JP6240993B2 - 多糖類、多糖類を含む組成物、及び免疫賦活剤 - Google Patents
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Description
非特許文献2:M Maki, R Renkonen. “Biosynthesis of 6-deoxyhexose glycans in bacteria” Soc Glycobiology (2004).
1.1.ミバエ科(Tephritidae)に属する昆虫に由来する免疫賦活作用を有する物質の同定
双翅目に属する昆虫が含有し、免疫賦活能を有する免疫賦活作用を有する物質の同定を行った。昆虫には、ミバエ科(Tephritidae)に属するウリミバエ(Bactrocera cucurbitae/Zeugodacus cucurbitae)の蛹を用いた。ウリミバエの蛹を粉砕してペースト状にし、遠心分離し、上清画分(A)を得た。さらに、ロータリエバポレータを用いて減圧濃縮を行い、4倍量のメタノールを添加して撹拌し、遠心してメタノール抽出画分(B)を得た。また、沈殿物として得られたアルコール(メタノール)不溶性固形物に対して水抽出を行い、水抽出画分(C)を得た。
双翅目に属する昆虫が含有し、免疫賦活能を有する多糖の同定を行った。昆虫には、イエバエ科(Muscidae)に属するイエバエ(Musca domestica)の蛹を用いた。1.1.と同様の方法により水抽出画分を調整した。
2.1.ヤママユガ科に属する昆虫に由来する免疫賦活作用を有する物質の同定
鱗翅目に属する昆虫が含有し、免疫賦活能を有する多糖の同定を行った。昆虫には、ヤママユガ科(Saturniidae)に属するヤママユ(Antheraea yamamai)の蛹を用いた。1.1.と同様の方法により水抽出画分を調整した。
鱗翅目に属する昆虫が含有し、免疫賦活能を有する多糖の同定を行った。昆虫には、カイコガ科(Bombycinae)に属するカイコガ(Bombyx mori)の蛹を用いた。1.と同様の方法により水抽出画分を調整した。
他の分類に属する昆虫にも本発明の免疫賦活作用を有する多糖類が含まれているかを検証するため、鞘翅目に属する昆虫を用いて免疫賦活作用を調べた。鞘翅目(甲虫目)(Coleoptera)多食亜目(Polyphaga)コガネムシ上科(Scarabaeoidea)コガネムシ科(Scarabaeidae)に属するカブトムシ(Trypoxylus dichotomus)の蛹を用いた。1.と同様の方法により上清画分を調整し、希釈した上清画分における免疫賦活作用をマウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出を指標として調べたところ、図16に示すように免疫賦活作用が確認された。したがって、鞘翅目に属する昆虫にも、双翅目に属する昆虫や鱗翅目に属する昆虫と同様に、免疫賦活作用を有する多糖類が含まれていると考えられた。
本発明の多糖類が有する免疫賦活作用を、免疫賦活作用を有することが知られているリポ多糖と比較した。上述の方法でウリミバエから本発明の多糖類を精製し、マウスマクロファージ細胞株の一酸化窒素の産出量をリポ多糖と比較した。結果を図17に示す。100 pg/mLのリポ多糖では、ほとんどマクロファージの一酸化窒素の産出がみられなかった一方で、ウリミバエから精製された多糖は100pg/mLでも一酸化窒素の産出を誘導した。したがって、本発明の多糖類には非常に強い免疫賦活作用が認められた。
本発明の多糖類の耐熱性を検証した。ウリミバエ蛹から得られた上清画分を100℃で0分〜30分熱処理し、マウスマクロファージ細胞株による一酸化窒素の産出量を測定した。図18に示すように、100℃で30分熱処理しても本発明の多糖類の免疫賦活作用が失われなかったことから、高い耐熱性を有することがわかった。
本発明の多糖類の免疫賦活作用が、昆虫の変態段階によってどのように変化するかを調べた。ウリミバエの3日目・4日目・5日目・6日目の幼虫、蛹化1日目・2日目・3日目・4日目の蛹をそれぞれ粉砕してペースト状にし、遠心分離により得られた上清画分を得て、マウスマクロファージ細胞株に、10倍希釈、100倍希釈、又は1,000倍希釈になるように添加し、一酸化窒素の産出量を測定した。図19に示すように、特に初期の幼虫と後期の蛹で高い免疫賦活作用が認められたが、幼虫〜蛹の全ての時期で免疫賦活作用が認められたことから、昆虫は、これらの時期で免疫賦活作用を有する多糖類を含有していると考えられた。
本発明の多糖類の有する免疫賦活作用が、動物のマクロファージのどの受容体を介して起こるかを調べた。Toll-like Receptor 2に対する抗体(anti-mTLR2)、又はToll-like Receptor 4に対する抗体(anti-mTLR4)でマクロファージを処理し、ウリミバエ由来多糖、又はLPSを1ng/mLになるように添加し、一酸化窒素の産出量を測定した。結果を図20に示す。Toll-like Receptor 4に対する抗体で処理したマクロファージで一酸化窒素の産出量が有意に低下したため、本発明の多糖類による免疫賦活作用は、少なくともToll-like Receptor 4を介していることが示された。
本発明の多糖類を含む飼料によりマダイの耐病性が向上するかどうかを調べた。マダイは尾叉長約10cm、魚体重約25gの個体を、各12尾ずつ水槽に収容した。ウリミバエ由来多糖の濃度がそれぞれ0.001 μg/g、0.01μg/g、0.1μg/g、1μg/gとなるように飼料を作製し、マダイに供与した。4週間飼育した後に、マダイの腹腔内にエドワジエラ症を引き起こすグラム陰性菌であるEdwardsiella tardaを5.0×105 cellを接種して強制感染させ、生存数を計測した。結果を図21に示す。ウリミバエ由来多糖を含んだ飼料は、対照群に比べていずれも生存率が高かった。したがって、ウリミバエ由来多糖の有する免疫賦活作用により、マダイがEdwardsiella tardaに対する耐病性を獲得したと考えられた。
Claims (7)
- 双翅目に属する昆虫由来で免疫賦活作用を有し、水に可溶であり、酸性を示し、分子量が約30万〜約180万であって、構成糖として少なくともラムノースを約10モル%〜約25モル%の割合で含有する多糖類
- 前記昆虫が、ミバエ科、イエバエ科、及びミズアブ科から選ばれる一又は複数である、請求項1に記載の多糖類
- 耐熱性を有する、請求項1又は請求項2に記載の多糖類
- 高温高圧耐性を有する、請求項1〜請求項3いずれか一項に記載の多糖類
- 前記免疫賦活作用がToll-like Receptor 4を介したものである、請求項1〜請求項4いずれか一項に記載の多糖類
- 昆虫の卵、幼虫、蛹、又は成虫の粉末からなる群から選択される1又は複数を、請求項1〜請求項5いずれか一項に記載の多糖類が不溶である溶媒と混合し、前記溶媒を取り除くことによって前記溶媒に不溶性の固形物を得る、前記多糖類を含有する組成物の製造方法
- 請求項6に記載の組成物の製造方法を含む、前記多糖類を有効成分とし、前記組成物を含有する免疫賦活剤の製造方法
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