WO2014030763A1 - 抗腫瘍剤 - Google Patents

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    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to an antitumor agent.
  • Patent Document 1 discloses an antitumor agent comprising an acidic xylo-oligosaccharide having a uronic acid residue in a xylo-oligosaccharide molecule and a Hatake shimeji extract as active ingredients. Further, (Patent Document 2) discloses an antitumor substance composed of a sugar ester of a monosaccharide or disaccharide and a fatty acid. These antitumor agents have insufficient antitumor effects and still have room for improvement.
  • Patent Document 3 discloses an intestinal bacterial activator containing cellooligosaccharide such as cellobiose as an active ingredient. According to the present invention, cellooligosaccharides can selectively increase useful bacteria in the intestine and suppress the increase of harmful bacteria. However, the antitumor activity of cellooligosaccharides such as cellobiose has never been studied.
  • Patent Document 4 discloses a cell killing action of a pharmaceutical containing cellobiose on cancer cells.
  • Patent Document 4 uses cellobiose impurities that are extracts from plants, and this is also based on NMR data described in (Patent Document 4). it is obvious.
  • the extract has a cell-killing effect. This also indicates that the extract is an impurity of cellobiose. I understand that.
  • JP 2008-208093 A Japanese Patent Laid-Open No. 2002-179577 JP 2007-330177 A International Publication No. 2011/110190
  • an object of the present invention is to provide an antitumor agent having excellent antitumor activity, high safety, and few side effects.
  • the present inventors conducted extensive research and found that cellobiose, which is a type of oligosaccharide, suppresses the occurrence of cancer induced by carcinogens and completed the present invention. . That is, the gist of the present invention is as follows.
  • An antitumor agent comprising cellobiose as an active ingredient.
  • a pharmaceutical comprising the antitumor agent according to (1) above.
  • a food containing the antitumor agent according to (1) above.
  • an antitumor agent having excellent antitumor activity and high safety, and a drug and a food using the same can be obtained.
  • the antitumor agent according to the present invention is characterized by containing cellobiose as an active ingredient.
  • Cellobiose is a disaccharide in which two glucose molecules are connected by ⁇ 1, 4 bonds, and the chemical formula is C 12 H 22 O 11 .
  • Such cellobiose can be appropriately produced by a method of decomposing a cellulosic substance with cellulase, a method of condensing or transferring a glucose sugar monosaccharide or a derivative thereof, a method of synthesizing from sucrose, and the like.
  • both plant and animal substances are applicable.
  • fibrous materials derived from natural products contained in cotton, wood, bamboo, kenaf, wheat, rice, bacterial cellulose, etc., regenerated cellulose obtained by dissolving them once in a solvent, or their chemistry The thing etc. which processed and made the cellulose derivative can be used. Any one of these cellulose materials may be used, or two or more of them may be used in combination.
  • natural cellulosic materials that do not undergo dissolution or chemical treatment are preferred because the cellobiose obtained does not contain solvents or chemicals that are harmful to the human body.
  • Any cellulase may be used as long as it has a decomposition activity on cellulose.
  • the cellulase enzyme source include cellulase-producing bacterial cells themselves, those obtained by purifying enzymes secreted by cellulase-producing bacteria, and those obtained by formulating purified enzymes together with additives such as excipients and stabilizers.
  • the dosage form may be any of powder, a granule, a liquid, etc.
  • Examples of the enzymatic decomposition method using cellulase include a method in which a cellulosic substance is suspended in an aqueous medium, cellulase is added to the suspension, and the saccharification reaction is performed by heating while stirring or shaking. Can be mentioned.
  • the suspension method, the stirring method, the addition method and order of addition of the cellulosic substance and cellulase, and the reaction conditions such as the concentration thereof can be appropriately set from the viewpoint of the yield of cellobiose.
  • the conditions such as pH and temperature of the reaction solution may be any conditions so long as the cellulase is not inactivated. Specifically, when the reaction is performed at normal pressure, the temperature is 5 to 95 ° C. and the pH is 1 to 11. It can be a range.
  • the cellobiose in the present invention can be obtained by enzymatic degradation of cotton (absorbent cotton).
  • This method is advantageous in that the process time is extremely short compared to a method using woody materials as a raw material.
  • the product obtained by enzymatic degradation of cotton has been confirmed by HPLC measurement to contain approximately 75% cellobiose, 22% glucose, and 3% cellotriose.
  • the produced cellobiose can be subjected to purification treatment such as enzyme removal, desalting, and decolorization as necessary.
  • purification treatment such as enzyme removal, desalting, and decolorization as necessary.
  • a known method can be used without particular limitation.
  • filtration treatment such as chromatography, microfiltration, ultrafiltration, and reverse osmosis membrane filtration, crystallization treatment, treatment with an ion exchange resin.
  • Activated carbon treatment, and the like, and any of these treatments can be performed alone or in combination with a plurality of treatments.
  • the cellobiose obtained as described above has antitumor activity for suppressing tumor development or tumor growth against various cancers such as breast cancer, and can be used as a medicine.
  • a cellobiose antitumor agent is used as a pharmaceutical, its form is not particularly limited, and depending on the administration method and the conditions such as the type, shape and location of the applied tumor, tablets, capsules, powders, granules It can be appropriately selected from various forms such as an agent and a drink. That is, the anti-tumor agent of cellobiose can be used as a pharmaceutical as it is, or it may be combined with a usual additive such as a carrier, a diluent or an excipient as necessary.
  • the ingestion or dosage of the antitumor agent according to the present invention is a therapeutically effective amount and cannot be generally specified depending on the type of tumor or the like, but in the case of an adult with a body weight of 60 kg, the amount of cellobiose per day is usually 240 mg or more. , Preferably 2400 mg or more.
  • the upper limit of the dose is not particularly limited, but is preferably less than 4800 mg.
  • the antitumor agent of the present invention can be used in combination with known antitumor agents or other therapeutic agents.
  • the cellobiose antitumor agent according to the present invention can be contained in food in general and used as a functional food having antitumor activity.
  • Cellobiose may be encapsulated using gelatin or the like, and the capsule may be used as a supplement food, or may be blended in beverages, confectionery, gum, candy and the like.
  • Example 1 Purpose of study The antitumor effect of cellobiose was examined using a rat DMBA-induced breast cancer model.
  • Test materials and equipment (1) Test substances and media a) Test substances Name: Cellobiose Properties: Powder Storage conditions: Low-temperature storage Handling precautions: Since it is highly hygroscopic, it was sealed after use and careful of moisture.
  • DMBA 7,12-Dimethylbenzo [a] anthracene Storage conditions: Room temperature Manufacturer: SIGMA Handling precautions: To avoid inhalation and skin contact, a mask, safety glasses and gloves were worn.
  • Sesame oil Storage conditions Room temperature Manufacturer: SIGMA Handling precautions: None in particular.
  • Test method (1) Grouping Based on the following group composition table (Table 1) by stratified randomization method using animals with no abnormalities observed in general condition observation during quarantine / acclimation period, using body weight as an index Grouping was performed. Residual animals were excluded from the test group on the day of grouping, euthanized by ether excess anesthesia, and disposed.
  • Monitoring animal setting In order to monitor the rearing environment, select the three animals with no abnormalities in the quarantine / acclimation period from the remaining animals after grouping in order of increasing individual identification number. Monitoring animals were set up. Monitoring animals were housed in the same animal room as the test group until the last autopsy day of the test group.
  • a carcinogen was administered to each animal after grouping. That is, forcible oral administration was performed at a dose of 1 mL / animal using an oral sonde (disposable oral sonde, Fuchigami Instruments) and syringe (disposable syringe, Terumo Corp.). At the time of administration, a mask, safety glasses and gloves were worn to avoid inhalation and skin contact.
  • test substance administration liquid For the preparation of the medium, CMC was weighed in the required amount using an electronic pan balance Sartorius Laboratory (Sartorius Co., Ltd.). The weighed CMC was added little by little while stirring distilled water in a beaker using a mighty magnetic stirrer (Koike Seimitsu Seisakusho). It moved to the graduated cylinder and made up to 0.5% (W / V). The prepared medium was stored and used under refrigeration for up to 9 days including the preparation date.
  • test substance was weighed using an electronic analytical balance Sartorius Analytical (Sartorius Co., Ltd.).
  • the weighed test substance was dissolved in a medium, transferred to a graduated cylinder and made up to a concentration of 0.8 and 8.0 mg / mL. It was prepared at the time of use.
  • the remaining test substance administration solution after administration was diluted with a large amount of tap water and discarded.
  • test substance Administration was started from the day after the grouping date (the first day). It was administered by oral gavage once a day for 12 consecutive weeks. At the time of administration, gavage was performed by oral gavage at 5 mL / kg / day according to the group composition table using an oral sonde (disposable oral sonde, Fuchigami Instruments) and syringe (disposable syringe, Terumo Corp.). The amount of liquid to be administered was calculated from the body weight value measured on the closest day at the time of administration.
  • Fecal collection Feces were collected on the end of the administration period. In the morning of the harvest day, animals were transferred from the double cage to the breeding cage. After standing for 1 hour, feces excreted in the breeding cage were collected for each animal and stored in a deep freezer set at ⁇ 80 ° C.
  • Dissection Anatomy was performed on the day after the end of the administration period.
  • the laparotomy was performed under anesthesia with ether, and the blood was exsanguinated from the abdominal aorta. Thereafter, all the tumors of each individual were excised, and the wet weight was measured using an electronic balance TX323L (Shimadzu Corporation). Tumors after wet weight measurement were discarded.
  • Test result (1) General state and weight transition The weight transition of each group is shown in FIG. The control group increased throughout the study period. The low-dose group and the high-dose group showed almost the same transition as the control group. There was no significant difference between the groups. As for the general condition, one animal died on the 8th day in the control group (animal number: 007). One animal died on day 4 in the low-dose group (animal number: 106). One animal died on day 76 in the high-dose group (animal number: 209).
  • Tumor wet weight The tumor wet weight of each group is shown in FIG.
  • the low dose group had approximately the same wet weight as the control group.
  • the high dose group was not significant compared to the control group, but showed a lower value.
  • Test material (1) Test substance Name: Cellobiose Storage method: Refrigerated, dark, dehumidified (2) Cells used Cell types: HeLa (human cervical cancer-derived cell line), HaCaT (human-derived immortalized keratinocytes) and Hep -G2 (human liver cancer-derived cell line) (3) Medium used Medium name: HeLa dedicated medium, HaCaT dedicated medium and Hep-G2 dedicated medium (4) Used reagent (for XTT assay) Reagent name: Cell Proliferation Kit (XTT) Manufacturer name: Cosmo Bio Co., Ltd. Catalog No. : 20-300-1000
  • Test method cell thawing / passaging
  • HeLa, HaCaT and Hep-G2 were thawed and cultured in various dedicated media.
  • Cell passage was performed 2-3 times.
  • Cells that recovered their proliferation were used for the test.
  • HeLa, HaCaT, and Hep-G2 were seeded in 24 wells at 1 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ L / well in each of two 96-well plates.
  • the cells were cultured for 24 hours in a CO 2 incubator.
  • the cells were cultured in a CO 2 incubator for 3 hours.
  • the cells were photographed.
  • the medium containing the test substance in one 96-well plate in which various cells were cultured was removed and replaced with a normal medium.
  • Test Results The results of the XTT assay for HeLa, HaCaT and Hep-G2 are shown in FIGS. As is apparent from FIGS. 8 to 10, the survival rate of HeLa and HaCaT was almost unchanged compared to the control even at the test substance concentration of 10 mg / mL. In addition, in Hep-G2, a maximum decrease in survival rate of about 15% was observed in the high concentration group of the test substance. Further, as a confirmation of the performance of the kit used, the assay was performed using HeLa and dexamethasone which is an apoptosis inducer. The result is shown in FIG. A decrease in survival rate of about 40% was observed at 500 ⁇ M dexamethasone, confirming that there was no problem with the kit performance.
  • FIGS. 8 to 10 show that high-purity cellobiose, which is the target substance of the present invention, does not have a cell-killing effect on cancer cells.
  • FIGURE 9 of (Patent Document 4) shows that the compound has a cell-killing effect on cancer cells. From this, it was found that the compound described in (Patent Document 4) is a cellobiose impurity, and the component having a cell-killing effect on cancer cells is a component other than cellobiose. That is, (Patent Document 4) does not disclose the technical idea regarding the antitumor action of cellobiose. As shown in FIGS.
  • the fact that high-purity cellobiose does not directly have a killing effect on cancer cells is that cellobiose is induced by a carcinogen as demonstrated in the above-mentioned Examples. This is consistent with suppressing the occurrence of cancer. That is, in the present invention, it is considered that cellobiose does not directly act on cells but acts on the immune system of the living body to enhance the immunity, resulting in an antitumor effect.

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Abstract

　優れた抗腫瘍活性を有し、また安全性が高く、副作用の少ない抗腫瘍剤を提供することを目的とする。　本発明の抗腫瘍剤は、セロビオースを有効成分とすることを特徴とする。

Description

抗腫瘍剤
　本発明は、抗腫瘍剤に関する。
　従来、癌の治療及び症状の軽減に適した治療方法を開発するべく多くの研究が行われている。癌の治療方法として、化学療法、放射線療法及び外科療法のいわゆる三大療法が適宜用いられている。放射線療法には、急性反応及び晩期反応としての副作用があり、放射線が癌細胞とともに正常細胞にもダメージを与えるため、倦怠感、食欲不振、紅斑等の皮膚障害、消化器官からの出血、白血球等の減少、脱毛等の多様な問題を引き起こす恐れがある。また、外科療法は、精神的・体力的に患者の負担が大きく、手術による後遺症や合併症の恐れがある。また、癌が外科的に切除し難い部位に発生した場合には適用できないという問題もある。
　一方、化学療法の分野においては、抗生物質、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ホルモン剤等が癌細胞に有効な抗腫瘍剤として見出されている。しかし、これらの抗腫瘍剤は、癌細胞を攻撃するだけでなく、正常細胞にも作用することから、嘔吐、悪心、食欲不振、脱毛等の副作用を引き起こし、患者のＱＯＬを著しく低下させるという問題が発生している。したがって、より安全性が高く、副作用の少ない新規な抗腫瘍剤の開発が望まれている。
　抗腫瘍剤として、（特許文献１）には、キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖とハタケシメジ抽出物を有効成分とする抗腫瘍剤が開示されている。また、（特許文献２）には、単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エステルからなる抗腫瘍物質が開示されている。これらの抗腫瘍剤は、抗腫瘍効果が不十分であり、なお改良の余地があった。
　ところで、（特許文献３）には、セロビオース等のセロオリゴ糖を有効成分とする腸内細菌賦活剤が開示されている。この発明によれば、セロオリゴ糖が腸内の有用細菌を選択的に増加させ、有害細菌の増加を抑制することができる。しかし、セロビオース等のセロオリゴ糖の抗腫瘍活性に関して従来検討されたことはなかった。
　また、（特許文献４）には、セロビオースを含む医薬品の癌細胞に対する殺細胞作用が開示されている。しかし、後述するように、（特許文献４）で用いられているのは植物からの抽出物であるセロビオースの不純物であり、このことは該（特許文献４）に記載されているＮＭＲデータからも明らかである。また、（特許文献４）に記載されている癌細胞の生存率に関する試験において該抽出物が殺細胞作用を有することが示されているが、このことからも該抽出物がセロビオースの不純物であることが分かる。
特開２００８－２０８０９３号公報 特開２００２－１７９５７７号公報 特開２００７－３３０１７７号公報 国際公開第２０１１／１１０１９０号
　そこで本発明は、上記従来の状況に鑑み、優れた抗腫瘍活性を有し、また安全性が高く、副作用の少ない抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本発明者らが鋭意研究を行った結果、オリゴ糖の一種であるセロビオースが、発癌性物質により誘発される癌の発生を抑制することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）セロビオースを有効成分とする抗腫瘍剤。
（２）上記（１）に記載の抗腫瘍剤を含有する医薬品。
（３）上記（１）に記載の抗腫瘍剤を含有する食品。
　本発明により、優れた抗腫瘍活性を有し、且つ安全性の高い抗腫瘍剤、並びにそれを利用した医薬品及び食品を得ることができる。
実施例における各群の体重推移を示すグラフである。 実施例における各群の腫瘍発生個体数推移を示すグラフである。 実施例における各群の推定腫瘍体積推移を示すグラフである。 実施例における各群の腫瘍湿重量を示すグラフである。 参考例における被験物質（セロビオース）の１３Ｃ　ＮＭＲスペクトルである。 参考例における被験物質（セロビオース）の１Ｈ　ＮＭＲスペクトルである。 参考例における被験物質（セロビオース）の赤外吸収スペクトルである。 ＨｅＬａに対する被験物質（セロビオース）の殺細胞活性を示すグラフである。 ＨａＣａＴに対する被験物質（セロビオース）の殺細胞活性を示すグラフである。 Ｈｅｐ－Ｇ２に対する被験物質（セロビオース）の殺細胞活性を示すグラフである。 デキサメタゾン濃度に対する生存率の変化を示すグラフである。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明に係る抗腫瘍剤は、セロビオースを有効成分とすることを特徴とする。セロビオースは、２つのグルコース分子がβ１、４結合でつながった二糖であり、化学式はＣ１２Ｈ２２Ｏ１１である。このようなセロビオースは、セルロース系物質をセルラーゼで分解する方法、グルコース糖の単糖類又はその誘導体を縮合もしくは糖転移させる方法、スクロースから合成する方法等により適宜製造することができる。
　セルラーゼにより分解されるセルロース系物質としては、植物性及び動物性のいずれも適用可能である。具体的には、コットン、木材、竹、ケナフ、ムギ、イネ、バクテリアセルロース等に含有される天然物由来の繊維質物質や、それらを一旦溶剤に溶解させ再生させた再生セルロース、又はそれらの化学処理を施しセルロース誘導体としたもの等を用いることができる。これらのセルロース系物質は、いずれか１種を用いても良いし、２種以上を併用しても良い。特に、溶解又は化学処理を経ない天然のセルロース系物質は、得られるセロビオースに人体に有害な溶剤又は化学物質が含まれないため好ましい。
　セルラーゼとしては、セルロースに対する分解活性を有するものであれば適用可能である。セルラーゼ酵素源としては、セルラーゼ産生菌体そのもの、セルラーゼ産生菌が分泌する酵素を精製したもの、あるいは、精製酵素を賦形剤、安定化剤等の添加剤とともに製剤化したもの等が挙げられる。製剤中の添加剤の種類には特に制限はなく、その剤形は、粉末、顆粒、液体等のいずれであっても良い。
　セルラーゼによる酵素分解方法としては、例えば、セルロース系物質を水性媒体中に懸濁させ、その懸濁液にセルラーゼを添加し、攪拌又は振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法等を挙げることができる。その際の懸濁方法、攪拌方法、セルロース系物質及びセルラーゼの添加方法及び添加順序、それらの濃度等の反応条件は、セロビオースの収率等の観点から適宜設定することができる。また、反応液のｐＨ及び温度等の条件は、セルラーゼが失活しない条件であれば良く、具体的には、常圧で反応を行う場合、温度は５～９５℃、ｐＨは１～１１の範囲とすることができる。
　好適な例として、本発明におけるセロビオースは、綿花（脱脂綿）を酵素分解して得ることができる。この方法は、木質系を原料とする方法と比べプロセス時間が極めて短い点で有利である。綿花の酵素分解により得られる生成物は、ＨＰＬＣ測定により、およそ７５％のセロビオース、２２％のグルコース、及び３％のセロトリオースを含むことを確認している。
　製造したセロビオースは、必要に応じて、酵素除去、脱塩、脱色等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法を特に制限されることなく用いることができ、例えば、クロマトグラフィー処理、精密濾過、限外濾過、逆浸透膜濾過等の濾過処理、晶析処理、イオン交換樹脂による処理、活性炭処理等を挙げることができ、これらの処理のいずれかを単独で、または複数の処理を組み合わせて行うことができる。
　以上のようにして得られたセロビオースは、乳癌等の種々の癌に対し、腫瘍の発生を抑制し、あるいは腫瘍の成長を抑制する抗腫瘍活性を有し、医薬品として利用することができる。セロビオースの抗腫瘍剤を医薬品として用いる場合、その形態は特に制限されるものではなく、投与方法や適用される腫瘍の種類、形状及び存在部位等の条件に応じて、錠剤、カプセル、散剤、顆粒剤、ドリンク剤等の種々の形態の中から適宜選択することができる。すなわち、セロビオースの抗腫瘍剤をそのまま医薬品として用いることができ、あるいは、必要に応じて担体、希釈剤もしくは賦形剤等の通常の添加物と組み合わせて医薬品としても良い。
　本発明に係る抗腫瘍剤の摂取もしくは投与量は、治療上有効量であり、腫瘍の種類等により一概にはいえないが、体重６０ｋｇの成人の場合、１日当たり上記セロビオースの量として通常２４０ｍｇ以上、好ましくは２４００ｍｇ以上である。投与量の上限は特に限定されるものではないが、４８００ｍｇ未満とすることが好ましい。また、本発明の抗腫瘍剤は、公知の抗腫瘍剤あるいは他の治療剤と併用することもできる。
　さらに、本発明に係るセロビオースの抗腫瘍剤は、食品一般に含有させ、抗腫瘍活性を有する機能性食品として利用することができる。また、セロビオースをゼラチン等を用いてカプセル化し、このカプセルをサプリメント食品として用いたり、飲料、菓子、ガム、キャンディー等に配合しても良い。
　次に、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。ただし、以下の実施例は単に例示するのみであり、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
（実施例）
１．試験目的
　ラットＤＭＢＡ誘発乳癌モデルを用いて、セロビオースの抗腫瘍作用を検討した。
２．適用する基準
　本試験は、以下の法律、基準及び指針を準用した。
・動物の愛護及び管理に関する法律〔法律第１０５号、昭和４８年１０月１日（平成２３年８月３０日最終改正：法律第１０５号）〕
・実験動物の飼養及び保管並びに苦痛の軽減に関する基準（環境省告示第８８号、平成１８年４月２８日）
・動物の殺処分方法に関する指針〔総理府告示第４０号、平成７年７月４日（平成１９年１１月１２日一部改正：環境省告示第１０５号）〕
　なお、本試験は、試験実施施設内動物実験委員会が規定する動物実験計画書の審議・承認を得た後に実施した。
３．試験の概要
　ラットＤＭＢＡ誘発乳癌モデルを用いて、セロビオースの抗腫瘍作用を検討した。具体的には、７週齢の雌性ラットを体重を指標にして群分け後、７，１２－ジメチルベンゾ［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ）を２０ｍｇ／ｍＬ／匹で強制経口投与した。そして、被験物質を４及び４０ｍｇ／ｋｇ／日の２用量で、群分け日の翌日より１日１回１２週間連続で強制経口投与した。
　その結果、低用量及び高用量群では、ともに腫瘍の発生時期が対照群と比較して遅く、高用量群は腫瘍重量についても対照群と比較して有意ではないが、低い値を示した。このことから、被験物質であるセロビオースは、発癌性物質であるＤＭＢＡにより誘発される乳がんに対して、その発生を抑制することが示唆された。
４．試験材料及び器材
　（１）被験物質及び媒体
　イ）被験物質
　　名称　　　：セロビオース
　　性状　　　：粉末
　　保存条件　：低温保存
　　取扱い上の注意　：吸湿性が高いので、使用後は密閉し、湿気に注意した。
　ロ）蒸留水
　　名称　　　：注射用水
　　保存条件　：室温
　　製造元　　：大塚製薬工場（株）
　　取扱い上の注意　：特になし。
　ハ）ＣＭＣ
　　名称　　　：カルボキシメチルセルロースナトリウム
　　保存条件　：室温
　　製造元　　：関東化学（株）
　　取扱い上の注意　：特になし。
　（２）使用試薬
　発癌剤として、以下の試薬を使用した。
　イ）ＤＭＢＡ
　　名称　　　：７，１２－ジメチルベンゾ［ａ］アントラセン
　　保存条件　：室温
　　製造元　　：ＳＩＧＭＡ
　　取扱い上の注意　：吸入及び皮膚への付着を避けるために、マスク、安全メガネ及び手袋を着用した。
　ロ）ごま油
　　名称　　　：ごま油
　　保存条件　：室温
　　製造元　　：ＳＩＧＭＡ
　　取扱い上の注意　：特になし。
　（３）使用動物
　６週齢のラット、Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）（ＳＰＦ）、雌性を日本チャールス・リバー（株）より２０１２年３月２８日に５２匹購入した（発注数：５０匹）。
　動物は入荷日に耳パンチ法により個体識別し、入荷から群分け日まで馴化した。一般状態観察を毎日行い、一般状態及び体重推移に異常が見られなかった動物を選択し使用した。各ケージには、群分け前は試験番号、性別及び個体識別番号（耳パンチ番号）を記入したカードを付し、群分け後は群及び動物番号を追記した。
　（４）飼育方法
　馴化飼育及び実験期間を通じ、温度２２±３℃、湿度５０±２０％、照明１２時間（８：００～２０：００）、換気回数１３～１７回／時間の環境下で、ステンレス製可動ラック（１７９０Ｗ×４７０Ｄ×１６５０Ｈ、ｍｍ）に設置したステンレス製金網２連ケージの１区画（２５５Ｗ×１８５Ｄ×２００Ｈ、ｍｍ）に個別で収容した。飼料は、固型飼料ＣＲＦ－１（オリエンタル酵母工業（株））を、ステンレス製固型飼料給餌器を用いて自由に与えた。水は、ポリサルフォン製給水器（先管ステンレス製）により、水道水を自由に与えた。
５．試験方法
　（１）群分け
　検疫・馴化期間中の一般状態観察において異常が認められない動物を選択し、体重を指標として、層別連続無作為化法により下記群構成表（表１）に基づき群分けを行った。残余動物については、群分け実施日に試験群から除外し、エーテルの過剰麻酔により安楽死させ処分した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（２）モニタリング動物の設定
　飼育環境のモニタリングをするために、群分け後の残余動物のうち検疫・馴化期間に異常の見られなかった３匹の動物を、個体識別番号の若い順に選定して、モニタリング動物を設定した。モニタリング動物は、試験群と同一の動物室で、試験群の最終剖検日まで飼育した。
　（３）発癌剤の投与
　イ）発癌剤の調製
　ＤＭＢＡを、電子上皿天秤Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ザルトリウス（株））を用いて必要量秤量した。秤量したＤＭＢＡは、ごま油の入ったビーカーに入れ、マイティーマグネチックスターラー（小池精密機器製作所）を用いて完全に溶解するまで攪拌した。溶解後、メスシリンダーに移して２０　ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにメスアップした。調製時には、吸入及び皮膚への付着を避けるためにマスク、安全メガネ及び手袋を着用し、ケミカルハザード対策を行った。用時調製とした。投与後の残余発癌剤は、医療廃棄物として処理した。
　ロ）発癌剤の投与
　群分け後のそれぞれの動物に発癌剤を投与した。すなわち、経口ゾンデ（ディスポーザブル経口ゾンデ、（有）フチガミ器械）と注射筒（ディスポーザブルシリンジ、テルモ（株））を用いて、１ｍＬ／匹の投与量で強制経口投与した。投与時には、吸入及び皮膚への付着を避けるために、マスク、安全メガネ及び手袋を着用した。
　（４）被験物質の投与
　イ）被験物質投与液の調製
　媒体の調製は、ＣＭＣを電子上皿天秤Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ザルトリウス（株））を用いて必要量秤量した。秤量したＣＭＣは、ビーカーに入れた蒸留水をマイティーマグネチックスターラー（小池精密機器製作所）を用いて撹拌しながら、少しずつ加えた。メスシリンダーに移して０．５％（Ｗ／Ｖ）にメスアップした。調製した媒体は、調製日を含めて９日間を限度に冷蔵下で保存し使用した。
　次に、被験物質を電子分析天秤Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　Ａｎａｌｙｔｉｃ（ザルトリウス（株））を用いて必要量秤量した。秤量した被験物質を媒体に溶解させ、メスシリンダーに移して０．８及び８．０ｍｇ／ｍＬの濃度にメスアップした。用時調製とした。投与後の残余の被験物質投与液は大量の水道水で希釈して廃棄した。
　ロ）被験物質の投与
　群分け日の翌日から投与を開始した（１日目とした）。１日１回１２週間連続で強制経口投与した。
　投与の際には、経口ゾンデ（ディスポーザブル経口ゾンデ、（有）フチガミ器械）と注射筒（ディスポーザブルシリンジ、テルモ（株））を用いて、群構成表に従って５ｍＬ／ｋｇ／ｄａｙで強制経口投与した。投与液量は、投与時に最も近い日に測定した体重値から算出した。
　（５）一般状態観察及び体重測定
　発癌剤の投与後、一般状態観察を毎日行った。体重測定を週１回の割合で行った。
　（６）被験物質投与期間中における推定腫瘍体積の算出
　腫瘍の発生が確認される場合は、発生している腫瘍の個数を測定し、各腫瘍の推定腫瘍体積（ｍｍ３）を週１回の割合で算出した。なお、各腫瘍の推定腫瘍体積（ｍｍ３）は、腫瘍付近の剃毛を行いノギスを用いて腫瘍径（長径ａ及び短径ｂ、ｍｍ）を測定後、下記式に従って算出し、各腫瘍における推定腫瘍体積の総和を求めた。
　各腫瘍の推定腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×ａ×ｂ２
　（７）糞便採取
　投与期間終了日に糞便採取を行った。採取日の午前中に、２連ケージから繁殖ケージに個体別に動物を移した。１時間放置し、繁殖ケージに排泄された糞便を動物ごとに回収し、－８０℃に設定したディープフリーザーで保存した。
　（８）解剖
　投与期間終了日の翌日に解剖を行った。エーテルによる麻酔下で開腹し、腹大動脈から放血して安楽死させた。その後、各個体の腫瘍を全て摘出し、電子天秤ＴＸ３２３Ｌ（（株）島津製作所）を用いて湿重量を測定した。湿重量測定後の腫瘍は廃棄した。
　（９）統計処理
　得られた数値（体重、推定腫瘍体積及び解剖時摘出腫瘍重量）は、各群で平均値及び標準誤差を算出した。
　各群間の有意差は、Ｂａｒｔｌｅｔｔ法により等分散性の検定を行い、等分散の場合はさらに一元配置分散分析を行い、有意である場合はＴｕｋｅｙ法により平均値の比較を行った。不等分散の場合はＫｒｕｓｋａｌ－ＷａｌｌｉｓのＨ検定を行い、有意である場合はＴｕｋｅｙ法により平均順位の比較を行った。Ｂａｒｔｌｅｔｔ法、一元配置分散分析及びＫｒｕｓｋａｌ－ＷａｌｌｉｓのＨ検定については、有意水準を危険率５％、Ｔｕｋｅｙ法については有意水準を危険率５％及び１％とした。
６．試験結果
　（１）一般状態及び体重推移
　各群の体重推移を図１に示す。対照群は、試験期間を通じて増加した。低用量群と高用量群は、対照群とほぼ同様の推移を示した。各群間に有意差は認められなかった。
　また、一般状態については、対照群で８日目に１匹死亡が認められた（動物番号：００７）。低用量群で４日目に１匹死亡が認められた（動物番号：１０６）。高用量群で７６日目に１匹死亡が認められた（動物番号：２０９）。
　（２）腫瘍発生個体数推移
　各群の腫瘍発生個体数推移を図２に示す。対照群は３５日目に腫瘍の発生が認められた個体数は１匹であった。その後、発生個体は増加し８４日目では１０匹であった。低用量群は４２日目まで腫瘍の発生は認められなかった。４９日目に腫瘍の発生が認められた個体数は４匹であった。その後、発生個体は増加し８４日目では１１匹であった。高用量群は４２日目まで腫瘍の発生は認められなかった。４９日目に腫瘍の発生が認められた個体数は２匹であった。その後、発生個体は増加し８４日目では１１匹であった。
　（３）推定腫瘍体積推移
　各群の推定腫瘍体積推移を図３に示す。対照群は、３５日目（５週後）から腫瘍の発生が確認された。その後、新たな腫瘍発生が確認され、それぞれの腫瘍体積も増加を示した。低用量群は、４９日目（７週後）から腫瘍の発生が確認された。その後、新たな腫瘍発生が確認され、それぞれの腫瘍体積は増加を示した。４２日目の時点では、対照群と比較して有意に低い値であった。高用量群は、４９日目（７週後）から腫瘍の発生が確認された。その後、新たな腫瘍発生が確認され、それぞれの腫瘍体積は増加を示した。４２及び４９日目に、対照群と比較して有意に低い値であった。
　（４）腫瘍湿重量
　各群の腫瘍湿重量を図４に示す。低用量群は、対照群とほぼ同様の湿重量であった。高用量群は、対照群と比較して有意ではないが、低い値を示した。
７．考察及び総括
　低用量及び高用量群では、ともに腫瘍の発生時期が対照群と比較して遅く、高用量群は腫瘍重量についても対照群と比較して有意ではないが低い値を示した。このことから、被験物質であるセロビオースは、発癌性物質であるＤＭＢＡにより誘発される乳がんに対して、その発生を抑制することが示唆された。
（参考例１）
　セロビオースについての１３Ｃ　ＮＭＲ、１Ｈ　ＮＭＲ及びＩＲ測定を行った。得られたＮＭＲスペクトル及び赤外吸収スペクトルを図５～７に示す。
　図６と上記（特許文献４）のＦＩＧＵＲＥ　４のＮＭＲチャートとの比較から明らかなように、セロビオース特有のピークが両チャートに確認されたが、ＦＩＧＵＲＥ　４のＮＭＲチャートにおいては、さらに別の位置にピークが確認された。この結果から、図５～７で示されているものは高純度のセロビオースであるのに対して、（特許文献４）に記載されているものはセロビオースの不純物であることが明らかとなった。
（参考例２）
　セロビオースを用いて細胞生存率に関する試験を次の方法で行った。
＜被験物質（セロビオース）による細胞生存性に対する作用検討試験＞
　各種株化細胞に対する被験物質（セロビオース）の選択的殺細胞活性の有無を検討した。
１．試験材料
（１）被験物質
　名称　：セロビオース
　保管方法　：冷蔵、暗所、除湿
（２）使用細胞
　細胞種　：ＨｅＬａ（ヒト子宮頸ガン由来細胞株）、ＨａＣａＴ（ヒト由来不死化角化細胞）及びＨｅｐ－Ｇ２（ヒト肝ガン由来細胞株）
（３）使用培地
　培地名　：ＨｅＬａ専用培地、ＨａＣａＴ専用培地及びＨｅｐ－Ｇ２専用培地
（４）使用試薬（ＸＴＴアッセイ用）
　試薬名　：Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＸＴＴ）
　メーカー名　：コスモ・バイオ（株）
　カタログＮｏ．　：２０－３００－１０００
２．試験方法
（細胞の解凍・継代）
（１）ＨｅＬａ、ＨａＣａＴ及びＨｅｐ－Ｇ２を解凍し、各種専用培地で培養した。
（２）２～３回細胞継代を行った。
（３）増殖性が回復した細胞を試験に使用した。
（細胞培養及びＸＴＴアッセイ）
（１）ＨｅＬａ、ＨａＣａＴ及びＨｅｐ－Ｇ２を９６ウェルプレート２枚のそれぞれに１×１０４細胞／１００μＬ／ウェルで２４ウェル分播種した。
（２）２４時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
（３）被験物質を０（対照）、０．００１、０．０１、０．１、１及び１０ｍｇ／ｍＬの６段階の濃度で添加した（Ｎ＝４）。
（４）添加後、３時間ＣＯ２インキュベーターで培養した。
（５）培養後、細胞の写真撮影を行った。
（６）写真撮影後、各種細胞を培養した９６ウェルプレート１枚の被験物質が含まれる培地を除去し、通常の培地に交換した。
（７）ＸＴＴ　ｒｅａｇｅｎｔを５０μＬ添加した。
（８）添加後、３時間ＣＯ２インキュベーターで培養した。
（９）４５０～５００ｎｍの吸光度を測定した（ｒｅｆ．：６３０～６９０ｎｍ）。
（Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＸＴＴ）の性能確認）
（１）ＨｅＬａを９６ウェルプレート１枚に１×１０４細胞／１００μＬ／ウェルで１６ウェル分播種した。
（２）２４時間、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
（３）デキサメタゾンを、０（対照）、１０、１００及び５００μＭの３段階の濃度で添加した（Ｎ＝４）。
（４）添加後、３時間ＣＯ２インキュベーターで培養した。
（５）ＸＴＴ　ｒｅａｇｅｎｔを５０μＬ添加した。
（６）添加後、３時間ＣＯ２インキュベーターで培養した。
（７）４５０～５００ｎｍの吸光度を測定した（ｒｅｆ．：６３０～６９０ｎｍ）。
３．試験結果
　ＨｅＬａ、ＨａＣａＴ及びＨｅｐ－Ｇ２についてのＸＴＴアッセイの結果を図８～１０に示す。図８～１０から明らかなように、ＨｅＬａ及びＨａＣａＴは被験物質１０ｍｇ／ｍＬの濃度においても、生存率はコントロールと比較して、ほとんど変化は認められなかった。また、Ｈｅｐ－Ｇ２では被験物質の高濃度群において最大約１５％の生存率の減少が認められた。また、使用キットの性能確認として、ＨｅＬａを用いて、アポトーシス誘導剤であるデキサメタゾンを使用してアッセイを行った。その結果を図１１に示す。デキサメタゾン５００μＭにおいて約４０％の生存率の低下が認められたことから、キットの性能には問題ないことが確認された。
　また、顕微鏡写真によれば、ＨｅＬａ、ＨａＣａＴ及びＨｅｐ－Ｇ２について、被験物質のいずれの濃度においても、添加前と比較して、死細胞の増加、細胞の形態変化等の影響は認められなかった。
　図８～１０は、本発明の目的物質である高純度のセロビオースが癌細胞に対して殺細胞作用を有していないことを示している。一方、（特許文献４）のＦＩＧＵＲＥ　９においては、化合物が癌細胞に対して殺細胞作用を有することが示されている。このことから、（特許文献４）に記載の化合物はセロビオースの不純物であり、癌細胞に対して殺細胞作用を有している成分はセロビオース以外の成分であることが判明した。すなわち、（特許文献４）にはセロビオースの抗腫瘍作用に関する技術思想は開示されていない。なお、図８～１０に示すように、高純度のセロビオースが直接的に癌細胞に対して殺細胞作用を有さないことは、上述の実施例で証明したようにセロビオースが発癌性物質により誘発される癌の発生を抑制することと矛盾しない。すなわち、本発明においては、セロビオースが直接細胞に作用するのではなく、生体の免疫系に作用し、免疫を高めることによって結果的に抗腫瘍作用を示すものと考えられる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (3)

  1. 　セロビオースを有効成分とする抗腫瘍剤。
  2. 　請求項１に記載の抗腫瘍剤を含有する医薬品。
  3. 　請求項１に記載の抗腫瘍剤を含有する食品。
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