WO2013186885A1 - 乳汁中の特定物質を検出する方法 - Google Patents

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浩志 前花
松山　健二
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Definitions

  • the present invention relates to an immunochromatographic method and an immunochromatographic apparatus for detecting substances in milk using an antigen-antibody reaction.
  • the milk of livestock represented by cattle, sheep and goats is not aseptic and may contain some microorganisms due to disease or the environment. Particularly in diseases caused by microbial infection, it is often known that many microorganisms are eliminated in milk. Mastitis is a typical livestock disease caused by microbial infection.
  • Mastitis is inflammation of the ductal system and mammary gland tissue, and is mainly caused by microorganisms invading, colonizing and proliferating in the breast. Mastitis affects many animals, but bovine mastitis, particularly in dairy cows, is said to affect 15-40% of all dairy cows and is one of the most important diseases for dairymen. Dairy cows suffer from mastitis, which impedes milk synthesis and reduces milk yield and, in some cases, halts lactation, as well as significant economic losses such as treatment costs and milk price penalties to dairymen. give. In addition, labor burdens on dairy farmers will increase, such as individually milking mastitis-affected quarters to prevent infection.
  • a culture method As a method for identifying the causative agent of an infectious disease, a culture method, a gene identification method, and an antigen-antibody reaction identification method are known.
  • the method for identifying the causative bacteria of livestock mastitis is mainly a culture method, but there are problems that the operation is complicated and it takes several days to obtain the result.
  • An identification method based on detection of a specific gene by a gene amplification method (PCR method) has also been reported (Non-patent Document 1). Although this method can produce results in about a day, it still requires special equipment and procedures.
  • Non-patent Document 2 an apparatus for detecting Staphylococcus aureus and Escherichia coli, which are one of the causative bacteria of mastitis, has been developed by surface plasmon resonance (SPR) based on an antigen-antibody reaction.
  • SPR surface plasmon resonance
  • an antibody against an antigen specific to each bacterium is prepared, and this antibody is immobilized on an SPR chip.
  • this method can quickly detect a specific causative bacterium, it requires a special device and is difficult to measure at a dairy site or the like.
  • a simple measurement device using an immunochromatography method that can quickly and easily measure biological samples such as blood and urine at home or in an examination room is widespread (for example, see Patent Document 1).
  • This method immobilizes a test paper containing a first antibody specific to a substance to be measured (antigen) labeled with colored particles such as colloidal gold and a second antibody that captures the substance to be measured.
  • a test piece connected to a porous membrane is used.
  • the measurement target substance binds to an antibody labeled with colored particles and / or an antibody immobilized on a porous membrane, and a line or the like that can be visually discerned appears on the membrane. Therefore, the presence or absence of the measurement substance can be detected by confirming the presence or absence of this line or the like.
  • Patent Document 1 teaches that the above method can be applied to blood (whole blood), plasma, serum, urine, saliva, sputum, sweat, etc., but the above method is applied to the milk of livestock. There is no teaching, and there is no teaching or suggestion of problems that arise in its application. Further, methods for applying the immunochromatography method using biological samples such as blood (whole blood) as specimens are also disclosed in Patent Documents 2 to 4, but the immunochromatography method is also applied to livestock milk in these patent documents. There is no suggestion or teaching to do.
  • Patent Document 5 describes an immunochromatographic method for the purpose of examining the causative bacteria of livestock mastitis using milk as a specimen.
  • a method of using is proposed.
  • This document teaches that milk fat globules and casein contained in milk inhibit detection by immunochromatography, and that it is preferable to remove them prior to testing.
  • This document discloses a technique in which milk is allowed to stand at the time of removing milk fat globules and casein, and the cream layer is separated and treated with a surfactant. However, the milk fat globules are removed using a filter. There is no teaching.
  • Patent Documents 2 to 4 In applying the immunochromatography method, methods for removing contaminants with a physical filter or a film having chemical affinity are taught in Patent Documents 2 to 4, but as described above, these techniques are described in these documents.
  • This method is a method of applying the immunochromatography method to a biological sample such as whole blood, and not a method of applying it to livestock milk.
  • Patent Documents 1 to 4 there is no teaching or suggestion about problems that occur when the immunochromatography method is applied to the milk of livestock, and there is no teaching at all about means for solving the problems.
  • the present invention has an object to be solved by providing an immunochromatographic method and an immunochromatographic apparatus for detecting substances in milk of livestock using an antigen-antibody reaction.
  • the present inventor examined identifying the causative bacteria of mastitis by antigen-antibody reaction using an immunochromatographic apparatus. However, when the present inventors actually examined whether or not microorganisms could be detected by immunochromatography using milk as a sample, it was found that the antigen-antibody reaction did not proceed on the test piece of the immunochromatography apparatus. As a result of investigating the reason why the antigen-antibody reaction does not proceed smoothly on the test piece, the present inventor found that a large amount of milk fat globules contained in the milk was clogged and developed in the test piece of the immunochromatography apparatus in which the porous membrane was connected. It was thought that this was because the liquid did not flow sufficiently.
  • a test piece having a pore diameter of about several tens to several hundreds of nanometers is used in order to make the transport by the developing solution and the speed of the antigen-antibody reaction appropriate.
  • Numerous milk fat globules with a particle size of about 1 to 10 ⁇ m are present in milk immediately after milking (in commercially available milk etc., the milk fat globules in raw milk are homogenized to reduce the particle size to 1 ⁇ m or less.
  • milk fat globules with a wide range of particle sizes are present in milk that has not been homogenized.) Since the particle size distribution of milk fat globules is much wider than that of red blood cells, It was thought that measurement would be difficult due to clogging.
  • the present inventor has identified a part of milk fat globules in milk by size processing on the upstream side of the test piece used in the immunochromatography method, thereby identifying the milk.
  • the present inventors have found that it is possible to measure this substance by immunochromatography, and have completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • An immunochromatographic method for detecting a specific substance in milk (1) a labeled first antibody against the specific substance or a first part in which the labeled specific substance is retained, a second antibody linked downstream of the first part and against the specific substance
  • a test strip having an immobilized second part and a third part connected to the first part or upstream of the second part and having a cavity capable of removing milk fat globules in the milk, Contacting the milk with the third portion or upstream thereof; and (2) flowing the milk to the second portion or downstream thereof, and detecting with the label at the second portion or downstream thereof.
  • [7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the retained particle size of the voids in the third portion is 1 to 3.5 ⁇ m.
  • the third part is constituted by two or more members having voids capable of removing milk fat globules having different particle sizes.
  • the third portion is configured by the first member disposed downstream and the second member disposed upstream, and the retained particle size of the second member is larger than the retained particle size of the first member.
  • the method according to [8]. [10] The method according to [9], wherein the retained particle size of the first member is 1.0 to 2.0 ⁇ m, and the retained particle size of the second member is 3.0 to 3.5 ⁇ m.
  • a method for diagnosing whether a causative bacterium of mastitis in livestock is staphylococci Obtaining milk containing causative bacteria from livestock suffering from mastitis, releasing specific substances present in the causative bacteria by mixing a lytic enzyme in the milk, and the identification
  • a diagnostic method comprising a step of measuring the presence or amount of an external specific substance by an immunological method using an antibody whose substance is an antigen.
  • lysostaphin is used as a lytic enzyme to diagnose whether the causative bacterium is staphylococci.
  • Milk comprising a test piece having an immobilized second part and a third part connected to the first part or upstream of the second part and having a cavity capable of removing milk fat globules in the milk
  • the presence or absence of a specific substance in milk can be detected quickly and easily on the spot.
  • the sign when diagnosing bovine mastitis, if the sign is visible, it can be carried out on a dairy farm without using a device, etc., and a cream layer separation process is not necessary. It is possible to quickly identify the causative bacteria before the worsening, and to determine an appropriate treatment policy such as selection of appropriate antibiotics and measures for preventing the spread of infection at an early stage.
  • the cross-sectional schematic diagram of the test piece of the immunochromatography apparatus used in Example 1 is shown.
  • 7 Fat globule removal member (third part)
  • the cross-sectional schematic diagram of another example of the test piece of an immunochromatography apparatus is shown.
  • the cross-sectional schematic diagram of another example of the test piece of an immunochromatography apparatus is shown.
  • the detection sensitivity improvement effect at the time of using an autolytic enzyme is shown.
  • the measurement result by ELISA of Staphylococcus aureus added to milk using achromopeptidase and lysostaphin is shown.
  • the cross-sectional schematic diagram of the test piece of the immunochromatography apparatus used in Example 6 is shown. 1: Labeled antibody-impregnated part (first part) 2: Chromatographic development membrane carrier (second part) 3: Supplementary part 4: Sample addition member 5: Absorption member 6: Substrate The result of having detected Staphylococcus aureus in milk by immunochromatography using lysostaphin as a lytic enzyme is shown.
  • the immunochromatography apparatus of the present invention is an apparatus for detecting a specific substance in milk by an immunochromatography method, wherein the first antibody labeled with the specific substance or the labeled specific substance is retained.
  • Specific examples of the configuration of the test piece include the test pieces whose cross-sectional schematic diagrams are shown in FIGS. 1, 2, and 3. In FIG.
  • the sample addition member 4 and the fat globule removal member (third portion) 7 are integrally installed upstream of the labeled antibody-impregnated member (first portion) 1.
  • the fat globule removing member (third portion) 7 is installed downstream of the labeled antibody-impregnated member (first portion) 1 and upstream of the chromatographic development membrane carrier (second portion) 2.
  • the fat globule removing member (third part) 7 is installed downstream of the sample addition member 4 and upstream of the labeled antibody impregnated member (first part) 1.
  • the immunochromatography apparatus can be manufactured using a commercially available material by a known method.
  • the material used for the first part is not particularly limited as long as it can perform immunochromatography, but is preferably a fiber matrix such as a cellulose derivative, filter paper, glass fiber, cloth, cotton, or the like.
  • the material used for the second part is not particularly limited as long as it can perform immunochromatography, but is preferably nitrocellulose, mixed nitrocellulose ester, polyvinylidene fluoride, nylon or the like.
  • the material used for the third part preferably has voids that can remove milk fat globules with a diameter of 1 to several tens ⁇ m contained in the milk.
  • the third part needs to be arranged upstream of the second part made of a porous membrane having a pore diameter of several tens to several hundreds of nanometers, and is a position where the sample solution can first contact and pass. It is preferable that the first portion is disposed on the upstream side.
  • the gap of the third part is not limited as long as milk fat globules can be separated, and the retained particle size is preferably 0.1 to 10 ⁇ m, more preferably 1 to 3.5 ⁇ m.
  • the material is not particularly limited as long as it has voids in the above range, but is preferably a fiber matrix such as a cellulose derivative, filter paper, glass fiber, cloth, cotton or the like.
  • the retained particle size is the particle size of milk fat globules that are retained in the third portion without allowing milk fat globules having a particle size larger than that size to pass through the void, and the average pore size of the voids in the third portion
  • milk fat globules having a particle size equal to or larger than 50%, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more. % Or more, and most preferably 98% or more cannot be passed through the gap and is held in the third portion.
  • the percentage of milk fat globules retained can be measured by methods well known to those skilled in the art. For example, GF / B provided by GE Healthcare Biosciences has been shown in the product catalog to have a retained particle size of 1.0 ⁇ m. It is possible to confirm.
  • the third part only a material having a specific retention particle size may be used, and in order to increase the separation efficiency of milk fat globules, particles having a large retention particle size may be used in a stepwise manner.
  • the third part is composed of two or more members having voids that can remove milk fat globules of different particle sizes, it is a preferred aspect of the present invention, and the third part is a first part disposed downstream. It is a further preferred embodiment of the present invention when it is constituted by a member and a second member disposed upstream, and the retained particle size of the second member is larger than the retained particle size of the first member.
  • the holding particle size of the first member disposed downstream is 1.0 to 2.0 ⁇ m, and the second member disposed upstream is retained.
  • the particle size is preferably 3.0 to 3.5 ⁇ m.
  • the third part is composed of a member having a small retaining particle size and retaining particles. It is preferable to configure a combination with a member having a large size.
  • the first part holds the labeled first antibody against the specific substance or the labeled specific substance.
  • the specific substance can be detected by a sandwich assay method.
  • the specific substance labeled in the first portion can be detected by the competition method.
  • the first portion should contain the first antibody labeled with a specific substance. Is preferred.
  • first antibody labeled with a specific substance When the first antibody labeled with a specific substance is held in the first part, two types of antibodies are used: a first antibody against the specific substance and a second antibody against the specific substance.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies that can simultaneously bind to the specific substance so that the specific substance can be detected by sandwich assay, and the first antibody recognizes the first antibody.
  • the epitope of the specific substance is preferably different from the epitope of the specific substance recognized by the second antibody.
  • the first antibody or specific substance held in the first portion is labeled.
  • the label used in the present invention include colored particles, enzymes, radioisotopes, and the like, but it is preferable to use colored particles that can be detected visually without the need for special equipment.
  • the colored particles include metal fine particles such as gold and platinum, non-metal particles, and latex particles, but are not limited thereto.
  • the colored particles may have any size as long as it can be transported downstream through the voids of the test piece, but the diameter is preferably 1 nm to 10 ⁇ m. More preferably, it is 5 nm to 1 ⁇ m, and further preferably 10 nm to 100 nm.
  • the specific substance to be measured in the present invention can be any substance that can be measured by immunochromatography, but is preferably a bacterial component or a substance secreted by bacteria. More preferably, it is a bacterial L7 / L12 ribosomal protein.
  • the L7 / L12 ribosomal protein has high detection sensitivity due to the presence of multiple copies in the cell.
  • an antibody capable of distinguishing a specific bacterium causing mastitis from another bacterium by species or genus can be actually obtained by a known method described below.
  • the kind of bacteria is not particularly limited, and may be either a gram positive bacterium or a gram negative bacterium.
  • staphylococci bacteria belonging to the genus Staphylococcus
  • Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus
  • bacteria belonging to the genus Escherichia coli and Klebsiella but are not limited thereto.
  • the above antibody can be prepared by the method described in International Publication No. 00/06603 pamphlet.
  • the bacterial ribosomal protein L7 / L12 can be prepared using the full-length protein of the bacterial ribosomal protein L7 / L12 or a partial peptide thereof as the antigen, but it is preferable to prepare the full-length protein as the antigen.
  • This partial peptide or full-length protein is directly or after cross-linking with a carrier protein, and then inoculated into an animal together with an adjuvant as necessary, and an anti-recognition containing an antibody (polyclonal antibody) that recognizes the L7 / L12 ribosomal protein by recovering the serum.
  • Serum can be obtained. Further, the antibody can be purified from the antiserum and used.
  • the animals to be inoculated include sheep, horses, goats, rabbits, mice, rats and the like, and sheep, rabbits and the like are particularly preferable for producing polyclonal antibodies. Further, as the antibody, it is more preferable to apply a monoclonal antibody obtained by a known method for producing a hybridoma cell. In this case, a mouse is preferable.
  • the monoclonal antibody As the monoclonal antibody, a monoclonal antibody that reacts with ribosomal protein L7 / L12 of a specific bacterium that causes mastitis and does not react with ribosomal protein L7 / L12 of a bacterium that causes mastitis other than the specific bacteria. By screening, it can be used for diagnosis of whether or not the bacterium has an infection.
  • the antibody reacts with a component of a specific bacterium causing mastitis or a substance secreted by the bacterium, and does not react with a component of a bacterium causing mastitis other than the specific bacterium or a substance secreted by the bacterium.
  • a monoclonal antibody even an antibody that recognizes other than ribosomal protein L7 / L12 as an antigen can be used.
  • the monoclonal antibody it is preferable to use a monoclonal antibody whose antigen-antibody reaction is not inhibited by contaminants other than the specific substance contained in the milk.
  • milk contains a large amount of protein such as casein, which may inhibit the reaction between a specific substance and a monoclonal antibody.
  • a monoclonal antibody against a specific substance is produced by a conventional method, for example, it may be preferable to appropriately select and use a monoclonal antibody in which the antigen-antibody reaction is not inhibited by casein or the like, or a monoclonal antibody that has little influence on the antigen-antibody reaction. is there.
  • a monoclonal antibody that specifically reacts with an antigen After manufacturing a monoclonal antibody that specifically reacts with an antigen according to a conventional method, such a monoclonal antibody is examined whether the antigen-antibody reaction is inhibited in the presence of contaminants such as casein, It can be easily obtained by selecting a monoclonal antibody that does not substantially inhibit the reaction.
  • the above-described test piece may be used as it is to provide an immunochromatography apparatus, or may be housed in a case to provide an immunochromatography apparatus.
  • the amount of milk serving as a sample when the amount of milk serving as a sample is large, it is preferable that one end of the test piece is directly immersed in the sample contained in the container.
  • the amount of milk serving as a sample when the amount of milk serving as a sample is small, it is preferable to measure a predetermined amount with a pipette or the like and drop it onto a test piece.
  • the shape of the case in the latter case may be any shape as long as the test piece can be accommodated.
  • the material of the case may be any material, and preferred examples include polypropylene and polycarbonate.
  • the immunochromatography apparatus of the present invention is a combination of a container, for example, a microtube, and an additive solution, for example, an additive solution containing a lytic enzyme or a surfactant for lysing bacteria and eluting the ribosomal protein L7 / L12 into the solution. It can also be provided as a kit.
  • the immunochromatographic method according to the present invention is an immunochromatographic method for detecting a specific substance in milk, (1) a labeled first antibody against the specific substance or a first part in which the labeled specific substance is retained, a second antibody linked downstream of the first part and against the specific substance
  • a test strip having an immobilized second part and a third part connected to the first part or upstream of the second part and having a cavity capable of removing milk fat globules in the milk, Contacting the milk with the third portion or upstream thereof; and (2) flowing the milk to the second portion or downstream thereof, and detecting with the label at the second portion or downstream thereof.
  • the milk is brought into contact with the sample addition member located in the third part or upstream thereof as it is or as a mixed solution with the additive solution added.
  • the surfactant component is added directly to the milk, or is added to the additive solution, or upstream from the second part, preferably the first part.
  • the bacterium can be lysed by retaining the surfactant component upstream of the portion (refer to JP-A-61-111464 for lysis treatment with a surfactant). You may combine these methods suitably.
  • the other component of the additive solution is not particularly limited as long as it does not inhibit the antigen-antibody reaction, but a suitable buffer solution (for example, MOPSO) can be used.
  • the lytic enzyme is added directly to the milk, or contained in the additive solution, or is immobilized upstream of the second part, preferably upstream of the first part,
  • the milk that the specific substance contained in the bacterial body is exposed outside the bacterial body through the treatment with the lytic enzyme can flow to the second part or the downstream part thereof, and the specific substance existing in the bacterial cell is highly sensitive. Can be detected. You may combine these methods suitably.
  • the lytic enzyme can be added directly to the milk and / or contained in the additive solution, and in a particularly preferred embodiment, the additive solution containing the lytic enzyme can be added to the milk.
  • the type of lytic enzyme is not particularly limited, and any two or more lytic enzymes may be used in appropriate combination. Escherichia coli, a bacterium belonging to the genus Klebsiella, or Staphylococcus aureus as a mastitis-causing bacterium, causing frequent lysis against these microorganisms It is also preferable to use one or a combination of two or more enzymes.
  • one or more lytic enzymes selected from lysozyme, lysostaphin, pepsin, glucosidase, galactosidase, achromopeptidase, ⁇ -N-acetylglucosaminidase and the like can be used.
  • a method using lysozyme and a cell membrane lysing agent as a lytic enzyme has been proposed (Japanese Patent Laid-Open No. 63-167799).
  • Autolytic enzyme As the lytic enzyme, an autolytic enzyme having a high lytic effect is preferred (see FIG. 4).
  • Autolytic enzyme refers to an enzyme that is produced by bacteria and that melts itself. The details of why such autolysis occurs are unknown, but it is thought to play a role in dissolving and separating the cells when the cells grow and divide.
  • Known bacterial autolytic enzymes include lysostaphin, acetylglucotaminidase, achromopeptidase, and the like.
  • the lysis rate of Staphylococcus aureus is low because of the surfactant lysis. It may be preferred to use the lysostaphin that exerts alone or in combination with other lytic enzymes.
  • a method for lysing Staphylococcus aureus with lysostaphin is disclosed in JP-A-11-28099, and those skilled in the art can easily obtain lysostaphin as a lytic enzyme. The entire disclosure of the above patent publication is incorporated herein by reference.
  • Natural lysostaphin is a zinc protease produced by Staphylococcus simulans and is known to lyse these bacteria by hydrolyzing the glycylglycine bond in the glycopeptide chain of cell wall peptidoglycan of Staphylococcus aureus or its congeners. It has been.
  • the term lysostaphin includes, in addition to the above-mentioned natural lysostaphin, addition, deletion, and / or addition to one or more amino acids in the amino acid sequence of natural lysostaphin, as long as the hydrolysis activity is not lost. Mutant lysostaphin into which mutations such as substitution have been introduced is included.
  • modified lysostaphin in which other compounds such as saccharides and polyethylene glycol are bound to the natural lysostaphin or mutant lysostaphin is also included as long as the hydrolysis activity is not lost.
  • lysostaphins can be obtained by the culture method or genetic engineering method described in JP-A No. 11-28099, or can be obtained by purchasing commercially available products.
  • lysostaphin is used as a lytic enzyme, for example, an antigen comprising the ribosome L7 / L12 protein of Staphylococcus aureus can be detected by an immunochromatographic method, or together with or in place of the immunochromatographic method. It is also possible to detect the above antigens by a pharmacological measurement method.
  • immunological measurement methods other than immunochromatography include agglutination reaction method, enzyme immunoassay method (ELISA method), radioimmunoassay method (RIA method), or fluorescent immunoassay method (FIA method). However, it is not limited to these.
  • the antigen-antibody reaction is performed by sandwich assay using “labeled first antibody against a specific substance” retained in the first part and “second antibody against the specific substance” immobilized on the second part. It can be detected by the method. Alternatively, the antigen-antibody reaction may be detected by a competition method using a labeled specific substance held in the first part and an antibody against the specific substance immobilized in the second part. However, in the present invention, a sandwich assay method in which the detection sensitivity is high and the antibody detection line appears positive is preferable.
  • the immunochromatography method has a lateral flow type that utilizes the fact that the test piece is placed in the horizontal direction and the liquid moves by capillary action, and a flow-through that is arranged in the vertical direction and passes the liquid from top to bottom mainly by gravity. Broadly divided into types. In the present invention, either a lateral flow type or a flow-through type may be used, but a lateral flow type is more preferable.
  • Example 1 Confirmation of liquid flow of milk sample by immunochromatography method (1) Production of immunochromatography apparatus An immunochromatography apparatus shown in a schematic cross-sectional view in Fig. 1 was produced as follows.
  • Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
  • L7 / L12 monoclonal antibody was used as the colloidal gold labeled antibody.
  • an L7 / L12 ribosomal protein of Staphylococcus aureus was obtained, and a monoclonal antibody was produced using the protein.
  • As the monoclonal antibody a combination of two kinds (SA-1 and SA-2) capable of simultaneously binding to another site of the L7 / L12 ribosomal protein was selected.
  • aureus (approximately 1 ⁇ 10 8 cells / ml) diluted 10-fold with 0.5% TritonX-100, PBS, and milk (Commercial drinking milk) 80 ⁇ l was added and reacted at room temperature for 1 hour. Further, after removing the supernatant, the peroxidase-labeled monoclonal antibody SA-2 was diluted with 0.02% Tween20 and PBS to a final concentration of 1 ⁇ g / ml, 100 ⁇ l of each was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour.
  • (B) Gold colloid label impregnated member Mixing 0.1M potassium phosphate pH7.5 with 0.9mL of gold colloid solution (particle size 60nm) manufactured by BBInternational, adding 100 ⁇ g / mL of monoclonal antibody SA-2 to label gold colloid at room temperature. Allow to stand for 5 minutes to allow the antibody to bind to the surface of the gold colloid particles, then add 10% bovine serum albumin (BSA) aqueous solution so that the final concentration in the gold colloid solution is 1%. The surface of each was blocked with BSA to prepare a colloidal gold labeled monoclonal antibody SA-2 (hereinafter referred to as “gold colloid labeled antibody”) solution.
  • BSA bovine serum albumin
  • This solution was centrifuged (15000 ⁇ rpm, 5 minutes) to precipitate the colloidal gold labeled antibody, and the supernatant was removed to obtain a colloidal gold labeled antibody.
  • the colloidal gold labeled antibody was suspended in 20 mm Tris-HCl buffer (pH 8.2) containing 0.25% BSA, 2.5% sucrose and 35 mm NaCl to obtain a colloidal gold labeled antibody solution.
  • a 10 mm ⁇ 300 mm belt-shaped glass fiber pad was impregnated with 2 mL of the colloidal gold labeled antibody solution, which was dried under reduced pressure at room temperature to obtain a colloidal gold labeled antibody impregnated member 1 (first part).
  • a solution containing 1.5 mg / mL of the monoclonal antibody SA-1 ⁇ was applied in a line at 1 ⁇ L / cm at a position 10 mm from the end of the chromatographic development start side in the membrane carrier 2 for chromatographic development, It was dried at 50 ° C. for 30 minutes, then immersed in a 0.5% sucrose solution for 30 minutes and dried overnight at room temperature.
  • Example 2 Detection of Staphylococcus aureus in Staphylococcus aureus in milk by immunochromatography (1) Production of immunochromatographic apparatus The immunochromatographic apparatus shown in Fig. 1 was produced by the method described in Example 1. As a member serving as both the sample addition member 4 and the fat globule removal member (third portion) 7, GF / DVA described in Table 2 was used.
  • Table 4 shows the visual judgment results and the culture results.
  • + indicates that a S. aureus colony was observed, and ⁇ indicates that no colony was observed.
  • + indicates that a reddish purple line was visible, and-indicates that it was not visible.
  • the immunochromatography apparatus of the present invention it is possible to develop a milk sample without causing clogging of the milk and accurately measure the milk in which milk fat globules are present. .
  • Example 3 Measurement of high-concentration milk by immunochromatography
  • the immunochromatography apparatus shown in Fig. 1 was prepared by the method described in Example 1, and the liquid flow when the ratio of milk was changed was confirmed.
  • the sample addition members used were those listed in Table 3.
  • Mix raw milk sample and additive solution at different ratios final concentration of additive solution 1% Tween20, 0.05M NaCl, 0.1M MOPSO pH7.5, total solution volume 250 ⁇ l
  • immerse immunochromatograph device from sample addition member Chromatographic development was performed using the lateral flow method, and it was examined whether or not the entire liquid was developed.
  • the two members for sample addition were overlapped and examined in the same manner.
  • two sample addition members were overlapped.
  • GF / AVA and GF / DVA were used as members for sample addition.
  • GF / DVA was placed upstream (sample addition member 4) and GF / AVA was placed downstream (fat globule removal member 7), and the length used was examined.
  • the milk ratio was 80% and the liquid volume was 250 ⁇ l.
  • the results are shown in Table 6 (refer to FIG. 3 for “length” and “overlap” in the table). + Indicates that the developing solution has flowed to the absorbing member 5. Even when the milk ratio was 80%, the liquid flow could not be stopped and the measurement could be performed correctly. Furthermore, it was possible to measure correctly even if the lengths of the two sample addition members were changed.
  • milk fat globules can be removed even when high-concentration milk is used, and the milk sample without clogging the membrane It has become possible to measure with high sensitivity and accuracy.
  • Example 4 Effect of lytic enzyme in detection of Staphylococcus aureus by enzyme immunoassay (ELISA)
  • ELISA enzyme immunoassay
  • Staphylococcus aureus was adjusted with physiological saline, and the final concentration was 2.5 ⁇ 10 5 (cells / ml).
  • phosphate physiological buffer solution PBS
  • Triton X-100 a nonionic surfactant Triton X-100 was used. The final concentration was 1% and treated overnight at room temperature.
  • Example 5 Effect of lytic enzyme using milk Using achromopeptidase (Wako Pure Chemical Industries) and lysostaphin (Wako Pure Chemical Industries) which showed high lytic effect in Example 4, they were added to milk. Measurement by Staphylococcus aureus ELISA was performed. For milk milk, commercially available drinks are used, and the ratio is 0 to 80% (the balance is 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)). Staphylococcus aureus is adjusted with physiological saline to a final concentration of 1 ⁇ 10 5. (Cells / ml). Achromopeptidase and lysostaphin were prepared using 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and mixed with the S. aureus solution to a final concentration of 5 ( ⁇ g / ml). The measurement by ELISA was in accordance with Example 4.
  • Example 6 Detection of Staphylococcus aureus in milk by immunochromatography (1) Production of immunochromatography apparatus An immunochromatography apparatus was produced as follows. (A) Gold colloid label impregnated member The gold colloid label impregnated member described in Example 1 was used. (B) Capture site of complex of antigen and colloidal gold labeled antibody It was prepared in the same manner as in Example 1.
  • GF / Filter paper was prepared as DVA (manufactured by GE Healthcare Bioscience: a filter member having a thickness of 776 ⁇ m and a holding particle size of 3.5 ⁇ m made of glass fiber) and the absorbing member 5. And after bonding these members to the base material 6 (thickness 254 ⁇ m, made of polystyrene and having an adhesive for bonding the members), it was cut to a width of 5 mm, and FIG. 6 shows a cross-sectional view. An immunochromatographic apparatus was produced.
  • Test Milk milk was measured with an immunochromatograph apparatus as follows. 100 ⁇ l of milk containing a known amount of Staphylococcus aureus added to a microtube, 150 ⁇ l of an additive solution (final concentration 1% Triton X-100, 5 ⁇ g / ml lysostaphin, 0.1 M MOPSO pH 7.5) is added and mixed at room temperature did. Commercial milk drinks were used for milk juice. For comparison, an additive solution not mixed with lysostaphin (final concentration: 1% Triton X-100, 0.1 M MOPSO pH 7.5) was also used for the study.
  • an additive solution not mixed with lysostaphin final concentration: 1% Triton X-100, 0.1 M MOPSO pH 7.5
  • the immunochromatograph apparatus is immersed in the mixed solution from the sample addition member 4 and allowed to stand at room temperature for 30 minutes in a lateral flow manner for development. Then, the ribosomal protein L7 / L12 antigen supplemented at the supplementary site 3 and gold The red-purple line that increases or decreases the capture of the complex with the colloid-labeled antibody in proportion to the capture amount was quantified with the apparatus FASTKIT immunochromatography reader DiaScan 20-A (manufactured by Nippon Becton Decktonson).
  • Results are shown in FIG. When an additive solution with lysostaphin is used, the curve shifts to a lower concentration compared to an additive solution with Triton X-100 instead of lysostaphin, and S. aureus can be detected about 10 times more sensitively. Became clear.
  • Example 7 Measurement of milk sample by immunochromatographic method An immunochromatographic apparatus was prepared according to Example 6. 100 ⁇ l of a raw milk sample in which Staphylococcus aureus was detected was collected in a microtube, and 150 ⁇ l of an additive solution was added and mixed at room temperature. Two types of additive solutions described in Example 6 were used. After the measurement according to Example 6, the reddish purple line that appeared was judged visually (positive +, negative-).
  • Table 8 shows the number of Staphylococcus aureus calculated by the culture method and the determination result by immunochromatography. When lysostaphin was not added, S. aureus could not be detected at 1 ⁇ 10 4 (cfu / ml) or less, but by adding lysostaphin, it was possible to detect up to 5 ⁇ 10 3 .
  • the present invention can be used for diagnosis of infectious diseases in livestock.

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Abstract

　乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ方法であって、（１）該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第１部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分と、該第１部分又は該第２部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第３部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第３部分又はそれより上流部に接触させる工程；及び（２）該乳汁を該第２部分又はそれより下流部まで流し、該第２部分又はそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程：を含む、上記方法。

Description

乳汁中の特定物質を検出する方法
　本発明は、抗原抗体反応を利用して乳汁中の物質を検出するためのイムノクロマトグラフ方法及びイムノクロマトグラフ装置に関する。
　牛、羊、ヤギに代表される家畜の乳汁は無菌なものではなく、疾患や環境が原因で何らかの微生物が混入している場合がある。特に微生物の感染による疾患ではしばしば乳汁中に多くの微生物を排菌することが知られている。微生物の感染が原因で引き起こされる代表的な家畜の疾患に乳房炎がある。
　乳房炎とは、乳管系、乳腺組織の炎症であり、主に微生物が乳房内に侵入・定着し、増殖することによって引き起こされる。乳房炎は多くの動物が罹患するが、特に乳牛における牛乳房炎は乳牛全体の15～40％が罹患すると言われ、酪農家にとって極めて重要な疾患の一つである。乳牛が乳房炎に罹患すると、乳汁の合成機能が阻害され、泌乳量の減少や場合によっては泌乳の停止が起こるだけでなく、治療費や、乳価のペナルティーなど多大な経済的損失を酪農家に与える。さらには、伝染防止のために乳房炎罹患分房を個別に搾乳するなど、酪農家にかかる労働負担も増加する。
　乳房炎は様々な微生物の感染によって引き起こされるが、原因菌によって効果を示す抗生物質が異なる、また、特定の微生物では他の分房や個体に伝染するなど性質やその後の対応が異なることから、乳汁中に存在する原因菌を迅速・簡便に同定することが極めて重要となる。
　感染症の原因菌の同定方法としては、培養法、遺伝子による同定法、および抗原抗体反応による同定法が知られている。現在行われている家畜の乳房炎の原因菌の同定法は培養法が中心であるが、操作が煩雑なうえ、結果が得られるのに数日間を要するという問題がある。また、遺伝子増幅法（PCR法）による特定遺伝子の検出に基づく同定方法も報告されている（非特許文献１）。この方法では約1日で結果が得られるものの、やはり特別な機器や手技を要するという問題がある。近年では、抗原抗体反応に基づいて表面プラズモン共鳴（SPR）により、乳房炎の原因菌の一つである黄色ブドウ球菌や大腸菌を検出する装置が開発されている（非特許文献２）。これは、それぞれの細菌に特異的な抗原に対する抗体を作製し、この抗体をSPRチップ上に固定して使用する。この方法では、迅速に特定の原因菌を検出できるものの、特別な装置が必要なため、酪農現場等での測定が困難である。
　一方、血液や尿などの生体試料に対して、家庭や診察室で迅速・簡便に測定できるイムノクロマトグラフ法を用いた簡易測定装置（イムノクロマトグラフ装置）が普及している（例えば、特許文献1参照）。この方法は、金コロイドなどの着色粒子を標識した抗体であって測定対象物質（抗原）に特異的な第一の抗体を含有した試験紙と、測定対象物質を捕捉する第二の抗体を固定化した多孔性のメンブレンとが連結した試験片を用いる。測定対象物質を含む検体を滴下すると、測定対象物質は着色粒子を標識した抗体及び／または多孔性メンブレン上に固定化した抗体と結合し、メンブレン上に目視で判別可能なライン等が出現する。したがって、このライン等の有無を確認することで測定物質の有無を検出することができる。
　特許文献１には、上記の方法が、血液（全血）のほか、血漿、血清、尿、唾液、喀痰、汗などに適用できることが教示されているが、上記の方法を家畜の乳汁に適用することは教示されておらず、その適用に際して生じる問題点についても何ら教示ないし示唆がない。また、血液（全血）などの生体試料を検体としてイムノクロマトグラフ法を適用する方法は特許文献2ないし4にも開示されているが、これらの特許文献にもイムノクロマトグラフ法を家畜の乳汁に適用することは示唆ないし教示されていない。
　家畜の乳汁を検体として用いてイムノクロマトグラフ法により酪農現場で迅速・簡便に測定できる簡易測定装置として、特許文献5には乳汁を検体として家畜の乳房炎の原因菌を検査する目的でイムノクロマトグラフ法を用いる方法が提案されている。この文献には、乳汁中に含まれる乳脂肪球とカゼインがイムノクロマトグラフ法による検出を阻害すること、及び検査に先だってこれらを事前に除去することが好ましいことが教示されている。この文献には、乳脂肪球とカゼインの除去に際して乳汁を静置してクリーム層を分離し、界面活性剤で処理する手法が開示されているが、フィルターを用いて乳脂肪球を除去するとの教示はない。
　なお、イムノクロマトグラフ法を適用するにあたり夾雑物を物理的なフィルターや化学的な親和性を有する膜により除去する手法は特許文献2ないし4に教示されているが、上述のとおりこれらの文献に記載された方法はイムノクロマトグラフ法を全血などの生体試料に適用する方法であり、家畜の乳汁に適用する方法ではない。特許文献1ないし4には、イムノクロマトグラフ法を家畜の乳汁に適用するに際して生じる問題点についての教示ないし示唆はなく、その問題点を解決するための手段についても全く教示がない。
特開平１-２４４３７０号公報 特表２００３－５１２６２４号公報 特表平１１－５０５３２７号公報 特開２００２－２１４２３６号公報 国際公開ＷＯ０２／０７５３１０号パンフレット
J.Dairy.Sci. 84: 74-83 JRA先進的家畜管理システム実用化報告書（平成18-20年度）p58-65
　本発明は、抗原抗体反応を利用して家畜の乳汁中の物質を検出するためのイムノクロマトグラフ方法及びイムノクロマトグラフ装置を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は、乳房炎の原因菌をイムノクロマトグラフ装置を用いて抗原抗体反応により同定することを検討した。しかしながら、実際に本発明者が、乳汁を試料としたイムノクロマトグラフ法で微生物を検出できるかどうかを検討したところ、イムノクロマトグラフ装置の試験片上で抗原抗体反応が進行しないことが判明した。本発明者は、試験片上で抗原抗体反応が円滑に進行しない原因を調査した結果、乳汁中に含まれる多量の乳脂肪球が多孔性のメンブランが連結したイムノクロマトグラフ装置の試験片に詰まり、展開液が十分に流れないことが原因でないかと考えた。通常、イムノクロマトグラフ装置においては、展開液による輸送と抗原抗体反応の速度を適切にするために、数１０～数１００ｎｍ程度の孔径を有する試験片が使用されている。搾乳直後の乳汁には１～１０数μｍ前後の粒径の乳脂肪球が多数存在しており（市販の牛乳等では、生乳中の乳脂肪球を均質化処理することによって粒径1μｍ以下としているが、均質化処理をしていない乳汁には広い範囲の粒径を有する乳脂肪球が存在している。）、乳脂肪球の粒径分布が赤血球に比べて非常に広いことからメンブランの目詰まりが生じて測定が困難になるものと考えられた。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、イムノクロマトグラフ法で使用する試験片の上流側で乳汁中の乳脂肪球の一部をサイズ処理によりトラップすることによって、乳汁中の特定の物質をイムノクロマトグラフ法にて測定することが可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］　乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ方法であって、
（１）該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第１部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分と、該第１部分又は該第２部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第３部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第３部分又はそれより上流部に接触させる工程；及び
（２）該乳汁を該第２部分又はそれより下流部まで流し、該第２部分又はそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程：
を含む、上記方法。
［２］　イムノクロマトグラフ方法がラテラルフロー型である、［１］に記載の方法。
［３］　該第１部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］　特定物質が、細菌の成分又は該細菌が分泌する物質である、［１］から［３］の何れかに記載の方法。
［５］　第一の抗体、及び第二の抗体の少なくとも片方が、モノクローナル抗体である、［１］から［４］の何れかに記載の方法。
［６］　第一の抗体及び第二の抗体が、それぞれモノクローナル抗体である、［５］に記載の方法。
［７］　第３部分の空隙の保持粒子サイズが１～３．５μｍである、［１］から［６］の何れかに記載の方法。
［８］　第３部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する２種以上の部材により構成される、［１］から［７］の何れかに記載の方法。
［９］　第３部分が下流に配置された第一の部材、及び上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、［８］に記載の方法。
［１０］　第一の部材の保持粒子サイズが１．０～２．０μｍであり、第二の部材の保持粒子サイズが３．０～３．５μｍである、［９］に記載の方法。
［１１］　溶菌酵素による処理を経た該乳汁を第２部分又はそれより下流部まで流す工程を含む、［１］から［１０］の何れかに記載の方法。
［１２］　溶菌酵素が自己溶菌酵素である、［１１］に記載の方法。
［１３］　溶菌酵素としてリゾスタフィンを用いて該乳汁中のブドウ球菌を検出する、［１１］に記載の方法。
［１４］　家畜の乳房炎の原因菌がブドウ球菌であるか否かを診断する方法であって、
乳房炎に罹患した家畜から原因菌を含む乳汁を得る工程、該乳汁中に溶菌酵素を混合することにより該原因菌の菌体内に存在する特定物質を菌体外に放出させる工程、及び該特定物質を抗原とする抗体を用いた免疫学的方法によって外特定物質の存在の有無または存在量を測定する工程を含む診断方法。
［１５］　溶菌酵素としてリゾスタフィンを用いて原因菌がブドウ球菌であるか否かを診断する、［１４］に記載の方法。
［１６］　該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第１部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分と、該第１部分又は該第２部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第３部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置。
［１７］　第１部分または第２部分に、溶菌酵素または界面活性剤が保持されてなる、［１６］記載のイムノクロマトグラフ装置
［１８］　溶菌酵素または界面活性剤を含む添加液と、［１６］記載のイムノクロマトグラフ装置とからなる検出キット。
　本発明によれば、乳汁中の特定の物質の有無を迅速・簡便に、かつその場で検出することができる。特に、牛乳房炎を診断する場合において、標識が視認できるものである場合には装置等を用いずに酪農場で実施することができ、クリーム層分離処理も不要であることから、病状の更なる悪化の前に迅速に原因菌を特定し、適切な抗生物質の選択などの的確な治療方針や、感染拡大防止のための措置を早期に決定することができる。
実施例１で用いたイムノクロマトグラフ装置の試験片の断面模式図を示す。１：標識抗体含浸部材（第1部分）、２：クロマト展開用膜担体（第２部分）、３：捕捉部位、４：試料添加用部材、５：吸収用部材、６：基材、及び７：脂肪球除去用部材（第３部分） イムノクロマトグラフ装置の試験片の別の一例の断面模式図を示す。 イムノクロマトグラフ装置の試験片の別の一例の断面模式図を示す。 自己溶菌酵素を用いた場合の検出感度改善効果を示す。 アクロモペプチダーゼおよびリゾスタフィンを用いて牛乳汁中に添加した黄色ブドウ球菌のＥＬＩＳＡによる測定結果を示す。 実施例６で用いたイムノクロマトグラフ装置の試験片の断面模式図を示す。１：標識抗体含浸部分（第１部分）、２：クロマト展開用膜担体（第２部分）、３：補足部位、４：試料添加用部材、５：吸収用部材、６：基材 溶菌酵素としてリゾスタフィンを用いてイムノクロマトグラフ法により乳汁中の黄色ブドウ球菌を検出した結果を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
　本発明のイムノクロマトグラフ装置は、イムノクロマトグラフ法によって乳汁中の特定物質を検出するための装置であって、該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第１部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分と、該第１部分又は該第２部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第３部分とを有する試験片を含む装置である。具体的な試験片の構成としては、図１、図２、図３に断面模式図を示した試験片が挙げられる。図１においては、試料添加用部材４と脂肪球除去用部材（第３部分）７とは一体となって、標識抗体含浸部材（第1部分）１の上流に設置されている。図２においては、脂肪球除去用部材（第３部分）７は、標識抗体含浸部材（第1部分）１の下流、かつクロマト展開用膜担体（第２部分）２の上流に設置されている。図３においては、脂肪球除去用部材（第３部分）７は、試料添加用部材４の下流、かつ標識抗体含浸部材（第1部分）１の上流に設置されている。
　イムノクロマトグラフ装置は公知の方法にて市販の材料を用いて作製することができる。
　第１部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、セルロース誘導体等の繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。
　第２部分に使用する材料は、イムノクロマトグラフを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ニトロセルロース、混合ニトロセルロースエステル、ポリビニリデンフロライド、ナイロン等である。
　第３部分に使用する材料は、乳汁中に含まれる直径１～１０数μｍの乳脂肪球を除去できる空隙を有していることが好ましい。第３部分は、試料溶液が孔径数１０～数１００ｎｍの多孔性のメンブレンからなる上記第２部分の上流側に配置されている必要があり、試料溶液が最初に接触・通過できる位置である、上記第１部分の上流側に配置されていることが好ましい。
　第３部分が有する空隙は乳脂肪球を分離できる大きさであればよく、保持粒子サイズは好ましくは０．１から１０μｍであり、より好ましくは１から３．５μｍである。材料は上記の範囲の空隙を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはセルロース誘導体等繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等である。保持粒子サイズとは、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球が空隙を通過できずに第３部分に保持される乳脂肪球の粒子サイズのことであり、第３部分の空隙の平均ポアサイズに実質的に対応しているが、そのサイズ以上の粒子サイズを有する乳脂肪球の５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９８％以上が空隙を通過できずに第３部分に保持される。保持される乳脂肪球の割合は当業者に周知の方法で測定することができる。例えば、GEヘルスケアバイオサイエンス社から提供されているGF/Bは保持粒子サイズが1.0μｍであることが同製品カタログにおいて明らかにされているが、当業者に周知の方法で上記の粒子サイズを確認することが可能である。
　上記第３部分は、特定の保持粒子サイズを有する材料のみを用いてもよく、乳脂肪球の分離効率を高めるために保持粒子サイズが大きいものから小さいものを段階的に張り合わせて用いてもよい。上記第３部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する２種以上の部材により構成される場合は本発明の好ましい態様であり、第３部分が下流に配置された第一の部材、及び上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい場合は本発明のさらに好ましい態様である。第３部分を２種の部材により構成する場合には、下流に配置された第一の部材の保持粒子サイズが１．０～２．０μｍであり、上流に配置された第二の部材の保持粒子サイズが３．０～３．５μｍであることが好ましい。高濃度で広い粒径分布を有する乳脂肪球を含む乳汁、好ましくは搾乳後の未希釈の乳汁から特定物質を高感度に検出するためは、第３部分を保持粒子サイズの小さな部材と保持粒子サイズの大きな部材との組み合わせにより構成することが好ましい。
　上記第１部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体、または標識された特定物質が保持されている。第１部分に、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている場合には、サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができる。また、第１部分に標識された特定物質が保持されている場合には、競合法により特定物質を検出することができる。本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法の方が好ましいことから、第１部分には、特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されていることが好ましい。
　第１部分に特定物質に対する標識された第一の抗体を保持させる場合には、特定物質に対する第一の抗体と、特定物質に対する第二の抗体の、２種類の抗体を用いる。サンドイッチアッセイ法により特定物質を検出することができるように、上記第一の抗体と上記第二の抗体は、当該特定物質に同時に結合できることができる抗体であり、上記第一の抗体が認識する当該特定物質のエピトープは、上記第二の抗体が認識する当該特定物質のエピトープとは異なることが好ましい。
　本発明において、検出可能な信号を得るために、第１部分に保持される第一の抗体又は特定物質は標識されている。本発明で用いる標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子、非金属粒子、ラテックス粒子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が１ｎｍから１０μｍが好ましい。より好ましくは、５ｎｍから１μｍであり、さらに好ましくは１０ｎｍから１００ｎｍである。
　本発明で測定される特定物質は、イムノクロマトグラフ法で測定できる物質であれば何れでも可能であるが、細菌の成分または細菌が分泌する物質であることが好ましい。さらに好ましくは、細菌のL７／L１２リボゾームタンパク質である。Ｌ７／Ｌ１２リボソームタンパク質は、細胞内に多コピー存在するために検出感度が高い。また、後の実施例で示すように、以下に記載の公知の方法により、乳房炎の原因となる特定の細菌を他の細菌と種または属で識別可能な抗体を実際に取得可能である。細菌の種類は特に限定されず、グラム陽性菌又はグラム陰性菌のいずれであってもよい。例えば、ブドウ球菌（スタフィロコッカス属に属する細菌）、好ましくは黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌、又は大腸菌やクレブシェラ属に属する細菌などを例示することができるが、これらに限定されることはない。
　上記の抗体は、国際公開第００／０６６０３号パンフレットに記載の方法で作製することができる。細菌リボゾームタンパク質L７／L１２を抗原とする場合は、細菌リボゾームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の全長タンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができるが、全長タンパク質を抗原として作製することが好ましい。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質をそのまま、またはキャリアタンパク質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、抗体としてはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。当該モノクローナル抗体として、乳房炎の原因となる特定の細菌のリボゾームタンパク質L７／L１２と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌のリボゾームタンパク質L７／L１２とは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、当該細菌による感染症にかかっているかどうかの診断に役立てることが可能となる。
　抗体が乳房炎の原因となる特定の細菌の成分または該細菌が分泌する物質と反応し、前記特定の細菌以外の乳房炎の原因となる細菌の成分または該細菌が分泌する物質とは反応しないモノクローナル抗体であれば、リボゾームタンパク質L７／L１２以外を抗原として認識する抗体であっても使用することができる。
　また、モノクローナル抗体としては、乳汁中に含まれる特定物質以外の夾雑物により抗原抗体反応が阻害されないモノクローナル抗体を用いることが好ましい。例えば、乳汁中にはカゼインなどのタンパク質が大量に含まれており、特定物質とモノクローナル抗体との反応を阻害する場合がある。特定物質に対するモノクローナル抗体を常法により製造するにあたり、例えばカゼインなどにより抗原抗体反応が阻害を受けないモノクローナル抗体や、抗原抗体反応への影響が少ないモノクローナル抗体を適宜選択して用いることが好ましい場合がある。このようなモノクローナル抗体は、通常の方法に従って抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を製造した後に、カゼインなどの夾雑物の存在下で抗原抗体反応が阻害されるか否かを調べて、実質的に反応の阻害を受けないモノクローナル抗体を選択することにより容易に取得することができる。
　本発明においては、上述した試験片をそのまま使用してイムノクロマトグラフ装置としてもよいし、ケースに収納して、イムノクロマトグラフ装置としてもよい。前者の場合は、試料となる乳汁の量が多い場合に、容器に入った試料に直接試験片の一端を浸して使用することが好ましい。また、後者の場合は、試料となる乳汁の量が少ない場合に、ピペット等で所定量を計量して試験片に滴下して使用することが好ましい。後者の場合のケースの形状は、試験片を収納できればいかなる形状でもよい。ケースの材料はいかなる材料でもよく、ポリプロピレンやポリカーボネートなどが好ましいものとしてあげられる。
　本発明のイムノクロマトグラフ装置は、容器、たとえばマイクロチューブ、及び添加液、例えば細菌を溶菌させてリボゾームタンパク質L７／L１２を溶液内に溶出させるための、溶菌酵素または界面活性剤を含む添加液を組合せたキットとして提供することもできる。
　本発明によるイムノクロマトグラフ方法は、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ方法であって、
（１）該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第１部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分と、該第１部分又は該第２部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第３部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第３部分又はそれより上流部に接触させる工程；及び
（２）該乳汁を該第２部分又はそれより下流部まで流し、該第２部分又はそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程：
を含む方法である。
　乳汁はそのまま、または添加液を加えた混合溶液として、上記第３部分又はそれより上流部に位置する試料添加用部材に接触させる。上記特定物質が細菌の細胞内に存在する物質である場合は、界面活性剤成分を乳汁に直接添加するか、又は上記添加液に含有させ、あるいは上記第２部分より上流、好ましくは上記第１部分の上流側に該界面活性剤成分を保持させることで、該細菌を溶菌することができる（界面活性剤による溶菌処理については特開昭６１－１１１４６４号公報を参照のこと）。これらの手法を適宜組み合わせてもよい。該添加液の他の成分としては、抗原抗体反応を阻害しない成分であれば特に限定されないが、適当な緩衝液（例えば、MOPSOなど）を用いることができる。
　別の態様として、溶菌酵素を乳汁に直接添加するか、又は上記添加液に含有させ、あるいは上記第２部分より上流、好ましくは上記第１部分の上流側に溶菌酵素を固定化することにより、溶菌酵素による処理を経て菌体内に含まれる特定物質が菌体外に露出した該乳汁を第２部分又はそれより下流部まで流すことができ、細菌の細胞内に存在する特定物質を高感度に検出することができる。これらの手法を適宜組み合わせてもよい。好ましい態様では、溶菌酵素を乳汁に直接添加するか、及び/又は上記添加液に含有させることができ、特に好ましい態様では溶菌酵素を含む上記添加液を乳汁に添加することができる。
　溶菌酵素の種類は特に限定されず、任意の2種以上の溶菌酵素を適宜組み合わせて用いてもよい。乳房炎の起炎菌として大腸菌(Escherichia coli)、クレブシェラ(Klebsiella)属に属する細菌、又は黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)による感染が多発することから、これらの微生物に対して溶菌作用を発揮できる溶菌酵素を1種又は2種以上組み合わせて用いることも好ましい。例えばリゾチーム、リゾスタフィン、ペプシン、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アクロモペプチダーゼ、β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼなどから選ばれる1種又は2種以上の溶菌酵素を用いることができる。例えば、溶菌酵素としてリゾチームと細胞膜溶解剤とを用いる方法が提案されている（特開昭６３－１６７７９９号公報）。
　溶菌酵素としては、自己溶菌酵素が溶菌効果の高いものが多く好ましい（図４参照）。自己溶菌酵素とは、細菌自身が生産し、自己を融解する酵素をいう。このような自己融解がなぜ起こるのか詳細は不明であるが、菌が伸張・分裂する際に，菌体を溶解して切り離す役割を果たすものと考えられている。細菌の自己溶菌酵素としては、リゾスタフィン、アセチルグルコタミニダーゼ、アクロモペプチダーゼなどが知られている。
　乳房炎の起炎菌として黄色ブドウ球菌の存在が特に疑われる場合には、黄色ブドウ球菌に対しては界面活性剤による溶菌率が低いことから、黄色ブドウ球菌に対して特異的に溶菌作用を発揮するリゾスタフィンを単独で、又は他の溶菌酵素と組み合わせて用いることが好ましい場合がある。リゾスタフィンにより黄色ブドウ球菌を溶菌する方法については特開平１１－２８０９９号公報に開示があり、当業者は溶菌酵素としてリゾスタフィンを容易に入手することができる。上記特許公報の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。
　天然型リゾスタフィンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｃｃｕｓ　ｓｉｍｕｌａｎｓが生産する亜鉛プロテアーゼであり、黄色ブドウ球菌またはその同属菌の細胞壁ペプチドグリカンのグリコペプチド鎖中のグリシルグリシン結合を加水分解することによりこれらの菌を溶菌することが知られている。本明細書において、リゾスタフィンの用語には、上記天然型リゾスタフィン以外に、上記加水分解活性を失わない範囲で、天然型リゾスタフィンのアミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸に付加、欠失、及び/又は置換等の変異が導入された変異型リゾスタフィンが包含される。また、加水分解活性を失わない範囲で、該天然型リゾスタフィンまたは変異型リゾスタフィンに他の化合物、例えば、糖類やポリエチレングリコール等を結合させた修飾型リゾスタフィンも包含される。これらのリゾスタフィンは、特開平１１－２８０９９号公報に記載された培養方法または遺伝子工学的手法で得るか、市販品の購入により入手することが可能である。リゾスタフィンを溶菌酵素として用いる場合には、例えば黄色ブドウ球菌のリボソームＬ７／Ｌ１２蛋白質からなる抗原をイムノクロマトグラフ法により検出することができ、あるいはイムノクロマトグラフ法とともに、又はイムノクロマトグラフ法に代えて他の免疫学的測定方法により上記抗原を検出することもできる。イムノクロマトグラフ以外の免疫学的測定方法としては、例えば、凝集反応法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射能免疫測定法（ＲＩＡ法）、又は蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
　抗原抗体反応は、第１部分に保持されている「特定物質に対する標識された第一の抗体」と、第２部分に固定化された「特定物質に対する第二の抗体」を用いて、サンドイッチアッセイ法により検出することができる。あるいは抗原抗体反応は、第１部分に保持されている標識された特定物質と、第２部分に固定化された特定物質に対する抗体を用いて競合法にて検出してもよい。但し、本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法が好ましい。
　イムノクロマトグラフ方法は、試験片を横方向に配置して毛細管現象により液が移動することを利用したラテラルフロー型と、縦方向に配置して主に重力により上から下へ液を通過させるフロースルー型に大別される。本発明においてはラテラルフロー型またはフロースルー型のいずれでもよいが、より好ましくはラテラルフロー型である。
　以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１：イムノクロマトグラフ法による乳汁サンプルの液流れの確認
（１）イムノクロマトグラフ装置の作製
　図1に断面模式図で示されるイムノクロマトグラフ装置を以下のように作製した。
（ａ）リボゾームタンパク質L７／L１２抗体の作製
　金コロイド標識する抗体には、Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）リボソームタンパク質L7/L12モノクローナル抗体を使用した。国際公開ＷＯ００／０６６０３号パンフレットの実施例５に記載の方法に準じて、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusのL７／L１２リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記L７／L１２リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる２種（SA-1およびSA-2）の組合せを選択した。
　モノクローナル抗体ＳＡ－１及びＳＡ－２の組み合わせが、黄色ブドウ球菌のリボゾームタンパク質L７／L１２と反応し、黄色ブドウ球菌以外の乳房炎の原因となる細菌のリボゾームタンパク質L７／L１２とは反応せず、かつ乳汁の成分による反応阻害を受けない抗体であることを以下のように確認した。
　10μg/mlのモノクローナル抗体SA-1とPBS溶液100μlを９６穴ELISAプレート（Nunc社Maxsorp ELISAプレート）に分注し４℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液（PBS中）200μl添加し室温で1時間反応させてブロッキングした。上澄み除去後洗浄液（0.02％Tween20、PBS）で数回洗浄し、表１に示す各種細菌（約１×108　cells/ml）を0.5%TritonX-100、PBS　にて10倍に希釈したものを100μl添加し室温にて1時間反応させた。さらに上澄み除去後、パーオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体SA-2を0.02% Tween20、PBSにて最終濃度１μg/mlになるように希釈してそれぞれ100μl添加し室温にて1時間反応させた。上澄み除去後さらに洗浄液で数回洗浄したのち、TMB溶液（KPL社製）を100μlずつ加え室温10分間反応させた後1mol/lの塩酸を100μl添加して反応を停止したのち450nmの吸光度を測定し、陰性コントロール（細菌を除いた溶液）シグナルとの差により反応性を評価した。結果を表1に示す。ここで陽性（＋）はELISAでの吸光度と陰性コントロールの吸光度の差が少なくとも0.5以上、陰性（－）は吸光度と陰性コントロールの吸光度の差が0.1以下である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　10μg/mlのモノクローナル抗体SA-1とPBS溶液100μlを９６穴ELISAプレート（Nunc社Maxsorp ELISAプレート）に分注し４℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液（PBS中）200μl添加し室温で1時間反応させてブロッキングした。上澄み除去後洗浄液（0.02％Tween20、PBS）で数回洗浄し、黄色ブドウ球菌（約１×108　cells/ml）を0.5%TritonX-100、PBS　にて10倍に希釈したものを20μlと牛乳（市販の飲用牛乳）80μｌとを添加し室温にて1時間反応させた。さらに上澄み除去後、パーオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体SA-2を0.02% Tween20、PBSにて最終濃度１μg/mlになるように希釈してそれぞれ100μl添加し室温にて1時間反応させた。上澄み除去後さらに洗浄液で数回洗浄したのち、TMB溶液（KPL社製）を100μlずつ加え室温10分間反応させた後1mol/lの塩酸を100μl添加して反応を停止したのち450nmの吸光度を測定し、陽性コントロール（牛乳汁を除いた溶液）シグナルとの差により反応性を評価し、牛乳による反応性低下がないものであることを確認した。
（ｂ）金コロイド標識含浸部材
　BBInternational社製金コロイド溶液(粒径60nm)0.9mLに0.1M リン酸カリウム pH7.5を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体SA-2を100μg/mL加え室温で5分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるようにウシ血清アルブミン（BSA）10%水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をBSAでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体SA-2（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（15000×rpm、5分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を0.25%BSA、2.5%スクロース、35mm NaClを含有する20mmトリス塩酸緩衝液（pH8.2）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。10mm×300mmの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液2mLを含浸せしめ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材1（第１部分）とした。
（ｃ）抗原および金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
　幅25mm、長さ300mmのニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体2（第２部分）として用意した。
　モノクローナル抗体SA-1 1.5ｍｇ/ｍLが含有されてなる溶液を、このクロマト展開用膜担体2におけるクロマト展開開始点側の末端から10mmの位置に1μL/ｃｍでライン状に塗布して、これを50℃で30分間乾燥し、その後、0.5％スクロース溶液に30分浸し、一晩室温で乾燥させた。Staphylococcus aureusリボソームタンパク質 L7/L12抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位3とした。
（ｄ）イムノクロマトグラフ装置の作製
　上記標識抗体含浸部材1、上記クロマト展開用膜担体2の他に、試料添加用部材４と脂肪球除去用部材（第３部分）７とを兼ねる部材として綿布と、吸収用部材5として濾紙を用意した。そして、これらの部材を基材６（厚さ254μｍ、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたもの）に貼り合せた後、5mm幅に切断し、図１に断面図を示したイムノクロマトグラフ装置を作成した。試料添加用部材4には表２に示す部材を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）試験
　イムノクロマトグラフ装置による牛の乳汁の測定は、マイクロチューブに黄色ブドウ球菌が検出された生乳サンプルを１００μｌ分取し、添加液（終濃度１％　Tween２０、０．０５M　NaCl、０．１M　MOPSO　ｐH7.5）１５０μｌを加えて混合した。同混合溶液に上記（１）で得られたイムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材４から浸漬してラテラルフロー方式でクロマト展開し、展開液が吸収用部材５まで流れるか検討した。
　結果を表３に示す。＋は展開液が吸収用部材５まで流れたことを示し、－は途中で停止したことを示す。保持粒子サイズが3.5μｍまでの部材のみ液が吸収用部材５まで流れた。それ以外はクロマト展開用膜担体２の途中で液流れが停止した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例２：イムノクロマトグラフ法による乳汁中の黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusの検出
（１）イムノクロマトグラフ装置の作製
　実施例１に記載の方法により、図１記載のイムノクロマトグラフ装置を作製した。試料添加用部材４と脂肪球除去用部材（第３部分）７とを兼ねる部材としては表２に記載のGF/DVAを用いた。
（２）試験
　イムノクロマトグラフ装置による牛乳汁の測定は、マイクロチューブに生乳サンプル１～６を１００μｌ分取し、添加液（終濃度１％　Tween２０、０．０５M　NaCl、０．１M　MOPSO　ｐH7.5）１５０μｌを加えて混合した。同混合溶液に上記イムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材４から浸漬して、ラテラルフロー方式で室温で１５分静置して展開後、上記捕捉部位３で捕捉されたリボソームタンパク質L７／L１２抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を捕捉量に比例して増減する赤紫色のラインの有無により目視で判定した。
　一方、乳汁中のStaphylococcus aureusの有無を確認するために、培養法にて検出を行った。トリプチケースソイII5%ヒツジ血液寒天培地（日本ベクトンデッキンソン社製）およびStaphylococcus aureus選択培地X-SA寒天培地（ニッスイ社製）に乳汁を100μｌ播種後、37℃で24時間培養し、出現したコロニーを確認した。
　目視判定結果および培養結果を表4に示す。培養結果においては、＋は黄色ブドウ球菌のコロニーが認められたことを示し、－は認められなかったことを示す。また、キット判定結果においては、＋は赤紫色のラインが目視できたことを示し、－は目視できなかったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　乳汁中から何も細菌が検出されなかった2検体についてはラインが出現しなかった。また、レンサ球菌が検出された2検体についてもラインが出現しなかった。一方、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusが検出された検体についてはラインが出現し、黄色ブドウ球菌を検出することができた。
　以上のように、本発明のイムノクロマトグラフ装置を使用することで、乳脂肪球が存在する乳汁において、メンブレンが目詰まりすることなく乳汁サンプルを展開させ、正確に測定を行うことが可能となった。
実施例３：イムノクロマトグラフ法による高濃度乳汁の測定
　実施例1に記載の方法により、図１記載のイムノクロマトグラフ装置を作製し、乳汁の割合を変えた場合の液流れを確認した。試料添加用部材は表3に記載のものを使用した。生乳サンプルと添加液を割合を変えて混合し（添加液終濃度　1％Ｔｗｅｅｎ20、0.05Ｍ　ＮａＣｌ、0.1Ｍ　ＭＯＰＳＯ　ｐＨ7.5、総液量250μｌ）、イムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材から浸漬してラテラルフロー方式でクロマト展開し、液が全量展開されるか否かを検討した。
　結果を表５に示す。＋は展開液が吸収用部材５まで流れたことを示し、－は途中で停止したことを示す。乳汁割合が50％の場合は、VF1以外の試料添加用部材で液が吸収用部材５まで全量流れた。乳汁割合を70％にした場合は、いずれの試料添加用部材を用いてもクロマト展開用膜担体２の途中で液流れが停止、または、吸収用部材5まで到達した場合でも、液流れが停止し、正しく測定できない結果となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　つぎに、試料添加用部材を2枚重ね合わせ、同様の検討を行った。図3に示すように2枚の試料添加用部材を重ね合わせた。試料添加用部材としてGF/AVAおよびGF/DVAを使用した。GF/ DVAを上流側（試料添加用部材４）GF/AVAを下流側（脂肪球除去用部材７）に配置し、使用する長さを変えて検討した。乳汁割合は80％とし、液量は250μｌとした。結果を表６に示す（表中の「長さ」及び「重なり」は図3を参照）。＋は展開液が吸収用部材５まで流れたことを示す。乳汁割合を80％にしても、液流れが停止せずに正しく測定することができた。さらに、2枚の試料添加用部材の長さを変えても正しく測定することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以上のように、保持粒子サイズの異なる2種類の試料添加用部材を組み合わせて使用することで、高濃度の乳汁を用いた場合でも乳脂肪球を除去でき、メンブレンが目詰まりすることなく乳汁サンプルを展開させ、高感度かつ正確に測定を行うことが可能となった。
実施例４：酵素免疫測定法（ELISA）による黄色ブドウ球菌の検出における溶菌酵素の効果
（ａ）リボゾームタンパク質L７／L１２に対するモノクローナル抗体の作製
　実施例１記載のモノクローナル抗体ＳＡ－１とＳＡ－２とを使用した。
（ｂ）ELISAによる溶菌酵素の効果の確認
　溶菌酵素の効果については以下のように確認した。
　黄色ブドウ球菌を表７に示す界面活性剤または溶菌酵素を用いて１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により調整し、３７℃で２０分間処理した後、実施例１（ａ）と同様のＥＬＩＳＡにて吸光度を測定した。黄色ブドウ球菌は生理食塩水にて調整し、終濃度は２．５×１０５　（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）とした。陰性コントロールとしてリン酸生理緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いた。陽性コントロールとしては非イオン性界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を用いた。終濃度は１％とし、室温で一晩処理した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　結果を図4に示す。
　陰性コントロールとして用いたＰＢＳと比べて、界面活性剤、及び何れの溶菌酵素においても吸光度が高くなった。一般的な溶菌剤として用いられる界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ－１００と比べると、自己溶菌酵素であるアクロモペプチダーゼおよびリゾスタフィンを用いた場合において吸光度が約２倍高くなった。
実施例５：乳汁を用いた溶菌酵素の効果
　実施例4において高い溶菌効果が見られたアクロモペプチダーゼ（和光純薬工業）およびリゾスタフィン（和光純薬工業）を用いて、牛乳汁中に添加した黄色ブドウ球菌のＥＬＩＳＡによる測定を行った。牛乳汁は市販の飲用品を用い、０～８０％の割合（残部は１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））とし、黄色ブドウ球菌は生理食塩水にて調整し、終濃度１×１０５（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）とした。アクロモペプチダーゼおよびリゾスタフィンは１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて調整し、終濃度５（μｇ／ｍｌ）となるように黄色ブドウ球菌溶液と混合した。ＥＬＩＳＡによる測定は実施例4に準じた。
　結果を図５に示す。アクロモペプチダーゼを用いた場合は、乳汁割合の増加に伴い吸光度が低下した。一方、リゾスタフィンを用いた場合は、乳汁割合に関係なく吸光度が一定となり、アクロモペプチダーゼは高濃度の乳汁存在下では十分な効果が見られない結果となった。
実施例６：イムノクロマトグラフ法による乳汁中の黄色ブドウ球菌の検出
（１）イムノクロマトグラフ装置の作製
　イムノクロマトグラフ装置は以下のように作製した。
（ａ）金コロイド標識含浸部材
　実施例１記載の金コロイド標識含浸部材を使用した。
（ｂ）抗原および金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
　実施例１と同様に作製した。
（ｃ）イムノクロマトグラフ装置の作製
　上記標識抗体含浸部材１、上記クロマト展開用膜担体２の他に、試料添加用部材４と脂肪球除去用部材（第３部分）７とを兼ねる部材としてＧＦ／ＤＶＡ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製：ガラス繊維からなる、厚み７７６μｍ、保持粒子サイズ３．５μｍのフィルター部材）と、吸収用部材５として濾紙を用意した。そして、これらの部材を基材６（厚さ２５４μｍ、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたもの）に貼り合せた後、５ｍｍ幅に切断し、図６に断面図を示したイムノクロマトグラフ装置を作製した。
（２）試験
　イムノクロマトグラフ装置による牛乳汁の測定は以下のように行った。
　マイクロチューブに既知量の黄色ブドウ球菌を添加した乳汁を１００μｌ分取し、添加液（終濃度１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、５μｇ／ｍｌ　リゾスタフィン、０．１Ｍ　ＭＯＰＳＯ　ｐＨ７．５）１５０μｌを加えて室温で混合した。牛乳汁は市販の飲用品を用いた。比較としてリゾスタフィンを混合していない添加液（終濃度１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．１Ｍ　ＭＯＰＳＯ　ｐＨ７．５）についても検討に用いた。同混合溶液に上記イムノクロマトグラフ装置を試料添加用部材４から浸漬して、ラテラルフロー方式で室温で３０分静置して展開後、上記補足部位３で補足されたリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉の有無を捕捉量に比例して増減する赤紫色のラインを装置ＦＡＳＴＫＩＴイムノクロマトリーダー　ＤｉａＳｃａｎ　２０－Ａ（日本ベクトンデッキンソン社製）により定量した。
　結果を図７に示す。リゾスタフィンを添加した添加液を用いた場合、リゾスタフィンにかえてＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加した添加液と比べて、低濃度側に曲線がシフトする結果となり、約１０倍高感度に黄色ブドウ球菌を検出できることが明らかとなった。
実施例７：イムノクロマトグラフ法による乳汁サンプルの測定
　イムノクロマトグラフ装置は実施例６に準じて作製した。
　マイクロチューブに黄色ブドウ球菌が検出された生乳サンプルを１００μｌ分取し、添加液１５０μｌを加えて室温で混合した。添加液は実施例６に記載の２種類を用いた。実施例６に準じて測定後、出現した赤紫色のラインを目視により判定した（陽性＋、陰性－）。
　一方、乳汁中の黄色ブドウ球菌の数を確認するために、培養法にて定量を行った。トリプチケースソイＩＩ５％ヒツジ血液寒天培地（日本ベクトンデッキンソン社製）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ選択培地Ｘ－ＳＡ寒天培地（ニッスイ社製）に乳汁を１００μｌ播種後、３７℃で２４時間培養し、出現したコロニーを計数した。
　培養法によって算出した黄色ブドウ球菌の数およびイムノクロマト法による判定結果を表８に示す。リゾスタフィンを添加していない場合、１×１０４　（ｃｆｕ／ｍｌ）以下では黄色ブドウ球菌を検出できなかったが、リゾスタフィンを添加することによって５×１０３まで検出することが可能となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　本発明は、家畜の感染症診断に利用することができる。
 

Claims (18)

  1. 乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ方法であって、
    （１）該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第１部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分と、該第１部分又は該第２部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第３部分とを有する試験片に対して、該乳汁を該第３部分又はそれより上流部に接触させる工程；及び
    （２）該乳汁を該第２部分又はそれより下流部まで流し、該第２部分又はそれより下流部で該標識による検出可能な信号を得る工程：
    を含む、上記方法。
  2. イムノクロマトグラフ方法がラテラルフロー型である、請求項１に記載の方法。
  3. 該第１部分に、該特定物質に対する標識された第一の抗体が保持されている、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 特定物質が、細菌の成分又は該細菌が分泌する物質である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
  5. 第一の抗体、及び第二の抗体の少なくとも片方が、モノクローナル抗体である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
  6. 第一の抗体及び第二の抗体が、それぞれモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
  7. 第３部分の空隙の保持粒子サイズが１～３．５μｍである、請求項１から６の何れかに記載の方法。
  8. 第３部分がそれぞれ異なる粒子サイズの乳脂肪球を除去できる空隙を有する２種以上の部材により構成される、請求項１から７の何れかに記載の方法。
  9. 第３部分が下流に配置された第一の部材、及び上流に配置された第二の部材により構成され、第二の部材の保持粒子サイズが第一の部材の保持粒子サイズより大きい、請求項８に記載の方法。
  10. 第一の部材の保持粒子サイズが１．０～２．０μｍであり、第二の部材の保持粒子サイズが３．０～３．５μｍである、請求項９に記載の方法。
  11. 溶菌酵素による処理を経た該乳汁を第２部分又はそれより下流部まで流す工程を含む、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
  12. 溶菌酵素が自己溶菌酵素である、請求項１１に記載の方法。
  13. 溶菌酵素としてリゾスタフィンを用いて該乳汁中のブドウ球菌を検出する、請求項１１に記載の方法。
  14. 家畜の乳房炎の原因菌がブドウ球菌であるか否かを診断する方法であって、
    乳房炎に罹患した家畜から原因菌を含む乳汁を得る工程、該乳汁中に溶菌酵素を混合することにより該原因菌の菌体内に存在する特定物質を菌体外に放出させる工程、及び該特定物質を抗原とする抗体を用いた免疫学的方法によって外特定物質の存在の有無または存在量を測定する工程を含む診断方法。
  15. 溶菌酵素としてリゾスタフィンを用いて原因菌がブドウ球菌であるか否かを診断する、請求項１４に記載の方法。
  16. 該特定物質に対する標識された第一の抗体または標識された該特定物質が保持された第１部分と、該第1部分の下流に連結され、かつ該特定物質に対する第二の抗体が固定化された第２部分と、該第１部分又は該第２部分の上流に連結され、かつ該乳汁中の乳脂肪球を除去できる空隙を有する第３部分とを有する試験片を含む、乳汁中の特定物質を検出するためのイムノクロマトグラフ装置。
  17. 第１部分または第２部分に、溶菌酵素または界面活性剤が保持されてなる、請求項１６に記載のイムノクロマトグラフ装置
  18. 溶菌酵素または界面活性剤を含む添加液と、請求項１６に記載のイムノクロマトグラフ装置とからなる検出キット。
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