WO2014069070A1 - バイオセンサ - Google Patents

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WO2014069070A1
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biosensor
hydrophilic
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純 ▲高▼木
秀明 大江
淳典 平塚
典子 佐々木
憲二 横山
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Murata Manufacturing Co Ltd
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Murata Manufacturing Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements

Definitions

  • the present invention includes an electrode layer provided with an electrode system including a working electrode and a counter electrode, a spacer layer in which a slit for forming a cavity is formed and stacked on the electrode layer, and an air hole communicating with the cavity.
  • the present invention relates to a biosensor comprising a cover layer laminated on a spacer layer and a reaction layer provided on a working electrode and a counter electrode.
  • a biosensor 500 shown in FIG. 11 is a sensor for quantifying glucose contained in a sample, and includes an electrode layer 510 formed by providing an electrode on an insulating substrate 504 such as polyethylene terephthalate or polyimide, and a cover layer. 506 and a spacer layer 505 disposed between the electrode layer 510 and the cover layer 506 are stacked.
  • the spacer layer 505 is provided with a slit for forming a cavity 507 to which a sample is supplied, and the cover layer 506 is laminated and bonded to the electrode layer 510 via the spacer layer 505.
  • a cavity 507 to which a sample is supplied is formed by the electrode layer 510, the slit portion of the spacer layer 505, and the cover layer 506.
  • the cover layer 506 has an air hole 506a communicating with the terminal portion of the cavity 507 in order to smoothly supply the sample to the cavity 507 by capillary action.
  • the electrode layer 510 is provided with a working electrode 501 and a counter electrode 502, and an electrode system is formed by providing electrode patterns electrically connected to the electrodes 501 and 502, respectively.
  • a reaction layer 503 is provided on the working electrode 501 and the counter electrode 502, and the working electrode 501 and the counter electrode 502 are provided on the insulating substrate 504 so as to be exposed to the cavity 507 formed in the biosensor 500. It has been.
  • the electrodes 501 and 502 exposed to the cavity 507 and the reaction layer 503 come into contact with the sample, and the reaction layer 503 is dissolved in the sample.
  • a reaction layer 503 provided on the working electrode 501 and the counter electrode 502 is provided on the electrode layer 510, and is laminated on the hydrophilic layer 503a including a hydrophilic polymer carboxymethylcellulose (CMC) and the hydrophilic layer 503a.
  • the reagent layer 503b contains glucose oxidase (enzyme) that specifically reacts with glucose contained in the sample and potassium ferricyanide as a mediator (electron acceptor).
  • the hydrophilic layer 503a provided on the electrode layer 510 protects the electrodes 501 and 502 and prevents the reagent layer 503b from peeling off.
  • Ferricyanide ion ionized by dissolving potassium ferricyanide in the sample is ferrocyanide ion (ferricyanide ion) due to electrons released when glucose is oxidized to gluconolactone by reacting with glucose oxidase. Reduced form). Therefore, when a sample containing glucose is supplied to the cavity 507 formed in the biosensor 500 from the sample introduction port, ferrocyanide ions are generated in an amount corresponding to the concentration of glucose contained in the sample.
  • the oxidation current obtained by oxidizing the reduced form of the mediator resulting from the enzyme reaction on the working electrode 501 has a magnitude depending on the glucose concentration in the sample.
  • the glucose contained in the sample can be quantified by measuring the oxidation current.
  • JP 2001-281202 A paragraphs 0017, 0018, FIG. 2, etc.
  • blood samples contain blood cells such as red blood cells, and it is known that the magnitude of the oxidation current described above is influenced by the size of the hematocrit value indicating the proportion of the volume of blood cells in the blood sample. Yes.
  • This influence on the oxidation current is caused by blood cells adhering to the working electrode, the surface of the counter electrode, and the like. Therefore, in the biosensor 500 described above, the blood sample is filtered by the hydrophilic layer 503a provided on the electrode layer 510 and containing CMC which is a hydrophilic polymer, and movement of blood cells in the direction of the electrode layer is suppressed. Therefore, the influence on the measurement accuracy due to the difference in hematocrit value is reduced.
  • a hydrophilic polymer such as CMC reduces the mediator contained in the reagent layer 503b. Therefore, for example, when the mediator is reduced by the hydrophilic polymer contained in the hydrophilic layer in a state where the biosensor 500 is stored, the mediator reduced by the hydrophilic polymer is measured when the above-described oxidation current is measured. Since the oxidation current resulting from the oxidation is also measured as the background current together with the oxidation current to be measured, the measurement accuracy deteriorates.
  • the hydrophilic layer 503a containing the hydrophilic polymer and the reagent layer 503b containing the mediator are stacked in a separated state, whereby the hydrophilic polymer contained in the hydrophilic layer 503a and the reagent Reaction with the mediator contained in the layer 503b is prevented.
  • This invention is made
  • the biosensor of the present invention comprises: An insulating substrate, and an electrode layer comprising an electrode system including a working electrode and a counter electrode on one surface of the insulating substrate; A spacer layer that is laminated on the electrode system side of the electrode layer so that the slit is located on the tip side of the working electrode and the counter electrode; A cavity formed by the electrode layer and the slit and supplied with a sample; A cover layer that has an air hole communicating with the cavity and is laminated on the spacer layer so as to cover the cavity;
  • the reaction layer is A hydrophilic layer comprising a hydrophilic polymer provided on the electrode layer and having a double bond of an oxygen atom; A water repellent formed on the surface of the hydrophilic layer, including a layer containing a surfactant, a layer containing a water-soluble gelling agent, a layer containing an amphiphilic polymer,
  • the hydrophilic layer containing the hydrophilic polymer having a double bond of oxygen atoms is provided on the electrode layer provided with the electrode system including the working electrode and the counter electrode.
  • a hydrophilic polymer having a double bond of an oxygen atom is highly effective in preventing the movement of blood cells contained in a blood sample. That is, for example, when a blood sample is supplied to the cavity, the blood sample is filtered by the hydrophilic layer to prevent blood cells from moving, and components other than blood cells (for example, glucose) contact each electrode of the electrode layer.
  • the hydrophilic polymer in the hydrophilic layer prevents blood cells in the blood sample from moving toward each electrode in the electrode layer, thus reducing the effect on measurement accuracy due to the difference in hematocrit values of the blood sample. can do.
  • the hydrophilic polymer has a double bond of oxygen atom
  • the mediator is reduced by the nucleophilic attack of the functional group having the double bond of oxygen atom on the mediator. Therefore, when a reagent layer is placed on a hydrophilic layer containing a hydrophilic polymer having a double bond of an oxygen atom, the reduction reaction of the mediator by the hydrophilic polymer gradually proceeds at the contact interface between both layers in the storage state. As described above, there arises a problem that the measurement accuracy of the oxidation current in the biosensor deteriorates.
  • a layer containing a surfactant, a water-soluble gelling agent is provided between a hydrophilic layer containing a hydrophilic polymer having a double bond of oxygen atoms and a reagent layer containing a mediator or the like. Since an intermediate layer including at least one of a layer including, a layer including an amphiphilic polymer, and a water-repellent layer formed by water-repellent treatment on the surface of the hydrophilic layer is disposed, The hydrophilic polymer in the hydrophilic layer and the mediator in the reagent layer can be prevented from coming into contact with each other, whereby the mediator can be prevented from being reduced.
  • the reagent layer may further contain a hydrophilic polymer having no oxygen atom double bond.
  • the mediator is surrounded by a hydrophilic polymer that does not have an oxygen atom double bond, that is, a hydrophilic polymer that is difficult to reduce the mediator.
  • the effect of preventing the contact between the hydrophilic polymer having a double bond of oxygen atoms contained in and the mediator of the reagent layer is further improved.
  • the hydrophilic polymer functions as a thickener, so that the adhesive strength between the reagent layer and the intermediate layer is increased, so that the reagent layer can be prevented from peeling off from the intermediate layer due to external stress or the like.
  • the reagent layer comprises an enzyme layer containing a hydrophilic polymer not having a double bond of the enzyme and the oxygen atom, and a hydrophilic polymer not having a double bond of the mediator and the oxygen atom. And a mediator layer that includes the mediator layer.
  • the mediator layer is laminated on the enzyme layer. If it does in this way, since the hydrophilic polymer and mediator of a hydrophilic layer will be arrange
  • the hydrophilic polymer having no oxygen atom double bond includes at least one of hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxyethylmethylcellulose, polyvinyl alcohol, and polyethylene glycol. It may be. With this configuration, the mediator contained in the reagent layer can be prevented from being reduced, and the reagent layer can be prevented from peeling from the intermediate layer.
  • a sensor can be provided.
  • the hydrophilic polymer having a double bond of oxygen atoms may include at least carboxymethylcellulose.
  • the hydrophilic polymer having a double bond of oxygen atoms may include at least carboxymethylcellulose.
  • the surfactant is sodium di (2-ethylhexyl) sulfosuccinate, polyethylene glycol mono-4-nonylphenyl ether (n ⁇ 7.5), sorbitan monolaurate, sorbitan monooleate, sodium cholate,
  • the structure containing at least 1 of lecithin may be sufficient.
  • the water-soluble gelling agent may include at least one of carrageenan and sodium alginate.
  • amphiphilic polymer may include at least one of polyvinyl pyrrolidone, polyethylene glycol, and polyvinyl alcohol.
  • the water repellent layer may be formed by etching the surface of the hydrophilic layer with plasma generated using a fluorine-based gas.
  • the mediator since the intermediate layer is provided between the hydrophilic layer containing a hydrophilic polymer having a double bond of oxygen atom and the reagent layer containing a mediator or the like, the mediator has a double bond of oxygen atom.
  • Contact with the hydrophilic polymer can be prevented, whereby the mediator can be prevented from being reduced by the hydrophilic polymer having a double bond of an oxygen atom in the storage state.
  • FIG. 2 is a diagram showing a method for manufacturing the biosensor of FIG. 1, wherein (a) to (c) show different processes. It is a figure which shows the relationship between the storage period and background current of the biosensor of FIG. It is a figure which shows the relationship between the storage period and background current of the biosensor concerning 2nd Embodiment of this invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing a method for manufacturing a biosensor according to a third embodiment of the present invention, in which (a) to (d) show different processes. It is a figure which shows the relationship between the storage period of the biosensor manufactured by the manufacturing method of FIG. 6, and background current.
  • FIG. 9 is a diagram showing a method for manufacturing a biosensor according to a fourth embodiment of the present invention, in which (a) to (c) show different processes. It is a figure which shows the relationship between the storage period of the biosensor manufactured by the manufacturing method of FIG. 8, and background current. It is a cross-sectional view of the cavity part of the biosensor according to the fifth embodiment of the present invention. It is a figure which shows the conventional biosensor.
  • FIGS. 1A and 1B are diagrams showing a biosensor according to a first embodiment of the present invention, where FIG. 1A is an exploded perspective view and FIG. 1B is a perspective view.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the cavity portion of the biosensor of FIG.
  • FIG. 3 is a diagram showing the biosensor manufacturing method according to the first embodiment of the present invention, wherein (a) to (c) show different steps.
  • a biosensor 100 includes an electrode system including a working electrode 101 and a counter electrode 102, and a reaction layer 106 including an enzyme that reacts with a mediator and a measurement target substance, and is attached to a measuring instrument (not shown). Used. Specifically, in a state where the biosensor 100 is mounted at a predetermined position of the measuring instrument, a sample such as blood is supplied to the cavity 103 provided on the tip side of the biosensor. The supplied sample comes into contact with the reaction layer 106 provided in the cavity 103, and the sample and the reaction layer 106 react to generate a reduced substance in which the substance contained in the reaction layer 106 is reduced.
  • glucose in the blood reacts with glucose oxidase (enzyme) contained in the reaction layer 106 to produce gluconolactone, which is a reactant obtained by oxidizing glucose.
  • glucose oxidase enzyme
  • the electrons released at this time reduce ferricyanide ions ionized from the potassium ferricyanide (mediator) contained in the reaction layer 106 to generate potassium ferrocyanide (reduced substance: reduced form of potassium ferricyanide).
  • a voltage is applied between the working electrode 101 and the counter electrode 102 to oxidize the reducing substance generated by this reaction, and the oxidation current obtained at that time is measured.
  • this oxidation current has a value that depends on the concentration of glucose contained in the blood. Therefore, by measuring the oxidation current obtained through each of the above reactions with the biosensor 100, Quantification of the measurement target substance contained in the sample (for example, glucose when the sample is blood) can be performed.
  • the biosensor 100 includes an insulating substrate 111 and an electrode layer including an electrode system including a working electrode 101 and a counter electrode 102 on one surface of the insulating substrate 111. 110, a slit 104, a spacer layer 120 stacked on the electrode system side of the electrode layer 110 so that the slit 104 is positioned on the tip side of the working electrode 101 and the counter electrode 102, and the electrode layer 110 and the spacer layer 120 A cavity 103 in which a sample is supplied, an air hole 105 communicating with the cavity 103, a cover layer 130 stacked on the spacer layer 120 so as to cover the cavity 103, and the cavity 103 A working electrode 101 exposed to the surface of the counter electrode 102 and a reaction layer 106 provided on the tip side of the counter electrode 102.
  • a spacer layer 120 disposed pinched in the cover layer 130 is formed by the sample introduction port 103a are bonded are laminated in a state where the top side is aligned provided.
  • the biosensor 100 is attached to the measuring instrument by being inserted into a predetermined insertion port of the measuring instrument from the rear end side.
  • the electrode layer 110 is formed of an insulating substrate made of an insulating material such as polyethylene terephthalate, ceramic, glass, plastic, paper, or biodegradable material. Further, a noble metal such as platinum, gold, and palladium, carbon, copper, aluminum, titanium, ITO (Indium Tin Oxide), ZnO (Zinc Oxide :) is formed on one surface of the insulating substrate 111 that forms the electrode layer 110. A conductive layer made of a conductive material such as zinc oxide) is formed by screen printing or sputtering deposition. When the conductive layer formed on one surface of the insulating substrate is subjected to patterning by laser processing or photolithography, the working electrode 101 and the counter electrode 102 and the biosensor 100 are mounted on the measuring instrument. In addition, an electrode system including electrode patterns 101a and 102a that electrically connect each of the working electrode 101 and the counter electrode 102 to the measuring instrument is formed.
  • a noble metal such as platinum, gold, and palladium, carbon, copper, aluminum, titanium
  • the working electrode 101 and the counter electrode 102 are arranged so that their respective tips are exposed to the cavity 103.
  • the electrode patterns 101a and 102a on the rear end side of the working electrode 101 and the counter electrode 102 are the edges of the electrode layer 110 on the opposite side to the sample introduction port 103a, and are the ends of the electrode layer 110 on which the spacer layer 120 is not stacked. It is stretched to the edge.
  • the spacer layer 120 is laminated on the electrode layer 110 formed as described above.
  • the spacer layer 120 is formed of an insulating substrate made of an insulating material such as polyethylene terephthalate, ceramic, glass, plastic, paper, or a biodegradable material, and is a slit for forming the cavity 103 at substantially the center of the front edge of the substrate. 104 is formed. Then, the slit 104 is disposed on the distal end side of the working electrode 101 and the counter electrode 102, and the spacer layer 120 is partially covered and laminated on one surface of the electrode layer 110, so that the electrode layer 110 and the slit 104 are stacked. A cavity 103 to which a sample is supplied is formed.
  • the reaction layer 106 is formed.
  • various plasmas used in metal activation treatment by plasma such as oxygen plasma, nitrogen plasma, and argon plasma can be used. Plasma may be used.
  • the reaction layer 106 is formed on the tip side of the working electrode 101 and the counter electrode 102 exposed to the cavity 103 before the cover layer 130 is laminated on the spacer layer 120.
  • a hydrophilizing agent such as a surfactant or phospholipid is applied to the inner wall of the cavity 103.
  • the reaction layer 106 is provided on the electrode layer 110 and is provided on the hydrophilic layer 106a including a hydrophilic polymer having a double bond of an oxygen atom, on the hydrophilic layer 106a, and included in the reagent layer 106c.
  • a predetermined amount of a reagent 201 containing CMC as a hydrophilic polymer having a double bond of an oxygen atom is dropped from the dropping device 200 into the cavity 103 and dried, thereby making the hydrophilic
  • the layer 106a is formed (hydrophilic layer forming step).
  • a predetermined amount of a reagent 202 containing sodium di (2-ethylhexyl) sulfosuccinate as a surfactant is dropped into the cavity 103 from the dropping device 200 and dried.
  • the intermediate layer 106b is formed (intermediate layer forming step).
  • the reagent 202 is obtained by dissolving a surfactant in acetone, isopropyl alcohol, or chloroform, and the intermediate layer 106b has a solution containing 0.01 to 5 wt% of the surfactant in an amount of 0.0%. It is formed by dropping 5 ⁇ L.
  • a mediator for example, potassium ferricyanide
  • an enzyme for example, glucose dehumanlogenase
  • a hydrophilic polymer for example, methylcellulose having no oxygen atom double bond.
  • Examples of the enzyme include glucose oxidase, lactate oxidase, cholesterol oxidase, alcohol oxidase, sarcosine oxidase, fructosylamine oxidase, pyruvate oxidase, lactate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, hydroxybutyrate dehydrogenase, and cholesterol esterase.
  • Creatininase, creatinase, DNA polymerase, etc. can be used, and these enzymes should be selected according to the substance to be measured (glucose, lactic acid, cholesterol, alcohol, sarcosine, fructosylamine, pyruvic acid, hydroxybutyric acid)
  • Various sensors can be formed.
  • glucose oxidase or glucose dehydrogenase can be used to form a glucose sensor that detects glucose in a blood sample
  • alcohol oxidase or alcohol dehydrogenase can be used to form an alcohol sensor that detects ethanol in a blood sample.
  • a lactic acid sensor for detecting lactic acid in a blood sample can be formed, and a total cholesterol sensor can be formed by using a mixture of cholesterol esterase and cholesterol oxidase.
  • ferrocene As the mediator, ferrocene, ferrocene derivative, benzoquinone, quinone derivative, osmium complex, ruthenium complex, etc. can be used in addition to the above-mentioned potassium ferricyanide.
  • hydrophilic polymers having a double bond of oxygen atom include carbonyl group, acyl group, carboxyl group, aldehyde group, sulfo group, sulfonyl group, sulfoxide group, tosyl group, nitro group, nitroso group, ester group, keto group.
  • a polymer having a group, a ketene group, or the like can be used.
  • hydrophilic polymer having no oxygen atom double bond it is possible to use hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxyethylmethylcellulose, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, etc. in addition to the above-mentioned methylcellulose. it can.
  • the hydrophilic polymer which does not have the double bond of the oxygen atom mixed with the reagent 203 with an enzyme, a mediator, etc. functions as a thickener.
  • a hydrophilic polymer having a double bond of oxygen atom and a hydrophilic polymer having no double bond of oxygen atom may be used in combination of two or more.
  • the hydrophilizing agent polyethylene glycol mono-4-octylphenyl ether (n ⁇ 10) (Triton X100: manufactured by Sigma Aldrich), polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20: manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), bis ( Surfactants such as sodium 2-ethylhexyl) sulfosuccinate and phospholipids such as lecithin can be used.
  • the hydrophilizing agent may be mixed with the reagent 203 and dropped into the cavity 103, or may be dropped into the cavity 104 after the reagent layer 106c is formed.
  • a buffering agent such as phosphoric acid may be provided in order to reduce variation in the concentration of ions contained in the sample.
  • a cover layer 130 formed of an insulating substrate made of an insulating material such as polyethylene terephthalate, ceramic, glass, plastic, paper, biodegradable material is formed as a spacer layer.
  • the biosensor 100 is formed.
  • the cover layer 130 has an air hole 105 that communicates with the cavity 103 when laminated on the spacer layer 120, and the cover layer 130 has the cavity 103. And is laminated on the spacer layer 120.
  • the biosensor 100 is formed for the purpose of quantifying glucose in blood, and FAD (flavin adenine dinucleotide) is used as an enzyme that specifically reacts with glucose as a measurement target substance.
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • a mediator that contains GDH (glucose dehydrogenase) hereinafter referred to as FAD-GDH
  • FAD-GDH glycose dehydrogenase
  • the reaction layer 106 containing potassium ferricyanide is provided on the tip side of the working electrode 101 and the counter electrode 102 exposed to the cavity 103.
  • the sample introduction port 103a at the tip when a sample made of blood is brought into contact with the sample introduction port 103a at the tip, the sample is sucked toward the air hole 105 by capillary action and is then injected into the cavity 103. A sample is supplied. Then, when the reaction layer 106 (reagent layer 106c) is dissolved in the sample supplied to the cavity 103, electrons are released by the enzyme reaction between glucose, which is the measurement target substance in the sample, and FAD-GDH. Ferricyanide ions are reduced by electrons to produce ferrocyanide ions, which are reducing substances.
  • a voltage for example, 0.3 V
  • the glucose in the sample is quantified in the measuring instrument by measuring the oxidation current flowing between the working electrode 101 and the counter electrode 102 by oxidation.
  • a current value 3 to 5 seconds later is measured as an oxidation current.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating the relationship between the storage period of the biosensor and the background current, where the horizontal axis indicates the storage period (h), and the vertical axis indicates the magnitude of the background current ( ⁇ A). Also, ⁇ (black rhombus) in the figure indicates the background current of the conventional biosensor in which the intermediate layer 106b is not provided between the reagent layer 106c and the hydrophilic layer 106a. A black square indicates a background current of the biosensor 100 of the present embodiment. The background current was measured by supplying a sample for measuring the background current to the cavity 103 and then measuring the oxidation current in the same manner as in a normal procedure.
  • the background current increases with time in the conventional biosensor, whereas in the biosensor 100 of the present embodiment, the background current increases. The increase is suppressed.
  • the hydrophilic layer 106a including a hydrophilic polymer having a double bond of oxygen atoms is provided on the electrode layer 110 provided with the electrode system including the working electrode 101 and the counter electrode 102.
  • the hydrophilic polymer having a double bond of oxygen atoms has an effect of preventing the movement of blood cells contained in the blood sample. For example, when the blood sample is supplied to the cavity, the hydrophilic sample 106a causes the blood sample to have a blood sample.
  • components other than blood cells for example, glucose
  • the hydrophilic polymer has an oxygen atom double bond
  • the functional group having the oxygen atom double bond is considered to reduce the mediator by nucleophilic attack on the mediator. Therefore, when the reagent layer 106c is arranged on the hydrophilic layer 106a, the reduction reaction of the mediator gradually proceeds at the contact interface between the two layers 106a and 106c in the storage state, and the measurement accuracy of the oxidation current in the biosensor 100 may deteriorate. There is.
  • a layer containing a surfactant is provided as the intermediate layer 106b between the hydrophilic layer 106a containing a hydrophilic polymer having a double bond of oxygen atoms and the reagent layer 106c containing a mediator or the like.
  • the mediator in the storage state of the biosensor 100, the mediator can be prevented from seeping out together with the moisture in the reagent layer 106c and coming into contact with the hydrophilic polymer of the hydrophilic layer 106a.
  • CMC hydrophilic polymer
  • the periphery of the mediator is a hydrophilic polymer that does not have an oxygen atom double bond, that is, a mediator. Is surrounded by a hydrophilic polymer that is difficult to reduce. Therefore, the effect of preventing contact between the hydrophilic polymer of the hydrophilic layer 106a and the mediator of the reagent layer 106c is further improved.
  • each hydrophilic polymer of the hydrophilic layer 106a and the reagent layer 106c functions as a thickener, the adhesive strength between the layers 106a, 106b, 106c constituting the reaction layer 106 is increased, and thus the layers 106a, 106b , 106c can be prevented from being peeled off by an external stress or the like on the bonding surface.
  • a highly reliable biosensor 100 can be provided.
  • FIG. 5 is a figure which shows the relationship between the storage period and background current of the biosensor concerning 2nd Embodiment.
  • This embodiment is different from the first embodiment described above in that the intermediate layer 106b of the biosensor 100 contains an amphiphilic polymer.
  • the intermediate layer 106b has a predetermined amount (for example, 0.5 ⁇ L) of a reagent in which an amphiphilic polymer is dissolved in acetone, isopropyl alcohol, chloroform, or the like at a ratio of 0.01 to 5 wt%. It is formed by being dropped and dried on 103.
  • polyvinyl pyrrolidone polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, etc.
  • amphiphilic polymer polyvinyl pyrrolidone, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, etc.
  • two or more of these amphiphilic polymers may be used in combination.
  • the increase in the background current is suppressed as in the first embodiment.
  • the background current shown in FIG. 5 is measured under the same conditions as the background current of the first embodiment described above.
  • the mediator of the reagent layer 106c contacts the hydrophilic polymer (CMC) of the hydrophilic layer 106a in the storage state. Therefore, an increase in the background current associated with the reduction of the mediator by CMC can be suppressed.
  • CMC hydrophilic polymer
  • FIG. 6 is a diagram showing a biosensor manufacturing method according to the third embodiment, and (a) to (d) show different processes.
  • FIG. 7 is a diagram showing the relationship between the storage period and the background current of the biosensor according to the third embodiment.
  • 6A is the same step as FIG. 3A showing the biosensor manufacturing method of the first embodiment
  • FIG. 6D is the same step as FIG. 3C.
  • This embodiment is different from the first embodiment described with reference to FIG. 2 in that the intermediate layer 106b contains a water-soluble gelling agent.
  • the intermediate layer 106b of the biosensor 100 is formed as follows. First, the hydrophilic layer 106a is formed in the same manner as in the first embodiment (see FIG. 6A). Next, as shown in FIG. 6B, a predetermined amount of a reagent 204 containing a water-soluble gelling agent that gels when mixed with a cation is dropped from the dropping device 200 into the cavity 103 and dried.
  • a predetermined amount of the cation-containing reagent 205 is dropped from the dropping device 200, whereby the water-soluble gelling agent is gelled to form the intermediate layer 106b.
  • the reagent layer 106c is formed in the same manner as in the first embodiment (see FIG. 6D).
  • water-soluble gelling agent a carrageenan or alginic acid compound
  • a ionic substance such as a ferricyanide compound, sodium chloride, potassium chloride, or calcium chloride can be used.
  • An aqueous solution in which either is dissolved can be used.
  • the increase in the background current is suppressed as in the first embodiment.
  • the background current shown in FIG. 7 is measured under the same conditions as the background current of the first embodiment described above.
  • the mediator of the reagent layer 106c contacts the hydrophilic polymer (CMC) of the hydrophilic layer 106a in the storage state. Therefore, an increase in the background current associated with the reduction of the mediator by CMC can be suppressed.
  • CMC hydrophilic polymer
  • FIG. 8 is a view showing a biosensor manufacturing method according to the fourth embodiment, and (a) to (c) show different processes.
  • FIG. 9 is a diagram showing the relationship between the storage period and the background current of the biosensor according to the fourth embodiment.
  • FIG. 8A is the same process as FIG. 3A showing the method of manufacturing the biosensor of the first embodiment
  • FIG. 8C is the same process as FIG. 3C.
  • This embodiment is different from the first embodiment described with reference to FIG. 2 in that the intermediate layer 106b is formed of a water repellent layer formed by subjecting the surface of the hydrophilic layer 106a to water repellent treatment. is there.
  • the intermediate layer 106b of the biosensor 100 is formed as follows. First, the hydrophilic layer 106a is formed in the same manner as in the first embodiment (see FIG. 8A). Next, as shown in FIG. 8B, the surface of the hydrophilic layer 106a is etched by plasma generated using a fluorine-based gas (for example, CHF 3 gas or CF 4 gas), so that the hydrophilic layer 106a. The surface is coated with fluorine to form a water repellent layer. Finally, the reagent layer 106c is formed in the same manner as in the first embodiment (see FIG. 8C).
  • the water repellent treatment is not limited to the above-described plasma etching of a fluorine-based gas, and various water repellent treatments such as dropping a water repellent on the hydrophilic layer 106a can be used.
  • the increase in the background current is suppressed as in the first embodiment.
  • the background current shown in FIG. 9 is measured under the same conditions as the background current of the first embodiment described above.
  • the mediator of the reagent layer 106c contacts the hydrophilic polymer (CMC) of the hydrophilic layer 106a in the storage state. Therefore, an increase in the background current associated with the reduction of the mediator by CMC can be suppressed.
  • CMC hydrophilic polymer
  • FIG. 10 is a cross-sectional view of the cavity portion of the biosensor according to the fifth embodiment.
  • the biosensor 100a differs from the biosensor 100 according to the first embodiment described with reference to FIG. 2 in that the reagent layer 106c has a double bond between a mediator and an oxygen atom as shown in FIG.
  • 106c1 is laminated. Since the other configuration is the same as that of the first embodiment, description thereof is omitted by attaching the same reference numerals.
  • hydrophilic polymer which does not have the double bond of the oxygen atom contained in each of the mediator layer 106c1 and the enzyme layer 106c2 can be the same as that in the first embodiment. Further, the order in which the mediator layer 106c1 and the enzyme layer 106c2 constituting the reagent layer 106c are stacked may be reversed.
  • the enzyme and the mediator are separated, so that the mediator can be prevented from being reduced by the enzyme in the storage state.
  • the hydrophilic polymer of the hydrophilic layer 106a and the mediator are arranged further apart from each other, so that the reduction effect of the mediator is further improved.
  • the mobility of the enzyme in the intermediate layer 106b and the hydrophilic layer 106a is smaller than the mobility of the mediator, the amount of enzyme / mediator in the vicinity of the electrodes 101 and 102 is larger than when the enzyme is disposed on the mediator.
  • the responsiveness and measurement accuracy of the sensor are improved.
  • the intermediate layer 106b is any one of a layer containing a surfactant, a layer containing an amphiphilic polymer, a layer containing a water-soluble gelling agent, and a water repellent layer.
  • the intermediate layer 106b may be formed as a multilayer structure, for example, by laminating a layer containing a water-soluble gelling agent on a layer containing a surfactant.
  • the intermediate layer 106b may be formed by dropping a reagent in which two or all of a surfactant, an amphiphilic polymer, and a water-soluble gelling agent are mixed onto the hydrophilic layer 106a. .
  • an ethanol sensor or a lactic acid sensor may be formed by changing the combination of the enzyme and the mediator included in the reaction layer 106 of the biosensor 100 described above.
  • the biosensor 100 is formed in a bipolar electrode structure having the working electrode 101 and the counter electrode 102.
  • the biosensor 100 is formed in a tripolar electrode structure by further providing a reference electrode. May be.
  • a predetermined potential based on the counter electrode 102 may be applied to the working electrode 101 in a state where the counter electrode 102 is grounded and a reference potential is applied to the reference electrode by the voltage output unit.
  • a blood sample is placed in the cavity 103 by monitoring a current flowing between the working electrode 101 and the counter electrode 102 by applying a predetermined voltage between the working electrode 101 and the counter electrode 102.
  • a detection electrode for detecting that the sample has been supplied to the cavity 103 may be further provided. In this case, by applying a predetermined voltage between the counter electrode 102 and the detection electrode, the current flowing between the counter electrode 102 and the detection electrode is monitored to detect that the sample is supplied to the cavity 103. do it.
  • the cover layer 130 is formed of a transparent member so that it can be visually recognized that the blood sample is supplied to the cavity 103. It is desirable to do.
  • the present invention can be applied to various biosensors.

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Abstract

　本発明のバイオセンサでは、バイオセンサ（１００）の反応層（１０６）の構成として、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層（１０６ａ）と、メディエータ等を含む試薬層（１０６ｃ）との間に界面活性剤を含む中間層（１０６ｂ）を設ける。これにより、メディエータが酸素原子の二重結合を有する親水性高分子と接触するのを防止することができるため、バイオセンサ（１００）の保管状態においてメディエータが還元されるのを防止することができる。

Description

バイオセンサ
　本発明は、作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、キャビティを形成するためのスリットが形成されて電極層に積層されるスペーサ層と、キャビティに連通する空気穴が形成されてスペーサ層に積層されるカバー層と、作用極および対極に設けられた反応層とを備えるバイオセンサに関する。
　図１１の従来のバイオセンサに示すように、作用極５０１および対極５０２を含む電極系と、測定対象物質と特異的に反応する酵素を含む反応層５０３とを有するバイオセンサ５００を用いて、試料に含まれる測定対象物質と反応層５０３とが反応することで生成される還元物質を作用極５０１と対極５０２との間に電圧を印加して酸化することにより得られる酸化電流を計測することで測定対象物質の定量を行う物質の測定方法が知られている（例えば、特許文献１：特開２００１－２８１２０２号公報参照）。
　図１１に示すバイオセンサ５００は、試料に含まれるグルコースを定量するためのセンサであって、ポリエチレンテレフタレートやポリイミドなどの絶縁性基板５０４に電極が設けられて形成された電極層５１０と、カバー層５０６と、電極層５１０とカバー層５０６とに挟まれて配置されるスペーサ層５０５とが積層されて形成される。また、スペーサ層５０５には、試料が供給されるキャビティ５０７を形成するためのスリットが設けられており、電極層５１０にスペーサ層５０５を介してカバー層５０６が積層されて接着されることで、電極層５１０と、スペーサ層５０５のスリットの部分と、カバー層５０６とにより試料が供給されるキャビティ５０７が形成される。そして、スリットの開口部分によりバイオセンサ５００の側面に形成される試料導入口からキャビティ５０７に試料が供給される。また、カバー層５０６には、毛細管現象による試料のキャビティ５０７への供給を円滑に行うために、キャビティ５０７の終端部と連通する空気穴５０６ａが形成されている。
　また、電極層５１０には、作用極５０１および対極５０２が設けられ、これらの電極５０１，５０２にそれぞれ電気接続される電極パターンが設けられることにより電極系が形成されている。また、作用極５０１および対極５０２上には反応層５０３が設けられており、作用極５０１および対極５０２は、それぞれバイオセンサ５００に形成されたキャビティ５０７に露出するように絶縁性基板５０４上に設けられている。
　したがって、液体から成る試料がキャビティ５０７に試料導入口から供給されると、キャビティ５０７に露出する各電極５０１，５０２と反応層５０３とが試料に接触すると共に、反応層５０３が試料に溶解する。
　また、作用極５０１および対極５０２上に設けられた反応層５０３は、電極層５１０上に設けられ、親水性高分子であるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む親水層５０３ａと、親水層５０３ａに積層され、試料に含まれるグルコースと特異的に反応するグルコースオキシダーゼ（酵素）およびメディエータ（電子受容体）としてのフェリシアン化カリウムを含む試薬層５０３ｂとにより形成されている。そして、電極層５１０上に設けられた親水層５０３ａにより、各電極５０１，５０２が保護されると共に、試薬層５０３ｂの剥離が防止されている。
　また、フェリシアン化カリウムが試料に溶解することで電離したフェリシアン化イオンは、グルコースがグルコースオキシダーゼと反応してグルコノラクトンに酸化される際に放出される電子によりフェロシアン化イオン（フェリシアン化イオンの還元体）に還元される。したがって、バイオセンサ５００に形成されたキャビティ５０７にグルコースを含む試料が試料導入口から供給されると、試料に含まれるグルコースの濃度に応じた量だけフェロシアン化イオンが生成される。
　このよう構成されたバイオセンサ５００では、酵素反応の結果生じたメディエータの還元体を作用極５０１上で酸化することにより得られる酸化電流が、試料中のグルコース濃度に依存した大きさとなるため、この酸化電流を計測することにより試料に含まれるグルコースの定量を行うことができる。
特開２００１－２８１２０２号公報（段落００１７，００１８、図２など）
　ところで、血液試料には赤血球などの血球が含まれており、上記した酸化電流の大きさは、血液試料中の血球の容積の割合を示すヘマトクリット値の大きさに影響されることが知られている。この酸化電流への影響は、血球が作用極や対極の表面等に付着することに起因する。そこで、上記したバイオセンサ５００では、電極層５１０上に設けられ、親水性高分子であるＣＭＣを含む親水層５０３ａにより、血液試料が濾過されて血球の電極層方向への移動が抑制されることで、ヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響の低減が図られている。
　ところが、ＣＭＣなどの親水性高分子は、試薬層５０３ｂに含まれるメディエータを還元することが知られている。したがって、例えばバイオセンサ５００が保管された状態において、親水層に含まれる親水性高分子によりメディエータが還元されると、上記した酸化電流を計測する際に、親水性高分子により還元されたメディエータが酸化することによる酸化電流もバックグランド電流として、計測対象である酸化電流と一緒に計測されるので、測定精度が劣化する。そこで、バイオセンサ５００では、親水性高分子を含む親水層５０３ａと、メディエータを含む試薬層５０３ｂとが分離された状態で積層されることにより、親水層５０３ａに含まれる親水性高分子と、試薬層５０３ｂに含まれるメディエータとの反応が防止されている。
　しかしながら、上記したように、親水層５０３ａおよび試薬層５０３ｂが分離された状態で積層されていても、親水層５０３ａおよび試薬層５０３ｂが接触する界面から、親水性高分子とメディエータとの反応が徐々に進むことにより、酸化電流の測定精度が劣化するので、劣化防止の改善策が求められていた。
　本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、保管状態においてメディエータが還元されるのを防止することができる技術を提供することを目的とする。
　上記した目的を達成するために、本発明のバイオセンサは、
　絶縁性基板、ならびに、前記絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系を備える電極層と、
　スリットを有し、前記スリットが前記作用極および前記対極の先端側に位置するように前記電極層の前記電極系側に積層されるスペーサ層と、
　前記電極層および前記スリットにより形成され、試料が供給されるキャビティと、
　前記キャビティに連通する空気穴を有し、前記キャビティを被覆するように前記スペーサ層に積層されるカバー層と、
　前記キャビティに露出する前記作用極および前記対極の先端側に設けられた反応層とを備えるバイオセンサにおいて、
　前記反応層は、
　前記電極層上に設けられ、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層と、
　前記親水層上に設けられ、界面活性剤を含む層、水溶性ゲル化剤を含む層、両親媒性高分子を含む層、および前記親水層の表面が撥水処理されて形成された撥水層のうちの少なくとも１つを含む中間層と、
　前記中間層上に設けられ、測定対象物質と反応する酵素およびメディエータを含む試薬層と
　を備えることを特徴としている。
　このような構成によれば、作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層上に酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層が設けられている。一般的に、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は血液試料に含まれる血球の移動を阻止する効果が高い。すなわち、例えば、血液試料がキャビティに供給されると、当該親水層により血液試料が濾過されて血球の移動が阻止され、血球を除く成分（例えば、グルコース）が電極層の各電極に接触する。このように、親水層の親水性高分子により血液試料の血球が電極層の各電極に向かって移動するのが防止されるため、血液試料のヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響を低減することができる。
　また、親水性高分子が酸素原子の二重結合を有する場合、酸素原子の二重結合を有する官能基がメディエータに対して求核攻撃することによりメディエータが還元されると考えられる。したがって、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層上に試薬層を配置すると、保管状態において、両層の接触界面で、親水性高分子によるメディエータの還元反応が徐々に進み、上記したように、バイオセンサにおける酸化電流の測定精度が劣化するという問題が生じる。
　しかしながら、上記した構成によれば、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層とメディエータ等を含む試薬層との間に、界面活性剤を含む層、水溶性ゲル化剤を含む層、両親媒性高分子を含む層、および親水層の表面が撥水処理されて形成された撥水層のうちの少なくとも１つを含む中間層が配置されるため、当該中間層により、親水層の親水性高分子と試薬層のメディエータとが接触するのを防止することができ、これにより、メディエータが還元されるのを防止することができる。
　したがって、メディエータの還元防止とヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響低減を両立することが可能となり、正確で信頼性の高いバイオセンサを提供することができる。
　また、前記試薬層は、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子をさらに含んでいてもよい。このように構成することにより、メディエータの周囲が、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子、すなわち、メディエータが還元されにくい親水性高分子により囲まれた状態になるため、親水層に含まれる酸素原子の二重結合を有する親水性高分子と試薬層のメディエータとの接触を防止する効果がさらに向上する。
　また、親水性高分子が増粘剤として機能することにより、試薬層と中間層との接着強度が増加するため、外部応力等により試薬層が中間層から剥離するのを防止することができる。
　また、前記試薬層は、前記酵素および前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層と、前記メディエータおよび前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層とを備えていてもよい。このように構成することにより、酵素およびメディエータが分離された状態となるため、保管状態においてメディエータが酵素により還元されるのを防止することができる。
　また、前記酵素層上に前記メディエータ層が積層されていることが好ましい。このようにすると、親水層の親水性高分子とメディエータとがさらに離れて配置されることになるため、メディエータの還元防止効果がさらに向上する。また、中間層および親水層中の酵素の移動度は、メディエータの移動度より小さいので、電極近傍での酵素・メディエータ量が、メディエータの上に酵素が配置された場合より多くなり、センサの応答性と測定精度が向上する。
　また、前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールのうちの少なくとも１つを含む構成であってもよい。このように構成することにより、試薬層に含まれるメディエータが還元されるのを防止することができるとともに、試薬層が中間層から剥離するのを防止することができるため、実用的な構成のバイオセンサを提供することができる。
　また、前記酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は、少なくともカルボキシメチルセルロースを含む構成であってもよい。このように構成することにより、親水層上に設けられる中間層が剥離するのを防止することができる。また、バイオセンサのキャビティに、例えば血液試料が供給された場合に、親水層の親水性高分子により血液試料が濾過されて血球の各電極への移動が阻止されるので、血液試料のヘマトクリット値の差異に伴う酸化電流の測定精度への影響を低減することができる。
　また、前記界面活性剤が、ジ（２－エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ－４－ノニルフェニルエーテル（ｎ≒７．５）、ソルビタンモノラウラート、ソルビタンモノオレエート、コール酸ナトリウム、レシチンのうちの少なくとも１つを含む構成であってもよい。このように構成することにより、中間層上に設けられた試薬層のメディエータが親水層の親水性高分子と接触するのを防止することができ、これにより、メディエータが親水層の親水性高分子により還元されるのを防止することができる。
　また、前記水溶性ゲル化剤が、カラギーナンおよびアルギン酸ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む構成であってもよい。このように構成することにより、中間層上に設けられた試薬層のメディエータが親水層の親水性高分子と接触するのを防止することができ、これにより、メディエータが親水層の親水性高分子により還元されるのを防止することができる。
　また、前記両親媒性高分子が、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールのうちの少なくとも１つを含む構成であってもよい。このように構成することにより、中間層上に設けられた試薬層のメディエータが親水層の親水性高分子と接触するのを防止することができ、これにより、メディエータが親水層の親水性高分子により還元されるのを防止することができる。
　また、前記撥水層は、前記親水層の表面が、フッ素系ガスを用いて生成されたプラズマによりエッチングされて形成されていてもよい。このように構成することにより、中間層上に設けられた試薬層のメディエータが親水層の親水性高分子と接触するのを防止することができ、これにより、メディエータが親水層の親水性高分子により還元されるのを防止することができる。
　本発明によれば、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層と、メディエータ等を含む試薬層との間に中間層を設けるため、メディエータが酸素原子の二重結合を有する親水性高分子と接触するのを防止することができ、これにより、保管状態において、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子によりメディエータが還元されるのを防止することができる。
本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサを示す図であって、（ａ）は分解斜視図、（ｂ）は斜視図である。 図１のバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。 図１のバイオセンサの製造方法を示す図であって、（ａ）～（ｃ）はそれぞれ異なる工程を示す。 図１のバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。 本発明の第２実施形態にかかるバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。 本発明の第３実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であって、（ａ）～（ｄ）はそれぞれ異なる工程を示す。 図６の製造方法により製造されたバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。 本発明の第４実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であって、（ａ）～（ｃ）はそれぞれ異なる工程を示す。 図８の製造方法により製造されたバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。 本発明の第５実施形態にかかるバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。 従来のバイオセンサを示す図である。
　＜第１実施形態＞
　本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサおよびこのバイオセンサの製造方法について図１～図４を参照して説明する。なお、図１は本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサを示す図であって、（ａ）は分解斜視図、（ｂ）は斜視図である。図２は図１のバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。図３は本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であって、（ａ）～（ｃ）はそれぞれ異なる工程を示す。
　（バイオセンサの構成および製造方法）
　本実施形態にかかるバイオセンサ１００は、作用極１０１および対極１０２を含む電極系と、メディエータおよび測定対象物質と反応する酵素を含む反応層１０６とを有し、測定器（図示省略）に装着されて使用されるものである。具体的には、バイオセンサ１００が測定器の所定の位置に装着された状態で、当該バイオセンサの先端側に設けられたキャビティ１０３に血液などの試料が供給される。供給された試料はキャビティ１０３内に設けられた反応層１０６と接触するとともに、試料と反応層１０６とが反応し、反応層１０６に含まれる物質が還元された還元物質が生成される。
　例えば、試料が血液である場合、血液中のグルコースと反応層１０６に含まれるグルコースオキシターゼ（酵素）とが反応し、グルコースが酸化された反応物質であるグルコノラクトンが生成される。その際に放出された電子により、反応層１０６に含まれるフェリシアン化カリウム（メディエータ）が電離したフェリシアン化イオンが還元され、フェロシアン化カリウム（還元物質：フェリシアン化カリウムの還元体）が生成される。
　そして、バイオセンサ１００において、作用極１０１および対極１０２との間に電圧を印加することにより、この反応により生成された還元物質を酸化し、その際に得られる酸化電流を計測する。この酸化電流は、例えば、試料が血液である場合、その血液に含まれるグルコースの濃度に依存した値となるため、上記した各反応を経て得られた酸化電流をバイオセンサ１００で計測することにより、試料に含まれる測定対象物質（例えば、試料が血液である場合のグルコース）の定量を行うことができる。
　より具体的には、バイオセンサ１００は、図１および図２に示すように、絶縁性基板１１１、ならびに、絶縁性基板１１１の一方面に作用極１０１および対極１０２を含む電極系を備える電極層１１０と、スリット１０４を有し、該スリット１０４が作用極１０１および対極１０２の先端側に位置するように電極層１１０の電極系側に積層されるスペーサ層１２０と、電極層１１０およびスペーサ層１２０のスリット１０４により形成され、試料が供給されるキャビティ１０３と、該キャビティ１０３に連通する空気穴１０５を有し、キャビティ１０３を被覆するようにスペーサ層１２０に積層されるカバー層１３０と、キャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に設けられた反応層１０６とを備え、電極層１１０およびカバー層１３０に挟まれて配置されるスペーサ層１２０とが、試料導入口１０３ａが設けられる先端側が揃った状態で積層されて接着されることにより形成される。そして、バイオセンサ１００は、その後端側から測定器の所定の挿入口に挿入されることで測定器に装着される。
　電極層１１０は、ポリエチレンテレフタレート、セラミック、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料などの絶縁材料からなる絶縁性基板により形成される。また、電極層１１０を形成する絶縁性基板１１１の一方面に、白金、金、パラジウムなどの貴金属やカーボン、銅、アルミニウム、チタン、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ　Ｔｉｎ　Ｏｘｉｄｅ：酸化インジウム錫）、ＺｎＯ（Ｚｉｎｃ　Ｏｘｉｄｅ：酸化亜鉛）などの導電性物質からなる導電層が、スクリーン印刷やスパッタリング蒸着法により形成される。そして、絶縁性基板の一方面に形成された導電層に、レーザ加工やフォトリソグラフィによるパターン形成が施されることにより、作用極１０１および対極１０２と、バイオセンサ１００が測定器に装着されたときに、作用極１０１および対極１０２のそれぞれと測定器とを電気的に接続する電極パターン１０１ａ，１０２ａとを含む電極系が形成される。
　また、作用極１０１および対極１０２は、それぞれの先端が、キャビティ１０３に露出するように配置される。また、作用極１０１および対極１０２それぞれの後端側の電極パターン１０１ａ，１０２ａは、試料導入口１０３ａと反対側の電極層１１０の端縁であって、スペーサ層１２０が積層されない電極層１１０の端縁まで延伸されて形成される。
　次に、上記したようにして形成された電極層１１０にスペーサ層１２０が積層される。スペーサ層１２０は、ポリエチレンテレフタレート、セラミック、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料などの絶縁材料からなる絶縁性基板により形成され、基板の先端縁部のほぼ中央にキャビティ１０３を形成するためのスリット１０４が形成されている。そして、スリット１０４が、作用極１０１および対極１０２の先端側に配置されて、スペーサ層１２０が電極層１１０の一方面を部分的に被覆して積層されることにより、電極層１１０およびスリット１０４により試料が供給されるキャビティ１０３が形成される。
　続いて、キャビティ１０３部分がプラズマにより洗浄処理された後に、反応層１０６が形成される。なお、プラズマ洗浄工程において使用されるプラズマは、酸素プラズマ、窒素プラズマ、アルゴンプラズマなど、プラズマによる金属活性化処理において使用される種々のプラズマを使用することができ、減圧プラズマであっても大気圧プラズマであってもよい。
　反応層１０６は、図３（ａ）～（ｃ）に示すように、カバー層１３０がスペーサ層１２０に積層される前に、キャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含有する試薬２０１と、ジ（２－エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウムなどの界面活性剤を含有する試薬２０２と、メディエータ、酵素、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子などを含有する試薬２０３とを順番に滴下することにより形成される。また、キャビティ１０４への血液などの試料の供給を円滑にするために、界面活性剤やリン脂質などの親水化剤がキャビティ１０３内壁に塗布される。
　具体的には、反応層１０６は、電極層１１０上に設けられ、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層１０６ａと、親水層１０６ａ上に設けられ、試薬層１０６ｃに含まれるメディエータが親水層１０６ａの親水性高分子に接触するのを防止するための界面活性剤を含む中間層１０６ｂと、中間層１０６ｂ上に設けられ、測定対象物質と反応する酵素、メディエータ（電子受容体）、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む試薬層１０６ｃとを備え、次のように形成される。
　すなわち、図３（ａ）に示すように、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子としてＣＭＣを含有する試薬２０１が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥されることにより親水層１０６ａが形成される（親水層形成工程）。次に、図３（ｂ）に示すように、界面活性剤としてジ（２－エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウムを含有する試薬２０２が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥されることにより中間層１０６ｂが形成される（中間層形成工程）。なお、この実施形態における試薬２０２は、界面活性剤をアセトンやイソプロピルアルコール、あるいはクロロホルムに溶解させたものであり、中間層１０６ｂは、界面活性剤を０．０１～５ｗｔ％含有した溶液が０．５μＬ滴下されることにより形成される。
　続いて、図３（ｃ）に示すように、メディエータ（例えば、フェリシアン化カリウム）、酵素（例えば、グルコースデヒトロゲナーゼ）、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子（例えば、メチルセルロース）を含有する試薬２０３が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥されることにより試薬層１０６ｃが形成され（試薬層形成工程）、これらの各工程により反応層１０６が形成される。この場合、試薬２０３中に含まれる酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子はなくてもかまわない。また、試薬２０３中に、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子の代わりに、またはこの親水性高分子とともに両親媒性高分子を含有させる構成であってもよい。
　なお、酵素としては、上記したグルコースデヒドロゲナーゼの他、グルコースオキシターゼ、乳酸オキシターゼ、コレステロールオキシターゼ、アルコールオキシターゼ、ザルコシンオキシターゼ、フルクトシルアミンオキシターゼ、ピルビン酸オキシターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールエステラーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができ、これらの酵素を測定対象物質（グルコース、乳酸、コレステロール、アルコール、ザルコシン、フルクトシルアミン、ピルビン酸、ヒドロキシ酪酸）に応じて選択することで種々のセンサを形成することができる。
　例えば、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼを用いれば血液試料中のグルコースを検出するグルコースセンサを形成でき、アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼを用いれば血液試料中のエタノールを検出するアルコールセンサを形成でき、乳酸オキシダーゼを用いれば血液試料中の乳酸を検出する乳酸センサを形成でき、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとの混合物を用いれば総コレステロールセンサを形成できる。
　また、メディエータとしては、上記したフェリシアン化カリウムの他、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などを用いることができる。
　また、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子として、カルボニル基、アシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホ基、スルホニル基、スルホキシド基、トシル基、ニトロ基、ニトロソ基、エステル基、ケト基、ケテン基などを有するポリマーを用いることができる。
　また、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子としては、上記したメチルセルロースの他、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどを用いることができる。なお、試薬２０３に、酵素およびメディエータ等と一緒に混合される酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は増粘剤として機能する。また、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は、それぞれ、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
　また、界面活性剤としては、上記したジ（２－エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウム（エーロゾルＯＴ：和光純薬工業株式会社）の他、ポリエチレングリコールモノ－４－ノニルフェニルエーテル（ｎ≒７．５）（Ｉｇｅｐａｌ　ＣＯ－２１０：ローヌ・プーラン社）、ソルビタンモノラウラート（Ｓｐａｎ２０：東京化成工業株式会社）、ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ８０：東京化成工業株式会社）、コール酸ナトリウム、レシチンなどを用いることができる。
　また、親水化剤としては、ポリエチレングリコールモノ－４－オクチルフェニルエーテル（ｎ≒１０）（ＴｒｉｔｏｎＸ１００：シグマアルドリッチ社製）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ２０：東京化成工業社製）、ビス（２－エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウムなどの界面活性剤、レシチンなどのリン脂質を用いることができる。また、親水化剤は、上記したようにキャビティ１０３に塗布する以外に、試薬２０３に混合してキャビティ１０３に滴下したり、試薬層１０６ｃが形成された後にキャビティ１０４に滴下してもよい。また、カバー層１３０のスペーサ層側の面に塗布してもよい。また、試料に含まれるイオン濃度のばらつきを低減するために、リン酸などの緩衝剤を設けてもよい。
　次に、反応層１０６がキャビティ１０３に形成された後に、ポリエチレンテレフタレート、セラミック、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料などの絶縁材料からなる絶縁性基板により形成されたカバー層１３０が、スペーサ層１２０に積層されることにより、バイオセンサ１００が形成される。図１（ａ），（ｂ）に示すように、カバー層１３０には、スペーサ層１２０に積層されたときにキャビティ１０３と連通する空気穴１０５が形成されており、カバー層１３０は、キャビティ１０３を被覆してスペーサ層１２０に積層される。
　なお、この実施形態では、バイオセンサ１００は、血液中のグルコースの定量を行うことを目的に形成されており、測定対象物質としてのグルコースと特異的に反応する酵素としてＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）を補酵素とするＧＤＨ（グルコースデヒドロゲナーゼ）（以下、ＦＡＤ－ＧＤＨと表記する）を含み、測定対象物であるグルコースとＦＡＤ－ＧＤＨとの反応により生成される電子により還元されて還元物質と成るメディエータとしてフェリシアン化カリウムを含む反応層１０６がキャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に設けられている。
　このように構成されたバイオセンサ１００では、上記したように、先端の試料導入口１０３ａに血液から成る試料を接触させることにより、毛細管現象により試料が空気穴１０５に向かって吸引されてキャビティ１０３に試料が供給される。そして、キャビティ１０３に供給された試料に反応層１０６（試薬層１０６ｃ）が溶解することにより、試料中の測定対象物質であるグルコースとＦＡＤ－ＧＤＨとの酵素反応により電子が放出され、放出された電子によりフェリシアン化イオンが還元されて還元物質であるフェロシアン化イオンが生成される。そして、反応層１０６が試料に溶解することによる酸化還元反応により生成された還元物質を、バイオセンサ１００の作用極１０１と対極１０２との間に電圧（例えば０．３Ｖ）を印加して電気化学的に酸化することにより、作用極１０１と対極１０２との間に流れる酸化電流を計測することで試料中のグルコースの定量が測定器において行われる。なお、バイオセンサ１００の作用極１０１と対極１０２との間に電圧が印加された後、３～５秒後の電流値が酸化電流として計測される。
　（バックグランド電流の比較例）
　図４はバイオセンサの保管期間とバックグランド電流との関係を示す図であり、横軸が保管期間（ｈ）を示し、縦軸がバックグランド電流の大きさ（μＡ）を示す。また、同図中の◆（黒色のひし形）は、試薬層１０６ｃと親水層１０６ａとの間に中間層１０６ｂが設けられていない従来のバイオセンサのバックグランド電流を示し、同図中の■（黒色の四角）は、本実施形態のバイオセンサ１００のバックグランド電流を示す。なお、バックグランド電流の測定は、バックグランド電流測定用の試料をキャビティ１０３に供給した後、通常の手順と同様に酸化電流を計測することにより行った。
　図４に示すように、バイオセンサの保管期間が長くなるのに伴い、従来のバイオセンサでは経時的にバックグランド電流が増大するのに対して、本実施形態のバイオセンサ１００ではバックグランド電流の増大が抑制されている。
　したがって、本実施形態では、作用極１０１および対極１０２を含む電極系が設けられた電極層１１０上に酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層１０６ａが設けられるが、一般的に、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は血液試料に含まれる血球の移動を阻止する効果を有し、例えば、血液試料がキャビティに供給されると、当該親水層１０６ａにより血液試料が濾過されて血球の移動が阻止され、血球を除く成分（例えば、グルコース）が電極層１１０の各電極１０１，１０２に接触することから、血液試料のヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響を低減することができる。
　ところで、親水性高分子が酸素原子の二重結合を有する場合、酸素原子の二重結合を有する官能基がメディエータに対して求核攻撃することによりメディエータが還元されると考えられる。そのため、親水層１０６ａ上に試薬層１０６ｃを配置すると、保管状態において、両層１０６ａ，１０６ｃの接触界面でこのメディエータの還元反応が徐々に進み、バイオセンサ１００における酸化電流の測定精度が劣化するおそれがある。
　そこで、本実施形態では、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層１０６ａとメディエータ等を含む試薬層１０６ｃとの間に、中間層１０６ｂとして、界面活性剤を含む層を設けることにより、バイオセンサ１００の保管状態において、メディエータが試薬層１０６ｃ中の水分と一緒に染み出して、親水層１０６ａの親水性高分子と接触するのを防止することができるように構成した。このように構成することにより、バイオセンサ１００の保管状態において、メディエータが、親水層１０６ａに含まれる酸素原子の二重結合を有する親水性高分子（ＣＭＣ）により還元されるのを防止することができるとともに、ＣＭＣによるメディエータの還元に伴うバックグラウンド電流の増加を抑制することができる。
　また、試薬層１０６ｃは、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含んでいるため、メディエータの周囲が、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子、すなわち、メディエータが還元されにくい親水性高分子により囲まれた状態になる。そのため、親水層１０６ａの親水性高分子と試薬層１０６ｃのメディエータとの接触を防止する効果がさらに向上する。
　また、親水層１０６ａおよび試薬層１０６ｃの各親水性高分子が増粘剤として機能することにより、反応層１０６を構成する各層１０６ａ，１０６ｂ，１０６ｃ間の接着強度が増加するため、各層１０６ａ，１０６ｂ，１０６ｃそれぞれの接着面での外部応力等による剥離を防止することができる。
　以上のように、本実施形態の構成により、ＣＭＣによるメディエータの還元に伴うバックグラウンド電流増加の抑制とヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響低減を両立することが可能となるため、正確で信頼性の高いバイオセンサ１００を提供することができる。
　＜第２実施形態＞
　本発明の第２実施形態にかかるバイオセンサについて図２および図５を参照して説明する。なお、図５は第２実施形態にかかるバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。
　この実施形態が上記した第１実施形態と異なるのは、バイオセンサ１００の中間層１０６ｂが、両親媒性高分子を含有している点である。
　この場合、中間層１０６ｂは、両親媒性高分子を０．０１～５ｗｔ％の割合で、アセトンやイソプロピルアルコール、あるいは、クロロホルムなどに溶解させた試薬が所定量（例えば、０．５μＬ）、キャビティ１０３に滴下・乾燥されることにより形成される。
　なお、両親媒性高分子として、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどを用いることができる。また、これらの両親媒性高分子を、それぞれ２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
　また、この実施形態におけるバイオセンサ１００の保管期間とバックグラウンド電流との関係については、図５に示すように、第１実施形態と同様、バックグラウンド電流の増大が抑制されている。なお、図５に示すバックグラウンド電流は、上記した第１実施形態のバックグラウンド電流と同じ条件で計測されたものである。
　したがって、本実施形態によれば、中間層１０６ｂを両親媒性高分子で構成した場合であっても、保管状態において、試薬層１０６ｃのメディエータが親水層１０６ａの親水性高分子（ＣＭＣ）に接触するのを防止することができるため、ＣＭＣによるメディエータの還元に伴うバックグラウンド電流の増加を抑制することができる。
　＜第３実施形態＞
　本発明の第３実施形態にかかるバイオセンサについて図２、図６、図７を参照して説明する。なお、図６は第３実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であり、（ａ）～（ｄ）はそれぞれ異なる工程を示す。図７は第３実施形態にかかるバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。なお、図６（ａ）は、第１実施形態のバイオセンサの製造方法を示した図３（ａ）と同じ工程であり、図６（ｄ）は図３（ｃ）と同じ工程である。
　この実施形態が図２を参照して説明した第１実施形態と異なるところは、中間層１０６ｂが水溶性ゲル化剤を含有している点である。
　この実施形態では、バイオセンサ１００の中間層１０６ｂは次のように形成される。まず、第１実施形態と同じ要領で親水層１０６ａが形成される（図６（ａ）参照）。次に、図６（ｂ）に示すように、カチオンと混合されるとゲル化する水溶性ゲル化剤を含有する試薬２０４が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥される。
　続いて、図６（ｃ）に示すように、カチオンを含有する試薬２０５が滴下装置２００から所定量滴下されることにより水溶性ゲル化剤がゲル化されて中間層１０６ｂが形成される。最後に、第１実施形態と同じ要領で試薬層１０６ｃが形成される（図６（ｄ）参照）。
　なお、水溶性ゲル化剤としては、カラギーナンやアルギン酸化合物を用いることができ、カチオンを含有した試薬２０５としては、フェリシアン化化合物、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等のイオン性物質のうちのいずれかを溶かした水溶液を用いることができる。また、これらの水溶性ゲル化剤を、それぞれ２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
　また、この実施形態におけるバイオセンサ１００の保管期間とバックグラウンド電流との関係については、図７に示すように、第１実施形態と同様、バックグラウンド電流の増大が抑制されている。なお、図７に示すバックグラウンド電流は、上記した第１実施形態のバックグラウンド電流と同じ条件で計測されたものである。
　したがって、本実施形態によれば、中間層１０６ｂを水溶性ゲル化剤で構成した場合であっても、保管状態において、試薬層１０６ｃのメディエータが親水層１０６ａの親水性高分子（ＣＭＣ）に接触するのを防止することができるため、ＣＭＣによるメディエータの還元に伴うバックグラウンド電流の増加を抑制することができる。
　＜第４実施形態＞
　本発明の第４実施形態にかかるバイオセンサについて図２、図８、図９を参照して説明する。なお、図８は第４実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であり、（ａ）～（ｃ）はそれぞれ異なる工程を示す。図９は第４実施形態にかかるバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。なお、図８（ａ）は、第１実施形態のバイオセンサの製造方法を示した図３（ａ）と同じ工程であり、図８（ｃ）は図３（ｃ）と同じ工程である。
　この実施形態が図２を参照して説明した第１実施形態と異なるところは、中間層１０６ｂが、親水層１０６ａの表面が撥水処理されて形成された撥水層で形成されている点である。
　この実施形態では、バイオセンサ１００の中間層１０６ｂは、次のように形成される。まず、第１実施形態と同じ要領で親水層１０６ａが形成される（図８（ａ）参照）。次に、図８（ｂ）に示すように、親水層１０６ａの表面がフッ素系ガス（例えば、ＣＨＦ３ガスやＣＦ４ガス）を用いて生成されたプラズマによりエッチングされることで、親水層１０６ａの表面がフッ素コーティングされ、撥水層が形成される。最後に、第１実施形態と同じ要領で試薬層１０６ｃが形成される（図８（ｃ）参照）。なお、撥水処理については、上記したフッ素系ガスのプラズマエッチングに限らず、親水層１０６ａ上に撥水剤を滴下するなど、種々の撥水処理を用いることができる。
　また、この実施形態におけるバイオセンサ１００の保管期間とバックグラウンド電流との関係については、図９に示すように、第１実施形態と同様、バックグラウンド電流の増大が抑制されている。なお、図９に示すバックグラウンド電流は、上記した第１実施形態のバックグラウンド電流と同じ条件で計測されたものである。
　したがって、本実施形態によれば、中間層１０６ｂを撥水層で構成した場合であっても、保管状態において、試薬層１０６ｃのメディエータが親水層１０６ａの親水性高分子（ＣＭＣ）に接触するのを防止することができるため、ＣＭＣによるメディエータの還元に伴うバックグラウンド電流の増加を抑制することができる。
　＜第５実施形態＞
　本発明の第５実施形態にかかるバイオセンサについて図１０を参照して説明する。なお、図１０は第５実施形態にかかるバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。
　この実施形態にかかるバイオセンサ１００ａが、図２を用いて説明した第１実施形態のバイオセンサ１００と異なるところは、図１０に示すように、試薬層１０６ｃが、メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層１０６ｃ１と、酵素および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層１０６ｃ２とで構成され、かつ、酵素層１０６ｃ２上にメディエータ層１０６ｃ１が積層されている点である。その他の構成は第１実施形態と同じであるため、同一符号を付すことにより説明を省略する。なお、メディエータ層１０６ｃ１および酵素層１０６ｃ２それぞれに含まれる酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は、上記した第１実施形態を同じものを用いることができる。また、試薬層１０６ｃを構成するメディエータ層１０６ｃ１および酵素層１０６ｃ２の積層される順番は、逆であってもかまわない。
　このように構成することにより、酵素およびメディエータが分離された状態となるため、保管状態においてメディエータが酵素により還元されるのを防止することができる。また、酵素層１０６ｃ２上に前記メディエータ層１０６ｃ１が積層されることにより、親水層１０６ａの親水性高分子とメディエータとがさらに離れて配置されることになるため、メディエータの還元防止効果がさらに向上する。また、中間層１０６ｂおよび親水層１０６ａ中の酵素の移動度は、メディエータの移動度より小さいので、電極１０１，１０２近傍での酵素・メディエータ量が、メディエータの上に酵素が配置された場合より多くなり、センサの応答性と測定精度が向上する。
　なお、本発明は上記した各実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて、上記したもの以外に種々の変更を行なうことが可能である。
　例えば、上記した各実施形態では、中間層１０６ｂが界面活性剤を含む層、両親媒性高分子を含む層、水溶性ゲル化剤を含む層、撥水層の内のいずれか一つの層で形成されているが、例えば、界面活性剤を含む層上に水溶性ゲル化剤を含む層を積層するなど、多層構造として中間層１０６ｂを形成してもよい。また、界面活性剤、両親媒性高分子、水溶性ゲル化剤のうちの２つ、あるいは全てが混合された試薬を親水層１０６ａ上に滴下することにより、中間層１０６ｂを形成してもよい。
　また、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を、複数種類組み合わせて試薬層１０６ｃに適切に混合することにより、血液試料中の血球の移動を効果的に阻止したり、酵素層およびメディエータ層の拡散、混合が低減されてメディエータの還元を防止する防止効果を向上することができる。
　また、上記したバイオセンサ１００の反応層１０６に含まれる酵素およびメディエータの組合せを変更することによりエタノールセンサや乳酸センサなどを形成してもよい。
　また、上記した各実施形態では、バイオセンサ１００は、作用極１０１および対極１０２を有する二極電極構造に形成されているが、参照極をさらに設けることによりバイオセンサ１００を三極電極構造に形成してもよい。この場合、対極１０２を接地して電圧出力部により参照極に参照電位を印加した状態で、作用極１０１に対極１０２を基準とする所定電位を印加すればよい。
　また、上記した実施形態では、作用極１０１と対極１０２との間に所定電圧を印加することにより、作用極１０１と対極１０２との間に流れる電流を監視することで、キャビティ１０３に血液試料が供給されたことが検出されるが、キャビティ１０３に試料が供給されたことを検知するための検知用電極をさらに設けてもよい。この場合、対極１０２と検知用電極との間に所定電圧を印加することにより、対極１０２と検知用電極との間に流れる電流を監視することで、キャビティ１０３に試料が供給されたことを検出すればよい。　
　また、バイオセンサ１００，１００ａを形成する電極層１１０、スペーサ層１２０およびカバー層１３０のうち、少なくともカバー層１３０は、キャビティ１０３に血液試料が供給されたことを視認できるように透明な部材で形成するのが望ましい。
　また、本発明は、種々のバイオセンサに適用することができる。
　１００，１００ａ，５００　バイオセンサ
　１０１，５０１　作用極
　１０２，５０２　対極
　１０１ａ，１０２ａ　電極パターン
　１０３，１０４，５０７　キャビティ
　１０３ａ　試料導入口
　１０４　スリット
　１０５，５０６ａ　空気穴
　１０６，５０３　反応層
　１０６ａ，５０３ａ　親水層
　１０６ｂ　中間層
　１０６ｃ，５０３ｂ　試薬層
　１０６ｃ１　メディエータ層
　１０６ｃ２　酵素層
　１１０，５１０　電極層
　１１１，５０４　絶縁性基板
　１２０，５０５　スぺーサ層
　１３０，５０６　カバー層
　２００　滴下装置
　２０１，２０２，２０３，２０４，２０５　試薬

Claims (10)

  1. 　絶縁性基板、ならびに、前記絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系を備える電極層と、
    　スリットを有し、前記スリットが前記作用極および前記対極の先端側に位置するように前記電極層の前記電極系側に積層されるスペーサ層と、
    　前記電極層および前記スリットにより形成され、試料が供給されるキャビティと、
    　前記キャビティに連通する空気穴を有し、前記キャビティを被覆するように前記スペーサ層に積層されるカバー層と、
    　前記キャビティに露出する前記作用極および前記対極の先端側に設けられた反応層とを備えるバイオセンサにおいて、
    　前記反応層は、
    　前記電極層上に設けられ、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層と、
    　前記親水層上に設けられ、界面活性剤を含む層、水溶性ゲル化剤を含む層、両親媒性高分子を含む層、および前記親水層の表面が撥水処理されて形成された撥水層のうちの少なくとも１つを含む中間層と、
    　前記中間層上に設けられ、測定対象物質と反応する酵素およびメディエータを含む試薬層と
    　を備えることを特徴とするバイオセンサ。
  2. 　前記試薬層は、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子をさらに含む、請求項１に記載のバイオセンサ。
  3. 　前記試薬層は、
    　前記酵素および前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層と、
    　前記メディエータおよび前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層と
    　を備える、請求項２に記載のバイオセンサ。
  4. 　前記酵素層上に前記メディエータ層が積層されている、請求項３に記載のバイオセンサ。
  5. 　前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールのうちの少なくとも１つを含む、請求項２～４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  6. 　前記酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は、少なくともカルボキシメチルセルロースを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  7. 　前記界面活性剤が、ジ（２－エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ－４－ノニルフェニルエーテル（ｎ≒７．５）、ソルビタンモノラウラート、ソルビタンモノオレエート、コール酸ナトリウム、レシチンのうちの少なくとも１つを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  8. 　前記水溶性ゲル化剤が、カラギーナンおよびアルギン酸ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  9. 　前記両親媒性高分子が、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールのうちの少なくとも１つを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  10. 　前記撥水層は、前記親水層の表面が、フッ素系ガスを用いて生成されたプラズマによりエッチングされて形成されている、請求項１～９のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
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