ES2676893T3 - Método para detectar células basales prostáticas - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para detectar células basales prostáticas, que comprende visualizar la expresión de proteína 29 que contiene motivo tripartito proteína (TRIM29) en células basales de una próstata por inmunohistotinción.
Description
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DESCRIPCION
Metodo para detectar celulas basales prostaticas Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un metodo para detectar celulas basales prostaticas, un metodo para identificar la presencia, disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas. La presente invencion permite una deteccion fiable de celulas basales prostaticas. La presente invencion permite asimismo un diagnostico definitivo fiable de cancer de prostata.
Tecnica anterior
La prostata normal consiste en celulas glandulares y celulas basales y se observa una imagen histologica en la que las celulas basales estan presentes alrededor de las celulas glandulares.
Los receptores de androgenos citoqueratina 8 y citoqueratina 18 se expresan espedficamente en las celulas glandulares y la mayona de los canceres de prostata expresan receptores de androgeno citoqueratina 8 o citoqueratina 18, como marcadores de estas celulas glandulares. Por lo tanto, el cancer de prostata se considera como derivado de las celulas glandulares.
Se sabe que las celulas basales desaparecen en el cancer de prostata. Por tanto, se realiza un diagnostico definitivo de cancer de prostata llevando a cabo una inmunohistotincion de la prostata utilizando un anticuerpo para p63 o citoqueratina expresado en celulas basales normales e identificando la desaparicion de las celulas basales.
Lista de citas
Bibliografia de patentes
Bibliografia de patente 1: Publicacion internacional No. WO 2008/150512 Bibliografia de patente 2: Publicacion internacional No. WO 2005/014781 Bibliografia de patente 3: Publicacion internacional No. WO 2004/018711 Bibliografia de patente 4: Publicacion internacional No. WO 2006/080597 Bibliografia de patente 5: Publicacion internacional No. WO 2004/018711
Roy et al (PLOS ONE, 2010, vol. 5, edicion 9, paginas 1-2) notifica la expresion genica diferencial de celulas desde el seno urogenital de embriones murinos de 16 dfas de vida, principalmente del epitelio del seno urogenital (UGE) frente al epitelio mesenquima del seno urogenital (UGM). Kosaka et al. (Annals de Surgical Oncology, 2007, 14(9): 2543-2549) notifica el aumento de la expresion de ARNm de TRIM29 en tejido de tumor de cancer gastrico. En la patente internacional WO2006/080597 se notifica asimismo marcadores de diagnostico de cancer de pulmon que comprenden TRIM29. Paner et al. (URL:
http://www.archivesofpathology.org/doi/pdf/10.1043/1543- 2165(2008)132[1388: BPIDIP] 2.0.CO; 2) Rock et al (PNAS, 2009, vol. 106, no 31 pp. 12771-12775) notifica expresion genica diferencial en celulas basales traqueales murmicas. Asimismo, T. Ernst, et. al. divulga la expresion genica reducida de TRIM29 en cancer de prostata (American Journal de Pathology, Vol.160(6), junio 2002, paginas 2169-2180).
http://www.archivesofpathology.org/doi/pdf/10.1043/1543- 2165(2008)132[1388: BPIDIP] 2.0.CO; 2) Rock et al (PNAS, 2009, vol. 106, no 31 pp. 12771-12775) notifica expresion genica diferencial en celulas basales traqueales murmicas. Asimismo, T. Ernst, et. al. divulga la expresion genica reducida de TRIM29 en cancer de prostata (American Journal de Pathology, Vol.160(6), junio 2002, paginas 2169-2180).
Sumario de la invencion Problema tecnico
En relacion con la inmunohistotincion de celulas basales mencionada, a veces resulta dificil determinar si las celulas basales han desaparecido o no unicamente por inmunohistotincion utilizando un anticuerpo anti-p63 o anticuerpo anti-citoqueratina.
Por tanto, un objeto de la presente invencion es proporcionar un metodo para detectar celulas basales prostaticas buscando moleculas expresadas espedficamente en celulas basales prostaticas y analizando dichas moleculas.
Solucion del problema
Como resultado de un exhaustivo estudio sobre moleculas expresadas espedficamente en celulas basales de tejido de prostata normal, los autores de la presente invencion han observado de manera sorprendente que la protema 29 que contiene motivo tripartita (TRIM29) se expresa espedficamente en las celulas basales de tejido de prostata normal. Mas adelante, se ha demostrado que las celulas basales se pueden detectar visualizando la expresion de TRIM29 en tejido de prostata por inmunohistotincion.
La presente invencion se basa en dichos hallazgos.
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Concretamente, la presente invencion se refiere a:
[1] Un metodo in vitro para detectar celulas basales prostaticas que comprende visualizar la expresion de protema 29 que contiene motivo tripartito (TRIM29) en celulas basales de la prostata por inmunohistotincion;
[2] El metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con [1], que comprende analizar la morfologfa de la estructura del tejido glandular de la prostata y la expresion de protema 29 que contiene motivo tripartito (TRIM29) visualizada;
[3] El metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con [1] o [2], que comprende ademas visualizar la expresion de citoqueratina y/o protema p63 por inmunohistotincion;
[4] El metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con [3], que comprende analizar la morfologfa de la estructura del tejido glandular de la prostata y la expresion de protema citoqueratina visualizada y/o la expresion de protema p63 visualizada;
[5] El metodo de cualquiera de los puntos [1] a [4], donde se visualiza la presencia, disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas en el tejido de prostata recogido del sujeto en comparacion con un tejido de prostata normal.
[6] Un metodo para diagnosticar cancer de prostata, que comprende una etapa de deteccion de celulas basales prostaticas en tejido de prostata recogido de un sujeto por inmunohistotincion utilizando un anticuerpo anti- TRIM29 o un fragmento de union a anffgeno del mismo;
[7] El metodo de diagnostico de acuerdo con [6], donde la disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas en comparacion con las de tejido de prostata normal indica la presencia de cancer de prostata;
[8] Uso de un anticuerpo anti-TRIM29 o un fragmento de union a anffgeno del mismo en el diagnostico in vitro de cancer de prostata a traves de la deteccion de TRIM29 en celulas basales prostaticas.
Se ha notificado que el gen de TRIM29 esta asociado a cancer de pulmon, adenocarcinoma papilar seroso de ovario y neoplasia intraepitelial cervical (Bibliograffa de patentes 1 to 4). Se ha divulgado asimismo un metodo para predecir un pronostico de cancer de prostata examinando 80 ARNm que comprenden TRIM29 (Bibliograffa de patente 5). Sin embargo, no se ha notificado que TRIM29 se exprese en celulas basales de la prostata normal.
Efectos ventajosos de la invencion
El metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente invencion puede detectar de forma fiable celulas basales prostaticas normales y es util para realizar estudios histologicos de la prostata. La combinacion del metodo con la inmunohistotincion de citoqueratina y/o p63 expresadas puede detectar con mayor fiabilidad celulas basales prostaticas.
El metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente invencion y el metodo para identificar la presencia, disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente invencion permite un diagnostico definitivo de cancer de prostata. La combinacion de los metodos con la inmunohistotincion de citoqueratina y/o p63 expresadas permite un diagnostico definitivo mas fiable de cancer de prostata.
Breve descripcion de los dibujos
[Figura1] La Figura 1 es una serie de micrograffas, en las que se muestra el tejido de prostata normal o tejido de cancer de prostata sometido a la inmunohistotincion con anticuerpos policlonales anti-TRIM29 o un anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina (34pE12).
[Figura2] La Figura 2 es un par de micrograffas, en las que se muestra tejido de prostata normal sometido a la inmunohistotincion con un anticuerpo monoclonal anti-TRIM29.
[Figura3] La Figura 3 es un par de micrograffas, en las que se muestra tejido de prostata normal sometido a la inmunohistotincion con un anticuerpo monoclonal anti-TRIM29 o un anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina (34pE12).
Descripcion de las realizaciones
[1] Metodo para detectar celulas basales prostaticas
El metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente invencion comprende visualizar la expresion de protema 29 que contiene motivo tripartito (TRIM29) en celulas basales de la prostata por inmunohistotincion. De acuerdo con el metodo, se puede determinar que celulas derivadas de la prostata que expresan TRIM29 son celulas basales sobre la base de su morfologfa y expresion de protema. Por otra parte, el metodo permite la deteccion de celulas basales que forman parte de la estructura del tejido glandular identificando la morfologfa de la estructura del tejido glandular de la prostata y la expresion visualizada de Protema TRIM29.
La especie animal que tiene celulas basales prostaticas que se pueden detectar segun el metodo de deteccion de la presente invencion no esta limitada siempre y cuando tenga celulas basales en la prostata; y entre los ejemplos de las especies animales se incluyen mairffferos, como seres humanos, monos, perros, gatos, hurones, vacas,
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caballos, cabras, ovejas, cobayas, hamsters, jerbos, ratones o ratas. El metodo de deteccion de la presente invencion puede utilizarse tambien en celulas separadas. Por ejemplo, es posible tambien aplicar el metodo a celulas cultivadas primarias o celulas de paso que comprenden celulas basales separadas de cualquiera de los mairnferos mencionados.
<Prostata>
La prostata es una glandula del sistema reproductor masculino y esta situada debajo de la vejiga y frente al recto. La prostata se compone de dos tipos de celulas: las celulas basales y las celulas glandulares. Histologicamente, las celulas basales prostaticas estan presentes alrededor de las celulas glandulares prostaticas.
(Celulas glandulares prostaticas)
Las celulas glandulares prostaticas expresan espedficamente receptores de androgeno, citoqueratina 8 y citoqueratina 18, y la mayona de los canceres de prostata se derivan de celulas glandulares prostaticas.
(Celulas basales prostaticas)
Las celulas basales prostaticas que se pueden detectar segun el metodo de deteccion de la presente invencion no estan limitadas siempre y cuando las celulas expresen TRIM29. Sin embargo, ello no excluye la presencia de celulas basales prostaticas que no expresan TRIM29.
Las celulas basales expresan espedficamente p63, citoqueratina 5 y citoqueratina 14 ademas de TRIM29. Se considera que p63 desempena un importante papel en el desarrollo de la prostata; se tinen los nucleos de las celulas basales por inmunohistotincion con 4A4 que es un anticuerpo monoclonal anti-p63. Citoqueratina 5 y citoqueratina 14 estan presentes en el citoplasma y se tinen por inmunohistotincion con 34pE12 que es un anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina. El anticuerpo monoclonal 34pE12 es un anticuerpo que presenta reacciones positivas a citoqueratina 1 y citoqueratina 10 ademas de a citoqueratina 5 y citoqueratina 14.
<TRIM29>
La protema 29 que contiene motivo tripartita (TRIM29) pertenece a la familia de genes TRIM conocida tambien como ATDC (protema asociada a grupo ataxia-telangiectasia D). TRIM29 humana consiste en 588 aminoacidos. TRIM29 tiene una pluralidad de motivos de dedos de zinc y motivos de cremallera de leucina y se une a ADN. Se considera que es posible que TRIM29 funcione como regulador transcripcional en los procesos de diferenciacion. Se sabe que TRIM29 esta asociado a ataxia-telangiectasia y se ha senalado que esta asociada a la funcion de la supresion de la sensibilidad de radiacion.
De acuerdo con la presente divulgacion, la secuencia base de un acido nucleico que codifica protema TRIM29 humana analizable (en adelante, se hace referencia a ella tambien como gen TRIM29 humano) se presenta en la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoacidos de la protema TRIM29 humana se presenta en la SEQ ID NO: 2. Sin embargo, el gen que se va a analizar no se limita al gen TRIM29 que tiene la secuencia base tal como se presenta en SEQ ID NO: 1 siempre y cuando se exprese en celulas basales prostaticas y pueda hibridarse con una sonda o un cebador capaz de unirse al gen TRIM29 que tiene la secuencia base de SEQ ID NO: 1. La protema para su analisis no esta limitada a la protema TRIM29 que tiene la secuencia de aminoacidos presentada en SEQ ID NO: 2 siempre y cuando se exprese en celulas basales prostaticas y se pueda unir a un anticuerpo capaz de unirse a la protema que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2. Es decir, de acuerdo con la presente invencion, el TRIM29 que se va a analizar puede ser TRIM29 que tiene mutacion o mutaciones, siempre y cuando se exprese en celulas basales prostaticas. Tampoco se limita a TRIM29 humano y puede ser TRIM29 de mai^ero, incluyendo por ejemplo TRIM29 de seres humanos, monos, perros, gatos, hurones, vacas, caballos, cabras, ovejas cobayas, hamster, jerbos, ratones o ratas. Entre los ejemplos de Protema TRIM29 que tienen una mutacion o mutaciones se incluyen, cuando se toma por ejemplo TriM29 humano, una protema que consiste en una secuencia de aminoacidos en la que de 1 a varios aminoacidos, p.ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9, estan sustituidos, suprimidos, insertados a anadidos en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y una protema que consiste en una secuencia de aminoacidos que tiene 80 % o mas de identidad de secuencia, p.ej., 80 % o mas, 85 % o mas, 90 % o mas, 95 % o mas o 98 % o mas identidad de secuencia, con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2.
<Analisis de expresion de protema TRIM29>
El analisis de expresion de TRIM29 por inmunohistotincion de acuerdo con el metodo de deteccion de la presente invencion implica, pero no se limita a ello, visualizar la expresion de Protema TRIM29. Mediante la visualizacion de la expresion de protema TRIM29, se pueden identificar morfologicamente celulas basales prostaticas en las mismas celulas basales y las morfologfas de celulas basales prostaticas y la estructura del tejido glandular de la prostata se puede identificar sobre la base de la expresion de protema TRIM29. Es decir, el metodo de deteccion de la presente invencion implica preferentemente analizar, en celulas basales que forman parte de la estructura del tejido glandular, la morfologfa de la estructura del tejido glandular de la prostata y la expresion visualizada de Protema TRIM29.
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Tal como se emplea en el presente documento, la "visualizacion" no significa solamente la identificacion total de la coloracion o fluorescencia que resultan de la inmunohistotincion a traves de un microscopio optico o un microscopio de fluorescencia, sino que incluye, por ejemplo, la deteccion mecanica de coloracion, fluorescencia, luminiscencia o radiacion (es decir, una senal) seguido de la identificacion de una imagen o similar obtenida por representacion en imagen de la senal.
Tal como se emplea en el presente documento, el "analisis de la morfologfa de la estructura del tejido glandular de la prostata y la expresion de la protema 29 que contiene motivo tripartita (TRIM29) visualizada" incluye no solo la observacion simultanea de la morfologfa de la estructura del tejido glandular de la prostata y la expresion de protema TRIM29, sino tambien, por ejemplo, la observacion de la morfologfa de la estructura del tejido glandular de la prostata en comparacion con la imagen o similar obtenida por representacion en imagen de la senal.
El analisis de la protema TRIM29 en celulas basales prostaticas se lleva a cabo por inmunohistotincion, ya que pueden identificarse por inmunohistotincion la posicion de celulas basales en el tejido de prostata o la morfologfa de celulas basales.
(Inmunohistotincion)
La inmunohistotincion es una tecnica establecida y se puede llevar a cabo basandose en un metodo conocido, excepto por el uso de un anticuerpo espedfico para TRIM29. Es decir, la inmunohistotincion es un metodo que implica detectar un antfgeno espedfico expresado en celulas de cortes de tejido utilizando un anticuerpo que reconoce espedficamente el antigeno.
Concretamente, la inmunohistotincion puede llevarse a cabo por ejemplo del siguiente modo. Se congela y se corta tejido de prostata o se corta un bloque de tejido embebido en parafina y fijado para preparar cortes de tejido. Se hace reaccionar un anticuerpo que reconoce TRIM29 con la superficie del corte de tejido. El anticuerpo anti-TRIM29 puede marcarse con una sustancia que emite una senal para detectar protema TIRM29 en cada corte de tejido. Alternativamente, se puede marcar un segundo anticuerpo para el anticuerpo anti-TRIM29 con una sustancia que emite una senal sin marcar el anticuerpo anti-TRIM29. Por otra parte, es posible unir biotina al anticuerpo anti- TRIM29 o el segundo anticuerpo, seguido de marcado con avidina, espedficamente, union a biotina, con una sustancia que emite una senal.
Entre las sustancias que pueden utilizarse para marcar el anticuerpo se incluyen, pero sin limitarse a ellas, un colorante fluorescente (p.ej., rodamina, fluorescema, isotiocianato (FITC) o un quelato de metal de tierras raras), una sustancia radioactiva (p.ej., 3H, 14C o 125I) o una enzima (p.ej., peroxidasa, fosfatasa alcalina o p-D-galactosidasa). La deteccion de una senal se puede llevar a cabo utilizando, pero sin limitarse a ellos, fluorescencia, radiacion (autorradiograffa), luminiscencia y coloracion. Por ejemplo, cuando se utiliza rodamina o FITC como colorante fluorescente, la senal puede detectarse utilizando un microscopio de fluorescencia. Por ejemplo, cuando se utiliza fosfatasa alcalina y se lleva a cabo la coloracion utilizando NBT/BCIP, puede detectarse la senal con un microscopio optico y puede observarse simultaneamente la morfologfa de las celulas.
Concretamente, entre los metodos utilizados normalmente se incluyen metodo peroxidasa anti-peroxidasas (metodo PAP), un metodo de complejo estreptavidina-biotina (metodo ABC), un metodo de reactivo de polfmero en el que se unen un anticuerpo secundario y una enzima marcadora con un polfmero y un metodo en el que se utiliza un anticuerpo primario marcado con FITC o utilizando un anticuerpo anti-FITC marcado con HRP como anticuerpo secundario.
(Anticuerpo anti-TRIM29)
El anticuerpo anti-TRIM29 utilizado para la inmunohistotincion de acuerdo con la presente invencion puede prepararse a traves de un metodo conocido, excepto por el uso de protema TRIM29 o un peptido parcial del mismo como inmunogeno. El anticuerpo anti-TRIM29 puede consistir en anticuerpos policlonales o un anticuerpo monoclonal; preferentemente, un anticuerpo monoclonal, ya que un anticuerpo monoclonal suele producir menos reaccion cruzada con otras protemas. Es posible utilizar tambien un anticuerpo conocido o disponible en el mercado.
Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo monoclonal de acuerdo con el metodo de Koehler y Milstein (Nature 256: 495-497, 1975). Para los anticuerpos policlonales, por ejemplo, puede mezclarse un antfgeno unido a BSA o KLH con un adyuvante, como adyuvante completo de Freund, e inmunizarse inoculandolo intracutaneamente a un conejo de forma periodica, seguido de la recogida de sangre una vez que haya aumentado la titulacion del anticuerpo en la sangre y se pueda utilizar la sangre recogida como un antisuero o se puedan purificar los anticuerpos a traves de un metodo conocido antes de su uso.
El anticuerpo utilizado en el metodo de analisis inmunologico tambien puede ser un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de union a antfgeno para la protema TRIM29 (fragmento de union a antfgeno). Entre los ejemplos de fragmento de antfgeno se incluyen F(ab')2, Fab', Fab y Fv. Estos fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse cada uno de ellos, por ejemplo, por digestion de un anticuerpo con una proteinasa (por ejemplo, pepsina o papama)
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a traves de un metodo convencional y, posteriormente, por purificacion del producto resultante a traves de un metodo convencional para separar y purificar una protema.
En el metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente invencion, preferentemente, se realiza el analisis de expresion de protema citoqueratina y/o protema p63 ademas del analisis de expresion de protema TRIM29. Es decir, pueden analizarse la protema TRIM29 y la protema citoqueratina; pueden analizarse la protema TRIM29 y la protema p63; o pueden analizarse las tres protemas.
De acuerdo con la presente realizacion, pueden analizarse 2 o mas protemas en el mismo corte de tejido del mismo sujeto (paciente). Asimismo, es posible analizar por separado 2 o mas protemas en cada corte de tejido diferente del mismo sujeto (paciente).
<Analisis de expresion de protema citoqueratina>
El analisis por inmunohistotincion de expresion de citoqueratina en el metodo de deteccion de la presente invencion implica, pero no se limita a ello, visualizar la expresion de protema citoqueratina. Mediante la visualizacion de la expresion de protema citoqueratina, se pueden identificar morfologicamente celulas basales prostaticas en las mismas celulas basales y se puede identificar las morfologfas de celulas basales prostaticas y la estructura del tejido glandular de la prostata sobre la base de la expresion de protema citoqueratina. Es decir, el metodo de deteccion de la presente invencion implica preferentemente analizar la morfologfa de la estructura del tejido glandular de la prostata y la expresion de protema citoqueratina visualizada en celulas basales que forman parte de la estructura del tejido glandular.
El analisis de expresion de protema citoqueratina puede llevarse a cabo basandose en un metodo conocido excepto por el uso de un anticuerpo espedfico para citoqueratina. Concretamente, puede llevarse a cabo el analisis de acuerdo con el metodo descrito en "Analisis de expresion de protema TRIM29" excepto por el uso de un anticuerpo espedfico para citoqueratina. La secuencia de aminoacidos de citoqueratina 5 se presenta en SEQ ID NO: 4 y la secuencia de aminoacidos de citoqueratina 14 se presenta en SEQ ID NO: 6. La secuencia base que codifica citoqueratina 5 se presenta en SEQ ID NO: 3 y la secuencia base que codifica citoqueratina 14 se presenta en SEQ ID NO: 5.
El anticuerpo espedfico para citoqueratina puede consistir en anticuerpos policlonales o un anticuerpo monoclonal; preferentemente un anticuerpo monoclonal, ya que un anticuerpo monoclonal suele producir menos reaccion cruzada con otras protemas. Es posible utilizar tambien un anticuerpo conocido o disponible en el mercado. Se puede utilizar por ejemplo anticuerpo monoclonal 34pE12 que es un anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina disponible en el mercado; este anticuerpo reconoce citoqueratinas 1, 5, 10 y 14.
<Analisis de expresion de protema p63>
El analisis de expresion de protema p63 en el metodo de deteccion de la presente invencion implica, pero no se limita a ellos, visualizar la expresion de protema p63. Mediante la visualizacion de la expresion de protema p63, se pueden identificar morfologicamente celulas basales prostaticas en las mismas celulas basales y se puede identificar las morfologfas de celulas basales prostaticas y la estructura del tejido glandular de la prostata sobre la base de la expresion de protema p63. Es decir, el metodo de deteccion de la presente invencion implica preferentemente analizar la morfologfa de la estructura del tejido glandular de la prostata y la expresion de protema p63 visualizada en celulas basales que forman parte de la estructura del tejido glandular.
El analisis de expresion de protema p63 puede llevarse a cabo basandose en un metodo conocido excepto por el uso de un anticuerpo espedfico para p63. Concretamente, puede llevarse a cabo el analisis de acuerdo con el metodo descrito en "analisis de expresion de protema TRIM29”, excepto por el uso de un anticuerpo espedfico para p63. La secuencia de aminoacidos de p63 se presenta en SEQ ID NO: 8 y la secuencia base que codifica p63 se presenta en SEQ ID NO: 7.
El anticuerpo espedfico para p63 puede consistir en anticuerpos policlonales o un anticuerpo monoclonal; preferentemente un anticuerpo monoclonal, ya que un anticuerpo monoclonal suele producir menos reaccion cruzada con otras protemas. Es posible utilizar tambien un anticuerpo conocido o disponible en el mercado. Por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo monoclonal 4A4, que es un anticuerpo monoclonal anti-p63 disponible en el mercado.
[2] Metodo para identificar la presencia, disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas
El metodo para identificar la presencia, disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente invencion comprende visualizar la expresion de protema 29 que contiene motivo tripartita (TRIM29) en el tejido de prostata por inmunohistotincion aplicando el metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente invencion. En el de metodo identificacion, se detecta la expresion de protema TRIM29. La deteccion de la expresion de protema TRIM29 puede llevarse a cabo de la misma manera que se ha descrito en "Analisis de
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expresion de protema TRIM29" en el metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente invencion. Una vez detectadas las celulas basales prostaticas, se identifica la presencia, disminucion o desaparicion de las celulas basales prostaticas.
En el metodo para identificar la presencia, disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente invencion, la visualizacion de la expresion de protema TRIM29 por inmunohistotincion permite la observacion de la relacion entre las morfologfas de las celulas basales y la estructura del tejido glandular de la prostata y la expresion de protema TRIM29, permitiendo una identificacion fiable de la presencia, disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas que forman parte de la estructura del tejido glandular.
Por ejemplo, cuando se identifica la presencia, disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas en secciones de tejido, se puede determinar visualmente la “presencia”, "disminucion," o "desaparicion" de protema TRIM29 en una muestra de ensayo con un microscopio de fluorescencia o un microscopio optico sobre la base del nivel de expresion visualizada de protema TRIM29 en comparacion con el nivel de expresion de protema TRIM29 en las celulas basales del tejido de prostata normal. Se puede visualizar mecanicamente una senal, como pueda ser coloracion, luminiscencia, fluorescencia o radiacion en una imagen tomada con una camara o similar para analizar el nivel de expresion de protema TRIM29. Dicho metodo permite determinar la "presencia," "disminucion," o "desaparicion" de protema TRIM29 en una muestra de ensayo observando la imagen a simple vista y permite tambien determinar la "presencia," "disminucion," o "desaparicion" de protema TRIM29 por digitalizacion mecanica de la senal.
Por ejemplo, cuando el nivel de protema TRIM29 en una muestra de ensayo es comparable segun se compara con el nivel de expresion de protema TRIM29 en celulas basales del tejido de prostata normal, se puede determinar que estan “presentas” celulas basales prostaticas en la muestra de ensayo. Cuando puede detectarse poca protema TRIM29 en una muestra de ensayo, es posible determinar que las celulas basales prostaticas han “desaparecido.” Cuando el nivel de la protema TRIM29 en una muestra de ensayo es intermedio entre el de “presencia” y el de desaparicion”, se puede determinar la “disminucion” de las celulas basales prostaticas.
<Cancer de prostata>
En el cancer de prostata, las celulas basales prostaticas desaparecen completamente o se produce una disminucion quedando algunas celulas. Por tanto, el metodo para detectar celulas basales prostaticas y el metodo para identificar la presencia, disminucion y desaparicion de celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente invencion permite un diagnostico o un diagnostico definitivo de cancer de prostata.
[3] Kit de Inmunohistotincion
El kit de inmunohistotincion kit para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente divulgacion comprende un anticuerpo anti-TRlM29. El kit de inmunohistotincion de la presente divulgacion se puede utilizar en el metodo para detectar celulas basales prostaticas, el metodo para identificar la presencia, disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas y un metodo para diagnosticar cancer de prostata.
el kit de inmunohistotincion de la presente divulgacion comprende preferentemente un anticuerpo que se une espedficamente a TRIM29 o un fragmento que tiene su sitio de union a antfgeno (fragmento de union a antfgeno) en una forma deseada. El anticuerpo anti-TRIM29 utilizado en este caso puede ser un anticuerpo anti-TRIM29 descrito en "[1] Metodo para detectar celulas basales prostaticas." Es decir, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o anticuerpos policlonales. El fragmento de anticuerpo no esta limitado en particular siempre y cuando tenga la capacidad de unirse espedficamente a TRIM29, es decir, es un fragmento que tiene el sitio de union a antfgeno (fragmento de union a antfgeno). El fragmento de anticuerpo utilizado en este caso puede ser por ejemplo Fab, Fab', F(ab')2 o Fv.
Por otra parte, el kit de inmunohistotincion para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente divulgacion comprende preferentemente un anticuerpo anti-citoqueratina y/o un anticuerpo anti-p63. El anticuerpo anti-citoqueratina y el anticuerpo anti-p63 utilizados en este caso pueden ser tambien el anticuerpo anti-citoqueratina y el anticuerpo anti-p63 descritos en "[1] Metodo para detectar celulas basales prostaticas," o fragmentos que tienen sus sitios de union a antfgeno (fragmentos de union a antfgeno).
Por otra parte, el kit de inmunohistotincion para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente divulgacion puede comprender una enzima como peroxidasa, fosfatasa alcalina, p-D-galactosidasa y glucosa oxidase. El kit puede comprender tambien, por ejemplo, fluorescema, isotiocianato o un quelato de metal de tierras raras como sustancia fluorescente. El kit puede comprender un isotopo radioactivo como 3H, 14C y 125I. El kit de acuerdo con la presente invencion puede utilizar otras sustancias de marcado como biotina, avidina y una sustancia quimioluminiscente. El kit de la presente divulgacion puede comprender por ejemplo un sustrato adecuado para la enzima o la sustancia quimioluminiscente.
El kit de la presente divulgacion puede comprender instrucciones en las que indique que sirve para detectar de
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celulas basales prostaticas. La descripcion al efecto de indicar que sirve para detectar celulas basales prostaticas puede presentarse en un envase para el kit. Se puede indicar que el kit se utiliza para el diagnostico o diagnostico definitivo de cancer de prostata.
El anticuerpo anti-TRIM29 puede utilizarse para fabricar el kit de inmunohistotincion para detectar celulas basales prostaticas. El anticuerpo anti-citoqueratina puede utilizarse tambien para la fabricacion del kit de inmunohistotincion para detectar celulas basales prostaticas. Por otra parte, el anticuerpo anti-p63 puede utilizarse para la fabricacion del kit de inmunohistotincion para detectar celulas basales prostaticas.
Ejemplos
A continuacion, se describe la presente invencion haciendo referencia a los ejemplos.
<Ejemplo 1>
En este Ejemplo, se llevo a cabo la inmunohistotincion de tejidos de prostata (normal y cancer) utilizando un anticuerpo anti TRIM29. Se llevo a cabo la inmunohistotincion utilizando muestras de prostata de 16 muestras almacenadas y tratadas en el Department of Cancer Pathology, Hokkaido University Graduate School of Medicine. En la Tabla 1 se proporcionan los perfiles de las muestras de prostata proporcionadas para su analisis. Se analizaron 15 muestras con cancer de prostata y 1 muestra con neoplasia intraepitelial prostatica (PIN).
[Tabla 1]
Tabla 1. Observaciones clinico-patologicas en 15 casos con cancer de prostata
- n (%)
- Edad (anos)
- <65
- 2 (13,3)
- 65-75
- 7 (46,7)
- >75
- 6 (40)
- PSA (ng/ml)
- 4<PSA<6
- 5 (33,3)
- 6 %PSA<10
- 8 (53,3)
- 10<
- 2 (13,3)
- T (Extension de tumor primario)
- T1c
- 12 (80)
- T2a
- 2 (13,3)
- T2b
- 0 (0)
- T2c
- 1 (6,7)
- N (Metastasis ganglio linfatico)
- N0
- 15 (100,0)
- N1<
- 0(0)
- M (Metastasis distante)
- M0
- 15 (100)
- M1<
- 0 (0)
- Estadio TNM
- I
- 0 (0)
- II
- 15 (100)
- III
- 0 (0)
- IV
- 0 (0)__________________________
(1) Tincion con anticuerpos policlonales de conejo anti-TRIM29
Se diluyeron anticuerpos policlonales de conejo anti-TRIM29 (ATDC(H-300)SC-33151 fabricado por Santa Cruz) como anticuerpo primario 200 veces con un diluyente (PBS que contema BSA al 1 %) y se anadieron a cada corte de tejido. Se llevo a cabo la reaccion primaria a 37 °C durante 30 minutos. Se lavaron los cortes de tejido resultantes 3 veces con solucion de lavado (PBS) y se anadio un reactivo que contema anticuerpo anti-conejo marcado con peroxidasa (Dako REAL™ Envision™ Reactivo de deteccion peroxidasa conejo/raton) como anticuerpo secundario al corte de tejido. Se llevo a cabo la segunda reaccion a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se lavo el producto resultante 3 veces con una solucion de lavado y despues se sometio a reaccion de coloracion utilizando una solucion de coloracion (REAL™ DAB + CHROMOGEN de Dako).
(2) Tincion con anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina
Por otra parte, se llevo a cabo la inmunohistotincion de tejidos de prostata (normal y cancer) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina, 34pE12, como anticuerpo primario. Se repitieron las etapas descritas en la
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subseccion (1) anterior, excepto por el uso de 34pE12 (H1205 Nichirei anticuerpo monoclonal anti-poUmero citoqueratina) diluido 2 veces con BSA al 1 % en lugar del anticuerpo policlonal de conejo anti-TRIM29 diluido 200 veces.
Los resultados de la inmunohistotincion tal como se han descrito en (1) y (2) se presentan en la Figura 1. Resulto que el anticuerpo anti-TRIKM29 tino espedficamente las celulas basales presentes alrededor de las celulas glandulares en el tejido de prostata normal. Resulto que estas celulas y tejido tenidos con el anticuerpo anti-TRIM29 disminuyeron o desaparecieron en el tejido de cancer de prostata. Estos resultados fueron comparables a los obtenidos cuando se llevo a cabo la inmunohistotincion utilizando 34pE12. El uso combinado de 34pE12 y el anticuerpo anti-TRIM29 puede aumentar la fiabilidad del diagnostico de cancer de prostata.
<Ejemplo 2>
En este Ejemplo, se llevo a cabo la inmunohistotincion de prostata normal utilizando un anticuerpo monoclonal anti- TRIM29 de raton (anticuerpo anti-ATDC (A-5)) (sc-166718) como anticuerpo primario.
Se repitieron las etapas descritas en la subseccion (1) del Ejemplo 1, a excepcion de que se utilizo el anticuerpo monoclonal de raton anti-TRIM29 A-5 como anticuerpo primario, que se utilizo el anticuerpo IgG anti-raton como anticuerpo secundario y que se utilizo como muestra solamente tejido de prostata normal.
Tal como se muestra en la Figura 2, no se observo tincion no espedfica y las celulas basales se tineron claramente. <Ejemplo 3>
En este Ejemplo, se llevo a cabo la inmunohistotincion de prostata normal utilizando un anticuerpo monoclonal de raton anti-TRIM29 (anticuerpo anti-ATDC (A-5)) (sc-166718) y un anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina.
Se repitieron las etapas descritas en el Ejemplo 2 para el anticuerpo monoclonal anti-TRIM29 de raton y las etapas descritas en la subseccion (2) del Ejemplo 1 para el anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina excepto por el uso de tejido de prostata normal solamente.
Tal como se muestra en la Figura 3, la tincion con el anticuerpo monoclonal de raton anti-TRIM29 proporciono un resultado muy similar al de la tincion con anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina y la combinacion de estas dos inmunohistotinciones permitio una identificacion fiable de celulas basales prostaticas.
Cuando se analizaron los resultados de la inmunohistotincion de los Ejemplos 1 a 3, se observo que habfa desaparecido la expresion de TRIM29 en las porciones de tejido con cancer en todos los casos de cancer de prostata. En cambio, para neoplasia intraepitelial prostatica, se observo expresion de TRIM29 en porciones de celulas basales igual que en la prostata normal. En la Tabla 2, se muestran estos resultados.
[Tabla 2]
Tabla 2. Grado de tincion de TRIM29 en cancer de prostata
Porcentaje de Acinos TRIM29-Positivos en todos los acinos
- Puntuacion de Gleason
- 0 0-30 30-60 60-100
- Puntuacion de Gleason
- 3 + 3 = = 6 (n=8) 8 0 0 0
- Puntuacion de Gleason
- 3 + 4 = = 7 (n=3) 3 0 0 0
- Puntuacion de Gleason
- 4 + 3 = = 7 (n=1) 1 0 0 0
- Puntuacion de Gleason
- 4 + 4 = = 8 (n=2) 2 0 0 0
- Puntuacion de Gleason
- 4 + 5 = =9(n=1) 1 0 0 0
- PIN (n=1)
- 0 0 0 1
- Sitio normal (n=15)
- 0 0 0 15
Susceptibilidad de aplicacion industrial
El metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente invencion puede emplearse para el estudio histologico de prostata. El metodo para identificar la presencia, disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas de acuerdo con la presente invencion permite un diagnostico definitivo de cancer de prostata. Asimismo, la combinacion de los metodos con el analisis de expresion de citoqueratina permite un diagnostico definitivo mas fiable de cancer de prostata.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY
10
15
<120> Un metodo para detectar celulas basales de glandula prostata
<130> 671812/P2012-103-WO01/LP0056
<150> JP 2012-277980 <151>
<160>8
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1 <211>1767 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 1
- atggaagctg
- cagatgcctc caggagcaac gggtcgagcc cagaagccag ggatgcccgg 60
- agcccgtcgg
- gccccagtgg cagcctggag aatggcacca aggctgacgg caaggatgcc 120
- aagaccacca
- acgggcacgg cggggaggca gctgagggca agagcctggg cagcgccctg 180
- aagccagggg
- aaggtaggag cgccctgttc gcgggcaatg agtggcggcg acccatcatc 240
- cagtttgtcg
- agtccgggga cgacaagaac tccaactact tcagcatgga ctctatggaa 300
- ggcaagaggt
- cgccgtacgc agggctccag ctgggggctg ccaagaagcc acccgttacc 360
- tttgccgaaa
- agggcgagct gcgcaagtcc attttctcgg agtcccggaa goccacggtg 420
- tccatcatgg
- agcccgggga gacccggcgg aacagctacc cccgggccga cacgggcctt 430
- ttttcacggt
- ccaagtccgg ctccgaggag gtgctgtgcg actcctgcat cggcaacaag 540
- cagaaggcgg
- tcaagtcctg cctggtgtgc caggcctcct tctgcgagct gcatctcaag 600
- ccccacctgg
- agggcgcogc cttccgagac caccagctgc tcgagcccat ocgggaottt 660
- gaggcccgca
- agtgtcccgt gcatggcaag acgatggagc tcttctgcca gaccgaccag 720
- acctgcatct
- gctacctttg catgttccag gagcacaaga atcatagcac cgtgacagtg 730
- gaggaggcca
- aggccgagaa ggagacggag ctgtcattgc aaaaggagca gctgcagctc 840
- aagatcattg
- agattgagga tgaagctgag aagtggcaga aggagaagga ccgcatcaag 900
- agcttcacca
- ccaatgagaa ggccatcctg gagcagaact tccgggacct ggtgcgggac 960
- ctggagaagc
- aaaaggagga agtgagggct gcgctggagc agcgggagca ggatgctgtg 1020
- gaccaagtga
- aggtgatcat ggatgctctg gatgagagag ccaaggtgct gcatgaggac 1030
- aagcagaccc
- gggagcagct gcatagcatc agcgactctg tgttgtttct gcaggaattt 1140
- ggtgcattga
- tgagcaatta ctctctcccc ccacccctgc ccacctatca tgtcctgctg 1200
- gagggggagg
- gcctgggaca gtcactaggc aacttcaagg acgacctgct caatgtatgc 1260
- atgcgccacg
- ttgagaagat gtgcaaggcg gacctgagcc gtaacttcat tgagaggaac 1320
- cacatggaga
- acggtggtga ccatcgctat gtgaacaact acacgaacag cttcgggggt 1380
- gagtggagtg
- caccggaoac catgaagaga tactcoatgt acctgacacc caaaggtggg 1440
- gtccggacat
- cataccagcc ctcgtctcct ggccgcttca ccaaggagac cacccagaag 1500
- aatttcaaca
- atctctatgg caccaaaggt aactacacct cccgggtctg ggagtactcc 1560
- tccagcattc
- agaactctga caatgacctg cccgtcgtcc aaggcagctc ctccttctcc 1620
- ctgaaaggct
- atccctcoct catgcggagc caaagoccca aggcccagcc ccagacttgg 1680
- aaatctggca
- agcagactat gctgtctcac taccggccat tctacgtcaa caaaggcaac 1740
- gggattgggt
- coaacgaagc cccatga 1767
<210>2 <211> 588 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400>2
Claims (8)
- 51015202530REIVINDICACIONES1. Un metodo in vitro para detectar celulas basales prostaticas, que comprende visualizar la expresion de protema 29 que contiene motivo tripartito protema (TRIM29) en celulas basales de una prostata por inmunohistotincion.
- 2. El metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende analizar la morfologfa de la estructura del tejido glandular de la prostata y la expresion de protema 29 que contiene motivo tripartito (TRIM29) visualizada.
- 3. El metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, que comprende ademas visualizar la expresion de citoqueratina y/o protema p63 por inmunohistotincion.
- 4. El metodo para detectar celulas basales prostaticas de acuerdo con la reivindicacion 3, que comprende analizar la morfologfa de la estructura del tejido glandular de la prostata y la expresion de protema citoqueratina visualizada y/o la expresion de protema p63 visualizada.
- 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde se visualiza la presencia, disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas en el tejido de prostata recogido del sujeto en comparacion con un tejido de prostata normal.
- 6. Un metodo para diagnosticar cancer de prostata, que comprende una etapa de deteccion de celulas basales prostaticas en tejido de prostata recogido de un sujeto por inmunohistotincion utilizando un anticuerpo anti-TRIM29 o un fragmento de union a antfgeno del mismo.
- 7. El metodo de diagnostico de acuerdo con la reivindicacion 6, donde la disminucion o desaparicion de celulas basales prostaticas en comparacion con las de tejido de prostata normal indica la presencia de cancer de prostata.
- 8. Uso de un anticuerpo anti-TRIM29 o un fragmento de union a antfgeno del mismo en el diagnostico in vitro de cancer de prostata a traves de la deteccion de TRIM29 en celulas basales prostaticas.[Figura 1]ProstatanormalCancer de prostata
imagen1 Anticuerpo anti-queratina (34pE)Anticuerpo anti-TRIIvl29[Figura 2]Anticuerpo monoclonal anti raton ATDC(A-5) SC-166718 x 100imagen2 imagen3
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