WO2014007400A1 - 花芽形成を促進する方法 - Google Patents

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WO2014007400A1
WO2014007400A1 PCT/JP2013/068800 JP2013068800W WO2014007400A1 WO 2014007400 A1 WO2014007400 A1 WO 2014007400A1 JP 2013068800 W JP2013068800 W JP 2013068800W WO 2014007400 A1 WO2014007400 A1 WO 2014007400A1
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plant
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protein
seq
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PCT/JP2013/068800
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Inventor
中村典子
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サントリーホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01029—Geranylgeranyl diphosphate synthase (2.5.1.29)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an early flowering plant, which comprises a step of introducing a polynucleotide encoding a protein having an activity of promoting flower bud formation into a plant cell.
  • the present invention also relates to a plant flowering promoter comprising a gene encoding a protein having an activity of promoting flower bud formation.
  • the scent of flowers consists of a mixture of a plurality of fragrance components (Non-patent Documents 1 and 2).
  • Non-patent Documents 1 and 2 a series of compounds belonging to a group called terpenoids are often important as aromatic components, and in particular, geraniol and linalool, which are monoterpenes, are contained in many flowers having a sweet floral scent such as roses and lily of the valley.
  • geraniol and linalool which are monoterpenes
  • MVA mevalonic acid
  • MEP methylerythritol
  • acetyl CoA reacts with the other two molecules of acetyl CoA and is reduced and synthesized through mevalonate.
  • Mevalonic acid is decarboxylated into isopentenyl pyrophosphate (hereinafter referred to as IPP) and dimethylallyl pyrophosphate (hereinafter referred to as DMAPP), and these two are the origin of the isoprene skeleton which is the basic structure of terpenoid compounds.
  • IPP and DMAPP are synthesized from 2-phosphoglyceraldehyde and pyruvic acid via 2-methyl-erythritol-4-phosphate (MEP) generated through decarboxylation and isomerization.
  • MEP 2-methyl-erythritol-4-phosphate
  • GPPS geranyl pyrophosphate synthase
  • GPP geranyl pyrophosphate
  • GES geraniol synthase
  • monoterpenes such as geraniol and linalool are produced by the action of monoterpene synthases such as linalool synthase (hereinafter referred to as LIS). (See FIG. 1).
  • Non-Patent Document 3 Non-Patent Document 3
  • Hd3a corresponding to FT has been found in rice, and these proteins are synthesized in leaves, which are known to move to the shoot apex and induce flower bud differentiation
  • Non-patent Document 5 chrysanthemum overexpressing the FT gene has come to flower even in tissue-cultured seedlings under long day conditions where chrysanthemum does not normally flower.
  • Many plants have genes corresponding to FT.
  • SFT and PtFT are obtained from tomato and poplar (Populus trichocarpa), respectively. Similar genes have also been obtained from citrus unshiu and the like. When these genes are constitutively overexpressed in plants, there has been a report that flowering was promoted by Arabidopsis, rice, Karatachi (Poncitrus trifolate), etc. (Non-patent Documents 6 and 7).
  • Non-patent Document 7 citrus and other fruit trees usually take several years from germination to flowering, but the recombinant orange introduced with the FT gene flowered in six months to one year. From the above, it is considered that the functions of the FT gene and other plant genes corresponding to the FT gene can exert the function of promoting flowering beyond species, and the FT gene and other plant genes corresponding thereto can be used. For example, it is expected that the generation change will be promoted and the time required for breed improvement will be shortened (Patent Document 2).
  • Non-patent Document 8 Non-patent Document 8
  • subsequent subculture is extremely difficult. This is a major disadvantage for plants that are usually grown and cultivated with cuttings, especially carnations.
  • the present inventors introduced a polynucleotide encoding a geranyl pyrophosphate synthase large subunit necessary for biosynthesis of a monoterpene into a plant cell, and generated a plant from the resulting transformed cell.
  • the plant is flowering at the seedling stage, and the flowering of the plant can be promoted by constitutively expressing the polynucleotide encoding the geranyl pyrophosphate synthase large subunit in the host plant. I found.
  • the present invention is based on the above findings.
  • a method for producing an early flowering plant comprising a step of introducing a polynucleotide encoding the following protein into a plant cell.
  • A a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • B a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 110 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity of promoting flower bud formation;
  • C a protein having an amino acid sequence having 70% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity of promoting flower bud formation
  • the plant is the same type of non-transformed plant The method according to [1] above, wherein the flowering occurs at an early growth stage as compared with the above.
  • a plant flowering promoter comprising at least one of the following proteins and polynucleotides encoding the following proteins: (A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (B) a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 110 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity of promoting flower bud formation; (C) a protein having an amino acid sequence having 70% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity of promoting flower bud formation [8] The polynucleotide is inserted into an expression vector The flowering promoter according to [7], wherein [9] The flowering promoter according to [7], wherein the protein is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • A a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • B a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 110 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity of promoting flower bud formation
  • C Effect of the protein invention having an amino acid sequence having 70% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity of promoting flower bud formation
  • the time required for flowering of a plant can be greatly shortened, and a flower can be attached at a stage where the plant body is small.
  • the time required for the formation of fruits and seeds can be shortened.
  • the method of the present invention makes it possible to produce a plant that does not exist in nature and that blooms at an early stage of growth compared to the wild type.
  • FIG. 3A shows the flowering state of the pSPB5505 introduction system.
  • FIG. 3A shows the flowering state of the host (CWP system) and the pSPB4613 introduction system.
  • part (broken line) for the proliferation by the cutting of the plant of this invention is shown.
  • the present invention relates to an early flowering plant comprising a step of introducing a polynucleotide encoding a protein having a geranyl pyrophosphate synthase large subunit into a plant cell.
  • a manufacturing method is provided.
  • Examples of the “polynucleotide encoding a protein having an activity of promoting flower bud formation” in the present invention include the following.
  • A a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • B The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which 1-110 amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and encodes a protein having an activity of promoting flower bud formation A polynucleotide;
  • C a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 70% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity of promoting flower bud formation;
  • D a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 1; and
  • SEQ ID NO: 2 The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 described above in (a) has been known so far as the amino acid sequence of the large subunit of geranyl pyrophosphate synthase derived from Qualcomm (variety: Maryland True Pink). . Further, SEQ ID NO: 1 described in (d) above is known as the CDS sequence of the gene encoding the geranyl pyrophosphate synthase large subunit.
  • the protein described in (b) or (c) above is typically a naturally occurring mutant of the protein of SEQ ID NO: 2 or a geranyl pyrophosphate synthase large subunit homologue of a heterologous plant other than snapdragon.
  • a naturally occurring mutant of the protein of SEQ ID NO: 2 or a geranyl pyrophosphate synthase large subunit homologue of a heterologous plant other than snapdragon For example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Pres 2001”, “Ausubel, Current Protocol. , 10, 6487 (1982) ",” Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 79, 6409 (1982) “,” Gene, 34, 315 (1985) ",” Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) ",” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 “. , 488 (1985) "etc., and those that can be obtained artificially using the site-
  • Examples of geranyl pyrophosphate synthase large subunit homologues of heterologous plants other than Qualcomm include, but are not limited to, those shown in the following table.
  • a protein having an amino acid sequence in which 1 to 110 amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are deleted, substituted, inserted and / or added, and having an activity of promoting flower bud formation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 1-110, 1-100, 1-90, 1-80, 1-70, 1-60, 1-50 1-40, 1-39, 1-38, 1-37, 1-36, 1-35, 1-34, 1-33, 1-32, 1-31 1-30, 1-29, 1-28, 1-27, 1-26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11 1 ⁇ 10, 1 ⁇ 9 (1 ⁇ number ) 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, or 1 amino acid residue deleted, substituted, It may be a protein consisting of an inserted and / or added amino acid sequence and having an activity of
  • Such a protein includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% Or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% Examples thereof include a protein having an amino acid sequence having the above or 99.9% identity and having an activity of promoting flower bud formation. In general, the larger the numerical value of identity, the better.
  • the “protein having the activity of promoting flower bud formation” has a function of promoting flowering of the host plant when it is expressed in the cells of the host plant.
  • the function of promoting the flowering of a host plant is to produce a transformed plant that constitutively expresses the polynucleotide by introducing the polynucleotide of the present invention into the host plant, and the transformed plant is the same kind of non-transformed plant. Compared with, it can be confirmed by verifying whether it blooms at an earlier growth stage.
  • the plant according to the method of the present invention is flowered at a growth stage of 60% or less, more preferably 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, compared to a non-transformed plant of the same species.
  • the “growth stage” can be represented, for example, by the time elapsed from the time when the shoot is formed from the germinated or undifferentiated cell bud or the time when the vegetative growth of the bud starts.
  • the “growth stage” can be represented, for example, by the sunshine time required for a plant to flower.
  • the same kind of non-transformed plant may require 200 hours of sunshine until flowering.
  • the plant according to the present invention will flower with a sunshine time of 120 hours or less.
  • the “growth stage” can be represented by, for example, the number of nodes of a stem of a plant individual.
  • the non-transformed plant of the same kind has grown to the number of stem nodes of 20 at the stage.
  • the “growth stage” can be represented by, for example, the length of a stem of a plant individual. In this case, when the plant according to the present invention blooms at a growth stage of 60% or less as compared with the non-transformed plant of the same species, the non-transformed plant of the same species has grown to a stem length of 20 cm. If the plant is flowered, the plant according to the present invention will bloom with a stem length of 12 cm or less. Further, the “growth stage” can be represented by, for example, a cross-sectional area of a stem of a plant individual.
  • the plant according to the present invention blooms at a growth stage of 60% or less compared to the same kind of non-transformed plant, the same kind of non-transformed plant grew to a cross-sectional area of 20 cm 2 in stem. If it blooms in a stage, the plant according to the present invention will bloom with a stem cross-sectional area of 12 cm 2 or less.
  • the “growth stage” can be expressed, for example, by the length of the root of a plant individual. In this case, when the plant according to the present invention is flowered at a growth stage of 60% or less compared to the same kind of non-transformed plant, the same kind of non-transformed plant has grown to a root length of 10 cm.
  • the plant according to the present invention will flower with a stem length of 6 cm or less.
  • the “growth stage” can be expressed, for example, by the number of true leaves of a plant individual. In this case, in the case where the plant according to the present invention blooms at a growth stage of 60% or less as compared with the non-transformed plant of the same species, the non-transformed plant of the same species has grown to 20 true leaves. If it blooms at a stage, the plant according to the present invention will bloom with 12 or less true leaves.
  • the above numerical values relating to the growth stage do not necessarily have to be exact, and may include an error of ⁇ 5%.
  • the plant body of this invention forms a bud and forms a flower bud after that, it can be made to proliferate by cutting by cutting the part (broken-line part of FIG. 4) containing a bud. Therefore, when the plant of the present invention is used, plants of the same strain can be easily grown. If such a characteristic is used, it is possible to select a strain in which a flower of a grower's desired color and shape blooms and to easily grow the strain.
  • deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the protein of the present invention means that one at any position in the same sequence and one or more amino acid sequences. Or it means that there are deletion, substitution, insertion and / or addition of a plurality of amino acid residues, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously. Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • group C asparagine, glutamine;
  • group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Group F serine, threonine, homoserine;
  • Group G phenylalanine, tyrosine.
  • polynucleotide means DNA or RNA.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions encodes a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • stringent conditions may be any of low stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C.
  • Medium stringent conditions are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C. or 5 ⁇ SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5). , 50% formamide, 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, (1) 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C., (2) 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 60 ° C, (3) 0.2xSSC, 0.1% SDS, 62 ° C, (4) 0.2xSSC, 0.1% SDS, 65 ° C, or (5) 0.1xSSC, 0.1% SDS, 65 ° C Etc. Under these conditions, it can be expected that DNA having higher identity can be efficiently obtained as the temperature is increased.
  • factors affecting the stringency of hybridization include multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration, and those skilled in the art can select these factors as appropriate. By doing so, it is possible to achieve the same stringency.
  • Alkphos Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare) can be used, for example.
  • incubation with the labeled probe is performed overnight, and then the membrane is washed with a primary washing buffer containing 0.1% (w / v) SDS at 55 ° C. Subsequently, the hybridized DNA can be detected.
  • hybridizable polynucleotide encodes the DNA of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 when calculated using the default parameters by homology search software such as FASTA, BLAST, etc.
  • the above-described polynucleotide of the present invention can be obtained by a known genetic engineering technique or a known synthesis technique.
  • the polynucleotide of the present invention may be inserted into an expression vector.
  • Such an expression vector is usually (I) a promoter capable of transcription in a host cell; (Ii) the polynucleotide according to any one of (a) to (e) bound to the promoter; and (iii) a signal that functions in a host cell with respect to transcription termination and polyadenylation of an RNA molecule.
  • an expression cassette As an expression cassette. Therefore, the polynucleotide of the present invention may be introduced into a host cell in a state inserted in an expression vector.
  • a method for producing an expression vector a method using a plasmid, phage, cosmid or the like can be mentioned, but it is not particularly limited.
  • the specific type of the vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in the host cell can be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the polynucleotide of the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide of the present invention are incorporated into various plasmids or the like is used as an expression vector. Good.
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region (for example, a promoter, a terminator and / or an origin of replication) depending on the type of host to be introduced.
  • promoters for constitutively expressing a target gene in a host plant cell include the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter, the rd29A gene promoter, the rbcS promoter, and the enhancer sequence of the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter. Examples thereof include a mac-1 promoter added to the 5 ′ side of a bacterial mannopine synthase promoter sequence.
  • promoters that are inducibly activated by external stimuli include alcohol-inducible gene promoters, tetracycline-responsive promoters, metallothionein promoters, heat shock protein promoters, and the like.
  • the expression vector preferably contains at least one selectable marker.
  • markers include drug resistance markers (hygromycin, zeocin, kanamycin), geneticin resistance gene (G418r), herbicide resistance gene (SurB), copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. .Acad.Sci.USA, vol.81, p.337, 1984), cerulenin resistance gene (fas2m, PDR4) (respectively, Minoru Ogura, Biochemistry, vol.64, p.660, 1992; Hussain et al. , Gene, vol. 101, p. 149, 1991) can be used.
  • Plants to be transformed in the present invention include whole plants, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (eg epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, It means any of a palisade tissue, a spongy tissue, etc.) or a plant culture cell, or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, and the like.
  • the plant used for transformation is not particularly limited, and may be any plant belonging to the monocotyledonous plant class or the dicotyledonous plant class.
  • transformation methods known to those skilled in the art for example, Agrobacterium method, particle gun method, PEG method, electroporation method, etc.
  • Agrobacterium method for example, Agrobacterium method, particle gun method, PEG method, electroporation method, etc.
  • a method using Agrobacterium and a method for directly introducing it into plant cells are well known.
  • the constructed plant expression vector is introduced into an appropriate Agrobacterium (for example, Agrobacterium tumefaciens), and this strain is used as a leaf disk method (Hirofumi Uchimiya).
  • the plant genetic manipulation manual (1990), pages 27-31, Kodansha Scientific, Tokyo) can be used to infect sterile cultured leaf pieces to obtain transformed plants.
  • the method of Nagel et al (Micibiol. Lett., 67: 325 (1990)) can be used.
  • an expression vector is first introduced into Agrobacterium, and the transformed Agrobacterium is then introduced into Plant Molecular Biology Manual (Gelvin, SB et al., Academic Press Publishers). In this method, it is introduced into plant cells or plant tissues.
  • plant tissue includes callus obtained by culturing plant cells.
  • binary vectors pBI121, pPZP202, pBINPLUS, pBIN19, etc.
  • an electroporation method or a particle gun method is known.
  • a plant body, a plant organ, or a plant tissue itself may be used as it is, or may be used after preparing a section, or a protoplast may be prepared and used.
  • the sample prepared in this manner can be processed using a gene transfer apparatus (for example, PDS-1000 (BIO-RAD)).
  • the treatment conditions vary depending on the plant or sample, but are usually performed at a pressure of about 450 to 2000 psi and a distance of about 4 to 12 cm.
  • a cell or plant tissue into which a gene has been introduced is first selected for drug resistance such as hygromycin resistance, and then regenerated into a plant by a conventional method. Regeneration from a transformed cell to a plant can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cell.
  • transformation is performed by introducing an expression vector into the cultured cells by particle gun, electroporation or the like.
  • Callus, shoots, hairy roots, etc. obtained by transformation can be used as they are for cell culture, tissue culture or organ culture, and plants of appropriate concentration can be obtained by using conventionally known plant tissue culture methods. It can be regenerated into plants by administration of hormones (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.).
  • telomere length is a region of DNA sequence.
  • PCR is performed by designing a DNA-specific primer. PCR can be performed under the same conditions as those used for preparing the plasmid. Thereafter, the amplification product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., stained with ethidium bromide, SYBRGreen solution, etc., and the amplification product is detected as a single band for transformation. Can be confirmed.
  • PCR can be performed using a primer previously labeled with a fluorescent dye or the like to detect an amplification product.
  • offspring can be obtained by sexual or asexual reproduction of the plant.
  • seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc. can be obtained from the plant or its progeny, or clones thereof, and the plant can be mass-produced based on them. it can. Therefore, the present invention also provides a plant introduced so that the polynucleotide according to the present invention can be expressed, or a progeny of the plant having the same properties as the plant, or a tissue derived therefrom.
  • transformation methods for various plants have already been reported.
  • Examples of the transformed plant according to the present invention include solanaceous plants (eg, eggplant, tomato, capsicum, potato, tobacco, datura, physalis, petunia, calibracore, nielbergia), legumes (eg, soybean, azuki bean, peanut).
  • Preferred examples of the plant include ornamental plants, such as Nadesicoaceae plants (carnation, gypsophila etc.), crasidaceae plants (antirrhinum majus, torenia etc.), solanaceae plants (eg eggplant, tomato, capsicum, potato, tobacco, Datura, physalis, petunia, caribracore, neilbergia, etc.), legumes (eg, soybean, azuki bean, groundnut, kidney bean, broad bean, cricket), rose family (eg, strawberry, plum, cherry, rose, blueberry, black) Berries, bilberries, cassis, raspberries, etc.), asteraceae plants (chrysanthemum, gerbera, sunflower, daisy, etc.), orchidaceae plants (orchid, etc.), primrose plants (cyclamen, etc.), gentian plant (eustoma, gentian etc.), Iridaceae (free) Ai, iris
  • Plants produced by the method of the present invention can be viewed or sold in any of the soil growing state, potted plant state, cut flower state or flower-only state, and further, a part of the flower, for example, It is also possible to view or sell only the corolla, petals or buds.
  • the plant of the present invention is expected not only to flower at an early stage or at a stage where the plant body is small, but also to exhibit fruits at an early stage or at a stage where the plant body is small. In the plant appreciation field, depending on the type of plant, not only flowers but also their fruits are subject to appreciation. Therefore, high commercial value is also expected for the fruit of the plant of the present invention.
  • the plant of this invention can obtain a complete plant body easily by growing the seed, cutting, bulb, etc.
  • the plant of the present invention includes the whole plant body, plant organs (for example, leaves, petals, stems, roots, seeds, bulbs, etc.), plant tissues (for example, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, fences) Tissue, spongy tissue, etc.) or plant culture cells, or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, and the like.
  • the method of the present invention may further include a step of growing a transformed plant obtained by the above method. If the host plant used for gene transfer was a part of a plant such as a plant organ, plant tissue, plant cell, protoplast, leaf section or callus, transform the transformant until a complete plant is formed. It may be nurtured in an appropriate environment.
  • a complete plant from a part of the plant, reference can be made to the description in the following literature: Biochemical Experimental Method 41 Introduction to Plant Cell Engineering Society Publishing Center ISBN 4-7622-1899-5.
  • the present invention also provides a transformed plant into which any one of the polynucleotides (a) to (e) is introduced.
  • the transformed plant according to the present invention introduces an expression vector containing any one of the polynucleotides (a) to (e) into the plant so that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed. Obtained by.
  • the expression vector used for transformation of the plant body is not particularly limited as long as it is a vector capable of expressing the polynucleotide according to the present invention in the plant.
  • Such a vector examples include a vector having a promoter that constitutively expresses a polynucleotide in a plant cell or a vector having a promoter that is inducibly activated by an external stimulus. Specific examples of such vectors are as described above.
  • Processed products of plants of the present invention At present , not only fresh flowers (for example, soil-growing plants, potted plants, cut flowers, tissue culture seedlings, etc.) but also processed products of fresh flowers are sold as products for plant appreciation.
  • the plant of the present invention is also very useful as a material for such a processed product of fresh flowers.
  • another embodiment of the present invention includes processed products of the plants of the present invention (eg, fresh flowers, cut flowers) or parts thereof (eg, leaves, petals, stems, roots, seeds, bulbs, etc.).
  • Examples of the processed product include, but are not limited to, pressed flowers, dried flowers, preserved flowers, material flowers, and sealed resin products.
  • the present invention provides a plant flowering promoter.
  • the flowering promoter contains at least one of the protein of the present invention and a polynucleotide encoding the protein of the present invention as its component. That is, the flowering promoter may contain any one of the protein of the present invention and the polynucleotide encoding the protein of the present invention as a component thereof, or may contain both.
  • the polynucleotide of the present invention may be inserted into an expression vector.
  • the expression vector is as described above.
  • the method for introducing a polynucleotide, the method for confirming the introduced polynucleotide, and the plant to be promoted for flowering are as described above.
  • the present invention provides a method for promoting flowering of plant, comprising the step of introducing the polynucleotide of any one of (a) to (e) into a plant cell.
  • the polynucleotide of the present invention may be inserted into an expression vector.
  • the expression vector is as described above.
  • the method for introducing a polynucleotide, the method for confirming the introduced polynucleotide, and the plant to be promoted for flowering are as described above.
  • the method of the present invention may further include a step of growing a transformed plant obtained by the above method. If the host plant used for gene transfer was a part of a plant such as a plant organ, plant tissue, plant cell, protoplast, leaf section or callus, transform the transformant until a complete plant is formed. It may be nurtured in an appropriate environment.
  • a complete plant from a part of the plant, reference can be made to the description in the following literature: Biochemical Experimental Method 41 Introduction to Plant Cell Engineering Society Publishing Center ISBN 4-7622-1899-5.
  • nucleotide sequence of the obtained plasmid was determined, the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) encoding the amino acid sequence of AmGPPS / SSU (SEQ ID NO: 4) and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of AmGPPS / LSU (SEQ ID NO: 2) were determined. Plasmids containing (SEQ ID NO: 1) were obtained, and the plasmids were designated as pSPB3506 and pSPB1400.
  • binary vector pSPB5055 for expressing the AmGPPS ⁇ SSU gene in a plant was constructed by the following method. It is obtained by digesting pSPB1477 having the Mac1 promoter, carnation-derived S12A2 gene and mas terminator with pbaA and KpnI on pUCAA (WO2004 / 018682) with XbaI and KpnI, and then digesting pSPB3506 with XbaI and KpnI. An about 0.95 kb DNA fragment (AmGPPS / SSU gene) was ligated to obtain pSPB3513 having a Mac1 promoter, AmGPPS / SSU gene, and mas terminator on pUCAA.
  • pSPB3513 was digested with HindIII and PstI, the Mac1 promoter was removed. After digestion with HindIII and PstI, the obtained DNA fragment of about 0.8 kb (petunia-derived CHSA promoter) was ligated to obtain pSPB4609 having a petunia-derived CHSA promoter, AmGPPS / SSU gene, and mas terminator on pUCAA. Furthermore, pSPB4609 was digested with AscI, and the resulting DNA fragment of about 2.5 kb was ligated to the AscI site of pCGP1988 (Patent Publication 2009-201512) to obtain pSPB5055.
  • AscI AscI
  • a binary vector pSPB4618 for expressing AmGPPS • SSU gene and AmGPPS • LSU gene in a plant was constructed by the following method.
  • An about 1.3 kb DNA fragment (AmGPPS ⁇ LSU gene) obtained by digesting pSPB1400 with XbaI and KpnI was ligated to pSPB2311 (WO2007 / 049816) digested with XbaI and KpnI, and the Mac1 promoter and AmGPPS ⁇ LSU were put on pBINPLUS.
  • PSPB3514 having the gene, mas terminator was obtained.
  • this pSPB3514 was digested with HindIII, and then the Mac1 promoter was removed by partial digestion with EcoRI.
  • a binary vector pSPB4613 for expressing the AmGPPS / LSU gene in a plant was constructed by the following method.
  • pSPB4618 was digested with AscI and then dephosphorylated, and a DNA fragment of about 2.5 kb obtained by digesting pSPB4609 with AscI and XmnI was ligated to obtain pSPB4613.
  • the time required for plant flowering can be greatly shortened.
  • the time required for fruit formation can be shortened.
  • the method of the present invention makes it possible to produce a plant that does not exist in nature and blooms at an early growth stage.
  • Sequence number 5 Synthetic DNA Sequence number 6: Synthetic DNA SEQ ID NO: 7: synthetic DNA Sequence number 8: Synthetic DNA

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Abstract

　本発明は、生長の早期段階で開花する植物を提供することを目的とする。　本発明は花芽形成を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物細胞内に導入する工程を含む、早期に開花する植物の製造方法を提供する。

Description

花芽形成を促進する方法
　本発明は、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物細胞内に導入する工程を含む、早期に開花する植物の製造方法に関する。また、本発明は、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む、植物の開花促進剤に関する。
　花の色、形、日持ち性は、花卉植物、特に切花の商品価値を決める上で重要な特性であり、これまで花卉植物の育種においてこれらの特性を重視した開発が行われてきた。しかし、日持ちがよいことと香りがすることは相反する関係にあることが多く、日持ちを重視した開発過程において、従来の香りを失った、或いは、弱くなった品種は少なくない。このような状況の中、色・形・日持ち性に加え、優れた芳香を有する園芸植物は、高い商品価値を有することが期待され、開発が望まれる。
　花の香りは、複数の香気成分の混合物からなる（非特許文献１及び２）。なかでも、テルペノイドと呼ばれるグループに属する一連の化合物は香気成分として重要なものが多く、特に、モノテルペンであるゲラニオールやリナロールは、バラやスズランなど甘いフローラルな香りを有する多くの花に含まれる。
　モノテルペンの生合成経路は、植物では細胞質に存在するメバロン酸（ＭＶＡ）経路とプラスチドに存在するメチルエリスリトール（ＭＥＰ）経路の２種類が知られている。メバロン酸経路では、アセチルＣｏＡが他の２分子のアセチルＣｏＡと反応し、還元されて生じるメバロン酸を介して合成される。メバロン酸が脱炭酸してイソペンテニルピロリン酸（以下、ＩＰＰと表す）およびジメチルアリルピロリン酸（以下、ＤＭＡＰＰと表す）となり、この２つがテルペノイド化合物の基本構造であるイソプレン骨格の起源となる。一方、メチルエリスリトール経路では、３−ホスホグリセルアルデヒドとピルビン酸から脱炭酸、異性化を経て生じる２−メチル−エリスリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）を介してＩＰＰとＤＭＡＰＰが合成される。ゲラニルピロリン酸合成酵素（以下、ＧＰＰＳと表す）の作用により、ＤＭＡＰＰに一分子のＩＰＰが付加することで、ゲラニルピロリン酸（以下、ＧＰＰと表す）となり、ＧＰＰにゲラニオール合成酵素（以下、ＧＥＳと表す）やリナロール合成酵素（以下、ＬＩＳと表す）などのモノテルペン合成酵素が作用し、ゲラニオールやリナロールなどのモノテルペンが生成する。
（図１参照）。
　ところで、植物が花を咲かせるためには、それぞれの植物種に最適な温度や日長など様々な条件が必要となる。植物がどのように花を咲かせるのか、その仕組みが近年、モデル植物であるアラビドプシスを中心に明らかにされた。多くの遺伝子が植物の開花調節に関わっているが、なかでもアラビドプシス由来のＦＴ遺伝子が重要な機能を果たし、ＦＴの発現レベルが上昇すると、開花促進が起こることがすでに報告されている（特許文献１、非特許文献３）。また、イネではＦＴに相当するＨｄ３ａが見出されていて、これらのタンパク質は葉で合成され、それが茎頂に移動し、花芽分化を誘導することが知られている（非特許文献４）。たとえば、ＦＴ遺伝子を過剰発現したキクは、キクが通常開花しないような長日条件下での組織培養苗でも開花するようになった（非特許文献５）。また、多くの植物がＦＴに対応する遺伝子を持ち、例えば、トマトやポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）から、それぞれＳＦＴ、ＰｔＦＴと名づけられた遺伝子が得られていている。また、同様の遺伝子がミカン（Ｃｉｔｒｕｓ　ｕｎｓｈｉｕ）などからも得られている。これらの遺伝子を植物で構成的に過剰発現させると、アラビドプシス、イネ、カラタチ（Ｐｏｎｃｉｔｒｕｓ　ｔｒｉｆｏｌｉａｔｅ）などで開花が促進された報告がある（非特許文献６及び７）。
　また、通常、かんきつ類をはじめ果樹などの樹木は、発芽から開花までに数年を要するが、ＦＴ遺伝子を導入した組換えオレンジは半年から一年で開花した（非特許文献７）。以上のことから、ＦＴ遺伝子およびそれに対応する他の植物の遺伝子の機能は、種を超えて、開花促進という機能を発揮できると考えられ、ＦＴ遺伝子およびそれに対応する他の植物の遺伝子を利用すれば、世代交代が促進され、品種改良に要する時間が短縮されることが期待されている（特許文献２）。
　しかしながら、ＦＴ遺伝子を導入した場合、茎長分裂組織は葉原基の代わりに花芽原基を形成するため、開葉することなく、花芽が形成される（非特許文献８）。その結果、以後の継代培養は極めて困難である。この点、特にカーネーションのような、通常、挿し木で増殖し栽培される植物にとっては大きなデメリットとなる。
国際公開公報ＷＯ９９／５３０７０ 特開２０００−１３９２５０
Ｄｕｄａｒｅｖａ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．．１８１−１８９，２００８ Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｉｓｉｏｌ．１２７　２００１，Ｐｌａｎｔ　Ｊ．２７　２００１，Ｍｏｌ　Ｂｒｅｅｄ．９　２００２ Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）１１　５５０−５５８ Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００７　３１６：１０３３−１０３６ 園芸学研究（２００７）巻６、別冊１、２１４ Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００２）４３，１０９５−１１０５ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）１４，７０３−７１２ Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００８）４９，１６４５−１６５８
　このような状況下で、植物の開花を促進する新たなタンパク質及びそれをコードする遺伝子の発見が望まれていた。
　本発明者らは、モノテルペンを生合成するために必要な、ゲラニルピロリン酸合成酵素ラージサブユニットをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入し、得られた形質転換細胞から植物体を発生させたところ、当該植物は幼苗の段階で開花することを発見し、ゲラニルピロリン酸合成酵素ラージサブユニットをコードするポリヌクレオチドを構成的に宿主植物内で発現させることにより植物の開花を促進することができることを見出した。
　本発明は、上記知見に基づくものである。
　すなわち、本発明は以下に関する。
［１］　以下のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物細胞内に導入する工程を含む、早期に開花する植物の製造方法。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~１１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、花芽形成を促進する活性有するタンパク質
［２］　前記植物が、同種の非形質転換植物と比べて、早期の生長段階において開花する、前記［１］に記載の方法。
［３］　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記［１］に記載の方法。
［４］　前記ポリヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものである、前記［１］に記載の方法。
［５］　前記植物が、ナデシコ科植物又はゴマノハグサ科植物である、前記［１］に記載の方法。
［６］　前記植物が、カーネーション又はトレニアである、前記［１］に記載の方法。
［７］　以下のタンパク質、および、以下のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも一方を含む、植物の開花促進剤。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~１１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質
［８］　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記［７］に記載の開花促進剤。
［９］　前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質である、前記［７］に記載の開花促進剤。
［１０］　前記ポリヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものである、前記［７］に記載の開花促進剤。
［１１］　前記植物が、ナデシコ科植物又はゴマノハグサ科植物である、前記［７］に記載の開花促進剤。
［１２］　前記植物が、カーネーション又はトレニアである、前記［７］に記載の開花促進剤。
［１３］　植物の開花を促進するための、以下のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~１１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質
発明の効果
　本発明の方法により、植物の開花までに要する時間を大幅に短縮することができ、植物体が小さい段階で花をつけさせることができる。また、本発明により、果実や種子の形成に要する時間を短縮することができる。
　さらに、本発明の方法により、自然界には存在し得ない、野生型と比べて早期の生長段階で開花する植物を作製することができる。
植物細胞内でのゲラニルピロリン酸合成経路を示す概略図である。 実施例で用いたゲラニルピロリン酸合成酵素ラージサブユニット発現ベクターｐＳＰＢ４６１３のマップである。 本発明の植物の開花状態を示す。図３Ａ：ｐＳＰＢ５５０５導入系の開花状態を示す。図３Ａ：宿主（ＣＷＰ系）およびｐＳＰＢ４６１３導入系の開花状態を示す。 本発明の植物の挿し木による増殖のための切断部位（破線）を示す。
　以下、本発明の実施態様について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる２０１２年７月３日に出願された日本国特許出願（特願２０１２−１４９４０９号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
１．　早期に開花する植物の製造方法
　本発明は、ある実施態様において、ゲラニルピロリン酸合成酵素ラージサブユニットを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物細胞内に導入する工程を含む、早期に開花する植物の製造方法を提供する。
　本発明において「花芽形成を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド」としては、以下のものが挙げられる。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~１１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　上記（ａ）に記載の配列番号２のアミノ酸配列は、これまでのところ、キンギョソウ（品種；メリーランドトゥルーピンク）由来のゲラニルピロリン酸合成酵素ラージサブユニットのアミノ酸配列として知られているものである。また、上記（ｄ）に記載の配列番号１は、前記ゲラニルピロリン酸合成酵素ラージサブユニットをコードする遺伝子のＣＤＳ配列として知られているものである。
　上記（ｂ）又は（ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、天然に存在する配列番号２のタンパク質の変異体又はキンギョソウ以外の異種植物のゲラニルピロリン酸合成酵素ラージサブユニットホモログであるが、例えば、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　２００１”、”Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９８７−１９９７”、”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）”、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）”、”Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）”、”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）”、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
　キンギョソウ以外の異種植物のゲラニルピロリン酸合成酵素ラージサブユニットホモログとしては、例えば、以下の表に示すものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本明細書中、「配列番号２のアミノ酸配列における１~１１０個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質」は、ある態様において、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１~１１０個、１~１００個、１~９０個、１~８０個、１~７０個、１~６０個、１~５０個、１~４０個、１~３９個、１~３８個、１~３７個、１~３６個、１~３５個、１~３４個、１~３３個、１~３２個、１~３１個、１~３０個、１~２９個、１~２８個、１~２７個、１~２６個、１~２５個、１~２４個、１~２３個、１~２２個、１~２１個、１~２０個、１~１９個、１~１８個、１~１７個、１~１６個、１~１５個、１~１４個、１~１３個、１~１２個、１~１１個、１~１０個、１~９個（１~数個）、１~８個、１~７個、１~６個、１~５個、１~４個、１~３個、１~２個、又は１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質であってもよい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
　また、このようなタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
　ここで、「花芽形成を促進する活性を有するタンパク質」とは、これを宿主植物の細胞内で発現した場合に、当該宿主植物の開花を促進する機能を有するものである。宿主植物の開花を促進する機能は、本発明のポリヌクレオチドを宿主植物に導入して当該ポリヌクレオチドを構成的に発現する形質転換植物を作製し、当該形質転換植物が、同種の非形質転換植物と比べて、より早期の生長段階において開花するかどうかを検証することにより確認することができる。
　好ましくは、本発明の方法に係る植物は、同種の非形質転換植物と比べて、６０％以下の生長段階で開花し、より好ましくは、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９．５％、９．４％、９．３％、９．２％、９．１％、９．０％以下の生長段階で開花する。
　ここで、「生長段階」とは、例えば、植物が発芽あるいは未分化の細胞隗からシュートが形成された時点、又は腋芽の栄養生長が開始した時点から経過した時間で表わすことができる。この場合、本発明に係る植物が、同種の非形質転換植物と比べて、６０％以下の生長段階で開花する場合では、同種の非形質転換植物が発芽又は茎頂分裂組織からの生長開始から開花まで２００時間を要するのであれば、本発明に係る植物は発芽又は茎頂分裂組織からの生長開始から１２０時間以下で開花することになる。
　別の側面では、「生長段階」とは、例えば、植物が開花までに要した日照時間で表わすことができる。この場合、本発明に係る植物が、同種の非形質転換植物と比べて、６０％以下の生長段階で開花する場合では、同種の非形質転換植物が開花まで２００時間の日照時間を要するのであれば、本発明に係る植物は１２０時間以下の日照時間で開花することになる。
　あるいは「生長段階」とは、例えば、植物個体の茎の節数で表わすことができる。この場合、本発明に係る植物が、同種の非形質転換植物と比べて、６０％以下の生長段階で開花する場合では、同種の非形質転換植物が茎の節数２０にまで生長した段階で開花するのであれば、本発明に係る植物は茎の節数１２以下で開花することになる。
　また「生長段階」とは、例えば、植物個体の茎の長さで表わすことができる。この場合、本発明に係る植物が、同種の非形質転換植物と比べて、６０％以下の生長段階で開花する場合では、同種の非形質転換植物が茎の長さが２０ｃｍにまで生長した段階で開花するのであれば、本発明に係る植物は茎の長さが１２ｃｍ以下で開花することになる。
　さらに「生長段階」とは、例えば、植物個体の茎の断面積で表わすことができる。この場合、本発明に係る植物が、同種の非形質転換植物と比べて、６０％以下の生長段階で開花する場合では、同種の非形質転換植物が茎の断面積が２０ｃｍ２にまで生長した段階で開花するのであれば、本発明に係る植物は茎の断面積が１２ｃｍ２以下で開花することになる。
　またさらに「生長段階」とは、例えば、植物個体の根の長さで表わすことができる。この場合、本発明に係る植物が、同種の非形質転換植物と比べて、６０％以下の生長段階で開花する場合では、同種の非形質転換植物が根の長さが１０ｃｍにまで生長した段階で開花するのであれば、本発明に係る植物は茎の長さが６ｃｍ以下で開花することになる。
　またさらに「生長段階」とは、例えば、植物個体の本葉の数で表わすことができる。この場合、本発明に係る植物が、同種の非形質転換植物と比べて、６０％以下の生長段階で開花する場合では、同種の非形質転換植物が本葉の数が２０枚にまで生長した段階で開花するのであれば、本発明に係る植物は本葉の数が１２枚以下で開花することになる。
　但し、植物の生長は、個体及び栽培環境に大きく依存するため、生長段階に関する上記数値は必ずしも厳密なものである必要はなく、±５％の誤差を含んでいてもよいものとする。
　本発明の植物体は、腋芽を形成し、その後に花芽を形成するため、腋芽を含む部分（図４の破線部分）を切断することにより、挿し木で増殖させることが可能である。
　従って、本発明の植物を用いた場合、容易に同じ株の植物を増殖させることができる。このような特性を用いれば、栽培者の所望の色や形状の花を咲かせる株を選択し、同株を容易に増殖することが可能である。
　本発明のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ、１若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
　本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
　本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ　＆　Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　２００１”及び”Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　１９８７−１９９７”などに記載されている方法を利用することができる。
　本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃又は５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、（１）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、（２）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃、（３）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６２℃、（４）０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、又は（５）０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃等の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルに従い、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列、又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
　上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１のＤＮＡ、又は配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
　なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７（４６９３）：１４３５−１４４１，（１９８５））や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｂｌａｓｔｐ、ｔｂｌａｓｔｎやｔｂｌａｓｔｘと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ＳＦ，ｅｔ　ａｌ：Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１５：４０３，１９９０）。ｂｌａｓｔｎを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ｂｌａｓｔｐを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。
　また、本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクターに挿入されていてもよい
　このような発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、上記（ａ）~（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
　を含むように構成される。
　従って、本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクターに挿入された状態で、宿主細胞に導入してもよい。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
　ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
　本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又は複製起点等）を含有する。
　宿主植物の細胞内で目的遺伝子を構成的に発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ　ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。
　外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、アルコール誘導性遺伝子のプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
　発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン、ゼオシン、カナマイシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、除草剤抵抗性遺伝子（ＳｕｒＢ），銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８１，ｐ．３３７，１９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，ｖｏｌ．６４，ｐ．６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０１，ｐ．１４９，１９９１）などが利用可能である。
　本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱又は双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
　植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７~３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌ　ｅｔ　ａｌの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７：３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞又は植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１、ｐＰＺＰ２０２、ｐＢＩＮＰＬＵＳ及びｐＢＩＮ１９など）を使用することができる。
　また、遺伝子を直接植物細胞又は植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が知られている。パーティクルガンを用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料によって異なるが、通常は４５０~２０００ｐｓｉ程度の圧力、４~１２ｃｍ程度の距離で行う。
　遺伝子が導入された細胞又は植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体への再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
　植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、発現ベクターをパーティクルガン、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換により得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
　遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ液などによって染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
　本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖又は無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体又はその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。従って、本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能なように導入された植物体、若しくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、又はこれら由来の組織も提供する。
　また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明に係る形質転換植物としては、ナス科植物（例えば、ナス、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、タバコ、チョウセンアサガオ、ホオズキ、ペチュニア、カリブラコア、ニーレンベルギア等）、マメ科植物（例えば、ダイズ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ、ミヤコグサ等）、バラ科植物（例えば、イチゴ、ウメ、サクラ、バラ、ブルーベリー、ブラックベリー、ビルベリー、カシス、ラズベリー等）、ナデシコ科植物（カーネーション、カスミソウ等）、キク科植物（キク、ガーベラ、ヒマワリ、デイジー等）、ラン科植物（ラン等）、サクラソウ科植物（シクラメン等）、リンドウ科植物（トルコギキョウ、リンドウ等）、アヤメ科植物（フリージア、アヤメ、グラジオラス等）、ゴマノハグサ科植物（キンギョソウ、トレニア等）、ベンケイソウ科植物（カランコエ）、ユリ科植物（ユリ、チューリップ等）、ヒルガオ科植物（アサガオ、モミジヒルガオ、ヨルガオ、サツマイモ、ルコウソウ、エボルブルス等）、アジサイ科植物（アジサイ、ウツギ等）、ウリ科植物（ユウガオ等）、フロウソウ科植物（ペラルゴニウム、ゼラニウム等）、モクセイ科植物（レンギョウ等）、ブドウ科植物（例えば、ブドウ等）、ツバキ科植物（ツバキ、チャノキ等）、イネ科植物（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ヒエ、コウリャン、サトウキビ、タケ、カラスムギ、シコクビエ、モロコシ、マコモ、ハトムギ、牧草等）、クワ科植物（クワ、ホップ、コウゾ、ゴムノキ、アサ等）、アカネ科植物（コーヒーノキ、クチナシ等）、ブナ科植物（ナラ、ブナ、カシワ等）、ゴマ科植物（ゴマ等）、ミカン科植物（例えば、ダイダイ、ユズ、ウンシュウミカン、サンショウ）及びアブラナ科植物（赤キャベツ、ハボタン、ダイコン、シロナズナ、アブラナ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー等）が挙げられる。
　植物の好ましい例としては、観賞用の植物、例えば、ナデシコ科植物（カーネーション、カスミソウ等）、ゴマノハグサ科植物（キンギョソウ、トレニア等）、ナス科植物（例えば、ナス、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、タバコ、チョウセンアサガオ、ホオズキ、ペチュニア、カリブラコア、ニーレンベルギア等）、マメ科植物（例えば、ダイズ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ、ミヤコグサ等）、バラ科植物（例えば、イチゴ、ウメ、サクラ、バラ、ブルーベリー、ブラックベリー、ビルベリー、カシス、ラズベリー等）、キク科植物（キク、ガーベラ、ヒマワリ、デイジー等）、ラン科植物（ラン等）、サクラソウ科植物（シクラメン等）、リンドウ科植物（トルコギキョウ、リンドウ等）、アヤメ科植物（フリージア、アヤメ、グラジオラス等）、ベンケイソウ（カランコエ）、ユリ科植物（ユリ、チューリップ等）、ヒルガオ科植物（アサガオ、モミジヒルガオ、ヨルガオ、サツマイモ、ルコウソウ、エボルブルス等）、ウリ科植物（ユウガオ等）、アジサイ科植物（アジサイ、ウツギ等）、フロウソウ科植物（ペラルゴニウム、ゼラニウム等）、モクセイ科植物（レンギョウ等）、ツバキ科植物（ツバキ、チャノキ等）、あるいは、開花後に得られる果実や種子にも有用性がある植物、例えばイネ科植物（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ヒエ、コウリャン、サトウキビ、タケ、カラスムギ、シコクビエ、モロコシ、マコモ、ハトムギ、牧草等）、クワ科植物（クワ、ホップ、コウゾ、ゴムノキ、アサ等）、アカネ科植物（コーヒーノキ、クチナシ等）、ゴマ科植物（ゴマ等）、ミカン科植物（例えば、ダイダイ、ユズ、ウンシュウミカン、サンショウ）、ブドウ科植物（例えば、ブドウ等）、及びアブラナ科植物（ダイコン、シロナズナ、アブラナ等）などが挙げられる。
　本発明の方法によって作製される植物は、土壌育成の状態、鉢植の状態、切り花の状態又は花のみの状態のいずれで鑑賞又は販売することも可能であり、更には、花の一部、例えば、花冠、花弁又は萼のみを鑑賞又は販売することも可能である。本発明の植物は、早期にあるいは植物体が小さい段階で開花するだけではなく、早期にあるいは植物体が小さい段階で果実を呈することも期待される。植物観賞の場では、植物の種類によっては花だけではなく、その果実も鑑賞の対象となる。従って、本発明の植物の果実にも高い商品価値が期待される。
　また、本発明の植物は、本発明の植物の種子、挿し木、球根等を育成することにより、容易に完全な植物体を得ることができる。
　よって、本発明の植物には、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子、球根等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が含まれる。
　本発明の方法は、上記の方法により得られた形質転換植物を育成する工程を更に含んでいてもよい。
　遺伝子導入に用いた宿主植物が、植物器官、植物組織、植物細胞、プロトプラスト、葉の切片又はカルスといった植物体の一部であった場合には、完全な植物体を形成するまで形質転換体を適切な環境で育成してもよい。植物体の一部から完全な植物体を育成する方法については、以下の文献の記載を参照できる：生物化学実験法４１　植物細胞工学入門　学会出版センター　ＩＳＢＮ　４−７６２２−１８９９−５。
２．形質転換植物
　また、本発明は、前記（ａ）~（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドが導入された形質転換植物を提供する。
　本発明に係る形質転換植物は、前記（ａ）~（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。
　発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターを有するベクター又は外的な刺激によって誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。このようなベクターの具体例は、先に述べたとおりである。
３．本発明の植物の加工製品
　現代では、生花（例えば、土壌育成植物、鉢植植物、切り花、組織培養苗等）のみではなく、生花の加工製品も植物観賞用の製品として販売されている。本発明の植物体は、このような生花の加工製品の材料としても非常に有用である。従って、本発明の別の実施形態として、本発明の植物（例えば、生花、切り花）又はその一部（例えば、葉、花弁、茎、根、種子、球根等）の加工製品が挙げられる。前記加工製品の例としては、押し花、ドライフラワー、プリザーブドフラワー、マテリアルフラワー、樹脂密封品等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
４．植物の開花促進剤
　別の態様において、本発明は、植物の開花促進剤を提供する。当該開花促進剤は、その成分として本発明のタンパク質、および、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも一方を含む。即ち、当該開花促進剤は、その成分として本発明のタンパク質および本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれか一方を含んでいてもよく、あるいは両方を含んでいてもよい。
　本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクターに挿入されていてもよい。発現ベクターについては、既に述べた通りである。
　また、ポリヌクレオチドの導入方法、導入されたポリヌクレオチドの確認方法及び開花促進の対象となる植物は、先に述べた通りである。
５．植物の開花促進方法
　また別の態様において、本発明は、前記（ａ）~（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドを植物細胞内に導入する工程を含む、植物の開花促進方法を提供する。
　本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクターに挿入されていてもよい。発現ベクターについては、既に述べた通りである。
　また、ポリヌクレオチドの導入方法、導入されたポリヌクレオチドの確認方法及び開花促進の対象となる植物は、先に述べた通りである。
　本発明の方法は、上記の方法により得られた形質転換植物を育成する工程を更に含んでいてもよい。
　遺伝子導入に用いた宿主植物が、植物器官、植物組織、植物細胞、プロトプラスト、葉の切片又はカルスといった植物体の一部であった場合には、完全な植物体を形成するまで形質転換体を適切な環境で育成してもよい。植物体の一部から完全な植物体を育成する方法については、以下の文献の記載を参照できる：生物化学実験法４１　植物細胞工学入門　学会出版センター　ＩＳＢＮ　４−７６２２−１８９９−５。
　以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
　以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されるものではない。
１．　キンギョソウ由来ゲラニルピロリン酸合成酵素スモールサブユニット（ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ）およびラージサブユニット（ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ）遺伝子の取得
　キンギョソウ（品種；メリーランドトゥルーピンク（株式会社ムラカミシード））の花よりＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、この得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡのうち１μｇからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造業者が推奨する方法によりｃＤＮＡを合成した。次に、合成したｃＤＮＡ　１μｌを鋳型とし、それぞれ既報の配列（ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ；ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＹ５３４６８６．１，ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ；ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＹ５３４６８７．１）をもとに作製したスモールサブユニット増幅用プライマー　ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ−Ｆ２とＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ−Ｒ２、ラージサブユニット増幅用プライマーＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ−ＦとＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ−Ｒの各０．２μＭおよびＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）１．２５Ｕを用いて製造業者の推奨する方法により計２５μｌでＰＣＲを行った。反応は、９８℃１０秒、５５℃１５秒、７２℃２分のサイクルを３０サイクル繰り返した後、７２℃で４分間保持した。反応液をアガロースゲル電気泳動で分離し、得られたそれぞれ約０．９５ｋｂ、１．３ｋｂのバンドを回収後、Ｚｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＲ４　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に製造者が推奨する方法でサブクローニングした。得られたプラスミドの塩基配列を決定したところ、ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵのアミノ酸配列（配列番号４）をコードする塩基配列（配列番号３）およびＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵのアミノ酸配列（配列番号２）をコードする塩基配列（配列番号１）を含むプラスミドが得られ、それぞれのプラスミドをｐＳＰＢ３５０６、ｐＳＰＢ１４００とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
２．　バイナリーベクターの構築
　植物にてＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ５０５５は次の方法で構築した。
　ｐＵＣＡＡ（ＷＯ２００４／０１８６８２）上にＭａｃ１プロモーターおよびカーネーション由来Ｓ１２Ａ２遺伝子、ｍａｓターミネーターを有するｐＳＰＢ１４７７をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化することによりカーネーション由来Ｓ１２Ａ２遺伝子を除き、これにｐＳＰＢ３５０６をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られる約０．９５ｋｂのＤＮＡ断片（ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ遺伝子）を連結し、ｐＵＣＡＡ上にＭａｃ１プロモーター、ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ遺伝子、ｍａｓターミネーターを有するｐＳＰＢ３５１３を得た。次に、このｐＳＰＢ３５１３をＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化することによりＭａｃ１プロモーターを除き、これに、ｐＵＣＰＰ上にペチュニア由来カルコン合成酵素遺伝子（ＰｈＣＨＳＡ）プロモーターおよびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、Ｎｏｓターミネーターを有するｐＳＰＢ６９８をＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化し、得られる約０．８ｋｂのＤＮＡ断片（ペチュニア由来ＣＨＳＡプロモーター）を連結し、ｐＵＣＡＡ上にペチュニア由来ＣＨＳＡプロモーター、ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ遺伝子、ｍａｓターミネーターを有するｐＳＰＢ４６０９を得た。さらに、ｐＳＰＢ４６０９をＡｓｃＩで消化し、得られる約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＣＧＰ１９８８（特許公開２００９−２０１５１２）のＡｓｃＩ部位に連結し、ｐＳＰＢ５０５５を得た。
　植物にてＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ遺伝子およびＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ４６１８は次の方法で構築した。
　ｐＳＰＢ１４００をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化して得られる約１．３ｋｂのＤＮＡ断片（ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ遺伝子）をＸｂａＩとＫｐｎＩで消化したｐＳＰＢ２３１１（ＷＯ２００７／０４９８１６）に連結し、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上にＭａｃ１プロモーター、ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ遺伝子、ｍａｓターミネーターを有するｐＳＰＢ３５１４を得た。次にこのｐＳＰＢ３５１４をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ＥｃｏＲＩで部分消化することによりＭａｃ１プロモーターを除き、これに、ｐＳＰＢ６９８ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化して得られる約０．８ｋｂのＤＮＡ断片（ペチュニア由来ＣＨＳＡプロモーター）を連結し、ｐＢＩＮＰＬＵＳ上にペチュニア由来ＣＨＳＡプロモーター、ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ遺伝子、ｍａｓターミネーターを有するｐＳＰＢ４６１０を得た。次に、このｐＳＰＢ４６１０をＡｓｃＩとＰａｃＩで消化し、得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＣＧＰ１９８８（特許公開２００９−２０１５１２）のＡｓｃＩとＰａｃＩ部位に連結し、ｐＳＰＢ４６１８を得た。
　植物にてＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ遺伝子を発現するためのバイナリーベクターｐＳＰＢ４６１３は次の方法で構築した。
　ｐＳＰＢ４６１８をＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化処理し、これにｐＳＰＢ４６０９をＡｓｃＩとＸｍｎＩで消化して得られる約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、ｐＳＰＢ４６１３を得た。
３．　形質転換カーネーションの作製
　温室の栽培株より収穫したカーネーション品種ＣＷＰの挿し穂を用い、国際公開公報ＷＯ１９９６／０３６７１６又はＬｕ　ｅｔ　ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：８６４−８６８，１９９１）に記載された方法に基づき、ｐＳＰＢ５０５５（ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ遺伝子）およびｐＳＰＢ４６１３（ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ遺伝子）の形質転換を行った。
４．　形質転換体の表現型
花芽形成時の節数の測定
　非形質転換系統（ＣＷＰ系統）ならびにｐＳＰＢ５０５５導入系統およびｐＳＰＢ４６１３導入系統について花芽形成に至るまでの節数を計測した。基部から花芽までの節の数を計測した結果、非形質転換個体（ＣＷＰ系統：１、２、３株）では花芽が形成されるまでが平均４１．３±７．６節であったのに対し、ｐＳＰＢ４６１３導入個体では３．７±０．６節と、大幅に花芽形成までの時間が短縮されたことが確認できた（図３及び表２を参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　表２より、ｐＳＰＢ４６１３導入個体では、開花までに要する生長段階が、平均して非形質転換体の８．９％にまで短縮されたことが分かる。
　以上の結果から、ｐＳＰＢ４６１３導入系統（ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ遺伝子発現系：（１６）−１、（２６）−１、（２８）−２の３株）にて花芽形成の促進が認められた。なお、ｐＳＰＢ５０５５導入系統（ＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ遺伝子発現系）はシュートが得られる前に全て枯死した。
　また、ｐＳＰＢ４６１８導入系統（ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ遺伝子ならびにＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ遺伝子共発現系）は、ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ遺伝子の効果により早咲き傾向は見られたものの、共発現させたＡｍＧＰＰＳ・ＳＳＵ遺伝子の影響により生長が極めて遅く、草丈も更に短くなる傾向が認められた。
　以上の結果から、ＡｍＧＰＰＳ・ＬＳＵ遺伝子の作用によって、形質転換体における花芽形成が促進されたものと考えられる。
　また、ｐＳＰＢ４６１３導入個体では、数箇所の腋芽が形成された後に花芽が形成された。従って、ｐＳＰＢ４６１３導入個体を親株とし、図４に示す破線箇所で切断したものを挿し木として用いることにより、同じ個体を増殖することが可能である。
　本発明の方法により、植物の開花までに要する時間を大幅に短縮することができる。また、本発明により、果実の形成に要する時間を短縮することができる。
　さらに、本発明の方法により、自然界には存在し得ない、早期の生長段階で開花する植物を作製することができる。
　配列番号５：合成ＤＮＡ
　配列番号６：合成ＤＮＡ
　配列番号７：合成ＤＮＡ
　配列番号８：合成ＤＮＡ

Claims (13)

  1. 　以下のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物細胞内に導入する工程を含む、早期に開花する植物の製造方法。
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~１１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質
  2. 　前記植物が、同種の非形質転換植物と比べて、早期の生長段階において開花する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記ポリヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものである、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記植物が、ナデシコ科植物又はゴマノハグサ科植物である、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記植物が、カーネーション又はトレニアである、請求項１に記載の方法。
  7. 　以下のタンパク質、および、以下のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも一方を含む、植物の開花促進剤。
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~１１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質
  8. 　前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項７に記載の開花促進剤。
  9. 　前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項７に記載の開花促進剤。
  10. 　前記ポリヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものである、請求項７に記載の開花促進剤。
  11. 　前記植物が、ナデシコ科植物又はゴマノハグサ科植物である、請求項７に記載の開花促進剤。
  12. 　前記植物が、カーネーション又はトレニアである、請求項７に記載の開花促進剤。
  13. 　植物の開花を促進するための、以下のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
    （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１~１１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、花芽形成を促進する活性を有するタンパク質
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