WO2013154138A1 - 分子ビーコン型プローブを用いた標的核酸の検出方法 - Google Patents

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WO2013154138A1
WO2013154138A1 PCT/JP2013/060861 JP2013060861W WO2013154138A1 WO 2013154138 A1 WO2013154138 A1 WO 2013154138A1 JP 2013060861 W JP2013060861 W JP 2013060861W WO 2013154138 A1 WO2013154138 A1 WO 2013154138A1
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target nucleic
probe
detection signal
substance
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達樹 松野
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富士レビオ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
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    • C12Q1/6823—Release of bound markers

Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for detecting a target nucleic acid.
  • nucleic acid amplification reaction examples include a nucleic acid amplification reaction accompanying temperature change (eg, PCR) and an isothermal nucleic acid amplification reaction.
  • a nucleic acid amplification reaction accompanying temperature change eg, PCR
  • an isothermal nucleic acid amplification reaction an RPA (Recombinase Polymerase Amplification) method, which is a method using a recombinase, is known.
  • Nucleic acid amplification reaction is used when detecting a target nucleic acid.
  • a detection probe for detecting a target nucleic acid in a nucleic acid amplification reaction a molecule that has a stem part and a loop part and can form a stem-loop structure
  • a beacon probe (Patent Document 1) and a cycling probe (Patent Document 2) having a cleavage site by RNase H are known.
  • a nucleic acid amplification reaction using recombinase uses a special nucleic acid probe, that is, a nucleic acid probe that is internally labeled with a fluorescent substance and a quencher and has a cleavage site by a cleavage enzyme (non-patent document).
  • Reference 1 a nucleic acid probe that is internally labeled with a fluorescent substance and a quencher and has a cleavage site by a cleavage enzyme
  • Non-Patent Document 1 a molecular beacon probe that has a fluorescent substance and a quencher at both ends, which is generally used as a detection system for a nucleic acid amplification reaction, cannot be used.
  • the above-described special nucleic acid probe that is internally labeled with a fluorescent substance and a quenching substance and has a cleavage site by a cleavage enzyme is used (Non-Patent Document 1).
  • nucleic acid probe that has a fluorescent substance and a quenching substance at both ends instead of at both ends, it is necessary to label nucleotide residues present inside the nucleic acid probe with the fluorescent substance and the quenching substance.
  • a nucleic acid probe having a functional group such as an amino group must be synthesized, and then this functional group must be reacted with a fluorescent substance and a quenching substance.
  • a fluorescent substance and a quenching substance are reacted with a functional group, severe reaction conditions such as heating are required, and depending on the substance to be labeled, it may be decomposed during the reaction. Therefore, the types of labeling substances that can be used for such labeling are limited.
  • a special technique is required for the synthesis of such a nucleic acid probe, there are problems that the synthesis is difficult and the synthesis cost is high.
  • an object of the present invention is to establish a detection system using a highly versatile nucleic acid probe that can use various labeling substances in a measurement system (eg, nucleic acid amplification reaction) using recombinase.
  • the present inventor succeeded in establishing a novel detection system by reversing the fact that the molecular beacon probe cannot form a stem-loop structure due to the influence of recombinase under the measurement conditions using recombinase. (FIG. 1). Therefore, the present inventors have succeeded in solving the above problems, and have completed the present invention.
  • a method for detecting a target nucleic acid comprising measuring the target nucleic acid using a probe having the following characteristics (a) to (c), a cleavage enzyme, and a recombinase: (A) a single-stranded nucleic acid molecule comprising a pair of regions that can bind complementarily to each other and a region that can bind complementarily to a target nucleic acid; (B) contains a site cleaved by a cleavage enzyme; and (c) has a terminal label. [2] The method of [1], wherein the target nucleic acid is measured over time.
  • [3] The method of [1] or [2], wherein the target nucleic acid is measured by the following (1) and (2): (1) subjecting a nucleic acid sample to a nucleic acid amplification reaction of a target nucleic acid using a recombinase in the presence of the probe and a cleavage enzyme; and (2) a detection signal caused by the probe in the nucleic acid amplification reaction. To detect.
  • [4] The method according to [3], further comprising evaluating the presence or absence of the target nucleic acid or the amount of the target nucleic acid based on a change in the detection signal with time.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the probe includes a site cleaved by a cleaving enzyme in a region capable of complementary binding to the target nucleic acid.
  • the probe is end-labeled by the following (c1) or (c2): (C1)
  • the probe has a detection signal generating substance at the 5 ′ end and a substance capable of interfering with the detection signal generating substance at the 3 ′ end; or (c2)
  • the probe interferes with the detection signal generating substance.
  • the detection signal generating substance is a fluorescent substance, and the substance capable of interfering with the detection signal generating substance is a quenching substance.
  • the amount of the target nucleic acid is measured by monitoring a decrease in fluorescence intensity over time.
  • the cleavage enzyme is RNaseH.
  • the target nucleic acid amplification reaction is performed under a temperature condition of 60 ° C. or lower.
  • a kit comprising a probe having the following characteristics (a) to (c), a cleavage enzyme, and a recombinase: (A) a single-stranded nucleic acid molecule comprising a pair of regions that can bind complementarily to each other and a region that can bind complementarily to a target nucleic acid; (B) contains a site cleaved by a cleavage enzyme; and (c) has a terminal label. [15] The kit according to [14], further comprising a DNA polymerase.
  • the method of the present invention can use various labeling substances (eg, a detection signal generating substance and a substance capable of interfering with the detection signal generating substance), and has advantages such as low synthesis difficulty and low synthesis cost. This is useful because it can be performed using various labeling substances (eg, a detection signal generating substance and a substance capable of interfering with the detection signal generating substance), and has advantages such as low synthesis difficulty and low synthesis cost. This is useful because it can be performed using various labeling substances (eg, a detection signal generating substance and a substance capable of interfering with the detection signal generating substance), and has advantages such as low synthesis difficulty and low synthesis cost. This is useful because it can be performed using various labeling substances (eg, a detection signal generating substance and a substance capable of interfering with the detection signal generating substance), and has advantages such as low synthesis difficulty and low synthesis cost. This is useful because it can be performed using various labeling substances (eg, a detection signal generating substance and a substance capable of inter
  • FIG. 1 is a diagram showing the principle of detection of a target nucleic acid by a nucleic acid amplification reaction using recombinase in the presence of a molecular beacon type probe and a cleavage enzyme.
  • a fluorescent substance will be described as a detection signal generating substance, and a quenching substance will be described as an example of a substance that can interfere with the detection signal generating substance.
  • recombinase is present: The molecular beacon probe cannot be directly used for detection of a target nucleic acid by a nucleic acid amplification reaction using recombinase.
  • a target nucleic acid is present: First, a molecular beacon probe (single-stranded nucleic acid) forms a double strand with the target nucleic acid. Next, the formed double strand is recognized by a cleavage enzyme, and the molecular beacon type probe is cleaved.
  • FIG. 2 is a diagram showing changes in fluorescence intensity in a nucleic acid amplification reaction of a target nucleic acid using recombinase in the presence of a molecular beacon type probe and an enzyme having RNase H activity.
  • HBV DNA Hepatitis B virus DNA
  • DW Distilled Water.
  • FIG. 3 is a diagram showing fluorescence signal quenching dependent on the amount of target nucleic acid added by the method of the present invention.
  • target nucleic acid HBV DNA having various copy numbers was used.
  • FIG. 4 is a diagram showing changes in fluorescence intensity with respect to temperature changes in the RPA reaction and PCR reaction using a molecular beacon type probe.
  • the present invention provides a method for detecting a target nucleic acid.
  • the method of the invention includes measuring a target nucleic acid using a probe, a cleavage enzyme, and a recombinase.
  • the probe used in the method of the present invention may have the following features (a) to (c): (A) a single-stranded nucleic acid molecule comprising a pair of regions that can bind complementarily to each other and a region that can bind complementarily to a target nucleic acid; (B) contains a site cleaved by a cleavage enzyme; and (c) has a terminal label.
  • the probe used in the method of the present invention can be a molecular beacon type probe having a structure similar to that of a molecular beacon probe having a stem portion and a loop portion (the probe used in the method of the present invention is referred to as a molecular beacon type probe).
  • the probe used in the method of the present invention is a target that can correspond to the stem portion of a molecular beacon probe, a pair of regions that can bind complementarily to each other, and the loop portion of a molecular beacon probe It can be a single-stranded nucleic acid molecule comprising a region that can bind complementarily to a nucleic acid. Since the probe used in the method of the present invention includes a region that can complementarily bind to the target nucleic acid as described above, it can form a double strand with the target nucleic acid.
  • Probes used in the method of the present invention include adenine (A), guanine (G), cytosine (C), uracil (U) and thymine (T) and their modified nucleobases (eg, tetrahydrofuran residues, inosine, uridine) , 3-nitropyrrole, 5-nitroindole, pyrimidine derivatives, purine derivatives), and nucleotide residues (DNA or RNA) having a nucleobase selected from the group consisting of.
  • the total length of the probe used in the method of the present invention is, for example, 23 or more nucleotides, preferably 26 or more, more preferably 32 or more nucleotides.
  • the total length of the probe used in the method of the present invention is also, for example, 100 or less, preferably 80 or less, more preferably 60 or less nucleotides in length.
  • a pair of regions that can bind complementarily to each other is composed of any nucleotide residue that allows complementary binding within the molecule, for example, the nucleotide residues described above that are DNA (eg, the normal DNA residues). It is comprised from 1 or more types (for example, 1 type, 2 types, 3 types, or 4 types) of A, G, C, and T which are structural components.
  • the pair of regions that can be complementarily bound to each other preferably has no cleavage-inducing residue described later. It is preferable that a pair of regions capable of complementarily binding to each other exist in the 5 ′ end region and 3 ′ end region of the probe, respectively.
  • Each region that can be complementarily bound to each other is preferably designed so as not to complementarily bind to the target nucleic acid.
  • the length of each individual region of the pair of regions that can bind complementarily to each other is, for example, 3 or more, preferably 5 or more, more preferably 6 or more nucleotides.
  • the length of a pair of regions that can bind complementarily to each other is also, for example, 25 or less, preferably 20 or less, more preferably 15 or less nucleotides.
  • the region capable of complementary binding to the target nucleic acid includes any nucleotide residue that allows complementary binding that allows binding of the probe to the target nucleic acid, eg, the above-described nucleotide residues that are DNA 1 type or more (for example, 1 type, 2 types, 3 types, or 4 types) of (For example, A, G, C, and T which are normal structural components of DNA) are included.
  • the region that can be complementarily bound to the target nucleic acid is preferably present between a pair of regions that can be complementarily bound to each other. It is preferable that the region capable of complementary binding with the target nucleic acid further has one or more cleavage-inducing residues (eg, 1, 2, 3 or 4) described later.
  • a cleavage-inducing residue in a region capable of complementary binding to the target nucleic acid may or may not bind complementarily to a predetermined nucleotide in the target nucleic acid.
  • the cleavage-inducing residue is counted from the first terminal nucleotide residue (the first nucleotide residue in the region capable of complementary binding to the target nucleic acid) of the region capable of complementary binding to the target nucleic acid. 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th It may be inserted at the position of the 19th, 19th or 20th nucleotide residue.
  • the length of the region capable of complementary binding to the target nucleic acid is, for example, 20 or more nucleotides, preferably 30 or more nucleotides.
  • the length of the region capable of complementary binding to the target nucleic acid is also, for example, 50 or less, preferably 40 or less nucleotides.
  • the length of the region capable of complementary binding to the target nucleic acid is preferably 20 to 50 nucleotides, more preferably 20 to 40 nucleotides, and even more preferably 30 to 30 nucleotides. It is 34 nucleotides long.
  • Probes used in the methods of the invention can also include sites that are cleaved by a cleaving enzyme.
  • cleaving enzyme refers to a probe (single-stranded nucleic acid) used in the present invention that forms a double-stranded nucleic acid composed of a probe and a target nucleic acid by complementary binding to the target nucleic acid. Furthermore, it means an enzyme having an activity of cleaving only the probe used in the present invention out of two nucleic acids forming a double-stranded nucleic acid. Therefore, the cleaving enzyme is double-stranded when the probe (single-stranded nucleic acid) used in the present invention is complementarily bound to the target nucleic acid to form a double-stranded nucleic acid composed of the probe and the target nucleic acid.
  • the cleaving enzyme examples include an enzyme having RNase H activity.
  • the “enzyme having RNase H activity” is composed of not only an RNA strand in a hybrid double-stranded nucleic acid composed of a DNA strand / RNA strand, but also a DNA strand / DNA strand containing a cleavage-inducing residue. It refers to an enzyme capable of cleaving a DNA strand containing a cleavage-inducing residue in a double-stranded nucleic acid.
  • examples of the cleavage enzyme include RNase H, exonuclease III, and Nfo (eg, derived from E. coli).
  • the “cleavage-inducing residue” refers to the above-mentioned cleavage enzyme when a single-stranded nucleic acid containing a cleavage-inducing residue binds complementarily to a target nucleic acid to form a double-stranded nucleic acid. The residue that is recognized by and induces cleavage of the single-stranded nucleic acid.
  • Cleavage-inducing residues include A, G, C and T, which are normal components of DNA (ie, 2′-deoxyadenosine 5′-phosphate, 2′-deoxyguanosine 5′-phosphate, 2′-deoxy Cytidine 5'-phosphate and 2'-deoxythymidine 5'-phosphate) are not included.
  • Examples of cleavage-inducing residues include RNA constituent units (nucleotides having ribose as the sugar moiety) and tetrahydrofuran residues (generally also referred to as d-spacers).
  • RNA building blocks include, for example, A, G, C, and U (ie, adenosine 5′-phosphate, guanosine 5′-phosphate, cytidine 5′-phosphate, and uridine 5′-), which are normal RNA building blocks. Phosphate).
  • the probe containing the site cleaved by the cleaving enzyme can be a chimeric single-stranded DNA containing a cleavage-inducing residue as described above.
  • the chimera single-stranded DNA is one or more selected from the group consisting of the aforementioned A, G, C, and T, which are normal components of DNA (eg, 1, 2, 3 or A single-stranded nucleic acid molecule having 4 types of nucleotide residues and having at least one cleavage-inducing residue.
  • the probe used in the method of the present invention may further have an end label.
  • End labeling means that a probe which is a single-stranded nucleic acid molecule has a labeling substance at its end.
  • the labeling substance means a substance that enables detection of a compound labeled with the labeling substance, and examples thereof include a detection signal generating substance and a substance that can interfere with the detection signal generating substance.
  • a detection signal generating substance is a compound capable of generating a detectable signal.
  • An example of the detection signal generating portion is a fluorescent substance.
  • a substance that can interfere with the detection signal generating substance is a compound that interacts with the detection signal generating substance and changes the detection signal.
  • Examples of such a change in the detection signal include disappearance and generation of the detection signal, and shift of the detection signal wavelength.
  • Examples of the substance that can interfere with the detection signal generating substance include a quencher and a nucleic acid molecule that exhibits a fluorescence quenching phenomenon.
  • the probe used in the method of the present invention may be end-labeled by the following (c1) or (c2): (C1)
  • the probe has a detection signal generating substance at the 5 ′ end and a substance capable of interfering with the detection signal generating substance at the 3 ′ end; or (c2)
  • the probe interferes with the detection signal generating substance.
  • the substance that can interfere with the detection signal generating substance is a quenching substance.
  • the fluorescent material used in the present embodiment include 6-FAM (6-carboxyfluorescein), TET (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX (hexachlorofluorescein), 6-JOE (6-carboxy-4 ′ , 5′-dichloro-2 ′, 7′-dimethoxyfluorescein), ROX (carboxy-6-rhodamine), and TAMRA ((6-tetramethylrhodamine-5 (6) -carboxamido) hexanoate).
  • BHQ-1 ([(4- (2-nitro-4-methyl-phenyl) -azo) -yl-((2-methoxy-5-methyl-phenyl) -Azo)]-aniline
  • BHQ-2 (([(4- (1-nitro-phenyl) -azo) -yl-((2,5-dimethoxy-phenyl) -azo)]-aniline)
  • Dabcyl 4-[[4- (dimethylamino) -phenyl] -azo] -benzoic acid), Eclipse (4-[[2-chloro-4-nitro-phenyl] -azo] -aniline), TAMRA ((6-tetra Methylrhodamine-5 (6) -carboxamide) hexanoate).
  • the substance that can interfere with the detection signal generating substance may be a nucleic acid molecule that exhibits a fluorescence quenching phenomenon.
  • the fluorescent substance used in the present embodiment fluorescent substance having a property of quenching by interaction with a nucleic acid molecule exhibiting a fluorescence quenching phenomenon
  • examples of the fluorescent substance used in the present embodiment include a fluorescent substance whose fluorescence signal decreases when approaching a guanine base. It is done.
  • fluorescent substances whose fluorescence signal decreases when they are close to a guanine base include, for example, Pacific Blue (2-oxo-6,8-difluoro-7-hydroxy-2H-1-benzopyran-3-carboxylic acid), BODIPY FL (N- [2- (iodoacetylamino) ethyl] -5,7-dimethyl-4,4-difluoro-3a-azonia-4-bora (IV) -4H-4a-aza-s-indacene-3-propane Amide), 5-CR6G (5-carboxyrhodamine), TAMRA ((6-tetramethylrhodamine-5 (6) -carboxamido) hexanoate), 6-JOE (6-carboxy-4 ′, 5′-dichloro-2 ′) , 7'-dimethoxyfluorescein), Alexa 488, Alexa 532, BODIPY TMR, B DIPY FL /
  • any recombinase that can be used for the measurement of the target nucleic acid can be used, but a recombinase that can be used for the nucleic acid amplification reaction of the target nucleic acid using the recombinase is preferable.
  • recombinases that can be used in the method of the present invention include UvsX, RecA, and analogs thereof.
  • the target nucleic acid may be measured over time. Measuring the target nucleic acid over time means measuring the target nucleic acid at two or more different time points. Therefore, the target nucleic acid can be measured in real time. Two or more different time points include, for example, two, two, three, four, five, six, seven, eight, nine and ten different time points, and more time points (eg, 15, 20, 25, 30, 35). , 40, 45 and 50).
  • the measurement interval which is the time interval at the time point, may or may not be constant, but is preferably constant.
  • the measurement interval is less than 1 minute (eg, 10 seconds, 15 seconds, 20 seconds, 30 seconds, 40 seconds, 50 seconds), 1 minute or more (eg, 1 minute, 1 minute 30 seconds, 2 minutes, 2 minutes 30 seconds, 3 minutes, 4 minutes, 5 minutes), and can be set as appropriate according to the purpose of measuring the target nucleic acid.
  • 1 minute eg, 10 seconds, 15 seconds, 20 seconds, 30 seconds, 40 seconds, 50 seconds
  • 1 minute or more eg, 1 minute, 1 minute 30 seconds, 2 minutes, 2 minutes 30 seconds, 3 minutes, 4 minutes, 5 minutes
  • the method of the present invention may be carried out according to the following (1) and (2): (1) subjecting a nucleic acid sample to a nucleic acid amplification reaction of a target nucleic acid using a recombinase in the presence of a probe and a cleavage enzyme; and (2) detecting a detection signal caused by the probe in the nucleic acid amplification reaction. thing.
  • nucleic acid sample a nucleic acid sample such as DNA or RNA itself or any sample containing it is used.
  • the nucleic acid sample is not particularly limited.
  • animals such as mammals, plants, insects, microorganisms (eg, bacteria, yeast), viruses (eg, hepatitis viruses such as HAV, HBV, HCV, and retroviruses such as HIV). It may be a sample containing or suspected of containing a nucleic acid component derived from.
  • the nucleic acid sample may be a biological sample (eg, blood, saliva, hair, mucous membrane, tissue sample) derived from a mammal suffering from or suspected of having a disease.
  • the nucleic acid sample is used in the method of the present invention after extraction of the nucleic acid, if necessary.
  • the measurement target is DNA, it can be used directly in the method of the present invention.
  • the measurement target is RNA, it can be used in the method of the present invention after reverse transcription reaction.
  • the nucleic acid amplification reaction using recombinase can be performed under any temperature condition, but is performed at a temperature of about 60 ° C. or lower, for example, about 55 ° C., about 50 ° C., about 45 ° C. or about 40 ° C. or lower. May be.
  • the temperature of the nucleic acid amplification reaction using recombinase may also be performed at a temperature of about 25 ° C. or higher, such as a temperature of about 30 ° C., about 37 ° C. or about 40 ° C. or higher.
  • the nucleic acid amplification reaction using recombinase may also be an isothermal nucleic acid amplification reaction.
  • the isothermal nucleic acid amplification reaction is generally performed under a medium-high temperature condition of 50 ° C. or higher (eg, 50 ° C. or higher and lower than 70 ° C.) and 50 ° C. or lower (eg, 25 ° C. or higher and 50 ° C. or lower). Can be classified into isothermal nucleic acid amplification reactions performed under low temperature conditions.
  • the nucleic acid amplification reaction using recombinase under isothermal conditions may be performed, for example, at a low temperature of about 50 ° C. or lower (eg, a temperature of about 45 ° C.
  • the nucleic acid amplification reaction under isothermal conditions using recombinase may also be performed at a temperature of about 25 ° C. or higher, for example, about 30 ° C., about 35 ° C., or about 37 ° C. or higher.
  • the nucleic acid amplification reaction using recombinase may be a reaction under isothermal conditions.
  • examples of the nucleic acid amplification reaction using recombinase under isothermal conditions include RPA (Recombinase Polymerase Amplification) method and SIBA (Strand Invasion Based Amplification) method.
  • the concentration of the probe in the reaction solution used in the method of the present invention is, for example, 0.01 to 2 ⁇ M, preferably 0.02 to 1 ⁇ M, more preferably 0.04 to 0.5 ⁇ M. .
  • the concentration of the cleavage enzyme and the recombinase in the reaction solution used in the method of the present invention can be appropriately adjusted.
  • Other conditions for the nucleic acid amplification reaction eg, primer concentration, amount of nucleic acid sample added to the reaction solution, reaction time) can be appropriately set.
  • the detection signal can be detected by any method known per se in the art.
  • the probe single-stranded nucleic acid
  • the formed double-stranded nucleic acid is recognized by a cleavage enzyme, and the probe is cleaved among the two nucleic acids forming the double-stranded nucleic acid.
  • a detection signal generating substance and a substance that can interfere with the detection signal generating substance Interact in close proximity, resulting in a change in the detection signal.
  • the target nucleic acid can be measured by detecting the changed detection signal. Since such a detection signal is generated due to the cleavage of the probe by the cleavage enzyme, the degree of change in the detection signal can be proportional to the amount of cleavage of the probe by the cleavage enzyme.
  • the amount of the probe cleaved by the cleaving enzyme can be proportional to the amount of target nucleic acid that can form a double-stranded nucleic acid with the probe.
  • the degree of change in the detection signal can be proportional to the amount of target nucleic acid.
  • a fluorescent substance is used as a detection signal generating substance and a quenching substance or a nucleic acid molecule that exhibits a fluorescence quenching phenomenon is used as a substance that can interfere with the detection signal generating substance
  • the degree of fluorescence quenching is proportional to the amount of target nucleic acid. obtain.
  • the detection signal may be detected over time. Detection of the detection signal with time means detecting the detection signal at two or more different time points. Therefore, the detection signal can be detected in real time. Two or more different time points include, for example, two, two, three, four, five, six, seven, eight, nine and ten different time points, and more time points (eg, 15, 20, 25, 30, 35). , 40, 45 and 50).
  • the measurement interval which is the time interval at the time point, may or may not be constant, but is preferably constant.
  • the measurement interval is less than 1 minute (eg, 10 seconds, 15 seconds, 20 seconds, 30 seconds, 40 seconds, 50 seconds), 1 minute or more (eg, 1 minute, 1 minute 30 seconds, 2 minutes, 2 minutes 30 seconds, 3 minutes, 4 minutes, 5 minutes), and can be set as appropriate according to the purpose of measuring the target nucleic acid.
  • 1 minute eg, 10 seconds, 15 seconds, 20 seconds, 30 seconds, 40 seconds, 50 seconds
  • 1 minute or more eg, 1 minute, 1 minute 30 seconds, 2 minutes, 2 minutes 30 seconds, 3 minutes, 4 minutes, 5 minutes
  • the change eg, decrease, increase
  • the presence or absence of the target nucleic acid or the amount of the target nucleic acid can be evaluated based on the change in the detection signal over time.
  • Such an evaluation step may be included in the method of the present invention.
  • the method of the present invention may include such an evaluation step in addition to the above steps (1) and (2). Specifically, when the value of the detection signal does not substantially change with time from the baseline level, it can be evaluated that the target nucleic acid is not present. On the other hand, if the value of the detection signal changes from the baseline level substantially over time, it can be evaluated that the target nucleic acid is present.
  • the amount of the target nucleic acid can be evaluated.
  • the method of the present invention is useful for measuring a target nucleic acid.
  • the present invention is useful for general qualitative assays (eg, polymorphism analysis such as SNP, haplotype, etc.) and quantitative assays (eg, analysis of gene expression level or genome content in a sample). As demonstrated in Example 2, FIG. 3, it can be suitably used for quantitative assays.
  • the method of the present invention is also useful for diagnosis, treatment monitoring and the like of animals such as humans.
  • the present invention also provides a kit.
  • the kit of the present invention includes the above-described probe, cleavage enzyme, and recombinase. Each of the probe, cleavage enzyme, and recombinase is as described above.
  • the kit of the present invention is used, for example, in the above-described measurement system (eg, nucleic acid amplification reaction).
  • the kit of the present invention may contain a DNA polymerase.
  • the kit of the present invention may also contain a single-stranded DNA binding protein (SSB).
  • the kit of the present invention may contain dNTPs.
  • the kit of the present invention may contain ATP.
  • the kit of the present invention may also contain a primer for the target nucleic acid.
  • the number of primers contained in the kit of the present invention is, for example, 2 (RPA method) or 3 (SIBA method).
  • the kit of the present invention can also be used for positive control [eg, normal target nucleic acid (eg, DNA, RNA)] and / or negative control [eg, solution containing no target nucleic acid, or abnormal target nucleic acid (eg, DNA, RNA). )] May be included.
  • the kit of the present invention further comprises a nucleic acid (eg, DNA,) against a housekeeping gene (eg, GAPDH, ⁇ -actin, ⁇ 2-microglobulin, HPRT1) that can be used as a comparative control in qualitative and / or quantitative assays. Other controls such as RNA) may be included.
  • the kit of the present invention may also contain primers for these controls.
  • the kit of the present invention may contain each component in a form isolated in individual containers (eg, tubes), but two or more kinds of components may be mixed in advance in the same container.
  • Example 1 Detection of Target Nucleic Acid by Nucleic Acid Amplification Reaction Using Recombinase, Molecular Beacon Probe, and Cleavage Enzyme
  • This kit contains DNA polymerase, recombinase (UvsX), dNTPs, ATP, and single-stranded DNA binding protein (SSB) as components necessary for the nucleic acid amplification reaction. Therefore, these components were utilized in the assay shown below.
  • a target nucleic acid DNA encoding a gene corresponding to the S antigen site of HBV was used.
  • the forward primer 5′-ctggctatcgctggagtgtgtctgcggcgttttta-3 ′ (SEQ ID NO: 1) and the reverse primer: 5′-ttgcgaaagccccgaggatgggggagacac-3 ′ (SEQ ID NO: 2) were used.
  • the sequence of the molecular beacon type probe which is a detection probe, is 5′-ccgtcgtttgct [g] tacaaaaccttcggacgg-3 ′ (SEQ ID NO: 3: g in parentheses is RNA) and 6-FAM (fluorescent substance at the 5 ′ end) ) Eclipse (quenching substance) labeled at the 3 ′ end was used.
  • 6-FAM fluorescent substance at the 5 ′ end
  • Eclipse quenching substance labeled at the 3 ′ end was used.
  • 0.42 ⁇ M forward primer, 0.42 ⁇ M reverse primer, 0.1 ⁇ M molecular beacon-type probe, and 1 U Ribonuclease H were added.
  • Example 2 Study on the addition amount of the target nucleic acid the target nucleic acid (HBV DNA) amount of 10 3 copies / 50 [mu] L, 10 4 copies / 50 [mu] L, except for using 10 5 copies / 50 [mu] L, the same method as in Example 1 Tested. Similarly, a solution (0 copy) using Distilled Water (DW) instead of the target nucleic acid was also tested. As a result, it was confirmed that the time during which the fluorescence signal was quenched changed depending on the target nucleic acid addition amount (FIG. 3). Therefore, it was shown that the method of the present invention can be used for quantification of a target nucleic acid.
  • HBV DNA Target nucleic acid
  • Example 3 Behavior of temperature change of molecular beacon type probe under RPA reaction conditions
  • 0.1 ⁇ M molecular beacon type probe and 14 mM magnesium acetate were added.
  • 50 ⁇ L of the prepared solution was added to RPA Pellet and dissolved.
  • the solution prepared above was incubated at 37 ° C. at intervals of 30 ° C. by 0.5 ° C. and incubated until the temperature increased to 80 ° C.
  • the fluorescence signal was measured at each temperature. As a result, the fluorescence signal intensity was high up to around 50 ° C., the fluorescence intensity decreased from around 50 ° C.
  • the present invention is useful for measuring a target nucleic acid.
  • the present invention is useful for qualitative and quantitative assays, as well as diagnostics, therapeutic monitoring, etc. for animals such as humans.

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Abstract

　本発明は、リコンビナーゼを用いる測定系（例、核酸増幅反応）において、汎用性の高い核酸プローブを用いた検出系を提供する。具体的には、本発明は、以下（ａ）～（ｃ）の特徴を有するプローブ、切断酵素、およびリコンビナーゼを用いて標的核酸を測定することを含む、標的核酸の検出方法を提供する： （ａ）互いに相補的に結合し得る一対の領域、および標的核酸と相補的に結合し得る領域を含む一本鎖核酸分子である； （ｂ）切断酵素により切断される部位を含む；かつ （ｃ）末端標識を有する。

Description

分子ビーコン型プローブを用いた標的核酸の検出方法
　本発明は、標的核酸の検出方法およびキットに関する。
　核酸増幅反応としては、温度変化を伴う核酸増幅反応（例、ＰＣＲ）、等温核酸増幅反応がある。等温核酸増幅反応としては、リコンビナーゼを用いる方法であるＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が知られている。核酸増幅反応は、標的核酸を検出する際に利用されており、核酸増幅反応における標的核酸を検出するための検出用プローブとしては、ステム部分およびループ部分を有し、ステムループ構造を形成できる分子ビーコンプローブ（特許文献１）、ＲＮａｓｅＨによる切断部位を有するサイクリングプローブ（特許文献２）が知られている。また、リコンビナーゼを用いる核酸増幅反応では、特殊な核酸プローブ、すなわち、蛍光物質および消光物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）で内部標識されており、かつ切断酵素による切断部位を有する核酸プローブが用いられている（非特許文献１）
ＷＯ１９９５／０１３３９９ ＷＯ８９／１０４１５
Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ，ＰＬｏＳ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２００６，Ｖｏｌｕｍｅ　４，Ｉｓｓｕｅ　７，ｅ２０４
　ところで、リコンビナーゼを用いる核酸増幅反応では、リコンビナーゼの影響により、一般的に用いられている他の核酸増幅反応の条件でステムループ構造を形成するプローブが、その構造を形成することができない。したがって、リコンビナーゼを用いる核酸増幅反応の検出では、核酸増幅反応の検出系として一般的に用いられている、蛍光物質および消光物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）をその両末端にそれぞれ有する分子ビーコンプローブが使用できず、その代わり、蛍光物質および消光物質で内部標識されており、かつ切断酵素による切断部位を有する上述した特殊な核酸プローブが使用されている（非特許文献１）。
　蛍光物質および消光物質をその両末端ではなく、その内部に有する核酸プローブの合成のためには、核酸プローブの内部に存在するヌクレオチド残基を、蛍光物質および消光物質で標識する必要がある。このような内部標識された核酸プローブの合成には、まずアミノ基などの官能基を有する核酸プローブを合成した後、この官能基を蛍光物質および消光物質と反応させなければならない。しかしながら、官能基に蛍光物質および消光物質を反応させるときには、加熱などの過酷な反応条件が必要となり、標識される物質によっては反応中に分解してしまう場合もある。したがって、このような標識に用いることができる標識物質の種類は限られている。また、このような核酸プローブの合成には特殊な技術が必要とされるため、合成が難しい、合成コストが高いという問題がある。
　すなわち、本発明の目的は、リコンビナーゼを用いる測定系（例、核酸増幅反応）において、種々の標識物質を利用することができる汎用性の高い核酸プローブを用いた検出系を確立することである。
　本発明者は、鋭意検討した結果、リコンビナーゼを用いる測定条件下では、リコンビナーゼの影響により、分子ビーコンプローブがステムループ構造を形成できないことを逆手に取って、新規な検出系を確立することに成功した（図１）。したがって、本発明者らは、上記課題を解決することに成功し、本願発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下（ａ）～（ｃ）の特徴を有するプローブ、切断酵素、およびリコンビナーゼを用いて標的核酸を測定することを含む、標的核酸の検出方法：
（ａ）互いに相補的に結合し得る一対の領域、および標的核酸と相補的に結合し得る領域を含む一本鎖核酸分子である；
（ｂ）切断酵素により切断される部位を含む；かつ
（ｃ）末端標識を有する。
〔２〕標的核酸の測定が経時的に行われる、〔１〕の方法。
〔３〕標的核酸の測定が、以下（１）および（２）により行われる、〔１〕または〔２〕の方法：
（１）前記プローブおよび切断酵素の存在下において、核酸試料を、リコンビナーゼを用いる標的核酸の核酸増幅反応に供すること：ならびに
（２）該核酸増幅反応において、前記プローブに起因して生じる検出シグナルを検出すること。
〔４〕経時的な検出シグナルの変化に基づいて、標的核酸の存在もしくは非存在、または標的核酸の量を評価することをさらに含む、〔３〕の方法。
〔５〕前記プローブが、標的核酸と相補的に結合し得る領域中に、切断酵素により切断される部位を含む、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕前記プローブが、以下（ｃ１）または（ｃ２）により末端標識されている、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法：
（ｃ１）前記プローブが、検出シグナル発生物質を５’末端に有し、かつ検出シグナル発生物質に干渉し得る物質を３’末端に有する；または
（ｃ２）前記プローブが、検出シグナル発生物質に干渉し得る物質を５’末端に有し、かつ検出シグナル発生物質を３’末端に有する。
〔７〕検出シグナル発生物質が蛍光物質であり、かつ検出シグナル発生物質に干渉し得る物質が消光物質である、〔６〕の方法。
〔８〕検出シグナルの検出において、経時的な蛍光強度の減少をモニタリングすることにより、標的核酸の量が測定される、〔７〕の方法。
〔９〕切断酵素がＲＮａｓｅＨである、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕６０℃以下の温度条件下で標的核酸の増幅反応が行われる、〔２〕～〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕５０℃以下の温度条件下で標的核酸の増幅反応が行われる、〔１０〕の方法。
〔１２〕核酸増幅反応が等温核酸増幅反応である、〔３〕～〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕等温核酸増幅反応がＲＰＡ法である、〔１２〕の方法。
〔１４〕以下（ａ）～（ｃ）の特徴を有するプローブ、切断酵素、およびリコンビナーゼを含むキット：
（ａ）互いに相補的に結合し得る一対の領域、および標的核酸と相補的に結合し得る領域を含む一本鎖核酸分子である；
（ｂ）切断酵素により切断される部位を含む；かつ
（ｃ）末端標識を有する。
〔１５〕ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、〔１４〕のキット。
　本発明の方法は、種々の標識物質（例、検出シグナル発生物質および検出シグナル発生物質に干渉し得る物質）を利用することができる、合成難度が低い、合成コストが安いなどの利点を有するプローブを用いて行うことができるため、有用である。
図１は、分子ビーコン型プローブおよび切断酵素の存在下における、リコンビナーゼを用いる核酸増幅反応による標的核酸の検出の原理を示す図である。検出シグナル発生物質として蛍光物質、および検出シグナル発生物質に干渉し得る物質として消光物質を例に挙げて説明する。　（１）リコンビナーゼが存在する場合：分子ビーコン型プローブはそのままでは、リコンビナーゼを用いる核酸増幅反応による標的核酸の検出に直接的に使用できない。これは、（ｉ）リコンビナーゼを用いる核酸増幅反応の条件下ではリコンビナーゼの影響でステムループ構造を形成できないため、ならびに（ｉｉ）ステムループ構造を形成できない場合、蛍光物質と消光物質との間の距離が離れているため、蛍光物質と消光物質とが相互作用し得ず、蛍光が消光されないためである。　（２）標的核酸が存在する場合：先ず、分子ビーコン型プローブ（一本鎖核酸）が標的核酸と二本鎖を形成する。次いで、形成された二本鎖が切断酵素により認識されて、分子ビーコン型プローブが切断される。最終的に、切断により生じた二本の互いに相補的に結合し得る領域がハイブリダイゼーションして二重鎖が形成されることで、蛍光が消光される。　（３）標的核酸が存在しない場合：分子ビーコン型プローブが標的核酸と二本鎖を形成しない。その結果、分子ビーコン型プローブが切断されないため、蛍光が消光されない。 図２は、分子ビーコン型プローブおよびＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素の存在下における、リコンビナーゼを用いる標的核酸の核酸増幅反応における、蛍光強度の変化を示す図である。ＨＢＶ　ＤＮＡ：Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ；ＤＷ：Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ。 図３は、本発明の方法による、標的核酸添加量依存的な蛍光シグナルの消光を示す図である。標的核酸として、種々のコピー数のＨＢＶ　ＤＮＡを用いた。 図４は、分子ビーコン型プローブを用いたＲＰＡ反応およびＰＣＲ反応の温度変化に対する蛍光強度の変化を示す図である。
　本発明は、標的核酸の検出方法を提供する。
　本発明の方法は、プローブ、切断酵素、およびリコンビナーゼを用いて標的核酸を測定することを含む。
　本発明の方法で用いられるプローブは、以下（ａ）～（ｃ）の特徴を有し得る：
（ａ）互いに相補的に結合し得る一対の領域、および標的核酸と相補的に結合し得る領域を含む一本鎖核酸分子である；
（ｂ）切断酵素により切断される部位を含む；かつ
（ｃ）末端標識を有する。
　特徴（ａ）について説明する。
　本発明の方法で用いられるプローブは、ステム部分およびループ部分を有する分子ビーコンプローブと同様の構造を有する分子ビーコン型プローブであり得る（本発明の方法で用いられるプローブを、分子ビーコン型プローブと称する場合がある）。具体的には、本発明の方法で用いられるプローブは、分子ビーコンプローブのステム部分に相当し得る、互いに相補的に結合し得る一対の領域、および分子ビーコンプローブのループ部分に相当し得る、標的核酸と相補的に結合し得る領域を含む一本鎖核酸分子であり得る。本発明の方法で用いられるプローブは、上述のとおり標的核酸と相補的に結合し得る領域を含むため、標的核酸と二本鎖を形成できる。
　本発明の方法で用いられるプローブは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）およびチミン（Ｔ）ならびにそれらの修飾核酸塩基（例、テトラヒドロフラン残基、イノシン、ウリジン、３－ニトロピロール、５－ニトロインドール、ピリミジン誘導体、プリン誘導体）からなる群より選ばれる核酸塩基を有するヌクレオチド残基（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。
　本発明の方法で用いられるプローブの全長は、例えば２３個以上、好ましくは２６個以上、より好ましくは３２個以上のヌクレオチド長である。本発明の方法で用いられるプローブの全長はまた、例えば１００個以下、好ましくは８０個以下、より好ましくは６０個以下のヌクレオチド長である。
　互いに相補的に結合し得る一対の領域は、分子内での相補的な結合を可能にする任意のヌクレオチド残基から構成され、例えば、ＤＮＡである上述したヌクレオチド残基（例、ＤＮＡの通常の構成成分であるＡ、Ｇ、ＣおよびＴ）の１種以上（例、１種、２種、３種または４種）から構成される。互いに相補的に結合し得る一対の領域は、後述する切断誘導性残基を有しないことが好ましい。互いに相補的に結合し得る一対の領域は、それぞれ、プローブの５’末端領域および３’末端領域中に存在することが好ましい。互いに相補的に結合し得る各領域は、標的核酸とは相補的に結合しないように設計されることが好ましい。
　互いに相補的に結合し得る一対の領域の個々の領域の長さは、例えば３個以上、好ましくは５個以上、より好ましくは６個以上のヌクレオチド長である。互いに相補的に結合し得る一対の領域の長さはまた、例えば２５個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下のヌクレオチド長である。
　標的核酸と相補的に結合し得る領域は、プローブと標的核酸との結合を可能にする、相補的な結合を可能にする任意のヌクレオチド残基を含み、例えば、ＤＮＡである上述したヌクレオチド残基（例、ＤＮＡの通常の構成成分であるＡ、Ｇ、ＣおよびＴ）の１種以上（例、１種、２種、３種または４種）を含む。標的核酸と相補的に結合し得る領域は、互いに相補的に結合し得る一対の領域の間に存在することが好ましい。標的核酸と相補的に結合し得る領域はさらに、後述する切断誘導性残基を１個以上（例、１個、２個、３個または４個）有することが好ましい。標的核酸と相補的に結合し得る領域中の切断誘導性残基は、標的核酸中の所定のヌクレオチドと相補的に結合してもよく、相補的に結合しなくてもよい。切断誘導性残基は、標的核酸と相補的に結合し得る領域の一方の末端ヌクレオチド残基（標的核酸と相補的に結合し得る領域中の１番目のヌクレオチド残基）から数えて、１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目または２０番目のヌクレオチド残基の位置に、挿入されてもよい。
　標的核酸と相補的に結合し得る領域の長さは、例えば２０個以上、好ましくは３０個以上のヌクレオチド長である。標的核酸と相補的に結合し得る領域の長さはまた、例えば５０個以下、好ましくは４０個以下のヌクレオチド長である。リコンビナーゼによる認識性の観点から、標的核酸と相補的に結合し得る領域の長さは、好ましくは２０～５０ヌクレオチド長であり、より好ましくは２０～４０ヌクレオチド長であり、さらにより好ましくは３０～３４ヌクレオチド長である。
　特徴（ｂ）について説明する。
　本発明の方法で用いられるプローブはまた、切断酵素により切断される部位を含み得る。
　本発明において、「切断酵素」とは、本発明で用いられるプローブ（一本鎖核酸）が標的核酸と相補的に結合して、プローブおよび標的核酸から構成される二本鎖核酸を形成したときに、二本鎖核酸を形成する２つの核酸のうち、本発明で用いられるプローブのみを切断する活性を有する酵素を意味する。したがって、切断酵素は、本発明で用いられるプローブ（一本鎖核酸）が標的核酸と相補的に結合して、プローブおよび標的核酸から構成される二本鎖核酸を形成したときに、二本鎖核酸を形成する２つの核酸のうち、標的核酸を切断する活性を有し得ない。切断酵素としては、例えば、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素が挙げられる。本発明において、「ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素」とは、ＤＮＡ鎖／ＲＮＡ鎖から構成されるハイブリッド二本鎖核酸におけるＲＮＡ鎖のみならず、ＤＮＡ鎖／切断誘導性残基含有ＤＮＡ鎖から構成される二本鎖核酸における切断誘導性残基含有ＤＮＡ鎖もまた切断する能力を有する酵素をいう。具体的には、切断酵素としては、例えば、ＲＮａｓｅＨ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｎｆｏ（例、Ｅ．ｃｏｌｉ由来）が挙げられる。
　本発明において、「切断誘導性残基」とは、切断誘導性残基を含有する一本鎖核酸が標的核酸と相補的に結合して二本鎖核酸を形成したときに、上述した切断酵素により認識されて、当該一本鎖核酸の切断を誘発する残基をいう。切断誘導性残基には、ＤＮＡの通常の構成成分であるＡ、Ｇ、ＣおよびＴ（即ち、２’－デオキシアデノシン　５’－ホスフェート、２’－デオキシグアノシン　５’－ホスフェート、２’－デオキシシチジン　５’－ホスフェート、および２’－デオキシチミジン　５’－ホスフェート）は含まれない。切断誘導性残基としては、例えば、ＲＮＡの構成単位（糖部分としてリボースを有するヌクレオチド）、テトラヒドロフラン残基（一般的にｄスペーサーとも呼ばれる）が挙げられる。ＲＮＡの構成単位としては、例えば、ＲＮＡの通常の構成単位であるＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ（即ち、アデノシン　５’－ホスフェート、グアノシン　５’－ホスフェート、シチジン　５’－ホスフェート、およびウリジン　５’－ホスフェート）が挙げられる。
　切断酵素により切断される部位を含むプローブは、上述したような切断誘導性残基を含むキメラ一本鎖ＤＮＡであり得る。本発明において、キメラ一本鎖ＤＮＡとは、ＤＮＡの通常の構成成分である上述したＡ、Ｇ、ＣおよびＴからなる群より選ばれる１種以上（例、１種、２種、３種または４種）のヌクレオチド残基を有し、かつ、切断誘導性残基を少なくとも１個有する一本鎖核酸分子をいう。
　特徴（ｃ）について説明する。
　本発明の方法で用いられるプローブはさらに、末端標識を有し得る。末端標識とは、一本鎖核酸分子であるプローブが、その末端に標識物質を有することをいう。標識物質とは、標識物質により標識された化合物の検出を可能にする物質を意味し、例えば、検出シグナル発生物質、検出シグナル発生物質に干渉し得る物質が挙げられる。検出シグナル発生物質は、検出可能なシグナルを発生し得る化合物である。検出シグナル発生部分としては、例えば、蛍光物質が挙げられる。検出シグナル発生物質に干渉し得る物質は、検出シグナル発生物質と相互作用して、検出シグナルを変化させる化合物である。このような検出シグナルの変化としては、例えば、検出シグナルの消失および発生、ならびに検出シグナル波長のシフトが挙げられる。検出シグナル発生物質に干渉し得る物質としては、例えば、消光物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、蛍光消光現象を示す核酸分子が挙げられる。
　本発明の方法で用いられるプローブは、以下（ｃ１）または（ｃ２）により末端標識されていてもよい：
（ｃ１）前記プローブが、検出シグナル発生物質を５’末端に有し、かつ検出シグナル発生物質に干渉し得る物質を３’末端に有する；または
（ｃ２）前記プローブが、検出シグナル発生物質に干渉し得る物質を５’末端に有し、かつ検出シグナル発生物質を３’末端に有する。
　一実施形態では、検出シグナル発生物質が蛍光物質である場合、検出シグナル発生物質に干渉し得る物質は、消光物質である。本実施形態で用いられる蛍光物質としては、例えば、６－ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（テトラクロロ－６－カルボキシフルオレセイン）、ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）、６－ＪＯＥ（６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン）、ＲＯＸ（カルボキシ－６－ローダミン）、およびＴＡＭＲＡ（（６－テトラメチルローダミン－５（６）－カルボキサミド）ヘキサノエート）が挙げられる。本実施形態で用いられる消光物質としては、例えば、ＢＨＱ－１（［（４－（２－ニトロ－４－メチル－フェニル）－アゾ）－イル－（（２－メトキシ－５－メチル－フェニル）－アゾ）］－アニリン）、ＢＨＱ－２（（［（４－（１－ニトロ－フェニル）－アゾ）－イル－（（２，５－ジメトキシ－フェニル）－アゾ）］－アニリン）、Ｄａｂｃｙｌ（４－［［４－（ジメチルアミノ）－フェニル］－アゾ］－安息香酸）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（４－［［２－クロロ－４－ニトロ－フェニル］－アゾ］－アニリン）、ＴＡＭＲＡ（（６－テトラメチルローダミン－５（６）－カルボキサミド）ヘキサノエート）が挙げられる。
　別の実施形態では、検出シグナル発生物質が蛍光物質である場合、検出シグナル発生物質に干渉し得る物質は、蛍光消光現象を示す核酸分子であってもよい。本実施形態で用いられる蛍光物質（蛍光消光現象を示す核酸分子との相互作用により消光する性質を有する蛍光物質）としては、例えば、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する蛍光物質が挙げられる。グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する蛍光物質としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ（２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸）、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ（Ｎ－［２－（ヨードアセチルアミノ）エチル］－５，７－ジメチル－４，４－ジフルオロ－３ａ－アゾニア－４－ボラ（ＩＶ）－４Ｈ－４ａ－アザ－ｓ－インダセン－３－プロパンアミド）、５－ＣＲ６Ｇ（５－カルボキシローダミン）、ＴＡＭＲＡ（（６－テトラメチルローダミン－５（６）－カルボキサミド）ヘキサノエート）、６－ＪＯＥ（６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン）、Ａｌｅｘａ　４８８、Ａｌｅｘａ　５３２、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ／Ｃ３が挙げられる。本実施形態で用いられる、蛍光消光現象を示す核酸分子としては、グアニン塩基を有する核酸分子（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）が挙げられる。
　リコンビナーゼとしては、標的核酸の測定に利用することができる任意のリコンビナーゼを使用することができるが、リコンビナーゼを用いる標的核酸の核酸増幅反応に利用することができるリコンビナーゼが好ましい。本発明の方法に利用することができるリコンビナーゼとしては、例えば、ＵｖｓＸ、ＲｅｃＡおよびそれらのアナログが挙げられる。
　標的核酸の測定は、経時的に行われてもよい。標的核酸の経時的な測定とは、異なる２以上の時点において、標的核酸を測定することを意味する。したがって、標的核酸の測定は、リアルタイムで行うことができる。異なる２以上の時点としては、例えば、異なる２、３、４、５、６、７、８、９および１０の時点、ならびにそれよりも多くの時点（例、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５および５０の時点）が挙げられる。上記時点の時間間隔である測定間隔は、一定であっても、一定でなくてもよいが、一定であることが好ましい。測定間隔は、１分未満（例、１０秒、１５秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒）であっても、１分以上（例、１分、１分３０秒、２分、２分３０秒、３分、４分、５分）であってもよく、標的核酸の測定目的に応じて適宜設定できる。
　本発明の方法は、以下（１）および（２）により行われてもよい：
（１）プローブおよび切断酵素の存在下において、核酸試料を、リコンビナーゼを用いる標的核酸の核酸増幅反応に供すること：ならびに
（２）上記核酸増幅反応において、プローブに起因して生じる検出シグナルを検出すること。
　核酸試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸試料自体、またはそれを含有する任意の試料が用いられる。核酸試料は、特に限定されないが、例えば、哺乳動物等の動物、植物、昆虫、微生物（例、細菌、酵母）、ウイルス（例、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等の肝炎ウイルス、ＨＩＶ等のレトロウイルス）に由来する核酸成分を含有する、または含有すると疑われる試料であってもよい。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、ペット（例、イヌ、ネコ、ウサギ）、使役動物または家畜（例、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）が挙げられる。核酸試料は、疾患に罹患している、または疾患に罹患していると疑われる哺乳動物に由来する生体試料（例、血液、唾液、毛髪、粘膜、組織サンプル）であってもよい。核酸試料は、必要に応じて、核酸の抽出後に、本発明の方法に用いられる。測定対象がＤＮＡである場合、本発明の方法に直接的に用いられ得る。測定対象がＲＮＡである場合、逆転写反応後に本発明の方法に用いられ得る。
　リコンビナーゼを用いる核酸増幅反応は、任意の温度条件下で行うことができるが、約６０℃以下の温度、例えば、約５５℃、約５０℃、約４５℃または約４０℃以下の温度で行われてもよい。リコンビナーゼを用いる核酸増幅反応の温度はまた、約２５℃以上の温度、例えば、約３０℃、約３７℃または約４０℃以上の温度で行われてもよい。
　リコンビナーゼを用いる核酸増幅反応はまた、等温核酸増幅反応であってもよい。等温核酸増幅反応は、一般的に、５０℃以上（例、５０℃以上７０℃未満）の中高温条件下で行われる等温核酸増幅反応、および５０℃以下（例、２５℃以上５０℃以下）の低温条件下で行なわれる等温核酸増幅反応に分類することができる。リコンビナーゼを用いる等温条件下の核酸増幅反応は、例えば、約５０℃以下の低温（例、約４５℃または約４０℃以下の温度）で行なわれてもよい。リコンビナーゼを用いる等温条件下の核酸増幅反応はまた、約２５℃以上の温度、例えば、約３０℃、約３５℃または約３７℃以上の温度で行われてもよい。
　リコンビナーゼを用いる核酸増幅反応は、等温条件下の反応であってもよい。リコンビナーゼを用いる等温条件下の核酸増幅反応としては、例えば、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＩＢＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｉｎｖａｓｉｏｎ　Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が挙げられる。
　本発明の方法（例、核酸増幅反応）で用いられる反応液中のプローブの濃度は、例えば０．０１～２μＭ、好ましくは０．０２～１μＭ、より好ましくは０．０４～０．５μＭである。
　本発明の方法（例、核酸増幅反応）で用いられる反応液中の、切断酵素およびリコンビナーゼの濃度の濃度は、適宜調整することができる。
　核酸増幅反応の他の条件（例、プライマー濃度、反応液に添加される核酸試料の量、反応時間）は、適宜設定することができる。
　検出シグナルの検出は、当該分野における自体公知の任意の方法により行うことができる。標的核酸が存在する場合、先ず、プローブ（一本鎖核酸）が標的核酸と相補的に結合して、プローブおよび標的核酸から構成される二本鎖核酸を形成する。次いで、形成された二本鎖核酸が切断酵素により認識されて、二本鎖核酸を形成する２つの核酸のうち、プローブが切断される。最終的に、切断により生じた、分離した２つの互いに相補的に結合し得る領域がハイブリダイゼーションして二重鎖が形成されることで、検出シグナル発生物質および検出シグナル発生物質に干渉し得る物質が近接して相互作用し、検出シグナルに変化が生じる。変化した検出シグナルを検出することにより、標的核酸を測定することができる。このような検出シグナルは、切断酵素によるプローブの切断に起因して生じるため、検出シグナルの変化の程度は、切断酵素によるプローブの切断量に比例し得る。切断酵素によるプローブの切断量は、プローブと二本鎖核酸を形成し得る標的核酸の量に比例し得る。換言すれば、検出シグナルの変化の程度は、標的核酸の量に比例し得る。例えば、検出シグナル発生物質として蛍光物質、および検出シグナル発生物質に干渉し得る物質として消光物質または蛍光消光現象を示す核酸分子を用いた場合、蛍光の消光の程度は、標的核酸の量に比例し得る。
　検出シグナルの検出は、経時的に行われてもよい。検出シグナルの経時的な検出とは、異なる２以上の時点において、検出シグナルを検出することを意味する。したがって、検出シグナルの検出は、リアルタイムで行うことができる。異なる２以上の時点としては、例えば、異なる２、３、４、５、６、７、８、９および１０の時点、ならびにそれよりも多くの時点（例、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５および５０の時点）が挙げられる。上記時点の時間間隔である測定間隔は、一定であっても、一定でなくてもよいが、一定であることが好ましい。測定間隔は、１分未満（例、１０秒、１５秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒）であっても、１分以上（例、１分、１分３０秒、２分、２分３０秒、３分、４分、５分）であってもよく、標的核酸の測定目的に応じて適宜設定できる。
　検出シグナルの検出が経時的に行われる場合、経時的な検出シグナルの変化（例、減少、増加）がモニタリングされてもよい。このようなモニタリングの結果、経時的な検出シグナルの変化に基づいて、標的核酸の存在もしくは非存在、または標的核酸の量を評価することができる。本発明の方法では、このような評価工程が含まれていてもよい。例えば、本発明の方法は、上記工程（１）および（２）に加えて、このような評価工程を含んでいてもよい。具体的には、検出シグナルの値がベースラインレベルから実質的に経時的に変化しない場合、標的核酸は存在しないと評価することができる。一方、検出シグナルの値がベースラインレベルから実質的に経時的に変化する場合、標的核酸は存在すると評価することができる。また、例えば、検出シグナルの値がベースラインレベルから実質的に経時的に変化するまでの時間、および／または検出シグナルの値がベースラインレベルから実質的に変化した後の単位時間あたりの検出シグナルの変化の度合いに基づいて、標的核酸の量を評価することができる。検出シグナルの値がベースラインレベルから実質的に経時的に変化するかどうかは、例えば、本発明の方法で得られた検出シグナルの値を、後述するようなネガティブコントロールで得られる経時的な検出シグナルの値と比較することにより、決定することができる。また、本発明の方法で得られた検出シグナルの値を、後述するようなポジティブコントロール（例えば、検量線作成のための標的核酸の希釈系列溶液であってもよい）を用いて得られる経時的な検出シグナルの値と比較してもよい。
　例えば、検出シグナル発生物質として蛍光物質、および検出シグナル発生物質に干渉し得る物質として消光物質または蛍光消光現象を示す核酸分子を用いた場合、経時的な蛍光強度の減少（即ち、蛍光の消光）に基づいて、標的核酸の存在もしくは非存在、または標的核酸の量を評価することができる。具体的には、検出強度がベースラインレベルから実質的に経時的に減少しない場合、標的核酸は存在しないと評価することができる。一方、蛍光強度がベースラインレベルから実質的に経時的に減少する場合、標的核酸は存在すると評価することができる。また、例えば、蛍光強度がベースラインレベルから実質的に減少するまでの時間、および／または蛍光強度がベースラインレベルから実質的に減少した後の単位時間あたりの蛍光強度の減少の度合いに基づいて、標的核酸の量を評価することができる。
　本発明の方法は、標的核酸の測定に有用である。例えば、本発明は、定性的アッセイ（例、ＳＮＰ、ハプロタイプ等の多型解析）および定量アッセイ（例、遺伝子の発現量、または試料中のゲノムの含量の解析）全般に有用であるが、実施例２、図３で実証されるように、定量的アッセイに好適に使用できる。本発明の方法はまた、ヒト等の動物の診断、治療モニタリングなどに有用である。
　本発明はまた、キットを提供する。
　本発明のキットは、上述したプローブ、切断酵素、およびリコンビナーゼを含む。プローブ、切断酵素、およびリコンビナーゼは、それぞれ、上述したとおりである。本発明のキットは、例えば、上述した測定系（例、核酸増幅反応）に用いられる。
　本発明のキットは、ＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよい。
　本発明のキットはまた、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）を含んでいてもよい。本発明のキットは、ｄＮＴＰｓを含んでいてもよい。本発明のキットは、ＡＴＰを含んでいてもよい。
　本発明のキットはまた、標的核酸に対するプライマーを含んでいてもよい。本発明のキットに含まれるプライマーの数は、例えば、２個（ＲＰＡ法）または３個（ＳＩＢＡ法）である。
　本発明のキットはまた、ポジティブコントロール〔例、正常な標的核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）〕および／またはネガティブコントロール〔例、標的核酸を含まない溶液、もしくは異常な標的核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）〕を含んでいてもよい。本発明のキットはさらに、定性的および／または定量的アッセイにおける比較用コントロールとして用いることができるハウスキーピング遺伝子（例、ＧＡＰＤＨ、β－アクチン、β２－マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１）に対する核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）のような他のコントロールを含んでいてもよい。本発明のキットはまた、これらのコントロールに対するプライマーを含んでいてもよい。本発明のキットは、個々の容器（例、チューブ）に隔離された形態で各成分を含んでいてもよいが、２種以上の成分が同一容器中で予め混合されていてもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、以下の実施例により本発明が限定されるものではない。
実施例１：リコンビナーゼ、分子ビーコン型プローブ、および切断酵素を利用する核酸増幅反応による標的核酸の検出
　核酸増幅アッセイには、ＴｗｉｓｔＤｘ社製のＲＰＡ法を原理とするＴｗｉｓｔＡｍｐ　Ｂａｓｉｃキットを使用した。このキットは、核酸増幅反応に必要な成分として、ＤＮＡポリメラーゼ、リコンビナーゼ（ＵｖｓＸ）、ｄＮＴＰｓ、ＡＴＰおよび一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）を含む。したがって、以下に示すアッセイでは、これらの成分を利用した。標的核酸として、ＨＢＶのＳ抗原部位に相当する遺伝子をコードするＤＮＡを使用した。標的核酸の増幅のため、フォワードプライマー：５’－ｃｔｇｇｃｔａｔｃｇｃｔｇｇａｔｇｔｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｔｔｔｔａ－３’（配列番号１）、リバースプライマー：５’－ｔｔｇｃｇａａａｇｃｃｃａｇｇａｔｇａｔｇｇｇａｔｇｇｇａａｔａｃ－３’（配列番号２）を使用した。検出用プローブである分子ビーコン型プローブの配列は、５’－ｃｃｇｔｃｇｔｔｇｃｔ［ｇ］ｔａｃａａａａｃｃｔｔｃｇｇａｃｇｇ－３’（配列番号３：括弧内のｇはＲＮＡである）とし、５’末端に６－ＦＡＭ（蛍光物質）、３’末端にＥｃｌｉｐｓｅ（消光物質）をそれぞれ標識したものを使用した。
　Ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒに、０．４２μＭ　フォワードプライマー、０．４２μＭ　リバースプライマー、０．１μＭ　分子ビーコン型プローブ、１Ｕ　Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｈとなるように添加した。次に、標的核酸（ＨＢＶ　ＤＮＡ）を１０５コピー／５０μＬとなるように加えた後、調製した溶液をＲＰＡ　Ｐｅｌｌｅｔに４７．５μＬ加え、溶解した。同様に標的核酸の代わりにＤｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ（ＤＷ）を使用した溶液も調製した。上記で調製した溶液に、２８０ｍＭ酢酸マグネシウム溶液を２．５μＬ添加し、良く撹拌した後、３７℃で２５分インキュベーションした。１分毎に蛍光シグナルを測定した。
　その結果、リコンビナーゼ、分子ビーコン型プローブ、および切断酵素を利用する核酸増幅反応において、標的核酸が存在する場合に蛍光シグナルが消光されることが確認された（図２）。
実施例２：標的核酸の添加量についての検討
　標的核酸（ＨＢＶ　ＤＮＡ）添加量を１０３コピー／５０μＬ、１０４コピー／５０μＬ、１０５コピー／５０μＬとした以外は、実施例１と同様の方法で試験した。同様に標的核酸の代わりにＤｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ（ＤＷ）を使用した溶液（０コピー）でも試験した。
　その結果、標的核酸添加量依存的に、蛍光シグナルが消光される時間が変化することが確認された（図３）。したがって、本発明の方法が標的核酸の定量に使用できることが示された。
実施例３：ＲＰＡ反応条件下での分子ビーコン型プローブの温度変化における挙動
　Ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒに、０．１μＭ　分子ビーコン型プローブ、１４ｍＭ　酢酸マグネシウムとなるように添加した。調製した溶液をＲＰＡ　Ｐｅｌｌｅｔに５０μＬ加え、溶解した。
　上記で調製した溶液を、３７℃から３０秒間隔で０．５℃ずつ温度を上昇させ、８０℃に上昇するまでインキュベーションした。インキュベーション時には各温度で蛍光シグナルを測定した。
　その結果、５０℃付近まで蛍光シグナル強度が高く、５０℃から６０℃付近にかけて蛍光強度が低下し、約６０℃の前後の温度において検出される蛍光強度の反転が観察された（図４の「ＲＰＡ反応液組成」を参照）。このことは、約５０℃以下の温度では、分子ビーコン型プローブがステムループ構造を形成していないこと、および５０℃から６０℃付近の温度ではリコンビナーゼの効果が温度依存的になくなり、徐々に分子ビーコン型プローブがステムループ構造を形成することを示す。６０℃前後の温度における蛍光強度の反転は、温度上昇に伴って、分子ビーコン型プローブがステムループ構造を維持できなくなっていることを示す。
参考例１：ＰＣＲ反応条件下での分子ビーコン型プローブの温度変化における挙動
　ＡＢＩ社製ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．３）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．００１％　Ｇｅｌａｔｉｎ）に、０．１μＭ　分子ビーコン型プローブとなるように添加した。
　上記で調製した溶液を、３７℃から３０秒間隔で０．５℃ずつ温度を上昇させ、８０℃までインキュベーションした。インキュベーション時には各温度で蛍光シグナルを測定した。
　その結果、５０℃付近の温度までは蛍光シグナルが低く、温度上昇と共に蛍光シグナルの上昇が認められた。これは、５０℃付近までの温度において、分子ビーコン型プローブがステムループ構造を形成していることを示す（図４の「ＰＣＲ反応液組成」を参照）。
　本発明は、標的核酸の測定に有用である。例えば、本発明は、定性的および定量アッセイ、ならびにヒト等の動物の診断、治療モニタリングなどに有用である。

Claims (15)

  1. 　以下（ａ）～（ｃ）の特徴を有するプローブ、切断酵素、およびリコンビナーゼを用いて標的核酸を測定することを含む、標的核酸の検出方法：
    （ａ）互いに相補的に結合し得る一対の領域、および標的核酸と相補的に結合し得る領域を含む一本鎖核酸分子である；
    （ｂ）切断酵素により切断される部位を含む；かつ
    （ｃ）末端標識を有する。
  2. 　標的核酸の測定が経時的に行われる、請求項１記載の方法。
  3. 　標的核酸の測定が、以下（１）および（２）により行われる、請求項１または２記載の方法：
    （１）前記プローブおよび切断酵素の存在下において、核酸試料を、リコンビナーゼを用いる標的核酸の核酸増幅反応に供すること：ならびに
    （２）該核酸増幅反応において、前記プローブに起因して生じる検出シグナルを検出すること。
  4. 　経時的な検出シグナルの変化に基づいて、標的核酸の存在もしくは非存在、または標的核酸の量を評価することをさらに含む、請求項３記載の方法。
  5. 　前記プローブが、標的核酸と相補的に結合し得る領域中に、切断酵素により切断される部位を含む、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  6. 　前記プローブが、以下（ｃ１）または（ｃ２）により末端標識されている、請求項１～５のいずれか一項記載の方法：
    （ｃ１）前記プローブが、検出シグナル発生物質を５’末端に有し、かつ検出シグナル発生物質に干渉し得る物質を３’末端に有する；または
    （ｃ２）前記プローブが、検出シグナル発生物質に干渉し得る物質を５’末端に有し、かつ検出シグナル発生物質を３’末端に有する。
  7. 　検出シグナル発生物質が蛍光物質であり、かつ検出シグナル発生物質に干渉し得る物質が消光物質である、請求項６記載の方法。
  8. 　検出シグナルの検出において、経時的な蛍光強度の減少をモニタリングすることにより、標的核酸の量が測定される、請求項７記載の方法。
  9. 　切断酵素がＲＮａｓｅＨである、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
  10. 　６０℃以下の温度条件下で標的核酸の増幅反応が行われる、請求項２～９のいずれか一項記載の方法。
  11. 　５０℃以下の温度条件下で標的核酸の増幅反応が行われる、請求項１０記載の方法。
  12. 　核酸増幅反応が等温核酸増幅反応である、請求項３～１１のいずれか一項記載の方法。
  13. 　等温核酸増幅反応がＲＰＡ法である、請求項１２記載の方法。
  14. 　以下（ａ）～（ｃ）の特徴を有するプローブ、切断酵素、およびリコンビナーゼを含むキット：
    （ａ）互いに相補的に結合し得る一対の領域、および標的核酸と相補的に結合し得る領域を含む一本鎖核酸分子である；
    （ｂ）切断酵素により切断される部位を含む；かつ
    （ｃ）末端標識を有する。
  15. 　ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１４記載のキット。
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