WO2014017451A1 - 多糖類、多糖類を含む組成物、及び免疫賦活剤 - Google Patents

多糖類、多糖類を含む組成物、及び免疫賦活剤 Download PDF

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WO2014017451A1
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polysaccharide
insect
immunostimulatory
composition
family
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PCT/JP2013/069834
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猛 三浦
智恵美 三浦
史 太田
俊治 岩井
高橋　隆行
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国立大学法人愛媛大学
物産バイオテック株式会社
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/63—Arthropods

Definitions

  • the present invention relates to an insect-derived polysaccharide having an immunostimulatory action, a composition containing the polysaccharide, and an immunostimulant containing the polysaccharide as an active ingredient.
  • polysaccharides having immunostimulatory action have been found.
  • techniques relating to polysaccharides having an immunostimulatory action include acidic mucopolysaccharide (see Patent Document 1), lipopolysaccharide and ⁇ -glucan (see Patent Document 2), gagome-derived viscous polysaccharide (see Patent Document 3), L-
  • ascofilan which is a sulfated polysaccharide mainly composed of D-glucuronic acid (see Patent Document 4), mannan having ⁇ -1,3-linkage (see Patent Document 5), etc.
  • Ascofilan which is a sulfated polysaccharide mainly composed of D-glucuronic acid
  • Patent Document 4 mannan having ⁇ -1,3-linkage
  • insects are regarded as important as animal proteins that are easy to produce artificially, and attempts have been made to use insect larvae and pupae as feed materials for livestock and fisheries (Patent Documents 6 and 7). reference)
  • the present invention is an insect-derived polysaccharide having an immunostimulatory action, and a composition containing the polysaccharide.
  • the polysaccharide having an immunostimulatory action contains at least rhamnose as a constituent sugar.
  • the polysaccharide is derived from an insect belonging to one or more selected from the group consisting of Diptera, Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera, Hemiptera, Diptera, and Lepidoptera .
  • the polysaccharide is derived from an insect belonging to one or more selected from the group consisting of Diptera, Lepidoptera, and Coleoptera.
  • another polysaccharide of the present invention is derived from an insect that is at least edible to plants.
  • the polysaccharide which has an immunostimulatory effect in another this invention has heat resistance and high temperature / high pressure tolerance. In such a case, an immunostimulatory effect is not lost even when the polysaccharide of the present invention is subjected to heat treatment or high temperature / high pressure treatment at the stage of production or processing, which is preferable.
  • another polysaccharide according to the present invention having an immunostimulatory action has an average molecular weight of about 1.0 ⁇ 10 5 to about 1.0 ⁇ 10 7 .
  • the immunostimulatory action of the polysaccharide can be at least via Toll-like Receptor 4.
  • compositions containing a polysaccharide derived from an insect and having an immunostimulatory action are selected from the group consisting of one or more powders selected from the group consisting of insect eggs, larvae, pupae and adults, insect eggs, larvae, pupae and adults. Or an alcohol-insoluble solid obtained from one or more selected from the group consisting of insect eggs, larvae, pupae and adults.
  • the present invention provides an immunostimulant comprising an insect-derived polysaccharide having an immunostimulatory action as an active ingredient.
  • the present invention is a polysaccharide having an immunostimulatory action derived from insects, a composition containing the polysaccharide, and an immunostimulant containing the polysaccharide as an active ingredient.
  • a high immunostimulatory effect can be obtained.
  • insects are increasing in value as animal resources for food and feed, they can be used as health foods having an immunostimulatory effect, and feed materials for livestock or fisheries having an immunostimulatory effect. .
  • the present invention provides an insect-derived polysaccharide having an immunostimulatory action, a composition containing the polysaccharide, and an immunostimulant containing the polysaccharide as an active ingredient.
  • the polysaccharide of the present invention is derived from insects.
  • the inventors have found that insects belonging to a plurality of species contain a polysaccharide having an immunostimulatory action, and have reached the present invention. Furthermore, it was clarified that insects belonging to a very wide range of species contain polysaccharides having an immunostimulatory action. Any insect containing a polysaccharide having an immunostimulatory action can be used in the present invention.
  • Insects are a general term for organisms belonging to the Arthropoda in the animal kingdom and classified as Insecta. Insecta is classified into the Apterygota and the Pterygota. Apterygota is classified into Collembola, Protura, Thysanura and the like.
  • the Pterygota is composed of Ephemeroptera, Plecoptera, Odonata, sticky leg (Embioptera), Orthoptera, Dermaptera, Isoptera (Termite) (Isoptera), Spinach (Termite) (Empioptera), Cannitic (Psocoptera), Caries (Mallophaga), Anoplura, Thysanoptera, Semi Hemiptera, Hymenoptera, Strepsiptera, Coleoptera, Neurooptera, Mecoptera, Trichoptera, Lepidoptera (Lepidoptera) Lepidoptera, Diptera, Aphaniptera, etc.
  • the lepidoptera the reticulates, the direct lepidoptera, the half lepidoptera, the pulmonales, the membrane moths, the coleoptera, the diptera, and the lepidoptera.
  • insects belonging to the order of the order are dragonflies.
  • Lepidoptera is further divided into the family of the damselfly (Calopterygidae), the southern dragonfly (Euphaeidae), the damselfly (Coenagrionidae), the damselfly (Megapodagrionidae), the green damselfly (Lestidae), and the monocytic dragonfly (Platycnemphidae) , Species of Epiphlebiidae, Petalulidae, Cordulegasteridae, Aeschnidae, Corduliidae, Macromiidae, Libellulidae, etc.
  • insects belonging to the reticulate are mantis and cockroaches.
  • the nettoid mantis (Mantodea) is further classified into mantisidae (Mantidae), Acromantidae, etc., and the nettome cockroach subfamily (Blattodea) is further classified as a cockroach (Blattidae) (Epilampridae), Greater cockroach (Pycnoscelidae), Greater cockroach (Blattellidae), Greater cockroach (Panesthiidae), etc.
  • insects belonging to the order of the order are grasshoppers, grasshoppers, crickets, kerats, mantis.
  • the order of the squirrel is Rhaphidophoridae, Gryllacridae, Grasshopper (Tettigoniidae), Cricketae (Gryllidae), Myrmechophilidae, Tridactylidae, Lotid pid , Classified into Tetrigidae, Locustidae, etc.
  • Heteroptera is further divided into the family Trichomeidae (Cydnidae), Buprestidae (Plataspidae), Pteratomidae, Acanthosomidae, Urostylidae, Helidameidae , Nagagameidae (Lygaeidae), Greater Beetle Family (Largidae), Hoshimetomeidae (Pyrrhocoridae), Eurythidae (Berytidae), Eurasianidae (Aradidae), Eurasianidae (Nabidae), Eurasianidae Naucoridae), Tameidae (Belostomatidae), Coleoptera (Nepidae), Scarabaei
  • Homoptera is a cicadaceae (Cicadidae), a hornworm family (Membracidae), a spotted beetle family (Cercopidae), a stag beetle family (Tomaspididae), a stag beetle family (Machaerotidae), a owl family (Ledridae), Tettigellidae), Euryanthidae, Nirvanidae / Paraboloponidae), Penthimiidae, Pensimiidae, Jassidae, Whites ), Aceraceae (Cicadellidae), Aphrodidae (Aphrodidae), Hecalidae, Errhomenellidae, Deltocephalidae, Tettigometridae, Falconidae (Mepla) ), Mosquitoes (Derbidae), staghorn eels (Achilidae),
  • the genus Lepidoptera is further divided into the family Lacidae (Inocellidae), Sembidae (Sialidae), Corydalidae (Corydalidae), Mantispidae, Ascalaphidae, Osmylidae, Chrysopidae (Chrysopidae) It is classified into the family Ameridae (Hemerobiidae), Myrmeleontidae, etc.
  • Hymenoptera examples include bees and ants. Hymenoptera is further classified into Xyelidae, Orussidae, Blasticotomidae, Siricidae, Cephidae, Pamphiliidae, thr Honey bee family (Diprionidae), Japanese bee family (Argidae), Japanese bee family (Cimbicidae), Japanese bee family (Blaconidae), Japanese wasp family (Aphidiidae), Japanese wasp family (Ichneumonidae), Japanese wasp family (Agaonidae) Leucospidae, Eucharitidae, Torymidae, Eurytomidae, Pteromalidae, Encyrtidae, Eulmididae, Elasmidae, Elasmidae Mistletoe (Trichogrammatidae) , Mymaridae, Proctotrupida
  • Coleoptera are also called beetles.
  • insects belonging to the order Coleoptera include beetles, stag beetles, longhorn beetles, common beetles, scarab beetles, bugs, canabuns, beetles, fireflies, ladybirds, weevil, beetles, and beetles.
  • the Coleoptera are further classified into the family of the family Lacopteridae (Cupedidae), the family Rhysodidae, the department of the beetle (Paussidae), the family Cicindelidae, the group of Carabidae, the group of Scaritidae, and the family of the Purdae (H).
  • Insects belonging to the order Diptera include mosquitoes, gangambo, flies, abu, buyu, as well as house flies, Drosophila, fruit flies, mizubu.
  • the Diptera is further divided into the family Anisopodidae, Cramptonomyiidae, Pachyneuridae, Axymyiidae, Hyperscelidae, Mycetophilidae, Bolitophilidae, Bolitophilidae Ceroplatidae, Sciophilidae, Macroceridae, Cecidomyiidae, Sciaridae, Bibionidae, Hesperinidae, Scatopidae, Scatopidae, Scatopidae (Psycodidae), Nisehimekamamboidae (Tanyderidae), Koshibosokamamboidae (Ptychopteridae), Scorpaenidae (Tricocheridae), Syribtokamamboidae (Cylindrotomatidae), Scorpaenidae (Tipulid
  • insects belonging to the family Tephritidae specifically, the fruit fly (Tetradacus) tsuneonis), fruit fly (Strumeta dorsalis), fruit fly (Bactrocera cucurbitae / Wegodacus) cucurbitae), pumpkin fruit fly (Para mecanicodacus depressus), thrips (Urophora sachalinensis), yellow fly (Oedaspis) japonica), Rhacochlaena japonica, Chamoenidae (Anomoia vulgaris), Acrotaeniostola scutellaris), Parastrozona japonica, Hemilea infuscata, Campiglossa hirayamae), Xyphosia punctigera, Tephritis majuscula, Ensina sonchi), Sphaeniscus atilia, and Rhabdochaeta asteria.
  • insects belonging to the family Muscidae are Musca domestica), Musca sorbens, Stomoxys calcitrans and the like.
  • Insects belonging to the order Lepidoptera include insects called butterflies and insects called moths.
  • Lepidoptera are further classified into Micropterygidae, Eriocraniidae, Hepialidae, Incurvariidae, Adelidae, Stigmellidae, Hetigelidae, and Heliozelidae.
  • insects belonging to the Bombycidae family include Bombyx (Bombyx). mori), Bombyx mandarina, Oberthuria falcigera, Pseudandraca gracilis), sukashisan (Prismosticta hyalinata) and the like.
  • the Saturniidae is further divided into the genus Attacus, Samia, Antheraea, Saturnia, Rhodinia, Actias and Cricula. ) And Gonimbrasia genus.
  • Specific examples of insects belonging to the Saturniidae family include Actias artemis aliena and Himasan (Samia).
  • the kind of insect in the present invention is not limited, and any insect containing a polysaccharide having an immunostimulatory action can be used in the present invention.
  • the insect in this invention is an insect which shows at least a food habit to a plant.
  • the polysaccharide contained in the composition of the present invention preferably contains at least rhamnose as a constituent sugar. Because rhamnose is abundantly contained in plants, rhamnose can be easily taken up if it is a phytophagous insect or an insect that is omnivorous or fecal and that also eats the plant.
  • insects may change their feeding habits between adult larvae and larvae. Therefore, when larvae or moths are used in the present invention, insects that are at least phagocytic to plants are preferred. Specific examples of phytophagous insects that are larvae include insects belonging to the family Tephritidae, Bombycidae, Saturniidae, and Scarabaeidae. In addition, insects belonging to the family Muscidae are examples of insects that have larvae that are fecal and that also eat plants.
  • the insect in this invention should just contain the polysaccharide which has an immunostimulatory effect, and is not limited in each transformation stage of an egg, a larva, a pupa, or an adult.
  • insect larvae or moths are suitable, but moths are particularly preferred. This is because larvae contain a large amount of undigested substances in the digestive tract, and it may be necessary to separate them.
  • the molecular weight of the polysaccharide of the present invention is not limited, but is preferably about 1.0 ⁇ 10 4 to about 1.0 ⁇ 10 8 , more preferably about 1.0 ⁇ 10 5 to about 1. 0 ⁇ 10 7 , more preferably about 3.0 ⁇ 10 5 to about 2.0 ⁇ 10 6 .
  • the polysaccharide of the present invention includes monosaccharides and derivatives thereof as constituent sugars.
  • monosaccharides and derivatives thereof that can be included in the polysaccharide of the present invention will be described in detail.
  • Monosaccharides also known as neutral sugars, are classified into aldoses and ketoses, and depending on the number of carbons contained, tricarbons, tricarbons, tetroses, pentoses, hexoses ( Hexose), pentose sugar (heptose), octose sugar (octulose), etc.
  • Specific examples of the three carbon sugars include glyceraldehyde and dihydroxyacetone.
  • Specific examples of tetracarbon sugars include erythrose, threose, erythrulose and the like.
  • pentose examples include ribose, lyxose, xylose, arabinose, aviose, ribulose, xylulose and the like.
  • hexose examples include allose, talose, growth, glucose, altrose, mannose, galactose, idose, psicose, fructose, sorbose, tagatose and the like.
  • pentose include cedoheptulose and coliose.
  • sugar derivatives include deoxy sugar, uronic acid, aldonic acid, aldaric acid, amino sugar and the like.
  • deoxy sugars include deoxyribose, deoxyglucose, quinose, tevetose, rhamnose, rhamnulose, fucose, digitinose, digitalose, digitoxose, simarose, avequeose, ascarylose, coritoses, paratose, tiberose and the like.
  • uronic acid include glucuronic acid, guluronic acid, mannuronic acid, galacturonic acid, iduronic acid and the like.
  • aldonic acid examples include gulonic acid and gluconic acid.
  • aldaric acid examples include glucaric acid, galactaric acid, mannalic acid and the like.
  • amino sugars include glucosamine, galactosamine, sialic acid, aminouronic acid, muramic acid and the like.
  • Polysaccharides rich in uronic acid, aldonic acid, or aldaric acid show acidity and are called acidic polysaccharides.
  • the above monosaccharides and derivatives thereof may have optical isomers.
  • the monosaccharide and its derivative may be either D-type or L-type optical isomers.
  • the polysaccharide of the present invention may contain monosaccharide (neutral sugar), amino sugar, uronic acid, aldonic acid, aldaric acid, deoxy sugar as constituent sugars. More specifically, the polysaccharide of the present invention includes D-glucose (D-Glc), D-galactose (D-Gal), D-mannose (D-Man), D-ribose (D-Rib) N- Acetyl-D-glucosamine (D-GlcNAc), N-acetyl-D-galactosamine (D-GalNAc), D-glucuronic acid (D-GlcA), L-rhamnose (L-Rha), L-fucose (L-Fuc ), D-mannuronic acid (D-ManA), and L-guluronic acid (L-GulA).
  • D-Glc D-galactose
  • D-Man D-mannose
  • D-Rib D-acet
  • the polysaccharide of the present invention preferably contains at least rhamnose as a constituent sugar.
  • Rhamnose is a kind of deoxy sugar, and has a structure in which the hydroxy group at the 6-position of mannose is replaced with a hydrogen atom.
  • rhamnose has L-rhamnose (L-Rha) which is L form in nature.
  • L-Rha L-rhamnose
  • the synthetic pathway of rhamnose has been specified in plants and bacteria, but the synthetic pathway of rhamnose has not been found in animals including insects so far (see Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Rhamnose is preferably contained in the polysaccharide of the present invention as a constituent sugar in a proportion of about 5 mol% to about 50 mol%, preferably about 10 mol% to about 25 mol%.
  • Non-Patent Document 1 MF Giraud, JH Naismith. “The rhamnose pathway ”Current opinion in structural biology (2000).
  • Non-Patent Document 2 M Maki, R Renkonen. “Biosynthesis of 6-deoxyhexose glycans in bacteria ”Soc Glycobiology (2004).
  • Analysis of the constituent sugars of the polysaccharide is performed using a gas mass chromatography mass spectrometer. By comparing the peak area of the total ion chromatogram obtained by the gas mass chromatography mass spectrometer with the standard product, the content and content rate of the constituent sugars can be calculated.
  • a polysaccharide is hydrolyzed with trifluoroacetic acid (TFA), etc., derivatized, dried, and analyzed with a gas chromatography mass spectrometer (GC / MS) to obtain a total ion chromatogram. Can do.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • GC / MS gas chromatography mass spectrometer
  • the peak area corresponding to L-rhamnose in the total ion chromatogram obtained using a gas mass chromatography mass spectrometer preferably occupies about 5% to about 50% of the entire peak area, More preferably, it accounts for about 10% to about 25%.
  • the polysaccharide of this invention has heat resistance.
  • the polysaccharide has heat resistance, its immunostimulatory action is maintained even when the polysaccharide is heat-treated.
  • the temperature of the heat treatment is not limited, but is, for example, 80 ° C. to 300 ° C., preferably 90 ° C. to 200 ° C., more preferably 100 ° C. to 150 ° C.
  • the heat treatment time is not limited, but is 1 minute to 2 hours, preferably 5 minutes to 30 minutes. It was confirmed that the polysaccharide of the present invention does not lose its immunostimulatory effect at least by heat treatment at 100 ° C. for 30 minutes.
  • the polysaccharide of this invention has high temperature / high pressure tolerance.
  • High temperature and high pressure treatment refers to high temperature and high pressure treatment.
  • the pressure of the high-temperature and high-pressure treatment is not limited, but is, for example, 0.1 MPa to 1000 MPa, and preferably 0.2 Mpa to 100 Mpa.
  • the temperature of the high-temperature and high-pressure treatment is not limited, but is, for example, 80 ° C. to 300 ° C., preferably 90 ° C. to 200 ° C., more preferably 100 ° C. to 150 ° C.
  • High temperature and high pressure treatment includes treatment by an extruder.
  • the extruder is also called a kneading extruder and is used for processing food and feed.
  • the polysaccharide of the present invention is preferably one that does not lose its immunostimulatory action even when treated with an extruder.
  • the extruder includes a single-axis or multi-axis screw. Specifically, a composition containing the polysaccharide of the present invention and other raw materials are kneaded with a screw in an extruder and extruded from a die while being subjected to a high-temperature and high-pressure treatment.
  • the present invention also provides a composition containing a polysaccharide derived from an insect and having an immunostimulatory action.
  • the composition of the present invention is produced using insect eggs, larvae, pupae or adults containing polysaccharides having an immunostimulatory action as raw materials.
  • the insect transformation stage is not limited as long as it contains a polysaccharide having an immunostimulatory action, but insect larvae or pupae are suitable. In particular, it is preferable that it is a cocoon. This is because larvae contain a large amount of undigested substances in the digestive tract, which may be mixed into the composition.
  • the composition of the present invention can be produced by using insect moth as a raw material and subjecting it to heat treatment, high-temperature and high-pressure treatment, drying treatment, pulverization treatment and the like.
  • the composition of the present invention is preferably a powder or paste obtained by pulverizing one or more selected from the group consisting of insect eggs, larvae, pupae, and adults, and is more preferably a powder. preferable.
  • composition of the present invention is produced by performing a process of extracting a polysaccharide having an immunostimulatory action from insects. Since the polysaccharide of the present invention is soluble in water, water is used as a solvent for extracting the polysaccharide. The temperature and pressure of extraction are not limited, and heating extraction, reduced pressure extraction / pressurized extraction may be used. That is, the composition of the present invention is an extract, preferably a water extract, from one or more selected from the group consisting of insect eggs, larvae, pupae, and adults. The extract contains a polysaccharide having an immunostimulatory action.
  • the polysaccharide contained in the composition of the present invention is soluble in water and insoluble in solvents with low polarity such as methanol, ethanol, propanol, acetone, hexane and the like. Therefore, the composition of the present invention is preferably obtained by removing impurities contained in insects using a solvent with low polarity. That is, the composition of the present invention may be an insoluble solid in a polysaccharide-insoluble solvent prepared from one or more selected from the group consisting of insect eggs, larvae, pupae, and adults.
  • insect eggs, larvae, pupae, or adults are mixed with a polysaccharide-insoluble solvent, and the polysaccharide is collected by means such as centrifugation or suction filtration.
  • An insoluble solid can be obtained by removing the insoluble solvent.
  • the polysaccharide-insoluble solvent refers to a solvent in which the polysaccharide is insoluble, and examples thereof include solvents having low polarity such as methanol, ethanol, propanol, butanol, acetone, hexane, ethyl acetate, and mixed solvents thereof.
  • the polysaccharide-insoluble solvent alcohol or an aqueous alcohol solution is preferably used.
  • the alcohol aqueous solution may be about 50% by volume or more, specifically, about 60% by volume or more, about 70% by volume or more, about 80% by volume or more, about 90% by volume or more. That is, the composition of the present invention can be an alcohol-insoluble solid prepared from one or more selected from the group consisting of insect eggs, larvae, pupae, and adults.
  • composition of the present invention can be used as an immunostimulatory composition. That is, as an immunostimulant comprising the above-mentioned polysaccharide as an active ingredient, it is provided as a pharmaceutical, health food, functional food, veterinary drug, feed, feed additive, feed raw material, not only humans, but swine, cows, sheep, It can be used for aquaculture of livestock such as goats and chickens, pets such as dogs and cats, red sea bream, yellowtail, amberjack, grouper, puffer fish, tuna, eel, shrimp and crabs.
  • livestock such as goats and chickens
  • pets such as dogs and cats
  • Identification of immunostimulatory substances derived from insects belonging to Diptera 1.1. Identification of a substance having an immunostimulatory action derived from an insect belonging to the family Tephritidae The substance having an immunostimulatory action contained in an insect belonging to the order Diptera was identified. Insects include the Bactrocera belonging to the family Tephritidae. cucurbitae / Wegodacus cucurbitae) was used. The fruit fly moth was crushed into a paste and centrifuged to obtain a supernatant fraction (A). Furthermore, it concentrated under reduced pressure using the rotary evaporator, added 4 times amount of methanol, stirred, and centrifuged, and the methanol extraction fraction (B) was obtained. Moreover, water extraction was performed with respect to the alcohol (methanol) insoluble solid substance obtained as a precipitate, and the water extraction fraction (C) was obtained.
  • Insects include the Bactrocera belonging to the family Tephritidae. cucurbit
  • Fractions (A), (B) and (C) were added to the culture solution of a mouse macrophage cell line (RAW264 cell), and the amount of nitric oxide produced was measured. Activated macrophages are known to produce nitric oxide, which was used as an index of immunostimulation. As a positive control, lipopolysaccharide (LPS), which is known to have an immunostimulatory effect, was used. As shown in FIG. 1, since the production of nitric oxide was confirmed in the supernatant fraction (A) diluted with 10 4 , 10 3 , and 10 2 , respectively, and the water extraction fraction (C), It has been found that these substances contain an immunostimulatory action.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the water extraction fraction (C) was eluted with 0 M, 0.2 M, 0.5 M, and 1 M sodium chloride aqueous solutions in order using a DE52 weak anion exchange column (manufactured by Whatman). The total amount of sugar contained in each eluted fraction was measured by the phenol sulfate method.
  • the elution fraction was diluted, and the immunostimulatory action of each elution fraction was examined using the production of nitric oxide by the mouse macrophage cell line as an index. As shown in FIG. 3, a strong immunostimulatory action was shown in the fraction eluted with 0.2 ⁇ M sodium chloride aqueous solution. Since it was adsorbed on an anion exchange column and eluted with 0.2 M aqueous sodium chloride solution, it was found that the substance having an immunostimulatory action was acidic.
  • the 0.2 M sodium chloride aqueous solution elution fraction was purified using gel filtration chromatography.
  • Superose 6 10/300 GL fractionation range 5 ⁇ 10 3 -5 ⁇ 10 6
  • the total amount of sugar contained in each eluted fraction was measured by the phenol sulfate method.
  • the elution fraction was diluted, and the immunostimulatory action of each elution fraction was examined using the production of nitric oxide by the mouse macrophage cell line as an index. As shown in FIG. 4, the fraction having a large molecular weight showed a strong immunostimulatory action.
  • the elution fraction in which an immunostimulatory effect was observed by gel filtration chromatography was subjected to high performance liquid chromatography, and the molecular weight was measured.
  • Showdex (registered trademark) SB-807 HQ (manufactured by Showa Denko KK) having a fractionation range of 500 to 10,000 was used for the column.
  • the substance having an immunostimulatory action is a polysaccharide having a molecular weight of about 1 million (about 1.0 ⁇ 10 6 ). 21.0 mg of the polysaccharide with immunostimulatory ability was purified from 1.0 kg of the fruit fly cocoon.
  • the purified polysaccharide is hydrolyzed under conditions of 2 M trifluoroacetic acid (TFA) at 100 ° C for 16 hours. Nitrogen was blown to dryness, dissolved in water, and extracted with hexane.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • GC / MS gas chromatography mass spectrometer
  • HP-5 column manufactured by Agilent Technologies, Inc.
  • the area ratio of the monosaccharide and its derivative corresponding to the peak of the total ion chromatogram was calculated, and the weight ratio and the composition ratio (mol%) of the monosaccharide and its derivative were calculated using the standard product.
  • Standard products include D-arabinose (D-Ara), D-xylose (D-Xyl), L-rhamnose (L-Rha), L-fucose (L-Fuc), D-ribose (D-Rib), D-glucose (D-Glu), D-galactose (D-Gal), D-mannose (D-Man), D-fructose (D-Fru), D-glucuronic acid (D-GlcA), D-galacturonic acid (D-GalUA), N-acetyl-D-glucosamine (D-GlcNAc), N-acetyl-D-galactosamine (D-GalNAc), and N-acetylneuraminic acid (NANA) were used.
  • unknown (1) to unknown (3) in Table 1 are different from any of the standard products described above.
  • the weight ratio and the constituent ratio of the constituent sugars of the polysaccharide are represented by the ratio to the monosaccharide and its derivatives that are consistent with the standard product.
  • the polysaccharides derived from the fruit fly are soluble in water, insoluble in about 80% by volume methanol aqueous solution, are acidic polysaccharides, and have an average molecular weight of about 1 million (about 1.0 ⁇ 10 3 N-acetyl-D-glucosamine (D-GlcNAc), N-acetyl-D-galactosamine (D-GalNAc), D-glucuronic acid (D-GlcA), L-rhamnose (L-Rha), L-fucose (L-Fuc), D-glucose (D-Glc), D-galactose (D-Gal), D-mannose (D-Man) and D-ribose (D-Rib) It was revealed that one or more included from the group consisting of: In addition, L-rhamnose was found to be contained at about 22.8% in the peak area ratio of the total ion chromatogram.
  • the water extraction fraction was purified using gel filtration chromatography.
  • Hiprep 26/60 Sephacryl S500 fractionation range 4 ⁇ 10 4 ⁇ 2 ⁇ 10 7 ) (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used.
  • the total amount of sugar contained in each eluted fraction was measured by the phenol sulfate method.
  • the elution fraction was diluted, and the immunostimulatory action of each elution fraction was examined using the production of nitric oxide by the mouse macrophage cell line as an index. As shown in FIG. 7, a fraction showing an immunostimulatory effect was obtained.
  • the house fly was found to contain a plurality of polysaccharides exhibiting immunostimulatory action.
  • the molecular weight of the polysaccharide contained in the housefly is about 1.8 million (1.8 ⁇ 10 6 ) (elution fraction 13 to elution fraction 17) and about 300,000 (3.0 ⁇ 10 5 ). (Elution fraction 23 to elution fraction 27) was predicted.
  • insects belonging to the order Diptera contain a polysaccharide having an immunostimulatory action.
  • the water extraction fraction was applied to a DEAE anion exchange column (Hiprep-DEAE-FF-16 / 10, manufactured by GE Healthcare Bioscience), and eluted with a sodium chloride concentration gradient of 0 to 0.6 M.
  • the total amount of sugar contained in each eluted fraction was measured by the phenol-sulfuric acid method.
  • the elution fraction was diluted, and the immunostimulatory action of each elution fraction was examined using the production of nitric oxide by the mouse macrophage cell line as an index.
  • a graph showing the total sugar amount and the sodium chloride concentration is shown in FIG. 8, and a graph showing the total sugar amount and the immunostimulatory action is shown in FIG.
  • An elution fraction having a strong immunostimulatory effect was confirmed. It was found that the substance having an immunostimulatory action was acidic because it was adsorbed on an anion exchange column and eluted with 0 to 0.6 M aqueous sodium chloride solution.
  • the elution fraction having an immunostimulatory effect was purified using gel filtration chromatography.
  • Hiprep 26/60 Sephacryl S500 fractionation range 4 ⁇ 10 4 ⁇ 2 ⁇ 10 7
  • the total amount of sugar contained in each eluted fraction was measured by the phenol sulfate method.
  • the elution fraction was diluted, and the immunostimulatory action of each elution fraction was examined using the production of nitric oxide by the mouse macrophage cell line as an index. As shown in FIG. 10, a fraction having a large molecular weight showed an immunostimulatory action.
  • the fraction in which the immunostimulatory effect was recognized by the gel filtration chromatography was applied to the high performance liquid chromatography, and the molecular weight was measured.
  • Showdex (registered trademark) SB-807 HQ (manufactured by Showa Denko KK) having a fractionation range of 500 to 10,000 was used for the column.
  • the substance having an immunostimulatory action was found to be a polysaccharide having an average molecular weight of about 310,000 (about 3.1 ⁇ 10 5 ).
  • Standard products include D-arabinose (D-Ara), D-xylose (D-Xyl), L-rhamnose (L-Rha), L-fucose (L-Fuc), D-ribose (D-Rib), D-glucose (D-Glu), D-galactose (D-Gal), D-mannose (D-Man), D-fructose (D-Fru), D-glucuronic acid (D-GlcA), D-galacturonic acid (D-GalUA), N-acetyl-D-glucosamine (D-GlcNAc), N-acetyl-D-galactosamine (D-GalNAc), and N-acetylneuraminic acid (NANA) were used. Therefore, unknown (1) to unknown (6) in Table 2 are different from any of the standard products described above.
  • Yamamayu-derived polysaccharide is soluble in water, insoluble in about 80% by volume methanol aqueous solution, is an acidic polysaccharide, and has an average molecular weight of about 310,000 (about 3.10 ⁇ 10 5 ).
  • D-mannuronic acid D-ManA
  • L-glucuronic acid L-GulA
  • L-rhamnose L-Rha
  • L-fucose L-Fuc
  • D-galactose D-galactose It has been clarified that it contains one or more members selected from the group consisting of (D-Gal), D-glucose (D-Glu), and D-mannose.
  • L-rhamnose was found to be contained at about 12.9% in terms of the peak area ratio of the total ion chromatogram.
  • the water extraction fraction was applied to a DEAE anion exchange column (Hiprep-DEAE-FF-16 / 10, manufactured by GE Healthcare Bioscience) and eluted with a sodium chloride concentration gradient of 0 to 1.0 M.
  • the total amount of sugar contained in each eluted fraction was measured by the phenol-sulfuric acid method.
  • the elution fraction was diluted, and the immunostimulatory action of each elution fraction was examined using the production of nitric oxide by the mouse macrophage cell line as an index.
  • a graph showing the total sugar amount and the sodium chloride concentration is shown in FIG. 13, and a graph showing the total sugar amount and the immunostimulatory action is shown in FIG.
  • An elution fraction having a strong immunostimulatory effect was confirmed.
  • the substance having an immunostimulatory effect was found to be acidic because it was adsorbed on an anion exchange column and eluted with 0 to 1.0 M aqueous sodium chloride solution.
  • the elution fraction having an immunostimulatory effect was purified using gel filtration chromatography. Purified using gel filtration chromatography. As the column, Hiprep 26/60 Sephacryl S500 (fractionation range 4 ⁇ 10 4 ⁇ 2 ⁇ 10 7 ) (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used. The total amount of sugar contained in each eluted fraction was measured by the phenol sulfate method. In addition, the elution fraction was diluted, and the immunostimulatory action of each elution fraction was examined using the production of nitric oxide by the mouse macrophage cell line as an index. As shown in FIG. 15, the fraction having a large molecular weight showed an immunostimulatory action.
  • the fraction which had an immunostimulatory effect by this gel filtration chromatography is 2.1. It is expected to be the same as the fraction that had an immunostimulatory effect by gel filtration chromatography. Therefore, it was revealed that silkworm moth also contains a polysaccharide having an immunostimulatory action, and the molecular weight of the polysaccharide is about 310,000 (about 3.10 ⁇ 10 5 ).
  • insects belonging to Lepidoptera also contain polysaccharides having an immunostimulatory action.
  • insects belonging to Coleoptera are selected. The immunostimulatory effect was examined using this. Coleoptera (Coleoptera) Polyphaga (Scarabaeoidea) Scarabaeidae (Trypoxylus dichotomus) moths were used. 1. The supernatant fraction was prepared by the same method as above, and the immunostimulatory action in the diluted supernatant fraction was examined using the production of nitric oxide by the mouse macrophage cell line as an index. As shown in FIG. Was confirmed. Therefore, it was considered that the insects belonging to the order Coleoptera also contain polysaccharides having an immunostimulatory action, like the insects belonging to the order Diptera and the insects belonging to the order Lepidoptera.
  • the immunostimulatory action of the polysaccharide of the present invention was compared with lipopolysaccharide known to have an immunostimulatory action.
  • the polysaccharide of the present invention was purified from the fruit fly by the method described above, and the amount of nitric oxide produced by the mouse macrophage cell line was compared with that of lipopolysaccharide. The results are shown in FIG. The 100 pg / mL lipopolysaccharide produced almost no nitric oxide in macrophages, whereas the polysaccharide purified from the fruit fly induced nitric oxide production even at 100 pg / mL. Therefore, a very strong immunostimulatory action was observed in the polysaccharide of the present invention.
  • Red sea bream breeding test using feed containing the polysaccharide of the present invention It was examined whether the feed containing the polysaccharide of the present invention improves the disease resistance of red sea bream.
  • red sea bream individuals with a fork length of about 10 cm and fish weight of about 25 g were housed in a water tank of 12 fish each. Feeds were prepared and provided to red sea bream so that the concentration of the polysaccharide from the fruit fly was 0.001 ⁇ g / g, 0.01 ⁇ g / g, 0.1 ⁇ g / g, and 1 ⁇ g / g, respectively.
  • Edwardiella a Gram-negative bacterium that causes Edwardsiellae in the abdominal cavity of red sea bream after 4 weeks of rearing tarda 5.0 ⁇ 10 5 Cells were inoculated to force infection and the number of survivors was counted. The results are shown in FIG. All the feeds containing cucurbitae-derived polysaccharides had higher survival rates than the control group. Therefore, it was considered that red sea bream acquired disease resistance against Edwardsiella tarda due to the immunostimulatory action of the polysaccharides derived from the fruit fly.

Abstract

これまでの免疫賦活能を有する多糖は、医薬品や健康食品、畜産用や水産用の飼料添加物として応用されているが、十分な免疫賦活効果を示すものは少なかった。そこで、低コストで高い免疫賦活効果を示す組成物の開発が求められていた。本発明は、昆虫由来で免疫賦活作用を有する多糖類、及び、該多糖類を含有する組成物、さらに該多糖類を有効成分とする免疫賦活剤を提供する。本発明の多糖類は、構成糖として、少なくとも、ラムノースを有することが好ましい。

Description

多糖類、多糖類を含む組成物、及び免疫賦活剤
本発明は、昆虫由来で免疫賦活作用を有する多糖、該多糖類を含む組成物、及び該多糖類を有効成分とする免疫賦活剤に関する。
これまで、免疫賦活作用を有する多糖類が多数見出されている。免疫賦活作用を有する多糖に関する技術としては、例えば、酸性ムコ多糖（特許文献１参照）、リポ多糖及びβグルカン（特許文献２参照）、ガゴメ由来の粘性多糖類（特許文献３参照）、Ｌ－フコースおよびＤ－キシロースの他にＤ－グルクロン酸を主な構成成分とする硫酸化多糖であるアスコフィラン（特許文献４参照）、β－１，３－結合を有するマンナン（特許文献５参照）等が存在する。しかし、免疫賦活作用を有する多糖の多くは、菌類由来又は植物由来であり、動物由来のものは見出されていなかった。
一方、昆虫は人工的な生産が容易な動物性タンパク質として重要視されており、昆虫の幼虫や蛹を畜産用や水産用の飼料原料として用いる試みがなされている（特許文献６及び特許文献７参照）
特開２０１２－０３１０８９号公報 特開２０１２－０８２１５６号公報 特開２００９－２２７６１８号公報 特開２００８－１２０７０７号公報 特開２００６－０６０２８８号公報 国際公開第２０１１／００７８６７号パンフレット 特開２００３－２１００７１号公報
これまでの免疫賦活作用を有する多糖類は、医薬品や健康食品、畜産用や水産用の飼料添加物として応用されているが、十分な免疫賦活効果を示すものは少なかった。そこで、低コストで高い免疫賦活効果を示す組成物の開発が求められていた。
すなわち、本発明は、昆虫由来で免疫賦活作用を有する多糖類、及び該多糖類を含む組成物である。また、別の本発明では、免疫賦活作用を有する多糖類は、構成糖として少なくともラムノースを含有する。
別の本発明では、双翅目、鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、直翅目、及び蜻蛉目からなる群から選択される１又は複数に属する昆虫由来の多糖類である。また、別の本発明では、双翅目、鱗翅目、及び鞘翅目からなる群から選択される１又は複数に属する昆虫由来の多糖類である。さらに、別の本発明の多糖類は、少なくとも植物に食性を示す昆虫由来である。
さらに、別の本発明における免疫賦活作用を有する多糖類は、耐熱性や、高温高圧耐性を有する。かかる場合には、製造や加工の段階で本発明の多糖類に熱処理や高温高圧処理が施された場合でも免疫賦活作用が失われないため、好ましい。
　さらに、別の本発明における免疫賦活作用を有する多糖類は、平均分子量が約１．０×１０５～約１．０×１０７である。また、多糖類の免疫賦活作用は、少なくともToll-like Receptor 4を介したものであり得る。
また、別の本発明は、昆虫由来で免疫賦活作用を有する多糖類を含む組成物である。さらに、本発明の組成物は、昆虫の卵、幼虫、蛹、及び、成虫からなる群から選択される１若しくは複数の粉末、昆虫の卵、幼虫、蛹、及び、成虫からなる群から選択される１若しくは複数からの抽出物、又は、昆虫の卵、幼虫、蛹、及び、成虫からなる群から選択される１若しくは複数から得られたアルコール不溶性固形分であり得る。
さらに、本発明は、昆虫由来で免疫賦活作用を有する多糖類を有効成分とする免疫賦活剤を提供する。
本発明は、昆虫に由来する免疫賦活作用を有する多糖類、該多糖類を含む組成物、及び該多糖類を有効成分とする免疫賦活剤である。本発明を、ヒトや畜産動物、水産動物、愛玩動物等に投与することにより、高い免疫賦活作用が得られる。また、昆虫は、食用や飼料用の動物性資源として価値が高まっていることから、免疫賦活作用を有する健康食品や、免疫賦活作用を有する畜産用又は水産用の飼料原料として利用することができる。
昆虫から得られた上清画分（A）、メタノール抽出画分（B）、及び水抽出画分（C）の免疫賦活作用を示す図である。 昆虫から得られた上清画分（C）の免疫賦活作用がプロテイナーゼＫ処理で変化しないことを示す図である。 双翅目に属する昆虫から得られた水抽出画分の陰イオン交換クロマトグラフィの結果を示す図である。 双翅目に属する昆虫由来の多糖類を、ゲル濾過クロマトグラフィを用いて精製したことを示す図である。 双翅目に属する昆虫由来の多糖類の分子量を、高速液体クロマトグラフィを用いて測定したことを示す図である。 双翅目に属する昆虫由来多糖の構成糖分析におけるトータルイオンクロマトグラムを示す図である。 双翅目に属する昆虫由来の多糖類を、ゲル濾過クロマトグラフィを用いて精製したことを示す図である。 鱗翅目に属する昆虫から得られた水抽出画分の陰イオン交換クロマトグラフィの結果（全糖量、及び塩化ナトリウム溶出濃度）を示す図である。 鱗翅目に属する昆虫から得られた水抽出画分の陰イオン交換クロマトグラフィの結果（全糖量、及び免疫賦活作用）を示す図である。 鱗翅目に属する昆虫由来の多糖類を、ゲル濾過クロマトグラフィを用いて精製したことを示す図である。 鱗翅目に属する昆虫由来の多糖類の分子量を、高速液体クロマトグラフィを用いて測定したことを示す図である。 鱗翅目に属する昆虫由来多糖の構成糖分析におけるトータルイオンクロマトグラムを示す図である。 鱗翅目に属する昆虫から得られた水抽出画分の陰イオン交換クロマトグラフィの結果（全糖量、及び塩化ナトリウム溶出濃度）を示す図である。 鱗翅目に属する昆虫から得られた水抽出画分の陰イオン交換クロマトグラフィの結果（全糖量、及び免疫賦活作用）を示す図である。 鱗翅目に属する昆虫由来の多糖類を、ゲル濾過クロマトグラフィを用いて精製したことを示す図である。 鞘翅目に属する昆虫から得られた上清画分の免疫賦活作用を示した図である。 双翅目に属する昆虫由来多糖の免疫賦活作用をリポ多糖と比較した図である。 本発明の多糖類の耐熱性を示す図である。 本発明の多糖類の有する免疫賦活作用の昆虫の変態段階における変化を示す図である。 抗TLR2抗体、又は抗TLR4抗体存在下における本発明の多糖類の免疫賦活作用を示す図である。 本発明の多糖類による免疫賦活作用によりマダイの耐病性が向上したことを示す図である。
本発明は、昆虫由来で且つ免疫賦活作用を有する多糖類と、多糖類を含む組成物、及び多糖類を有効成分とする免疫賦活剤を提供する。
本発明の多糖類は昆虫由来である。発明者らは、複数の種に属する昆虫が免疫賦活作用を有する多糖類を含有していることを見出し、本発明に到達した。さらに、非常に広い範囲の種に属する昆虫が免疫賦活作用を有する多糖を含有していることを明らかにした。免疫賦活作用を有する多糖類を含有する昆虫であれば、本発明に利用することができる。
昆虫は、動物界の中で節足動物門（Arthropoda）に属し、昆虫綱（Insecta）に分類される生物の総称である。昆虫綱（Insecta）は、無翅亜綱（Apterygota）と、有翅亜綱（Pterygota）とに分類される。無翅亜綱（Apterygota）は、粘管目（Collembola）、原尾目（Protura）、総尾目（Thysanura）等に分類される。また、有翅亜綱（Pterygota）は、蜉蝣目（Ephemeroptera）、せき翅目（Plecoptera）、蜻蛉目（Odonata）、粘脚目（Embioptera）、直翅目（Orthoptera）、革翅目（Dermaptera）、等翅目（シロアリ目）（Isoptera）、紡脚目（シロアリモドキ目）（Empioptera）、噛虫目（Psocoptera）、食毛目（Mallophaga）、蝨目（Anoplura）、総翅目（Thysanoptera）、半翅目（Hemiptera）、膜翅目（Hymenoptera）、撚翅目（Strepsiptera）、鞘翅目（Coleoptera）、脈翅目（Neuroptera）、長翅目（Mecoptera）、毛翅目（Trichoptera）、鱗翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）、隠翅目（Aphaniptera）等に分類される。
上記の分類のなかで、蜻蛉目、網翅目、直翅目、半翅目、脈翅目、膜翅目、鞘翅目、双翅目、及び鱗翅目についてさらに詳細に説明する。
蜻蛉目に属する昆虫としては、トンボ等が挙げられる。蜻蛉目は、さらに、カワトンボ科（Calopterygidae）、ミナミカワトンボ科（Euphaeidae）、イトトンボ科（Coenagrionidae）、ヤマイトトンボ科（Megapodagrionidae）、アオイトトンボ科（Lestidae）、モノサシトンボ科（Platycnemididae）、サナエトンボ科（Gomphidae）、ムカシトンボ科（Epiophlebiidae）、ムカシヤンマ科（Petaluridae）、オニヤンマ科（Cordulegasteridae）、ヤンマ科（Aeschnidae）、エゾトンボ科（Corduliidae）、ヤマトンボ科（Macromiidae）、トンボ科（Libellulidae）等に分類される。
網翅目に属する昆虫としては、カマキリやゴキブリ等が挙げられる。網翅目カマキリ亜目（Mantodea）は、さらにカマキリ科（Mantidae）、ヒメカマキリ科（Acromantidae）等に分類され、網翅目ゴキブリ亜目（Blattodea）は、さらにゴキブリ科（Blattidae）、マダラゴキブリ科（Epilampridae）、オガサワラゴキブリ科（Pycnoscelidae）、チャバネゴキブリ科（Blattellidae）、オオゴキブリ科（Panesthiidae）等に分類される。
直翅目に属する昆虫としては、バッタ、キリギリス、コオロギ、ケラ、カマドウマ等が挙げられる。直翅目は、さらにカマドウマ科（Rhaphidophoridae）、コロギス科（Gryllacridae）、キリギリス科）（Tettigoniidae）、コオロギ科（Gryllidae）、アリツカコオロギ科（Myrmechophilidae）、ノミバッタ科（Tridactylidae）、ケラ科（Gryllotalpidae）、ヒシバッタ科（Tetrigidae）、バッタ科（Locustidae）等に分類される。
半翅目に属する昆虫としては、カメムシ、タガメ、アメンボ、セミ、ウンカ、アブラムシ等が挙げられる。半翅目カメムシ亜目（Heteroptera）は、さらにツチカメムシ科（Cydnidae）、マルカメムシ科（Plataspidae）、カメムシ科（Pentatomidae）、ツノカメムシ科（Acanthosomidae）、クヌギカメムシ科（Urostylidae）、ヘリカメムシ科（Coreidae）、ナガカメムシ科（Lygaeidae）、オオホシカメムシ科（Largidae）、ホシカメムシ科（Pyrrhocoridae）、イトカメムシ科（Berytidae）、ヒラタカメムシ科（Aradidae）、マキバサシガメ科（Nabidae）、サシガメ科（Reduviidae）、コバンムシ科（Naucoridae）、タガメ科（Belostomatidae）、タイコウチ科（Nepidae）、クビナガカメムシ科（Enicocephalidae）、グンバイムシ科（Tingidae）、ハナカメムシ科（Anthocoridae）、トコジラミ科（Cimicidae）、メクラカメムシ科（Miridae）、アメンボ科（Gerridae）、イトアメンボ科（Hydrometridae）、カタビロアメンボ科（Veliidae）、ケシミズカメムシ科（Hebridae）、ミズカメムシ科（Mesoveliidae）、ムクゲカメムシ科（Dipsocoridae）、ミズギワカメムシ科（Saldidae）、メミズムシ科（Octheridae）、ナベブタムシ科（Aphelocheiridae）、マツモムシ科（Notonectidae）、マルミズムシ科（Pleidae）、タマミズムシ科（Helotrephidae）、ミズムシ科（Corixidae）等に分類される。
半翅目同翅亜目（Homoptera）は、セミ科（Cicadidae）、ツノゼミ科（Membracidae）、アワフキムシ科（Cercopidae）、コガシラアワフキ科（Tomaspididae）、トゲアワフキ科（Machaerotidae）、ミミズク科（Ledridae）、オオヨコバイ科（Tettigellidae）、カンムリヨコバイ科（Evacanthidae）、ホソサジヨコバイ科（Nirvanidae /
Paraboloponidae）、クロヒラタヨコバイ科（Penthimiidae）、アオズキンヨコバイ科（Jassidae）、ヒロズヨコバイ科（Macropsidae）、シダヨコバイ科（Agalliidae）、ブチミャクヨコバイ科（Drabescidae）、ズキンヨコバイ科（Idioceridae）、ホシヨコバイ科（Xestocephalidae）、ヒメヨコバイ科（Cicadellidae）、ヒラタヨコバイ科（Aphrodidae）、フクロクヨコバイ科（Hecalidae）、フトヨコバイ科（Errhomenellidae）、ヨコバイ科（Deltocephalidae）、アリヅカウンカ科（Tettigometridae）、シマウンカ科（Meenoplidae）、ビワハゴロモ科（Fulgolidae）、ハネナガウンカ科（Derbidae）、コガシラウンカ科（Achilidae）、ウンカ科（Delphacidae）、テングスケバ科（Dictyopharidae）、ヒシウンカ科（Cisiidae）、グンバイウンカ科（Tropiduchidae）、アオバハゴロモ科（Flatidae）、マルウンカ科（Issidae）、ハゴロモ科（Ricaniidae）、キジラミ科（Psyllidae）、コナジラミ科（Aleyrodidae）、アブラムシ科（Aphididae）、ワタフキカイガラムシ科（Margarodidae）、フクロカイガラムシ科（Eriococcidae）、カタカイガラムシ科（Coccidae）、カブラカイガラムシ科（Beesoniidae）、マルカイガラムシ科（Diaspididae）等に分類される。
脈翅目は、さらに、ラクダムシ科（Inocellidae）、センブリ科（Sialidae）、ヘビトンボ科（Corydalidae）、カマキリモドキ科（Mantispidae）、ツノトンボ科（Ascalaphidae）、ヒロバカゲロウ科（Osmylidae）、クサカゲロウ科（Chrysopidae）、アミメカゲロウ科（Hemerobiidae）、ウスバカゲロウ科（Myrmeleontidae）等に分類される。
膜翅目に属する昆虫としては、ハチやアリ等が挙げられる。膜翅目は、さらに、ナギナタハバチ科（Xyelidae）、ヤドリキバチ科（Orussidae）、ヨフシハバチ科（Blasticotomidae）、キバチ科（Siricidae）、クビナガキバチ科（Cephidae）、ヒラタハバチ科（Pamphiliidae）、ハバチ科（Tenthredinidae）、マツハバチ科（Diprionidae）、ミフシハバチ科（Argidae）、コンボウハバチ科（Cimbicidae）、コマユバチ科（Blaconidae）、アブラバチ科（Aphidiidae）、ヒメバチ科（Ichneumonidae）、イチジクコバチ科（Agaonidae）、アシブトコバチ科（Chalcididae）、シリアゲコバチ科（Leucospidae）、アリヤドリコバチ科（Eucharitidae）、オナガコバチ科（Torymidae）、カタビロコバチ科（Eurytomidae）、コガネコバチ科（Pteromalidae）、トビコバチ科（Encyrtidae）、ホソナガコバチ科（Elasmidae）、ヒメコバチ科（Eulophidae）、タマゴヤドリコバチ科（Trichogrammatidae）、ホソバネヤドリコバチ科（Mymaridae）、シリボソクロバチ科（Proctotrupidae）、ヒゲナガクロバチ科（Ceraphronidae）、ハラビロヤドリバチ科（Platygasteridae）、クロタマゴバチ科（Scelionidae）、アリ科（Formicidae）、タマバチ科（Cynipidae）、カギバラバチ科（Trigonalidae）、カマバチ科（Dryinidae）、コツチバチ科（Tiphiidae）、コンボウヤセイバチ科（Gasteruptionidae）、アリバチ科（Mutillidae）、アリガタバチ科（Bethylidae）、セイボウ科（Chrycididae）、セイボウモドキ科（Cleptidae）、ベッコウバチ科（Pompilidae）、ツチバチ科（Scolidae）、スズメバチ科（Vespidae）、ジガバチ科（Sphecidae）、ヒメハナバチ科（Andrenidae）、ミツバチモドキ科（Colletidae）、ケアシハナバチ科（Melittidae）、ハキリバチ科（Megachilidae）、コハナバチ科（Halictidae）、コシブトハナバチ科（Anthophoridae）、ミツバチ科（Apidae）等に分類される。
鞘翅目は、甲虫類とも称される。鞘翅目に属する昆虫としては、カブトムシ、クワガタムシ、カミキリムシ、ゲンゴロウ、コガネムシ、ハナムグリ、カナブン、オサムシ、ホタル、テントウムシ、ゾウムシ、ゴミムシ、ゴミムシダマシ等が挙げられる。
鞘翅目は、さらに、ナガヒラタムシ科（Cupedidae）、セスジムシ科（Rhysodidae）、ヒゲブトオサムシ科（Paussidae）、ハンミョウ科（Cicindelidae）、オサムシ科（Carabidae）、ヒョウタンゴミムシ科（Scaritidae）、ゴミムシ科（Harpalidae）、ホソクビボミムシ科（Brachinidae）、コガシラミズムシ科（Haliplidae）、コツブゲンゴロウ科（Noteridae）、ゲンゴロウ科（Dytiscidae）、ミズスマシ科（Cyrinidae）、ガムシ科（Hydrophilidae）、エンマムシモドキ科（Synteliidae）、エンマムシ科（Histeridae）、チビシデムシ科（Catopidae）、シデムシ科（Silphidae）、デオキノコムシ科（Scaphidiidae）、ハネカクシ科（Staphylinidae）、クワガタムシ科（Lucanidae）、クロツヤムシ科（Passalidae）、コブスジコガネ科（Trogidae）、センチコガネ科（Geotrupidae）、コガネムシ科（Scarabaeidae）、マルハナノミ科（Helodidae）、マルトゲムシ科（Byrrhidae）、ヒラタドロムシ科（Psephenidae）、ナガハナノミ科（Ptilodactylidae）、ドロムシ科（Dryopidae）、ヒメドロムシ科（Elmidae）、クシヒゲムシ科（Rhipiceridae）、タマムシ科（Buprestidae）、コメツキムシ科（Elateridae）、コメツキダマシ科（Eucnemidae）、ホタルモドキ科（Drilidae）、ホタル科（Lapyridae）、ジョウカイボン科（Cantharidae）、ベニボタル科（Lycidae）、ヒメトゲムシ科（Nosodendridae）、カツオブシムシ科（Dermestidae）、シバンムシ科（Anobiidae）、ヒョウホンムシ科（Ptinidae）、ナガシンクイムシ科（Bostrychidae）、ヒラタキクイムシ科（Lyctidae）、コクヌスト科（Trogositidae）、カッコウムシ科（Cleridae）、ジョウカイモドキ科（Melyridae）、ツツシンクイムシ科（Lymexylidae）、ケシキスイ科（Nitidulidae）、ネスイムシ科（Rhizophagidae）、ヒラタムシ科（Cucujidae）、ホソヒラタムシ科（Silvanidae）、オオキスイ科（Helotidae）、キスイムシ科（Cryptophagidae）、キスイモドキ科（Byturidae）、コメツキモドキ科（Languriidae）、オオキノコムシ科（Erotylidae）、テントウムシ科（Coccinellidae）、テントウダマシ科（Endomychidae）、コキノコムシ科（Mycetophagidae）、ホソカタムシ科（Colydiidae）、ゴミムシダマシ科（Tenebrionidae）、ハムシダマシ科（Lagriidae）、クチキムシ科（Alleculidae）、コフゴミムシダマシ科（Zopheridae）、ツヤキカワムシ科（Boridae）、クチキムシダマシ科（Elacatidae）、キカワムシ科（Pythidae）、アカハネムシ科（Pyrochroidae）、キノコムシダマシ科（Tetratomidae）、ナガクチキムシ科（Melandryidae）、ハナノミ科（Mordellidae）、オオハナノミ科（Rhipiphoridae）、クビナガムシ科（Cephaloidae）、ツチハンミョウ科（Cephaloidae）、カミキリモドキ科（Oedemeridae）、イッカクチュウ科（Anthicidae）、カミキリムシ科（Cerambycidae）、マメゾウムシ科（Bruchidae）、ハムシ科（Chrysomelidae）、ヒゲナガゾウムシ科（Anthribidae）、オトシブミ科（Attelabidae）、ミツギリゾウムシ科（Brenthidae）、ホソクチゾウムシ科（Curculionidae）、キクイムシ科（Scolytidae）、ナガキクイムシ科（Platypodidae）等に分類される。
双翅目に属する昆虫としては、カ、ガガンボ、ハエ、アブ、ブユ、さらにはイエバエ、ショウジョウバエ、ミバエ、ミズアブ等が挙げられる。
双翅目は、さらに、ハエカ科（Anisopodidae）、ハルカ科（Cramptonomyiidae）、エゾカ科（Pachyneuridae）、クチキカ科（Axymyiidae）、モリカ科（Hyperoscelidae）、タケカ科（Mycetophilidae）、ホソタケカ科（Bolitophilidae）、ヒゲブトタケカ科（Ceroplatidae）、オオタケカ科（Sciophilidae）、ヒゲナガタケカ科（Macroceridae）、タマカ科（Cecidomyiidae）、クロカ科（Sciaridae）、フルカ科（Bibionidae）、ヒゲナガフルカ科（Hesperinidae）、ゴミカ科（Scatopsidae）、チョウカ科（Psycodidae）、ニセヒメカガンボ科（Tanyderidae）、コシボソカガンボ科（Ptychopteridae）、カガンボダマシ科（Tricocheridae）、シリブトカガンボ科（Cylindrotomatidae）、カガンボ科（Tipulidae）、ヒメカガンボ科（Limnobiidae）、カ科（Culicidae）、ホソカ科（Dixidae）、ケヨソイカ科（Chaoboridae）、ユスリカ科（Chironomidae）、ユスリハエカ科（Thaumaleidae）、ヌカカ科（Ceratopogonidae）、ブユ科（Simuliidae）、アミカ科（Blepharoceridae）、ミズアブ科（Stratiomyiidae）、クサアブ科（Coenomyiidae）、ナガレシギアブ科（Athericidae）、シギアブ科（Rhagionidae）、ツルギアブ科（Therevidae）、マドアブ科（Scenopinidae）、ムシヒキアブ科（Asilidae）、キアブ科（Xylophagidae）、キアブモドキ科（Solvidae）、アブ科（Tabanidae）、ツリアブ科（Bombyliidae）、コガシラアブ科（Acroceridae）、ツリアブモドキ科（Nemestrinidae）、オドリバエ科（Empididae）、アシナガバエ科（Dolichopodidae）、ヤリバエ科（Lonchopteridae）、ヒラタアシバエ科（Platypezidae）、ノミバエ科（Phoridae）、アタマバエ科（Pipunculidae）、アブバエ科（Syrphidae）、ナガズヤセバエ科（Neriidae）、マルズヤセバエ科（Micropezidae）、フトモモホソバエ科（Megamerinidae）、メバエ科（Conopidae）、デガシラバエ科（Pyrgotidae）、ハネオレバエ科（Psilidae）、ヤチバエ科（Sciomyzidae）、ハマベバエ科（Coelopidae）、ヒロクチバエ科（Platystomatidae）、ベッコウバエ科（Dromyzidae）、ツヤホソバエ科（Sepsidae）、ミバエ科（Tephritidae）、アブラコバエ科（Chamaemyiidae）、シマバエ科（Lauxaniidae）、クロツヤバエ科（Lonchaeidae）、チーズバエ科（Piophilidae）、ハモグリバエ科（Agromyzidae）、トゲハネバエ科（Heleomyzidae）、ヒゲブトコバエ科（Cryptochaetidae）、ショウジョウバエ科（Drosophilidae）、ミギワバエ科（Ephydridae）、ホソショウジョウバエ科（Diastatidae）、ヒメコバエ科（Opomyzidae）、キモグリバエ科（Chloropidae）、クチキバエ科（Clusiidae）、フンバエ科（Scatophagidae）、ハナバエ科（Anthomyiidae）、イエバエ科（Muscidae）、ヤドリバエ科（Tachinidae）、ヒラタヤドリバエ科（Phasiidae）、クロバエ科（Calliphoridae）、ニクバエ科（Sarcophagidae）、シラミバエ科（Hippoboscidae）、コウモリバエ科（Streblidae）、クモバエ科（Nycteribiidae）等に分類される。
ミバエ科（Tephritidae）に属する昆虫としては、具体的に、ミカンバエ（Tetradacus
tsuneonis）、ミカンコミバエ（Strumeta dorsalis）、ウリミバエ（Bactrocera cucurbitae／Zeugodacus
cucurbitae）、カボチャミバエ（Parazeugodacus depressus）、アザミオナガミバエ（Urophora sachalinensis）、ヤマトハラダラミバエ（Oedaspis
japonica）、オウトウハマダラミバエ（Rhacochlaena japonica）、チャイロワモンハマダラミバエ（Anomoia vulgaris）、タテキハマダラミバエ（Acrotaeniostola
scutellaris）、ミツマタハマダラミバエ（Paragastrozona japonica）、セアカハマダラミバエ（Hemilea infuscata）、ヒラヤマアメミケブカミバエ（Campiglossa
hirayamae）、キイロケブカミバエ（Xyphosia punctigera）、アザミケブカミバエ（Tephritis majuscula）、ノゲシケブカミバエ（Ensina
sonchi）、ネジロクロミバエ（Sphaeniscus atilia）、ナカグロギナタミバエ（Rhabdochaeta asteria）等が挙げられる。
イエバエ科（Muscidae）に属する昆虫としては、具体的に、イエバエ（Musca
domestica）、フタスジイエバエ（Musca sorbens）、サシバエ（Stomoxys calcitrans）等が挙げられる。
鱗翅目に属する昆虫としては、チョウと呼ばれる昆虫や、ガと呼ばれる昆虫が含まれる。鱗翅目は、さらに、コバネガ科（Micropterygidae）、 スイコバネ科（Eriocraniidae）、コウモリガ科（Hepialidae）、マガリガ科（Incurvariidae）、ヒゲナガガ科（Adelidae）、ムグリチビガ科（Stigmellidae）、ツヤコガ科（Heliozelidae）、ムモンムグリガ科（Tischeriidae）、ヒロズコガ科（Tineidae）、ミノガ科（Psychidae）、ツマオレガ科（Lyonetiidae）、クチブサガ科（Plutellidae）、スガ科（Hyponomeutidae）、キヌバコガ科（Seythiridae）、ササベリガ科（Epermeniidae）、クサムグリガ科（Elachistidae）、ホソガ科（Gracilariidae）、ツツミノガ科（Coleophoridae）、ハマキモドキガ科（Glyphipterygidae）、マイコガ科（Heliodinidae）、スカシバガ科（Aegeriidae）、トガリホソガ科（Cosmopterygidae）、キバガ科（Gelechiidae）、ヒロバキバガ科（Xyloryetidae）、ネマルハガ科（Blastobasidae）、マルハキバガ科（Oecophoridae）、ボクトウガ科（Cossidae）、シンクイガ科（Carposinidae）、ノコメハマキガ科（Eucosmidae）、ハマキガ科（Tortricidae）、ホソハマキガ科（Phaloniidae）、マドガ科（Thyrididae）、メイガ科（Pyralidae）、トリバガ科（Pterophoridae）、ニジュウシトリバガ科（Alucitidae）、マダラガ科（Zygaenidae）、セミヤドリガ科（Epipyropidae）、イラガ科（Heterogeneidae）、ツバメガ科（Uraniidae）、フタオガ科（Epiplemidae）、アゲハモドキガ科（Epicopeidae）、シャクガ科（Geometridae）、カギバガ科（Drepanidae）、トガリバガ科（Thyatiridae）、イカリモンガ科（Callidulidae）、カイコガ科（Bombycidae）、オビガ科（Eupterotidae）、カレハガ科（Lasiocampidae）、ドクガ科（Lymantriidae）、シャチホコガ科（Notodontidae）、ヤガ科（Noctuidae）、トラガ科（Agaristidae）、ヒトリガ科（Arctiidae）、ヒトリモドキガ科（Aganaidae）、コブガ科（Nolidae）、カノコガ科（Amatidae）、イボタガ科（Brahmaeidae）、ヤママユガ科（Saturniidae）、スズメガ科（Sphingidae）、セセリチョウ科（Hesperiidae）、ジャノメチョウ科（Satyridae）、タテハチョウ科（Nymphalidae）、マダラチョウ科（Danaidae）、テングチョウ科（Libytheidae）、シジミチョウ科（Lycaenidae）、シロチョウ科（Pieridae）、アゲハチョウ科（Papilionidae）等に分類される。
カイコガ科（Bombycidae）に属する昆虫としては、具体的に、カイコ（Bombyx
mori）、クワゴ（Bombyx mandarina）、オオクワゴモドキ（Oberthuria falcigera）、カギバモドキ（Pseudandraca
gracilis）、スカシサン（Prismosticta hyalinata）等が挙げられる。
ヤママユガ科（Saturniidae）は、さらに、ヨナグニサン属（Attacus）、シンジュサン属（Samia）、ヤママユ属（Antheraea）、クスサン属（Saturnia）、ウスタビガ属（Rhodinia）、ミズアオガ属（Actias）、クリキュラ属（Cricula）、Gonimbrasia属等に分類される。ヤママユガ科（Saturniidae）に属する昆虫としては、具体的に、オオミズアオ（Actias artemis aliena）、ヒマサン（Samia
Cynthia ricini）、シンジュサン（Samia Cynthia pryeri）、サクサン
（Antheraea pernyi）、ヤママユ（ヤママユガ、テンサンともいう。）（Antheraea yamamai）、ウスタビガ（Rhodinia
fugax fugax）、クロウスタビガ（Rhodinia jankowskii
hattoriae）、エゾヨツメ（Aglia tau microtau）、クスサン（Dictyoploca japonica japonica）、ヒメヤママユ （Caligula boisduvalii jonasii）、ヨナグニサン（Attacus atlas ryukyuensis）、モパネワーム（Gonimbrasia belina）、Cricula
trifenestrata等が挙げられる。
本発明における昆虫の種類は限定されず、免疫賦活作用を有する多糖類を含有する昆虫であれば本発明に利用することができる。また、本発明における昆虫は、少なくとも植物に食性を示す昆虫であることが好ましい。後述するように、本発明の組成物に含まれる多糖類は、構成糖として、少なくともラムノースを含有することが好ましい。ラムノースは植物に豊富に含まれているため、植物食性の昆虫や、雑食性又は糞食性で植物にも食性を示す昆虫であれば、ラムノースを容易に取り込むことができるためである。
昆虫は成虫と幼虫とで食性が変化することがあるため、幼虫又は蛹を本発明に利用する場合には、幼虫が少なくとも植物に食性を示す昆虫が好ましい。幼虫が植物食性の昆虫として、具体的には、ミバエ科（Tephritidae）、カイコガ科（Bombycidae）、ヤママユガ科（Saturniidae）、コガネムシ科（Scarabaeidae）に属する昆虫等が挙げられる。また、幼虫が糞食性であり、植物にも食性を示す昆虫として、イエバエ科（Muscidae）に属する昆虫等が挙げられる。
本発明における昆虫は、免疫賦活作用を有する多糖類が含有されていればよく、卵、幼虫、蛹、又は成虫の各変態段階で限定されない。免疫賦活作用を有する多糖類を含有する組成物を製造するためには、昆虫の幼虫又は蛹が適しているが、特に、蛹であることが好ましい。幼虫には、消化管内に未消化物が多く含まれており、それらの分離が必要な場合があるためである。
また、本発明の多糖類の分子量は限定されないが、好ましくは、約１．０×１０４～約１．０×１０８であり、より好ましくは、約１．０×１０５～約１．０×１０７であり、さらに好ましくは、約３．０×１０5～約２．０×１０6である。
本発明の多糖類は、構成糖として、単糖及びその誘導体を含む。以下、本発明の多糖類に含まれ得る単糖及びその誘導体について詳細に説明する。
単糖は、中性糖とも呼ばれ、アルドースとケトースに分類され、含まれる炭素の数によって、三炭糖（トリオース）、四炭糖（テトロース）、五炭糖（ペントース）、六炭糖（ヘキソース）、七炭糖（ヘプトース）、八炭糖（オクツロース）等と呼ばれる。三炭糖の具体例として、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン等が挙げられる。四炭糖の具体例として、エリトロース、トレオース、エリトルロース等が挙げられる。五炭糖の具体例として、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、アビオース、リブロース、キシルロース等が挙げられる。六炭糖の具体例として、アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース等が挙げられる。七炭糖の具体例として、セドヘプツロース、コリオース等が挙げられる。
さらに、糖の誘導体としては、デオキシ糖、ウロン酸、アルドン酸、アルダル酸、アミノ糖等が挙げられる。デオキシ糖の具体例として、デオキシリボース、デオキシグルコース、キノボース、テベトース、ラムノース、ラムヌロース、フコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、シマロース、アベクオース、アスカリロース、コリトース、パラトース、チベロース等が挙げられる。また、ウロン酸の具体例として、グルクロン酸、グルロン酸、マンヌロン酸、ガラクツロン酸、イズロン酸等が挙げられる。また、アルドン酸の具体例として、グロン酸、グルコン酸等が挙げられる。また、アルダル酸の具体例として、グルカル酸、ガラクタル酸、マンナル酸等が挙げられる。また、アミノ糖の具体例として、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸、アミノウロン酸、ムラミン酸等が挙げられる。ウロン酸、アルドン酸、又はアルダル酸を多く含む多糖類は酸性を示し、酸性多糖類と呼ばれる。
また、上記の単糖及びその誘導体は光学異性体を持つ場合がある。かかる場合、単糖及びその誘導体はＤ型、Ｌ型どちらの光学異性体でも構わない。
本発明の多糖類は、構成糖として、単糖（中性糖）、アミノ糖、ウロン酸、アルドン酸、アルダル酸、デオキシ糖を含み得る。より具体的には、本発明の多糖類は、D-グルコース（D-Glc）、D-ガラクトース（D-Gal）、D-マンノース（D-Man）、D-リボース（D-Rib）N-アセチル-D-グルコサミン（D-GlcNAc）、N-アセチル-D-ガラクトサミン（D-GalNAc）、D-グルクロン酸（D-GlcA）、L-ラムノース（L-Rha）、L-フコース（L-Fuc）、D-マンヌロン酸（D-ManA）、及びL-グルロン酸（L-GulA）からなる群から含まれる１又は複数を含むことが好ましい。
さらに、本発明の多糖類は、構成糖として、少なくともラムノースを含有することが好ましい。ラムノースは、デオキシ糖の一種であり、マンノースの６位のヒドロキシ基が水素原子に置き換わった構造を有する。また、ラムノースは、天然にはＬ体であるL-ラムノース（L-Rha）が存在する。ラムノースは、植物や細菌でその合成経路が特定されているが、これまで昆虫を含めた動物ではラムノースの合成経路が発見されていなかった（非特許文献１、及び非特許文献２参照）。ラムノースは、本発明の多糖類に、構成糖として、約５モル％～約５０モル％、好ましくは約１０モル％～約２５モル％の割合で含有されることが好ましい。
非特許文献１：MF Giraud, JH Naismith. “The rhamnose
pathway” Current opinion in structural biology (2000).
非特許文献２：M Maki, R Renkonen. “Biosynthesis of
6-deoxyhexose glycans in bacteria” Soc Glycobiology
(2004).
多糖類の構成糖の分析は、ガスマスクロマトグラフィ質量分析計を用いて行われる。ガスマスクロマトグラフィ質量分析計により得られたトータルイオンクロマトグラムのピーク面積と標準品とを比較して、構成糖の含有量及び含有率を算出することができる。具体的には、トリフルオロ酢酸（TFA）等により多糖類を加水分解し、誘導体化し、乾固させ、ガスクロマトグラフィ質量分析計（GC/MS）で分析することで、トータルイオンクロマトグラムを得ることができる。ここでの誘導体化は、ジエチルジチオアセタール化及びトリメチルシリル化を施す方法が公知となっている。本発明の多糖類は、ガスマスクロマトグラフィ質量分析計を用いて得られたトータルイオンクロマトグラムにおけるL-ラムノースに対応するピーク面積が、ピーク面積全体の約５％～約５０％を占めることが好ましく、約１０％～約２５％を占めることがさらに好ましい。
また、本発明の多糖類は、耐熱性を有していることが好ましい。多糖類が耐熱性を有している場合には、多糖類が熱処理されても、その免疫賦活作用が保持される。熱処理の温度は限定されないが、例えば、８０℃～３００℃であり、好ましくは９０℃～２００℃であり、より好ましくは１００℃～１５０℃である。また、熱処理の時間は限定されないが、１分間～２時間であり、好ましくは、５分間～３０分間である。本発明の多糖類は、少なくとも、１００℃・３０分間の熱処理で免疫賦活作用が失われないことが確認された。
また、本発明の多糖類は、高温高圧耐性を有していることが好ましい。多糖類が高温高圧耐性を有している場合には、多糖類が高温高圧処理されてもその免疫賦活作用は失われない。高温高圧処理とは、高温且つ高圧の処理をいう。高温高圧処理の圧力は限定されないが、例えば、０．１ＭＰａ～１０００ＭＰａであり、好ましくは０．２Ｍｐａ～１００Ｍｐａである。高温高圧処理の温度は限定されないが、例えば、８０℃～３００℃であり、好ましくは９０℃～２００℃であり、より好ましくは１００℃～１５０℃である。
高温高圧処理はエクストルーダによる処理が含まれる。エクストルーダは混練押出機とも呼ばれ、食品や飼料の加工に用いられる。本発明の多糖類は、エクストルーダによる処理でも免疫賦活作用を失わないものであることが好ましい。エクストルーダは、１軸型又は多軸型のスクリュを備える。具体的には、本発明の多糖類を含有する組成物やその他の原料がエクストルーダ内でスクリュによって混練され、高温高圧処理を施されながら、ダイから押し出される。
また、本発明は、昆虫由来で免疫賦活作用を有する多糖類を含有する組成物を提供する。本発明の組成物は、免疫賦活作用を有する多糖を含有する昆虫の卵、幼虫、蛹、又は成虫を原料として製造される。昆虫の変態段階は、免疫賦活作用を有する多糖を含有していれば限定されないが、昆虫の幼虫又は蛹が適している。特に、蛹であることが好ましい。幼虫では、消化管内に未消化物が多く含まれており、それらが組成物に混入する可能性があるためである。本発明の組成物は、昆虫の蛹を原料とし、熱処理、高温高圧処理、乾燥処理、粉砕処理等の処理を施して製造することができる。
本発明の組成物は、好ましくは、昆虫の卵、幼虫、蛹、及び成虫からなる群から選ばれた１又は複数を粉砕処理して得られた粉末又はペーストであり、粉末であることがより好ましい。本発明の組成物を粉末又はペーストとすることで、本発明の組成物を供与したヒト又は動物における多糖類の吸収が促進される。また、本発明の組成物を粉末とすることで、その保存が容易となる。
また、別の本発明の組成物は、昆虫から免疫賦活作用を有する多糖類を抽出する処理を施して製造される。本発明の多糖類は水に可溶であるため、多糖類の抽出には水が溶媒として用いられる。抽出の温度、圧力は限定されず、加熱抽出や、減圧抽出・加圧抽出でも構わない。すなわち、本発明の組成物は、昆虫の卵、幼虫、蛹、及び成虫からなる群から選ばれた１又は複数からの抽出物、好ましくは水抽出物である。該抽出物には免疫賦活作用を有する多糖類が含有される。
また、本発明の組成物に含まれる多糖類は、水に可溶であり、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、ヘキサン等の極性の低い溶媒には不溶である。したがって、本発明の組成物は、昆虫に含まれる夾雑物を極性の低い溶媒を用いて除去して得られたものであることが好ましい。すなわち、本発明の組成物は、昆虫の卵、幼虫、蛹、及び成虫からなる群から選ばれた１又は複数から調整された多糖類不溶性溶媒に対する不溶性固形物であり得る。
具体的には、昆虫の卵、幼虫、蛹、又は成虫、好ましくは昆虫の卵、幼虫、蛹、又は成虫の粉末を多糖類不溶性溶媒と混合し、遠心分離や吸引濾過等の手段によって多糖類不溶性溶媒を取り除くことによって不溶性固形物を得ることができる。多糖類不溶性溶媒とは、多糖類が不溶である溶媒をいい、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、ヘキサン、酢酸エチル、それらの混合溶媒等、極性が低い溶媒が挙げられる。本工程は１回でも構わないが、複数回繰り返すことで、組成物中の多糖類の含有率を高めることができる。
多糖類不溶性溶媒としては、アルコール、又はアルコール水溶液が好ましく用いられる。アルコール水溶液は、約５０容量％以上、具体的には、約６０容量％以上、約７０容量％以上、約８０容量％以上、約９０容量％以上のものを用いることができる。すなわち、本発明の組成物は、昆虫の卵、幼虫、蛹、及び成虫からなる群から選ばれた１又は複数から調整されたアルコール不溶性固形物であり得る。
本発明の組成物は、免疫賦活組成物として用いることができる。すなわち、上述の多糖を有効成分とする免疫賦活剤として、医薬品や健康食品、機能食品、動物用医薬品、飼料、飼料添加剤、飼料原料として提供され、ヒトだけでなく、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等の畜産、イヌ、ネコ等の愛玩動物、マダイ、ブリ、カンパチ、ハタ、フグ、マグロ、ウナギ、エビ、カニ等の水産養殖に利用することができる。
さらに、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
１．双翅目に属する昆虫に由来する免疫賦活作用を有する物質の同定
１．１．ミバエ科（Tephritidae）に属する昆虫に由来する免疫賦活作用を有する物質の同定
双翅目に属する昆虫が含有し、免疫賦活能を有する免疫賦活作用を有する物質の同定を行った。昆虫には、ミバエ科（Tephritidae）に属するウリミバエ（Bactrocera
cucurbitae／Zeugodacus cucurbitae）の蛹を用いた。ウリミバエの蛹を粉砕してペースト状にし、遠心分離し、上清画分（Ａ）を得た。さらに、ロータリエバポレータを用いて減圧濃縮を行い、4倍量のメタノールを添加して撹拌し、遠心してメタノール抽出画分（Ｂ）を得た。また、沈殿物として得られたアルコール（メタノール）不溶性固形物に対して水抽出を行い、水抽出画分（Ｃ）を得た。
マウスマクロファージ細胞株（RAW264細胞）の培養液に画分（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ ）を添加し、産出される一酸化窒素量を測定した。活性化したマクロファージは、一酸化窒素を産出することが知られており、これを免疫賦活の指標として用いた。また、ポジティブコントロールとして、免疫賦活作用を有することが知られているリポ多糖（LPS）を用いた。図１に示すように、一酸化窒素の産出は、それぞれ１０４希釈、１０３希釈、１０２希釈した上清画分（Ａ）、及び水抽出画分（Ｃ）で確認されたことから、免疫賦活作用を有する物質がこれらに含まれていることがわかった。
上清画分（Ａ）をタンパク質分解酵素であるプロテイナーゼＫで処理しても、その免疫賦活作用が保持されるかどうかを調べた。図２に示すように、３７℃、及び５５℃の処理でタンパク質がプロテイナーゼＫ処理によりで分解されたことがSDS-PAGEで確認された。一方、マクロファージの一酸化窒素の産出量は変化しなかったため、免疫賦活作用を有する物質はタンパク質ではなく、多糖類であることがわかった。
さらに、水抽出画分（Ｃ）を、DE52弱陰イオン交換カラム（ワットマン社製）を用いて、順に0 M、0.2 M、0.5 M、及び1 Mの塩化ナトリウム水溶液で溶出を行った。各溶出画分に含まれる全糖量はフェノール硫酸法によって測定した。また、溶出画分を希釈し、マウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出を指標として、各溶出画分の免疫賦活作用を調べた。図３に示すように、0.2 Mの塩化ナトリウム水溶液溶出画分に強い免疫賦活作用を示した。陰イオン交換カラムに吸着し、0.2 M 塩化ナトリウム水溶液で溶出したため、免疫賦活作用を有する物質は酸性であることがわかった。
さらに、0.2 Mの塩化ナトリウム水溶液溶出画分を、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて精製した。カラムにはSuperose 6 10/300 GL（分画範囲5×103―5×106）（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた。各溶出画分に含まれる全糖量はフェノール硫酸法によって測定した。また、溶出画分を希釈し、マウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出を指標として、各溶出画分の免疫賦活作用を調べた。図４に示すように、分子量の大きい画分が強い免疫賦活作用を示した。
ゲル濾過クロマトグラフィで免疫賦活作用が認められた溶出画分を高速液体クロマトグラフィにかけ、分子量を測定した。カラムには分画範囲が５億から１万のShowdex（登録商標） SB-807 HQ（昭和電工株式会社製）を用いた。図５に示すように、免疫賦活作用を有する物質は、分子量約100万（約1.0×106）の多糖類であることがわかった。1.0 kgのウリミバエの蛹から、22.7 mgの免疫賦活能を有する多糖類が精製された。
さらに、精製された多糖類を2 Mのトリフルオロ酢酸（TFA）100℃、16時間の条件で加水分解し、加水分解で得られた単糖及びその誘導体をジエチルジチオアセタール化及びトリメチルシリル化し、さらに窒素を吹き付けて乾固して水に溶解させ、ヘキサンで抽出した。HP-5カラム（アジレントテクノロジー株式会社製）を用いてガスクロマトグラフィ質量分析計（GC/MS）を用いて上記の多糖の構成糖を分析したところ、図６に示されるパターンのトータルイオンクロマトグラム（TIC）が得られた。トータルイオンクロマトグラムのピークに対応する単糖及びその誘導体の面積比を算出し、さらに標準品を用いて単糖及びその誘導体の重量比と構成比（モル％）を算出した。
標準品には、D-アラビノース（D-Ara）、D-キシロース（D-Xyl）、L-ラムノース（L-Rha）、L-フコース（L-Fuc）、D-リボース（D-Rib）、D-グルコース（D-Glu）、D-ガラクトース（D-Gal）、D-マンノース（D-Man）、D-フルクトース（D-Fru）、D-グルクロン酸（D-GlcA）、D-ガラクツロン酸（D-GalUA）、N-アセチル-D-グルコサミン（D-GlcNAc）、N-アセチル-D-ガラクトサミン（D-GalNAc）、及びN-アセチルノイラミン酸（NANA）を用いた。したがって、表１中の不明（１）～不明（３）は、上述の標準品のいずれとも異なる。また、多糖類の構成糖の重量比及び構成比は、標準品と一致した単糖及びその誘導体に対する比で表されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
以上の結果から、ウリミバエ由来の多糖類は、水に可溶であり、約80容量％のメタノール水溶液に不溶であり、酸性多糖類であり、さらに平均分子量が約１００万（約1.0×103 kDa）であり、少なくとも、構成糖として、N-アセチル-D-グルコサミン（D-GlcNAc）、N-アセチル-D-ガラクトサミン（D-GalNAc）、D-グルクロン酸（D-GlcA）、L-ラムノース（L-Rha）、L-フコース（L-Fuc）、D-グルコース（D-Glc）、D-ガラクトース（D-Gal）、D-マンノース（D-Man）及び、D-リボース（D-Rib）からなる群から含まれる１又は複数を含むことが明らかとなった。また、L-ラムノースは、トータルイオンクロマトグラムのピーク面積比で約22.8％含まれていることが明らかとなった。
１．２．イエバエ科（Muscidae）に属する昆虫に由来する免疫賦活作用を有する物質の同定
双翅目に属する昆虫が含有し、免疫賦活能を有する多糖の同定を行った。昆虫には、イエバエ科（Muscidae）に属するイエバエ（Musca domestica）の蛹を用いた。１．１．と同様の方法により水抽出画分を調整した。
水抽出画分を、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて精製した。カラムにはHiprep 26/60　Sephacryl S500（分画範囲4×104 ―2×107）（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた。各溶出画分に含まれる全糖量はフェノール硫酸法によって測定した。また、溶出画分を希釈し、マウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出を指標として、各溶出画分の免疫賦活作用を調べた。図７に示すように、免疫賦活作用を示す画分が得られた。イエバエには免疫賦活作用を示す多糖類が複数含まれていることがわかった。ゲル濾過クロマトグラフィの結果から、イエバエに含まれている多糖類の分子量は、約１８０万（1.8×106）（溶出画分１３～溶出画分１７）、及び約３０万（3.0×105）（溶出画分２３～溶出画分２７）であると予測された。
以上の結果から、双翅目に属する昆虫には、免疫賦活作用を有する多糖類が含まれていることが明らかとなった。
２．鱗翅目に属する昆虫に由来する免疫賦活作用を有する物質の同定
２．１．ヤママユガ科に属する昆虫に由来する免疫賦活作用を有する物質の同定
鱗翅目に属する昆虫が含有し、免疫賦活能を有する多糖の同定を行った。昆虫には、ヤママユガ科（Saturniidae）に属するヤママユ（Antheraea
yamamai）の蛹を用いた。１．１．と同様の方法により水抽出画分を調整した。
水抽出画分を、DEAE陰イオン交換カラム（Hiprep DEAE FF 16/10、GEヘルスケアバイオサイエンス社製）にかけ、0 M～0.6 Mの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。各溶出画分に含まれる全糖量をフェノール硫酸法によって測定した。また、溶出画分を希釈し、マウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出を指標として、各溶出画分の免疫賦活作用を調べた。全糖量と塩化ナトリウム濃度を示したグラフを図８、全糖量と免疫賦活作用を示したグラフを図９に示す。強い免疫賦活作用を有する溶出画分が確認された。陰イオン交換カラムに吸着し、0 M ～0.6 Mの 塩化ナトリウム水溶液で溶出したため、免疫賦活作用を有する物質は酸性であることがわかった。
さらに、免疫賦活作用を有する溶出画分を、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて精製した。カラムにはHiprep 26/60　Sephacryl S500（分画範囲4×104 ―2×107）（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた。各溶出画分に含まれる全糖量はフェノール硫酸法によって測定した。また、溶出画分を希釈し、マウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出を指標として、各溶出画分の免疫賦活作用を調べた。図１０に示すように、分子量が大きな画分が免疫賦活作用を示した。
さらに、ゲル濾過クロマトグラフィで免疫賦活作用が認められた画分を高速液体クロマトグラフィにかけ、分子量を測定した。カラムには分画範囲が５億から１万のShowdex（登録商標） SB-807 HQ（昭和電工株式会社製）を用いた。図１１に示すように、免疫賦活作用を有する物質は、平均分子量約31万（約3.1×105）の多糖類であることがわかった。
さらに、１．１．と同様の方法でガスクロマトグラフィ質量分析計を用いて該多糖類の構成糖を分析したところ、図１２に示されるパターンのトータルイオンクロマトグラム（TIC）が得られた。トータルイオンクロマトグラムのピークに対応する単糖とその面積比を算出した。
標準品には、D-アラビノース（D-Ara）、D-キシロース（D-Xyl）、L-ラムノース（L-Rha）、L-フコース（L-Fuc）、D-リボース（D-Rib）、D-グルコース（D-Glu）、D-ガラクトース（D-Gal）、D-マンノース（D-Man）、D-フルクトース（D-Fru）、D-グルクロン酸（D-GlcA）、D-ガラクツロン酸（D-GalUA）、N-アセチル-D-グルコサミン（D-GlcNAc）、N-アセチル-D-ガラクトサミン（D-GalNAc）、及びN-アセチルノイラミン酸（NANA）を用いた。したがって、表２中の不明（１）～不明（６）は、上述の標準品のいずれとも異なる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
以上の結果から、ヤママユ由来の多糖類は、水に可溶であり、約80容量％のメタノール水溶液に不溶であり、酸性多糖であり、さらに平均分子量が約３１万（約3.10×105 ）であり、少なくとも、構成糖として、D-マンヌロン酸（D-ManA）、L-グルクロン酸（L-GulA）、L-ラムノース（L-Rha）、L-フコース（L-Fuc）、D-ガラクトース（D-Gal）、D-グルコース（D-Glu）、及びD-マンノースからなる群から含まれる１又は複数を含むことが明らかとなった。また、L-ラムノースは、トータルイオンクロマトグラムのピーク面積比で約12.9％含まれていることが明らかとなった。
２．２．カイコガ科に属する昆虫に由来する免疫賦活作用を有する物質の同定
鱗翅目に属する昆虫が含有し、免疫賦活能を有する多糖の同定を行った。昆虫には、カイコガ科（Bombycinae）に属するカイコガ（Bombyx
mori）の蛹を用いた。１．と同様の方法により水抽出画分を調整した。
水抽出画分を、DEAE陰イオン交換カラム（Hiprep DEAE FF 16/10、GEヘルスケアバイオサイエンス社製）にかけ、0 M～1.0 Mの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。各溶出画分に含まれる全糖量をフェノール硫酸法によって測定した。また、溶出画分を希釈し、マウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出を指標として、各溶出画分の免疫賦活作用を調べた。全糖量と塩化ナトリウム濃度を示したグラフを図１３、全糖量と免疫賦活作用を示したグラフを図１４に示す。強い免疫賦活作用を有する溶出画分が確認された。陰イオン交換カラムに吸着し、0 M ～1.0 Mの 塩化ナトリウム水溶液で溶出したため、免疫賦活作用を有する物質は酸性であることがわかった。
さらに、免疫賦活作用を有する溶出画分を、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて精製した。ゲルろ過クロマトグラフィを用いて精製した。カラムにはHiprep 26/60　Sephacryl S500（分画範囲4×104 ―2×107）（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いた。各溶出画分に含まれる全糖量はフェノール硫酸法によって測定した。また、溶出画分を希釈し、マウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出を指標として、各溶出画分の免疫賦活作用を調べた。図１５に示すように、分子量の大きい画分が免疫賦活作用を示した。
また、このゲルろ過クロマトグラフィで免疫賦活作用を有していた画分は、２．１．でのゲルろ過クロマトグラフィで免疫賦活作用を有していた画分と同一であると予測される。したがって、カイコガにも免疫賦活作用を有する多糖類が含まれており、該多糖類の分子量は約31万（約3.10×105）であることが明らかとなった。
以上の結果から、鱗翅目に属する昆虫にも、免疫賦活作用を有する多糖類が含まれていることが明らかとなった。
３．鞘翅目に属する昆虫が有する免疫賦活作用の検証
他の分類に属する昆虫にも本発明の免疫賦活作用を有する多糖類が含まれているかを検証するため、鞘翅目に属する昆虫を用いて免疫賦活作用を調べた。鞘翅目（甲虫目）（Coleoptera）多食亜目（Polyphaga）コガネムシ上科（Scarabaeoidea）コガネムシ科（Scarabaeidae）に属するカブトムシ（Trypoxylus dichotomus）の蛹を用いた。１．と同様の方法により上清画分を調整し、希釈した上清画分における免疫賦活作用をマウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出を指標として調べたところ、図１６に示すように免疫賦活作用が確認された。したがって、鞘翅目に属する昆虫にも、双翅目に属する昆虫や鱗翅目に属する昆虫と同様に、免疫賦活作用を有する多糖類が含まれていると考えられた。
４．免疫賦活作用の検証
本発明の多糖類が有する免疫賦活作用を、免疫賦活作用を有することが知られているリポ多糖と比較した。上述の方法でウリミバエから本発明の多糖類を精製し、マウスマクロファージ細胞株の一酸化窒素の産出量をリポ多糖と比較した。結果を図１７に示す。100 pg/mLのリポ多糖では、ほとんどマクロファージの一酸化窒素の産出がみられなかった一方で、ウリミバエから精製された多糖は100pg/mLでも一酸化窒素の産出を誘導した。したがって、本発明の多糖類には非常に強い免疫賦活作用が認められた。
５．本発明の組成物の耐熱性の検証
本発明の多糖類の耐熱性を検証した。ウリミバエ蛹から得られた上清画分を100℃で0分～30分熱処理し、マウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出量を測定した。図１８に示すように、100℃で30分熱処理しても本発明の多糖類の免疫賦活作用が失われなかったことから、高い耐熱性を有することがわかった。
６．昆虫の変態段階における免疫賦活作用の変化
本発明の多糖類の免疫賦活作用が、昆虫の変態段階によってどのように変化するかを調べた。ウリミバエの3日目・4日目・5日目・6日目の幼虫、蛹化1日目・2日目・3日目・4日目の蛹をそれぞれ粉砕してペースト状にし、遠心分離により得られた上清画分を得て、マウスマクロファージ細胞株に、10倍希釈、100倍希釈、又は1,000倍希釈になるように添加し、一酸化窒素の産出量を測定した。図１９に示すように、特に初期の幼虫と後期の蛹で高い免疫賦活作用が認められたが、幼虫～蛹の全ての時期で免疫賦活作用が認められたことから、昆虫は、これらの時期で免疫賦活作用を有する多糖類を含有していると考えられた。
７．本発明の多糖類による免疫賦活の作用機序の解析
本発明の多糖類の有する免疫賦活作用が、動物のマクロファージのどの受容体を介して起こるかを調べた。Toll-like Receptor 2に対する抗体（anti-mTLR2）、又はToll-like Receptor 4に対する抗体（anti-mTLR4）でマクロファージを処理し、ウリミバエ由来多糖、又はLPSを1ng/mLになるように添加し、一酸化窒素の産出量を測定した。結果を図２０に示す。Toll-like Receptor 4に対する抗体で処理したマクロファージで一酸化窒素の産出量が有意に低下したため、本発明の多糖類による免疫賦活作用は、少なくともToll-like Receptor 4を介していることが示された。
８．本発明の多糖類を含む飼料によるマダイ飼育試験
本発明の多糖類を含む飼料によりマダイの耐病性が向上するかどうかを調べた。マダイは尾叉長約10cm、魚体重約25gの個体を、各12尾ずつ水槽に収容した。ウリミバエ由来多糖の濃度がそれぞれ0.001 μg/g、0.01μg/g、0.1μg/g、1μg/gとなるように飼料を作製し、マダイに供与した。4週間飼育した後に、マダイの腹腔内にエドワジエラ症を引き起こすグラム陰性菌であるEdwardsiella
tardaを5.0×105
cellを接種して強制感染させ、生存数を計測した。結果を図２１に示す。ウリミバエ由来多糖を含んだ飼料は、対照群に比べていずれも生存率が高かった。したがって、ウリミバエ由来多糖の有する免疫賦活作用により、マダイがEdwardsiella tardaに対する耐病性を獲得したと考えられた。

Claims (14)

  1. 昆虫由来で免疫賦活作用を有する多糖類
  2. 構成糖として少なくともラムノースを含有する、請求項１に記載の多糖類
  3. 前記昆虫が、双翅目、鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、直翅目、及び蜻蛉目からなる群から選択される１又は複数に属する、請求項１又は請求項２に記載の多糖類
  4. 前記昆虫が、双翅目、鱗翅目、及び鞘翅目からなる群から選択される１又は複数に属する、請求項１又は請求項２に記載の多糖類
  5. 前記昆虫が、少なくとも植物に食性を示す、請求項１～請求項４いずれか一項に記載の多糖類
  6. 耐熱性を有する、請求項１～請求項５いずれか一項に記載の多糖類
  7. 高温高圧耐性を有する、請求項１～請求項６いずれか一項に記載の多糖類
  8. 　平均分子量が約１．０×１０５～約１．０×１０７である、請求項１～請求項７いずれか一項に記載の多糖類
  9. 前記免疫賦活作用がToll-like Receptor 4を介したものである、請求項１～請求項８いずれか一項に記載の多糖類
  10. 請求項１～請求項９いずれか一項に記載の多糖類を含有する組成物
  11. 前記組成物が、昆虫の卵、幼虫、蛹、及び、成虫からなる群から選択される１又は複数の粉末である、請求項１０に記載の組成物
  12. 前記組成物が、昆虫の卵、幼虫、蛹、及び、成虫からなる群から選択される１又は複数からの抽出物である、請求項１０に記載の組成物
  13. 前記組成物が、昆虫の卵、幼虫、蛹、及び、成虫からなる群から選択される１又は複数から得られたアルコール不溶性固形分である、請求項１０に記載の組成物
  14. 前記多糖類を有効成分とし、請求項１０～請求項１３いずれか一項に記載の組成物を含有する免疫賦活剤
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