WO2013176157A1 - ギ酸脱水素酵素変異体、およびその用途 - Google Patents

ギ酸脱水素酵素変異体、およびその用途 Download PDF

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WO2013176157A1
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amino acid
substituted
acid sequence
cysteine residue
reductase
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桃子 上田
山本　浩明
素子 林
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Daicel Corp
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Daicel Corp
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group

Definitions

  • the present invention relates to a mutant of formate dehydrogenase derived from Mycobacterium vaccae, a DNA encoding the variant, and reduced from oxidized ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP +) using the same.
  • the present invention relates to a method for producing type ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH).
  • NADH reduced ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADPH reduced ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • the coenzyme is reduced by a reaction that reduces coenzyme oxidized ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) to NADH or a reaction that reduces coenzyme oxidized ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP +) to NADPH. It is important to use it repeatedly.
  • Non-patent Document 1 examples of using formate dehydrogenase to reduce coenzyme NAD + to NADH or coenzyme NADP + to NADPH (Non-patent Document 1) and glucose dehydrogenase (Patent Document 3) Examples used have been reported.
  • glucose dehydrogenase converts glucose to gluconic acid, there is a problem that gluconic acid equivalent to the target optically active alcohol is by-produced.
  • formate dehydrogenase catalyzes the conversion of formic acid to carbonic acid, and the produced carbonic acid is efficiently removed from the system as carbon dioxide, which can be an economically advantageous process.
  • a disadvantage of using formate dehydrogenase is that the enzyme itself is not highly stable, and thus inactivation tends to occur. This deactivation is known to be affected by various factors, pH value, temperature, mechanical load, ionic strength and ionic strength of substrate solution, ionic species, heavy metals, oxidation of thiol groups by oxygen, etc. (Patent Literature) 4). For this reason, methods for increasing stability by the mutations listed below are known.
  • Non-Patent Document 2 mutants in which the serine at positions 131, 160, 168, 184, 228 is substituted with alanine, valine, or leucine to increase thermal stability have also been reported (Non-patent Document 3).
  • the present inventors have introduced a site-specific mutation into a formate dehydrogenase derived from Mycobacterium vaccae, so that ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) -dependent formic acid can be obtained under organic solvent conditions. It shows that dehydrogenase activity occurs (Patent Document 5).
  • formate dehydrogenases Many of the formate dehydrogenases reported so far are ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) -dependent formate dehydrogenase, ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) -dependent There were only a few formate dehydrogenases.
  • NAD ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • Non-Patent Documents 5 to 8 Attempts have been made (Non-Patent Documents 5 to 8).
  • Non-Patent Document 5 NADP-dependent formate dehydrogenase from Burkholderia stabilis, and reported that coenzyme dependence was altered to NAD-dependent by replacing glutamine at position 223 with glutamate.
  • NADP ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and the object thereof is to formate dehydrogenase whose activity does not decrease even in the process of producing a reduced product from an oxidized substrate while regenerating the coenzyme NADPH. Is to provide. Furthermore, another object of the present invention is to efficiently produce a reduced product from an oxidized substrate using such an enzyme.
  • the present inventors have conducted intensive research.
  • the present inventors introduced ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) under organic solvent conditions by introducing a site-specific mutation into formate dehydrogenase derived from Mycobacterium vaccae. It has been clarified that highly dependent formate dehydrogenase activity occurs (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-223776).
  • NAD ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide
  • mutant enzyme produces ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) -dependent formate dehydrogenase activity, but ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) -dependent formate dehydrogenase activity is not. It was low.
  • NAD ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • the present inventors further introduced site-specific mutations into the mutant enzyme, thereby exhibiting resistance to organic solvents or increasing activity by organic solvents, while increasing ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ( We searched for mutants of formate dehydrogenase that showed NADP) -dependent formate dehydrogenase activity.
  • the present inventors constructed a formate dehydrase mutant exhibiting ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) -dependent formate dehydrogenase activity to efficiently convert the substrate from an oxidized substrate to the substrate.
  • NADP ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • the present invention relates to the following protein and a method for efficiently producing a reduced product from an oxidized substrate using the protein.
  • a protein comprising the amino acid sequence described in the following (a) or (b), and having a ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-dependent formate dehydrogenase activity; (A) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence comprising a mutation in which at least the histidine residue at position 224 is substituted with an amino acid other than histidine, or (b) in the amino acid sequence described in (a), 1 Alternatively, an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted.
  • any mutation selected from the group consisting of the following (1) to (13), and / or the following (14) comprising an amino acid sequence having any mutation selected from the group consisting of: (16); (1) an amino acid sequence in which cysteine residues at positions 6, 146, and 256 are both substituted with serine, (2) an amino acid sequence in which the cysteine residue at position 6 is substituted with alanine and the cysteine residue at position 256 is substituted with serine, (3) an amino acid sequence in which the cysteine residue at position 6 is substituted with valine and the cysteine residue at position 256 is substituted with serine; (4) an amino acid sequence in which the cysteine residue at position 6 is substituted with serine and the cysteine residue at position 256 is substituted with alanine, (5) an amino acid sequence in which the cysteine residue at position 6 is substituted with serine and the cysteine
  • the cysteine residue at position 6 is alanine
  • the cysteine residue at position 146 is serine
  • the cysteine residue at position 256 is The protein according to [1] or [2], comprising an amino acid sequence comprising a mutation substituted with valine and / or a mutation wherein the aspartic acid residue at position 222 is substituted with glutamine, asparagine or glycine.
  • the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 consisting of an amino acid sequence comprising a mutation in which the aspartic acid residue at position 222 is substituted with glutamine in addition to the mutation at position 224, ] The protein of description.
  • [7] DNA encoding the protein according to any one of [1] to [6].
  • [8] A vector into which the DNA according to [7] is inserted.
  • the reductase is at least one reductase selected from the group consisting of tropinone reductase, imine reductase, ⁇ -keto acid reductase, enone reductase, and carbonyl reductase.
  • [11] A transformant carrying the vector according to any one of [8] to [10].
  • [12] The transformant according to [11], wherein the host cell is a microorganism.
  • a method for producing a reduced product of the substrate from an oxidized substrate comprising the following steps; (1) A step of producing reduced ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate by the method according to [15], and (2) a reduced ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, oxidized type of step (1) Contacting the substrate with a reductase capable of producing a reduced product from the oxidized substrate in the presence of reduced ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, and recovering the reduced product produced.
  • the present invention provides a mutant of ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-dependent formate dehydrogenase derived from Mycobacterium vaccae.
  • One preferred embodiment of the mutant of the present invention is that, in the formate dehydrogenase mutant derived from Mycobacterium vaccae (SEQ ID NO: 2), at least the histidine residue at position 224 is changed to an amino acid other than histidine.
  • a mutant containing a substituted mutation (hereinafter referred to as “224 mutant”).
  • the substituted amino acid at position 224 is preferably asparagine. If the 224 mutant has a histidine residue at position 224 substituted with an amino acid other than histidine, one or more amino acids in the amino acid sequence other than position 224 are substituted, deleted, added, and / or inserted. It may have a mutation. Such mutations can be introduced artificially or can occur in nature.
  • the variants of the present invention include both of these variants.
  • the number of amino acids to be mutated in the 224 mutant is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids (for example, within 5 amino acids, within 3 amino acids).
  • the protein of the present invention is accompanied by a mutation such as amino acid deletion, addition, or insertion at a position other than position 224 of the formate dehydrogenase mutant (SEQ ID NO: 2) derived from Mycobacterium vaccae.
  • the position of histidine residues counted from the N-terminus may vary.
  • histidine at least at position 224 in SEQ ID NO: 2 is substituted with another amino acid sequence to obtain a protein according to the present invention.
  • the protein of the present invention includes a high ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphoprotein in which the amino acid at position 224 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with an amino acid other than histidine. Proteins having acid-dependent formate dehydrogenase activity are included.
  • the homologous position can be revealed by aligning the amino acid sequence around histidine with the amino acid sequence around histidine at position 224 in SEQ ID NO: 2. Such an operation is called amino acid sequence alignment.
  • amino acid sequence alignment As an algorithm for alignment, for example, BLAST can be shown.
  • One skilled in the art can determine the position of homologous amino acids by alignment between amino acid sequences of different lengths.
  • the 224 mutant preferably has a higher ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-dependent formate dehydrogenase activity compared to formate dehydrogenase (SEQ ID NO: 2) from Mycobacterium vaccae. It is a variant which shows.
  • the ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-dependent formate dehydrogenase activity is high means that the enzyme activity when ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate is a coenzyme is at least 20 mU / It means having an enzyme activity of mL-br or higher, for example, 30 mU / mL-br or higher, preferably 35 mU / mL-br or higher, more preferably 40 mU / mL-br or higher.
  • Natural formate dehydrogenase can only recognize a slight enzyme activity (at most 15 mU / mL-br) when ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate is used as a coenzyme.
  • the 224 mutant exhibits high ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-dependent formate dehydrogenase activity.
  • Formate dehydrogenase activity can be measured by methods generally performed by those skilled in the art. For example, the following method can be illustrated. The reaction is carried out at 30 ° C. in a reaction solution containing potassium phosphate buffer (pH 7.0, 100 mM), NADP + 2.5 mM, sodium formate 100 mM, and the enzyme, and the increase in absorbance at 340 nm as NADPH increases is measured. 1U is the amount of enzyme that catalyzes an increase of 1 ⁇ mol NADPH per minute. Proteins are quantified by a dye binding method using a BioRad protein assay kit.
  • the aspartic acid residue at position 222 is substituted with an amino acid other than aspartic acid. It is a mutant containing a mutation (hereinafter referred to as “224-222 mutant”).
  • the substituted amino acid at position 222 is preferably glutamine, asparagine, or glycine, and particularly preferably glutamine.
  • the aspartic acid residue at position 222 is substituted with an amino acid other than aspartic acid, one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence other than position 222. Etc.
  • the variants of the present invention include both of these variants.
  • the number of amino acids to be mutated in the 224-222 mutant is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids (eg, within 5 amino acids, within 3 amino acids).
  • the 224-222 variant is preferably highly ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dependent compared to the formate dehydrogenase (SEQ ID NO: 2) from Mycobacterium vaccae or the 222 variant. It is a variant which shows type formate dehydrogenase activity.
  • a mutation in which at least a cysteine residue at position 146 is substituted with an amino acid other than cysteine is provided.
  • the substituted amino acid at position 146 is preferably serine or valine. If the 146 variant has a cysteine residue at position 146 substituted with an amino acid other than cysteine, one or more amino acids in the amino acid sequence other than position 146 are substituted, deleted, added and / or inserted. It may have a mutation. Such mutations can be introduced artificially or can occur in nature.
  • the variants of the present invention include both of these variants.
  • the number of amino acids to be mutated in the 224-146 mutant is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids (eg, within 5 amino acids, within 3 amino acids).
  • a mutation in which a cysteine residue at position 256 is substituted with an amino acid other than cysteine in addition to the mutation at position 224 of the formate dehydrogenase derived from Mycobacterium spp.
  • Mutants hereinafter referred to as “224-256 mutants”.
  • the substituted amino acid at position 256 is preferably serine, alanine, or valine.
  • the cysteine residue at position 256 is substituted with an amino acid other than cysteine, one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence other than position 256. Etc. may have such mutations.
  • the variants of the present invention include both of these variants.
  • the number of amino acids to be mutated in the 224-256 mutant is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids (eg, within 5 amino acids, within 3 amino acids).
  • the 224-256 mutant preferably exhibits higher resistance to organic solvents compared to formate dehydrogenase (SEQ ID NO: 2) derived from Mycobacterium vaccae.
  • organic solvent include 4-haloacetoacetic acid ethyl ester, 4-bromoacetoacetic acid ethyl ester, 4-iodoacetoacetic acid ethyl ester, methyl 4-chloroacetoacetate, propyl 4-chloroacetoacetate and the like.
  • Haloacetophenones such as chloroacetophenone and bromoacetophenone, and 3-halo-1-phenyl-2-propanone such as 3-chloro-1-phenyl-2-propanone and 3-bromo-1-phenyl-2-propanone
  • derivatives etc. can be mentioned, it is not limited to these organic solvents.
  • the 224-256 mutant is highly resistant in at least one organic solvent.
  • the resistance of formate dehydrogenase to organic solvents, such as resistance to ethyl 4-chloroacetoacetate, can be measured as follows.
  • both the cysteine residues at positions 146 and 256 are changed to amino acids other than cysteine.
  • a mutant containing at least a substituted mutation (hereinafter referred to as “224-146-256 mutant”).
  • the substituted amino acid at position 146 is preferably serine or valine
  • the substituted amino acid at position 256 is preferably serine, alanine, or valine.
  • the mutation of amino acids other than positions 146 and 256 is not particularly limited.
  • the 224-146-256 mutant preferably exhibits high formate dehydrase activity in the presence of an organic solvent as compared to formate dehydrogenase derived from Mycobacterium 2vaccae (SEQ ID NO: 2), In addition, it exhibits high resistance to organic solvents.
  • the cysteine residue at position 6 is other than cysteine. It is a mutant of formate dehydrase containing a mutation substituted with an amino acid.
  • the substituted amino acid at position 6 is preferably serine, alanine, or valine.
  • the mutant preferably has a higher formate dehydrase activity in the presence of an organic solvent and / or higher relative to an organic solvent compared to formate dehydrogenase (SEQ ID NO: 2) from Mycobacterium vaccae Shows tolerance.
  • a specific example of a preferred variant of the present invention is a variant comprising an amino acid sequence having any mutation selected from the group consisting of the following (a) to (n) in addition to the mutation at position 224: .
  • the cysteine residue at position 6 is alanine and position 256 A mutant of formate dehydrogenase derived from Mycobacterium buccae in which the cysteine residue is substituted with serine (i) the cysteine residue at position 6 in valine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is at position 256 Mutant of formate dehydrogenase derived from Mycobacterium baccae in which the cysteine residue is substituted with serine (j) In the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, the cysteine residue at position 6 is serine and the cysteine at position 256 Mutant of formic acid dehydrogenase derived from Mycobacterium baccae wherein the residue is substituted with alanine (k) In the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, the cysteine residue at position 6 is the serine residue at position 256 Mutant of formate dehydrogenase derived from Mycobacterium buccae in which the cysteine residue is substituted with
  • mutants (a) to (n) exhibits high formate dehydrase activity in the presence of an organic solvent.
  • the mutants shown in (b), (c), (h), (i), (j), (k), and (m) exhibit high resistance to organic solvents.
  • the mutants shown in (d), (f), (g), (l), and (n) show high formate dehydrogenase activity in the presence of an organic solvent and show high resistance to the organic solvent.
  • These mutants may further include a mutation in which the aspartic acid residue at position 222 is substituted with glutamine, asparagine, or glycine.
  • the above mutant of the present invention can be obtained, for example, by modifying the amino acid sequence of formate dehydrase derived from Mycobacterium buccae.
  • These proteins can be obtained by methods commonly used by those skilled in the art, such as site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M (1983) (Methods Enzymol. 100, 468-500) and the like. Specifically, it can be obtained by the method shown in the examples of JP-A-2002-223776.
  • the applicant of the present application has deposited E. coli having pSFR415 (JM109 (pSFR415)) and E. coli having pSFR426 (JM109 (pSFR426)) described in JP-A-2002-223776. DNA inserted into the plasmid can be suitably used in the production of the mutant of the present invention.
  • the region around the 256th cysteine residue in the formate dehydrogenase derived from Mycobacterium buccae is a region conserved in other formate dehydrogenases.
  • the 256th cysteine is, for example, Aspergillus nidulans (currently From Emericella nidulans, 224 position cysteine, from Hansenula polymorpha (now Pichia angusta) (SWISS: P33677), 228 position cysteine, from Neurospora crassa (SWISS: NEUFDHA) corresponds to cysteine at position 228, and from Pseudomonas sp. 101 (SWISS: P33160) corresponds to position cysteine at position 255.
  • Aspergillus nidulans currently From Emericella nidulans, 224 position cysteine, from Hansenula polymorpha (now Pichia angusta)
  • SWISS: NEUFDHA 228 position cysteine
  • the region around the cysteine residue at position 146 in the formate dehydrogenase derived from Mycobacterium buccae is a region conserved in other formate dehydrogenases, for example, derived from Pseudomonas sp. 33101 (SWISS: P33160) Corresponds to cysteine at position 145 (Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 479-483, 1995).
  • SWISS: P33160 Publ. Microbiol. Biotechnol. 44, 479-483, 1995.
  • These known enzymes can also be expected to have an effect of improving resistance to organic solvents and / or an activation effect of organic solvents by modification by site-specific mutation.
  • the present invention also relates to DNA encoding a formate dehydrogenase mutant.
  • the DNA encoding the mutant of formate dehydrogenase of the present invention is, for example, the site-specific DNA commonly used by those skilled in the art to the DNA encoding formate dehydrogenase derived from Mycobacterium buccae described in SEQ ID NO: 1. It can be obtained by introducing a base substitution using a method for introducing a mutation.
  • the present invention provides a formate dehydrogenase mutant expression vector prepared by inserting the thus obtained DNA encoding the formate dehydrogenase mutant of the present invention into a known expression vector. . By culturing the transformant transformed with the expression vector, the mutant of formate dehydrogenase of the present invention can be obtained as a recombinant protein.
  • the present invention provides for the expression of a formate dehydrase mutant and a reductase produced by inserting a DNA encoding the formate dehydrase mutant of the present invention and a DNA encoding a reductase into a known expression vector.
  • Provide vector By culturing the transformant transformed with the expression vector, the formate dehydrase mutant and the reductase of the present invention can be obtained as a recombinant protein.
  • the reductase preferably includes at least one reductase selected from the group consisting of tropinone reductase, imine reductase, ⁇ -keto acid reductase, enone reductase, and carbonyl reductase. .
  • the following microorganism-derived reductase can be mentioned.
  • Tropinone reductase Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-230398
  • -Tropinone reductase-I from Datura stramonium Imine reductase WO2010-024445, WO2010-024444, Japanese Patent Application No. 2010-0413708
  • a microorganism to be transformed encodes a formate dehydrogenase mutant DNA and / or a reductase.
  • the organism is not particularly limited as long as it is transformed with a recombinant vector containing the DNA to be expressed and can express a formate dehydrogenase mutant and / or a reductase.
  • Such a transformant and a method for producing a formate dehydrase mutant and / or a reductase of the present invention comprising the step of culturing the transformant are also encompassed in the present invention.
  • microorganisms that can be used as a host organism for the transformant include the following microorganisms. Escherichia genus, Bacillus genus, Pseudomonas genus, Serratia genus, Brevibacterium genus, Corynebacterium genus, Streptococcus genus, Lactobacillus genus Host vector systems such as the genus (Lactobacillus) and other host vector systems such as the genus Rhodococcus and Streptomyces, and the genus Actinomyces and Saccharomyces Kluyveromyces genus, Schizosaccharomyces genus, Zygosaccharomyces genus, Yarrowia genus, Trichosporon genus, Rhodosporidium genus, Rhodosporidium genus, Pichia P Yeast and Neurospora genus for which host vector systems such as (Can
  • the procedure for producing transformants and the construction of a recombinant vector suitable for the host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering (for example, Sambrook et al., Molecular cloning, ColdCSpring Harbor Laboratories).
  • the DNA of the present invention is transferred to a plasmid vector or a phage vector that is stably present in the microorganism. Introduce and transcribe and translate the genetic information.
  • a promoter corresponding to a unit controlling transcription / translation may be incorporated upstream of the 5′-side of the DNA strand of the present invention, more preferably a terminator downstream of the 3′-side.
  • a promoter and terminator a promoter and terminator known to function in a microorganism used as a host is used.
  • vectors, promoters, terminators and the like that can be used in these various microorganisms, for example, “Basic Course of Microbiology 8 Genetic Engineering / Kyoritsu Shuppan”, especially regarding yeast, Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990) Yeast 8, 423-488 (1992), etc.
  • Escherichia In the genus Escherichia, particularly Escherichia coli, Escherichia coli, for example, plasmids such as pBR and pUC can be used, and lac ( ⁇ -galactosidase), trp (tryptophan operon), tac, trc (lac, trp Fusion), promoters derived from ⁇ phage PL, PR, etc. can be used.
  • lac ⁇ -galactosidase
  • trp tryptophan operon
  • tac trc
  • the terminator a terminator derived from trpA, phage, or rrnB ribosomal RNA can be used.
  • pUB110 series plasmids In the genus Bacillus, pUB110 series plasmids, pC194 series plasmids, etc. can be used as vectors, and can be integrated into chromosomes. Further, apr (alkaline protease), npr (neutral protease), amy ( ⁇ -amylase) or the like can be used as a promoter or terminator.
  • host vector systems such as Pseudomonas putida and Pseudomonas cepacia have been developed.
  • a broad host range vector including genes necessary for autonomous replication derived from RSF1010
  • pKT240 based on the plasmid TOL plasmid involved in the degradation of toluene compounds can be used.
  • a lipase Japanese Patent Laid-Open No. 5-284973 gene or the like can be used.
  • plasmid vectors such as pAJ43 (Gene 39, 281 (1985)) can be used.
  • promoter or terminator promoters and terminators used in E. coli can be used as they are.
  • plasmid vectors such as pCS11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799) and pCB101 (Mol.etGen. Genet. 196, 175 (1984) are available. is there.
  • pAM ⁇ 1 J. Bacteriol. 137, 614 (1979) developed for Streptococcus can be used, and those used in Escherichia coli as promoters can be used. .
  • Rhodococcus In the genus Rhodococcus, plasmid vectors and the like isolated from Rhodococcus rhodochrous can be used (J.olGen. Microbiol. 138,1003, (1992)).
  • plasmids can be constructed according to the method described in Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories (1985).
  • pIJ486 Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986
  • pKC1064 Gene 103, 97-99 (1991)
  • pUWL-KS Gene 165, 149 -150 (1995)
  • the same plasmid can also be used in Streptomyces virginiae (Actinomycetol. 11, 46-53 (1997)).
  • YRp, YEp, YCp, and YIp plasmids can be used, and homologous recombination with multiple copies of ribosomal DNA in the chromosome can be performed.
  • the utilized integration vector (EP 456456, etc.) is extremely useful because it can introduce a gene in multiple copies and can stably hold the gene.
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • GAPDH glycosyl dehydrogenase
  • PHO acid phosphatase
  • GAL ⁇ -galactosidase
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • ENO enolase
  • Kluyveromyces in particular Kluyveromyces lactis, 2 ⁇ m-type plasmid derived from Saccharomyces cerevisiae, pKD1-type plasmid (J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)), killer A plasmid derived from pGKl1 involved in the activity, an autonomously proliferating gene KARS plasmid in the genus Kleberomyces, a vector plasmid that can be integrated into the chromosome by homologous recombination with ribosomal DNA, etc. (EP 537456, etc.) can be used.
  • promoters and terminators derived from ADH, PGK and the like can be used.
  • plasmid vectors containing ARS derived from Schizosaccharomyces pombe (genes involved in autonomous replication), and selection markers that complement auxotrophy derived from Saccharomyces cerevisiae, etc. are available (Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)).
  • the ADH promoter derived from Schizosaccharomyces pombe can be used (EMBO J. 6, 729 (1987)).
  • pAUR224 is commercially available from Takara Shuzo and can be easily used.
  • plasmid vectors derived from Zygosaccharomyces rouxii pSB3 (Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)), etc. are available, and S. cerevisiae ⁇ Saccharomyces ⁇ Promoters and promoters of ⁇ GAP-Zr (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) derived from Tigo Saccharomyces rouxi (Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)) are available.
  • Pichia angusta formerly Hansenula polymorpha
  • genes involved in autonomous replication derived from Pichia Angusta HSS1, HARS2 can be used, but because they are relatively unstable, multicopy integration into the chromosome is effective (Yeast 7, 431- 443 (1991)).
  • AOX alcohol oxidase
  • FDH formate dehydrogenase
  • host vector systems using genes (PARS1, PARS2), etc. involved in Pichia-derived autonomous replication have been developed in Pichia pastoris (Mol. Cell, Biol., 5, 3376 (1985)). Strong promoters such as high concentration culture and methanol-inducible AOX can be used (Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)).
  • Candida In the genus Candida, the host vector system in Candida maltosa, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida utilis etc. Has been developed.
  • Candida maltosa ARS derived from Candida maltosa has been cloned (Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)), and vectors using this have been developed.
  • Candida utilis a strong promoter for a chromosome integration type vector has been developed (Japanese Patent Laid-Open No. 08-173170).
  • Aspergillus Aspergillus niger, Aspergillus oryzae etc. are the most studied among molds, and it is possible to use integration into plasmids and chromosomes, Promoters derived from extracellular proteases or amylases are available (Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)).
  • Trichoderma In the genus Trichoderma, a host vector system using Trichoderma reesei has been developed, and a promoter derived from an extracellular cellulase gene can be used (Biotechnology 7, 596-603 (1989)).
  • various host / vector systems have been developed in plants and animals, especially in plants such as insects such as moths (Nature 315, 592-594 (1985)), rapeseed, corn, or potatoes.
  • insects such as moths (Nature 315, 592-594 (1985)), rapeseed, corn, or potatoes.
  • a system for expressing a large amount of heterologous protein has been developed and can be suitably used.
  • Microorganisms capable of producing formate dehydrogenase mutants used in the present invention are produced by using Mycobacterium buccae mutants, variants, and genetic engineering techniques capable of producing formate dehydrogenase mutants. And a transformant that has acquired the enzyme-producing ability of the present invention.
  • the present invention also relates to a coenzyme NADP + (oxidized ⁇ -nicotinamide dinucleotide phosphate) using the mutant of the formate dehydrogenase of the present invention, the transformant of the present invention, or a processed product of the transformant.
  • a method for producing NADPH is provided.
  • the coenzyme NADPH is useful as a reduced coenzyme for various carbonyl reductases, alcohol dehydrogenases, aldehyde dehydrogenases, hydroxy acid dehydrogenases, and amino acid dehydrogenases, and these enzymes exhibit their reducing ability. It is an indispensable coenzyme.
  • the present invention relates to NADP + produced when a reduced product of a substrate is produced from an oxidized substrate by a NADPH-dependent reductase, from formic acid to carbonic acid using a formate dehydrogenase mutant of the present invention.
  • a method for efficiently producing the reduced product by regenerating to NADPH by a conversion reaction of The NADPH-dependent reductase refers to an enzyme that performs a reductive reaction using NADPH as a coenzyme, and may be an enzyme that can catalyze both a reductive reaction and an oxidative reaction, such as alcohol dehydrogenase.
  • the transformant of the present invention or a processed product of the transformant can be used instead of the formate dehydrase mutant of the present invention.
  • Examples of the NADPH-dependent reductase, its oxidized substrate, and the reduced product of the substrate include, but are not limited to, the following combinations.
  • Production of carbon-carbon single bonds from carbon-carbon double bonds by enzymes that generate carbon-carbon single bonds by reducing carbon-carbon double bonds EC 1.3.1.-
  • Reductive using carbonyl groups as substrates Production of amino acids from keto acids by enzymes that generate amino groups by amination (EC 1.4.1.-) Enzymes that generate diols by adding oxygen to carbon-carbon double bonds (EC 1.14.12.-) Production of diols from alkenes
  • enzymes classified as EC 1.1.1.- include alcohol dehydrogenase, D-hydroxyisocaproate dehydrogenase, L-hydroxyisocaproate dehydrogenase, D-mandelate dehydrogenase, for example. , L-mandelate dehydrogenase, D-lactate dehydrogenase, and L-lactate dehydrogenase.
  • Examples of the enzymes classified as E.C.1.2.1.- include aldehyde dehydrogenase.
  • Examples of the enzymes classified as E.C.1.3.1.- ⁇ include enoyl-CoA reductase and fumarate reductase.
  • Examples of enzymes classified as E.C.1.4.1.- include phenylalanine dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, leucine dehydrogenase, and alanine dehydrogenase.
  • Examples of the enzyme classified as E.C.1.14.2.- include benzenedioxygenase.
  • the substrate in which these enzymes are allowed to act is not particularly limited as long as it is a compound that can act on the enzyme.
  • Those having halogen, sulfur, and / or phosphorus in the substrate molecule, hydroxyl group, amino Examples thereof include those having a group, those having a branched carbon chain, those having an unsaturated carbon chain, and those having an aromatic ring including a heterocyclic ring.
  • the formate dehydrogenase variants of the present invention are resistant to and / or activated by organic solvents and thus have a longer and / or higher activity even in the presence of, for example, ketones and alcohols. This is advantageous in industrial alcohol production.
  • the carbonyl reductase is not particularly limited as long as it uses NADPH as a coenzyme and generates alcohol from a ketone.
  • the reaction solution is obtained by dissolving NADPH, a coenzyme necessary for the substrate and enzyme reaction, in a solvent suitable for the expression of the enzyme activity.
  • the processed product of a microorganism containing a mutant of formate dehydrogenase or the processed product of a microorganism containing a carbonyl reductase according to the present invention has a cell membrane permeability by treatment with an organic solvent such as a surfactant or toluene. Examples thereof include microorganisms that have been changed, cell-free extracts obtained by crushing bacterial cells by glass beads or enzyme treatment, and products obtained by partially purifying the extracts.
  • the ketone used as a raw material for the production of alcohol according to the present invention is not particularly limited as long as the carbonyl reductase used can be reduced.
  • the reaction using the enzyme of the present invention is carried out in water or an organic solvent that is difficult to dissolve in water, for example, an organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, toluene, chloroform, cyclohexane, 1-octanol, n-hexane, and n-octane. Or a two-phase system with an aqueous medium. It can also be carried out in a mixed solvent system in which a water-soluble solvent such as methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile, or acetone is added to an aqueous system such as a buffer solution.
  • a reaction in a reverse micelle system can also be carried out, and examples of the surfactant include an isooctane / water reverse micelle system using aerosol OT (Aerosol OT).
  • the reaction of the present invention can be performed using, for example, an immobilized enzyme, a membrane reactor, or the like.
  • an immobilized enzyme a membrane reactor, or the like.
  • a sulfur-containing polysaccharide such as ⁇ -carrageenan, calcium alginate, agar gel method
  • a known method such as a polyacrylamide gel method.
  • the reaction of the present invention may be carried out under conditions that allow the enzyme of the present invention to react.
  • the reaction temperature is 4-60 ° C, preferably 10-37 ° C, pH 3-11, preferably pH 5-8, and the substrate concentration is 0.01-90. %, Preferably 0.1-30%.
  • 0.001 mM-100 mM, preferably 0.01-10 mM of coenzyme NADP + or NADPH can be added to the reaction system as necessary.
  • the substrate can be added all at once at the start of the reaction, but it is desirable to add the substrate continuously or intermittently so that the substrate concentration in the reaction solution does not become too high.
  • the alcohol produced by the reduction of the ketone of the present invention can be purified by appropriately combining fungal cells, protein centrifugation, separation by membrane treatment, solvent extraction, distillation, crystallization and the like.
  • the reaction solution containing microbial cells is centrifuged, the microbial cells are removed, proteins are removed by ultrafiltration, and a solvent such as 1-butanol is added to the filtrate. Extract 3-quinuclidinol into the solvent layer. After phase separation, high-purity 3-quinuclidinol can be purified by concentration under reduced pressure.
  • all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
  • Example 1 Mutation introduction to Mycobacterium baccae-derived formate dehydrogenase mutant by PCR Mycobacterium vaccae-derived formate dehydrogenase mutant McFDH-37 (see below) Based on the expression vector pSU-MF37 in Example 1), McFDH-40-F01 (5 ') is used as a mix primer for changing His at position 224 of Mycobacterium baccae-derived formate dehydrogenase to an amino acid other than His.
  • H224X substitution of His at position 224 with any amino acid is referred to as H224X.
  • the resulting PCR amplified fragment was ligated with the pSU-MF37 double digested with two restriction enzymes NcoI and EcoRI using the In-Fusion cloning system (Clontech), and formic acid dehydrated with the H224X mutation introduced Plasmid pSU-MF37m capable of expressing the enzyme enzyme McFDH-37 mutant was obtained.
  • Example 2 The Escherichia coli JM109 strain was transformed with the plasmid pSU-MF37m expressing the mycobacterium baccae-derived formate dehydrogenase mutant constructed in Example 1. 194 recombinant E. coli were inoculated into LB medium (1% bactotryptone, 0.5% bacto yeast extract, 1% sodium chloride), cultured at 30 ° C overnight, then isopropylthio- ⁇ -galactopyranoside ( Thereafter, IPTG) was added and further cultured.
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% bacto yeast extract, 1% sodium chloride
  • the cells are collected by centrifugation, suspended in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.01% dithiothreitol, and treated for 4 minutes using a sealed ultrasonic crusher. It was crushed. The cell disruption solution was centrifuged, the supernatant was recovered as a cell extract, and the formate dehydrogenase activity was measured. Formate dehydrogenase activity was reacted at 30 ° C in a reaction solution containing potassium phosphate buffer (pH 7.0, 100 mM), NAD + or NADP + 2.5 mM, sodium formate 100 mM and enzyme, and increased to 340 nm as NADH or NADPH increased. Measured by increase in absorbance.
  • 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes an increase in 1 ⁇ mol of NADH or NADPH per minute.
  • the amount of protein was measured using Bio-Rad Protein Assay Kit (manufactured by Bio-Rad). From these, 2 clones having high activity were selected, cultured in LB medium containing ampicillin, and then purified from the cells to obtain a plasmid. For the purified plasmid, the nucleotide sequence of the mutated portion was confirmed by the primer walking method.
  • Example 3 The Escherichia coli JM109 strain was transformed with the plasmid pSU-MF40 expressing the mycobacterium baccae-derived formate dehydrogenase constructed in Example 2. Each recombinant Escherichia coli was inoculated into LB medium containing ampicillin and cultured at 30 ° C. overnight, and then IPTG was added and further cultured. The cells are collected by centrifugation, suspended in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.01% dithiothreitol, and treated for 4 minutes using a sealed ultrasonic crusher. It was crushed.
  • 100 mM potassium phosphate buffer pH 7.0
  • the cell disruption solution was centrifuged, the supernatant was recovered as a cell extract, and the formate dehydrogenase activity was measured. Formate dehydrogenase activity was reacted at 30 ° C in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 2.5 mM NAD + or NADP +, 100 mM sodium formate, and enzyme, and increased to 340 nm as NADH or NADPH increased. Measured by increase in absorbance. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes an increase in 1 ⁇ mol of NADH or NADPH per minute. Table 1 shows the enzyme activity of the crude enzyme solution obtained from recombinant Escherichia coli.
  • Example 4 The dura stramonium-derived tropinone reductase-I expression plasmid pSG-DSR1 described in JP-A-2003-230398 is used as a sense primer DsTR1-A2 (5'-GTCAGAGGAATTCTAAAATGGAAGAATCAAAAGTGTCCATG-3 '/ SEQ ID NO: 19) and antisense. PCR was performed with a set of primers DsTR1-T2 (5′-GTCCTTAAGTTAAAACCCACCATTAGCTGTG-3 ′ / SEQ ID NO: 20). As a result of analyzing a part of the PCR reaction solution by agarose gel electrophoresis, a specific band of about 850 bp was detected.
  • the PCR reaction solution was treated to recover the DNA fragment and double digested with restriction enzymes EcoRI and AflII. After treatment with phenol-chloroform, agarose gel electrophoresis was performed, and the target band portion was excised and purified to recover the target DNA fragment.
  • Plasmid pSU-MF40 is double-digested with restriction enzymes EcoRI and AflII, treated with phenol-chloroform in the same manner, and then subjected to agarose gel electrophoresis. The target band is excised, purified, and purified using T4 DNA ligase. The DNA fragments were ligated. E. coli JM109 was transformed with the obtained plasmid.
  • the transformed strain was grown on an LB medium plate containing ampicillin, and colony direct PCR was performed with a set of sense primer DsTR1-A2 and antisense primer DsTR2, and the size of the inserted fragment was confirmed.
  • a colony considered to have a DNA fragment of about 850 bp inserted was cultured in LB medium containing ampicillin and purified from the cells to obtain plasmid pSF-DSR4.
  • plasmids pSU-MF37 and plasmid pSU-MF26 described in WO2006 / 132145 were similarly double digested with EcoRI and AflII, and the target DNA fragments were ligated to obtain plasmids pSF-DSR1 and pSF-DSR3, respectively. It was.
  • Example 5 After inoculating Escherichia coli co-expressing the mycobacterium baccae-derived formate dehydrogenase and Datsura Stramonium-derived tropinone reductase constructed in Example 4 in LB medium containing ampicillin and culturing overnight at 30 ° C, IPTG Added and further cultured. The cells are collected by centrifugation, then suspended in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.01% dithiothreitol, and 4 minutes using a sealed ultrasonic crusher UCD-200TM (Cosmo Bio). The cells were crushed by the treatment.
  • 100 mM potassium phosphate buffer pH 7.0
  • UCD-200TM sealed ultrasonic crusher
  • the cell disruption solution was centrifuged, and the supernatant was recovered as a cell extract, and formate dehydrogenase activity and tropinone reductase activity were measured. Formate dehydrogenase activity was measured by the method described in Example 3.
  • Tropinone reductase activity was caused by a decrease in absorbance at 340 nm as NADPH decreased, when reacted at 30 ° C in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 0.2 mM NADPH, 4 mM 3-quinuclidinone, and enzyme. It was measured. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the decrease of 1 ⁇ mol of NADPH per minute.
  • Table 1 shows the enzyme activity of the crude enzyme solution obtained from each recombinant Escherichia coli.
  • Example 6 The Escherichia coli HB101 strain was transformed with the plasmids pSF-DSR4, pSF-DSR3, or pSF-DSR1 obtained in Example 4, and the obtained transformant was cultured overnight at 33 ° C. in LB medium containing 0.01 mM IPTG. Thereafter, the cells were collected to obtain Escherichia coli expressing formate dehydrogenase and tropinone reductase. Prepare a reaction solution consisting of 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), cells prepared from 2 mL of the culture solution, 1 wt% 3-quinuclidinone, 100 mM sodium formate, and NADP + (1 mM or without addition) at 30 ° C. The reaction was carried out overnight by shaking at 50 spm. 400 ⁇ L was sampled from the reaction solution, and the conversion rate was analyzed under the analysis conditions described below. NADPH was not added to the reaction solution. The results are shown in Table 2.
  • the analysis regarding the conversion rate was performed as follows. 400 ⁇ L of 1M sodium hydroxide and 1 mL of 1-butanol were suspended in 400 ⁇ L of a sample collected from the reaction solution, and the supernatant obtained by centrifugation was analyzed by gas chromatography. The conversion rate (%) was defined as (3-quinuclidinol area) ⁇ ⁇ (3-quinuclidinone area) + (3-quinuclidinol area) ⁇ ⁇ 100.
  • Example 7 The total amount of the reaction solution obtained using the pSF-DSR4 transformant obtained from Example 6 was used as a sample, and the optical purity was analyzed under the analysis conditions described later. As a result, the peak of the (S) -3-quinuclidinol derivative was not detected and was 100% ee (R).
  • optical purity is ⁇ ((R) -3-quinuclidinol area) ⁇ ((S) -3-quinuclidinol area) ⁇ ⁇ ⁇ ((R) -3-quinuclidinol area) + ((S) -3- Kinuclidinol area) ⁇ ⁇ 100.
  • the DNA fragment amplified by 1st PCR was diluted and mixed, and primers MCF-ATG3 (SEQ ID NO: 13) and MCF-TAA3 (SEQ ID NO: 14) were added, and 2nd PCR (94 ° C., 30 seconds, 50 seconds). °C, 30 seconds, 72 °C, ⁇ 30 seconds, 25 cycles).
  • the obtained PCR amplified fragment was double-digested with two restriction enzymes NcoI and XbaI. Double digestion of pSE420D (Invitrogen plasmid vector pSE420 multicloning site modified plasmid, Japanese Patent Laid-Open No.
  • primer MCF-ATG3 (5'-CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTTCTGTCTGTTC -3 '/ SEQ ID NO: 13)
  • MCF-TAA3 5'- The plasmid pSU-MF38 capable of expressing formate dehydrogenase McFDH-38 introduced with the D222N mutation using the set of CAGTCTAGATTAGACCGCTTTTTTGAATTTGGCG -3 '/ SEQ ID NO: 14) was expressed as primer MCF-ATG3 (5'- CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTTCTGTCTGTTC '/ SEQ ID NO: 13), introduction of D222G mutation using a set of McFDH-39-R01 and primer McFDH-39-F01, MCF-TAA3 (5'- CAGTCTAGATTAGACCGCTTTTTTGAATTT
  • the Escherichia coli JM109 strain was transformed with the plasmid expressing the formate dehydrogenase derived from Mycobacterium baccae constructed in Reference Example 1 or the plasmid expressing the formate dehydrogenase derived from Burkholderia stabilis constructed in Reference Example 2.
  • Each recombinant Escherichia coli is inoculated into a liquid medium (1% bactotryptone, 0.5% bacto-yeast extract, 1.0% sodium chloride, hereinafter LB medium), cultured at 30 ° C. overnight, and then isopropylthio- ⁇ -galacto Pyranoside (hereinafter, IPTG) was added and further cultured.
  • a liquid medium 1% bactotryptone, 0.5% bacto-yeast extract, 1.0% sodium chloride, hereinafter LB medium
  • IPTG isopropylthio- ⁇ -galacto Pyranoside
  • the cells are collected by centrifugation, then suspended in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mM dithiothreitol, and treated for 4 minutes using the UCD-200TM closed ultrasonic crusher (Cosmo Bio). As a result, the cells were crushed. The cell disruption solution was centrifuged, the supernatant was recovered as a cell extract, and the formate dehydrogenase activity was measured.
  • Formate dehydrogenase activity was reacted at 30 ° C in a reaction solution containing potassium phosphate buffer (pH 7.0, 100 mM), NAD + or NADP + 2.5 mM, sodium formate 100 mM and enzyme, and increased to 340 nm as NADH or NADPH increased. Measured by increase in absorbance. 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes an increase in 1 ⁇ mol of NADH or NADPH per minute. The amount of protein was measured using Bio-Rad Protein Assay Kit (manufactured by Bio-Rad). Bovine Plasma Albumin was used as a standard protein. The enzyme activity of the crude enzyme solution obtained from each recombinant E. coli is shown in Table 3.
  • Example 4 Escherichia coli co-expressing mycobacterium baccae-derived formate dehydrogenase and datsura stramonium-derived tropinone reductase constructed in Example 4 was prepared in a liquid medium (1% bactotryptone, 0.5% bacto-yeast extract, 1.0% sodium chloride Inoculated into LB medium) and cultured at 30 ° C. overnight, isopropylthio- ⁇ -galactopyranoside (hereinafter referred to as IPTG) was added and further cultured.
  • IPTG isopropylthio- ⁇ -galactopyranoside
  • the cells are collected by centrifugation, suspended in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.01% dithiothreitol, and treated for 4 minutes using a sealed ultrasonic crushing device. It was crushed. The cell disruption solution was centrifuged, and the supernatant was recovered as a cell extract, and formate dehydrogenase activity and tropinone reductase activity were measured. Formate dehydrogenase activity was reacted at 30 ° C in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 2.5 mM NAD + or NADP +, 100 mM sodium formate, and enzyme, and increased to 340 nm as NADH or NADPH increased.
  • 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes an increase in 1 ⁇ mol of NADH or NADPH per minute.
  • Tropinone reductase activity was caused by a decrease in absorbance at 340 nm as NADPH decreased, when reacted at 30 ° C in a reaction solution containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), 0.2 mM NADPH, 4 mM 3-quinuclidinone, and enzyme. It was measured.
  • 1 U was defined as the amount of enzyme that catalyzes the decrease of 1 ⁇ mol of NADPH per minute.
  • the amount of protein was measured using Bio-Rad Protein Assay Kit (manufactured by Bio-Rad). The enzyme activity of the crude enzyme solution obtained from each recombinant E. coli is shown in Table 4.

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Description

ギ酸脱水素酵素変異体、およびその用途
　本発明は、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素酵素の変異体、該変異体をコードするDNA、およびこれらを利用した酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP+）から還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を製造する方法に関する。
　カルボニル還元酵素を用いて光学活性アルコールを製造する、もしくはイミン還元酵素を用いて光学活性アミンを製造するためには、補酵素として化学量論量の還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)又は還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を必要とする。これらの補酵素は極めて高価であるため、単純に補酵素を必要量使用する方法は、工業的規模で実施する場合に経済的に不利であり、経済的に有利なプロセスを構築するためには、補酵素酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)をNADHに還元する反応、又は補酵素酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP+）をNADPHに還元する反応によって、補酵素を繰り返し利用することが重要となる。
　これまでのところ、補酵素NAD+をNADHに、又は補酵素NADP+をNADPHに還元するために、ギ酸脱水素酵素を使用した例（非特許文献１）や、グルコース脱水素酵素（特許文献３）を使用した例が報告されている。しかしながら、グルコース脱水素酵素はグルコースからグルコン酸への変換を行うために、目的とする光学活性アルコールと当量のグルコン酸が副生されるという問題があった。
　一方、ギ酸脱水素酵素はギ酸から炭酸への変換を触媒し、生成した炭酸は二酸化炭素として系内から効率的に除去されるために、経済的にも有利なプロセスとなりうる。しかし、ギ酸脱水素酵素を使用することの欠点は、酵素自身の安定性が高くないために、失活が起こりやすいことであった。この失活は、種々のファクター、pH値、温度、機械的負荷、基質溶液のイオン強度およびイオン種、重金属、酸素によるチオール基の酸化などによって影響を及ぼされることが知られている（特許文献４）。このため、以下に挙げた突然変異により安定性をあげる方法が知られている。
　ティシュコフ（Tishkov）らは、シュードモナス（Pseudomonas）sp.101 からのギ酸脱水素酵素を部位特異的変異により、２５６位のシステインをセリンやメチオニンに置換し、水銀に対する安定性を増大させたが、熱安定性が減少することを示した（非特許文献２）。同じく１３１位、１６０位、１６８位、１８４位、２２８位のセリンをアラニンやバリン、ロイシンに置換し、熱安定性を増大させた変異体に関しても報告している（非特許文献３）。
　スルザルクジク（Slusarczyk）らは、キャンディダ ボイジニイ（Candida boidinii）からのギ酸脱水素酵素を部位特異的変異により、２３位のシステインをセリンに、２６２位のシステインをバリン、アラニンに置換することにより、銅に対する安定性、弱アルカリ領域での安定性を増大させたが、熱安定性が減少することを示した（非特許文献４）。
　本発明者らは、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素酵素に部位特異的変異を導入することにより、有機溶媒条件下においてβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）依存型の高いギ酸脱水素酵素活性が生じることを示している（特許文献５）。
　これまで報告が行われてきたギ酸脱水素酵素の多くは、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）依存型のギ酸脱水素酵素であり、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）依存型のギ酸脱水素酵素は数種のみであった。ギ酸脱水素酵素を使用することにより、生成する炭酸が除去されるため有利なプロセスとなり得るが、NADPH依存型還元酵素による還元プロセスにおいて、補酵素再生に利用可能な活性を有するギ酸脱水素酵素は知られておらず、ギ酸脱水素酵素によるNADPHの再生はこれまで困難であるとされてきた。
　そのため、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）依存型ギ酸脱水素酵素に部位特異的変異を導入することにより、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）依存型ギ酸脱水素酵素へ改変する試みが行われている（非特許文献５～８）。
　Hatrongjitらは、バークホルデリア スタビリス（Burkholderia stabilis）からNADP依存型ギ酸脱水素酵素を見出し、223位のグルタミンをグルタミン酸に置換することで補酵素依存性がNAD依存型に改変されることを報告している(非特許文献５)。
　Hoelschらは、マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素221位アスパラギン酸をグリシンに置換したNADP依存型ギ酸脱水素酵素変異体と3-ケトアシル還元酵素の融合タンパク質によるキラルアルコール生産を報告している(非特許文献６)。
　Andreadeliらは、キャンディダ ボイジニイからのギ酸脱水素酵素の195位アスパラギン酸をグルタミンに、196位チロシンをヒスチジンに置換しNADP依存型ギ酸脱水素酵素に改変されることを報告している(非特許文献７)。
　また、Wuらは、キャンディダ ボイジニイからのギ酸脱水素酵素の195位アスパラギン酸をグルタミンに、196位チロシンをアルギニンに、197位グルタミンをアスパラギンに置換しNADP依存型ギ酸脱水素酵素に改変されることを報告している(非特許文献８)。
　しかしながら、工業的に利用可能な、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）依存型の高いギ酸脱水素酵素活性を示す改変体はこれまで得られていなかった。
特開昭61-146191 特開平6-209782 特開2000-236883 特開平11-225784 特開2002-223776
Mosbach K., Methods in Enzymology, 136, 9-21, 1987 Tishkov V. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 192, 4480-4485, 1993 Rojkova A.M. et al., FEBS Letters, 445, 183-188, 1999 Slusarczyk H. et al., Eur. J. Biochem., 267, 1280-1289, 2000 Hatrongjit R. et al., Enzyme Microb. Technol., 46, 557-561, 2010 Holsch K. et al., Biotechnol Appl Biochem., 56, 131-140, 2010 Andreadeli A. et al., FEBS J., 275, 3859-3869, 2008 Wu, Weihua; Zhu, Dunming; Hua, Ling； Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 61(3-4), 157-161, 2009
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、補酵素NADPHを再生しながら酸化型基質から還元型生成物を製造する過程においても活性の低下しないギ酸脱水素酵素を提供することにある。さらに、本発明は、このような酵素を利用して効率的に酸化型基質から還元型生成物を製造することをも目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行った。
　本発明者らは、これまでの研究において、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素酵素に部位特異的変異を導入することにより、有機溶媒条件下においてβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）依存型の高いギ酸脱水素酵素活性が生じることを明らかにしている（特開2002-223776）。しかしながら、当該変異体酵素は、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）依存の高いギ酸脱水素酵素活性を生じるものの、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）依存型ギ酸脱水素酵素活性は低いものであった。
　そこで本発明者らは、当該変異体酵素にさらに部位特異的変異を導入することで、有機溶媒に耐性を示す又は有機溶媒によって活性が増大しつつ、高いβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）依存型ギ酸脱水素酵素活性を示すようなギ酸脱水素酵素の変異体の探索を試みた。
　当該酵素の変異体を種々構築し、探索した結果、マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素変異体（アミノ酸配列、配列番号：４）の２２４位のヒスチジン残基をさらに改変することによって、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）依存型ギ酸脱水素酵素活性を示すギ酸脱水素酵素の変異体を構築することに成功した。
　本発明者らは上記の如く、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）依存型ギ酸脱水素酵素活性を示すギ酸脱水酵素変異体を構築することにより、効率的に酸化型基質から該基質の還元型生成物を製造する方法を見出し、本発明を完成させた。
　即ち本発明は、以下の蛋白質、並びに該蛋白質を利用して効率的に酸化型基質から還元型生成物を製造する方法に関する。
　本発明は、より具体的には以下の〔１〕～〔１８〕を提供するものである。
〔１〕次の（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質であって、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存型ギ酸脱水素酵素活性を有する蛋白質；
　（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸において、少なくとも２２４位のヒスチジン残基がヒスチジン以外のアミノ酸へ置換された変異を含むアミノ酸配列、又は
　（ｂ）（ａ）に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列。
〔２〕前記２２４位の置換アミノ酸がアスパラギンであることを特徴とする、〔１〕に記載の蛋白質。
〔３〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、前記２２４位の変異に加えて、更に少なくとも６位、１４６位および／または２５６位のシステイン残基がシステイン以外のアミノ酸へ置換された変異、ならびに／あるいは２２２位のアスパラギン酸残基がアスパラギン酸以外のアミノ酸へ置換された変異を含む蛋白質であることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の蛋白質。
〔４〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、前記２２４位の変異に加えて、下記（１）～（１３）からなる群から選択されたいずれかの変異、および／または下記（１４）～（１６）からなる群から選択されたいずれかの変異を有するアミノ酸配列からなる、〔１〕または〔２〕に記載の蛋白質；
　（１）６位、１４６位、および２５６位のシステイン残基が共にセリンに置換されたアミノ酸配列、
　（２）６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイン残基がセリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
　（３）６位のシステイン残基がバリンに、２５６位のシステイン残基がセリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
　（４）６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がアラニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
　（５）６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
　（６）１４６位のシステイン残基がセリンに置換されたアミノ酸配列、
　（７）２５６位のシステイン残基がセリンに置換されたアミノ酸配列、
　（８）１４６位および２５６位のシステイン残基が共にセリンに置換されたアミノ酸配列、
　（９）２５６位のシステイン残基がバリンに置換されたアミノ酸配列、
　（１０）１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
　（１１）６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
　（１２）６位のシステイン残基がアラニンに、１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、及び
　（１３）６位および１４６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
　（１４）２２２位のアスパラギン酸残基がグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
　（１５）２２２位のアスパラギン酸残基がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列、
　（１６）２２２位のアスパラギン酸残基がグリシンに置換されたアミノ酸配列。
〔５〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、前記２２４位の変異に加えて、６位のシステイン残基がアラニンに、１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換された変異、および／または２２２位のアスパラギン酸残基がグルタミン、アスパラギン、もしくはグリシンに置換された変異を含むアミノ酸配列からなる、〔１〕または〔２〕に記載の蛋白質。
〔６〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、前記２２４位の変異に加えて、２２２位のアスパラギン酸残基がグルタミンに置換された変異を含むアミノ酸配列からなる、〔１〕または〔２〕に記載の蛋白質。
〔７〕〔１〕～〔６〕のいずれか一項に記載の蛋白質をコードするDNA。
〔８〕〔７〕に記載のDNAが挿入されたベクター。
〔９〕更に還元酵素をコードするDNAが挿入された〔８〕に記載のベクター。
〔１０〕前記還元酵素が、トロピノン還元酵素、イミン還元酵素、α－ケト酸還元酵素、エノン還元酵素、およびカルボニル還元酵素からなる群より選択される少なくとも一つ以上の還元酵素であることを特徴とする、〔９〕に記載のベクター。
〔１１〕〔８〕～〔１０〕のいずれかに記載のベクターを保持する形質転換体。
〔１２〕宿主細胞が微生物である〔１１〕に記載の形質転換体。
〔１３〕〔１１〕または〔１２〕に記載の形質転換体を培養する工程を含む、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の蛋白質を製造する方法。
〔１４〕〔９〕または〔１０〕に記載のベクターを保持する形質転換体を培養する工程を含む、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の蛋白質、および還元酵素を製造する方法。
〔１５〕下記の（ａ）から（ｃ）のいずれかを酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸に接触させる工程を含む、酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸から還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を製造する方法；
　（ａ）〔１〕～〔６〕のいずれか一項に記載の蛋白質、
　（ｂ）〔１１〕または〔１２〕に記載の形質転換体、および
　（ｃ）（ｂ）に記載の形質転換体の処理物。
〔１６〕次の工程を含む酸化型基質から該基質の還元型生成物を製造する方法；
　（１）〔１５〕に記載の方法によって還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を製造する工程、および
　（２）工程（１）の還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型基質、および還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の存在下で前記酸化型基質から還元型生成物を生成し得る還元酵素とを接触させ、生成する還元型生成物を回収する工程。
〔１７〕酸化型基質がケトンもしくはイミンであり、該基質の還元型生成物がアルコールもしくはアミンである〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕還元酵素が、〔１４〕に記載の方法によって製造されたものである〔１６〕に記載の方法。
　本発明は、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存型ギ酸脱水素酵素の変異体を提供する。
　本発明の該変異体の一つの好ましい態様は、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素変異体（配列番号：２）において、少なくとも２２４位のヒスチジン残基がヒスチジン以外のアミノ酸へ置換された変異を含む変異体（以下、「２２４変異体」と称する）である。２２４位の置換アミノ酸は、好ましくはアスパラギンである。２２４変異体は、２２４位のヒスチジン残基がヒスチジン以外のアミノ酸へ置換されたものであれば、２２４位以外のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入などの変異を有していてもよい。このような変異は、人為的に導入することもできるし、自然界において生じることもある。本発明の変異体には、これら双方の変異体が含まれる。２２４変異体における変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内）である。
　本発明の蛋白質において、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素変異体（配列番号：２）の２２４位以外の位置にアミノ酸の欠失、付加、あるいは挿入などの変異を伴うときには、N末端からカウントしたヒスチジン残基の位置が変動する場合がある。このような場合には、変動後のアミノ酸配列における、配列番号：２において、少なくとも２２４位に相同な位置にあるヒスチジンを他のアミノ酸配列に置換して、本発明による蛋白質とする。すなわち本発明の蛋白質には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、２２４位に相同な位置のアミノ酸を、ヒスチジン以外のアミノ酸に置換した蛋白質であって、高いβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存型ギ酸脱水素酵素活性を有する蛋白質が含まれる。
　相同な位置は、ヒスチジンの周辺のアミノ酸配列を配列番号：２における２２４位のヒスチジン周辺のアミノ酸配列と整列させることによって明らかにすることができる。このような操作は、アミノ酸配列のアライメントと呼ばれる。アライメントのためのアルゴリズムとして、たとえばBLASTを示すことができる。当業者は、異なる長さのアミノ酸配列の間で、アライメントにより相同なアミノ酸の位置を明らかにすることができる。
　２２４変異体は、好ましくは、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：２）と比較して、高いβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存型ギ酸脱水素酵素活性を示す変異体である。
　本発明において、「β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存型ギ酸脱水素酵素活性が高い」とは、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とした場合の酵素活性が、少なくとも２０mU/mL-br以上、たとえば３０mU/mL-br以上、好ましくは３５mU/mL-br以上、より好ましくは４０mU/mL-br以上の酵素活性を有することを言う。天然のギ酸脱水素酵素は、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とした場合ではわずかな酵素活性（多くとも１５mU/mL-br以下）しか認めることができない。
　２２４変異体は、高いβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存型ギ酸脱水素酵素活性を示すものである。ギ酸脱水素酵素活性は、当業者によって一般的に行われる方法によって測定することができる。例えば、以下の方法を例示することができる。リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0、100mM）、NADP+ 2.5mM、ギ酸ナトリウム 100mM および酵素を含む反応液中 30℃で反応させ、NADPHの増加にともなう 340nmの吸光度の増加を測定する。1U は、1分間に1μmolのNADPHの増加を触媒する酵素量とする。また、タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。
　本発明の変異体の他の態様は、上述のマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の２２４位の変異に加えて、少なくとも２２２位のアスパラギン酸残基がアスパラギン酸以外のアミノ酸へ置換された変異を含む変異体（以下、「２２４－２２２変異体」と称する）である。２２２位の置換アミノ酸は、好ましくはグルタミン、アスパラギン、またはグリシンであり、特に好ましくはグルタミンである。２２２変異体は、２２２位のアスパラギン酸残基がアスパラギン酸以外のアミノ酸へ置換されたものであれば、２２２位以外のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入などの変異を有していてもよい。このような変異は、人為的に導入することもできるし、自然界において生じることもある。本発明の変異体には、これら双方の変異体が含まれる。２２４－２２２変異体における変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内）である。
　２２４－２２２変異体は、好ましくは、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：２）または２２２変異体と比較して、高いβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存型ギ酸脱水素酵素活性を示す変異体である。
　本発明の変異体の他の態様は、上述のマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の２２４位の変異に加えて、少なくとも１４６位のシステイン残基がシステイン以外のアミノ酸へ置換された変異を含む変異体（以下、「２２４－１４６変異体」と称する）である。１４６位の置換アミノ酸は、好ましくはセリンまたはバリンである。１４６変異体は、１４６位のシステイン残基がシステイン以外のアミノ酸へ置換されたものであれば、１４６位以外のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入などの変異を有していてもよい。このような変異は、人為的に導入することもできるし、自然界において生じることもある。本発明の変異体には、これら双方の変異体が含まれる。２２４－１４６変異体における変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内）である。
　本発明の変異体の他の態様は、上述のマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の２２４位の変異に加えて、２５６位のシステイン残基がシステイン以外のアミノ酸へ置換された変異を少なくとも含む変異体（以下、「２２４－２５６変異体」と称する）である。２５６位の置換アミノ酸は、好ましくは、セリン、アラニン、またはバリンである。２２４－２５６変異体は、２５６位のシステイン残基がシステイン以外のアミノ酸へ置換されたものであれば、２５６位以外のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入などの変異を有していてもよい。このような変異は、人為的に導入することもできるが、自然界において生じることもある。本発明の変異体には、これら双方の変異体が含まれる。２２４－２５６変異体における変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内）である。
　２２４－２５６変異体は、好ましくは、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：２）と比較して、有機溶媒に対し高い耐性を示す。有機溶媒としては、例えば、４－クロロアセト酢酸エチルエステル、４－ブロモアセト酢酸エチルエステル、４－ヨードアセト酢酸エチルエステル、４－クロロアセト酢酸メチル、４－クロロアセト酢酸プロピル等の４－ハロ－３－オキソ酪酸エステル類、クロロアセトフェノン、ブロモアセトフェノン等のハロアセトフェノン、また３－クロロ－１－フェニル－２－プロパノン、３－ブロモ－１－フェニル－２－プロパノン等の、３－ハロ－１－フェニル－２－プロパノン誘導体等を挙げることができるが、これらの有機溶媒に限定されない。２２４－２５６変異体は、少なくとも一つの有機溶媒において高い耐性を示すものである。ギ酸脱水素酵素の有機溶媒耐性、例えば４－クロロアセト酢酸エチル耐性は、次のようにして測定することができる。
　リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0、100mM）、４－クロロアセト酢酸エチル 20mM、ギ酸脱水素酵素を含む反応液中 25℃、20分保持後、NADP+ を 2.5mM、ギ酸ナトリウムを 100mMになるように加え、反応液中 25℃で反応させ、NADPHの増加にともなう 340nmの吸光度の増加を測定する。対照実験としては、リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0、100mM）、ギ酸脱水素酵素を含む反応液中 25℃、20分保持後、NADP+を 2.5mM、ギ酸ナトリウムを100mM、４－クロロアセト酢酸エチルを20mMになるように加え、反応液中 30℃で反応させ、NADPHの増加にともなう340nmの吸光度の増加を測定する。
　本発明の変異体のさらなる好ましい態様は、上述のマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の２２４位の変異に加えて、上記１４６位および２５６位の両システイン残基が共にシステイン以外のアミノ酸へ置換された変異を少なくとも含むような変異体（以下、「２２４－１４６－２５６変異体」と称する）である。１４６位の置換アミノ酸は、好ましくは、セリンまたはバリンであり、２５６位の置換アミノ酸は、好ましくは、セリン、アラニン、またはバリンである。１４６位および２５６位の両システイン残基が共にシステイン以外のアミノ酸へ置換されたものであれば、１４６位および２５６位以外のアミノ酸の変異については特に制限されない。
　２２４－１４６－２５６変異体は、好ましくは、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：２）と比較して、有機溶媒存在下において高いギ酸脱水酵素活性を示し、かつ、有機溶媒に対して高い耐性を示す。
　本発明の変異体の他の態様は、上述のマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の２２４位並びに１４６位および／または２５６位の変異に加えて、６位のシステイン残基がシステイン以外のアミノ酸に置換した変異を含むギ酸脱水酵素の変異体である。６位の置換アミノ酸は、好ましくは、セリン、アラニン、またはバリンである。該変異体は、好ましくは、マイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来のギ酸脱水素酵素（配列番号：２）と比較して、有機溶媒存在下における高いギ酸脱水酵素活性および／または有機溶媒に対する高い耐性を示す。
　本発明の好ましい変異体の具体例は、前記２２４位の変異に加えて、以下の（ａ）～（ｎ）からなる群から選択されたいずれかの変異を有するアミノ酸配列からなる変異体である。
　（ａ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において、１４６位のシステイン残基がセリンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｂ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において、２５６位のシステイン残基がセリンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｃ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において、２５６位のシステイン残基がバリンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｄ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がセリンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｅ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がアラニンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｆ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｇ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６位のシステイン残基がセリンに、１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がセリンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｈ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイン残基がセリンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｉ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６位のシステイン残基がバリンに、２５６位のシステイン残基がセリンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｊ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がアラニンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｋ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｌ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６位のシステイン残基がアラニンに、１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｍ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイン残基がバリンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　（ｎ）配列番号：２に記載したアミノ酸配列において６位のシステイン残基がアラニンに、１４６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイン残基がバリンに置換されているマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素の変異体
　上記（ａ）から（ｎ）の変異体のうち、（ａ）で示した変異体は、有機溶媒存在下において高いギ酸脱水酵素活性を示す。（ｂ）、（ｃ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｍ）で示した変異体は、有機溶媒に対して高い耐性を示す。（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｌ）および（ｎ）で示した変異体は、有機溶媒存在下において高いギ酸脱水素酵素活性を示し、かつ有機溶媒に対して高い耐性を示す。
　これらの変異体は、更に２２２位のアスパラギン酸残基がグルタミン、アスパラギン、またはグリシンに置換されている変異を含んでいてもよい。
　本発明の上記変異体は、例えば、マイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水酵素のアミノ酸配列を改変することにより得ることができる。これらのタンパク質は、当業者によって一般的に行われる方法、例えば部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500）等を用いて作製することができる。具体的には特開2002-223776の実施例で示される方法によって取得することができる。本願出願人は特開2002-223776に示すpSFR415を有する大腸菌(JM109(pSFR415))、およびpSFR426を有する大腸菌(JM109(pSFR426))を寄託している。該プラスミドに挿入されたDNAは、本発明の変異体の作製において好適に利用することができる。
　なお、マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素における２５６位システイン残基周辺は、他のギ酸脱水素酵素においても保存された領域であり、２５６位システインは、例えばアスペルギルス ニデュランス（Aspergillus nidulans）（現エメリセラ ニデュランス（Emericella nidulans））由来では２２４位システインに、ハンセヌラ ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（現ピキア アングスタ（Pichia angusta））由来（SWISS：P33677）では２２８位システインに、ニューロスポラ クラッサ（Neurospora crassa）由来（SWISS：NEUFDHA）では２２８位システインに、シュードモナスsp. 101由来（SWISS：P33160）では２５５位システインに相当する。
　また、同じくマイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素における１４６位システイン残基周辺は、他のギ酸脱水素酵素においても保存された領域であり、例えばシュードモナス（Pseudomonas）sp. 101由来（SWISS：P33160）では１４５位システインに相当する（Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 479-483, 1995）。これら既知酵素においても部位特異的変異による改変によって、有機溶媒耐性を向上させる効果、および／または有機溶媒による活性化効果が期待できる。
　また本発明は、ギ酸脱水素酵素の変異体をコードするDNAに関する。本発明のギ酸脱水素酵素の変異体をコードするDNAは、例えば配列番号：１に記載されたマイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素をコードするDNAに、当業者によって一般的に行われる部位特異的変異導入法を用いて塩基置換を導入することによって得ることができる。
　本発明は、このようにして得られた本発明のギ酸脱水素酵素の変異体をコードするDNAを、公知の発現ベクターに挿入することによって作製されるギ酸脱水素酵素変異体発現ベクターを提供する。該発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のギ酸脱水素酵素の変異体を、組換え体タンパク質として得ることができる。
　さらに本発明は、本発明のギ酸脱水酵素の変異体をコードするDNA、および還元酵素をコードするDNAを、公知の発現ベクターに挿入することによって作製されるギ酸脱水酵素変異体および還元酵素の発現ベクターを提供する。該発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のギ酸脱水酵素変異体および還元酵素を、組換えタンパク質として得ることができる。該還元酵素としては、好ましくはトロピノン還元酵素、イミン還元酵素、α－ケト酸還元酵素、エノン還元酵素、およびカルボニル還元酵素からなる群より選択される少なくとも一つ以上の還元酵素を挙げることができる。具体的には、例えば下記の微生物由来の還元酵素を挙げることができる。
トロピノン還元酵素（特開２００３－２３０３９８）
・ダチュラ　ストラモニウム（Datura stramonium）由来トロピノン還元酵素-I
イミン還元酵素（ＷＯ２０１０－０２４４４５、ＷＯ２０１０－０２４４４４、特願２０１０-０４１３７８）
・ストレプトマイセス（Streptomyces）sp. 由来 (S)-イミン還元酵素
・ストレプトマイセス（Streptomyces）sp. 由来 (R)-イミン還元酵素
・ストレプトマイセス　カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）由来 (R)-イミン還元酵素
・ストレプトマイセス　ロゼウム（Streptomyces roseum）由来 (S)-イミン還元酵素
α-ケト酸還元酵素（特開２００１－２３８６８２）
・リゥコノストック　エノス（Leuconostoc oenos）由来 α-ケト酸還元酵素
エノン還元酵素（特開２００２－２４７９８７）
・クリヴェロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）由来 エノン還元酵素
カルボニル還元酵素（特開２００５－０００００２）
・トルラスポラ　デルブリュッキイ（Torulaspora delbrueckii）由来カルボニル還元酵素
　本発明においてギ酸脱水素酵素の変異体、および／または還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、ギ酸脱水素酵素の変異体をコードするDNA、および／または還元酵素をコードするDNAを含む組み換えベクターにより形質転換され、ギ酸脱水素酵素の変異体、および／または還元酵素を発現することができる生物であれば特に制限されない。このような形質転換体および該形質転換体を培養する工程を含む本発明のギ酸脱水酵素変異体、および／または還元酵素を製造する方法も本発明に包含される。形質転換体の宿主生物として利用可能な微生物は、例えば以下のような微生物を示すことができる。
・エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属等の宿主ベクター系の開発されている細菌
・ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属等の宿主ベクター系の開発されている放線菌
・サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属等の宿主ベクター系の開発されている酵母
・ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma)属等の宿主ベクター系の開発されているカビ
　形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物菌体内などにおいて、本発明のギ酸脱水素酵素の変異体遺伝子、および／または還元酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターまたはファージベクターへ本発明のDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ－等に関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、等に詳細に記載されている。
　エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、例えばpBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β－ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、trc (lac、trpの融合)、λファージ PＬ、PＲ等に由来するプロモーター等が利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いることができる。
　バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能であり、染色体にインテグレートさせることも可能である。また、プロモーターまたはターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、 npr(中性プロテアーゼ)、またはamy(α－アミラーゼ)等が利用できる。
　シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)等の宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む)pKT240等が利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子等が利用できる。
　ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))等のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
　コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)等のプラスミドベクターが利用可能である。
　ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）等がプラスミドベクターとして利用可能である。
　ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）等が利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
　ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクター等が利用可能である (J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
　ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995) )等が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997) ）。
　サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β－ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)等のプロモーターおよびターミネーターが利用可能である。
　クライベロマイセス（Kluyveromyces）属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNA等との相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
　シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)、およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクター等が利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
　チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zygosaccharomyces rouxii)由来の pSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクター等が利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーター、およびチゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)）等が利用可能である。
　ピキア(Pichia)属においては、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta、旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーター等が利用可能である。また、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、PARS2)等を利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。
　キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス (Candida utilis) 等において宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターの強力なプロモーターが開発されている（特開平08-173170）。
　アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) 等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミド、および染色体へのインテグレーションの利用が可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
　トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター等が利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。
　また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕等の昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）、菜種、トウモロコシ、またはジャガイモ等の植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており好適に利用できる。
　本発明において使用するギ酸脱水素酵素変異体の生産能を有する微生物は、ギ酸脱水素酵素の変異体生産能を有するマイコバクテリウム バッカエの突然変異株、変種、および遺伝子操作技術の利用により作成された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換体を含む。
　また本発明は、本発明のギ酸脱水素酵素の変異体、本発明の形質転換体、または該形質転換体の処理物を用いた補酵素NADP+（酸化型β-ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸）からNADPH（還元型β-ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸）を生産する方法を提供する。補酵素NADPHは、各種カルボニル還元酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、ヒドロキシ酸脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素の還元型の補酵素として有用であり、これらの酵素がその還元能を発揮するためには必須の補酵素である。
　さらに本発明は、NADPH依存性の還元酵素によって酸化型基質から該基質の還元型生成物の製造を行う際に生じるNADP+を、本発明のギ酸脱水素酵素の変異体を用いてギ酸から炭酸への変換反応によりNADPHへと再生させ、効率的に該還元型生成物を製造する方法を提供する。このNADPH依存性還元酵素とは、NADPHを補酵素として還元反応を行う酵素を指し、例えばアルコール脱水素酵素のように、還元反応、酸化反応ともに触媒しうる酵素であってもよい。また、上記方法において本発明のギ酸脱水酵素変異体の替わりに、本発明の形質転換体または該形質転換体の処理物を利用することも可能である。
　上記NADPH依存性還元酵素、その酸化型基質、該基質の還元型生成物としては、例えば、以下の組み合わせを挙げることができるが、これらに制限されない。
・カルボニル基を基質としてアルコールを生成する酵素（E.C. 1.1.1.－）によるケトンからアルコールの生産
・カルボン酸を基質としてアルデヒドを生成する酵素（E.C. 1.2.1.－）によるカルボン酸からのアルデヒドの生産
・炭素炭素二重結合を還元し炭素炭素一重結合を生成する酵素（E.C. 1.3.1.－）による炭素炭素二重結合体から炭素炭素一重結合体の生産
・カルボニル基を基質として還元的アミノ化によりアミノ基を生成する酵素（E.C. 1.4.1.－）によるケト酸からアミノ酸の生産
・炭素炭素二重結合に酸素を付加することによりジオールを生成する酵素（E.C. 1.14.12.－）によるアルケンからジオールの生産
　ここで、E.C. 1.1.1.- に分類される酵素としては、例えばアルコール脱水素酵素、D-ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素、L-ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素、D-マンデル酸脱水素酵素、L-マンデル酸脱水素酵素、D-乳酸脱水素酵素、およびL-乳酸脱水素酵素等が挙げられる。E.C.1.2.1.- に分類される酵素としては、例えばアルデヒド脱水素酵素等が挙げられる。E.C.1.3.1.- に分類される酵素としては、例えばエノイル-CoA 還元酵素およびフマル酸還元酵素等が挙げられる。E.C.1.4.1.- に分類される酵素としては、例えばフェニルアラニン脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素、およびアラニン脱水素酵素等が挙げられる。E.C.1.14.2.- に分類される酵素としては、例えばベンゼンジオキシゲナーゼ等が挙げられる。
　これら酵素を作用させる場合の基質としては、その酵素が作用しうる化合物であれば特に制限はなく、基質分子内に、ハロゲン、硫黄、および／またはリン等を有しているもの、水酸基、アミノ基等を有しているもの、炭素鎖が分枝状であるもの、炭素鎖が不飽和であるもの、複素環を含む芳香環を有しているものを例示することができる。
　本発明のギ酸脱水素酵素の変異体は、有機溶媒に耐性を持つ、および／または有機溶媒により活性化されるため、例えばケトンおよびアルコールの存在下であっても活性を長く、および／または高く保持することができ、工業的なアルコール製造において有利である。また、カルボニル還元酵素はNADPHを補酵素とし、ケトンからアルコールを生成するものであれば、特に限定されない。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、または酵素を生成する微生物等の形質転換体を反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。反応溶液は、基質および酵素反応に必要な補酵素のNADPHを、酵素活性の発現に適した溶媒に溶解させたものである。本発明におけるギ酸脱水素酵素の変異体を含む微生物の処理物、またはカルボニル還元酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエン等の有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、ガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液、および該抽出液を部分精製したもの等が含まれる。
　本発明によるアルコールの製造の原料となるケトンとしては、使用されるカルボニル還元酵素が還元しうるケトンであれば特に制限はない。
　本発明の酵素を用いた反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、シクロヘキサン、1-オクタノール、n-ヘキサン、n-オクタン等の有機溶媒中、もしくは水性媒体との2相系により行うことができる。また、緩衝液等の水系にメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、アセトンなどの水溶性溶媒を加えた混合溶媒系においても行うことが可能である。また、逆ミセル系での反応も行うことができ、界面活性剤としては、例えばエーロゾルOT（Aerosol OT）を用いたイソオクタン／水逆ミセル系等を挙げることができる。
　本発明の反応は、例えば、固定化酵素、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。本発明の酵素、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体を固定化する場合には、含硫多糖、例えばκ-カラギーナンやアルギン酸カルシウム、寒天ゲル法、ポリアクリルアミドゲル法等の公知の方法により固定化することができる。
　また、本発明の反応は、本発明の酵素が反応できる条件であれば良く、反応温度 4－60℃、好ましくは10－37℃、pH3－11、好ましくはpH5－8、基質濃度0.01－90％、好ましくは0.1－30％で行うことができる。菌体またはその処理物を反応に利用する場合には、反応系に必要に応じて補酵素NADP+もしくはNADPHを0.001mM－100mM、好ましくは、0.01－10mM添加することができる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなり過ぎないように連続的、もしくは間欠的に添加することが望ましい。
　本発明のケトンの還元により生成するアルコールの精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理等による分離、溶媒抽出、蒸留、晶析等を適当に組み合わせることにより行うことができる。例えば、3-キヌクリジノールでは、微生物菌体を含む反応液を遠心分離し、微生物菌体を除いた後、限外ろ過によりタンパク質を除去し、そのろ液に1-ブタノール等の溶媒を添加して3-キヌクリジノールを溶媒層に抽出する。これを相分離後、減圧濃縮することにより純度の高い3-キヌクリジノールを精製することができる。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
〔実施例１〕　マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素変異体へのPCRによる変異導入
　本発明者らが構築したマイコバクテリウム バッカエ（Mycobacterium vaccae）由来ギ酸脱水素酵素変異体 McFDH-37（下記参考例１参照）の発現ベクターpSU-MF37をもとにして、マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の224位のHisをHis以外のアミノ酸へ変えるためのミックスプライマーとしてMcFDH-40-F01（5'- CTACACCGACCGTXXXCGCCTGCCG -3'／配列番号：１５）とMcFDH-40-R01（5'- CGATTCCGGCAGGCGXXXACGGTCGGTG -3'／配列番号：１６）を合成した。以後、224位のHisを任意のアミノ酸に置き換えることをH224Xと表記する。
McFDH-37のH224X変異体を得るため、プラスミドpSU-MF37を鋳型として、プライマーMcFDH26-F（5'- AGGAATAATCCATGGCAAAAG -3'／配列番号：１７）、McFDH-40-R01のセットおよびプライマー McFDH-40-F01、McFDH26-R（5'- ACTAGTTTTAGAATTCCTCTAG -3'／配列番号：１８）のセットにより1st PCRを行った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断片を希釈、混合し、プライマーMcFDH26-F、McFDH26-Rを加え、2nd PCRを行った。得られたPCR増幅断片をIn-Fusionクローニングシステム（Clontech社）を用いてpSU-MF37をNcoI、EcoRI の2つの制限酵素で二重消化したベクターと連結し、H224Xの変異の導入されたギ酸脱水素酵素McFDH-37変異体を発現可能なプラスミドpSU-MF37mを得た。
〔実施例２〕
　実施例１で構築したマイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素変異体を発現するプラスミドpSU-MF37mにより、大腸菌JM109株を形質転換した。194個の組換え大腸菌をLB培地（1% バクトトリプトン、0.5% バクト酵母エキス、1% 塩化ナトリウム）に植菌し、30 ℃で終夜培養した後、イソプロピルチオ-β- ガラクトピラノシド（以下、IPTG ）を添加し、さらに培養した。菌体を遠心分離により集菌後、0.01% ジチオスレイトールを含む 100mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置を用いて4分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収、ギ酸脱水素酵素活性を測定した。ギ酸脱水素酵素活性は、リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0、100mM）、NAD+もしくはNADP+ 2.5mM 、ギ酸ナトリウム 100mM および酵素を含む反応液中 30 ℃で反応させ、NADHもしくはNADPHの増加にともなう 340nm の吸光度の増加により測定した。1U は、1 分間に1μmolのNADH もしくはNADPHの増加を触媒する酵素量とした。タンパク質量の測定は、Bio-Rad Protein Assay Kit（Bio-Rad 製）を用いて測定した。
　この中から、活性の高かった2クローンを選択し、アンピシリンを含むLB培地で培養後、菌体から精製することにより、プラスミドを得た。
　精製したプラスミドについて、プライマーウォーキング法により変異部分の塩基配列を確認した。プラスミドに挿入されたマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素変異体の塩基配列を、下記参考例１に記載のマイコバクテリウム バッカエ由来のギ酸脱水素酵素遺伝子McFDH-37と比較したところ、いずれの変異体でもORFの開始位置を1位として、670C→A（224His→Asn）というアミノ酸置換を含む1つの塩基置換が認められた。この変異を含むプラスミドをpSU-MF40とした。
〔実施例３〕
　実施例2で構築したマイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素を発現するプラスミドpSU-MF40により、大腸菌JM109株を形質転換した。それぞれの組換え大腸菌をアンピシリンを含むLB培地に植菌し、30 ℃で終夜培養した後、IPTGを添加し、さらに培養した。菌体を遠心分離により集菌後、0.01% ジチオスレイトールを含む 100mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置を用いて4分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収、ギ酸脱水素酵素活性を測定した。ギ酸脱水素酵素活性は、100mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、2.5mM NAD+もしくはNADP+、100mM ギ酸ナトリウム、および酵素を含む反応液中 30℃で反応させ、NADHもしくはNADPHの増加にともなう 340nm の吸光度の増加により測定した。1U は、1 分間に1μmolのNADH もしくはNADPHの増加を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性を表１に示した。
〔実施例４〕
　特開2003-230398に記載のダツラ・ストラモニウム（Datura stramonium）由来トロピノン還元酵素-I発現プラスミドpSG-DSR1をセンスプライマーDsTR1-A2（5'- GTCAGAGGAATTCTAAAATGGAAGAATCAAAAGTGTCCATG -3'／配列番号：１９）とアンチセンスプライマーDsTR1-T2（5'- GTCCTTAAGTTAAAACCCACCATTAGCTGTG -3'／配列番号：２０）のセットによりPCRを行った。PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的な約850bpのバンドが検出された。
　PCR反応液を処理してDNA断片を回収し、制限酵素EcoRI、AflIIで二重消化した。フェノール－クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出して精製し、目的のDNA断片を回収した。プラスミドpSU-MF40を制限酵素EcoRI、AflIIで二重消化し、同様にフェノール－クロロホルム処理後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンド部分を切り出し、精製して、T4 DNAリガーゼを用いて目的のDNA断片を連結した。
　得られたプラスミドにより大腸菌JM109を形質転換した。形質転換株をアンピシリンを含むLB培地プレート上で生育させ、センスプライマーDsTR1-A2とアンチセンスプライマーDsTR2のセットによりコロニーダイレクトPCRを行い、挿入断片のサイズを確認した。約850bpのDNA断片が挿入されていると考えられるコロニーをアンピシリンを含むLB培地で培養し、菌体から精製することにより、プラスミドpSF-DSR4を得た。
　また、pSU-MF37およびWO2006/132145に記載のプラスミドpSU-MF26を同様にEcoRI、AflIIで二重消化したものに対して目的のDNA断片を連結し、それぞれプラスミドpSF-DSR1、pSF-DSR3を得た。
〔実施例５〕
　実施例4で構築したマイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素とダツラ・ストラモニウム由来トロピノン還元酵素を共発現する大腸菌をアンピシリンを含むLB培地に植菌し、30 ℃で終夜培養した後、IPTGを添加し、さらに培養した。菌体を遠心分離により集菌後、0.01% ジチオスレイトールを含む 100mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM （コスモバイオ製）を用いて4 分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収、ギ酸脱水素酵素活性及びトロピノン還元酵素活性を測定した。ギ酸脱水素酵素活性は、実施例3記載の方法で測定した。トロピノン還元酵素活性は、100mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、0.2mM NADPH、4mM 3-キヌクリジノン、および酵素を含む反応液中 30 ℃で反応させ、NADPHの減少に伴う 340nm の吸光度の減少により測定した。1U は、1 分間に1μmolのNADPHの減少を触媒する酵素量とした。各組換え大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性を表1に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔実施例６〕
　実施例4で得たプラスミドpSF-DSR4、pSF-DSR3、またはpSF-DSR1で大腸菌HB101株を形質転換し、得られた形質転換体を0.01mM IPTGを含むLB培地を用いて33℃で終夜培養した後、菌体を集菌して、ギ酸脱水素酵素及びトロピノン還元酵素を発現する大腸菌を得た。
　200mM リン酸カリウム緩衝液(pH 6.0)、培養液2mL分から調製した菌体、1重量% 3-キヌクリジノン、100mM ギ酸ナトリウム、およびNADP+ （1mMまたは添加せず）からなる反応液を調製し、30℃、50spmで振盪することにより終夜反応を行った。反応液から400μLをサンプルとして採取し、後述の分析条件で変換率を分析した。反応液にNADPHは添加しなかった。その結果を表2に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　変換率に関する分析は以下の通り行った。
　反応液から採取したサンプル400μLに1M 水酸化ナトリウム 400μLと1-ブタノール 1mLを加えて懸濁し、遠心分離して得た上清をガスクロマトグラフィーにより分析した。変換率（%）は、（3-キヌクリジノールの面積）÷｛（3-キヌクリジノンの面積）＋（3-キヌクリジノールの面積）｝×100 で定義した。
〔分析条件〕
カラム：　　　　　　　　Rtx5-Amine (0.32mm×30m（DF 1.5um）)（レステック製）
カラム温度：　　　　　　185℃
インジェクション温度：　250℃
キャリア：　　　　　　　ヘリウム 100kPa
スプリット比：　　　　　20
検出：　　　　　　　　　FID 250℃（水素圧 50kPa、空気圧 50kPa）
メイクアップ：　　　　　ヘリウム 40mL/min
セプタムパージ：　　　　He 3mL/min
参考保持時間：　　　　　1-ブタノール 1.5分、3-キヌクリジノン 4.2分、
　　　　　　　　　　　　3-キヌクリジノール 4.5分
〔実施例７〕
　実施例6から得られたpSF-DSR4の形質転換株を用いて得られた反応液全量をサンプルとして用い、後述の分析条件で光学純度を分析した。その結果、(S)-3-キヌクリジノール誘導体のピークは検出されず、100%e.e.(R) であった。
　光学純度に関する分析は以下の通り行った。
　反応液1mLに1M 水酸化ナトリウム 1mLと1-ブタノール 2mLを加えて懸濁し、遠心分離して得られた上清を抽出液とした。抽出液を乾固させた後、クロロホルムを添加し、塩化ベンゾイルでベンゾイル化した。得られた溶液を乾固させ、エタノールに溶解して高速液体クロマトグラフィーにより光学純度を分析した。
　光学純度は、｛（(R)-3-キヌクリジノールの面積）－（(S)-3-キヌクリジノールの面積）｝÷｛（(R)-3-キヌクリジノールの面積）＋（(S)-3-キヌクリジノールの面積）｝×100で定義した。
〔分析条件〕
カラム：　　　　CHIRALCEL AD-H （φ4.6mm×250mm）（ダイセル製）
移動相：　　　　ヘキサン/エタノール/ジエチルアミン = 95/5/0.1
流速：　　　　　1.0mL/min
検出：　　　　　UV 254nm
参考保持時間：　(S)-3-キヌクリジノール誘導体 12分、
　　　　　　　　(R)-3-キヌクリジノール誘導体 23分
〔参考例１〕　マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素変異体へのPCRによるさらなる変異導入
　本発明者らが構築したマイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素変異体 McFDH-26（塩基配列　配列番号：３、アミノ酸配列　配列番号：４）の発現ベクターpSFR426をもとにして、マイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素の222位のAspをGlnへ変えるためのプライマーとしてMcFDH-37-F01 (5'-CACTACACCCAGCGTCACCGCCTG -3'／配列番号：７)とMcFDH-37-R01 (5'-CGGTGACGCTGGGTGTAGTGCAG -3'／配列番号：８)を、222位のAspをAsnへ変えるためのプライマーとしてMcFDH-38-F01 (5'- CACTACACCAATCGTCACCGCCTG -3'／配列番号：９)とMcFDH-38-R01 (5'- CGGTGACGATTGGTGTAGTGCAG -3'／配列番号：１０)、222位のAspをGlyへ変えるためのプライマーとしてMcFDH-39-F01 (5'-CACCGGTCGTCACCGCCTGCCGGAATC -3'／配列番号：１１)とMcFDH-39-R01(5'- GGCAGGCGGTGACGACCGGTGTAGTGCAGG -3'／配列番号：１２)、を合成した。以後、222位のAspをGlnに置き換えることをD222Qと表記する。
　McFDH-26のD222Q変異体を得るため、プラスミドpSFR426を鋳型として、プライマーMCF-ATG3 (5'- CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTTCTGTCTGTTC -3'／配列番号：１３)、McFDH-37-R01のセットおよびプライマー McFDH-37-F01、MCF-TAA3 (5'- CAGTCTAGATTAGACCGCTTTTTTGAATTTGGCG -3' ／配列番号：１４)のセットにより1st PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を行った。続いて、1st PCRにより増幅されたDNA断片を希釈、混合し、プライマーMCF-ATG3 （配列番号：１３）、MCF-TAA3 （配列番号：１４）を加え、2nd PCR（94℃, 30秒、50℃, 30秒、72℃, 30秒、25サイクル）を行った。得られたPCR増幅断片をNcoI、XbaI の2つの制限酵素で二重消化した。pSE420D（Invitrogen製のプラスミドベクターpSE420のマルチクローニングサイトを改変したプラスミド、特開2000-189170）を NcoI、XbaIの2つの制限酵素で二重消化し、同酵素で消化したPCR増幅断片をTakara Ligation Kitを用いてライゲーションし、D222Qの変異の導入されたギ酸脱水素酵素McFDH-37を発現可能なプラスミドpSU-MF37を得た。得られたプラスミドの塩基配列の解析を行い、変異が導入されていることを確認した。同様に、プラスミドpSFR426を鋳型として、プライマーMCF-ATG3 (5'-CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTTCTGTCTGTTC -3'／配列番号：１３)、McFDH-38-R01のセットおよびプライマー McFDH-38-F01、MCF-TAA3 (5'- CAGTCTAGATTAGACCGCTTTTTTGAATTTGGCG -3'／配列番号：１４)のセットを用いてD222Nの変異の導入されたギ酸脱水素酵素McFDH-38を発現可能なプラスミドpSU-MF38を、プライマーMCF-ATG3 (5'- CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTTCTGTCTGTTC -3'／配列番号：１３)、McFDH-39-R01のセットおよびプライマー McFDH-39-F01、MCF-TAA3 (5'- CAGTCTAGATTAGACCGCTTTTTTGAATTTGGCG -3'／配列番号：１４)のセットを用いてD222Gの変異の導入されたギ酸脱水素酵素McFDH-39を発現可能なプラスミドpSU-MF39を得た。
〔参考例２〕　バークホールデリア スタビリス由来ギ酸脱水素酵素のギ酸脱水素酵素活性測定
　バークホールデリア スタビリス由来ギ酸脱水素酵素(BsFDH)（塩基配列　配列番号：５、アミノ酸配列　配列番号：６）をコードするDNA配列の5'末端にNcoIサイトを、3'末端にXbaIサイトを導入した遺伝子を合成した。 DNA断片をNcoI、XbaIで2重消化し、NcoI、XbaIで2重消化したpSE420D（Invitrogen製のプラスミドベクターpSE420のマルチクローニングサイトを改変したプラスミド、特開2000-189170）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。
〔参考例３〕
　参考例１で構築したマイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素を発現するプラスミド、または参考例２で構築したバークホールデリア スタビリス由来ギ酸脱水素酵素を発現するプラスミドにより、大腸菌JM109株を形質転換した。それぞれの組換え大腸菌を液体培地（1% バクトトリプトン、0.5% バクト- 酵母エキス、1.0% 塩化ナトリウム、以下LB培地）に植菌し、30 ℃で終夜培養した後、イソプロピルチオ-β- ガラクトピラノシド（以下、IPTG ）を添加し、さらに培養した。菌体を遠心分離により集菌後、1mM ジチオスレイトールを含む 100mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0 ）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM （コスモバイオ製）を用いて4 分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収、ギ酸脱水素酵素活性を測定した。ギ酸脱水素酵素活性は、リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0、100mM）、NAD+もしくはNADP+ 2.5mM 、ギ酸ナトリウム 100mM および酵素を含む反応液中 30 ℃で反応させ、NADHもしくはNADPHの増加にともなう 340nm の吸光度の増加により測定した。1U は、1 分間に1μmolのNADH もしくはNADPHの増加を触媒する酵素量とした。タンパク質量の測定は、Bio-Rad Protein Assay Kit（Bio-Rad 製）を用いて測定した。標準タンパク質としては、Bovine Plasma Albumin を用いた。各組換え大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔参考例４〕
　実施例4で構築したマイコバクテリウム バッカエ由来ギ酸脱水素酵素とダツラ・ストラモニウム由来トロピノン還元酵素を共発現する大腸菌を液体培地（1% バクトトリプトン、0.5% バクト- 酵母エキス、1.0% 塩化ナトリウム、以下LB培地）に植菌し、30 ℃で終夜培養した後、イソプロピルチオ-β- ガラクトピラノシド（以下、IPTG）を添加し、さらに培養した。菌体を遠心分離により集菌後、0.01% ジチオスレイトールを含む 100mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置を用いて4 分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収、ギ酸脱水素酵素活性及びトロピノン還元酵素活性を測定した。ギ酸脱水素酵素活性は、100mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、2.5mM NAD+もしくはNADP+、100mM ギ酸ナトリウム、および酵素を含む反応液中 30 ℃で反応させ、NADHもしくはNADPHの増加に伴う 340nm の吸光度の増加により測定した。1U は、1 分間に1μmolのNADH もしくはNADPHの増加を触媒する酵素量とした。トロピノン還元酵素活性は、100mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）、0.2mM NADPH、4mM 3-キヌクリジノン、および酵素を含む反応液中 30 ℃で反応させ、NADPHの減少に伴う 340nm の吸光度の減少により測定した。1U は、1 分間に1μmolのNADPHの減少を触媒する酵素量とした。タンパク質量の測定は、Bio-Rad Protein Assay Kit（Bio-Rad 製）を用いて測定した。各組換え大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性を表4に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
〔参考例５〕
　実施例4で得たプラスミドpSF-DSR1またはpSF-DSR3で大腸菌HB101株を形質転換し、得られた形質転換体を0.01mM IPTGを含むLB培地を用いて33℃で終夜培養した後、菌体を集菌して、ギ酸脱水素酵素及びトロピノン還元酵素を発現する大腸菌を得た。
　200mM リン酸カリウム緩衝液(pH 6.0)、培養液2mL分から調製した菌体、1重量% 3-キヌクリジノン、100mM ギ酸ナトリウムおよびNADP+（1mMまたは添加せず）からなる反応液を調製し、30℃で終夜反応を行った。反応液から400μLをサンプルとして採取し、後述の分析条件で変換率を分析した。反応液にNADPHは添加しなかった。その結果を表5に示す。分析は実施例６に記載した通りに行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明の酵素を利用することにより、効率的に酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP+）から還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）を製造することが可能となった。さらに、カルボニル還元酵素によるケトンからアルコールの生産において、本発明の変異体酵素を用いて効果的に補酵素還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を酸化型から還元型に再生することによって、極めて収率よくアルコールを生産することが可能となった。

Claims (18)

  1. 　次の（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質であって、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存型ギ酸脱水素酵素活性を有する蛋白質；
    　（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸において、少なくとも２２４位のヒスチジン残基がヒスチジン以外のアミノ酸へ置換された変異を含むアミノ酸配列、又は
    　（ｂ）（ａ）に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列。
  2. 　前記２２４位の置換アミノ酸がアスパラギンであることを特徴とする、請求項１に記載の蛋白質。
  3. 　配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、前記２２４位の変異に加えて、更に少なくとも６位、１４６位および／または２５６位のシステイン残基がシステイン以外のアミノ酸へ置換された変異、ならびに／あるいは２２２位のアスパラギン酸残基がアスパラギン酸以外のアミノ酸へ置換された変異を含む蛋白質であることを特徴とする、請求項１または２に記載の蛋白質。
  4. 　配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、前記２２４位の変異に加えて、下記（１）～（１３）からなる群から選択されたいずれかの変異、および／または下記（１４）～（１６）からなる群から選択されたいずれかの変異を有するアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の蛋白質；
    　（１）６位、１４６位、および２５６位のシステイン残基が共にセリンに置換されたアミノ酸配列、
    　（２）６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイン残基がセリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
    　（３）６位のシステイン残基がバリンに、２５６位のシステイン残基がセリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
    　（４）６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がアラニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
    　（５）６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
    　（６）１４６位のシステイン残基がセリンに置換されたアミノ酸配列、
    　（７）２５６位のシステイン残基がセリンに置換されたアミノ酸配列、
    　（８）１４６位および２５６位のシステイン残基が共にセリンに置換されたアミノ酸配列、
    　（９）２５６位のシステイン残基がバリンに置換されたアミノ酸配列、
    　（１０）１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
    　（１１）６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
    　（１２）６位のシステイン残基がアラニンに、１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、及び
    　（１３）６位および１４６位のシステイン残基がアラニンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列、
    　（１４）２２２位のアスパラギン酸残基がグルタミンに置換されたアミノ酸配列、
    　（１５）２２２位のアスパラギン酸残基がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列、
    　（１６）２２２位のアスパラギン酸残基がグリシンに置換されたアミノ酸配列。
  5. 　配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、前記２２４位の変異に加えて、６位のシステイン残基がアラニンに、１４６位のシステイン残基がセリンに、２５６位のシステイン残基がバリンにそれぞれ置換された変異、および／または２２２位のアスパラギン酸残基がグルタミン、アスパラギン、もしくはグリシンに置換された変異を含むアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の蛋白質。
  6. 　配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、前記２２４位の変異に加えて、２２２位のアスパラギン酸残基がグルタミンに置換された変異を含むアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の蛋白質。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の蛋白質をコードするDNA。
  8. 　請求項７に記載のDNAが挿入されたベクター。
  9. 　更に還元酵素をコードするDNAが挿入された請求項８に記載のベクター。
  10. 　前記還元酵素が、トロピノン還元酵素、イミン還元酵素、α－ケト酸還元酵素、エノン還元酵素、およびカルボニル還元酵素からなる群より選択される少なくとも一つ以上の還元酵素であることを特徴とする、請求項９に記載のベクター。
  11. 　請求項８～１０のいずれかに記載のベクターを保持する形質転換体。
  12. 　宿主細胞が微生物である請求項１１に記載の形質転換体。
  13. 　請求項１１または１２に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１～６のいずれかに記載の蛋白質を製造する方法。
  14. 　請求項９または１０に記載のベクターを保持する形質転換体を培養する工程を含む、請求項１～６のいずれかに記載の蛋白質、および還元酵素を製造する方法。
  15. 　下記の（ａ）から（ｃ）のいずれかを酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸に接触させる工程を含む、酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸から還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を製造する方法；
    　（ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の蛋白質、
    　（ｂ）請求項１１または１２に記載の形質転換体、および
    　（ｃ）（ｂ）に記載の形質転換体の処理物。
  16. 　次の工程を含む酸化型基質から該基質の還元型生成物を製造する方法；
    　（１）請求項１５に記載の方法によって還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を製造する工程、および
    　（２）工程（１）の還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型基質、および還元型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の存在下で前記酸化型基質から還元型生成物を生成し得る還元酵素とを接触させ、生成する還元型生成物を回収する工程。
  17. 　酸化型基質がケトンもしくはイミンであり、該基質の還元型生成物がアルコールもしくはアミンである請求項１６に記載の方法。
  18. 　還元酵素が、請求項１４に記載の方法によって製造されたものである請求項１６に記載の方法。
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