WO2013133526A1 - 보트리오코커스 브라우니의 생장 촉진 및 지방산 함량 증가 특성을 가진 신규 미생물 리조비움 속 ｋｂ１０ - Google Patents

보트리오코커스 브라우니의 생장 촉진 및 지방산 함량 증가 특성을 가진 신규 미생물 리조비움 속 ｋｂ１０ Download PDF

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안치용
이영기
고소라
김희식
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Definitions

  • the present invention relates to a novel microbial Rizobium genus KB10 having the characteristics of promoting the growth of Boturiococcus brownies and increasing fatty acid content, including oleic acid, and more specifically, Rizobium to promote the growth of Botryococcus braunii strains. Rhizobium sp.
  • the method of promoting the growth of Botrychococcus brownie strain comprising the step of co-cultivation of the genus Rizobium KB10 strain and Botryococcus brownie strain and mass production method of the fatty acid, the riso By co-culturing the microbial preparations for mass production of fatty acids and microbial preparations for mass production of biodiesel, and the KB10 strain and Boliococcus brownie strains, which are co-culture of empty KB10 strains and Boturiococcus brownie strains as active ingredients. Producing fatty acids It relates to a method of Iwo diesel production.
  • Biodiesel based on oily vegetable oils such as corn, rapeseed or palm
  • the relative increase in costs due to the high price of raw material crops and additional costs is relatively weak compared to crude oil-derived diesel.
  • the recent rise in raw material crop prices has created new problems for biodiesel competitiveness.
  • the main raw material source of biodiesel may be a photosynthetic oil such as vegetable oil, microalgal oil and the like.
  • the expansion of biodiesel based on photosynthetic oils could lead to new environmental problems caused by food shortages and the cultivation of raw crops, requiring the need for another type of source.
  • Algae are independent or heterotrophic photosynthetic bacteria that grow anywhere in the presence of solar energy, water and carbon dioxide.
  • productivity is higher than the conventional vegetable raw material, corn, palm or sugar cane, and the content of lipids, which is a biodiesel production material, is much higher than other sources.
  • Algae can produce various kinds of useful materials as well as biodiesel, and have the advantage of being a renewable energy source in that they are not conventional food crops.
  • microalgae one of the algae, produces about 58,700 L / ha of biodiesel per unit area, which is 130 times higher than 446 L / ha of soybeans (Chisti. Biotechology Advances). 2007. vol. 25 p394-306). Therefore, the mass cultivation of microalgae can be said to be a green technology that can produce biodiesel from algae produced at the same time as preventing global warming by absorbing carbon dioxide in the atmosphere.
  • Botrychococcus brownies are widely distributed in freshwater, saline lakes and temperate and tropical regions.
  • the biodiesel is much higher than other algae, which has been found to have up to 75% oil. It is easy to switch to.
  • the biggest drawback to biodiesel production using Boturiococcus brownies is slow growth (twice in 6 days) and low growth rate, which is likely to be contaminated with other microorganisms in outdoor mass culture.
  • Korean Patent Publication No. 2011-0007989 discloses a 'method for producing fatty acid alkyl esters using microorganisms having oil generating ability'
  • Korean Patent Publication No. 2000-0000842 discloses a method for extracting hydrocarbons from microalgae. It is disclosed, and Korean Patent Publication No. 2011-0002951 discloses a 'method for preparing hydroxyalkanoate alkyl ester using microorganisms having polyhydroxyalkanoate generating ability,' but Botryococcus brownies as in the present invention.
  • KB10 genus microbial zobiium which has the properties of promoting growth and increasing oleic acid content.
  • the present invention has been made in accordance with the above-described requirements, and the present inventors co-cultured with KB10 genus Ribiumum, a novel mycobacterial bacterium isolated from the water system, to promote cell growth of Boturiococcus brownies, It was confirmed that the oleic acid content was increased by more than 9 times. This solved the slow cell growth, which is the biggest problem in biodiesel production using Boturiococcus brownies, and various fatty acid contents including oleic acid in cultured Boliococcus brownies. The present invention was completed by confirming the increase greatly.
  • the present invention provides a strain of genus Rizobium KB10 ( Rhizobium sp. KB10) to promote the growth of Botryococcus braunii strain.
  • the present invention provides a method for promoting the growth of Botrychococcus brownie strain comprising the step of co-culturing the KB10 strain of genus Rizobium and Boturiococcus brownie strain and a mass production method of fatty acids.
  • the present invention also provides a microbial preparation for mass production of fatty acids and a microbial preparation for mass production of biodiesel, comprising the co-culture of the KB10 strain of Rizobium and Boturiococcus brownie strain as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for producing biodiesel comprising the step of co-culturing the KB10 strain of the genus Rizovium and Botryococcus brownie strain to produce a fatty acid.
  • the genus KB10 is not only to promote the growth of Boturiococcus brownies, but also effectively increase the content of oleic acid, which is a high quality biodiesel ingredient, so that the outdoor mass culture of Boturiococcus brownies using this strain Pollution can be prevented and high quality biodiesel components can be obtained more than 9 times. Therefore, in the biodiesel industrialization, it can be said that the ripple effect such as securing a large amount of biomass, stable strain culture and economic cost reduction according to the industrialization process.
  • Figure 2 is a graph showing the chlorophyll a concentration of the cell growth difference of Boturiococcus brownie according to the addition amount of KB10 in the mycobacteria lysobium during co-culture (control, no addition of KB10 in the lysobicium; 0.5%, 0.5% lysobiium KB10 addition 5%, 5% risbidium in KB10).
  • Figure 3 shows the results of gas chromatography analysis of standard fatty acids.
  • Figure 4 shows the results of gas chromatography analysis of fatty acids of Boturiococcus brownie single cultured for 30 days.
  • Figure 5 shows the results of gas chromatography analysis of the fatty acid of Boturiococcus brownie co-cultured with KB10 in the mycobacteria lysovium for 30 days.
  • Figure 6 shows the results of gas chromatography analysis of fatty acids of KB10 genus mycelia strain cultured in a single day 30 days.
  • the present invention provides a strain of genus Rizobium KB10 ( Rhizobium sp. KB10) that promotes the growth of Botryococcus braunii strain.
  • the mycobacterial strain of the present invention collected surface water and Journey from the water and separated the microorganisms using various nutrient media and separated purely through three or four passages.
  • the microorganisms and bovine microorganisms were treated in Boturiococcus brownie broth, and the microorganisms which promoted growth and increased oleic acid content were finally selected.
  • a final identification of a microorganism boat facilitate the growth of Rio Lactococcus brownies of the strains selected by a molecular biological method of 16s rDNA base sequence identification method result, it was identified as genus Rhizopus away by this separation tank emptying in KB10 (Rhizobium sp. KB10) Named it.
  • the new strain was deposited on February 7, 2012, at the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology (Accession No .: KCTC 12131BP).
  • the present invention provides a method for promoting the growth of Botryococcus brownie strain comprising co-culturing the genus KB10 strain and Botryococcus braunii strain.
  • the Boturiococcus brownie strain culture medium it can be co-cultured by adding 0.110% (v / v) of KB10 strain in the genus Rizobium, preferably 0.3-5% (v) in the KB10 strain of genus Rizobium / v) can be co-cultured, and most preferably, it can be co-cultured by adding 0.5% (v / v), but is not limited thereto.
  • the co-cultivation method of the strain may use any method known in the art, it is not particularly limited to a specific method.
  • the co-culture of the strain may be co-cultured for 30 days at 120 ⁇ mol m ⁇ 2 s ⁇ 1 at 28 ° C., but is not limited thereto.
  • the present invention provides a mass production method of fatty acids comprising co-culturing the genus KB10 strain and Botryococcus braunii strain.
  • the fatty acid is preferably oleic acid, linolenic acid, linoleic acid, palmitic acid or palmitoleic acid. It may be, but most preferably may be oleic acid, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a microbial preparation for fatty acid mass production comprising a co-culture of the KB10 strain of the genus Rizobium and Botryococcus braunii strain as an active ingredient.
  • the fatty acid may be preferably oleic acid, linolenic acid, linoleic acid, palmitic acid or palmitoleic acid, and most preferably may be oleic acid, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a microbial preparation for biodiesel mass production comprising a co-culture of the KB10 strain of the genus Rizobium and Botryococcus braunii strain as an active ingredient.
  • the microbial preparation for mass production of fatty acids or biodiesel of the present invention can be prepared using co-culture of KB10 strain and Botryococcus braunii strain in the genus Rizobium as an active ingredient.
  • the microbial agent for mass production of fatty acids or biodiesel according to the present invention may be prepared as a solution, powder or suspension, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of co-cultivating the above-mentioned Riboseum KB10 strain and Botryococcus braunii strain to produce a fatty acid;
  • biodiesel It provides a method of producing biodiesel comprising the step of converting the produced fatty acid into biodiesel.
  • the method for converting the fatty acid produced by the strain of the present invention into biodiesel may use any method known in the art, and is not particularly limited to the specific method.
  • Example 1 Identification of the strain isolated in Example 1 was cultured using the same medium, and genomic DNA was isolated using a genomic DNA separation kit (Quiagen, Hilden, Germany).
  • Two universal primers (9F, 536R) commonly used in 16s rDNA were used to amplify the variable region in 16S rDNA by PCR; 9F primer: GAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO: 1), 536R primer: AAGGAGGTGATCCAGCCGCA (SEQ ID NO: 2).
  • PCR conditions were denatured at 95 ° C. for 5 minutes, DNA amplification was repeated 30 times for 1 minute at 95 ° C., 1 minute at 58 ° C., and 1 minute at 72 ° C., and finally extended at 10 ° C.
  • Example 3 Boturiococcus brownie growth promotion and oleic acid production investigation
  • Boturiococcus brownie URTEX572 was treated with BG11 medium (NaNO 3 1.5 g, K 2 HPO 4 0.039 g, MgSO 4 .7H 2 O 0.075 g, Na 2 CO 3 0.021 g, CaCl 2 0.027 g, ferric citrate 0.006 g, citric acid 0.006 g, EDTA 0.001 g, Microelement stock solution 1 ml per Liter; microelement stock solution (H 3 BO 3 2.86 g, MnCl 2 4H 2 O 1.81 g, ZnSO 4 7H 2 O 0.222 g, Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.391 g, CuSO 4 .5H 2 O 0.079, Co (NO 3 ) 2 .6H 2 O 0.0494 g per 0.5 Liter)) was inoculated in 100 ml and incubated at 28 ° C., 120 ⁇ mol m ⁇ 2 s ⁇ 1 .
  • fatty acid standards purchased from Sigma-Aldrich were analyzed by gas chromatography as shown in FIG. 3. Bligh and Dyer from Boturiococcus brownies experimental group and control group incubated for 30 days ( Can. J. Biochem. Physiol. 1959, fatty acids were extracted using the method vol 37 p911-917). The extracted fatty acids were subjected to GC analysis under the same conditions.

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Abstract

본 발명은 바이오디젤 생산 조류인 보트리오코커스 브라우니의 생장 촉진과 동시에 바이오디젤 생산능을 향상시키는 기능을 가진 리조비움 속 KB10 균주에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바이오디젤 생산에 사용되는 보트리오코커스 브라우니의 생장을 촉진하면서 양질의 바이오디젤 성분에 해당하는 C18 (올레인산) 함량을 최대 9배까지 증가시키는 기능을 가진 신균주 리조비움 속 KB10 균주에 관한 것이다. 리조비움 같은 근균류 박테리아를 이용함으로써 보트리오코커스 브라우니의 저조한 세포 생장을 효과적으로 촉진함과 동시에 양질의 바이오디젤 성분인 올레인산 함량을 최대한 증가시킬 수 있다. 또한 이러한 박테리아를 이용하여 혼합 배양함으로써 옥외배양을 통한 바이오디젤 생산 공정 시 다른 미생물에 의한 오염 발생 문제를 획기적으로 해결할 수 있다.

Description

보트리오코커스 브라우니의 생장 촉진 및 지방산 함량 증가 특성을 가진 신규 미생물 리조비움 속 ＫＢ１０
본 발명은 보트리오코커스 브라우니의 생장 촉진 및 올레인산을 포함한 지방산 함량 증가 특성을 가진 신규 미생물 리조비움 속 KB10에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주의 생장을 촉진시키는 리조비움 속 KB10(Rhizobium sp. KB10) 균주, 상기 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니 균주를 공동배양하는 단계를 포함하는 보트리오코커스 브라우니 균주의 생장을 촉진시키는 방법 및 지방산의 대량생산 방법, 상기 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니 균주의 공동 배양액을 유효성분으로 포함하는 지방산 대량생산용 미생물 제제 및 바이오디젤 대량생산용 미생물 제제 및 상기 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니 균주를 공동배양하여 지방산을 생산하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법에 관한 것이다.
옥수수, 유채 혹은 팜과 같은 유지성 식물 오일을 원료로 하는 바이오디젤은 이미 상용화가 이루어진 대표적 바이오디젤로서 전 세계적으로 급격한 생산량 증가 추세를 보이고 있다. 그러나 원료작물의 높은 가격, 부가 비용 발생 등으로 인한 상대적인 비용 증가 문제는 원유 유래의 디젤과 비교할 경우 상대적으로 경쟁력이 취약하다. 또한 최근 원료 작물 가격 상승은 바이오디젤 경쟁력에 대한 새로운 문제를 발생하게 하였다. 바이오디젤의 주 원료 공급원으로는 식물성 유지, 미세조류 오일 등과 같은 광합성 오일이 공급원이 될 수 있다. 그러나 광합성 오일을 원료로 하는 바이오디젤의 확대는 식량 부족이나 원료작물 대량 재배에 따른 새로운 환경문제를 야기할 수 있기 때문에 또 다른 형태의 공급원에 대한 필요성이 요구되었다.
최근 바이오디젤을 안정적이며 경제적으로 생산할 수 있는 에너지 공급원으로서 조류가 각광받고 있다. 조류는 독립 혹은 종속 영양 광합성균으로 태양에너지와 물 그리고 이산화탄소가 존재하는 곳이면 어느 곳에서 성장하는 특성이 있다. 또한 기존의 식물성 원료인 옥수수, 팜 혹은 사탕수수에 비해 생산성이 좋다는 장점이 있으며 바이오디젤 생산 물질인 지질의 함량이 다른 공급원에 비해 월등히 높다는 장점이 있다. 조류는 바이오디젤 뿐만 아니라 다양한 종류의 유용물질을 생산할 수 있고, 기존의 식용작물이 아니라는 점에서 재생에너지원으로서의 장점을 가지고 있다. 실제로 조류 가운데 하나인 미세조류의 경우 단위 면적당 바이오디젤 생산은 오일 함량이 30%인 경우를 기준으로 해서 계산할 경우 약 58,700 L/ha로 446 L/ha인 대두에 비해 130배 높다(Chisti. Biotechology Advances 2007. vol. 25 p394-306). 따라서 미세조류의 대량 배양은 대기 중의 이산화탄소를 흡수함으로써 지구온난화 방지 효과와 동시에 생산된 조류의 조체로부터 바이오디젤을 생산할 수 있는 녹색기술이라고 할 수 있다.
근래에 이러한 조류를 이용하여 생물연료 생산에 대해 전 세계적으로 관심이 증가되면서 관련 연구는 물론 국가적으로 많은 투자가 이루어지고 있다. 국제적으로는 대표적 기업으로 SOLIX, GreenFuel, Cyannotech 등이 있으며 국내의 경우 정부 주도로 기초 연구 및 산업화에 대한 많은 투자가 이루어지고 있다.
미세조류 중 보트리오코커스 브라우니는 담수, 염분 호수와 온대, 열대 지방 등에 널리 분포하는 군집형 미세조류로서, 체내 오일함량이 최대 75%로 지금까지 밝혀진 다른 조류에 비해 월등히 높고 생산되는 지질은 바이오디젤로 전환하기가 용이한 종이다. 그러나 보트리오코커스 브라우니를 이용한 바이오디젤 생산에 있어서 가장 큰 단점은 생장이 느리다는 점이고 (6일에 2배), 또한 저조한 생장률로 인해 옥외 대량 배양시 다른 미생물로 오염될 가능성이 높다는 점이다.
한편, 한국공개특허 제2011-0007989 호에는 '오일 생성능을 가지는 미생물을 이용한 지방산 알킬에스테르의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2000-0000842호에는 '미세조류로부터 탄화수소의 추출방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0002951호에는 '폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 미생물을 이용한 하이드록시알카노에이트 알킬에스테르의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명과 같이 보트리오코커스 브라우니의 생장 촉진 및 올레인산 함량증가 특성을 가진 신규 미생물 리조비움 속 KB10에 관해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자는 수계에서 분리한 신규한 근균류 박테리아인 리조비움 속 KB10과 공동 배양하여 보트리오코커스 브라우니의 세포성장 촉진과 동시에 양질의 바이오디젤 성분인 올레인산 함량을 9배 이상 증가시키는 것을 확인하였는데, 이를 통해 보트리오코커스 브라우니를 이용한 바이오디젤 생산에 있어서 가장 큰 문제점인 느린 세포성장을 해결하였고, 배양된 보트리오코커스 브라우니에서 올레인산을 포함한 다양한 지방산 함량을 크게 증가시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주의 생장을 촉진시키는 리조비움 속 KB10(Rhizobium sp. KB10) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니 균주를 공동배양하는 단계를 포함하는 보트리오코커스 브라우니 균주의 생장을 촉진시키는 방법 및 지방산의 대량생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니 균주의 공동 배양액을 유효성분으로 포함하는 지방산 대량생산용 미생물 제제 및 바이오디젤 대량생산용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니 균주를 공동배양하여 지방산을 생산하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신균주 리조비움 속 KB10은 보트리오코커스 브라우니의 생장을 촉진시킬 뿐만 아니라 양질의 바이오디젤 성분인 올레인산 함량을 효과적으로 증가시킬 수 있으므로, 이 균주를 이용하여 보트리오코커스 브라우니의 옥외 대량 배양시 오염을 방지할 수 있고 양질의 바이오디젤 성분을 9배 이상 얻을 수 있다. 따라서, 바이오디젤 산업화에서 바이오매스 대량 확보, 안정적인 균주 배양 및 산업화 공정에 따른 경제적 비용 절감 등 그 파급효과 크다고 할 수 있다.
도 1은 신균주 리조비움 속 KB10과 공동 배양시 보트리오코커스 브라우니의 세포 생장 차이를 나타낸다 (좌, 보트리오코커스 브라우니만 배양; 우, 신균주 리조비움 속 KB10 및 보트리오코커스 브라우니의 공동 배양).
도 2는 공동 배양시 신균주 리조비움 속 KB10 첨가량에 따른 보트리오코커스 브라우니의 세포 생장 차이를 엽록소 a농도로 나타낸 그래프이다 (control, 리조비움 속 KB10 무첨가; 0.5%, 0.5% 리조비움 속 KB10 첨가; 5%, 5% 리조비움 속 KB10 첨가).
도 3은 표준 지방산의 가스크로마토그래피 분석 프로파일을 나타낸 결과이다.
도 4는 30일간 단일 배양한 보트리오코커스 브라우니의 지방산을 가스크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 5는 30일간 신균주 리조비움 속 KB10과 공동 배양한 보트리오코커스 브라우니의 지방산을 가스크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 6은 30일 단일 배양한 신균주 리조비움 속 KB10의 지방산을 가스크로마토그래피로 분석한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주의 생장을 촉진시키는 리조비움 속 KB10(Rhizobium sp. KB10) 균주를 제공한다.
본 발명의 신균주는 수계에서 표층수와 저니를 채취하여 다양한 영양배지를 사용하여 미생물을 분리한 후 서너 차례 계대를 통하여 순수 분리하였다. 보트리오코커스 브라우니 배양액에 순수 분리한 미생물 조체와 배양액을 처리하여 생장을 촉진하고 올레인산 함량을 증가시키는 미생물을 최종 선별하였다. 최종적으로 선별된 균주 중 보트리오코커스 브라우니의 생장을 촉진하는 미생물을 분자 생물학적 방법인 16s rDNA 염기서열 동정방법으로 동정한 결과, 리조비움 속으로 동정되었으며 이를 리조비움 속 KB10 (Rhizobium sp. KB10)으로 명명하였다. 상기 신균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2012년 2월 7일자로 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 12131BP).
또한, 본 발명은 상기 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주를 공동배양하는 단계를 포함하는 보트리오코커스 브라우니 균주의 생장을 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 리조비움 속 KB10 균주를 보트리오코커스 브라우니 균주 배양에 너무 많이 첨가할 경우는 보트리오코커스 브라우니 균주 생장에 저해(inhibition)를 줄 수 있고, 리조비움 속 KB10 균주를 너무 적게 첨가할 경우는 보트리오코커스 브라우니 균주 생장을 촉진시키는데 어떤 영향도 미치지 않을 수 있다. 따라서, 상기 보트리오코커스 브라우니 균주 배양액 기준으로 리조비움 속 KB10 균주를 0.1 ~ 10%(v/v)로 첨가하여 공동배양할 수 있고, 바람직하게는 리조비움 속 KB10 균주를 0.3 ~ 5%(v/v)로 첨가하여 공동배양할 수 있고, 가장 바람직하게는 0.5%(v/v)로 첨가하여 공동배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 균주의 공동배양 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 균주의 공동배양은 28℃에서 120 μmol m-2s-1로 30일간 공동 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주를 공동배양하는 단계를 포함하는 지방산의 대량생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 지방산은 바람직하게는 올레인산(oleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 리놀레산(linoleic acid), 팔미트산(palmitic acid) 또는 팔미톨레산(palmitoleic acid)일 수 있고, 가장 바람직하게는 올레인산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주의 공동 배양액을 유효성분으로 포함하는 지방산 대량생산용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 미생물 제제에서, 상기 지방산은 바람직하게는 올레인산, 리놀렌산, 리놀레산, 팔미트산 또는 팔미톨레산일 수 있고, 가장 바람직하게는 올레인산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주의 공동 배양액을 유효성분으로 포함하는 바이오디젤 대량생산용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 지방산 또는 바이오디젤 대량생산용 미생물 제제는 유효성분으로서 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주의 공동 배양액를 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 지방산 또는 바이오디젤 대량생산용 미생물 제제는 용액, 분말 또는 현탁액으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주를 공동배양하여 지방산을 생산하는 단계; 및
상기 생산된 지방산을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 균주로 생산된 지방산을 바이오디젤로 전환하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 미생물의 분리
수계에서 표층수와 저니를 채취하여 다양한 영양배지(LB, R2A, NA 및 1/5 희석된 LB : SERVA LB (Code 48502), Difco™ R2A (Item No. 218263), Difco™ NA (Item No. 213000))를 사용하여 37℃에서 24시간 배양을 통해 다양한 미생물을 1차 분리하였다. 분리된 미생물들은 동일 영양배지를 사용하여 서너 차례 계대를 통하여 순수 분리한 후 보트리오코커스 브라우니 UTEX572 (The University of Texas at Austin, The culture collection of algae) 배양액에 순수 분리한 미생물 조체와 배양액을 처리하여 생장을 1.2배 이상 증가시키는 미생물을 선별하였다.
실시예 2: 분리 균주의 동정
상기 실시예 1에서 분리한 균주의 동정은 동일한 배지를 사용하여 배양한 후, 게놈 DNA 분리 키트 (Quiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 16S rDNA 내의 가변부위를 PCR로 증폭하기 위하여 16s rDNA에서 일반적으로 사용하는 두 유니버셜 프라이머(9F, 536R)를 사용하였다 ; 9F 프라이머: GAGTTTGATCCTGGCTCAG (서열번호 1), 536R 프라이머: AAGGAGGTGATCCAGCCGCA (서열번호 2). PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성하고, 95℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 30번 반복하여 DNA를 증폭시키고 마지막으로 72℃에서 10분간 연장하여 PCR 반응을 종결시켰다. 전기영동 결과에서 약 1500bp의 증폭된 DNA를 분리한 뒤 이를 클로닝 벡터인 pGEM T-이지 벡터(Quiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 형질전환하였다. 얻어진 서열번호 3의 16S rDNA 내의 가변 부위의 서열은 BLAST Search Program(NCBI)을 사용하여 비교 분석을 수행한 결과, 본 발명의 신균주는 리조비움과 높은 상동성을 가지는 것을 확인하여(표 1), 본 발명의 신균주를 리조비움 속 KB10(Rhizobium sp. KB10)라 명명하였고, 미생물 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2012년 2월 7일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 12131BP를 부여받았다.
표 1 16S rDNA 염기서열분석 결과
균주 유사성(%) 근접 미생물명 Accession No.
Rhizobium sp. KB10 1398/1407(99.6) Candidatus Rhizobium massiliae AF531767
실시예 3: 보트리오코커스 브라우니 생장 촉진 및 올레인산 생산 조사
신균주 리조비움 속 KB10을 R2A 배지(Difco™ R2A (Item No. 218263))에 접종하였고, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 새로운 동일 배지에 전배양액 10%를 접종하여 동일 조건으로 16시간 배양한 후 4,000rpm으로 20분간 원심 분리하여 조체와 배양 상등액을 분리하였다. 원심 분리한 조체를 멸균된 증류수로 2회 세척한 후 OD600nm=0.4로 세포 개수를 조정하였다. 보트리오코커스 브라우니 URTEX572를 BG11 배지(NaNO3 1.5g, K2HPO4 0.039g, MgSO4·7H2O 0.075g, Na2CO3 0.021g, CaCl2 0.027g, 페릭 시트레이트 0.006g, 시트르산 0.006g, EDTA 0.001g, Microelement stock solution 1ml per Liter; microelement stock solution (H3BO3 2.86g, MnCl2·4H2O 1.81g, ZnSO4·7H2O 0.222g, Na2MoO4·2H2O 0.391g, CuSO4·5H2O 0.079, Co(NO3)2·6H2O 0.0494g per 0.5 Liter)) 100 ml에 접종하여 28℃, 120 μmol m-2s-1 배양하였다. 보트리오코커스 브라우니 URTEX572 배양액 100 ml에 2회 세척한 리조비움 속 KB10 조체를 0.5%와 5% 접종하여 28℃에서 120 μmol m-2s-1로 30일간 공동 배양하였다.
도 1에서 나타난 바와 같이, 신균주 리조비움 속 KB10을 접종하지 않은 단일 배양액과 0.5% 접종한 공동 배양액에서의 보트리오코커스 브라우니 UTEX572의 생장을 육안으로 비교하였다. 그 결과, 신균주 리조비움 속 KB10을 처리한 공동 배양 실험군의 세포 생장이 우수한 것을 확인하였다. 또한 보트리오코커스 브라우니 단일 배양액과 리조비움 속 KB10을 접종한 혼합 배양액에서 보트리오코커스 브라우니의 엽록소 a 농도를 비교하였다(도 2). 그 결과, 공동 배양된 실험군에서 엽록소 a가 1.3배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 배양 17일째 세포 생장의 차이가 확연히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
30일 배양한 보트리오코커스 브라우니 단일 배양액과 공동 배양된 실험군의 올레인산 함량 증가를 비교하였다. 보트리오코커스 브라우니의 올레인산 생산 양을 비교하기 위해 도 3에서 나타난 바와 같이 시그마알드리치에서 구입한 지방산 표준 물질을 가스크로마토그래피로 분석하였다. 30일간 배양한 보트리오코커스 브라우니 실험군과 대조군으로부터 Bligh and Dyer (Can. J. Biochem. Physiol. 1959, vol 37 p911-917) 방법을 사용하여 지방산을 추출하였다. 추출한 지방산을 동일 조건으로 GC 분석을 수행하였다. 그 결과, 단일 배양된 보트리오코커스 브라우니에 비해(도 4) 도 5에서 나타난 바와 같이 공동 배양한 보트리오코커스 브라우니의 올레인산(oleate)이 9배 이상 증가된 것을 확인하였고, 리놀렌산(linolenate), 리놀레산(linoleate), 팔미트산(palmitate) 및 팔미톨레산(palmitoleate)도 크게 증가한 것을 확인하였다(표 2). 공동 배양을 통해 증가된 올레인산의 유래를 명확하게 하기 위해 공동 배양에 사용된 리조비움 KB10 균주를 영양배지인 R2A 배지를 사용하여 30일간 배양한 후 가스크로마토그래피로 지방산을 분석하였다(도 6). 도 6에서 나타난 바와 같이, 30일 배양된 신균주 리조비움 KB10의 올레인산 함량은 극히 낮은 것으로 확인되었다. 또한, 24시간 동안 동일 배지에서 배양된 경우에서도 올레인산은 극히 낮게 검출되었다 (데이터 미제시).
표 2 신균주 리조비움 KB10 및 보트리오코커스 브라우니의 공동배양된 배양액의 지방산 함량 분석 결과 (Peak area)
대조군 실험군
palmitate(C16:0) 5042.7 18616.1
palmitoleate(C16:1) 1705.0 5972.8
oleate(C18:1) 15740.4 142421.8
linoleate(C18:2) 6100.8 13887.0
linolenate(C18:3) 8339.1 27339.0

Claims (9)

  1. 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주의 생장을 촉진시키는 리조비움 속 KB10(Rhizobium sp. KB10) 균주 (KCTC 12131BP).
  2. 제1항의 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주를 공동배양하는 단계를 포함하는 보트리오코커스 브라우니 균주의 생장을 촉진시키는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 보트리오코커스 브라우니 균주 배양액 기준으로 리조비움 속 KB10 균주를 0.1 ~ 10%(v/v)로 첨가하여 공동배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항의 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주를 공동배양하는 단계를 포함하는 지방산의 대량생산 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 지방산은 올레인산, 리놀렌산, 리놀레산, 팔미트산 또는 팔미톨레산인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항의 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주의 공동 배양액을 유효성분으로 포함하는 지방산 대량생산용 미생물 제제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 지방산은 올레인산, 리놀렌산, 리놀레산, 팔미트산 또는 팔미톨레산인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  8. 제1항의 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주의 공동 배양액을 유효성분으로 포함하는 바이오디젤 대량생산용 미생물 제제.
  9. 제1항의 리조비움 속 KB10 균주 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 균주를 공동배양하여 지방산을 생산하는 단계; 및
    상기 생산된 지방산을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법.
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