TW201410249A

TW201410249A - 多醣類、含有多醣類的組合物、以及免疫賦活劑

Info

Publication number: TW201410249A
Application number: TW102126214A
Authority: TW
Inventors: Takeshi Miura; Chiemi Miura; Takashi Ohta; Toshiharu Iwai; Takayuki Takahashi
Original assignee: Univ Ehime; Bussan Biotech Co Ltd
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2014-03-16
Also published as: JP2017031173A; JP6019505B2; JP6240993B2; CN104884068B; CN104884068A; JPWO2014017451A1; WO2014017451A1

Abstract

迄今為止具有免疫賦活能的多醣作為醫藥品或健康食品、畜產用或水產用的飼料添加物進行利用，但是顯現出充分的免疫賦活效果之多醣相當少，因此尋求以低成本開發出顯現強免疫賦活效果之組合物；本發明提供源自昆蟲且具有免疫賦活作用的多醣類、含有該多醣類的組合物、以及以該多醣類作為活性成分的免疫賦活劑；本發明的多醣類之組成糖以至少含有鼠李糖為佳。

Description

多醣類、含有多醣類的組合物、以及免疫賦活劑

本發明係有關於源自昆蟲且具有免疫賦活作用的多醣類、含有該多醣類的組合物、以及以該多醣類作為活性成分的免疫賦活劑。

迄今為止已發現多種具有免疫賦活作用的多醣類。作為有關具有免疫賦活作用的多醣之技術，例如存在酸性粘多醣(參照專利文獻1)、脂多糖及β-葡聚糖(參照專利文獻2)、源自籠目褐藻的粘性多醣類(參照專利文獻3)、作為除了L-岩藻糖和D-木糖之外還以D-葡萄糖醛酸為主要構成成分的硫酸多醣之岩衣藻蛋白(參照專利文獻4)、具有β-1,3-鍵的甘露聚糖(參照專利文獻5)等。但是，具有免疫賦活作用的多醣大多數都是源自菌類或源自植物，並未發現源自動物的多醣。

另一方面，昆蟲作為容易人工生產的動物性蛋白質而受到重視，也嘗試了將昆蟲的幼蟲或蛹用作畜產用或水產用的飼料原料(參照專利文獻6和專利文獻7)。

【先前技術文獻】 【專利文獻】

專利文獻1：：日本公報、特開2012-031089號

專利文獻2：日本公報、特開2012-082156號

專利文獻3：日本公報、特開2009-227618號

專利文獻4：日本公報、特開2008-120707號

專利文獻5：日本公報、特開2006-060288號

專利文獻6：國際公開公報第2011/007867號

專利文獻7：日本公報、特開2003-210071號

迄今為止的具有免疫賦活作用的多醣類被作為醫藥品或健康食品、畜產用或水產用的飼料添加物進行利用，但是顯現出充分的免疫賦活效果之多醣類相當少。因此，期求以低成本開發顯現強免疫賦活效果之組合物。

即，本發明係一源自昆蟲且具有免疫賦活作用的多醣類、以及含有該多醣類的一組合物。另外，在其他的本發明中，該具有免疫賦活作用的多醣類至少含有鼠李糖作為組成糖。

其他的本發明係源自下述昆蟲的多醣類，該昆蟲為選自雙翅目、鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、直翅目及蜻蜓目構成的群組中的一種或多種。另外，其他的本發明係源自下述昆蟲的多醣類，該昆蟲為選自雙翅目、鱗翅目及鞘翅目構成的群組中一種或多種。進而，其他本發明的多醣類係源自至少對植物顯現出食性的昆蟲。

進而，其他本發明中的具有免疫賦活作用的多醣類具有耐熱性或耐高溫高壓性。在該情況下，即使在製造或加工階段對本發明的多醣類實施了熱處理或高溫高壓處理時，免疫賦活作用也不會喪失，因此是理想的。

進而，其他本發明中的具有免疫賦活作用的多醣類的平均分子量為約1.0×10⁵~約1.0×10⁷。另外，該多醣類的免疫賦活作用至少係經由類鐸受體4(Toll-like Receptor 4)實現。

另外，其他的本發明係含有多醣類的組合物，該多醣類源自昆蟲且具有免疫賦活作用。進而，本發明的該組合物可以為選自昆蟲的卵、幼蟲、蛹及成蟲構成的群組中的一種或多種的粉末，選自昆蟲的卵、幼蟲、蛹及成蟲構成的群組中的一種或多種中萃取的萃取物，或者，從選自昆蟲的卵、幼蟲、蛹及成蟲構成的群組中的一種或多種中得到的醇類不溶性固形物。

進而，本發明提供以多醣類作為活性組分的免疫賦活劑，該多醣類源自昆蟲且具有免疫賦活作用。

本發明係有關於源自昆蟲的具有免疫賦活作用的多醣類、含有該多醣類的組合物、以及將該多醣類作為活性組分的免疫賦活劑。透過對人或畜產動物、水產動物、寵物等給藥本發明，能夠得到強免疫賦活作用。另外，由於昆蟲作為食用或飼料用的動物性資源的價值高，因此，能夠作為具有免疫賦活作用的健康食品、或具有免疫賦活作用的畜產用或水產用的飼料原料而進行利用。

圖1係顯示從昆蟲中得到的上清液部分(A)、甲醇萃取部分(B)、以及水萃取部分(C)的免疫賦活作用的圖。

圖2係顯示從昆蟲中得到的上清液部分(A)的免疫賦活作用在蛋白酶K處理下未發生變化的圖。

圖3係顯示從屬於雙翅目的昆蟲中得到的水萃取部分之陰離子交換色層分析之結果的圖。

圖4係顯示利用凝膠過濾層析法將源自屬於雙翅目的昆蟲的多醣類進行純化的圖。

圖5係顯示利用高效液相色譜法將源自屬於雙翅目的昆蟲的多醣類之分子量進行測定的圖。

圖6係顯示源自屬於雙翅目的昆蟲的多醣之組成糖分析中的總離子層析圖。

圖7係顯示利用凝膠過濾層析法將源自屬於雙翅目的昆蟲的多醣類進行純化的圖。

圖8係顯示從屬於鱗翅目的昆蟲中得到的水萃取部分之陰離子交換色層分析之結果(總糖量及氯化鈉洗脫濃度)的圖。

圖9係顯示從屬於鱗翅目的昆蟲中得到的水萃取部分之陰離子交換色層分析之結果(總糖量及免疫賦活作用)的圖。

圖10係顯示利用凝膠過濾層析法將源自屬於鱗翅目的昆蟲的多醣類進行純化的圖。

圖11係顯示利用高效液相色譜法將源自屬於鱗翅目的昆蟲的多醣類之分子量進行測定的圖。

圖12係顯示源自屬於鱗翅目的昆蟲的多醣之組成糖分析中的總離子層析圖。

圖13係顯示從屬於鱗翅目的昆蟲中得到的水萃取部分之陰離子交換色層分析之結果(總糖量及氯化鈉洗脫濃度)的圖。

圖14係顯示從屬於鱗翅目的昆蟲中得到的水萃取部分之陰離子交換色層分析之結果(總糖量及免疫賦活作用)的圖。

圖15係顯示利用凝膠過濾層析法將源自屬於鱗翅目的昆蟲的多醣類進行純化的圖。

圖16係顯示從屬於鞘翅目的昆蟲中得到的上清液部分之免疫賦活作用的圖。

圖17係將源自屬於雙翅目的昆蟲的多醣之免疫賦活作用與脂多糖進行比較的圖。

圖18係顯示本發明的多醣類的耐熱性的圖。

圖19係顯示本發明的多醣類所具有之免疫賦活作用在昆蟲的變態階段中的變化的圖。

圖20係顯示在抗TLR2抗體或抗TLR4抗體的存在下本發明的多醣類的免疫賦活作用的圖。

圖21係顯示透過由本發明的多醣類產生之免疫賦活作用而使得真鯛的耐病性提高的圖。

本發明提供源自昆蟲且具有免疫賦活作用的多醣類、含有多醣類的組合物、以及將多醣類作為活性組分的免疫賦活劑。

本發明的多醣類源自昆蟲。發明者們發現了屬於多個種別的昆蟲含有具免疫賦活作用之多醣類，並達成了本發明。進而，闡明了：非常大範圍的種別的昆蟲含有具免疫賦活作用之多醣。只要是含有具免疫賦活作用之多醣類的昆蟲，便能夠用於本發明。

昆蟲在動物界中屬於節肢動物門(Arthropoda)，為被分類為昆蟲綱(Insecta)的生物之總稱。昆蟲綱(Insecta)分類為無翅亞綱(Apterygota)和有翅亞綱(Pterygota)。無翅亞綱(Apterygota)被分類為彈尾目(Collembola)、原尾目(Protura)、纓尾目(Thysanura)等。另外，有翅亞綱(Pterygota)被分類為蜉蝣目(Ephermeroptera)、襀翅目(Plecoptera)、蜻蜓目(Odonata)、紡腳目(Embioptera)、直翅目(Orthoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(白蟻目)(Isoptera)、紡足目(擬白蟻目)(Empioptera)、齧蟲目(Psocoptera)、食毛目(Mallophaga)、蝨目(Anoplura)、纓翅目(Thysanoptera)、半翅目(Hemiptera)、膜翅目 (Hymenoptera)、撚翅目(Strepsiptera)、鞘翅目(Coleoptera)、脈翅目(Neuroptera)、長翅目(Mecoptera)、毛翅目(Trichoptera)、鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、隱翅目(Aphaniptera)等。

在上述分類中，對蜻蜓目、網翅目(Dictyoptera)、直翅目、半翅目、脈翅目、膜翅目、鞘翅目、雙翅目以及鱗翅目進一步詳細地進行說明。

作為屬於蜻蜓目的昆蟲，可以舉出蜻蜓等。蜻蜓目進一步分類為珈蟌科(Calopterygidae)、幽蟌科(Euphaeidae)、細蟌科(Coenagrionidae)、蟎蟌科(Megapodagrionidae)、絲蟌科(Lestidae)、琵蟌科(Platycnemididae)、春蜓科(Gomphidae)、蟌蜓科(Epiophlebiidae)、古蜓科(Petaluridae)、鉤蜓科(Cordulegasteridae)、晏蜓科(Aeschnidae)、弓蜓科(Corduliidae)、山蜻蛉科(Macromiidae)、蜻蜓科(Libellulidae)等。

作為屬於網翅目的昆蟲，可以舉出螳螂和蟑螂等。螳螂亞目(Mantodea)進一步分類為螳螂科(Mantidae)、姬螳螂科(Acromantidae)等，蜚蠊目(Blattodea)進一步分類為蟑螂科(Blattidae)、光蠊科(Epilampridae)、蔗蠊科(Pycnoscelidae)、姬蠊科(Blattellidae)、硬蜚蠊科(Panesthiidae)等。

作為屬於直翅目的昆蟲，可以舉出蝗蟲、螽斯、蟋蟀、螻蛄、駱駝蟋蟀等。直翅目進一步分類為穴螽科(Rhaphidophoridae)、蟋螽科(Gryllacridae)、螽蟴科(Tettigoniidae)、蟋蟀科(Gryllidae)、蟻蟋科(Myrmecophilidae)、蚤螻科(Tridactylidae)、螻蛄科(Gryllotalpidae)、菱蝗科(Tetrigidae)、蝗蟲科(Locustidae)等。

作為屬於半翅目的昆蟲，可以舉出蝽、田鼈、水黽、蟬、浮塵子、蚜蟲等。半翅目異翅亞目(Heteroptera)進一步分類為土蝽科(Cydnidae)、龜蝽科(Plataspidae)、蝽科(Pentatomidae)、同蝽科(Acanthosomatidae)、異蝽科(Urostylidae)、緣蝽科(Coreidae)、長蝽科(Lygaeidae)、大紅蝽科(Largidae)、紅蝽科(Pyrrhocoridae)、錘角蝽科(Berytidae)、扁蝽科(Aradidae)、姬蝽科(Nabidae)、獵蝽科(Reduviidae)、小錢蟲科(Naucoridae)、負蝽科(Belostomatidae)、蝎蝽科(Nepidae)、奇蝽科(Enicocephalidae)、網蝽科(Tingidae)、花蝽科(Anthocoridae)、臭蟲科(Cimicidae)、盲蝽科(Miridae)、黽蝽科(Gerridae)、尺蝽科(Hydrometridae)、寬肩蝽科(Veliidae)、膜蝽科(Hebridae)、水蝽科(Mesoveliidae)、鞭蝽科(Dipsocoridae)、跳蝽科(Saldidae)、蜍蝽科(Octheridae)、蓋蝽科(Aphelocheiridae)、仰蝽科(Notonectidae)、固頭蝽科(Pleidae)、蚤蝽科(Helotrephidae)、劃蝽科(Corixidae)等。

半翅目同翅亞目(Homoptera)分類為蟬科(Cicadidae)、角蟬科(Membracidae)、沫蟬科(Cercopidae)、廣胸漠蟬科(Tomaspididae)、刺沫蟬科(Machaerotidae)、耳葉蟬科 (Ledridae)、大葉蟬科(Tettigellidae)、橫脊葉蟬科(Evacanthidae)、隱脈葉蟬科(Nirvanidae/Paraboloponidae)、烏葉蟬科(Penthimiidae)、浮塵子科(Jassidae)、廣頭葉蟬科(Macropsidae)、圓頂葉蟬科(Agalliidae)、黃胸槽脛葉蟬科(Drabescidae)、片角葉蟬科(Idioceridae)、小眼葉蟬科(Xestocephalidae)、葉蟬科(Cicadellidae)、緣脊葉蟬科(Aphrodidae)、長頭葉蟬科(Hecalidae)、叉突纖細葉蟬科(Errhomenellidae)、角頂葉蟬科(Deltocephalidae)、蟻蠟蟬科(Tettigometridae)、縞飛蝨科(Meenoplidae)、蠟蟬科(Fulgoridae)、長翅飛蝨科(Derbidae)、小頭飛蝨科(Achilidae)、稻蝨科(Delphacidae)、象蠟蟬科(Dictyopharidae)、菱飛蝨科(Cisiidae)、軍配飛蝨科(Tropiduchidae)、青翅飛蝨科(Flatidae)、圓飛蝨科(Issidae)、廣翅蠟蟬科(Ricaniidae)、木蝨科(Psyllidae)、粉蝨科(Aleyrodidae)、蚜蝨科(Aphididae)、綿蚧科(Margarodidae)、粉介殼蟲科(Eriococcidae)、介殼蟲科(Coccidae)、蜂蚧科(Beesoniidae)、盾介殼蟲科(Diaspididae)等。

脈翅目進一步分類為盲蛇蛉科(Inocellidae)、泥蛉科(Sialidae)、魚蛉科(Corydalidae)、螳蛉科(Mantispidae)、長角蛉科(Ascalaphidae)、翼蛉科(Osmylidae)、草蛉科(Chrysopidae)、姬蛉科(Hemerobiidae)、蟻蛉科(Myrmeleontidae)等。

作為屬於膜翅目的昆蟲，可以舉出蜂和螞蟻等。膜翅目進一步分類為鞘蜂科(Xyelidae)、寄生樹蜂科(Orussidae)、四節葉蜂科(Blasticotomidae)、樹蜂科(Siricidae)、莖蜂科(Cephidae)、扁葉蜂科(Pamphiliidae)、葉蜂科(Tenthredinidae)、松葉蜂科(Diprionidae)、三節葉蜂科(Argidae)、錘角葉蜂科(Cimbicidae)、繭蜂科(Braconidae)、蚜繭蜂科(Aphidiidae)、姬蜂科(Ichneumonidae)、榕小蜂科(Agaonidae)、小蜂科(Chalcididae)、褶翅小蜂科(Leucospidae)、蟻小蜂科(Eucharitidae)、長尾小蜂科(Torymidae)、廣肩小蜂科(Eurytomidae)、金小蜂科(Pteromalidae)、跳小蜂科(Encyrtidae)、扁股小蜂科(Elasmidae)、釉小蜂科(Eulophidae)、赤眼蜂科(Trichogrammatidae)、纓小蜂科(Mymaridae)、細蜂科(Proctotrupidae)、分盾細蜂科(Ceraphronidae)、廣腹細蜂科(Platygasteridae)、緣腹細蜂科(Scelionidae)、蟻科(Formicidae)、癭蜂科(Cynipidae)、鉤腹蜂科(Trigonalidae)、螯蜂科(Dryinidae)、小土蜂科(Tiphiidae)、褶翅姬蜂科(Gasteruptionidae)、蟻蜂科(Mutillidae)、蟻形蜂科(Bethylidae)、青蜂科(Chrysididae)、尖胸青蜂科(Cleptidae)、蛛蜂科(Pompilidae)、土蜂科(Scoliidae)、胡蜂科(Vespidae)、細腰蜂科(Sphecidae)、地花蜂科(Andrenidae)、擬蜜蜂科(Colletidae)、毛腳花蜂科(Melittidae)、切葉蜂科(Megachilidae)、隧蜂科(Halictidae)、條蜂科(Anthophoridae)、蜜蜂科(Apidae)等。

鞘翅目也稱作甲蟲類。作為屬於鞘翅目的昆蟲，可以舉出甲蟲、鍬形蟲、長角甲蟲、龍蝨、金龜子、花金龜、銅花金龜子、步行蟲、螢火蟲、瓢蟲、象鼻蟲、步甲蟲、偽步行蟲等。

鞘翅目進一步分類為長扁甲科(Cupedidae)、背條蟲科(Rhysodidae)、粗角步行蟲科(Paussidae)、斑螯科(Cicindelidae)、步行蟲科(Carabidae)、瓢簞塵蟲科(Scaritidae)、芥蟲科(Harpalidae)、細頸步行蟲科(Brachinidae)、小頭水蟲科(Haliplidae)、方胸龍蝨科(Noteridae)、龍蝨科(Dytiscidae)、鼓甲科(Gyrinidae)、牙蟲科(Hydrophilidae)、長閻甲科(Synteliidae)、閻魔蟲科(Histeridae)、脊球蕈甲科(Catopidae)、埋葬蟲科(Silphidae)、突尾蕈蟲科(Scaphidiidae)、隱翅蟲科(Staphylinidae)、鍬形蟲科(Lucanidae)、黑艷蟲科(Passalidae)、皮金龜科(Trogidae)、糞金龜科(Geotrupidae)、金龜子科(Scarabaeidae)、圓花蚤科(Helodidae)、丸甲科(Byrrhidae)、扁泥蟲科(Psephenidae)、長花蚤科(Ptilodactylidae)、泥蟲科(Dryopidae)、長角泥蟲科(Elmidae)、蟬寄甲科(Rhipiceridae)、吉丁蟲科(Buprestidae)、叩頭蟲科(Elateridae)、偽叩頭蟲科(Eucnemidae)、擬螢科(Drilidae)、螢科(Lampyridae)、菊虎科(Cantharidae)、紅螢科(Lycidae)、姬刺蟲科(Nosodendridae)、鰹節蟲科(Dermestidae)、食骸蟲科(Anobiidae)、標本蠹科(Ptinidae)、長蠹蟲科(Bostrychidae)、扁蠹蟲科(Lyctidae)、穀盜蟲科(Trogositidae)、郭公蟲科(Cleridae)、姬螢科(Melyridae)、筒蠹蟲科(Lymexylidae)、出尾蟲科(Nitidulidae)、擬出尾蟲科(Rhizophagidae)、扁甲科(Cucujidae)、細扁甲科(Silvanidae)、大吸木甲科(Helotidae)、吸木蟲科(Cryptophagidae)、擬吸木蟲科(Byturidae)、長菌蟲科 (Languriidae)、大蕈蟲科(Erotylidae)、瓢蟲科(Coccinellidae)、擬瓢蟲科(Endomychidae)、小蕈蟲科(Mycetophagidae)、細堅蟲科(Colydiidae)、擬步行蟲科(Tenebrionidae)、偽葉甲科(Lagriidae)、朽木蟲科(Alleculidae)、瘤擬步行蟲科(Zopheridae)、盤胸甲科(Boridae)、方胸甲科(Elacatidae)、樹皮甲科(Pythidae)、赤翅螢科(Pyrochroidae)、偽蕈甲科(Tetratomidae)、長朽木蟲科(Melandryidae)、花蚤科(Mordellidae)、大花蚤科(Rhipiphoridae)、長頸蟲科(Cephaloidae)、地膽科(Meloidae)、擬天牛科(Oedemeridae)、蟻形蟲科(Anthicidae)、天牛科(Cerambycidae)、豆象科(Bruchidae)、金花蟲科(Chrysomelidae)、長角象鼻蟲科(Anthribidae)、捲葉象鼻蟲科(Attelabidae)、三錐象鼻蟲科(Brenthidae)、象鼻蟲科(Curculionidae)、小蠹蟲科(Scolytidae)、長小蠹蟲科(Platypodidae)等。

作為屬於雙翅目的昆蟲，可以舉出蚊子、大蚊、蠅、虻、蚋，進一步可以舉出蒼蠅、果蠅、實蠅、水虻等。

雙翅目進一步分類為蚊蚋科(Anisopodidae)、春蚊科(Cramptonomyiidae)、粗脈蚋科(Pachyneuridae)、朽木蚋科(Axymyiidae)、棒足毛蚊科(Hyperoscelidae)、蕈蚋科(Mycetophilidae)、蕈柄蚊科(Bolitophilidae)、扁角蚊科(Ceroplatidae)、粘蚊科(Sciophilidae)、大角蕈蚊科(Macroceridae)、癭蚋科(Cecidomyiidae)、黑翅蕈蚋科(Sciaridae)、毛蚋科(Bibionidae)、長角蚊科(Hesperinidae)、偽毛蚋科(Scatopsidae)、蛾蚋科(Psychodidae)、偽蚊科 (Tanyderidae)、細腰大蚊科(Ptychopteridae)、冬大蚊科(Trichoceridae)、錐大蚊科(Cylindrotomidae)、大蚊科(Tipulidae)、亮大蚊科(Limnoniidae)、蚊科(Culicidae)、細蚊科(Dixidae)、幽蚊科(Chaoboridae)、搖蚊科(Chironomidae)、山蚋科(Thaumaleidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、蚋科(Simuliidae)、網蚊科(Blepharoceridae)、水虻科(Stratiomyiidae)、臭蚊科(Coenomyiidae)、流虻科(Athericidae)、鷸虻科(Rhagionidae)、劍虻科(Therevidae)、窗虻科(Scenopinidae)、食蟲虻科(Asilidae)、食木虻科(Xylophagidae)、擬樹虻科(Solvidae)、虻科(Tabanidae)、蜂虻科(Bombyliidae)、小頭虻科(Acroceridae)、擬長吻虻科(Nemestrinidae)、舞虻科(Empididae)、長足虻科(Dolichopodidae)、槍蠅科(Lonchopteridae)、扁角蠅科(Platypezidae)、蚤蠅科(Phoridae)、頭蠅科(Pipunculidae)、食蚜蠅科(Syrphidae)、長腳蠅科(Neriidae)、微腳蠅科(Micropezidae)、細蠅科(Megamerinidae)、眼蠅科(Conopidae)、蜣蠅科(Pyrgotidae)、折翅蠅科(Psilidae)、甲蠅科(Sciomyzidae)、海濱蠅科(Coelopidae)、廣口蠅科(Platystomatidae)、鱉蠅科(Dryomyzidae)、艷細蠅科(Sepsidae)、果實蠅科(Tephritidae)、蚜小蠅科(Chamaemyiidae)、縞蠅科(Lauxaniidae)、黑艷蠅科(Lonchaeidae)、酪蠅科(Piophilidae)、潛蠅科(Agromyzidae)、陽蠅科(Heleomyzidae)、隱毛蠅科(Cryptochaetidae)、果蠅科(Drosophilidae)、水蠅科(Ephydridae)、小果蠅科(Diastatidae)、禾蠅科(Opomyzidae)、稈蠅科(Chloropidae)、澳蠅科(Clusiidae)、糞蠅科(Scatophagidae)、花蠅科(Anthomyiidae)、家蠅科 (Muscidae)、寄生蠅科(Tachinidae)、裸寄蠅科(Phasiidae)、麗蠅科(Calliphoridae)、肉蠅科(Sarcophagidae)、蝨蠅科(Hippoboscidae)、蝙蝠蠅科(Streblidae)、蛛蠅科(Nycteribiidae)等。

作為屬於果實蠅科(Tephritidae)的昆蟲，具體可以舉出蜜柑大實蠅(Tetradacus tsuneonis)、東方果實蠅(Strumeta dorsalis)、瓜實蠅(Bactrocera cucurbitae/Zeugodacus cucurbitae)、南瓜實蠅(Paradacus depressus)、紅景天實蠅(Urophora sachalinensis)、日本突鞘實蠅(Oedaspis japonica)、日本櫻桃實蠅(Rhacochlaena japonica)、普通紋實蠅(Anomoia vulgaris)、黑漆尖帶實蠅(Acrotaeniostola scutellaris)、日本擬腹帶實蠅(Paragastrozona japonica)、背赤翅斑蠅(Hemilea infuscata)、平山長唇實蠅(Campiglossa hirayamae)、黃色毛深實蠅(Xyphosia punctigera)、薊毛深果實蠅(Tephritis majuscula)、松綺曲吻果實蠅(Ensina sonchi)、爪斑實蠅(Sphaeniscus atilia)、星棒毛實蠅(Rhabdochaeta asteria)等。

作為屬於家蠅科(Muscidae)的昆蟲，具體可以舉出蒼蠅(Musca domestica)、市蠅(Musca sorbens)、刺蠅(Stomoxys calcitrans)等。

作為屬於鱗翅目的昆蟲，包括稱作蝴蝶的昆蟲和稱作蛾的昆蟲。鱗翅目進一步分類為小翅蛾科(Micropterygidae)、毛頂蛾科(Eriocraniidae)、蝙蝠蛾科(Hepialidae)、穿孔蛾科 (Incurvariidae)、長角蛾科(Adelidae)、微蛾科(Stigmellidae)、日蛾科(Heliozelidae)、冠潛蛾科(Tischeriidae)、蕈蛾科(Tineidae)、蓑蛾科(Psychidae)、萊氏蛾科(Lyonetiidae)、菜蛾科(Plutellidae)、巢蛾科(Hyponomeutidae)、絹蛾科(Scythridae)、貂蛾科(Epermeniidae)、草潛蛾科(Elachistidae)、細蛾科(Gracillariidae)、鞘蛾科(Coleophoridae)、擬捲葉蛾科(Glyphipterygidae)、日逐蛾科(Heliodinidae)、透翅蛾科(Aegeriidae)、尖細蛾科(Cosmopterygidae)、旋蛾科(Gelechiidae)、木蛾科(Xyloryetidae)、痣蛾科(Blastobasidae)、織蛾科(Oecophoridae)、木蠹蛾科(Cossidae)、果蛀蛾科(Carposinidae)、小捲葉蛾科(Eucosmidae)、捲蛾科(Tortricidae)、細捲蛾科(Phaloniidae)、網蛾科(Thyrididae)、螟蛾科(Pyralidae)、羽蛾科(Pterophoridae)、翼蛾科(Alucitidae)、斑蛾科(Zygaenidae)、蟬寄蛾科(Epipyropidae)、刺蛾科(Heterogeneidae)、燕蛾科(Uraniidae)、蛛蛾科(Epiplemidae)、擬鳳蝶蛾科(Epicopeidae)、尺蛾科(Geometridae)、鉤蛾科(Drepanidae)、尖翅蛾科(Thyatiridae)、錨紋蛾科(Callidulidae)、蠶蛾科(Bombycidae)、帶蛾科(Eupterotidae)、枯葉蛾科(Lasiocampidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、舟蛾科(Notodontidae)、夜蛾科(Noctuidae)、虎蛾科(Agaristidae)、燈蛾科(Arctiidae)、擬燈蛾科(Aganaidae)、瘤蛾科(Nolidae)、鹿蛾科(Amatidae)、籮紋蛾科(Brahmaeidae)、天蠶蛾科(Saturniidae)、天蛾科(Sphingidae)、弄蝶科(Hesperiidae)、眼蝶科(Satyridae)、蛺蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、長鬚蝶科(Libytheidae)、灰蝶科 (Lycaenidae)、粉蝶科(Pieridae)、鳳蝶科(Papilionidae)等。

作為屬於蠶蛾科(Bombycidae)的昆蟲，具體可以舉出蠶(Bombyx mori)、華家蠶(Bombyx mandarina)、大擬桑蠶蛾(Oberthueria falcigera)、擬鉤翅蛾(Pseudandraca gracilis)、透蠶(Prismosticta hyalinata)等。

天蠶蛾科(Saturniidae)進一步分類為蛇頭蛾屬(Attacus)、眉紋天蠶蛾屬(Samia)、目天蠶蛾屬(Antheraea)、天蠶蛾屬(Saturnia)、銀目天蠶蛾屬(Rhodinia)、長尾水青蛾屬(Actias)、小字蠶屬(Cricula)、天蠶蛾科(Gonimbrasia)屬。

作為屬於天蠶蛾科(Saturniidae)的昆蟲，具體可以舉出曲緣尾大蠶蛾(Actias artemis aliena)、蓖麻蠶(Samia Cynthia ricini)、日樗蠶(Samia Cynthia pryeri)、柞蠶(Antheraea pernyi)、樟蠶(也稱作天蠶、野蠶)(Antheraea yamamai)、天蠶蛾(Rhodinia fugax fugax)、黑天蠶蛾(Rhodinia jankowskii hattoriae)、蝦夷四目蛾(Aglia tau microtau)、銀杏大蠶蛾(Dictyoploca japonica japonica)、綠目天蠶蛾(Caligula boisduvalii jonasii)、與那國蠶(Attacus atlas ryukyuensis)、莫桑比蟲(Gonimbrasia belina)、小字大蠶蛾(Cricula trifenestrata)等。

本發明中的昆蟲的種類並未限定，只要係含有具免疫賦活作用的多醣類的昆蟲，便能夠利用於本發明。另外，本發明中的昆蟲為至少對植物顯示出食性的昆蟲較佳。如後所述，本發明的組合物中所含的多醣類，至少含有鼠李糖作為組成糖較佳。這是：由於鼠李糖富含於植物中，因此只要是植物食性的昆蟲、或者雜食性或食糞性的但對植物也顯示出食性的昆蟲，便能夠容易地攝入鼠李糖。

由於昆蟲在成蟲和幼蟲階段食性會發生變化，在將幼蟲或蛹利用於本發明的情況下，至少幼蟲顯示出植物食性的昆蟲較佳。作為幼蟲為植物食性的昆蟲，具體可以舉出屬於果實蠅科(Tephritidae)、蠶蛾科(Bombycidae)、天蠶蛾科(Saturniidae)、金龜子科(Scarabaeidae)的昆蟲等。另外，作為幼蟲為食糞性但對植物也顯示出食性的昆蟲，可以舉出屬於家蠅科(Muscidae)的昆蟲等。

本發明中的昆蟲只要含有具免疫賦活作用的多醣類即可，並不限定於卵、幼蟲、蛹或成蟲的各變態階段。為了製造含有具免疫賦活作用的多醣類的組合物，適合使用昆蟲的幼蟲或蛹，尤其以蛹為佳。這是因為：幼蟲的消化道內含有大量未消化的物質，有時需要將這些物質分離。

另外，本發明的多醣類的分子量並未限定，以約1.0×10⁴~約1.0×10⁸為佳，較佳為約1.0×10⁵~約1.0×10⁷，更佳為約3.0×10⁵~約2.0×10⁶。

本發明的多醣類含有單糖及其衍生物作為組成糖。以下，對本發明的多醣類中能夠含有的單糖及其衍生物詳細地進行說明。

單糖也稱作中性糖，類別分為醛糖和酮糖，根據所含的碳數，稱作丙糖(Triose)、丁糖(Tetrose)、戊糖(Pentose)、己糖(Hexose)、庚糖(Heptose)、辛酮糖(Octulose)等。作為丙糖的具體例子，可以舉出甘油醛(glyceraldehyde)、二羥丙酮(dihydroxyacetone)等。作為丁糖的具體例子，可以舉出赤藻糖(erythrose)、異赤藻糖(threose)、赤藻酮糖(erythrulose)等。作為戊糖的具體例子，可以舉出核糖(ribose)、來蘇塘(lyxose)、木糖(xylose)、阿拉伯糖(arabinose)、芹菜糖(apiose)、核酮糖(ribulose)、木酮糖(xylulose)等。作為己糖的具體例子，可以舉出阿洛糖(allose)、塔羅糖(talose)、古羅糖(gulose)、葡萄糖(glucose)、阿卓糖(altrose)、甘露糖(mannose)、半乳糖(Galactose)、艾杜糖(idose)、阿洛酮糖(psicose)、果糖(fructose)、山梨糖(sorbose)、塔格糖(tagatose)等。作為庚糖的具體例子，可以舉出景天庚酮糖(sedoheptulose)、馬桑糖(coriose)等。

進而，作為糖的衍生物，可以舉出去氧糖(Deoxy sugar)、糖醛酸(uronic acid)、醛糖酸(aldonic acid)、糖二酸(aldaric acid)、氨基糖(amino sugar)等。

作為去氧糖的具體例子，可以舉出去氧核糖(deoxyribose)、去氧葡萄糖(deoxyglucose)、奎諾糖(quinovose)、黃夾竹桃糖(thevetose)、鼠李糖(rhamnose)、鼠李樹膠糖(rhamnulose)、岩藻糖(fucose)、2-脫氧毛地黃糖(diginose)、毛地黃糖(digitalose)、毛地黃毒糖(digitoxose)、磁麻糖(cymarose)、阿比可糖(abequose)、蛔糖(ascarylose)、可立糖(colitose)、泊雷糖(paratose)、泰威糖(tyvelose)等。

另外，作為糖醛酸的具體例子，可以舉出葡糖醛酸(glucuronic acid)、古羅糖醛酸(guluronic acid)、甘露糖醛酸(mannuronic acid)、半乳糖醛酸(galacturonic acid)、艾杜糖醛酸(iduronic acid)等。

另外，作為醛糖酸的具體例子，可以舉出古洛糖酸(gulonic acid)、葡萄糖酸(gluconic acid)等。

另外，作為糖二酸的具體例子，可以舉出葡糖二酸(glucaric acid)、半乳糖二酸(galactaric acid)、甘露糖二酸(mannaric acid)等。

另外，作為氨基糖的具體例子，可以舉出葡糖胺(glucosamine)、氨基半乳糖(galactosamine)、唾液酸(sialic acid)、氨基糖醛酸(aminouronic acid)、胞壁酸(muramic acid)等。

含有大量糖醛酸、醛糖酸或糖二酸的多醣類顯現出酸性，被稱作酸性多醣類。

另外，上述單糖及其衍生物存在具有旋光異構體的情況。在該情況下，單糖及其衍生物可以為D型、L型中的任意一種旋光異構體。

對於本發明的多醣類，作為其組成糖，可以包含單糖(中性糖)、氨基糖、糖醛酸、醛糖酸、糖二酸、去氧糖。更具體而言，本發明的多醣類包含選自D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-甘露糖(D-Man)、D-核糖(D-Rib)、N-乙醯-D-氨基葡萄糖(D-GlcNAc)、N-乙醯-D-氨基半乳糖(D-GalNAc)、D-葡糖醛酸(D-GlcA)、L-鼠李糖(L-Rha)、L-岩藻糖(L-Fuc)、D-甘露糖醛酸(D-ManA)、以及L-古羅糖醛酸(L-GulA)所構成的群組的一種或多種為佳。

進而，本發明的多醣類至少含有鼠李糖作為其組成糖為佳。鼠李糖係去氧糖的一種，具有甘露糖的6位羥基被氫原子取代的結構。另外，鼠李糖天然存在L型的L-鼠李糖(L-Rha)。鼠李糖的合成路徑被特定在植物或細菌中，至今為止在包括昆蟲在內的動物中並未發現鼠李糖的合成路徑(參照非專利文獻1和非專利文獻2)。鼠李糖在本發明的多醣類中作為組成糖含有約5mol%~約50mol%(莫耳百分比)的比例，以含有約10mol%~約25mol%的比例較佳。

非專利文獻1：MF Giraud，JH Naismith. “The rhamnose pathway” Current opinion in structural biology (2000).

非專利文獻2：M Maki，R Renkonen. “Biosynthesis of 6-deoxyhexose glycans in bacteria” Soc Glycobiology (2004).

利用氣相層析質譜儀(GC/MS)進行多醣類的組成糖的分析。對利用氣相層析質譜儀得到的總離子層析圖(TIC)的峰面積和標準品進行比較，能夠計算出組成糖的含有量和含有率。具體而言，利用三氟乙酸(TFA)將多醣類水解並衍生化後使其乾燥硬化，然後利用氣相層析質譜儀(GC/MS)進行分析，由此能夠得到總離子層析圖。此處的衍生化，為公知的進行二乙基縮硫醛(diethyl dithioacetal)化和三甲基矽基(trimethylsilyl)化的方法。本發明的多醣類利用氣相層析質譜儀(GC/MS)得到的總離子層析圖中與L-鼠李糖對應的峰面積占整體峰面積的約5%~約50%較佳，更佳為占整體峰面積的約10%~約25%。

另外，本發明的多醣類以具有耐熱性較佳。在多醣類具有耐熱性的情況下，即使對多醣類進行熱處理，多醣類的免疫賦活作用也被維持。熱處理的溫度未加限定，例如為80℃~300℃，較佳為90℃~200℃，更佳為100℃~150℃。另外，熱處理的時間雖未加限定，為1分鐘~2小時，較佳為5分鐘~30分鐘。對於本發明的多醣類，確認了至少在進行100℃、30分鐘的熱處理後免疫賦活作用不會喪失。

另外，本發明的多醣類以具有耐高溫高壓性為佳。在多醣類具有耐高溫高壓性的情況下，即使對多醣類進行高溫高壓處理，多醣類的免疫賦活作用也不會喪失。所謂的高溫高壓處理，係指進行高溫且高壓的處理。高溫高壓處理的壓力未加限定，例如為0.1MPa~1000MPa，較佳為0.2MPa~100MPa。高溫高壓處理的溫度未加限定，例如為80℃~300℃，較佳為90℃~200℃，更佳為100℃~150℃。

高溫高壓處理包括利用擠壓機進行的處理。擠壓機也稱作混練擠壓機(kneading extruder)，使用於食品或飼料的加工中。本發明的多醣類為即使在利用擠壓機進行的處理下也不會喪失免疫賦活作用的多醣類為佳。擠壓機具備單軸型或多軸型的螺杆。具體而言，在擠壓機內利用螺杆將含有本發明的多醣類的組合物或其他原料混勻，並在實施高溫高壓處理的同時從沖模中擠出。

另外，本發明提供含有多醣類的組合物，其中，該多醣類源自昆蟲且具有免疫賦活作用。本發明的組合物以含有具免疫賦活作用的多醣的昆蟲的卵、幼蟲、蛹或成蟲為原料而製造。只要含有具免疫賦活作用的多醣，則昆蟲的變態階段沒有限定，但是適宜使用昆蟲的幼蟲或蛹。尤其以蛹為佳。這是因為：幼蟲的消化道內含有的大量未消化的物質可能會混入組合物中。本發明的組合物能夠以昆蟲的蛹為原料，並透過實施熱處理、高溫高壓處理、乾燥處理、粉碎處理等處理而製造。

本發明的組合物係為對選自昆蟲的卵、幼蟲、蛹及成蟲構成的群組中的一種或多種進行粉碎處理而得到的粉末或糊劑為佳，更佳為粉末。透過將本發明的組合物形成為粉末或糊劑，促進了被供給了本發明組合物的人或動物對於多醣類的吸收。另外，透過將本發明的組合物形成為粉末，該組合物的保存也變得容易。

另外，其他本發明的組合物係為透過從昆蟲中萃取具有免疫賦活作用的多醣類而製造。由於本發明的多醣類可溶於水，因此，在多醣類的萃取中使用水作為溶劑。萃取的溫度、壓力未加限定，也可以進行加熱萃取、減壓萃取或加壓萃取。即，本發明的組合物係為選自昆蟲的卵、幼蟲、蛹及成蟲構成的群組中的一種或多種中萃取的萃取物，以水萃取物為佳。該萃取物中含有具免疫賦活作用的多醣類。

另外，本發明的組合物中所含的多醣類可溶於水，且不溶於甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、己烷等極性低的溶劑。因此，本發明的組合物以使用極性低的溶劑除去昆蟲中所含的雜質後得到的物質為佳。即，本發明的組合物可以係為選自昆蟲的卵、幼蟲、蛹及成蟲構成的群組中的一種或多種中調製的、對於多醣類不溶性溶劑具不溶性之固形物。

具體而言，透過將昆蟲的卵、幼蟲、蛹或成蟲、較佳為昆蟲的卵、幼蟲、蛹或成蟲的粉末與多醣類不溶性溶劑混合，然後利用離心分離或吸引過濾等方法除去多醣類不溶性溶劑，由此能夠得到不溶性固形物。所謂的多醣類不溶性溶劑，係指多醣類不會溶於其中的溶劑，可以舉出甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、己烷、乙酸乙酯及它們的混合溶劑等極性低的溶劑。本工序也可以僅進行一次，但是，透過重複多次本工序，能夠提高組合物中的多醣類的含有率。

作為多醣類不溶性溶劑，較佳為使用醇類或醇類水溶液。醇類水溶液可以使用約50V%(體積百分比)以上的乙醇水溶液，具體而言可以使用約60V%以上、約70V%以上、約80V%以上、約90V%以上的醇類水溶液。即，本發明的組合物可以為選自昆蟲的卵、幼蟲、蛹及成蟲構成的群組中的一種或多種中調製的醇類不溶性固形物。

本發明的組合物能夠作為免疫賦活組合物而使用。即，可以作為以上述多醣為活性組分的免疫賦活劑，而提供用作醫藥品或健康食品、功能食品、動物用醫藥品、飼料、飼料添加劑、飼料原料，不僅能夠利用於人，也能夠利用於豬、牛、羊、山羊、雞等的畜產業，狗、貓等的寵物，真鯛、鰤魚、紅甘鰺、石斑魚、河豚、鮪魚、鰻鱺魚、蝦、蟹等的水產養殖業。

【實施例】

進而，以實施例對本發明進一步詳細地進行說明，但是本發明並不為實施例所限。

1.源自屬於雙翅目的昆蟲且具有免疫賦活作用的物質的鑑定

1.1.源自屬於果實蠅科(Tephritidae)的昆蟲且具有免疫賦活作用的物質的鑑定

對具有屬於雙翅目的昆蟲所含有且具免疫賦活能的免疫賦活作用之物質進行鑑定。對於昆蟲，使用了屬於果實蠅科(Tephritidae)的瓜實蠅(Bactrocera cucurbitae/Zeugodacus cucurbitae)的蛹。將瓜實蠅的蛹粉碎形成糊狀並進行離心分離，由此得到上清液部分(A)(supernatant fraction)。進而，利用旋轉蒸發儀進行減壓濃縮，添加四倍量的甲醇進行攪拌並進行離心，由此得到甲醇萃取部分(B)。另外，對作為沉澱物得到的醇類(甲醇)不溶性固形物進行水萃取，得到水萃取部分(C)。

在小鼠巨噬細胞株(RAW264細胞)的培養液中添加上述部分(A)、(B)及(C)，並對產生的一氧化氮量進行了測量。已知活化後的巨噬細胞會產生一氧化氮，從而將其作為免疫賦活的指標。另外，作為正控制組，使用已知具有免疫賦活作用的脂多糖(LPS)。如圖1所示，由於分別在以10⁴倍、10³倍、10²倍稀釋後的上清液部分(A)和水萃取部分(C)中確認到產生了一氧化氮，因此，可知在這些部分中含有具免疫賦活作用的物質。

對：利用為蛋白水解酶的蛋白酶K對上清液部分(A)進行處理後上清液部分(A)的免疫賦活作用的維持情況進行調查。如圖2所示，利用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)確認了在37℃和55℃的處理中蛋白質透過蛋白酶K處理而被分解。另一方面，由於巨噬細胞的一氧化氮的產量未發生變化，因此可知：具有免疫賦活作用的物質不是蛋白質，而是多醣類。

進而，使用DE52弱陰離子交換柱(Whatman公司製)並依次以0M、0.2M、0.5M以及1M的氯化鈉溶液對水萃取部分(C)進行了洗脫。利用苯酚-硫酸法對各洗脫部分中所含的總糖量進行了測量。另外，將洗脫部分進行稀釋並以利用小鼠巨噬細胞株進行的一氧化氮的產生作為指標，對各洗脫部分的免疫賦活作用進行了調查。如圖3所示，0.2M的氯化鈉溶液洗脫部分中顯現出了強免疫賦活作用。由於吸附於陰離子交換柱且利用0.2M氯化鈉溶液進行了洗脫，因此可知具有免疫賦活作用的物質為酸性。

進而，利用凝膠過濾層析法提純了0.2M的氯化鈉溶液洗脫部分。對於塔柱，使用了Superose 6 10/300 GL(分離範圍5×10³-5×10⁶)(GE Healthcare公司製)。利用苯酚-硫酸法對各洗脫部分中所含的總糖量進行了測量。另外，將洗脫部分進行稀釋並以利用小鼠巨噬細胞株進行的一氧化氮的產生作為指標，對各洗脫部分的免疫賦活作用進行了調查。如圖4所示，分子量大的部分顯現出了強免疫賦活作用。

將利用凝膠過濾層析法認定有免疫賦活作用的洗脫部分倒入高效液相色譜儀中，對分子量進行了測量。對於塔柱，使用了分離範圍為5億至1萬的Showdex(注冊商標)SB-807 HQ(昭和電工株式會社製)。如圖5所示，可知具有免疫賦活作用的物質為分子量約100萬(約1.0×10⁶)的多醣類。從1.0kg的瓜實蠅的蛹中提純了22.7mg的具有免疫賦活能的多醣類。

進而，將提純出的多醣類在2M的三氟乙酸(TFA)、100℃、16小時的條件下進行水解，將透過水解得到的單糖及其衍生物進行二乙基縮硫醛化以及三甲基矽基化，進而噴吹氮氣進行乾燥硬化後使其溶解於水中，並利用己烷進行萃取。使用HP-5柱(Agilent Technologies Japan，LTD.製)並利用氣相色譜-質譜聯用儀(GC/MS)對上述多醣的組成糖進行分析後，得到了圖6所示的圖譜的總離子層析圖(TIC)。計算出與總離子層析圖的峰對應的單糖及其衍生物的面積比，進而使用標準品計算出單糖及其衍生物的重量比和構成比(mol%、摩爾百分比)。

對於標準品，使用了D-阿拉伯糖(D-Ara)、D-木糖(D-Xyl)、L-鼠李糖(L-Rha)、L-岩藻糖(L-Fuc)、D-核糖(D-Rib)、D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-甘露糖(D-Man)、D-果糖(D-Fru)、D-葡萄糖醛酸(D-GlcA)、D-半乳糖醛酸(D-GalUA)、N-乙醯-D-氨基葡萄糖(D-GlcNAc)、N-乙醯-D-氨基半乳糖(D-GalNAc)、以及N-乙醯神經氨酸(NANA)。因此，表1中的“不詳(1)”~“不詳(3)”與上述標準品中的任意一個均不同。另外，多醣類的組成糖的重量比和構成比，以相對於與標準品一致的單糖及其衍生物的比進行表示。

由以上結果明確了：源自瓜實蠅的多醣類可溶於水但不溶於約80V%(體積百分比)的甲醛水溶液，且為酸性多醣類，進而平均分子量為約100萬(約1.0×10³ kDa)，並且，作為其組成糖，至少含有選自N-乙醯-D-氨基葡萄糖(D-GlcNAc)、N-乙醯-D-氨基半乳糖(D-GalNAc)、D-葡萄糖醛酸(D-GlcA)、L-鼠李糖(L-Rha)、L-岩藻糖(L-Fuc)、D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-甘露糖(D-Man)以及D-核糖(D-Rib)構成的群組中的一種或多種。另外，明確了：以總離子層析圖的峰面積比計算，L-鼠李糖含有約22.8%。

1.2.源自屬於家蠅科(Muscidae)的昆蟲且具有免疫賦活作用的物質的鑑定

對屬於雙翅目的昆蟲所含有的具免疫賦活能的多醣進行了鑑定。對於昆蟲，使用了屬於家蠅科(Muscidae)的蒼蠅 (Musca domestica)的蛹。利用與1.1.同樣的方法調製了水萃取部分。

利用凝膠過濾層析法提純了水萃取部分。對於塔柱，使用了Hiprep 26/60 Sephacryl S500(分離範圍4×10⁴-2×10⁷)(GE Healthcare公司製)。利用苯酚-硫酸法對各洗脫部分中所含的總糖量進行了測量。另外，將洗脫部分進行稀釋並以利用小鼠巨噬細胞株進行的一氧化氮的產生作為指標，對各洗脫部分的免疫賦活作用進行了調查。如圖7所示，得到了顯現免疫賦活作用的部分。可知：蒼蠅含有大量顯現免疫賦活作用的多醣類。由凝膠過濾層析的結果預測了：蒼蠅中所含的多醣類的分子量為約180萬(1.8×10⁶)(洗脫部分13~洗脫部分17)、以及約30萬(3.0×10⁵)(洗脫部分23~洗脫部分27)。

由以上結果明確了：在屬於雙翅目的昆蟲中含有具免疫賦活作用的多醣類。

2.源自屬於鱗翅目的昆蟲且具有免疫賦活作用的物質的鑑定

2.1.源自屬於天蠶蛾科的昆蟲且具有免疫賦活作用的物質的鑑定

對屬於鱗翅目的昆蟲所含有的具免疫賦活能的多醣進行了鑑定。對於昆蟲，使用了屬於天蠶蛾科(Saturniidae)的樟蠶(Antheraea yamamai)的蛹。利用與1.1.同樣的方法調製了水萃取部分。

將水萃取部分倒入DEAE陰離子交換柱(Hiprep DEAE FF 16/10、GE Healthcare公司製)中，利用0M~0.6M的氯化鈉的濃度梯度使水萃取部分洗脫。利用苯酚-硫酸法對各洗脫部分中所含的總糖量進行了測量。另外，將洗脫部分進行稀釋並以利用小鼠巨噬細胞株進行的一氧化氮的產生作為指標，對各洗脫部分的免疫賦活作用進行了調查。將表示總糖量和氯化鈉濃度的圖表顯示於圖8中，將表示總糖量和免疫賦活作用的圖表顯示於圖9中。確認到了具有強免疫賦活作用的洗脫部分。由於吸附於陰離子交換柱且利用0M~0.6M的氯化鈉溶液進行了洗脫，因此可知具有免疫賦活作用的物質為酸性。

進而，利用凝膠過濾層析法提純了具有免疫賦活作用的洗脫部分。對於塔柱，使用了Hiprep 26/60 Sephacryl S500(分離範圍4×10⁴-2×10⁷)(GE Healthcare公司製)。利用苯酚-硫酸法對各洗脫部分中所含的總糖量進行了測量。另外，將洗脫部分進行稀釋並以利用小鼠巨噬細胞株進行的一氧化氮的產生作為指標，對各洗脫部分的免疫賦活作用進行了調查。如圖10所示，分子量大的部分顯現出了免疫賦活作用。

進而，將利用凝膠過濾層析法認定有免疫賦活作用的洗脫部分倒入高效液相色譜儀中，對分子量進行了測量。對於塔柱，使用了分離範圍為5億至1萬的Showdex(注冊商標)SB-807 HQ(昭和電工株式會社製)。如圖11所示，可知具有免疫賦活作用的物質為平均分子量約31萬(約3.1×10⁵)的多醣類。

進而，利用與1.1.同樣的方法並使用氣相色譜-質譜聯用儀(GC/MS)對該多醣類的組成糖進行分析後，得到了圖12所示的圖譜的總離子層析圖(TIC)。計算出與總離子層析圖的峰對應的單糖及其衍生物的面積比。

對於標準品，使用了D-阿拉伯糖(D-Ara)、D-木糖(D-Xyl)、L-鼠李糖(L-Rha)、L-岩藻糖(L-Fuc)、D-核糖(D-Rib)、D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-甘露糖(D-Man)、D-果糖(D-Fru)、D-葡萄糖醛酸(D-GlcA)、D-半乳糖醛酸(D-GalUA)、N-乙醯-D-氨基葡萄糖(D-GlcNAc)、N-乙醯-D-氨基半乳糖(D-GalNAc)、以及N-乙醯神經氨酸(NANA)。因此，表2中的“不詳(1)”~“不詳(6)”與上述標準品中的任意一個均不同。

由以上結果明確了：源自天蠶的多醣類可溶於水但不溶於約80V%(體積百分比)的甲醛水溶液，且為酸性多醣，進而平均分子量為約31萬(約3.10×10⁵)，並且，作為其組成糖，至少含有選自D-甘露糖醛酸(D-ManA)、L-古羅糖醛酸(L-GulA)、L-鼠李糖(L-Rha)、L-岩藻糖(L-Fuc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-葡萄糖(D-Glc)以及D-甘露糖構成的群組中的一種或多種。另外，明確了：以總離子層析圖的峰面積比計算，L-鼠李糖含有約12.9%。

2.2.源自屬於蠶蛾科的昆蟲且具有免疫賦活作用的物質的鑑定

對屬於鱗翅目的昆蟲所含有的具免疫賦活能的多醣進行了鑑定。對於昆蟲，使用了屬於蠶蛾科(Bombycidae)的蠶(Bombyx mori)的蛹。利用與1.1.同樣的方法調製了水萃取部分。

將水萃取部分倒入DEAE陰離子交換柱(Hiprep DEAE FF 16/10、GE Healthcare公司製)中，利用0M~1.0M的氯化鈉的濃度梯度使水萃取部分洗脫。利用苯酚-硫酸法對各洗脫部分中所含的總糖量進行了測量。另外，將洗脫部分進行稀釋並以利用小鼠巨噬細胞株進行的一氧化氮的產生作為指標，對各洗脫部分的免疫賦活作用進行了調查。將表示總糖量和氯化鈉濃度的圖表顯示於圖13中，將表示總糖量和免疫賦活作用的圖表顯示於圖14中。確認到了具有強免疫賦活作用的洗脫部分。由於吸附於陰離子交換柱且利用0M~1.0M的氯化鈉溶液進行了洗脫，因此可知具有免疫賦活作用的物質為酸性。

進而，利用凝膠過濾層析法提純了具有免疫賦活作用的洗脫部分。對於塔柱，使用了Hiprep 26/60 Sephacryl S500(分離範圍4×10⁴-2×10⁷)(GE Healthcare公司製)。利用苯酚-硫酸法對各洗脫部分中所含的總糖量進行了測量。另外，將洗脫部分進行稀釋並以利用小鼠巨噬細胞株進行的一氧化氮的產生作為指標，對各洗脫部分的免疫賦活作用進行了調查。如圖15所示，分子量大的部分顯現出了免疫賦活作用。

另外，預測到該利用凝膠過濾層析法認定具有免疫賦活作用的部分與2.1.中的利用凝膠過濾層析法認定具有免疫賦活作用的部分相同。因此，明確了蠶中也含有具免疫賦活作用的多醣類，並且該多醣類的分子量為約31萬(約3.10×10⁵)。

由以上結果明確了在屬於鱗翅目的昆蟲中也含有具免疫賦活作用的多醣類。

3.屬於鞘翅目的昆蟲所具有的免疫賦活作用的驗證

為了驗證屬於其他分類的昆蟲中是否也含有本發明的具有免疫賦活作用的多醣類，使用屬於鞘翅目的昆蟲對免疫賦活作用進行了調查。使用了屬於鞘翅目(甲蟲目)(Coleoptera)多食亞目(Polyphaga)金龜總科(Scarabaeoidea)金龜子科(Scarabaeidae)的獨角仙(Trypoxylus dichotomus)的蛹。在利用與1.相同的方法調製了上清液部分並以利用小鼠巨噬細胞株進行的一氧化氮的產生作為指標對稀釋的上清液部分中的免疫賦活作用進行了調查後，如圖16所示確認到了免疫賦活作用。因此認為：與屬於雙翅目的昆蟲或屬於鱗翅目的昆蟲同樣地，屬於鞘翅目的昆蟲也含有具免疫賦活作用的多醣類。

4.免疫賦活作用的驗證

將本發明的多醣類所具有的免疫賦活作用與已知具有免疫賦活作用的脂多糖進行了比較。利用上述方法從瓜實蠅中提純本發明的多醣類，並將小鼠巨噬細胞株的一氧化氮的產量與脂多糖進行了比較。將結果表示於圖17中。在 100pg/mL的脂多糖中基本未觀察到巨噬細胞的一氧化氮的產出，而另一方面，從瓜實蠅中提純的多醣即使是100pg/mL也引起了一氧化氮的產出。因此，認為本發明的多醣類具有非常強的免疫賦活作用。

5.本發明的組合物的耐熱性的驗證

對本發明的多醣類的耐熱性進行了驗證。將從瓜實蠅的蛹得到的上清液部分在100℃下熱處理0分鐘~30分鐘，並對利用小鼠巨噬細胞株進行的一氧化氮的產量進行了測量。如圖18所示，即使在100℃下熱處理了30分鐘，本發明的多醣類的免疫賦活作用也不會喪失，因此可知本發明的多醣類具有高耐熱性。

6.昆蟲變態階段中的免疫賦活作用的變化

對本發明的多醣類的免疫賦活作用根據昆蟲變態階段的不同如何變化這一情況進行了調查。將瓜實蠅的第三天、第四天、第五天、第六天的幼蟲、蛹化第一天、第二天、第三天、第四天的蛹分別粉碎形成糊狀，並得到透過離心分離而得到的上清液部分，然後以10倍稀釋、100倍稀釋、或1000倍稀釋的方式對小鼠巨噬細胞株添加上清液部分，並對一氧化氮的產量進行了測量。如圖19所示，尤其在初期的幼蟲和後期的蛹中確認到了強免疫賦活作用，並在幼蟲~蛹的全部時期中均確認到了免疫賦活作用，因此，認為昆蟲含有在這些時期具有免疫賦活作用的多醣類。

7.由本發明的多醣類產生的免疫賦活作用機制的分析

對本發明的多醣類所具有的免疫賦活作用經由動物的巨噬細胞的哪一個受體產生這一情況進行了調查。利用針對類鐸受體2(Toll-like Receptor 2)的抗體(anti-mTLR2)、或針對類鐸受體4(Toll-like Receptor 4)的抗體(anti-mTLR4)來處理巨噬細胞，並以呈1ng/ml的分量添加源自瓜實蠅的多醣或LPS(脂多糖)，對一氧化氮的產量進行了測量。將結果表示於圖20中。由於在利用針對類鐸受體4(Toll-like Receptor 4)的抗體處理後的巨噬細胞中一氧化氮的產量有意(非偶然)地下降，因此，表示由本發明的多醣類產生的免疫賦活作用至少經由類鐸受體4(Toll-like Receptor 4)實現。

8.利用含有本發明的多醣類的飼料進行的真鯛飼養試驗

對利用含有本發明的多醣類的飼料是否會提高真鯛的耐病性這一情況進行了調查。將尾叉長約10cm、魚體重約25g的真鯛個體每十二條收容到水槽中。以使源自瓜實蠅的多醣的濃度分別為0.001ug/g、0.01ug/g、0.1ug/g、1ug/g的方式製造飼料並供給真鯛。在飼養四周後，對真鯛的腹腔內接種作為引起愛德華氏症的革蘭氏陰性菌的Edwardsiella tarda(愛德華氏菌)5.0×10⁵ cell使其強制感染，並對生存數量進行計測。將結果表示於圖21中。與控制組(control group)相比較，以含有源自瓜實蠅的多醣的飼料飼養下的真鯛的生存率均高。因此，認為透過源自瓜實蠅的多醣所具有的的免疫賦活作用，真鯛獲得了相對於Edwardsiella tarda(愛德華氏菌)的耐病性。

Claims

一種多醣類，其源自昆蟲且具有免疫賦活作用。
如申請專利範圍第1項所述之多醣類，其中該多醣類至少含有鼠李糖作為組成糖。
如申請專利範圍第1或2項所述之多醣類，其中該昆蟲係選自雙翅目、鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、直翅目及蜻蜓目所構成的群組中的一種或多種。
如申請專利範圍第1或2項所述之多醣類，其中該昆蟲係選自雙翅目、鱗翅目及鞘翅目所構成的群組中的一種或多種。
如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之多醣類，其中該昆蟲係表現出對於至少植物的食性。
如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之多醣類，其中該多醣類具有耐熱性。
如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之多醣類，其中該多醣類具有耐高溫高壓性。
如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之多醣類，其中該多醣類之平均分子量為約1.0×10⁵~約1.0×10⁷。
如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之多醣類，其中該免疫賦活作用是經由類鐸受體4(Toll-like Receptor 4)實現。
一種組合物，含有如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之多醣類。
如申請專利範圍第10項所述之組合物，其中該組合物係為選自昆蟲的卵、幼蟲、蛹及成蟲所構成的群組中的一種或多種的粉末。
如申請專利範圍第10項所述之組合物，其中該組合物係為選自昆蟲的卵、幼蟲、蛹及成蟲所構成的群組中的一種或多種中所萃取的萃取物。
如申請專利範圍第10項所述之組合物，其中該組合物係為選自昆蟲的卵、幼蟲、蛹及成蟲所構成的群組中的一種或多種中所得的醇類不溶性固形物。
一種免疫賦活劑，含有如申請專利範圍第10至13項中任一項所述之組合物，以該多醣類作為活性成分。