WO2014098135A1 - 前立腺基底細胞の検出方法 - Google Patents

前立腺基底細胞の検出方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting prostate basal cells, a method for confirming the presence, decrease or disappearance of prostate basal cells, and an immunohistochemical staining kit for detecting prostate basal cells.
  • prostate basal cells can be reliably detected.
  • a definitive diagnosis of prostate cancer can be performed reliably.
  • a normal prostate consists of glandular cells and basal cells, and a tissue image in which basal cells exist around the glandular cells is observed. Androgen receptor, cytokeratin 8 and cytokeratin 18 are specifically expressed in glandular cells. Many prostate cancers are markers of these glandular cells. It expresses the androgen receptor, cytokeratin 8, or cytokeratin 18, and thus prostate cancer is thought to be derived from glandular cells.
  • basal cells are known to disappear in prostate cancer. Therefore, a prostate cancer is confirmed by performing immunohistochemical staining of prostate using an antibody against p63 or cytokeratin expressed in normal basal cells, and confirming disappearance of basal cells. Yes.
  • an object of the present invention is to provide a method for detecting prostate basal cells by searching for a molecule specifically expressed in prostate basal cells and analyzing the molecule.
  • TRIM29 Tripartite motif-containing protein 29
  • the present invention [1] A method for detecting prostate basal cells, characterized by visualizing the expression of TRIM29 (Tripartite motif-containing protein 29) protein in prostate basal cells by immunohistochemical staining, [2] The method for detecting prostate basal cells according to [1], wherein the morphology of prostate glandular tissue structure and the expression of visualized TRIM29 (Tripartite motif-containing protein 29) protein are analyzed, [3] The method for detecting prostate basal cells according to [1] or [2], wherein the expression of cytokeratin and / or p63 protein is further visualized by immunohistochemical staining.
  • TRIM29 Tripartite motif-containing protein 29
  • the TRIM29 gene has been reported to be associated with lung cancer, ovarian serous papillary adenocarcinoma, and cervical intraepithelial neoplasia (Patent Documents 1 to 4). Further, a method for predicting prognosis of prostate cancer by examining 80 mRNAs including TRIM29 is disclosed (Patent Document 5). However, it has not been reported that TRIM29 is expressed in basal cells of normal prostate.
  • prostate basal cells of the present invention normal prostate basal cells can be reliably detected, which is useful for histological studies of the prostate.
  • a definitive diagnosis of prostate cancer can be performed.
  • cytokeratin and / or immunohistochemical staining of p63 expression together a definitive diagnosis of prostate cancer can be performed more accurately.
  • FIG. 5 is a photomicrograph of normal prostate tissue immunostained with anti-TRIM29 monoclonal antibody or anti-cytokeratin monoclonal antibody (34 ⁇ E12).
  • the method for detecting prostate basal cells according to the present invention is characterized in that the expression of TRIM29 (Tripartite motif-containing protein 29) protein in the basal cells of the prostate is visualized by immunohistochemical staining. It is. That is, cells expressing prostate-derived TRIM29 can be determined as basal cells from their morphology and protein expression. Furthermore, basal cells constituting a part of the glandular tissue structure can be detected by confirming the morphology of the glandular tissue structure of the prostate and the expression of the visualized TRIM29 protein.
  • TRIM29 Tripartite motif-containing protein 29
  • the animal species having prostate basal cells detected by the detection method of the present invention is not limited as long as it has basal cells in the prostate, and mammals such as humans, monkeys, dogs, cats, ferrets, cows, horses , Goats, sheep, guinea pigs, hamsters, gerbils, mice or rats.
  • the detection method of the present invention can also be used for isolated cells. For example, it can also be used for primary cultured cells or isolated cells containing the isolated basal cells of the mammal.
  • prostate The prostate is a gland of the male (male) genital system that lies below the bladder and before the rectum. It is composed of two types of cells, basal cells and glandular cells. Histologically, prostate basal cells are present around the prostate gland cells.
  • Prostate gland cells specifically express the androgen receptor, cytokeratin 8 and cytokeratin 18 and many prostate cancers are derived from prostate line cells.
  • Prostate basal cells that can be detected by the detection method of the present invention are not limited as long as TRIM29 is expressed. However, the existence of prostate basal cells in which TRIM29 is not expressed is not denied.
  • TRIM29 Prostate basal cells that can be detected by the detection method of the present invention are not limited as long as TRIM29 is expressed. However, the existence of prostate basal cells in which TRIM29 is not expressed is not denied.
  • p63, cytokeratin 5 (cytokeratin 5), and cytokeratin 14 (cytokeratin 14) are specifically expressed in the basal cells. p63 is believed to play an important role in prostate development, and immunohistochemical staining using 4A4, an anti-p63 monoclonal antibody, stains nuclei of basal cells.
  • Cytokeratin 5 and cytokeratin 14 are present in the cytoplasm and stained by immunohistochemical staining with 34 ⁇ E12, which is an anti-cytokeratin monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody 34 ⁇ E12 is an antibody that shows a positive reaction with cytokeratin 1 and cytokeratin 10 in addition to cytokeratin 5 and cytokeratin 14.
  • TRIM29 Tripartite motif-containing protein 29 belongs to the TRIM gene family, is a protein consisting of 588 amino acids in humans, and is also called ATDC (ataxia-telangiectasia group D-associated protein). TRIM29 has a plurality of zinc finger motifs and leucine zipper motifs, and is considered to bind to DNA and act as a transcriptional regulator in differentiation. In addition, it is known to be related to telangiectasia ataxia-telangiectasia, and it has been pointed out that it is related to the function of suppressing radiosensitivity.
  • the nucleotide sequence of a nucleic acid encoding human TRIM29 protein that can be analyzed (hereinafter also referred to as human TRIM29 gene) is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the human TRIM29 protein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the gene to be analyzed can be hybridized with a probe or primer that is expressed in prostate basal cells and can bind to the TRIM29 gene of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is used. It is not limited to having TRIM29 gene.
  • TRIM29 protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as long as it can bind to an antibody that is expressed in prostate basal cells and can bind to a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It is not limited. That is, in the present invention, TRIM29 to be analyzed may be TRIM29 having a mutation as long as it is expressed in prostate basal cells. Further, it is not limited to human TRIM29, and may be mammalian TRIM29, for example, human, monkey, dog, cat, ferret, cow, horse, goat, sheep, guinea pig, hamster, gerbil, mouse, or rat. Mention may be made of TRIM29.
  • a TRIM29 protein having a mutation taking human TRIM29 as an example, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 1 to several, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which 7, 8 or 9 amino acids are substituted, deleted, inserted or added; 80% or more of sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 80% or more, 85%
  • Examples of the protein include amino acid sequences having sequence identity of 90% or more, 95% or more, or 98% or more.
  • TRIM29 protein expression analysis by immunohistochemical staining in the detection method of the present invention is not limited, the expression of TRIM29 protein is visualized.
  • the detection method of the present invention preferably analyzes the morphology of the glandular tissue structure of the prostate and the expression of the visualized TRIM29 protein in the basal cells constituting a part of the glandular tissue structure.
  • visualization does not only mean that color development or fluorescence by immunohistochemical staining is confirmed with the naked eye via an optical microscope or fluorescence microscope.
  • color development, fluorescence, luminescence, or This includes mechanically detecting radiation (that is, a signal) and confirming an image or the like obtained by imaging the signal.
  • TRIM29 Tripartite motif-containing protein 29
  • TRIM29 protein in prostate basal cells is performed by immunohistochemical staining. This is because the position of the basal cell in the prostate tissue or the form of the basal cell can be confirmed.
  • Immunohistochemical staining is an established technique and can be performed based on a known method except that an antibody specific for TRIM29 is used. That is, immunohistochemical staining is a technique for detecting a specific antigen expressed in cells of a tissue section with an antibody that specifically recognizes the antigen. Specifically, immunohistochemical staining can be performed as follows, for example. The prostate tissue is sliced as a frozen section, or sliced from a block embedded in paraffin after fixation, and a tissue section is prepared. An antibody recognizing TRIM29 is reacted on the tissue section.
  • the TRIM29 protein By labeling this anti-TRIM29 antibody with a substance that emits a signal, the TRIM29 protein can be detected on a tissue section.
  • the second antibody against the anti-TRIM29 antibody may be labeled with a substance that emits a signal without labeling the anti-TRIM29 antibody.
  • biotin may be bound to the anti-TRIM29 antibody or the second antibody, and avidin that specifically binds to biotin may be labeled with a substance that emits a signal.
  • the substance used for labeling the antibody is not limited, but fluorescent dyes (eg, rhodamine, fluorescein isothiocyanate (FITC), rare earth metal chelates), radioactive substances (eg, 3 H, 14 C, or 125 I ), Enzymes (for example, peroxidase, alkaline phosphatase, or ⁇ -D-galactosidase) and the like can be used.
  • fluorescent dyes eg, rhodamine, fluorescein isothiocyanate (FITC), rare earth metal chelates), radioactive substances (eg, 3 H, 14 C, or 125 I ), Enzymes (for example, peroxidase, alkaline phosphatase, or ⁇ -D-galactosidase) and the like can be used.
  • the detection of the signal is not limited, but it can be detected by fluorescence, radiation (autoradiography), luminescence, color development or the like.
  • a signal can be detected under an optical microscope, and the cell morphology can be observed simultaneously.
  • Specific methods include a peroxidase anti-peroxidase method (PAP method), a streptavidin-biotin complex method (sABC method), a polymer reagent method in which a secondary antibody and a labeling enzyme are bound to a polymer, or labeled with FITC.
  • PAP method peroxidase anti-peroxidase method
  • sABC method streptavidin-biotin complex method
  • a method using a primary antibody or a method using an HRP-labeled anti-FITC antibody as a secondary antibody is generally used.
  • the anti-TRIM29 antibody used for immunohistochemical staining in the present invention can be prepared by a known method except that the TRIM29 protein or a partial peptide thereof is used as an immunogen.
  • the anti-TRIM29 antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferred. This is because monoclonal antibodies often have less cross-reactivity with other proteins.
  • Existing or commercially available antibodies can also be used.
  • monoclonal antibodies can be made according to the method of Koehler and Milstein (Nature 256: 495-497, 1975).
  • Polyclonal antibodies can be immunized periodically, for example, in the skin of rabbits by mixing NKG2D ligand alone or with an adjuvant such as Freund's complete adjuvant as an antigen combined with BSA, KLH, etc. When the blood pressure rises, blood can be collected and used directly as antiserum, or the antibody can be purified by a known method and used.
  • an adjuvant such as Freund's complete adjuvant as an antigen combined with BSA, KLH, etc.
  • an antibody fragment (antigen-binding fragment) containing an antigen-binding site for TRIM29 protein can be used.
  • antibody fragments include F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, or Fv.
  • a proteolytic enzyme for example, pepsin or papain
  • cytokeratin protein expression analysis and / or p63 protein expression analysis in addition to the TRIM29 protein expression analysis. That is, TRIM29 protein and cytokeratin protein may be analyzed, TRIM29 protein and p63 protein may be analyzed, or three proteins may be analyzed. In this embodiment, two or more proteins may be analyzed in the same tissue section of the same subject (patient). Further, two or more proteins may be individually analyzed in different tissue sections of the same subject (patient).
  • the cytokeratin expression analysis by immunohistological staining in the detection method of the present invention is not limited, but visualizes the expression of cytokeratin protein.
  • the detection method of the present invention preferably comprises analyzing the morphology of the glandular tissue structure of the prostate and the expression of the visualized cytokeratin protein in the basal cells constituting a part of the glandular tissue structure.
  • Cytokeratin protein expression analysis can be performed based on known methods, except that an antibody specific for cytokeratin is used. That is, it can be performed according to the method described in “TRIM29 protein expression analysis” except that an antibody specific for cytokeratin is used.
  • the amino acid sequence of cytokeratin 5 is shown in SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence of cytokeratin 14 is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the base sequence encoding cytokeratin 5 is shown in SEQ ID NO: 3, and the base sequence encoding cytokeratin 14 is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the antibody specific for cytokeratin may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferred.
  • monoclonal antibodies often have less cross-reactivity with other proteins.
  • Existing or commercially available antibodies can also be used.
  • a commercially available anti-cytokeratin monoclonal antibody 34 ⁇ E12 monoclonal antibody can be used, and this antibody recognizes cytokeratin 1, 5, 10, and 14.
  • the p63 protein expression analysis in the detection method of the present invention is not limited, but visualizes the expression of the p63 protein.
  • prostate basal cells can be morphologically confirmed in the same basal cell, and the morphology of prostate basal cells and prostate glandular tissue structure can be confirmed by p63 protein expression.
  • the detection method of the present invention preferably includes analyzing the morphology of the glandular tissue structure of the prostate and the expression of the visualized p63 protein in the basal cells constituting a part of the glandular tissue structure.
  • the expression analysis of p63 protein can be performed based on a known method except that an antibody specific for p63 is used. That is, it can be carried out according to the method described in “TRIM29 protein expression analysis” except that an antibody specific for p63 is used.
  • the amino acid sequence of p63 is shown in SEQ ID NO: 8, and the base sequence encoding p63 is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the antibody specific for p63 may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferred. This is because monoclonal antibodies often have less cross-reactivity with other proteins.
  • Existing or commercially available antibodies can also be used. For example, a commercially available anti-p63 monoclonal antibody 4A4 monoclonal antibody can be used.
  • the method for confirming the presence, decrease or disappearance of prostate basal cells according to the present invention uses the method for detecting prostate basal cells according to the present invention.
  • Tripartite motif-containing protein 29 It is characterized by visualizing protein expression by immunohistochemical staining.
  • the expression of TRIM29 protein is detected.
  • This detection of TRIM29 protein expression can be performed in the same manner as the “TRIM29 protein expression analysis” in the method for detecting prostate basal cells of the present invention. After the detection of the prostate basal cells, the presence, decrease or disappearance of the prostate basal cells is confirmed.
  • the expression of TRIM29 protein is visualized by immunohistochemical staining, whereby the morphology of basal cells and the glandular tissue structure of prostate, and the expression of TRIM29 protein And the presence, decrease or disappearance of prostate basal cells that constitute a part of the glandular tissue structure can be confirmed.
  • the expression level of the TRIM29 protein visualized under a fluorescence microscope or an optical microscope can be determined by visual observation of “decrease” or “disappearance”.
  • signals such as color development, luminescence, fluorescence, or radiation in an image taken with a camera or the like can be visualized mechanically and the expression level of the TRIM29 protein can be analyzed.
  • “presence”, “decrease”, or “disappearance” of the TRIM29 protein in the test sample can be determined by viewing the image with the naked eye, and the signal is mechanically quantified. It is also possible to judge. For example, when the amount of TRIM29 protein in the test sample is equivalent to the expression level of TRIM29 protein in the basal cells of normal prostate tissue, it is determined that prostate basal cells are “present” in the test sample. be able to. If the amount of TRIM29 protein in the test sample is hardly detected, it can be determined that the prostate basal cells are “disappeared”. Further, when the amount of TRIM29 protein in the test sample is an intermediate amount between “present” and “disappeared”, it can be determined that prostate basal cells are “decreased”.
  • prostate basal cells have disappeared completely or have been partially reduced. Therefore, it is possible to diagnose prostate cancer or make a definitive diagnosis by the method for detecting prostate basal cells and the method for confirming the presence, decrease or disappearance of prostate basal cells of the present invention.
  • the immunohistological staining kit for detecting prostate basal cells of the present invention comprises an anti-TRIM29 antibody.
  • the immunohistochemical staining kit of the present invention can be used in the method for detecting prostate basal cells, the method for confirming the presence, decrease or disappearance of prostate basal cells, and the method for diagnosing prostate cancer.
  • the immunohistochemical staining kit of the present invention preferably contains an antibody that specifically binds to TRIM29 or a fragment having an antigen-binding site thereof (antigen-binding fragment) in a desired form.
  • the anti-TRIM29 antibody the anti-TRIM29 antibody described in “[1] Method for detecting prostate basal cells” can be used.
  • the antibody fragment is not particularly limited as long as it has specific binding ability to TRIM29, that is, has an antigen-binding site (antigen-binding fragment).
  • an antibody fragment for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , or Fv can be used.
  • the immunohistochemical staining kit for detecting prostate basal cells of the present invention preferably contains an anti-cytokeratin antibody and / or an anti-p63 antibody.
  • the anti-cytokeratin antibody and the anti-p63 antibody the anti-cytokeratin antibody and the anti-p63 antibody described in “[1] Prostate basal cell detection method” or a fragment (antigen-binding fragment) having an antigen-binding site thereof may be used. it can.
  • the immunohistochemical staining kit for detecting prostate basal cells of the present invention may contain peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, glucose oxidase, or the like as an enzyme.
  • kits according to the present invention may contain an appropriate substrate for an enzyme or chemiluminescent substance.
  • kit of the present invention may include an instruction manual clearly stating that it is for detection of prostate basal cells.
  • the statement that it is for detection of prostate basal cells may be attached to the container of the kit. It may also be described that it is used for prostate cancer diagnosis or definitive diagnosis.
  • the anti-TRIM29 antibody can be used for producing an immunohistochemical staining kit for detecting prostate basal cells.
  • the anti-cytokeratin antibody can be used for the production of an immunohistochemical staining kit for detecting prostate basal cells.
  • the anti-p63 antibody can be used for the production of an immunohistochemical staining kit for detecting prostate basal cells.
  • Example 1 In this example, immunohistochemical staining of prostate tissue (normal and cancer) using anti-TRIM29 antibody was performed. Immunohistochemical staining was performed using 16 prostate specimens stored and managed in the Department of Pathology of Oncology, graduate School of Medicine, Hokkaido University. A summary of the prostate specimen subjected to the analysis is shown in Table 1. Fifteen specimens with prostate cancer and one specimen with prostate intraepithelial neoplasia (PIN) were analyzed.
  • PIN prostate intraepithelial neoplasia
  • FIG. 1 shows a part of the results of immunohistochemical staining of (1) and (2) above.
  • Anti-TRIM29 antibody was found to specifically stain basal cells present around glandular cells of normal prostate tissue. It has been found that cells and tissues stained with anti-TRIM29 antibody are reduced or disappeared in prostate cancer tissue. These results were equivalent to those obtained when immunohistochemical staining was performed using 34 ⁇ E12. In addition, the reliability of diagnosis of prostate cancer can be increased by overlapping use of 34 ⁇ E12 and anti-TRIM29 antibody.
  • Example 2 immunohistochemical staining of normal prostate was performed using an anti-TRIM29 mouse monoclonal antibody (anti-ATDC (A-5) antibody) (sc-166718) as the primary antibody.
  • Example 1 except that anti-TRIM29 mouse monoclonal antibody A5 was used as the primary antibody, anti-mouse IgG secondary antibody was used as the secondary antibody, and only normal prostate tissue was used as the specimen. The operation of 1) was repeated. As shown in FIG. 2, there was no non-specific staining, and the basal cells were clearly stained.
  • Example 3 immunohistochemical staining of normal prostate was performed using an anti-TRIM29 mouse monoclonal antibody (anti-ATDC (A-5) antibody) (sc-166718) and an anti-cytokeratin monoclonal antibody.
  • the procedure of Example 2 was repeated for the anti-TRIM29 mouse monoclonal antibody, and the procedure of Example 1 (2) was repeated for the anti-cytokeratin monoclonal antibody except that only normal prostate tissue was used.
  • staining with anti-TRIM29 mouse monoclonal antibody and anti-cytokeratin monoclonal antibody is very similar, but the prostate basal cells can be reliably confirmed by combining the two immunostainings. I was able to.
  • the method for detecting prostate basal cells of the present invention can be used for prostate histological studies. According to the method for confirming the presence, decrease or disappearance of prostate basal cells of the present invention, a definitive diagnosis of prostate cancer can be performed. In addition, a definitive diagnosis of prostate cancer can be performed more accurately by combining the analysis of the expression of cytokeratin.

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Abstract

　本発明の目的は、前立腺の基底細胞に特異的に発現している分子を探索し、その分子を解析することにより前立腺基底細胞の検出方法を提供することである。前記課題は、前立腺の基底細胞におけるＴＲＩＭ２９（Tripartite motif-containing protein 29）タンパク質の発現を免疫組織染色により可視化することを特徴とする前立腺基底細胞の検出方法により、解決することができる。

Description

前立腺基底細胞の検出方法
　本発明は、前立腺基底細胞の検出方法、前立腺基底細胞の存在、減少又は消失の確認方法及び前立腺基底細胞の検出用免疫組織染色キットに関する。本発明によれば、前立腺基底細胞を確実に検出することができる。また、前立腺がんの確定診断を確実に行うことができる。
　正常な前立腺は、腺細胞及び基底細胞からなっており、腺細胞の周囲に基底細胞が存在する組織像が観察される。
　腺細胞には、アンドロゲン受容体（Ａｎｄｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、サイトケラチン８（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ８）、及びサイトケラチン１８（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１８）が特異的に発現しているが、前立腺がんの多くは、これらの腺細胞のマーカーであるアンドロゲン受容体、サイトケラチン８、又はサイトケラチン１８を発現しており、従って前立腺がんは腺細胞に由来すると考えられている。
　一方、基底細胞は前立腺がんにおいて、消失することが知られている。そのため、正常な基底細胞に発現しているｐ６３又はサイトケラチンに対する抗体を用いて、前立腺の免疫組織染色を行い、そして基底細胞の消失を確認することによって、前立腺がんの確定診断が行われている。
国際公開第２００８／１５０５１２号公報 国際公開第２００５／０１４７８１号公報 国際公開第２００４／０１８７１１号公報 国際公開第２００６／０８０５９７号公報 国際公開第２００４／０１８７１１号公報
　しかしながら、前記の基底細胞の免疫組織染色において、抗ｐ６３抗体、又は抗サイトケラチン抗体を用いた免疫組織染色のみでは、基底細胞が消失しているか否かの判断が困難な場合があった。
　従って、本発明の目的は、前立腺の基底細胞に特異的に発現している分子を探索し、その分子を解析することにより前立腺基底細胞の検出方法を提供することである。
　本発明者は、正常前立腺組織の基底細胞に特異的に発現している分子について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、正常前立腺組織の基底細胞にＴＲＩＭ２９（Tripartite motif-containing protein 29）が特異的に発現していることを見出した。そして、ＴＲＩＭ２９の前立腺組織における発現を免疫組織染色により可視化することにより、基底細胞を検出できることがわかった。
　本発明は、こうした知見に基づくものである。
　従って、本発明は、
［１］前立腺の基底細胞におけるＴＲＩＭ２９（Tripartite motif-containing protein 29）タンパク質の発現を免疫組織染色により可視化することを特徴とする前立腺基底細胞の検出方法、
［２］前立腺の腺組織構造の形態及び可視化されたＴＲＩＭ２９（Tripartite motif-containing protein 29）タンパク質の発現を解析する、［１］に記載の前立腺基底細胞の検出方法、
［３］更にサイトケラチン及び／又はｐ６３タンパク質の発現を免疫組織染色により可視化する、［１］又は［２］に記載の前立腺基底細胞の検出方法、
［４］前立腺の腺組織構造の形態、並びに可視化されたサイトケラチンタンパク質の発現及び／又は可視化されたｐ６３タンパク質の発現を解析する、［３］に記載の前立腺基底細胞の検出方法、
［５］前記［１］～［４］のいずれかに記載の前立腺基底細胞の検出方法を用いることを特徴とする前立腺基底細胞の存在、減少又は消失の確認方法、
［６］抗ＴＲＩＭ２９抗体またはその抗原結合断片を用いる免疫組織染色により、対象から採取された前立腺組織における前立腺基底細胞を検出する工程を含む、前立腺がんの診断方法、
［７］正常な前立腺組織との比較における前立腺基底細胞の減少又は消失が前立腺がんの存在を示す、［６］に記載の診断方法、
［８］前立腺がんの診断において使用するための、抗ＴＲＩＭ２９抗体またはその抗原結合断片、
［９］前立腺がんの診断のための、抗ＴＲＩＭ２９抗体またはその抗原結合断片を含む診断組成物、
［１０］前立腺がんの診断のための診断組成物の製造における、抗ＴＲＩＭ２９抗体またはその抗原結合断片の使用、
［１１］抗ＴＲＩＭ２９抗体またはその抗原結合断片を含む、前立腺基底細胞の検出用免疫組織染色キット、及び
［１２］抗サイトケラチン抗体もしくはその抗原結合断片及び／又は抗ｐ６３抗体もしくはその抗原結合断片を更に含む、［１１］に記載の前立腺基底細胞の検出用免疫組織染色キット、
に関する。
　なお、前記ＴＲＩＭ２９の遺伝子は、肺癌、卵巣漿液性乳頭状腺癌、及び子宮頸部上皮内腫瘍との関連が報告されている（特許文献１～４）。また、ＴＲＩＭ２９を含む８０のｍＲＮＡを調べることにより、前立腺がんの予後を予測する方法が開示されている（特許文献５）。しかしながら、正常前立腺の基底細胞においてＴＲＩＭ２９が発現していることは、報告されていなかった。
　本発明の前立腺基底細胞の検出方法によれば、正常な前立腺基底細胞を確実に検出することができ、前立腺の組織学的な研究に有用である。また、サイトケラチン及び／又はｐ６３の発現の免疫組織染色を併用することにより、更に正確に前立腺基底細胞を検出することが可能である。
　また、本発明の前立腺基底細胞の検出方法、及び本発明の前立腺基底細胞の存在、減少又は消失の確認方法によれば、前立腺がんの確定診断を行うことができる。また、サイトケラチン及び／又はｐ６３の発現の免疫組織染色を併用することにより、更に正確に前立腺がんの確定診断を行うことができる。
正常前立腺又は前立腺がんのそれぞれの組織を、抗ＴＲＩＭ２９ポリクローナル抗体又は抗サイトケラチンモノクローナル抗体（３４βＥ１２）によって免疫組織染色を行った顕微鏡写真である。 正常前立腺の組織を、抗ＴＲＩＭ２９モノクローナル抗体によって免疫組織染色を行った顕微鏡写真である。 正常前立腺組織を、抗ＴＲＩＭ２９モノクローナル抗体又は抗サイトケラチンモノクローナル抗体（３４βＥ１２）によって免疫組織染色した顕微鏡写真である。
［１］前立腺基底細胞の検出方法
　本発明の前立腺基底細胞の検出方法は、前立腺の基底細胞におけるＴＲＩＭ２９（Tripartite motif-containing protein 29）タンパク質の発現を免疫組織染色により可視化することを特徴とするものである。すなわち、前立腺由来のＴＲＩＭ２９が発現している細胞をその形態及びタンパク質の発現から基底細胞と判断することができるものである。更に、前立腺の腺組織構造の形態及び可視化されたＴＲＩＭ２９タンパク質の発現を確認することにより腺組織構造の一部を構成する基底細胞を検出することができるものである。
　本発明の検出方法によって検出される前立腺基底細胞を有する動物種は、前立腺に基底細胞を有する限りにおいて限定されるものではなく、哺乳動物、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、フェレット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、マウス、又はラットを挙げることができる。また、本発明の検出方法は、分離された細胞に用いることもできる。例えば、前記の哺乳動物の分離された基底細胞を含む初代培養細胞、又は継代細胞に使用することもできる。
《前立腺》
　前立腺は、男性（雄）生殖器系の腺であって、膀胱に下で直腸の前にある。基底細胞と腺細胞との２種類の細胞によって構成されている。組織学的には、前立腺腺細胞の周囲に前立腺基底細胞が存在している。
（前立腺腺細胞）
　前立腺腺細胞は、アンドロゲン受容体（Ａｎｄｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、サイトケラチン８（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ８）、及びサイトケラチン１８（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１８）を特異的に発現しており、多くの前立腺がんは前立腺線細胞由来である。
（前立腺基底細胞）
　本発明の検出方法によって検出することのできる前立腺基底細胞は、ＴＲＩＭ２９が発現している限りにおいて限定されない。しかしながら、ＴＲＩＭ２９が発現していない前立腺基底細胞の存在を否定するものではない。
　基底細胞には、ＴＲＩＭ２９以外に、ｐ６３、サイトケラチン５（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ５）、及びサイトケラチン１４（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ　１４）が特異的に発現している。ｐ６３は前立腺の発達に重要な役割を果たすと考えられており、抗ｐ６３モノクローナル抗体である４Ａ４を用いた免疫組織染色では基底細胞の核が染色される。また、サイトケラチン５及びサイトケラチン１４は細胞質に存在し、抗サイトケラチンモノクローナル抗体である３４βＥ１２による免疫組織染色で染色される。なお、モノクローナル抗体３４βＥ１２は、サイトケラチン５及びサイトケラチン１４以外にも、サイトケラチン１及びサイトケラチン１０にも陽性反応を示す抗体である。
《ＴＲＩＭ２９》
　ＴＲＩＭ２９（Tripartite motif-containing protein 29）は、ＴＲＩＭ遺伝子ファミリーに属し、ヒトでは５８８アミノ酸からなるタンパク質であり、別名をＡＴＤＣ（ataxia-telangiectasia group D-associated protein）という。ＴＲＩＭ２９は、複数のジンクフィンガーモチーフ（zinc finger motifs）及びロイシンジッパーモチーフ（leucine zipper motif）を有しており、ＤＮＡに結合し、分化において転写制御因子として働く可能性が考えられている。また、毛細血管拡張性運動失調（ataxia-telangiectasia）に関連することが知られており、放射線感受性の抑制機能との関連が指摘されている。
　本発明において、分析することのできるヒトのＴＲＩＭ２９タンパク質をコードする核酸（以下、ヒトＴＲＩＭ２９遺伝子とも称する）の塩基配列を配列番号１に、該ヒトＴＲＩＭ２９タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。しかしながら、分析対象の遺伝子は、前立腺基底細胞に発現し、且つ配列番号１の塩基配列のＴＲＩＭ２９遺伝子に結合することのできるプローブ又はプライマーとハイブリダイズできる限りにおいて、配列番号１に記載の塩基配列を有するＴＲＩＭ２９遺伝子に限定されない。また、分析対象のタンパク質は、前立腺基底細胞に発現し、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質と結合することのできる抗体と結合できる限りにおいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＴＲＩＭ２９タンパク質に限定されない。すなわち、本発明において、分析されるＴＲＩＭ２９は、前立腺基底細胞に発現する限りにおいて、変異を有するＴＲＩＭ２９でもよい。また、ヒトのＴＲＩＭ２９に限定されるものではなく、哺乳動物のＴＲＩＭ２９でもよく、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、フェレット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、マウス、又はラットのＴＲＩＭ２９を挙げることができる。変異を有するＴＲＩＭ２９タンパク質の例としては、ヒトＴＲＩＭ２９を例にとると、配列番号２のアミノ酸配列において、１個から数個、例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質； 配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。
《ＴＲＩＭ２９タンパク質発現解析》
　本発明の検出方法における免疫組織染色によるＴＲＩＭ２９発現解析は、限定されるものではないが、ＴＲＩＭ２９タンパク質の発現を可視化するものである。ＴＲＩＭ２９タンパク質の発現を可視化することにより、同一の基底細胞において、前立腺基底細胞を形態的に確認することができ、更に前立腺基底細胞及び前立腺の腺組織構造の形態をＴＲＩＭ２９タンパク質の発現により確認することができる。すなわち、本発明の検出方法は、好ましくは前立腺の腺組織構造の形態及び前記可視化されたＴＲＩＭ２９タンパク質の発現を、腺組織構造の一部を構成する基底細胞において解析するものである。
　なお、本明細書において「可視化」とは、免疫組織染色による発色又は蛍光を光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡を介して、肉眼により確認することのみを意味するものではなく、例えば発色、蛍光、発光、又は放射線（すなわち、シグナル）を機械的に検出し、そのシグナルをイメージ化した映像等を確認することを含むものである。
　また、本明細書において、「前立腺の腺組織構造の形態及び前記可視化されたＴＲＩＭ２９（Tripartite motif-containing protein 29）タンパク質の発現を解析する」とは、前立腺の腺組織構造の形態と、ＴＲＩＭ２９タンパク質の発現を同時に観察することのみではなく、例えば、前立腺の腺組織構造の形態と、前記のシグナルをイメージ化した映像等とを比較して観察することを含むものである。
　前立腺基底細胞におけるＴＲＩＭ２９タンパク質の解析は、免疫組織染色によって行う。前立腺組織における基底細胞の位置、又は基底細胞の形態を確認することができるからである。
（免疫組織染色）
　免疫組織染色は、確立された技術であり、ＴＲＩＭ２９に特異的な抗体を使用することを除いては、公知の方法に基づいて行うことが可能である。すなわち、免疫組織染色とは、組織切片の細胞に発現している特定の抗原を、その抗原を特異的に認識する抗体によって検出する手法である。
　具体的には、免疫組織染色は、例えば以下のように行うことができる。前立腺組織を凍結切片として薄切、又は固定後パラフィン包埋したブロックから薄切し、組織切片を作製する。組織切片上にＴＲＩＭ２９を認識する抗体を反応させる。この抗ＴＲＩＭ２９抗体を、シグナルを発する物質で標識しておくことにより、ＴＲＩＭ２９タンパク質を組織切片上において検出することができる。また、抗ＴＲＩＭ２９抗体を標識せずに、抗ＴＲＩＭ２９抗体に対する第２抗体を、シグナルを発する物質で標識してもよい。更に、抗ＴＲＩＭ２９抗体、又は第２抗体にビオチンを結合させ、ビオチンに特異的に結合するアビジンをシグナルを発する物質で標識してもよい。
　抗体の標識に用いられる物質も限定されるものではないが、蛍光色素（例えば、ローダミン、フルオレセインイソチアネート（ＦＩＴＣ）、希土類金属キレート）、放射性物質（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、又はβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ）などを用いることができる。また、シグナルの検出も限定されるものではないが、蛍光、放射線（オートラジオグラフィー）、発光、又は発色などによって検出することが可能である。蛍光色素として、ローダミン又はＦＩＴＣ等を用いた場合は、蛍光顕微鏡を用いてシグナルを検出できる。また、アルカリフォスファターゼを用い、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ等で発色した場合は、光学顕微鏡下でシグナルを検出することができ、細胞の形態も同時に観察することが可能である。
　具体的な方法としては、ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ法（ＰＡＰ法）、ストレプトアビジンービオチン複合体法（ｓＡＢＣ法）、二次抗体と標識酵素とのポリマーへ結合させたポリマー試薬法、又はＦＩＴＣで標識した一次抗体を用いるか又は二次抗体としてＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体を用いる方法などが、一般的に用いられている。
（抗ＴＲＩＭ２９抗体）
　本発明における免疫組織染色に用いる抗ＴＲＩＭ２９抗体は、免疫原としてＴＲＩＭ２９タンパク質又はその部分ペプチドを用いること以外は、公知の方法によって作成することが可能である。抗ＴＲＩＭ２９抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体の方が、他のタンパク質との交差反応が少ないことが多いからである。既存又は市販の抗体を用いることもできる。
　例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５－４９７、１９７５）に従って作製することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えばウサギの皮内に、ＮＫＧ２Ｄリガンドを単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫し、血中の抗体価が上昇した時点で採血してそのまま抗血清とするか、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
　また、免疫学的分析方法に用いる抗体として、ＴＲＩＭ２９タンパク質に対する抗原結合部位を含む抗体断片（抗原結合断片）を用いることも可能である。かかる抗体断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、又はＦｖ等を挙げることができる。これらの抗体断片は、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することにより、得ることができる。
　本発明の前立腺基底細胞の検出方法においては、前記ＴＲＩＭ２９タンパク質発現分析に加えて、サイトケラチンタンパク質の発現分析及び／又はｐ６３タンパク質の発現分析を行うことが好ましい。すなわち、ＴＲＩＭ２９タンパク質及びサイトケラチンタンパク質を解析してもよく、ＴＲＩＭ２９タンパク質及びｐ６３タンパク質を解析してもよく、又は３つのタンパク質を解析してもよい。
　本実施態様においては、同一対象（患者）の同一組織切片において、２つ以上のタンパク質を解析してもよい。また、同一対象（患者）の異なる組織切片において、２つ以上のタンパク質を、それぞれ個別に解析してもよい。
《サイトケラチンタンパク質発現解析》
　本発明の検出方法における免疫組織染色によるサイトケラチン発現解析は、限定されるものではないが、サイトケラチンタンパク質の発現を可視化するものである。サイトケラチンタンパク質の発現を可視化することにより、同一の基底細胞において、前立腺基底細胞を形態的に確認することができ、更に前立腺基底細胞及び前立腺の腺組織構造の形態をサイトケラチンタンパク質の発現により確認することができる。すなわち、本発明の検出方法は、好ましくは前立腺の腺組織構造の形態及び前記可視化されたサイトケラチンタンパク質の発現を、腺組織構造の一部を構成する基底細胞において解析することを含むものである。
　サイトケラチンのタンパク質の発現解析は、サイトケラチンに特異的な抗体を使用することを除いては、公知の方法に基づいて行うことが可能である。すなわち、サイトケラチンに特異的な抗体を使用することを除いては、前記「ＴＲＩＭ２９タンパク質発現解析」に記載の方法に従って、実施することができる。サイトケラチン５のアミノ酸配列を配列番号４に、そしてサイトケラチン１４のアミノ酸配列を配列番号６に示す。サイトケラチン５をコードする塩基配列を配列番号３に、サイトケラチン１４をコードする塩基配列を配列番号５に示す。
　サイトケラチンに特異的な抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であてもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体の方が、他のタンパク質との交差反応が少ないことが多いからである。既存又は市販の抗体を用いることもできる。例えば、市販の抗サイトケラチンモノクローナル抗体である３４βＥ１２モノクローナル抗体を用いることができるが、この抗体はサイトケラチン１、５、１０、及び１４を認識する抗体である。
《ｐ６３タンパク質発現解析》
　本発明の検出方法におけるｐ６３タンパク質発現解析は、限定されるものではないが、ｐ６３タンパク質の発現を可視化するものである。ｐ６３タンパク質の発現を可視化することにより、同一の基底細胞において、前立腺基底細胞を形態的に確認することができ、更に前立腺基底細胞及び前立腺の腺組織構造の形態をｐ６３タンパク質の発現により確認することができる。すなわち、本発明の検出方法は、好ましくは前立腺の腺組織構造の形態及び前記可視化されたｐ６３タンパク質の発現を、腺組織構造の一部を構成する基底細胞において解析することを含むものである。
　ｐ６３タンパク質の発現分析は、ｐ６３に特異的な抗体を使用することを除いては、公知の方法に基づいて行うことが可能である。すなわち、ｐ６３に特異的な抗体を使用することを除いては、前記「ＴＲＩＭ２９タンパク質発現解析」に記載の方法に従って、実施することができる。ｐ６３のアミノ酸配列を配列番号８に示し、ｐ６３をコードする塩基配列を配列番号７に示す。
　ｐ６３に特異的な抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であてもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体の方が、他のタンパク質との交差反応が少ないことが多いからである。既存又は市販の抗体を用いることもできる。例えば、市販の抗ｐ６３モノクローナル抗体である４Ａ４モノクローナル抗体を用いることができる。
［２］前立腺基底細胞の存在、減少又は消失の確認方法
　本発明の前立腺基底細胞の存在、減少又は消失の確認方法は、本発明の前立腺基底細胞の検出方法を用いて、前立腺組織におけるＴＲＩＭ２９（Tripartite motif-containing protein 29）タンパク質の発現を免疫組織染色により可視化することを特徴とするものである。前記確認方法において、ＴＲＩＭ２９タンパク質の発現を検出する。このＴＲＩＭ２９タンパク質発現の検出は、前記本発明の前立腺基底細胞の検出方法における「ＴＲＩＭ２９タンパク質発現解析」と同じように実施することができる。そして、前記前立腺基底細胞の検出の後に、前立腺基底細胞の存在、減少又は消失を確認する。
　本発明の前立腺基底細胞の存在、減少又は消失の確認方法においては、ＴＲＩＭ２９タンパク質の発現を免疫組織染色により可視化することにより、基底細胞の形態及び前立腺の腺組織構造の形態と、ＴＲＩＭ２９タンパク質の発現との関係を観察することが可能であり、確実に腺組織構造の一部を構成する前立腺基底細胞の存在、減少又は消失を確認することが可能である。
　例えば、組織切片上において、前立腺基底細胞の存在、減少又は消失を確認する場合、正常前立腺組織の基底細胞におけるＴＲＩＭ２９タンパク質の発現量と比較して、被検試料のＴＲＩＭ２９タンパク質の「存在」、「減少」又は「消失」を蛍光顕微鏡下、又は光学顕微鏡下における可視化したＴＲＩＭ２９タンパク質の発現量を目視によって判定することができる。また、カメラ等で撮影したイメージ中の発色、発光、蛍光、又は放射線などのシグナルを、機械的に可視化し、そのＴＲＩＭ２９タンパク質の発現量を解析することができる。かかる方法によれば、被検試料のＴＲＩＭ２９タンパク質の「存在」、「減少」、又は「消失」を、イメージを肉眼で見ることによって判断することもでき、また上記シグナルを機械的に数値化して判断することも可能である。
　例えば、正常前立腺組織の基底細胞におけるＴＲＩＭ２９タンパク質の発現量と比較して、被検試料のＴＲＩＭ２９タンパク質の量が同等の場合、該被検試料において前立腺基底細胞が「存在」していると判断することができる。また被検試料のＴＲＩＭ２９タンパク質の量がほとんど検出できない場合、前立腺基底細胞は「消失」していると判断できる。また、被検試料のＴＲＩＭ２９タンパク質の量が「存在」と「消失」の中間の量の場合、前立腺基底細胞が「減少」していると判断することができる。
《前立腺がん》
　前立腺がんの場合、前立腺基底細胞が完全に消失したり、一部を残して減少している。従って、本発明の前立腺基底細胞の検出方法、及び前立腺基底細胞の存在、減少又は消失の確認方法によって、前立腺がんの診断、又は確定診断を行うことが可能である。
［３］免疫組織染色キット
　本発明の前立腺基底細胞の検出用免疫組織染色キットは、抗ＴＲＩＭ２９抗体を含むものである。本発明の免疫組織染色キットは、前記前立腺基底細胞の検出方法、前立腺基底細胞の存在、減少又は消失の確認方法、および前立腺がんの診断方法に用いることができる。
　本発明の免疫組織染色キットは、ＴＲＩＭ２９に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合部位を有する断片（抗原結合断片）が、所望の形態で含まれていることが好ましい。抗ＴＲＩＭ２９抗体としては、「［１］前立腺基底細胞の検出方法」に記載の抗ＴＲＩＭ２９抗体を用いることができる。すなわち、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体断片としては、ＴＲＩＭ２９への特異的結合能を有するもの、すなわち抗原結合部位を有するもの（抗原結合断片）であれば特に限定されるものではない。かかる抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。
　更に、本発明の前立腺基底細胞の検出用免疫組織染色キットは、抗サイトケラチン抗体及び／又は抗ｐ６３抗体を含むことが好ましい。抗サイトケラチン抗体及び抗ｐ６３抗体も、「［１］前立腺基底細胞の検出方法」に記載の抗サイトケラチン抗体及び抗ｐ６３抗体、又はその抗原結合部位を有する断片（抗原結合断片）を用いることができる。
　更に本発明の前立腺基底細胞の検出用免疫組織染色キットは、酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を含んでもよい。また、蛍光物質として、フルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を含んでもよい。また、放射性同位体として、３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を含んでもよい。なお、本発明に係るキットでは、その他の標識物質として、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を用いてもよい。また、本発明のキットは、酵素又は化学発光物質に対する適当な基質等を含んでいてもよい。
　また、本発明のキットは、前立腺基底細胞の検出用であることを明記した使用説明書を含んでいてもよい。前立腺基底細胞の検出用である旨の記載は、キットの容器に付されていてもよい。また、前立腺がんの診断、又は確定診断に用いることが記載されていてもよい。
　前記抗ＴＲＩＭ２９抗体は、前立腺基底細胞の検出用免疫組織染色キットの製造のために使用することができる。また、前記抗サイトケラチン抗体は、前立腺基底細胞の検出用免疫組織染色キットの製造のために使用することができる。更に、抗ｐ６３抗体は前立腺基底細胞の検出用免疫組織染色キットの製造のために使用することができる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１》
　本実施例では、抗ＴＲＩＭ２９抗体を使用した前立腺組織（正常及びがん）の免疫組織染色を行った。北海道大学大学院医学研究科病理学講座腫瘍病理学分野に保管及び管理されている１６検体の前立腺標本を用いて、免疫組織染色を行った。解析に供した前立腺標本の概要を表１に示す。前立腺癌を有する１５検体および前立腺上皮内腫瘍（Prostatic Intraepithelial Neoplasia: PIN）を有する１検体を解析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（１）抗ＴＲＩＭ２９ウサギポリクローナル抗体による染色
　１次抗体として抗ＴＲＩＭ２９ウサギポリクローナル抗体（サンタクルーズ社製ＡＴＤＣ（Ｈ－３００）ＳＣ－３３１５１）を、希釈液（１％ＢＳＡを含んだＰＢＳ）で２００倍に希釈し、それぞれの組織切片に添加した。１次反応は、３７℃、３０分で行った。洗浄液（ＰＢＳ）で、３回洗浄後、２次抗体として、ペルオキシダーゼ標識された抗ウサギ抗体を含む試薬（Ｄａｋｏ　ＲＥＡＬＴＭＥｎｖｉｓｉｏｎＴＭ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｒａｂｂｉｔ／ｍｏｕｓｅ）を組織切片に添加した。２次反応は、室温、３０分で行った。洗浄液で３回洗浄後、発色液（Ｄａｋｏ社ＲＥＡＬＴＭＤＡＢ＋ＣＨＲＯＭＯＧＥ　Ｎ）で発色反応を行った。
（２）抗サイトケラチンモノクローナル抗体による染色
　更に１次抗体として、抗サイトケラチンモノクローナル抗体である３４βＥ１２を用いて、前立腺組織（正常及びがん）の免疫組織染色を行った。２００倍に希釈した抗ＴＲＩＭ２９ウサギポリクローナル抗体に代えて、１％ＢＳＡにて２倍希釈した３４βＥ１２（Ｈ１２０５ニチレイ抗高分子サイトケラチンモノクローナル抗体）を用いたことを除いては、前記（１）の操作を繰り返した。
　上記（１）及び（２）の免疫組織染色の結果の一部を図１に示す。抗ＴＲＩＭ２９抗体は正常前立腺組織の腺細胞の周囲に存在する基底細胞を特異的に染色することが判明した。前立腺がん組織において、抗ＴＲＩＭ２９抗体によって染色される細胞及び組織が減少もしくは消失することが判明した。これらの結果は、３４βＥ１２を用いて免疫組織染色を行った場合と同等であった。また、３４βＥ１２及び抗ＴＲＩＭ２９抗体を重複して使用することで前立腺がんの診断の信頼度を高めることができる。
《実施例２》
　本実施例では、１次抗体として抗ＴＲＩＭ２９マウスモノクローナル抗体（抗ＡＴＤＣ（Ａ－５）抗体）（ｓｃ－１６６７１８）を用いて、正常前立腺の免疫組織染色を行った。
　１次抗体として、抗ＴＲＩＭ２９マウスモノクローナル抗体Ａ５を用い、２次抗体として、抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いたこと、並びに検体として正常前立腺組織のみを用いたことを除いては、実施例１（１）の操作を繰り返した。
　図２に示すように、非特異的な染色が無く、基底細胞が明瞭に染色された。
《実施例３》
　本実施例では、抗ＴＲＩＭ２９マウスモノクローナル抗体（抗ＡＴＤＣ（Ａ－５）抗体）（ｓｃ－１６６７１８）及び抗サイトケラチンモノクローナル抗体を用いて、正常前立腺の免疫組織染色を行った。
　抗ＴＲＩＭ２９マウスモノクローナル抗体については、実施例２の操作を、抗サイトケラチンモノクローナル抗体については、正常前立腺組織のみを用いたことを除いては、実施例１（２）の操作を繰り返した。
　図３に示すように、抗ＴＲＩＭ２９マウスモノクローナル抗体と抗サイトケラチンモノクローナル抗体とによる染色は、非常に似たものであるが、２つの免疫染色を組み合わせることにより、確実に前立腺基底細胞を確認することができた。
　また、実施例１～３の免疫組織染色の結果を解析したところ、前立腺癌の全例に関して、癌組織部分においてはＴＲＩＭ２９の発現が消失していた。一方、前立腺上皮内腫瘍に関しては、正常前立腺と同じように基底細胞部分でＴＲＩＭ２９の発現が認められた。これらの結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明の前立腺基底細胞の検出方法は、前立腺の組織学的な研究に用いることができる。本発明の前立腺基底細胞の存在、減少又は消失の確認方法によれば、前立腺がんの確定診断を行うことができる。また、サイトケラチンの発現の分析を併用することにより、更に正確に前立腺がんの確定診断を行うことができる。

Claims (12)

  1. 　前立腺の基底細胞におけるＴＲＩＭ２９（Tripartite motif-containing protein 29）タンパク質の発現を免疫組織染色により可視化することを特徴とする前立腺基底細胞の検出方法。
  2. 　前立腺の腺組織構造の形態及び可視化されたＴＲＩＭ２９（Tripartite motif-containing protein 29）タンパク質の発現を解析する、請求項１に記載の前立腺基底細胞の検出方法。
  3. 　更にサイトケラチン及び／又はｐ６３タンパク質の発現を免疫組織染色により可視化する、請求項１又は２に記載の前立腺基底細胞の検出方法。
  4. 　前立腺の腺組織構造の形態、並びに可視化されたサイトケラチンタンパク質の発現及び／又は可視化されたｐ６３タンパク質の発現を解析する、請求項３に記載の前立腺基底細胞の検出方法。
  5. 　前記請求項１～４のいずれか一項に記載の前立腺基底細胞の検出方法を用いることを特徴とする前立腺基底細胞の存在、減少又は消失の確認方法。
  6. 　抗ＴＲＩＭ２９抗体またはその抗原結合断片を用いる免疫組織染色により、対象から採取された前立腺組織における前立腺基底細胞を検出する工程を含む、前立腺がんの診断方法。
  7. 　正常な前立腺組織との比較における前立腺基底細胞の減少又は消失が前立腺がんの存在を示す、請求項６に記載の診断方法。
  8. 　前立腺がんの診断において使用するための、抗ＴＲＩＭ２９抗体またはその抗原結合断片。
  9. 　前立腺がんの診断のための、抗ＴＲＩＭ２９抗体またはその抗原結合断片を含む診断組成物。
  10. 　前立腺がんの診断のための診断組成物の製造における、抗ＴＲＩＭ２９抗体またはその抗原結合断片の使用。
  11. 　抗ＴＲＩＭ２９抗体またはその抗原結合断片を含む、前立腺基底細胞の検出用免疫組織染色キット。
  12. 　抗サイトケラチン抗体もしくはその抗原結合断片及び／又は抗ｐ６３抗体もしくはその抗原結合断片を更に含む、請求項１１に記載の前立腺基底細胞の検出用免疫組織染色キット。
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