성숙을 조절하며, 최근 여러 연구에서 흥분성 시냅스 발달을 조절하는 뉴런 내 신호 전달 네트워크가 확인되었다. 그러나, GABA(γ-aminobutyric acid)방출 억제성 시냅스의 활성 의존성 발달을 조절하는 분자 기작에 대해서는 알려진 바가 적다. 따라서 본 발명자들은 Npas4 유전자에 의한 항우울 행동 변화 및 GABA 방출 억제성 시냅스에 대한 효과를 연구하고, Npas4 유전자의 발현이 Somatostatin-양성 GABA성 개재뉴런에 특이적으로 영향을 미치는 것을 확인하였다. 한편, 상기 Npas4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 서열은 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 수득할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "단백질"은 "폴리펩타이드" 또는 "폴리펩티드"와 동일한 의미로 사용될 수 있으며, 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭한다. 단백질은 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는, 자연 발생한 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 폴리머, 뿐만 아니라 자연 발생한 아미노산 폴리머, 변형된 잔기를 함유하는 것들, 및 비-자연 발생한 아미노산 폴리머에 적용된다.

본 명세서에서 용어, "낙아웃"은 유전자의 결손이 유발된 DNA를 외부에서 도입하여 정상 유전자에 완전 불활성화를 유도하는 것을 의미하며, 용어, "낙다운"은 예를 들어, RNAi 등을 이용해서 발현하는 mRNA를 퇴화(degradation)시켜서 유전자 발현량을 줄이는 것을 의미한다.

상기 Npas4 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 Npas4 단백질의 기능을 저해 또는 방해하는 물질을 의미한다. 이와 같은 저해 또는 방해는 Npas4 유전자의 전사를 방해하거나, 또는 Npas4 유전자의 mRNA의 번역을 저해함으로써 이루어질 수 있다. 또는 Npas4 단백질의 활성 부위에 특이적으로 결합하거나, 단백질 구조 변형을 일으킴으로써, Npas4 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화시킬 수 있다.

Npas4 단백질의 발현 억제제는 Npas4 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있다. 상기 활성의 억제제는 유전적으로 조작되지 않은 모세포(예, 야생형)가 갖지 않는 또는 갖는 내재적 활성에 비해, 동일한 타입의 활성이 보다 더 낮도록 만드는 물질을 의미할 수 있다. Npas4 단백질의 활성 억제제는 Npas4 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체, 또는 천연물일 수 있다.

상기 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록이고, 본 발명의 목적을 위하여 천연 발생 및 비-천연 발생 뉴클레오티드를 둘 다 포함한다. 천연적으로, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는 리보스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트 기(뉴클레오시드에는 부재함)를 포함한다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "단위" 또는 "단량체"와 상호교환적으로 지칭될 수 있다.

상기 "상보적으로 결합"하는 것의 의미는 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭(Watson-Crick)의 염기 쌍과 관련이 있다. 왓슨-크릭 염기 쌍은 구아닌(G)-시토신(C) 및 아데닌(A)-티민(T)/우라실(U)이다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어 5-메틸 시토신이 종종 시토신 대신에 사용된다. 상기 용어 "상보적으로 결합"은 비-변형된 핵염기와 변형된 핵염기 사이의 왓슨-크릭 염기-결합을 포함할 수 있다.(예를 들어, 문헌[Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 문헌[Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1] 참고).

상기 안티센스 뉴클레오티드는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로 정의된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중가닥이 아니고, 이에 따라 siRNA 또는 shRNA가 아니다.

상기 용어, "작은 간섭 RNA"는 유전자의 활성을 억제하는 RNAi(RNA interference)를 유발시킬 수 있는 RNA를 의미한다. 상기 작은 간섭 RNA는 Npas4 유전자의 발현을 억제할 수 있는 miRNA, siRNA 등이 될 수 있는데, 상기 작은 간섭 RNA는 Npas4 유전자의 발현 또는 활성을 억제시키기만 하면 어떠한 형태의 것도 가능하다. 예를 들면, 화학합성 또는 생화학적 합성 또는 생체 내 합성에 의해 수득되는 siRNA, 혹은 약 40개 염기 이상의 이중가닥 RNA가 체내에서 분해된 10개 염기 이상의 이중가닥 RNA 등을 사용할 수 있다.

상기 "앱타머"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로, 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다.

상기 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법을 거쳐 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 또는 Fv 등이 될 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 억제성 시냅스에 특이적으로 작용하는 것일 수 있다. 상기 억제성 시냅스(inhibitory synapse)는 시냅스전 신경세포에서의 활동전위(action potential)로부터 시냅스후 세포에서 활동전위가 발생하는 확률을 감소시키는 시냅스를 의미한다. 신경세포는 각각의 신경세포가 다른 세포와 수많은 신경자극(nerve impulses)이 이동하는 네트워크를 형성한다. 이러한 전기적 신호는 흥분성 또는 억제성일 수 있으나, 전체 억제성 영향이 전체 흥분성 영향보다 큰 경우, 신경세포가 억제될 수 있다. 즉, 신경세포의 축삭소구(axon hillock)에서 새로운 활동전위의 생성이 억제된다. 이러한 현상을 억제성 시냅스후 전위(inhibitory postsynaptic potential; IPSP)라 한다. 활동전위는 전기적 시냅스에서와 같이 세포 간의 직접적인 접촉을 통해서(예컨대, 간극결합을 통해; via gap junction) 발생할 수 있다. 그러나 가장 일반적으로는 화학적 시냅스에서와 같이 시냅스전 축삭 말단으로부터 시냅스 틈새(cleft)로 신경전달물질(neurotransmitter)의 소포성 방출(vesicular release)을 통해 발생한다. 억제성 신경전달물질은 시냅스후 신경세포의 수지상극(dendritic spine)으로 확산을 통해 이동하여 해당 세포의 탈분극을 억제하는 특정 막관통 수용체 단백질(transmembrane receptor protein)에 결합할 수 있다.

해마는 Dentate gyrus(DG)와 Hippocampus proper 등의 구조로 이루어진다고 알려져 있으며, Dentate gyrus는 granule cell layer(GCL), molecular layer(ML)을 포함하고, Hippocampus proper는 CA1, CA2, CA3, CA4와 같은 구조를 포함한다. 상기 CA1은 해마 회로의 첫 번째 영역이며, Stratum oriens(SO), Stratum pyramidale(SP), Stratum radiatum과 같은 구조를 포함한다. 일 실시예에 따르면, 상기 Npas4 단백질은 상기 CA1 SO층에 특이적으로 작용하여 항우울 효과를 나타내는 것일 수 있다. 특히, 상기 Npas4 단백질은 SO 층의 SST-양성 개재뉴런에 특이적으로 작용하는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 IQSEC3 유전자의 프로모터에 작용하는 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면, SST-양성 GABA성 개재뉴런의 특이적 활성화는 IQSEC3 유전자의 발현에 의존적임을 확인하였다. 즉, Npas4 발현의 억제에 의한 SST-양성 GABA성 개재뉴런의 억제성 시냅스 비활성화, 및 이에 따른 항우울 행동의 발현은 IQSEC3 유전자의 발현과 높은 상관 관계를 보였다.

일 실시예에 따르면, Npas4 유전자를 특이적으로 낙다운(knock-down) 또는 낙아웃(knock-out)한 실험쥐에서, 기분 장애 감소의 표현형을 나타냈으며, 특히, 이러한 효과는 행동학적으로 기억력과 같은 다른 표현형에는 영향없이 기분 장애에 관련하여, 특이적으로 나타났다. 따라서, Npas4 유전자의 발현 또는 활성 억제는 기분 장애 질병을 특이적으로 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피내 또는 경구를 통해 투여될 수 있다. 달리, 상기 약제는 경구 투여 또는 표적 기관에 직접적으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 연령, 성별, 식이, 건강상태 및 체중, 투여시간, 투여방법, 배설률, 질환의 중증도, 병행치료의 종류, 치료의 빈도 및 원하는 효과의 성질 등에 비추어 결정될 수 있으며, 그 범위가 다양하다. 또한, 치료되는 질환, 부위-특이적 치료의 필요성, 투여되는 약물의 양과 같은 조건들을 고려하여 전신적 또는 국소적으로 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 임의의 약학적 제형을 가질 수 있다. 예를 들면, 정제, 캡슐, 환제, 분말, 서방성 제형, 용액, 또는 현탁액으로서의 경구 투여에 적합한 형태이거나, 멸균 용액, 현탁액 또는 유화액으로서의 비경구 주사에 적합한 형태이거나, 연고 또는 크림으로서의 국소 투여에 적합한 형태이거나, 또는 좌제로서의 직장 투여에 적합한 형태일 수 있다. 상기 조성물은 정제, 환제, 주사제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 정확한 투여량을 단일 투여하기에 적합한 단위 투여형일 수 있다.

상기 약학적 조성물을 제공하거나 약학적 조성물을 이용하여 질환의 치료를 수행함에 있어서, 상기 약학적 조성물은 단독으로 또는 조합하여, 또는 다른 치료제 또는 진단제와 조합하여 사용할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 일반적으로 허용되는 의학적 관행에 따라 의도된 질환에 대해 전형적으로 처방되는 다른 약제와 동시 투여될 수 있다. 예를 들어, 시탈로프람, 플루옥세틴, 플루복사민, 파록세틴, 설트랄린, 벤라팍신, 둘록세틴, 트라조돈, 네파조돈, 미르타자핀, 아미트리프틸린, 클로미프라민, 독세핀, 이미프라민, 데시미프라민, 노르트리프틸린, 또는 부프로피온일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 약학적 조성물은 일반적으로 포유동물, 예를 들면, 인간의 생체 내(in vivo)에서 이용될 수 있다.

다른 양상은 개체에 상기 Npas4 단백질의 발현 또는 활성 억제제, 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 기분 장애의 치료방법; 및 기분 장애의 치료 또는 기분 장애 치료제를 제조하기 위한, 상기 Npas4 단백질의 발현 또는 활성 억제제 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 의약적 용도를 제공한다.

또 다른 양상은 기분 장애의 치료를 위한 후보물질을 접촉시킨 세포에서 Npas4(neuronal PAS domain protein 4) 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 Npas4 단백질의 발현 또는 활성 수준을 후보물질과 접촉시키지 않은 대조구 세포의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 기분 장애 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 스크리닝하는 방법에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.

본 명세서에서 용어, "후보 물질"은 상술한 바와 같은 Npas4 단백질의 발현 또는 활성을 억제시킬 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme), 또는 당 및 지질 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 구체예에서 있어서, 상기 세포는 Npas4 단백질 또는 이의 전구체를 포함하는 세포일 수 있고, 해마 CA1 Stratum Oriens의 SST(somatostatin)-양성 뉴런으로부터 유래하는 것일 수 있다.

상기 방법에서, "접촉(Contacting)"은 일반적인 의미이며, 2개 이상의 제제(예를 들어, 2개 폴리펩티드)를 결합시키거나, 제제와 세포(예를 들어, 단백질과 세포)를 결합시키는 것 등을 지칭할 수 있다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나, 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시킬 수 있다. 또한, 접촉은 세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpression)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시킬 수 있다. 또한 테스트하고자 하는 단백질이 고정상의 표면에 배열된 단백질 칩(protein chip)이나 단백질 어레이(protein array)를 이용할 수도 있다.

상기 방법에서, 후보물질을 접촉시킨 세포에서 측정된 Npas4 단백질의 발현 수준이 비접촉된 대조군에 비해 감소된 경우, 기분 장애 치료제로 결정 또는 선정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 발현 수준의 변화는 Npas4 단백질의 발현 수준이 비처리된 대조군 또는 음성 대조군에 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 기분 장애 치료제는 억제성 시냅스의 활성을 특이적으로 조절하는 것일 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 기분 장애 치료제는 억제성 시냅스의 활성을 특이적으로 조절하는 방법에 의해 스크리닝되는 것일 수 있다.

상기 Npas4 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계는 당업계에서 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블랏팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩(protein chip), 또는 효소 활성 평가 등이 사용될 수 있다.

상기 Npas4 단백질의 발현 또는 활성 수준의 측정은 시냅스에서 신경전달물질의 농도를 이용해서 측정할 수도 있으며, 상기 신경전달물질은 글루탐산, 글리신, 콜레시스토키닌, 엔케파린, 신경펩타이드 Y, 아세틸콜린, 노르에피네프린, 도파민, 세로토닌, 또는 히스타민일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에서, IQSEC3 단백질의 발현 또는 활성 수준을 후보물질과 접촉시키지 않은 대조구 세포의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 후보물질을 접촉시킨 세포에서 측정된 IQSEC3 단백질의 발현 수준이 비접촉된 대조군에 비해 감소된 경우, 기분 장애 치료제로 결정 또는 선정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 발현 수준의 변화는 IQSEC3 단백질의 발현 수준이 비처리된 대조군 또는 음성 대조군에 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.

일 양상에 따르면, Npas4(neuronal PAS domain protein 4) 단백질의 낙아웃 실험쥐를 제작하여 행동 실험을 수행한 결과, 기분 장애 행동 양상이 정상 실험쥐에 비해 현저하게 감소되어 있음을 확인하였다. 따라서, Npas4 유전자의 발현 조절은 기분 장애 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 기분 장애 치료제를 스크리닝하는 방법에도 적용할 수 있다.

도 1의 (A)는 오픈 필드 테스트(open field test)에서 실험쥐의 운동 경로를 나타낸 것이고, (B) 내지 (E)는 각각 총 이동거리, 이동속도, 중앙(center)에 머문 시간, 빈도를 나타낸 것으로서, Npas4 낙아웃 실험쥐의 항우울 행동 양상을 확인한 결과이다.
도 2는 강제 수영 테스트(forced swim test: FS test)로 (A)는 부동시간(Immobility time), (B)는 부동성에서의 지연(Latency to immobility)을 나타낸 것으로서, Npas4 낙아웃 실험쥐의 항우울 행동 양상을 확인한 결과이다.
도 3은 신 물체 인식 테스트(novel object recognition test)의 결과를 나타낸 것으로, (A)는 실험 과정을 설명하고 있고, (B)는 차별 지수(Discrimination index), (C)와 (D)는 각각 훈련 기간(training phase)과 테스트 기간(testing phase)에서 각 물체의 탐사 시간(Exploration time)을 나타낸 것으로써, Npas4 낙아웃 실험쥐의 기억력이 대조군과 유의한 차이가 없음을 확인한 결과이다.
도 4a는 루시퍼라제의 발현 양상을 나타낸 것이고, 도 4b는 전기영동 이동성 변화분석을 나타낸 것으로, Npas4 단백질이 IQSEC3 유전자의 DNA 결합 전사 활성인자로써 작용함을 확인한 결과이다.
도 5a는 면역 조직 화학 염색을 통하여 IQSEC3-양성 세포 수를 나타낸 것이고, 도 5b는 IQSEC3의 영역에 따른 효과를 나타낸 것으로서, Npas4에 의해 발현이 증가된 IQSEC3가 SST-양성 GABA성 개재뉴런에서 특이적인 효과가 나타남을 확인한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Npas4와 항우울 행동의 연관성 확인

1-1. 오픈 필드 테스트(open field test: OF test)

Npas4 KO 실험쥐에서 Npas4 유전자가 항우울 행동과 연관성이 있는지 확인하기 위하여, 오픈 필드 테스트를 수행하였다.

구체적으로, 실험쥐를 흰색의 아크릴로 된, 오픈 필드 테스트를 위한 상자(가로 40cm, 세로 40cm, 높이 40cm)에 놓았다. 그리고 0 lux의 어둠 속에서 60분 동안 자유롭게 움직이게 하였다. 실험 시간 동안 움직인 총 거리와 중심 부위(center zone)에서 머문 시간을 top-view 적외선 카메라로 기록하였고, EthoVision XT 10 software (Noldus)를 사용하여 분석하였다. 실험쥐는 우울함이 감소하면 운동 능력의 증가로 탐색 행동 또한 증가하게 되는 반면, 우울함이 증가하면 운동 능력이 떨어지게 되어 오픈 필드에서 벽면에 가까이 머물러있게 된다.

그 결과, 도 1의 (A)에 나타낸 바와 같이, 대조군(Control)과 Npas4 KO 실험쥐를 비교한 결과, Npas4 KO 실험쥐의 항우울 유사 행동이 증가하였음을 관찰할 수 있었다. 또한 도 1의 (B) 및 (C)에 나타낸 바와 같이, 대조군(Control)과 Npas4 KO 실험쥐를 비교한 결과, Npas4 KO 실험쥐에서 총 이동거리(Total distance) 및 이동속도(Velocity)의 유의한 증가를 관찰할 수 있었다. 따라서, Npas4 유전자의 억제가 항우울 행동과 연관되었음을 확인할 수 있었다.

1-2. 강제 수영 테스트(forced swim test: FS test)

Npas4 KO 실험쥐에서 Npas4 유전자가 항우울 행동과 연관성이 있는지 확인하기 위하여, 강제 수영 테스트를 수행하였다.

구체적으로, 직경 15cm, 높이 30cm의 투명한 유리 원통을 준비하였다. 상기 원통에 15cm 높이로 수온 24±1℃의 물을 채운 후 실험쥐를 넣었다. 모든 실험쥐는 물 위에서 6분 동안 강제로 수영하도록 하며, 테스트의 마지막 4분 동안에는 부동자세의 지속 시간(duration of immobility)을 기록하고 측정하였다. 부동자세의 지속 시간은 실험쥐가 활발히 원통에서 움직이지 않거나 원통에서 벗어나려고 노력하지 않은 시간으로 정의하였다. 부동 시간(immobility time)은 쥐가 탈출하려는 노력없이 물속에 떠있는 시간으로 정의하며, 물 위에 머리를 유지하기 위해 꼭 필요한 작은 행동만을 하는 경우를 포함하였다.

실험쥐는 원통에 빠뜨리면 탈출하려고 시도하지만, 결국 탈출하지 못하면 포기하게 되며, 부동자세가 좌절행동의 결과로 나타나는 것으로 평가하였다. 따라서 부동자세는 동물의 우울함에 대한 척도로 사용되었다. 만약 실험쥐가 대조군에 비하여 부동 자세의 감소가 나타났다면 항우울 효과가 있다고 평가하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, Npas4 KO 실험쥐는 Control에 비하여 부동시간이 증가하였으며, 부동성에 대한 Latency(Latency to immobility)가 증가하였음을 관찰할 수 있었다. 따라서, Npas4 KO 실험쥐의 항우울 행동 발현이 증가했음을 확인할 수 있었으며, Npas4 유전자의 억제가 항우울 행동과 연관되어있음을 알 수 있었다.

1-3. 신 물체 인식 테스트(novel object recognition test: NOR test)

Npas4 KO 실험쥐에서 Npas4 유전자가 기억력과 연관성이 있는지 확인하기 하여, 신 물체 인식 테스트를 수행하였다.

신 물체 인식 테스트는 오픈 필드 챔버(open field chamber)를 사용하였다. 실험쥐가 챔버에 익숙해지도록 실험쥐를 챔버 안에 10분 동안 놓았다. 훈련 기간 동안 두 가지 동일한 물체가 규칙적인 간격으로 챔버의 중앙에 놓여지며, 실험쥐가 10분 동안 그 물체를 더듬어 보도록 하였다. 훈련 기간 후에는 실험쥐를 12시간 동안 우리(cage)에 가두었다. 신 물체 인식 테스트를 위해 두 물체 중 하나를 새로운 물체로 교체하여 챔버의 동일한 위치에 놓았다. 실험쥐는 다시 챔버로 들어가고 10분 동안 자유롭게 더듬어 보도록 하였다. 실험쥐의 움직임을 적외선 카메라로 녹화하였으며, 실험쥐가 각 물체에 접촉(contact)하는 수와 지속 시간은 EthoVision XT 10 (Noldus)를 이용하여 분석하였다.

실험쥐는 본능적으로 새로운 물체를 더듬어 보려는 습성이 있다. 따라서, 두 물체 중 한 물체가 교체된 후 실험쥐를 챔버에 놓았을 때, 실험쥐가 새로운 물체에서 오랜 시간을 보낸다면 실험쥐의 기억력이 감소되지 않았다고 판단할 수 있다.

그 결과, 도 3의 (D)에서 나타낸 바와 같이, Testing phase에서 실험쥐가 신 물체인 O3를 탐색하는 시간이 Control과 유사하게 유의한 증가를 보였으므로, Npas4 KO 실험쥐의 기억력은 대조군에 비하여 유의한 차이가 없음을 관찰할 수 있었다. 따라서, Npas4 유전자의 억제는 특이적으로 항우울 작용과 연관이 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. Npas4 유전자의 항우울 분자적 작용 효과 확인

2-1. Npas4 단백질이 IQSEC3 프로모터에 결합함을 확인

IQSEC3가 GABA성 시냅스 발달에 관여하는 과정에서, Npas4가 IQSEC3를 타겟으로 하여 GABA성 시냅스 발달에 전사인자로써 영향을 미치는지 확인하기 위하여 실험을 수행하였다.

구체적으로는, HEK293T 세포를 10 % 태아 소 혈청(fetal bovine serum: FBS, Tissue Culture Biologicals)과 1 % 페니실린-스트렙토마이신(Thermo Fisher)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle 's Medium(DMEM, WELGENE)에서 37 ℃ 및 가습된 5 % CO₂ 환경으로 배양하였다. 배양된 일차 해마 뉴런은 배아 18일(E18)에 Sprague-Dawley 쥐의 뇌(KOATECK)로부터 준비하였다. 뉴런을 25 mm poly-L-lysine(1 mg/ml)으로 코팅된 coverslips에 뿌렸고, 페니실린-스트렙토마이신과 2 % B-27(Thermo Fisher) 및 0.5 % FBS(Hyclone)가 보충된 0.5 mM GlutaMax(Thermo Fisher)가 함유된 Neurobasal 배지(Gibco)에서 배양하였다. 상기 HEK293T 세포에 IQSEC3 프로모터-루시퍼라제 리포터 구조체(luciferase reporter construct)와 Npas4를 발현하는 벡터를 동시에 형질 감염시켰다. 모든 절차는 DGIST 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받은 설치류 실험 지침 및 프로토콜에 따라 수행되었다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, Npas4의 이소성 발현은 IQSEC3 야생형(WT)의 루시퍼라제 발현을 약 3배까지 증가 시켰으며, 이 증가는 IQSEC3 프로모터 영역에서 Npas4 컨센서스(consensus) 사이트의 돌연변이(MT)에 의해 감소됨을 관찰할 수 있었다.

추가적으로 전기영동 이동성 변화분석(Electrophoretic mobility shift assay: EMSA)을 수행하였다. IQSEC3 프로모터 내에 Npas4 결합(5'-CGG GAA GCA GGG TTC CTC ACG AAG CCC AGA GGT GGG AGG TGG-3 ') 및 그 점 돌연변이체(5'-CGG GAA GCA GGG TTC CTA AAA AAG CCC AGA GGT)에 대한 컨센서스 서열을 함유하는 올리고 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 키나제 및 [-32P] ATP를 사용하여 말단 표지하였고, 그 다음, 상보적 올리고 뉴클레오티드에 어닐링시켰다. 25 ng/μl 폴리(dl-dC)가 보충된 반응 완충액(10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 50 mM K-글루타메이트, 1 mM DTT 및 5 % 글리세롤) 19 μl에 정제된 Npas4 단백질을 함유하는 반응을 얼음 상에서 15 분 동안 예비 배양 하였다. 약 3ng의 올리고 뉴클레오티드 이중 가닥을 포함하는 32P-표지된 프로브 1 μL를 첨가한 후, 반응물을 얼음 상에서 30 분 동안 항온 배양하였다. 0.25x TBE 완충액 중 6 % 폴리아크릴아미드겔에서 4 ℃에서 전기 영동하여 시료 내 단백질을 분석하였고, 오토라디오그래피를 실시하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 전기영동 이동성 변화분석에서는 정제된 Npas4 단백질을 포함하는, 방사성 표지된 IQSEC3 WT oligoduplex probe가 하나의 결합 복합체를 형성한다는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 프로모터-리포터 분석과 일치하였으며, 상기 DNA-단백질 상호 작용은 Npas4 컨센서스 사이트의 돌연변이에 의해 소멸되었음을 관찰하였다.

상기 결과에 따라, Npas4 단백질이 IQSEC3의 DNA 결합 전사 활성인자로서 작용하여, IQSEC3에 발현 시 나타나는 항우울 작용에 유의한 효과를 미침을 알 수 있었다.

2-2. Npas4에 의해 조절되는 IQSEC3 발현의 SST(somatostatin)-양성 GABA성 개재뉴런 특이적 효과 확인

Npas4 유전자가 IQSEC3 유전자의 발현에 미치는 효과를 확인한 후, 이어서 Npas4에 의하여 전사가 조절되는 IQSEC3가 어떤 신경학적 효과를 보이는지 확인하기 위해, 생리 식염수(SA) 또는 15 mg/kg(kainic acid: KA)를 주입한 생후 11 주된 생쥐를 사용하여 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. 상기 kainic acid는 글루탐산 수용체를 흥분시키기 위하여 사용하였다.

구체적으로, 3 개월된 생쥐를 마취시키고 즉시 PBS로 3 분간, 이어서 4 % 파라 포름 알데히드로 5 분간 관류시켰다. 뇌를 해부하고 밤새 4 % 파라 포름 알데히드로 고정시킨 다음 PBS에서 30 % 수크로오스 용액으로 밤새 배양하고, vibratome(Model VT1200S; Leica Biosystems) 또는 cryotome(Model CM-3050-S; Leica Biosystems)을 사용하여 30 μm 두께의 관상 절편(coronal section)으로 절단하였다. 절편들은 5 % 소 혈청 알부민 및 5 % 말 혈청을 함유하는 PBS 중의 1 % Triton X-100으로 30 분 동안 배양하여 투과되었다. 면역 염색을 위해 절편들은 동일한 차단 용액(blocking solution)으로 희석한 1차 항체와 함께 4 ℃에서 8-12 시간 동안 항온 배양되었다. 1차 항체로 Anti-Npas4(1 : 100), anti-IQSEC3(JK079; 2 μg/ml), anti-GAD67(1 : 100), anti-PV (1 : 500), anti-CCK(1 : 100) 및 anti-SST(1:50)이 사용되었다. 절편을 PBS로 3 회 세척하고, 적절한 Cy3-또는 FITC-결합 2차 항체(Jackson ImmunoResearch)와 함께 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. PBS로 3 회 세척한 후, 절편을 Vectashield mounting 매질(H-1200; Vector Laboratories)을 갖는 유리 슬라이드(Superfrost Plus; Fisher Scientific) 위에 장착하였다.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, KA 주사는 IQSEC3 양성 세포의 수를 증가시켰으며, 특히, stratum oriens(SO) 층에서의 증가는 유의적인 수준이었던 반면, 다른 층에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 특히, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 해마 CA1의 stratum oriens 층에서 IQSEC3의 KA 주입 의존성 상향 조절은 SST-양성 GABA성 개재뉴런에서는 두드러지게 관찰되었지만, parvalbumin(PV) 또는 cholecystokinin(CCK)의 GABA성 개재뉴런에서는 전혀 관찰되지 않았다.

상기 결과에 따라, Npas4 단백질은 IQSEC3의 활성 전사인자로 작용하고, Npas4에 의하여 발현이 증가되는 IQSEC3는 GABA성 시냅스 발달을 조절하며, 특히 SST-양성 개재뉴런에서 유의한 효과가 나타난다고 평가할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

Npas4(neuronal PAS domain protein 4) 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 기분 장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 Npas4 단백질의 발현 억제제는 Npas4 mRNA에 상보적으로 결합하는 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이며,
상기 조성물은 뇌의 해마 CA1 지향층(Stratum Oriens) 영역으로 국소투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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삭제
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 억제성 시냅스에 특이적으로 작용하는 것인, 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 IQSEC3 유전자의 프로모터에 작용하는 것인, 약학적 조성물.
청구항 1에서 있어서, 상기 기분 장애는 우울장애(depressive disorder)와 양극성장애(bipolar disorder)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
삭제
기분 장애의 치료를 위한 후보물질을 접촉시킨 세포에서 Npas4(neuronal PAS domain protein 4) 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
상기 후보물질과 접촉된 세포의 Npas4 단백질 발현 또는 활성 수준이 후보물질과 접촉시키지 않은 대조구 세포에 비해 감소된 경우, 상기 후보물질을 기분 장애 치료제로 결정하는 단계를 포함하는, 기분 장애 치료제를 스크리닝하는 방법으로서,
상기 세포는 해마 CA1 지향층 영역으로부터 유래한 세포인 것을 특징으로 하는, 기분 장애 치료제를 스크리닝하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 Npas4 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합으로 수행하는 것인, 기분 장애 치료제를 스크리닝하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 기분 장애 치료제는 억제성 시냅스의 활성을 특이적으로 조절하는 것인, 기분 장애 치료제를 스크리닝하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 기분 장애는 우울장애(depressive disorder)와 양극성장애(bipolar disorder)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 기분 장애 치료제를 스크리닝하는 방법.
삭제
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청구항 8에 있어서, 상기 방법은 IQSEC3 단백질의 발현 또는 활성 수준을 후보물질과 접촉시키지 않은 대조구 세포의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 더 포함하는 것인, 기분 장애 치료제를 스크리닝하는 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 후보물질과 접촉된 세포의 IQSEC3 단백질의 발현 또는 활성 수준이 대조구 세포에 비해 감소된 경우, 상기 후보물질을 기분 장애 치료제로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인, 기분 장애 치료제를 스크리닝하는 방법.