본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 2 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 3 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 4 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 5 서열에서 49-51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 6 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 7 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 8 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 9 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 서열 목록 제 10 서열에서 51번째 뉴클레오타이드, 또는 서열목록 제 11 서열에서 51번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보적인 서열을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 서열목록 제 2 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 서열목록 제 3 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 서열목록 제 4 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 C인 것, 서열목록 제 5 서열에서 49-51번째 뉴클레오타이드, 서열목록 제 6 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 T인 것, 서열목록 제 7 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 C인 것, 서열목록 제 8 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 C인 것, 서열목록 제 9 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 서열목록 제 10 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 C인 것, 또는 서열목록 제 11 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 G인 것을 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 골밀도 진단용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 골다공증과 같은 골 발달 질환(bone development disorders)의 효율적인 진단을 위하여 골밀도(bone mineral density: BMD)와 상관관계를 갖는 유전자 마커를 발견하고자 노력하였다. 그 결과, XPD(ERCC2) 유전자에서 골밀도를 유전자 수준에서 구별해 주는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) 현상을 발견하였다.
본 명세서에서, 용어 “골밀도”는 골미세 조직의 형태학적 및 기능적 측면을 설명하는 용어로 단위면적당 골질량이 차지하는 정도를 의미한다. 단위면적당 골질량의 정도를 BMD로 표현되며, 정상골밀도, 골결핍증(감소증) 및 골다공증으로분류된다.
본 발명의 SNP는 골밀도가 관련된 모든 질환 또는 질병, 즉 골 발달 질환의 진단에 될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “골 발달 질환”은 골 발달에서의 이상상태(disorders)를 의미하며, 예컨대, 질병 과정에서의 골 발달 변화, 노화 과정에서의 골 발달 변화에 의한 이상 상태를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 SNP에 의해 진단될 수 있는 골 발달 질환은 골다공증, 골다공증-가성신경교종, 엥겔만 질환, 리빙 질환(Ribbing's disease), 고포스파타아제혈증(hyperphosphatasemia), 반 부켐 질환(Van Buchem's disease), 국한성유선상과골증, 골화석증, 경결구축, 골반문증, 말단비대증, 파제트병, 섬유형성이상, 골형성 부전증, 고칼슘뇨증 및 골연화증이다. 가장 바람직하게는, 골 발달 질환은 골다공증이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기한 SNP 및 결손 변이 중에서, 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기가 골밀도의 유전적 마커로서 유용하다. 서열목록 제 1 서열은 XPD 유전자의 엑손 5에 있는 IVS(intervening sequence)에 발생된 SNP를 포함하는 서열이다. 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 G인 경우에는 골밀도가 높은 성향을 나타내는 인간을 나타내며, 이러한 SNP를 갖는 인간은 골다공증이 유발될 가능성이 낮다.
본 명세서에서 용어, “뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
한편, 본 발명은 상술한 바와 같이, 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 G, 서열목록 제 2 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 C, 서열목록 제 3 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 C, 서열목록 제 4 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 T, 서열목록 제 6 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 A, 서열목록 제 7 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 T, 서열목록 제 8 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 T, 서열목록 제 9 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 C, 서열목록 제 10 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 T, 서열목록 제 11 서열에서 51번째 뉴클레오타이드가 A로 변화된 것의 대립형(allele)에 관한 것이나, 이러한 대립형 뉴클레오타이드가 이중가닥의 gDNA (genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
이러한 측면에서, 본 명세서의 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, gDNA에서 센 스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.
본 발명의 유전적 마커를 이용하여 골밀도를 진단하는 경우, 우선 생체시료(biosmaple)로부터 핵산 분자를 분리한다.
본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산분자는 다양한 생체시료로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 조직, 세포, 혈액, 림프, 골수액, 타액, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액 및 세포 조직액으로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 유전적 마커를 이용하여 골밀도 또는 골 발달 질환을 진단하는 경우, 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다.
출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다 (참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem . 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 식물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다 (참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).
본 발명의 유전적 마커를 이용하여 이러한 마커가 있는 지 여부를 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS , USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res ., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann . Rev . Genet ., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석 또는 TDGS(two-dimensional gene scanning)도 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다.
다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다.
예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.
혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 자가면역질환 여부를 결정한다.
본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.
본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 상술한 유전적 마커를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3‘-말단 또는 5’-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스 (duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3‘-말단 또는 5’-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.
혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
골밀도 또는 골 발달 질환을 진단하기 위하여, 유전적 마커를 증폭하기 위해서는, 상술한 유전적 마커를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 기본적으로 이용한다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 PCR 증폭 (참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822)), 리가아제 체인 반응 (LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 체인 반응 (Barany, PCR Methods and Applic ., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 리페어 체인 반응 (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA (U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 PCR 증폭 단계에 따라 증폭한다.
증폭 기술이 적용되는 경우에는, 프라이머의 디자인이 중요하다. 바람직하게는, 프라이머쌍 중에서 전방향 또는 역방향 프라이머는 서열목록 제 1 서열 내지 제 11 서열에서 변이가 발생하는 위치에 인접한 서열과 어닐링할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 전방향 프라이머의 3‘-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 전방향 프라이머의 3‘-말단은 상기 SNP 염기 에 상보적인 염기를 갖으며, 바로 인접한 서열은 타깃 서열에 매칭되지 않는 비상보적인 염기를 갖는다.
PCR 방법의 조건 및 사용되는 시약과 효소는 당업계에서 통상적으로 공지된 것을 이용할 수 있다. 한편, PCR에 의해 증폭된 산물은 아가로스-겔 전기영동과 같은 통상적인 전기영동 방법으로 확인된다. 즉, PCR 증폭 반응물을 아가로스-겔에 로딩하여, 밴드가 출현하는 지 여부를 관찰하여 자가면역질환 여부를 판정한다.
본 발명은 골밀도 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 상술한 프라이머 또는 프로브를 필수 구성요소로 하는 바, 프라이머 또는 프로브에 대한 상세한 설명은 본 발명의 키트에 이용되는 프라이머 또는 프로브에도 적용된다. 따라서, 반복적인 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 키트에 포함되는 프라이머 또는 프로브는 서열목록 서열목록 제 1 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것, 또는 서열목록 제 2 서열에서 51번째 뉴클레오타이드 또는 이 뉴클레오타이드가 A인 것을 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 잔기로 이루어진 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는다.
예를 들어, 서열목록 서열목록 제 1 서열에서 51번째 위치한 SNP G 염기는 골밀도의 증가와 상관관계가 있는 SNP이다. 특히, GG 동형접합체(homozygote)인 경우 골밀도, 특히 대퇴골 골밀도의 증가와 큰 상관관계가 있다.
또한, 서열목록 제 2 서열에서 51번째에 위한 SNP C 염기는 골밀도의 감소와 상관관계가 있는 SNP이다. 특히, CC 동형접합체(homozygote)인 경우 골밀도, 특히 대퇴골 골밀도의 감소와 상관관계가 있다.
한편, 본 발명의 SNPs는 골밀도에 대한 반수체 분석(haplotyping)에 이용될 수 있다. 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 서열목록 서열목록 제 1 서열에서 51번째 염기가 G이고, 서열목록 제 2 서열에서 51번째 염기가 A인 반수체는 골밀도, 특히 대퇴골 골밀도의 증가와 큰 상관관계가 있다.
본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.