WO2013119033A1 - Ｕｂａｐ２를 포함하는 골다공증 진단 및 치료효과 평가용 바이오 마커 조성물 - Google Patents

Ｕｂａｐ２를 포함하는 골다공증 진단 및 치료효과 평가용 바이오 마커 조성물 Download PDF

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WO2013119033A1
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protein
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정선용
진현석
김보영
정윤석
김범택
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아주대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a biomarker composition for diagnosing osteoporosis and evaluating the therapeutic effect including UBAP2, a method for screening osteoporosis-inducing substances using UBAP2, a method for screening osteoporosis therapeutic substances, and a composition for preventing or treating osteoporosis diseases.
  • Osteoporosis is postmenopausal osteoporosis, which is indicated by increased bone resorption due to the activation of osteoclasts due to rapid hormonal changes following menopause, and senile osteoporosis, in which osteoblasts decrease due to aging and osteoblasts decrease. Can be classified as
  • osteoporosis diagnosis Since osteoporosis fractures lead to severe activity limitations and are associated with a high mortality rate of about 15-35% in hip fractures, the diagnosis and treatment of osteoporosis is important before osteoporotic fractures occur (osteoporosis diagnosis). And Treatment Guidelines 2007, 2008).
  • osteoporosis Diagnosis and Treatment Guideline 2007, 2008 The prevalence of osteoporosis in Korea has increased threefold over the last five years as of 2008, and it is reported that the annual socioeconomic loss caused by osteoporosis fracture is about 1 trillion and 50 billion won (Operation Osteoporosis Diagnosis and Treatment Guideline 2007, 2008).
  • the inventors of the present inventors have been studying to find osteoporosis-related biomarkers that can be the target of efficient prevention, diagnosis, prognosis and treatment of osteoporosis.
  • We have studied the osteoporosis cell model, ovarian ablation mouse animal model, and post-menopausal female osteoporosis. It was confirmed that the expression level increased significantly and completed the present invention.
  • the present invention is to provide a biomarker composition for diagnosing osteoporosis diagnosis and treatment effect comprising UBAP2.
  • the present invention is to provide a method for screening osteoporosis-inducing substances and a method for screening osteoporosis-treating substances using UBAP2.
  • the present invention is to provide a composition for the prevention or treatment of osteoporosis disease, including the expression inhibitor or activity inhibitor of UBAP2 as an active ingredient.
  • the present invention provides a biomarker composition for diagnosing osteoporosis and evaluating therapeutic effect comprising UBAP2.
  • the present invention also provides a method for screening an osteoporosis-inducing substance using UBAP2 and a method for screening an osteoporosis therapeutic substance.
  • the present invention also provides a composition for the prevention or treatment of osteoporosis disease, including the expression inhibitor or activity inhibitor of UBAP2 as an active ingredient.
  • the UBAP2 of the present invention can be used as a biomarker for predicting the occurrence of osteoporosis or evaluating the diagnosis and treatment effect, and measuring osteoporosis by measuring the increase or decrease in the amount of UBAP2 expression before and after treatment of a test substance in a test subject. It can be used as a screening method for inducing, or preventing or treating a substance. In addition, by measuring the expression level of UBAP2 in the blood taken from the patient it can be useful for diagnosing osteoporosis and determining the therapeutic effect of osteoporosis patients at the molecular level.
  • FIG. 1 is a biochemical indicator of bone formation after treatment with osteoxic cell model, Dexamethasone (DEX), known to inhibit bone formation, treated with mouse skull-derived mesenchymal stem cells C3H10T1 / 2 and osteoblasts MC3T3-E1.
  • Figure is a comparison of phosphorus ALP (Alkaline phosphatase) activity.
  • Figure 2 is a comparison of the mRNA expression levels of the Ubap1, Ubap2 genes in the confirmed osteoporosis cell models C3H10T1 / 2 and MC3T3-E1 cell line.
  • Figure 3 is a comparison of the protein expression of the Ubap2 gene in C3H10T1 / 2 and MC3T3-E1 cell lines of ovarian resection osteoporosis cell models.
  • Figure 4 is a view showing the comparison of bone mineral density measurement results of bone marrow tissue of the Sham mouse (Sham-operated mouse) and the ovary removed OVX mouse to verify the animal model of ovarian resection osteoporosis.
  • Figure 5 is a comparison showing the mRNA expression difference of the Ubap1 and Ubap2 gene in bone tissue of Sham mouse and OVX osteoporosis animal model.
  • Figure 6 is a diagram showing the comparison of the protein expression of the Ubap2 gene in Sham mouse and OVX osteoporosis animal model.
  • Figure 7 is a comparison of the mRNA expression level of the UBAP2 gene in the peripheral blood cells of the normal group and postmenopausal female osteoporosis patient group to confirm the applicability in real people.
  • Figure 8 is a comparison of the protein expression levels of UBAP2 and Osteocalcin in peripheral blood cells of the normal group and postmenopausal female osteoporosis patient group.
  • the present invention provides a biomarker composition for diagnosing osteoporosis and evaluating therapeutic effects comprising the UBAP2 gene.
  • UBAP1 and UBAP2 are proteins that have a UBA-domain found in proteins associated with the ubiquitination pathway, and the UBAP1 gene is a member of the frontal temporal lobar degeneration disease belonging to dementia. Although it is reported as a genetic factor (Rollinson S et al, Neurobiology of Aging, 30: 656-665 (2009)), for the UBAP2 gene, the Mouse Genome Informatics (MGI) database (http: //www.informatics.jax. There was no specifically reported phenotype for Ubap2 knock-down mice in org /), and no association with human disease was reported.
  • MMI Mouse Genome Informatics
  • UBAP2 of the present invention is highly expressed in the blood of osteoporosis patients, and can be used as a biomarker for diagnosing osteoporosis because it can safely and easily predict the occurrence of osteoporosis without using an invasive method of biopsy of bone tissue.
  • the present invention also provides a method for screening an osteoporosis-inducing substance comprising the following steps:
  • the osteoporosis may be female osteoporosis.
  • a test substance is treated to an experimental model animal or a cell line to be a subject.
  • test subjects include one or more osteoporosis animal models selected from the group consisting of UBAP2 gene, human, chimpanzee, mouse, hamster, pig, cow, chicken, dog, cat, sheep, and goat including protein; or
  • MC3T3-E1 or C3H10T1 / 2 osteoporosis cell model but is not limited thereto, and may be any clinically available osteoporosis animal model or osteoporosis cell model cell line.
  • test material refers to an unknown material used in screening to examine whether it affects the expression level of UBAP2 gene or the amount of UBAP2 protein.
  • the test agent includes, but is not limited to, compounds, nucleotides, antisense nucleotides, siRNAs and natural extracts.
  • Test substances can be obtained from libraries of synthetic or natural compounds, and methods of obtaining libraries of such compounds are known in the art.
  • Test materials can be obtained by various combination library methods known in the art, for example, biological libraries, spatial addressable parallel solid or liquid libraries, synthetic library methods requiring deconvolution, "1-bead 1 -Compound "library method, and synthetic library method using affinity chromatography screening.
  • the expression level or activity level of UBAP2 in the test subject is measured.
  • the expression level of the gene is composed of immunoprecipitation, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), immunohistochemistry, RT-PCR, Western blot and flow cytometry (FACS). It is preferred to measure with any one selected from, but is not limited thereto, and any method of measuring the amount of transcript or protein encoded therefrom known to those skilled in the art can be used.
  • the activity level of the UBAP2 protein of step (b) is preferably measured by any one selected from the group consisting of SDS-PAGE, immunofluorescence, enzyme immunoassay (ELISA), mass spectrometry and protein chip.
  • the present invention is not limited thereto.
  • test substance is selected in which the expression or activity of the UBAP2 is increased compared to before the test substance is treated.
  • a test substance whose expression or activity level is increased compared to that of the test substance treatment may be determined as an osteoporosis-inducing substance, and a test substance whose expression or activity level is reduced compared to before the test substance treatment is determined as a prevention or treatment substance of osteoporosis. can do.
  • a method for screening a material for preventing or treating osteoporosis comprising the following steps:
  • the screening-in material by the screening method of the present invention is a substance that induces osteoporosis or prevents and treats osteoporosis, which is selected as a substance causing osteoporosis, or used as a composition for preventing or treating osteoporosis. Can be.
  • the method of the present invention by effectively screening the lead compound of a new drug for preventing and treating osteoporosis, it is possible to improve the hit-ratio in preclinical and clinical trials, and consequently to prevent osteoporosis, The cost and time required to develop new therapeutic drugs can be greatly reduced.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoporosis diseases, including an inhibitor or an inhibitor of the expression of UBAP2 as an active ingredient.
  • the inhibitor of expression of the UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2) protein is an antisense nucleotide that complementarily binds to the mRNA of the UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2) gene, a short hairpin RNA, and a small interfering RNA.
  • ribozyme may be one or more selected from the group consisting of
  • the activity inhibitor of the UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2) protein is selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, substrate analogs, aptamers and antibodies that complementarily bind to UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2) proteins. It is preferably one or more species, but is not limited thereto.
  • the siRNA is composed of a 15 to 30 mer sense sequence selected from the base sequence of the mRNA of the gene encoding the ubiquitin-Associated Protein 2 (UBAP2) protein and an antisense sequence complementary to the sense sequence.
  • the sense sequence is not particularly limited thereto, but is preferably composed of 25 bases, but is not limited thereto.
  • the antisense nucleotide binds (hybridizes) the complementary sequence of DNA, immature-mRNA or mature mRNA, as defined in Watson-Crick base pairs, thereby interfering with the flow of genetic information as a protein in DNA. will be.
  • the nature of antisense nucleotides specific to the target sequence makes them exceptionally multifunctional. Since antisense nucleotides are long chains of monomeric units they can be easily synthesized for the target RNA sequence. Many recent studies have demonstrated the utility of antisense nucleotides as biochemical means for studying target proteins (Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81: 1539-1544, 1999).
  • antisense nucleotides can be considered as a new type of inhibitor because of recent advances in the field of nucleotide synthesis that exhibit oligonucleotide chemistry and enhanced cell adsorption, affinity of target binding and nuclease resistance.
  • the peptide mimetics is to inhibit the activity of UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2) protein by inhibiting the binding domain of UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2) protein.
  • Peptide mimetics can be peptides or non-peptides and are amino acids bound by non-peptide bonds, such as psi bonds (Benkirane, N., et al. J. Biol. Chem., 271: 33218-33224, 1996). Can be configured.
  • cyclic mimetics comprising “conformationally constrained” peptides, cyclic mimetics, at least one exocyclic domain, binding moieties (binding amino acids) and active sites
  • Peptide mimetics are structured similar to the secondary structure of UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2) protein and are either antibodies (Park, BW et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) or water soluble receptors (Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997), which can mimic the inhibitory properties of large molecules, and may be novel small molecules that can act equivalent to natural antagonists (Wrighton, NC et al. Nat Biotechnol 15). , 1261-1265, 1997).
  • the aptamer is a single-chain DNA or RNA molecule, and has a high affinity for a specific chemical or biological molecule by an evolutionary method using an oligonucleotide library called systemic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Oligomers that have the ability to select and bind can be obtained by isolation (C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505-510, 2005; AD Ellington and JW Szostak, Nature 346, 818-822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591-599, 2000; DS Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611-647, 1999). Aptamers can specifically bind to targets and modulate the activity of the targets, such as by blocking the ability of the targets to function through binding.
  • the antibody may specifically and directly bind to UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2) to effectively inhibit the activity of UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2).
  • UBAP2 Ubiquitin-Associated Protein 2
  • the antibody that specifically binds to UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2) may be prepared by a method known to those skilled in the art, and commercially known UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2) antibodies may be purchased and used.
  • the antibody can be prepared by injecting an ubiquitin-associated protein 2 (UBAP2) protein, an immunogen, into an external host according to conventional methods known to those skilled in the art.
  • External hosts include mammals such as mice, rats, sheep, rabbits.
  • Immunogens are injected intramuscularly, intraperitoneally or subcutaneously, and can generally be administered in conjunction with an adjuvant to increase antigenicity.
  • Antibodies can be isolated by collecting blood from an external host at regular intervals and collecting serum showing specificity for antigens and antigens formed.
  • the inhibitor of expression or activity of UBAP2 according to the present invention exhibits an excellent effect of inhibiting the expression or activity of UBAP2, and thus may be usefully used as a prophylactic or therapeutic agent for osteoporosis.
  • composition of the present invention may contain one or more known active ingredients having an effect of inhibiting the expression or activity of UBAP2.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) according to the desired method, and the dosage is based on the weight, age and sex of the patient.
  • the range varies depending on health, diet, time of administration, method of administration, duration or interval of administration, excretion rate, constitution specificity, and the nature of the formulation.
  • the daily dosage of the inhibitor of the expression or activity of UBAP2 of the present invention is about 0.1 to 100 mg / kg, preferably about 1 to 10 mg / kg, but may be added or subtracted according to clinical trial results. It is preferable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in various formulations for administration, and may be formulated in various forms by addition of excipients.
  • the excipients are nontoxic and inert pharmaceutically suitable solid, semisolid or liquid formulation aids of all types, for example fillers, weights, binders, wetting agents, disintegrants, dispersants, surfactants or diluents and the like. Can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in dosage unit form.
  • the formulated dosage unit may comprise 1, 2, 3 or 4 times, or 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily individual dosage of the active compound.
  • Preferably said individual dose contains an amount in which the active compound is administered at one time, which usually corresponds to all, 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily dose.
  • compositions of the present invention may be used as tablets, coated tablets, capsules, pills, granules, suppositories, solutions, suspensions and emulsions, pastes, ointments, gels, creams, lotions, powders or sprays. Can be formulated.
  • Dexamethasone (DEX), a glucocorticoid, is used for C3H10T1 / 2, a mouse-derived mesenchymal stem cell, and MC3T3-E1, a mouse-derived osteoblast cell. After treatment, the osteoporosis cell model was verified by confirming ALP (alkaline phosphatase) activity and apoptosis, which are biochemical markers of bone formation.
  • ALP alkaline phosphatase
  • the dexamethasone treated C3H10T1 / 2 and MC3T3-E1 cells can be seen to decrease the ALP level lower than the control.
  • RT PCR real time reverse-transcriptase-polymer chain reaction
  • Real-time RT PCR reaction conditions include one reaction for 15 minutes at 95 ° C., 45 reactions at 20 ° C.-62 ° C., 20 seconds-72 ° C., 40 seconds at 95 ° C., and finally a melting curve. In order to make a) was performed by adjusting the conditions to decrease the temperature by 0.2 °C from 95 °C to 60 °C.
  • the dexamethasone-treated osteoporosis cell model (C3H10T1 / 2, MC3T3-E1) it was confirmed that the mRNA expression of the Ubap2 gene significantly increased by about two times compared to the control.
  • OVX mice verified as osteoporosis animal models, and Sham mice as controls, were divided into two groups and euthanized.
  • bone tissue of each mouse subjected to euthanasia was rapidly collected and total RNA was extracted.
  • RNA was extracted according to the manufacturer's protocol using RNA extraction kits commonly used in the art.
  • cDNA was synthesized by reverse transcriptase in the same manner as in Example 1 and real-time RT PCR was performed with each gene-specific primer (Table 1).
  • the mRNA expression level of the Ubap1 gene was not changed, whereas the expression level of the mRNA was significantly increased in the OVX mouse group of the osteoporosis model group in the Ubap2 gene.
  • Ajou University Medical Center approved the clinical study protocol, and among the 50 or more postmenopausal women, the osteoporosis group and normal group of patients with bone mineral density were given a description of the study and a genetic test agreement as a study subject.
  • the most obvious method is to obtain the bone tissue of the subject and compare the expression levels of the UBAP2 gene.However, it is difficult to obtain bone tissue through surgery.However, in the existing studies, the expression of bone tissue was analyzed through gene expression analysis of cells isolated from blood. It has been used to confirm indirectly (Kung AW et al, Am J Hum Gent, 86: 229-239 (2010)), and also because the object of the present invention is the development of biomarkers for the prevention or treatment of osteoporosis in patients.
  • the blood sampling method was selected as a method for easy sampling and analysis.
  • Real-time RT PCR was performed in the same manner as in Example 1 using the purified RNA.
  • the mRNA expression level of the UBAP2 gene in the osteoporosis patient group was about 7.08 times higher than that of the control group.
  • UBAP2 protein, bone formation markers, and osteoporosis treatment effects were measured using plasma collected from 22 patients with postmenopausal osteoporosis in their 50s or older and 21 normal patients with control.
  • ELISA test was performed on the Osteocalcin protein.
  • the expression of UBAP2 is specifically increased in osteoporosis disease, and thus, by analyzing the mRNA and protein expression levels of UBAP2 gene, it can be used as a biomarker for confirming the diagnosis and treatment effect of osteoporosis patients. Or it can be seen that the target gene or protein used for the screening of candidates for the development of therapeutics.
  • the UBAP2 of the present invention can be used as a biomarker for predicting the occurrence of osteoporosis or evaluating the diagnosis and treatment effect, and measuring osteoporosis by measuring the increase or decrease in the amount of UBAP2 expression before and after treatment of a test substance in a test subject. It can be used as a screening method for inducing, or preventing or treating a substance. In addition, by measuring the expression level of UBAP2 in the blood taken from the patient it can be useful for diagnosing osteoporosis and determining the therapeutic effect of osteoporosis patients at the molecular level.

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Abstract

본 발명은 UBAP2를 포함하는 골다공증 진단 및 치료효과 평가용 바이오 마커 조성물, UBAP2를 이용한 골다공증 유발물질의 스크리닝 방법, 골다공증 치료물질의 스크리닝 방법, 및 골다공증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

ＵＢＡＰ２를 포함하는 골다공증 진단 및 치료효과 평가용 바이오 마커 조성물
본 발명은 UBAP2를 포함하는 골다공증 진단 및 치료효과 평가용 바이오 마커 조성물, UBAP2를 이용한 골다공증 유발물질의 스크리닝 방법, 골다공증 치료물질의 스크리닝 방법, 및 골다공증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
골다공증은 폐경에 따른 급격한 호르몬의 변화에 의한 파골세포(osteoclast)의 활성화에 따른 골흡수 증가로 나타나는 폐경 후 골다공증과, 노화가 되면서 조골세포(osteoblast)의 기능이 감소하여 골형성이 감소하는 노인성 골다공증으로 분류할 수 있다.
이러한 골다공증으로 인한 골절은 심각한 활동 제한에 이르게 되고, 고관절 골절의 경우 약 15-35%의 높은 사망률과 관련되어 있기 때문에, 골다공증성 골절이 발생하기 이전에 골다공증의 진단과 치료가 중요하다(골다공증 진단 및 치료 지침 2007, 2008).
국내의 골다공증 유병률이 2008년 기준 최근 5년간 약 3배 증가되었고, 골다공증 골절에 의한 연간 사회경제적 손실이 약 1조 500억원에 달할 정도로 심각한 수준에 이르고 있다고 보고되어 있다(골다공증 진단 및 치료 지침 2007, 2008).
국내의 골다공증 유병률은 2008년 기준 최근 약 5년간 3배 증가되었고, 골다공증으로 인한 골절에 의한 연간 사회경제적 손실이 약 1조 500억원에 달할 정도로 심각한 수준에 이르고 있다고 보고된다(골다공증 진단 및 치료지침 2007, 2008). 또한, 최신의 2009년도 국민건강통계에 따르면, 50세 이상 및 65세 이상 한국인 전체의 골다공증 유병률은 23.1%와 42.0%로 만성질환 중에서도 유병률이 매우 높게 나타나 국민건강에 커다란 문제로 떠오르고 있다(2009년 국민건강통계-국민건강영양조사).
한편, 여성의 경우 폐경 이후 급격한 골소실이 진행되는데, 이는 여성 호르몬의 결핍으로 급격한 골흡수가 야기되기 때문으로, 폐경 이후에는 노화로 골형성 기능이 점차 감소되어 골 소실이 지속된다.
골다공증 발병과 관련된 요소인 최대 골량은 약 50~85% 정도의 강한 유전적 성향을 가진다고 알려져 있으며(Pocock NA et al, J Clin Invest, 80:706-710 (1987); Gueguen R et al, J Bone Miner Res, 10:2017-2022 (1995); Ralston SH et al, Endocr Rev, 31:629-662 (2010)) 이러한 유전적 영향은 최대 골량 형성기뿐만 아니라 그 이후에도 지속된다고 알려져 있다.
골다공증의 발병 또는 골밀도와 관련된 많은 유전자적 연구가 진행되어온 결과, 연관 분석(linkage analysis)(Ralston SH, Ann N Y Acad Sci, 1192:181-189 (2010)), 후보 유전자 상관 분석(candidate gene association study)(GENOMOS(www.genomos.eu), GEFOS(www.gefos.org)), 전장 유전체 분석법(genome-wide association study: GWAS)(Ralston SH et al, Endocr Rev, 31:629-662, (2010))등에 의해 관련 유전자들이 밝혀진 바 있다. 최근에는 차세대 염기서열 분석 기술(Next-Generation Sequencing)의 진보에 따라 유전체 전체 DNA의 염기서열을 단시간 내에 값싸게 읽을 수 있게 되면서 다수의 개인 유전체(genome) 염기서열 분석(Genome-wide sequencing)을 통해 골다공증과 같은 복합질환에 대한 원인 유전자 규명에 대한 연구가 더욱 활발히 진행되고 있다.
상기 언급한 연구들을 통해 골다공증 관련 유전자(gene)/유전자 자리(locus)가 많이 보고되어 있으나, 아직까지 정상군-환자군의 비교 및 기능연구 등의 실험적 증명을 통하여 확실한 유전적 소인으로 밝혀진 유전자는 많지 않으며, 일부 알려진 골대사 기전을 중심으로 한 연구 및 특허들만이 집중되어 있는 실정이다.
따라서, 골다공증 발병과 관련된 새로운 골대사 기전의 발견, 및 골다공증 예방과 치료의 지표로 사용할 수 있는 골다공증 진단용 바이오 마커의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 골다공증의 효율적인 예방, 진단, 예후 및 치료의 표적이 될 수 있는 골다공증 관련 바이오 마커를 발견하기 위해 연구하던 중, 골다공증 세포 모델과 난소 절제 마우스 동물 모델, 폐경 후 여성 골다공증 환자군에서 UBAP2 유전자의 발현량이 유의성있게 증가하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 UBAP2를 포함하는 골다공증 진단 및 치료효과 평가용 바이오 마커 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 UBAP2를 이용한 골다공증 유발물질의 스크리닝 방법 및 골다공증 치료물질의 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 UBAP2의 발현억제제 또는 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 골다공증 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 UBAP2를 포함하는 골다공증 진단 및 치료효과 평가용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 UBAP2를 이용한 골다공증 유발물질의 스크리닝 방법 및 골다공증 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 UBAP2의 발현억제제 또는 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 골다공증 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 UBAP2의 발현량에 따른 골다공증 발생여부를 알아보기 위하여 골다공증 세포모델, 골다공증 유발 마우스 모델, 및 환자의 혈액 세포 내에서 UBAP2의 발현량을 측정한 결과, 각각의 모델 및 환자에서 UBAP2의 발현량이 매우 증가되었음이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 UBAP2는 골다공증의 발생을 예측, 또는 진단 및 치료효과를 평가 할 수 있는 바이오 마커로서 사용될 수 있으며, 실험대상에 피검물질을 처리하기 전, 후의 UBAP2 발현량의 증감을 측정함으로써 골다공증의 유발, 또는 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법으로 사용할 수 있다. 또한, 환자로부터 채취한 혈액에서 UBAP2의 발현량을 측정함으로써 골다공증의 진단 및 골다공증 환자의 치료효과를 분자 수준에서 판단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 골다공증 세포 모델 검증을 위하여, 뼈 형성을 억제한다고 알려진 Dexamethasone(DEX)을 마우스 두개골 유래 중간엽 줄기세포인 C3H10T1/2 및 조골세포인 MC3T3-E1 에 처리한 후, 뼈 형성의 생화학적 지표인 ALP(Alkaline phosphatase) 활성을 비교하여 나타낸 도이다.
도 2는 확인된 골다공증 세포 모델인 C3H10T1/2 및 MC3T3-E1세포주에서 Ubap1, Ubap2 유전자의 mRNA 발현량 차이를 비교하여 나타낸 도이다.
도 3은 난소절제 골다공증 세포 모델인 C3H10T1/2 및 MC3T3-E1세포주에서 Ubap2 유전자의 단백질 발현량을 비교하여 나타낸 도이다.
도 4는 난소절제 골다공증 동물 모델의 검증을 위하여, 복강만 절개한 Sham 마우스(Sham-operated mouse) 및 난소를 절제한 OVX 마우스의 골수조직의 골밀도 측정결과를 비교하여 나타낸 도이다.
도 5는 Sham 마우스 및 OVX 골다공증 동물 모델의 골조직 내의 Ubap1 및 Ubap2 유전자의 mRNA 발현량 차이를 비교하여 나타낸 도이다.
도 6은 Sham 마우스 및 OVX 골다공증 동물 모델에서 Ubap2 유전자의 단백질 발현량을 비교하여 나타낸 도이다.
도 7은 실제 사람에서 적용 가능성을 확인하기 위하여 정상군 및 폐경 후 여성 골다공증 환자군의 말초혈액 세포 내의 UBAP2 유전자의 mRNA 발현량 차이를 비교하여 나타낸 도이다.
도 8은 정상군 및 폐경 후 여성 골다공증 환자군의 말초혈액 세포 내의 UBAP2 및 Osteocalcin의 단백질 발현량을 비교하여 나타낸 도이다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 UBAP2유전자를 포함하는 골다공증 진단 및 치료효과 평가용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
UBAP1 및 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2)는 유비퀴틴화 경로와 연관된 단백질에서 발견되는 UBA-domain을 가지는 단백질로, UBAP1 유전자의 경우는 치매(dementia)에 속하는 전측두엽 퇴행성 질환(Frontotemporal lobar degeneration disease)의 유전적 인자로 보고 되어 있으나(Rollinson S et al, Neurobiology of Aging, 30:656-665 (2009)), UBAP2 유전자의 경우에는 Mouse Genome Informatics(MGI) 데이터베이스(http://www.informatics.jax.org/)에서 Ubap2 넉다운(Knock-down) 마우스에 대해 특별히 보고된 표현형이 없었으며, 사람의 질병과의 관련성에 대해서도 전혀 보고된 바가 없었다.
본 발명자들은 UBAP2와 골다공증 간에 어떠한 상관관계가 있는지 발굴하고자 노력하였고, 그 결과 골다공증 세포 모델에서 Ubap2 유전자의 발현량이 유의하게 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 정상인의 혈액에 비하여 Ubap2 유전자가 골다공증 환자의 혈액에서 높게 발현되며 혈액 내 Ubap2의 높은 발현량은 골다공증의 발생과 양의 상관관계를 가진다는 사실을 확인하였다. 따라서 본 발명의 UBAP2는 골다공증환자의 혈액에서 높게 발현되어, 골조직을 생검하는 침습적인 방법을 사용하지 않고도 안전하고 손쉽게 골다공증의 발생을 예측할 수 있으므로 골다공증 진단용 바이오 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 골다공증 유발물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a)실험대상에 분석하고자 하는 피검물질을 처리하는 단계;
(b)상기 실험대상에서 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2)의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(c)상기 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2)의 발현 또는 활성 정도가 상기 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 피검물질을 선별하는 단계.
상기 골다공증은 여성 골다공증일 수 있다.
본 발명의 방법을 각각의 단계에 따라 상세하게 설명하면 하기와 같다;
단계(a): 실험대상에 분석하고자 하는 피검물질을 처리
본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 우선 실험대상이 되는 실험모델동물 또는 세포주에 피검물질을 처리한다.
상기 실험대상은 UBAP2 유전자, 단백질을 포함하는 사람, 침팬지, 마우스, 햄스터, 돼지, 소, 닭, 개, 고양이, 면양, 및 산양으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 골다공증 동물모델; 또는
MC3T3-E1 또는 C3H10T1/2골다공증 세포모델일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 임상적으로 활용 가능한 모든 골다공증 동물모델 또는 골다공증 세포모델 세포주일 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "피검물질"은 UBAP2 유전자의 발현량 또는 UBAP2 단백질의 양에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 피검 물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA 및 천연추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
피검 물질은 합성 또는 천연화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있고, 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
피검 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리, 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 및 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다.
단계(b): 상기 실험대상에서 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2)의 발현 또는 활성 정도를 측정
이어서, 상기 실험대상에서 UBAP2의 발현량 또는 활성 정도를 측정한다. 상기 유전자의 발현정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴블롯(Western Blot) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.
또한, 상기 방법에 있어서, 단계(b)의 UBAP2 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단계(c): 상기 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2)의 발현 또는 활성 정도가 상기 피검물질을 처리하기 전에 비해 증가한 피검물질을 선별
최종적으로 상기 UBAP2의 발현 또는 활성정도가 상기 피검물질을 처리하기 전에 비해 증가한 피검물질을 선별한다. 구체적으로는, 상기 발현 또는 활성 정도가 피검물질 처리 전에 비해 증가한 피검물질은 골다공증 유발물질로 판정할 수 있으며, 상기 발현 또는 활성 정도가 피검물질 처리 전에 비해 감소한 피검물질은 골다공증 예방, 치료물질로 판정할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 하기의 단계를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a)실험대상에 분석하고자 하는 피검물질을 처리하는 단계;
(b)상기 실험대상에서 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2)의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(c)상기 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2)의 발현 또는 활성 정도가 상기 피검물질을 처리하기 전에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계.
본 발명의 방법 중 상기 골다공증 유발물질의 스크리닝 방법과 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 스크리닝-인(screening-in)된 물질은 골다공증을 유발하거나 골다공증을 예방, 치료하는 물질이며, 이는 골다공증을 유발하는 물질로 선별하거나, 골다공증의 예방, 치료용 조성물로서 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 골다공증을 예방, 치료하는 신약의 선도화합물(Lead Compound)를 효과적으로 스크리닝하여, 전임상 및 임상 시험에서의 적중율(hit-ratio)을 향상시킬 수 있으며, 결과적으로 골다공증을 예방, 치료하는 신약을 개발하는데 요구되는 비용 및 시간을 크게 줄일 수 있다.
본 발명은 UBAP2의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 골다공증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 단백질의 발현 억제제는 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상 일 수 있고,
상기 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 단백질의 활성 억제제는 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 siRNA는 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 25개의 염기로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합의 친화도 및 뉴클레아제(nuclease) 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
상기 펩티드 모방체(Peptide mimetics)는 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 단백질의 결합 도메인을 억제하여 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합(Benkirane, N., et al. J.Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 모방체(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체는 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체(Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체(Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).
상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.
상기 항체는 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2)에 특이적이고 직접적으로 결합하여 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2)의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2)에 특이적으로 결합하는 항체로는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2)에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근육 내, 복강 내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형성된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.
본 발명에 따른 UBAP2의 발현 또는 활성 억제제는 UBAP2의 발현 또는 활성을 억제하는 효과를 우수하게 나타냄으로써, 골다공증의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 UBAP2의 발현 또는 활성 억제 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 체질 특이성, 제제의 성질 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 UBAP2의 발현 또는 활성 억제제의 일일 투여량은 약 0.1~100mg/kg, 바람직하게는 약 1~10mg/kg이나, 임상실험결과에 따라 가감될 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여 여러 가지 제제로 제형화 될 수 있으며, 부형제를 첨가하여 다양한 형태로 제형화될 수 있다. 상기 부형제는 비독성이고 불활성인 약제학적으로 적합한 고상, 준고상 또는 액상의 모든 유형의 제형 보조물로서, 예를 들면, 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면활성제 또는 희석제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 투약 단위 형태로 제형화 될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형화된 투약 단위는 상기 유효 화합물의 1일 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 개별 투약량은 유효 화합물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 액제, 현탁액제 및 에멀전제, 페이스트제 (pastes), 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 산제 또는 분무제로 제형화될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 골다공증 세포 모델에서 Ubap2 유전자의 mRNA 및 단백질 발현량의 비교 분석
골다공증 연구에 많이 사용되고 있는 마우스 유래 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell)인 C3H10T1/2 세포와 마우스 유래 조골세포 (osteoblast cell)인 MC3T3-E1 세포에 당질코르티코이드(glucocorticoid)인 덱사메타손(dexamethasone, DEX)을 처리한 후, 뼈 형성의 생화학적 지표인 ALP(alkaline phosphatase) 활성 및 자연세포사멸(apoptosis)을 확인하여 골다공증 세포 모델을 검증하였다.
결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 덱사메타손을 처리한 C3H10T1/2 및 MC3T3-E1 세포에서 대조군보다 ALP 수치가 낮게 감소하는 것을 확인할 수 있다.
이어서 상기에서 확인된 골다공증 세포 모델(C3H10T1/2, MC3T3-E1)에서 Ubap1 및 Ubap2 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정하기 위하여 실시간 RT PCR(real time Reverse-Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다.
실시간 RT PCR 반응 조건은 95℃에서 15분 동안 가열하는 반응을 1회, 95℃에서 20초-62℃에서 20초-72℃에서 40초로 이어지는 반응을 45회, 그리고 마지막으로 융해곡선(melting curve)을 작성하기 위해 95℃에서 60℃까지 0.2℃씩 온도를 내리는 조건으로 조절하여 수행하였다.
실시간 RT PCR용 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
생물종 유전자 서열이름 서열 정보 (5'->3')
마우스 Gapdh Gapdh-F TGA CCA CAG TCC ATG CCA TC
Gapdh-R GAC GGA CAC ATT GGG GGT AG
Ubap1 Ubap1-F GGA CAG ATG TTC ATG GGA CTT T
Ubap1-R CAA TAG GCA GAC CCA CTT TCG
Ubap2 Ubap2-F TGA GCA ATG ATC GTT GCC GAG
Ubap2-R ACT TGA GCA AGC CGC ATC T
사람 GAPDH GAPDH-F TGT TGC CAT CAA TGA CCC CTT
GAPDH-R CTC CAC GAC GTA CTC AGC G
UBAP1 UBAP1-F GGG AAG CAG AGT GCA AAA TTG
UBAP1-R GTG GCT GTA CTG TGA GTC TTG
UBAP2 UBAP2-F AGT GGC CCT ACA TGA TTG TAA TG
UBAP2-R TCT CCC ATG AAG TTG TGT CTG AA
상기 확인된 골다공증 세포 모델과 대조군 세포 각각에 대하여 Ubap1, Ubap2의 발현을 실시간 RT PCR로 분석한 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 덱사메타손을 처리한 골다공증 세포 모델(C3H10T1/2, MC3T3-E1)에서 Ubap2 유전자의 mRNA 발현이 대조군에 비하여 2배 정도 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 골다공증 세포 모델(C3H10T1/2, MC3T3-E1)에서 Ubap2의 단백질 발현 정도를 측정하기 위하여 Ubap2 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴블롯(Western blotting)을 수행하였다.
결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 덱사메타손을 처리한 골다공증 세포 모델 모두에서 Ubap2 단백질의 발현이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 UBAP2의 mRNA 및 단백질의 발현이 골다공증 질환에 특이적으로 증가된다는 것을 알 수 있다.
<실시예 2> 난소절제 골다공증 동물 모델 제작 및 검증
폐경기 여성 골다공증의 동물모델로서 8주령의 암컷 ddY 마우스에 난소 절제술을 시행한 OVX(ovariectomized) 마우스와, 이의 대조군으로서 복강 절개는 시행하였으나 난소는 제거하지 않은 마우스(Sham-operated mouse) 를 구입하였다.
구입한 난소절제 마우스의 골다공증 동물 모델의 검증을 위하여 난소 절제술 이후 온-습도가 유지되는 청정 동물실에서 8주간 두 그룹을 동일한 조건에서 사육한 후, PIXI-mus bone densitometer로 골수조직의 골밀도를 측정하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, Sham 마우스에 비하여 OVX 마우스의 골밀도가 매우 저하된 것으로 확인되어 OVX 마우스가 본 발명의 골다공증 동물 모델로서 사용될 수 있음이 검증되었다.
<실시예 3> 난소절제 골다공증 동물 모델에서 Ubap2 유전자의 mRNA 및 단백질 발현량의 비교 분석
난소절제 골다공증 동물 모델인 OVX 마우스와 대조군인 Sham 마우스 간의 Ubap2 유전자 발현량의 차이를 비교 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저 골다공증 동물 모델로서 검증이 된 OVX마우스와 대조군인 Sham 마우스를 두 그룹으로 분류하고, 안락사를 시행하였다. 다음으로, 안락사를 시행한 각 마우스의 골조직을 신속하게 채취하여 total RNA를 추출하였다.
Total RNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 RNA 추출 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 추출된 RNA로부터 Ubap1, Ubap2 유전자의 mRNA 발현 양상을 조사하기 위해, 실시예 1과 같은 방법으로 역전사효소로 cDNA를 합성하고 각 유전자 특이적 프라이머(표 1)로 실시간 RT PCR을 시행하였다.
결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, Ubap1 유전자의 mRNA 발현량은 변화가 없었던 반면에, Ubap2 유전자의 경우 골다공증 모델 그룹인 OVX 마우스 그룹에서 mRNA의 발현량이 유의하게 증가함을 확인하였다.
이어서, 골다공증 모델(OVX) 그룹에서 Ubap2의 단백질 발현 정도를 측정하기 위하여 Ubap2 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴블롯(Western blotting)을 수행하였다.
결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 골다공증 모델 그룹에서 Ubap2 단백질의 발현이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다
따라서, 골다공증 세포 모델과 마찬가지로 골다공증 동물모델에 있어서도 UBAP2의 mRNA 및 단백질 발현이 증가되는 것을 확인하였고, 이로부터 골다공증 질환에 특이적으로 UBAP2의 발현이 증가된다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 4> 골다공증 환자 및 대조군의 말초 혈액 채취
실제 골다공증 환자와 대조군에서 UBAP2의 발현 정도를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저 아주대 의료원으로부터 임상연구계획서를 승인 받아, 50대 이상 폐경 여성들 중에서 골밀도 검사상 골다공증 환자군과 정상인 환자군을 대상으로 연구내용에 대한 설명 및 연구피험자로서의 유전자검사 동의를 받았다.
대상자의 골조직을 획득하여 UBAP2 유전자의 발현량을 비교하는 것이 가장 확실한 방법이나, 수술을 통한 골조직의 획득이 현실적으로 어려운 점이 있고, 기존 연구에서도 혈액에서 분리한 세포의 유전자 발현 분석을 통해 골조직의 발현을 간접적으로 확인하는데 사용해오고 있으며(Kung AW et al, Am J Hum Gent, 86: 229-239 (2010)), 또한, 본 발명의 목적이 골다공증의 예방 또는 치료에 대한 바이오 마커의 개발이기 때문에 환자에서 시료 채취가 용이하고 분석이 편리한 방법을 채혈방법을 선택하였다.
<실시예 5> 골다공증 환자 및 대조군에서 UBAP2 유전자의 mRNA 및 단백질 발현량의 비교 분석
Ubap2 유전자의 mRNA 발현량을 알아보기 위하여 유전자 검사에 동의한 50대 이상 폐경 여성 골다공증 환자 31명과 대조군으로서 정상 환자 32명의 혈액을 각 8 ml씩 채혈하고, 최대한 신선한 상태의 RNA를 추출하기 위해 혈액 채취 후 곧바로 실험실로 운반하여 RNA 추출 키트를 사용해 total RNA를 분리 정제하였다.
분리 정제한 RNA를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 실시간 RT PCR을 시행하였다.
결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 골다공증 환자군에서의 UBAP2 유전자의 mRNA 발현량이 대조군인 정상 환자군에 비하여 약 7.08배나 높은 것을 확인하였다.
또한, UBAP2 단백질의 발현량을 알아보기 위하여 실험군인 50대 이상 폐경 여성 골다공증 환자 22명과 대조군인 정상 환자 21명에서 채취한 혈장을 가지고 UBAP2 단백질과, 골형성 마커 및 골다공증 치료 효과에 대한 마커로 사용하는 Osteocalcin 단백질에 대하여 ELISA 테스트를 수행하였다.
결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, UBAP2 및 Osteocalcin 단백질 모두가 골다공증 환자군에서 대조군에 비하여 약 1.7배 정도 통계적으로 유의하게 높은 것을 확인하였다. 이때 피어슨 상관계수 값은 r=0.478 (p=0.0012)로 UBAP2와 Osteocalcin의 농도간의 관련성도 통계적으로 유의성이 있었다.
이러한 결과로부터, UBAP2의 발현이 골다공증 질환에 특이적으로 증가하며, 따라서 UBAP2 유전자의 mRNA와 단백질의 발현량을 분석함으로써 골다공증 환자의 진단 및 치료 효과 확인을 위한 바이오 마커로서 사용할 수 있고, 향후 골다공증 예방 또는 치료제의 개발을 위한 후보물질의 스크리닝에 사용되는 표적 유전자 혹은 단백질이 될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 UBAP2의 발현량에 따른 골다공증 발생여부를 알아보기 위하여 골다공증 세포모델, 골다공증 유발 마우스 모델, 및 환자의 혈액 세포 내에서 UBAP2의 발현량을 측정한 결과, 각각의 모델 및 환자에서 UBAP2의 발현량이 매우 증가되었음이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 UBAP2는 골다공증의 발생을 예측, 또는 진단 및 치료효과를 평가 할 수 있는 바이오 마커로서 사용될 수 있으며, 실험대상에 피검물질을 처리하기 전, 후의 UBAP2 발현량의 증감을 측정함으로써 골다공증의 유발, 또는 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법으로 사용할 수 있다. 또한, 환자로부터 채취한 혈액에서 UBAP2의 발현량을 측정함으로써 골다공증의 진단 및 골다공증 환자의 치료효과를 분자 수준에서 판단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (12)

  1. UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2) 유전자를 포함하는 골다공증의 진단 및 치료효과 평가용 바이오 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 골다공증은 여성 골다공증인 것을 특징으로 하는 골다공증의 진단 및 치료효과 평가용 바이오 마커 조성물.
  3. 하기의 단계를 포함하는 골다공증 유발물질의 스크리닝 방법:
    (a)실험대상에 분석하고자 하는 피검물질을 처리하는 단계;
    (b)상기 실험 대상에서 UBAP2 의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    (c)상기 UBAP2 의 발현 또는 활성 정도가 상기 피검물질을 처리하기 전에 비해 증가한 피검물질을 선별하는 단계.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 실험대상은 UBAP2 유전자, 단백질을 포함하는, 사람, 침팬지, 마우스, 햄스터, 돼지, 소, 닭, 개, 고양이, 면양, 및 산양으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 골다공증 동물모델; 또는
    MC3T3-E1 또는 C3H10T1/2의 골다공증 세포모델인 것을 특징으로 하는, 골다공증 유발물질의 스크리닝 방법.
  5. 하기의 단계를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법:
    (a)실험대상에 분석하고자 하는 피검물질을 처리하는 단계;
    (b)상기 실험대상에서 UBAP2 의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    (c)상기 UBAP2 의 발현 또는 활성 정도가 상기 피검물질을 처리하기 전에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 실험대상은 UBAP2 유전자, 단백질을 포함하는, 사람, 침팬지, 마우스, 햄스터, 돼지, 소, 닭, 개, 고양이, 면양, 및 산양으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 골다공증 동물모델; 또는
    MC3T3-E1 또는 C3H10T1/2의 골다공증 세포모델인 것을 특징으로 하는, 골다공증 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
  7. 제3항 또는 제5항에 있어서, 상기 골다공증은 여성 골다공증인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  8. 제3항 또는 제5항에 있어서,
    상기 (b)단계에서 UBAP2의 발현정도는 면역침강법, 방사능면역분석법, 효소면역분석법, 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴블롯, 및 유세포 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  9. 제3항 또는 제5항에 있어서,
    상기 (b)단계에서 UBAP2의 활성정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  10. UBAP2 의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 골다공증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 UBAP2 의 발현 억제제는 UBAP2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 골다공증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 UBAP2의 활성 억제제는 UBAP2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 골다공증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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