WO2013128777A1 - 等電点電気泳動用試験具およびその製造方法 - Google Patents

等電点電気泳動用試験具およびその製造方法 Download PDF

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WO2013128777A1
WO2013128777A1 PCT/JP2012/084036 JP2012084036W WO2013128777A1 WO 2013128777 A1 WO2013128777 A1 WO 2013128777A1 JP 2012084036 W JP2012084036 W JP 2012084036W WO 2013128777 A1 WO2013128777 A1 WO 2013128777A1
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WO
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gel layer
gel
test device
isoelectric focusing
outer peripheral
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PCT/JP2012/084036
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Inventor
政俊 中川
Original Assignee
シャープ株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44795—Isoelectric focusing

Definitions

  • the present invention relates to a test device for isoelectric focusing and a method for producing the same.
  • Electrophoresis is a separation analysis method using a phenomenon in which a charged substance in a medium moves in an electric field according to the electric charge when a voltage is applied to the medium such as a solution or a hydrophilic support immersed in the solution. It is.
  • electrophoresis using gel as a medium is a technique for separating biopolymers such as proteins and nucleic acids, in bioscience, molecular biology and other life science fields and clinical laboratory fields. Widely used.
  • electrophoresis isoelectric focusing method
  • proteins are separated by gathering at a pH position equal to their isoelectric point in a pH gradient.
  • an amphoteric carrier has been used in the past, but in recent years, an immobilized pH gradient (Immobilized pH Gradient: IPG) gel that does not collapse during energization is often used. ing.
  • IPG immobilized pH Gradient
  • gel electrophoresis is an indispensable technique for separating and analyzing biopolymers such as proteins.
  • the accuracy and reproducibility of analysis largely depend on the quality of the gel used. Therefore, in this field, it is desired to develop a technique capable of stably producing an electrophoretic test device equipped with a high-resolution gel.
  • Patent Document 1 discloses a gel sheet having a concentration gradient by mixing two types of gel stock solutions having different concentrations in a stirring tank, and introducing the mixed solution into a gel container from the bottom to cause gelation (polymerization).
  • a method of making is disclosed.
  • an SDS-PAGE gel sheet having a predetermined concentration gradient can be obtained by changing the ratio of each gel stock solution in the mixed solution to be introduced into the gel container.
  • two types of gel stock solutions having different pH are mixed in a stirring tank, and the mixture is introduced into the gel container from the bottom to cause gelation, thereby adjusting the pH gradient.
  • the gel sheet which has can be produced.
  • a gel sheet having a predetermined pH gradient is obtained by changing the ratio of each gel stock solution in the mixed solution to be introduced into the gel container, and the gel sheet is elongated by cutting it at a predetermined width in the pH gradient direction.
  • a gel plate for isoelectric focusing is obtained.
  • Patent Document 2 discloses a gel plate manufacturing method in which a monomer solution is applied onto a plate as a technique capable of accurately managing a concentration gradient or pH gradient. That is, after forming a puddle on the plate and discharging a monomer solution into the puddle, a polymerization initiator is applied to gel the coating film, thereby forming a gel layer on the substrate.
  • an SDS-PAGE gel plate having a predetermined concentration gradient or a predetermined pH gradient is prepared by mixing two types of monomer solutions having different concentrations or pHs and applying them to the pool while changing the mixing ratio.
  • a gel plate for isoelectric focusing is obtained.
  • the gel layer In order to be able to store the gel layer produced as described in Patent Documents 1 and 2 for a long period of time, the gel layer is usually dried. And a gel layer is decompress
  • the gel layer G 11 for isoelectric focusing of Patent Document 1 As shown in FIG. 12 (A), the gel layer G 11 swollen by absorbing water into the dry film is formed on the plate P 11 . It swells by protruding beyond the outer peripheral end face (end face in four directions). Therefore, as shown in FIG. 12 (B), the gel layer G 11 of the first gel plate GP 11 used in the first-dimensional electrophoresis (isoelectric focusing) in the two-dimensional electrophoresis is changed in the two-dimensional electrophoresis.
  • the protein separated by the gel layer G 11 of the first gel plate GP 11 is pressed onto the gel layer G 12 of the second gel plate GP 12 for second-dimensional electrophoresis (SDS-PAGE), and the second gel plate GP.
  • SDS-PAGE second-dimensional electrophoresis
  • the protein present in the gel layer G 11 of the protruding portion (shaded portion) of the first gel plate GP 11 does not move sufficiently or not to the gel layer G 12 of the second gel plate GP 12 .
  • the gel layer G 21 does not contact the gel layer G 22 of the second gel plate GP 22 sufficiently or not.
  • proteins present in the gel layer G21 of the outer peripheral portion of the first gel plate G21 (hatched portion) is not enough or no movement in the gel layer G 22 of the second gel plate GP 22.
  • the present invention has been made in view of such problems, and an object thereof is to provide an isoelectric focusing test device capable of performing highly reliable two-dimensional electrophoresis and a method for manufacturing the same. .
  • an isoelectric focusing test device in which a dry film obtained by drying a gel layer is formed on a substrate, and when the dry film is swollen (1) gel The layer has an outer peripheral end surface perpendicular to the substrate; (2) The outer peripheral end surface of the gel layer and the outer peripheral end surface of the substrate are on the same plane, (3) The film thickness of the outer peripheral edge in the gel layer is the thinnest and the film thickness of the central part is the thickest, (4) An isoelectric focusing test device that provides a gel layer satisfying the conditions (1) to (4) that the thickness of the central portion of the gel layer is 110 to 120% of the thickness of the outer peripheral edge portion Is provided.
  • coating a gel material liquid on a base material, making it gel, and forming a gel layer The process of cut
  • the frame is provided with a method for producing an isoelectric focusing test device having a hydrophobically treated inner peripheral surface in contact with the gel material solution.
  • the dry film of the isoelectric focusing test device absorbs water and swells, so that it does not have a portion protruding from the outer peripheral end surface of the substrate, and the center portion and the outer peripheral end portion A gel layer having a small film thickness difference can be restored. Therefore, after performing the first-dimensional electrophoresis in the two-dimensional electrophoresis using the isoelectric focusing test device of the present invention, this test device (hereinafter sometimes referred to as “first-dimensional gel plate”) When the gel layer is pressed against the gel layer of the second-dimensional electrophoresis test device (hereinafter sometimes referred to as “second-dimensional gel plate”), the gel layer of the first-dimensional gel plate becomes the gel layer of the second-dimensional gel plate.
  • first-dimensional gel plate When the gel layer is pressed against the gel layer of the second-dimensional electrophoresis test device (hereinafter sometimes referred to as “second-dimensional gel plate”), the gel layer of the first-dimensional gel plate becomes the gel layer of the second-dimensional gel plate
  • the separated protein existing in the gel layer of the first dimension gel plate can be accurately and sufficiently moved (transferred) to the gel layer of the second dimension gel plate, and the reliability of the second dimension electrophoresis High analysis results can be obtained.
  • FIG. 3 is a partially omitted cross-sectional view showing a state in which the isoelectric focusing test device of Embodiment 1 is overlaid on the second-dimensional electrophoresis testing device.
  • FIG. 3 is a partially omitted cross-sectional view showing a state in which the isoelectric focusing test device is pressed from the state of FIG.
  • FIG. 2 is a diagram corresponding to FIG. 1 (A) showing a shape of the isoelectric focusing test device of Embodiment 1 viewed from the width direction.
  • FIG. 2 is a diagram corresponding to FIG. 1A illustrating a shape of the isoelectric focusing test device according to the first embodiment viewed from the length direction. It is a perspective view which shows the stage used at the time of manufacture of the test device for isoelectric focusing of Embodiment 2, and the frame installed on it.
  • FIG. 6 is an explanatory view showing a part of the manufacturing process of the isoelectric focusing test device of Embodiment 2.
  • FIG. It is a partially omitted cross-sectional view showing a state in which a conventional isoelectric focusing test device is overlaid on a second-dimensional electrophoresis testing device.
  • FIG. 13 is a partially omitted cross-sectional view showing a state in which the isoelectric focusing test device is pressed from the state of FIG.
  • FIG. 5 is a partially omitted cross-sectional view showing a state in which another conventional isoelectric focusing test device is stacked on a second-dimensional electrophoresis test device.
  • FIG. 14 is a partially omitted cross-sectional view showing a state in which the isoelectric focusing test device is pressed from the state of FIG.
  • the isoelectric focusing test device of the present invention is an isoelectric focusing test device in which a dry film obtained by drying a gel layer is formed on a substrate, and the dry film is swollen.
  • the gel layer has an outer peripheral end surface in a direction perpendicular to the base material, (2) The outer peripheral end surface of the gel layer and the outer peripheral end surface of the substrate are on the same plane, (3) The film thickness of the outer peripheral edge in the gel layer is the thinnest and the film thickness of the central part is the thickest, (4) The gel layer satisfies the conditions (1) to (4) that the thickness of the central portion of the gel layer is 110 to 120% of the thickness of the outer peripheral end portion.
  • the gel layer satisfying the conditions (1) to (4) refers to a gel layer in a water saturated state.
  • the isoelectric focusing test device of the present invention is such that a dry film obtained by drying a gel layer satisfying the above conditions (1) to (4) is formed on a substrate.
  • the surface of the gel layer on the side opposite to the base material is formed into a gently convex surface with no depressions.
  • the surface of the gel layer opposite to the substrate becomes a pressing surface, and this pressing surface is a gentle convex.
  • the air between the upper and lower gel layers is easily pushed out to the outer peripheral side, and the adhesion between the upper and lower gel layers is further increased.
  • the separated protein existing in the gel layer of the first dimension gel plate can be surely moved to the gel layer of the second dimension gel plate, which is more reliable and more accurate for the second dimension electrophoresis. Analysis results can be obtained.
  • the “gradual convex curved surface” includes a case where the highest part is a flat surface.
  • the softness of the gel layer is not particularly limited, but considering the case where the isoelectric focusing test device of the present invention is used as the first-dimensional gel plate in two-dimensional electrophoresis, the first-dimensional gel plate
  • the gel layer is preferably softer than the gel layer of the second-dimensional gel plate.
  • the length and width of the gel layer are the same as the length and width of the substrate.
  • the length and width of the substrate are not particularly limited, but as an example, the length is about 50 to 250 mm, and the width is about 0.5 to 5 mm.
  • the film thickness of the gel layer is not particularly limited. As an example, the film thickness of the thinnest outer peripheral edge is about 180 to 840 ⁇ m, and the film thickness of the thickest central part is 110 to 120%.
  • the film thickness of the dried film obtained by drying the gel layer shrinks to 100 ⁇ m or less, but the length and width hardly change.
  • the form of the base material of the electrophoresis test device is not particularly limited, and examples thereof include an elongated plate and a chip molded into a predetermined shape.
  • the material of the base material is not particularly limited as long as it can function as a base material for a test device for electrophoresis.
  • glass such as quartz glass and non-alkali glass, polyethylene terephthalate (PET), polymethacryl
  • resins such as acid methyl resin (PMMA), ceramics such as alumina, and low-temperature co-fired ceramic.
  • the surface of the substrate on which the gel layer is formed may be subjected to a hydrophilic treatment, thereby improving the wettability of the monomer solution described below with respect to the substrate, and the monomer solution Adhesion between the gelled gel layer and the substrate is improved.
  • a hydrophilic treatment include nitration using sulfuric acid, sulfonation using nitric acid, oxygen plasma treatment and the like.
  • the material of the gel layer of the electrophoresis test device is not particularly limited as long as it can function as the gel layer of the electrophoresis test device.
  • acrylamide Monomer
  • bisacrylamide crosslinking agent
  • pH adjusting material pH buffer
  • TEMED polymerization accelerator
  • ammonium persulfate APS
  • the gel layer is formed by applying a gel material solution on a base material to cause gelation.
  • a gel material solution to which a polymerization initiator has been added in advance (a gel material solution containing a polymerization initiator) is applied on the substrate, a monomer solution in which materials other than the polymerization initiator are mixed (not including a polymerization initiator) After the gel material liquid) is applied onto the substrate, a polymerization initiator may be applied onto the coating film, and the present invention includes both cases.
  • gel material liquid means all of a gel material liquid to which a polymerization initiator has been added in advance, a gel material liquid not containing a polymerization initiator, and a polymerization initiator, unless otherwise specified.
  • a gel material solution to which a polymerization initiator has been added in advance may be referred to as “a gel material solution containing a polymerization initiator”
  • a gel material solution that does not include a polymerization initiator may be referred to as a “monomer solution”.
  • the test device for isoelectric focusing of the present invention is a step of forming a gel layer by applying a gel material solution on a base material to form a gel layer, and a step of cutting the entire outer periphery of the gel layer together with the base material And a step of drying the gel layer.
  • This manufacturing method will be described in Embodiment 1 described later.
  • the isoelectric focusing test device of the present invention comprises a step of applying a gel material solution on a base material surrounded by a frame to cause gelation to form a gel layer, and removing the frame to And the step of drying the gel layer, wherein the frame body can be manufactured by a manufacturing method having a hydrophobically treated inner peripheral surface in contact with the gel material liquid. This manufacturing method will be described in a second embodiment described later.
  • the method for applying the gel material liquid onto the substrate is not particularly limited, and any method can be used as long as the gel material liquid can be applied to a predetermined region on the upper surface of the substrate.
  • a pipetter, a dispenser, an inkjet device, etc. can be mentioned.
  • an ink jet apparatus provided with an ink jet head that discharges fine droplets with high accuracy and adheres them to a substrate.
  • minute droplets can be applied to a predetermined area of an elongated base material with high accuracy and quantitatively. Therefore, the formation area of the gel layer to be obtained, film thickness, pH gradient, concentration gradient, etc. Can be controlled easily and with high accuracy.
  • FIG. 1 (A) is a perspective view showing a usable state of the isoelectric focusing test device of Embodiment 1 of the present invention
  • FIG. 1 (B) is the isoelectric focusing of FIG. 1 (A). It is a perspective view which shows the state which can be preserve
  • FIG. 9 (A) is a view corresponding to FIG. 1 (A) showing the shape of the isoelectric focusing test device of Embodiment 1 viewed from the width direction
  • FIG. 9 (B) is the same as that of Embodiment 1. It is a figure corresponding to Drawing 1 (A) showing the shape seen from the length direction of the test tool for electric spot electrophoresis.
  • the isoelectric focusing test device GP 1 shown in FIG. 1A is obtained by forming a gel layer G 1 satisfying the following conditions (1) to (4) on a base material Sx.
  • the gel layer G 1 has an outer peripheral end face G 1a perpendicular to the substrate S.
  • the outer peripheral end face G 1a of the gel layer G 1 and the outer peripheral end face Sa of the base material Sx are on the same plane.
  • the film thickness T 1 at the outer peripheral edge in the gel layer G 1 is the thinnest and the film thickness T 2 at the central is the thickest.
  • the film thickness T 2 at the center of the gel layer G 1 is 110 to 120% of the film thickness T 1 at the outer peripheral edge.
  • the above conditions (1) to (4) are obtained by causing water to be absorbed and swelled in the dry film D 1 of the storable isoelectric focusing test instrument GPD 1 in FIG. 1 (B).
  • the gel layer G 1 (see FIG. 1A) satisfying (1) is restored.
  • This gel layer G 1 has a gently convex curved upper surface (surface opposite to the base material) and an outer peripheral end face G 1a perpendicular to the surface of the base material S in contact with the gel layer G 1.
  • the outer peripheral end face G 1a of the gel layer G 1 is on the same plane as the outer peripheral end face Sa of the substrate S.
  • the gel layer G 1 satisfying these conditions (1) to (4) does not have a portion protruding from the outer peripheral end surface Sa of the substrate Sx, and the film thickness difference (T 2 ⁇ between the central portion and the outer peripheral end portion).
  • T 1 ) is a small gel layer. Therefore, when the isoelectric focusing test device GP 1 is used as a first-dimensional gel plate in two-dimensional electrophoresis, the analysis result of the first-dimensional electrophoresis can be accurately reflected in the second-dimensional electrophoresis. .
  • the convex curved surface G 1b of the gel layer G 1 of the first-dimensional gel plate GP 1 is superimposed on the upper surface of the gel layer G 22 of the second-dimensional gel plate GP 22 .
  • the vicinity of the outer peripheral end face G 1a of the convex curved surface G 1b in the upper gel layer G 1 may not be in contact with the upper surface of the lower gel layer G 22 .
  • the entire surface of the first dimension gel plate GP 1 gel layer G 1 of the convex curved surface G 1b is the second dimension It contacts the upper surface of the gel layer G 22 of the gel plate GP 22 .
  • the separated proteins existing in the gel layer G 1 of the first-dimensional gel plate GP 1 can be accurately and sufficiently moved to the gel layer G 22 of the second-dimensional gel plate GP 22 , Analytical results with high migration reliability can be obtained.
  • the isoelectric focusing test device GPD 1 shown in FIG. can get.
  • FIG. 3 is a configuration diagram showing an apparatus capable of manufacturing the electrophoresis test device of the first embodiment.
  • This test device manufacturing apparatus includes a stage 10 on which a base material S is set, an ink jet apparatus 30 as an application unit, a moving mechanism 40 that moves the stage 10 in a linear direction, and a sealable case 50 that houses these. And a control unit (not shown).
  • the case 50 is provided with an opening / closing door (not shown).
  • the moving mechanism 40 includes a support base 40a that supports the stage 10, and the support base 40a can be reciprocated in a linear direction by a linear guide mechanism (not shown).
  • a linear guide mechanism not shown.
  • the support base 40a indicated by the solid line is in the standby position, and the support base 40a, the stage 10 and the substrate S travel straight to the position indicated by the two-dot chain line in the coating process.
  • the substrate S set on the stage 10 passes directly below first to third inkjet heads 31b, 32b, and 33b, which will be described later.
  • the ink jet device 30 includes an acidic solution discharge unit 31, a basic solution discharge unit 32, a polymerization initiator discharge unit 33, and a negative pressure adjustment unit 34.
  • the acidic solution discharge unit 31 includes a first tank 31a that stores the acidic monomer solution A, a first inkjet head 31b, and a first pipe 31c that sends the acidic monomer solution A from the first tank 31a to the first inkjet head 31b. And the acidic monomer solution A is supplied from the first tank 31a to the first inkjet head 31b using the water head difference.
  • the basic solution discharge unit 32 includes a second tank 32a that stores the basic solution B, a second inkjet head 32b, and a second pipe 32c that sends the basic solution B from the second tank 32a to the second inkjet head 32b. And the basic monomer solution B is supplied from the second tank 32a to the second inkjet head 32b using the water head difference.
  • the polymerization initiator discharge unit 33 includes a third tank 33a that stores the polymerization initiator C, a third inkjet head 33b, and a third pipe 33c that sends the polymerization initiator C from the third tank 33a to the third inkjet head 33b. And the polymerization initiator C is supplied from the third tank 33a to the third inkjet head 33b using the water head difference.
  • Examples of the first to third ink jet heads 31b to 33b include a thermal jet method, a piezo jet method, an electrostatic drive method, and the like, but each liquid (acidic monomer solution A, basic monomer solution B, polymerization in the ink jet device 30).
  • a thermal jet method a piezo jet method, an electrostatic drive method, and the like
  • each liquid acidic monomer solution A, basic monomer solution B, polymerization in the ink jet device 30.
  • the initiator C is cooled, it is desirable to use a piezo jet method or an electrostatic drive method without using a thermal jet method for applying heat to each liquid.
  • the negative pressure adjusting unit 34 is connected to the first to third tanks 31a to 33a by pipes 35 to 37, manages the atmospheric pressure in the first to third tanks, and controls the first to third inkjet heads 31b.
  • the insides of the first to third tanks 31a to 33a are adjusted to be constant at a predetermined pressure lower than the atmospheric pressure so that the liquid does not drip from the nozzle holes H (see FIG. 5).
  • the first to third ink jet heads 31b to 33b are integrated to form a set of discharge head units U, which are fixed by a fixing member (not shown). As shown in FIG. 4, the first to third ink jet heads 31b to 33b are arranged in a line on the movement locus E of the base material S, but the head arrangement order is not limited to this order. In the first embodiment, the first to third inkjet heads 31b to 33b are arranged in this order from the upstream side in the moving direction of the substrate S.
  • a plurality of nozzles are formed on the lower surfaces of the first to third inkjet heads 31b to 33b facing the movement locus E of the substrate S in a direction orthogonal to the direction of the movement locus E.
  • the holes H are provided in one row. That is, the nozzle hole group HG in one row extends in a direction orthogonal to the direction of the movement locus E and with a length exceeding the width of the movement locus E.
  • the nozzle hole diameter D and the nozzle hole interval P are not particularly limited, but the diameter of the nozzle hole H is suitably about 10 to 100 ⁇ m, and the nozzle hole interval P is suitably about 100 to 200 ⁇ m.
  • the nozzle hole group HG may be provided in a plurality of rows of two or more.
  • an elongated rectangular base material S is set on the stage 10 in the standby position.
  • a coating process under normal temperature and atmospheric pressure based on a predetermined program is performed. That is, as shown in FIGS. 6A to 6C and FIG. 7, the support base 40a is intermittently moved in the direction of arrow M by the moving mechanism 40, and the first to third inkjet heads 31b to The minute droplets La, Lb, and Lc are intermittently ejected from the substrate 33b at regular time intervals to form the coating film L3 on the substrate S.
  • the first inkjet head 31b A small droplet La of the acidic monomer solution is discharged and applied onto the substrate S.
  • the coating film L1 acidic monomer solution is formed at one end S 1 side of the substrate S.
  • the nozzle hole H that discharges the micro droplet La is selected from the nozzle hole group HG in the first inkjet head 31b so that the micro droplet La is not discharged onto the stage 10.
  • the second and third inkjet heads 32b and 33b are the second and third inkjet heads 32b and 33b.
  • the mixed coating film of the monomer solution and the polymerization initiator are mixed and polymerization initiator containing gel material liquid L3 (see FIG. 7) is formed at one end S 1 side of the substrate S, the substrate this way continuously coated film L3 toward the other end S 2 side from the one end S 1 side of the S is gradually being formed.
  • the discharge amount of the acidic monomer solution (microdroplets La) and the basic monomer solution (microdroplets Lb) from the first and second inkjet heads 31b and 32b is the amount of the gel layer obtained after the gelling process.
  • the pH gradient in the longitudinal direction (arrow M direction) is adjusted to be a predetermined gradient.
  • coating process is performed when a control part controls each drive part based on a predetermined program.
  • the door of the case 50 is opened, the base material S is taken out and stored in the case for the gelation process, and the gelation process of the coating film L3 is performed at room temperature in the case. Note that it takes about 3 to 5 hours to complete the gelation at room temperature.
  • an isoelectric focusing test in which a bowl-shaped gel layer G having roundness at the four ends is formed on the substrate S as shown in FIGS. 8 (A) and (B). Tool T is obtained.
  • the isoelectric focusing test device T is an incomplete product.
  • a step of cutting the entire outer periphery of the gel layer G of the obtained isoelectric focusing test device T together with the substrate S is performed.
  • the thickness of the central portion of the gel layer G is the gel layer obtained after cutting (the gel layer G shown in FIGS. 9A and 9B). 1 )
  • the isoelectric focusing test device T is cut at a position (dotted line position) that is 110 to 120% of the film thickness at the outer peripheral edge of 1 ).
  • the isoelectric focusing test device T is cut at (dotted line position).
  • the rounded outer periphery of the gel layer G of the isoelectric focusing test device T is cut off, and the isoelectric focusing electrophoresis shown in FIGS. 1 (A), 9 (A) and 9 (B) is used.
  • a test device GP 1 is obtained.
  • the isoelectric focusing test device GPD 1 of the present invention as a finished product shown in FIG. 1B is obtained.
  • the method of drying the gel layer G 1 is not particularly limited, and examples thereof include a method of heating the gel layer G 1 with a heater or blowing hot air to the gel layer G 1 for drying.
  • a cooling step for cooling the dry film D 1 to ⁇ 20 ° C. or less may be performed. Or you may perform a freeze-dry process instead of a drying process and a cooling process.
  • FIG. 10 is a perspective view showing a stage used at the time of manufacturing the isoelectric focusing test device of the second embodiment and a frame body installed thereon
  • FIG. 11 is a diagram for isoelectric focusing of the second embodiment. It is explanatory drawing which shows a part of manufacturing process of a test tool.
  • differences from the first embodiment in the second embodiment will be mainly described.
  • the frame F shown in FIGS. 10 and 11 is used by being installed on the stage 10 in the test device manufacturing apparatus shown in FIG.
  • the frame F is formed of the same material as the base material S or the stage 10 and has a concave portion Fa having the same size and shape as the base material S.
  • the inner peripheral surface Fa 1 of the concave portion Fa is subjected to a hydrophobic treatment. ing.
  • the frame body F Before the start of production, the frame body F is installed on the stage 10, and the base material S is set in the recess Fa of the frame body F. Thereafter, in the same manner as in Embodiment 1 except that the frame F is present, the acidic monomer solution, the basic monomer solution, and the polymerization initiator in this order (or the basic monomer solution, the acidic monomer solution, and These are applied in the order of polymerization initiator) to form a coating film L3.
  • the inner peripheral surface Fa 1 of the frame F is subjected to hydrophobic treatment, the liquid surface of the coating film L3 becomes a gently convex curved surface. That is, the outer peripheral portion of the liquid surface of the coating film L3 is lower than the central portion.
  • the frame body F is taken out from the test device manufacturing apparatus, and the coating film L3 on the substrate S is gelled in the frame body F at room temperature. Thereby, a gel layer having the same cross-sectional shape as the coating film L3 is formed.
  • This gel layer satisfies the above conditions (1) to (4) in the same manner as the gel layer G 1 in the first embodiment.
  • the gel layer is taken out from the frame body F together with the base material S and dried, so that the same isoelectric point as in Embodiment 1 (see FIG. 1B) in which the dry film is formed on the base material S is obtained.
  • a test device for electrophoresis is obtained. According to the manufacturing method of Embodiment 2, the cutting process performed in Embodiment 1 can be omitted.
  • a gel material solution containing a polymerization initiator may be applied onto the substrate.
  • a gel material solution containing a polymerization initiator in a cooled state is used so that gelation of the gel material solution containing a polymerization initiator does not proceed during the coating process.
  • the cooled monomer solution and the cooled polymerization initiator are mixed in the vicinity of the nozzle, and further, the vicinity of the nozzle is also cooled to cool the gel material solution containing the polymerization initiator before discharge.
  • the substrate may be cooled.
  • a water film is formed in advance on the substrate, and the monomer solution and the polymerization initiator may be individually applied onto the water film as in the first embodiment, or the gel material solution containing the polymerization initiator may be applied. . 4).
  • the first embodiment the case where the coating film L3 is formed by passing the substrate S once under the discharge head unit U is illustrated. However, the coating film L3 is formed by moving the substrate S one or more times. May be.
  • the application timing of the polymerization initiator can be set, for example, at every movement, at a predetermined movement, or at the last movement.
  • GPD 1 Preservable isoelectric focusing test device

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Abstract

信頼性の高い二次元電気泳動を行うことができる等電点電気泳動用試験具およびその製造方法を提供すること。 ゲル層を乾燥した乾燥膜が基材上に形成されてなる等電点電気泳動用試験具であって、前記乾燥膜は、膨潤させたときに （１）ゲル層が、前記基材に対して垂直方向の外周端面を有し、 （２）ゲル層の前記外周端面と基材の外周端面とは同一面上にあり、 （３）ゲル層における外周端部の膜厚が最も薄くかつ中央部の膜厚が最も厚く、 （４）ゲル層における前記中央部の膜厚が前記外周端部の膜厚の１１０～１２０％であるの条件（１）～（４）を満たすゲル層となることを特徴とする等電点電気泳動用試験具。

Description

等電点電気泳動用試験具およびその製造方法
　本発明は、等電点電気泳動用試験具およびその製造方法に関する。
　電気泳動法は、溶液またはこれに浸漬した親水性の支持体などの媒体に電圧をかけることによって、該媒体中の荷電物質がその電荷に応じて電界中を移動する現象を利用した分離分析法である。特に、媒体としてゲルを用いる電気泳動（ゲル電気泳動法）は、タンパク質および核酸のような生体高分子を分離する手法として、生化学、分子生物学などの生命科学分野や臨床検査の分野などにおいて広く利用されている。
　タンパク質の電気泳動法には、主として、タンパク質の大きさ（分子量）により分離する方法と、電荷（等電点）により分離する方法とがある。分子量による分離には、ポリアクリルアミドゲルを用いて、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の存在下で行う電気泳動（SDS-PAGE法）が広く利用されている。SDS-PAGE法では、タンパク質は一定の割合でSDSと結合してその電荷密度が一定となり、この状態でタンパク質が網目状構造を有するポリアクリルアミド中を移動することで、タンパク質は分子ふるい効果により、その分子量に応じて分離される。
　等電点による分離には、pH勾配の存在下で行う電気泳動（等電点電気泳動法）が利用されている。等電点電気泳動法では、pH勾配中で、タンパク質が自身の等電点と等しいpHの位置に集まることによって、タンパク質が分離される。等電点電気泳動法の媒体として、従来は両性担体が用いられていたが、近年では、通電中にpH勾配が崩れることのない固定化pH勾配（Immobilized pH Gradient：IPG）ゲルがよく用いられている。
　近年では、生物が有する全タンパク質の構造および機能を網羅的に解析することを目的とするプロテオーム解析の一環として、上記の２つの電気泳動法を組み合わせた二次元電気泳動法が利用されている。二次元電気泳動法では、一次元目に等電点電気泳動が行われ、続く二次元目にSDS-PAGEが行われる。これにより、数千種類ものタンパク質を高い分解能で一挙に分離することが可能となった。
　このように、ゲル電気泳動法はタンパク質などの生体高分子の分離分析に不可欠な手法であるが、いずれの電気泳動法においても分析の精度および再現性は、用いるゲルの品質によるところが大きい。したがって、当該分野においては、分解能の高いゲルを搭載した電気泳動用試験具を安定して製造可能な技術の開発が望まれている。
　例えば、特許文献１には、濃度が異なる２種類のゲル原液を撹拌槽で混合し、その混合液をゲル容器内へ底部から導入してゲル化（重合）させることにより濃度傾斜を有するゲルシートを作製する方法が開示されている。この場合、ゲル容器内へ導入する混合液中の各ゲル原液の割合を変化させることによって、所定の濃度傾斜を有するSDS-PAGE用ゲルシートが得られる。また、特許文献１に記載のグラジェントメイカーを用い、ｐＨが異なる２種類のゲル原液を撹拌槽で混合し、その混合液をゲル容器内へ底部から導入してゲル化させることによりｐＨ傾斜を有するゲルシートを作製することができる。この場合、ゲル容器内へ導入する混合液中の各ゲル原液の割合を変化させることによって、所定のｐＨ傾斜を有するゲルシートが得られ、このゲルシートをｐＨ傾斜方向に所定の幅で切断して細長いプレート上に貼り付けることにより、等電点電気泳動用のゲルプレートが得られる。
　特許文献１に記載のゲルプレート製造方法では、ゲル容器内での濃度傾斜またはｐＨ傾斜の管理が難しく、安定した品質のゲルプレートが得られ難いという面があった。そこで、濃度傾斜またはｐＨ傾斜を精度よく管理できる技術として、プレート上にモノマー溶液を塗布するゲルプレート製造方法が特許文献２に開示されている。すなわち、プレート上に液たまりを形成し、液たまりにモノマー溶液を吐出した後、重合開始剤を塗布して塗布膜をゲル化させることにより、基材上にゲル層を形成する。この場合、濃度またはｐＨが異なる２種類のモノマー溶液を混合比率を変化させながら混合して液たまりに塗布することにより、所定の濃度傾斜を有するSDS-PAGE用ゲルプレートまたは所定のｐＨ傾斜を有する等電点電気泳動用のゲルプレートが得られる。
　特許文献１および２のようにして作製されたゲル層を長期間保存できるようにするために、通常はゲル層を乾燥する。そして、使用時に乾燥膜に試料溶液を吸収させ膨潤させることにより、ゲル層を復元する。
特開昭６２－１６７４５９号公報 特開２０１２－２７３９号公報
　特許文献１の等電点電気泳動用の第１ゲルプレートＧＰ11の場合、図１２（Ａ）に示すように、乾燥膜に水を吸収させて膨潤したゲル層Ｇ11は、プレートＰ11の外周端面（四方の端面）よりも外側まではみ出して膨潤する。そのため、図１２（Ｂ）に示すように、二次元電気泳動における一次元目電気泳動（等電点電気泳動）に使用した第１ゲルプレートＧＰ11のゲル層Ｇ11を、二次元電気泳動における二次元目電気泳動（SDS-PAGE）用の第２ゲルプレートＧＰ12のゲル層Ｇ12上に押圧して、第１ゲルプレートＧＰ11のゲル層Ｇ11で分離したタンパク質を第２ゲルプレートＧＰ12のゲル層Ｇ12へ移す際、第１ゲルプレートＧＰ11のはみ出した部分（斜線部分）のゲル層Ｇ11はプレートＰ11にて押圧されず、かつ第２ゲルプレートＧＰ12のゲル層Ｇ12に十分あるいは全く接触しない場合が生じる。この結果、第１ゲルプレートＧＰ11の前記はみ出した部分（斜線部分）のゲル層Ｇ11に存在するタンパク質が第２ゲルプレートＧＰ12のゲル層Ｇ12へ十分あるいは全く移動しないおそれがある。
　また、特許文献２の場合、プレート上に形成された塗布膜は表面張力によって中央部が盛り上がるため、図１３（Ａ）に示すように、中央部から四方の外周部に向かうにつれて膜厚が薄くなった形状のゲル層Ｇ21を有する等電点電気泳動用の第１ゲルプレートＧＰ21が得られる。そのため、図１３（Ｂ）に示すように、一次元目電気泳動に使用した第１ゲルプレートＧＰ21のゲル層Ｇ21を、二次元目電気泳動用の第２ゲルプレートＧＰ22のゲル層22上に押圧して、第１ゲルプレートＧ21のゲル層Ｇ21で分離したタンパク質を第２ゲルプレートＧＰ22のゲル層Ｇ22へ移す際、第１ゲルプレートＧＰ21の外周部（斜線部分）のゲル層Ｇ21が第２ゲルプレートＧＰ22のゲル層Ｇ22に十分あるいは全く接触しない場合が生じる。この結果、第１ゲルプレートＧ２１の外周部（斜線部分）のゲル層Ｇ２１に存在するタンパク質が第２ゲルプレートＧＰ22のゲル層Ｇ22に十分あるいは全く移動しないおそれがある。
　このように、一次元目電気泳動に使用したゲルプレートのタンパク質を二次元目電気泳動用のゲルプレートへ正確かつ十分に移動させる（移転させる）ことができないと、二次元目泳動で得られた分析結果の信頼性が低下してしまう。
　本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、信頼性の高い二次元電気泳動を行うことができる等電点電気泳動用試験具およびその製造方法を提供することを目的とする。
　かくして、本発明によれば、ゲル層を乾燥した乾燥膜が基材上に形成されてなる等電点電気泳動用試験具であって、前記乾燥膜は、膨潤させたときに
（１）ゲル層が、前記基材に対して垂直方向の外周端面を有し、
（２）ゲル層の前記外周端面と基材の外周端面とは同一面上にあり、
（３）ゲル層における外周端部の膜厚が最も薄くかつ中央部の膜厚が最も厚く、
（４）ゲル層における前記中央部の膜厚が前記外周端部の膜厚の１１０～１２０％であるの条件（１）～（４）を満たすゲル層となる等電点電気泳動用試験具が提供される。
　また、本発明の別の観点によれば、基材上にゲル材料液を塗布しゲル化させてゲル層を形成する工程と、前記ゲル層の外周部全周を基材と共に切断する工程と、前記ゲル層を乾燥する工程とを含む等電点電気泳動用試験具の製造方法が提供される。
　また、本発明のさらに別の観点によれば、枠体に囲まれた基材上にゲル材料液を塗布しゲル化させてゲル層を形成する工程と、前記枠体を取り外して前記ゲル層を乾燥する工程とを含み、
　前記枠体は、前記ゲル材料液と接する疎水処理された内周面を有している等電点電気泳動用試験具の製造方法が提供される。
　本発明によれば、等電点電気泳動用試験具の乾燥膜に水を吸収させ膨潤させることにより、基材の外周端面からはみ出た部分を有さず、かつ中央部と外周端部との膜厚差が小さいゲル層を復元することができる。そのため、本発明の等電点電気泳動用試験具を用いて二次元電気泳動における一次元目電気泳動を行った後、この試験具（以下、「一次元目ゲルプレート」という場合がある）のゲル層を二次元目電気泳動用試験具（以下、「二次元目ゲルプレート」という場合がある）のゲル層に押圧すると、一次元目ゲルプレートのゲル層が二次元目ゲルプレートのゲル層に全面的に接触する。この結果、一次元目ゲルプレートのゲル層に存在する分離されたタンパク質が二次元目ゲルプレートのゲル層へ正確かつ十分に移動する（移転する）ことができ、二次元目電気泳動の信頼性の高い分析結果を得ることができる。
本発明の実施形態１の等電点電気泳動用試験具の使用可能な状態を示す斜視図である。 図１（Ａ）の等電点電気泳動用試験具におけるゲル層を乾燥した後の保存可能な状態を示す斜視図である。 実施形態１の等電点電気泳動用試験具を二次元目電気泳動用試験具上に重ねた状態を示す一部省略断面図である。 図２（Ａ）の状態から等電点電気泳動用試験具を押圧した状態を示す一部省略断面図である。 実施形態１の電気泳動用試験具を製造することができる装置を示す構成図である。 図３の製造装置におけるインクジェットヘッドを下方から見た概略底面図である。 図３の製造装置におけるインクジェットヘッドのノズル孔群を示す拡大図である。 図３の製造装置を用いて基材へ酸性モノマー溶液を塗布する状態を示す説明図である。 図６（Ａ）から引き続いて基材へ酸性モノマー溶液を塗布する状態を示す説明図である。 図６（Ｂ）から引き続いて基材へ重合開始剤を塗布する状態を示す説明図である。 図３の製造装置によるゲル材料液の塗布が終了した状態を示す説明図である。 切断工程前の等電点電気泳動用試験具の幅方向から見た形状を示す図である。 切断工程前の等電点電気泳動用試験具の長さ方向から見た形状を示す図である。 実施形態１の等電点電気泳動用試験具の幅方向から見た形状を示す図１（Ａ）対応図である。 実施形態１の等電点電気泳動用試験具の長さ方向から見た形状を示す図１（Ａ）対応図である。 実施形態２の等電点電気泳動用試験具の製造時に用いられるステージおよびその上に設置される枠体を示す斜視図である。 実施形態２の等電点電気泳動用試験具の製造工程の一部を示す説明図である。 従来の等電点電気泳動用試験具を二次元目電気泳動用試験具上に重ねた状態を示す一部省略断面図である。 図１２（Ａ）の状態から等電点電気泳動用試験具を押圧した状態を示す一部省略断面図である。 別の従来の等電点電気泳動用試験具を二次元目電気泳動用試験具上に重ねた状態を示す一部省略断面図である。 図１３（Ａ）の状態から等電点電気泳動用試験具を押圧した状態を示す一部省略断面図である。
（等電点電気泳動用試験具について）
　本発明の等電点電気泳動用試験具は、ゲル層を乾燥した乾燥膜が基材上に形成されてなる等電点電気泳動用試験具であって、前記乾燥膜は、膨潤させたときに
（１）ゲル層が、前記基材に対して垂直方向の外周端面を有し、
（２）ゲル層の前記外周端面と基材の外周端面とは同一面上にあり、
（３）ゲル層における外周端部の膜厚が最も薄くかつ中央部の膜厚が最も厚く、
（４）ゲル層における前記中央部の膜厚が前記外周端部の膜厚の１１０～１２０％であるの条件（１）～（４）を満たすゲル層となる。
　ここで、条件（１）～（４）を満たすゲル層は、水分飽和状態にあるときのゲル層を指す。本発明の等電点電気泳動用試験具は、前記条件（１）～（４）を満たすゲル層を乾燥した乾燥膜が基材上に形成されたものである。
　本発明の等電点電気泳動用試験具を二次元電気泳動における一次元目ゲルプレートとして使用する上で、ゲル層における基材と反対側の面は窪みが無い緩やかな凸曲面に形成されていることが好ましい。つまり、一次元目ゲルプレートのゲル層を二次元目ゲルプレートのゲル層に重ね合わせて押圧する際、ゲル層における前記基材と反対側の面は押圧面となり、この押圧面が緩やかな凸曲面であると上下のゲル層間の空気が外周側へ押し出され易くなり、上下のゲル層の密着度がより高まる。これにより、一次元目ゲルプレートのゲル層に存在する分離されたタンパク質が二次元目ゲルプレートのゲル層へ確実に移動することができ、二次元目電気泳動のより信頼性の高い高精度な分析結果を得ることができる。この場合、「緩やかな凸曲面」とは、最も高い部分が平坦面である場合も含まれる。
　本発明において、ゲル層の軟らかさは特に限定されないが、本発明の等電点電気泳動用試験具を二次元電気泳動における一次元目ゲルプレートとして使用する場合を考慮すると、一次元目ゲルプレートのゲル層は二次元目ゲルプレートのゲル層よりも軟らかい方が好ましい。これにより、一次元目ゲルプレートのゲル層を二次元目ゲルプレートのゲル層に押圧する際の各ゲル層の密着度を高めることができる。
　本発明において、ゲル層の長さおよび幅は、基材の長さおよび幅と同じである。基材の長さおよび幅は特に限定されないが、一例としては、長さは50～250ｍｍ程度であり、幅は0.5～5ｍｍ程度である。ゲル層の膜厚は特に限定されないが、一例としては、最も薄い外周端部の膜厚は180～840μｍ程度であり、最も厚い中央部の膜厚はその１１０～１２０％である。
　このゲル層を乾燥した乾燥膜の膜厚は100μｍ以下に収縮するが、長さおよび幅はほとんど変化しない。
　電気泳動用試験具の基材の形態は、特に限定されるものではなく、例えば、細長プレート、所定形状に成型したチップ等が挙げられる。基材の材料としては、電気泳動用試験具の基材としての機能が発揮できるものであれば特に限定されず、例えば、石英ガラス、無アルカリガラス等のガラス、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）等の樹脂、アルミナ、低温同時焼成セラミック等のセラミックスなどが挙げられる。また、基材が疎水性材料からなる場合、基材におけるゲル層が形成される面を親水性処理してもよく、これにより基材に対する後述のモノマー溶液の濡れ性が向上し、モノマー溶液がゲル化したゲル層と基材との密着性が向上する。親水性処理としては、硫酸を用いたニトロ化、硝酸を用いたスルホン化、酸素プラズマ処理等が挙げられる。
　電気泳動用試験具のゲル層の材料は、電気泳動用試験具のゲル層としての機能が発揮できるものであれば特に限定されず、例えば、一般的なポリアクリルアミドゲルの材料としては、アクリルアミド（モノマー）、ビスアクリルアミド（架橋剤）、ｐＨ調整材料（ｐＨバッファ）、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ：重合促進剤）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ：重合開始剤）および純水が挙げられる。
　本発明において、ゲル層は、ゲル材料液を基材上に塗布しゲル化させることにより形成される。この際、予め重合開始剤を添加したゲル材料液（重合開始剤入りゲル材料液）を基材上に塗布する場合と、重合開始剤以外の材料を混合したモノマー溶液（重合開始剤を含まないゲル材料液）を基材上に塗布した後、この塗布膜上に重合開始剤を塗布する場合があり、本発明ではこれら両方の場合を包含する。
　よって、本発明において、「ゲル材料液」とは、特に言及がない限り、予め重合開始剤を添加したゲル材料液、重合開始剤を含まないゲル材料液、および重合開始剤の全てを意味する。以下、「予め重合開始剤を添加したゲル材料液」を「重合開始剤入りゲル材料液」という場合があり、「重合開始剤を含まないゲル材料液」を「モノマー溶液」という場合がある。
（等電点電気泳動用試験具の製造方法について）
　本発明の等電点電気泳動用試験具は、基材上にゲル材料液を塗布しゲル化させてゲル層を形成する工程と、前記ゲル層の外周部全周を基材と共に切断する工程と、前記ゲル層を乾燥する工程とを含む製造方法により製造することができる。この製造方法については後述の実施形態１で説明する。
　また、本発明の等電点電気泳動用試験具は、枠体に囲まれた基材上にゲル材料液を塗布しゲル化させてゲル層を形成する工程と、前記枠体を取り外して前記ゲル層を乾燥する工程とを含み、前記枠体は、前記ゲル材料液と接する疎水処理された内周面を有している製造方法により製造することができる。この製造方法については後述の実施形態２で説明する。
　本発明において、基材上にゲル材料液を塗布する方法は特に限定されず、基材上面の所定領域にゲル材料液を塗布できるものであればよく、例えば、ピペッター、ディスペンサー、インクジェット装置等が挙げられる。これらの中でも、高精度に微小液滴を吐出して基材に付着させるインクジェットヘッドを備えたインクジェット装置を用いることが好ましい。インクジェットヘッドを用いれば、細長い基材の所定領域にも高精度かつ定量的に微小液滴を塗布することができるため、得ようとするゲル層の形成領域、膜厚、ｐＨ傾斜および濃度傾斜等を容易かつ高精度に制御することができる。
　以下、図面を参照しながら本発明の実施形態を詳説する。
（実施形態１）
　図１（Ａ）は本発明の実施形態１の等電点電気泳動用試験具の使用可能な状態を示す斜視図であり、図１（Ｂ）は図１（Ａ）の等電点電気泳動用試験具におけるゲル層を乾燥した後の保存可能な状態を示す斜視図である。また、図９（Ａ）は実施形態１の等電点電気泳動用試験具の幅方向から見た形状を示す図１（Ａ）対応図であり、図９（Ｂ）は実施形態１の等電点電気泳動用試験具の長さ方向から見た形状を示す図１（Ａ）対応図である。
　図１（Ａ）に示す等電点電気泳動用試験具ＧＰ1は、基材Ｓｘ上に次の条件（１）～（４）を満たすゲル層Ｇ1が形成されたものである。
（１）ゲル層Ｇ1が、基材Ｓに対して垂直方向の外周端面Ｇ1aを有する。
（２）ゲル層Ｇ1の外周端面Ｇ1aと基材Ｓｘの外周端面Ｓａとは同一面上にある。
（３）ゲル層Ｇ1における外周端部の膜厚Ｔ1が最も薄くかつ中央部の膜厚Ｔ2が最も厚い。
（４）ゲル層Ｇ1における中央部の膜厚Ｔ2が外周端部の膜厚Ｔ1の１１０～１２０％であ
る。
　換言すると、図１（Ｂ）の保存可能な状態の等電点電気泳動用試験具ＧＰＤ1の乾燥膜Ｄ1に水を飽和状態まで吸収させ膨潤させることにより、前記条件（１）～（４）を満たすゲル層Ｇ1（図１（Ａ）参照）が復元する。このゲル層Ｇ1は、緩やかな凸曲面となった上面（基材と反対側の面）と、基材Ｓにおけるゲル層Ｇ1と接触した面に対して垂直方向の外周端面Ｇ1aとを有し、ゲル層Ｇ1の外周端面Ｇ1aは基材Ｓの外周端面Ｓａと同一面上にある。
　これらの条件（１）～（４）を満たすゲル層Ｇ1は、基材Ｓｘの外周端面Ｓａからはみ
出た部分を有さず、かつ中央部と外周端部との膜厚差（Ｔ2－Ｔ1）が小さいゲル層である。そのため、等電点電気泳動試験具ＧＰ1を二次元電気泳動における一次元目ゲルプレートとして使用する場合に、一次元目電気泳動の分析結果を二次元目電気泳動に正確に反映させることができる。
　詳しく説明すると、この等電点電気泳動用試験具としての一次元目ゲルプレートＧＰ1を用いて二次元電気泳動における一次元目電気泳動を行った後、図２（Ａ）に示すように、この一次元目ゲルプレートＧＰ1のゲル層Ｇ1の凸曲面Ｇ1bを二次元目ゲルプレートＧＰ22のゲル層Ｇ22の上面に重ね合わせる。このとき、上のゲル層Ｇ1における凸曲面Ｇ1bの外周端面Ｇ1a付近は、下のゲル層Ｇ22の上面と接触しない場合がある。
　そして、図２（Ｂ）に示すように、一次元目ゲルプレートＧＰ1に押圧力Ｆを加えると、一次元目ゲルプレートＧＰ1のゲル層Ｇ1の凸曲面Ｇ1bの全面が二次元目ゲルプレートＧＰ22のゲル層Ｇ22の上面に接触する。この結果、一次元目ゲルプレートＧＰ1のゲル層Ｇ1に存在する分離されたタンパク質が二次元目ゲルプレートＧＰ22のゲル層Ｇ22へ正確かつ十分に移動することができ、二次元目電気泳動の信頼性の高い分析結果を得ることができる。
　図１（Ａ）に示した実施形態１の等電点電気泳動用試験具ＧＰ1の場合、ゲル層Ｇ1における外周端部の膜厚Ｔ1は約430μｍであり、中央部の膜厚Ｔ2は約500μｍである。また、ゲル層Ｇ1の長さ（矢印Ｙ方向）および幅（矢印Ｘ方向）は、基材Ｓｘの長さ70ｍｍおよび幅3ｍｍと同じである。このゲル層Ｇ1を含水率５％以下に乾燥させることにより、ゲル層Ｇ1が乾燥して乾燥膜Ｄ1となった図１（Ｂ）に示す等電点電気泳動用試験具ＧＰＤ1が得られる。
　次に、図１（Ａ）に示す試験具ＧＰ1を製造することができる装置について説明し、その後でこの装置を用いて試験具ＧＰ1を製造する方法について説明する。
　図３は実施形態１の電気泳動用試験具を製造することができる装置を示す構成図である。この試験具製造装置は、基材Ｓがセットされるステージ１０と、塗布部としてのインクジェット装置３０と、ステージ１０を直線方向に移動させる移動機構４０と、これらを収納する密閉可能なケース５０と、図示しない制御部とを備える。なお、ケース５０には図示しない開閉扉が設けられている。
　移動機構４０は、ステージ１０を支持する支持台４０ａを有し、この支持台４０ａが図示しないリニアガイド機構によって直線方向に往復移動可能とされている。
　図３において、実線で示された支持台４０ａは待機位置にあり、塗布工程において２点鎖線で示された位置まで支持台４０ａ、ステージ１０および基材Ｓは直進する。これにより、ステージ１０上にセットされた基材Ｓは、後述する第１～第３インクジェットヘッド３１ｂ、３２ｂ、３３ｂの真下を通過する。
　インクジェット装置３０は、酸性溶液吐出部３１と、塩基性溶液吐出部３２と、重合開始剤吐出部３３と、負圧調整部３４とを備える。
　酸性溶液吐出部３１は、酸性モノマー溶液Ａを貯蔵する第１タンク３１ａと、第１インクジェットヘッド３１ｂと、第１タンク３１ａから第１インクジェットヘッド３１ｂへ酸性モノマー溶液Ａを送る第１パイプ３１ｃとを有し、水頭差を利用して第１タンク３１ａから第１インクジェットヘッド３１ｂへ酸性モノマー溶液Ａが供給されるように構成されている。
　塩基性溶液吐出部３２は、塩基性溶液Ｂを貯蔵する第２タンク３２ａと、第２インクジェットヘッド３２ｂと、第２タンク３２ａから第２インクジェットヘッド３２ｂへ塩基性溶液Ｂを送る第２パイプ３２ｃとを有し、水頭差を利用して第２タンク３２ａから第２インクジェットヘッド３２ｂへ塩基性モノマー溶液Ｂが供給されるように構成されている。
　重合開始剤吐出部３３は、重合開始剤Ｃを貯蔵する第３タンク３３ａと、第３インクジェットヘッド３３ｂと、第３タンク３３ａから第３インクジェットヘッド３３ｂへ重合開始剤Ｃを送る第３パイプ３３ｃとを有し、水頭差を利用して第３タンク３３ａから第３インクジェットヘッド３３ｂへ重合開始剤Ｃが供給されるように構成されている。
　第１～第３インクジェットヘッド３１ｂ～３３ｂとしては、サーマルジェット方式、ピエゾジェット方式、静電駆動方式等が挙げられるが、インクジェット装置３０における各液（酸性モノマー溶液Ａ、塩基性モノマー溶液Ｂ、重合開始剤Ｃ）を冷却する場合は、各液に熱を加えるサーマルジェット方式を用いず、ピエゾジェット方式または静電駆動方式を用いることが望ましい。
　負圧調整部３４は、第１～第３タンク３１ａ～３３ａとパイプ３５～３７にて接続されており、第１から第３のタンク内の気圧を管理し、第１～第３インクジェットヘッド３１ｂ～３３ｂのノズル孔Ｈ（図５参照）から液が垂れ落ちない所定の圧力となるよう、第１～第３タンク３１ａ～３３ａ内を大気圧より低い所定圧で一定になるように調整する。
　第１～第３インクジェットヘッド３１ｂ～３３ｂは一体化されて１組の吐出ヘッドユニットＵが構成されており、この吐出ヘッドユニットＵは図示しない固定部材にて固定されている。そして、図４に示すように、この基材Ｓの移動軌跡Ｅ上に、第１～第３インクジェットヘッド３１ｂ～３３ｂは一列で配置されているが、ヘッド配置順はこの順番に限定されない。なお、実施形態１の場合、基材Ｓの移動方向の上流側から第１～第３インクジェットヘッド３１ｂ～３３ｂの順で配置されている。
　また、図４と図５に示すように、基材Ｓの移動軌跡Ｅと対向する第１～第３インクジェットヘッド３１ｂ～３３ｂの下面には、移動軌跡Ｅの方向と直交する方向に複数のノズル孔Ｈが１列で設けられている。すなわち、１列のノズル孔群ＨＧが、移動軌跡Ｅの方向と直交する方向に、かつ移動軌跡Ｅの幅を超える長さで延びている。ノズル孔径Ｄおよびノズル孔間隔Ｐは特に限定されないが、ノズル孔Ｈの径は10～100μｍ程度が適当であり、ノズル孔間隔Ｐは100～200μｍ程度が適当である。なお、ノズル列が直線状に配置されている場合、ヘッド向きを傾けることで見掛け上、ノズル孔間隔を狭くする方法も使用できる。また、第１～第３インクジェットヘッド３１ｂ～３３ｂにおいて、ノズル孔群ＨＧは２列以上の複数列で設けられていてもよい。
　次に、前記構成を有する試験具製造装置を用いて試験具ＧＰ1を製造する方法の一例について説明する。
　先ず、図３に示すように、待機位置にあるステージ１０上に細長い矩形の基材Ｓをセットする。
　次に、所定のプログラムに基づく常温大気圧下での塗布工程が行われる。すなわち、図６（Ａ）～（Ｃ）および図７に示すように、移動機構４０により支持台４０ａが矢印Ｍ方向に断続的に一定速度で移動すると共に、第１～第３インクジェットヘッド３１ｂ～３３ｂから微小液滴Ｌａ、Ｌｂ、Ｌｃが一定時間間隔で断続的に吐出して、基材Ｓ上に塗布膜Ｌ３が形成される。
　詳しく説明すると、図６（Ａ）に示すように、基材Ｓの一端Ｓ1がインクジェット装置３０の第１インクジェットヘッド３１ｂのノズル孔群ＨＧの真下位置まで移動したところで、第１インクジェットヘッド３１ｂから酸性モノマー溶液の微小液滴Ｌａが吐出されて基材Ｓ上に塗布される。これにより、図６（Ｂ）に示すように、酸性モノマー溶液の塗布膜Ｌ１が基材Ｓの一端Ｓ1側に形成される。この場合、ステージ１０上に微小液滴Ｌａが吐出されないように、第１インクジェットヘッド３１ｂにおけるノズル孔群ＨＧのうちから微小液滴Ｌａを吐出するノズル孔Ｈが選択されており、これについては第２および第３インクジェットヘッド３２ｂ、３３ｂでも同様である。
　そして、基材Ｓの一端Ｓ1が第２インクジェットヘッド３２ｂのノズル孔群ＨＧの真下位置まで移動したところで、第２インクジェットヘッド３２ｂから塩基性モノマー溶液の微小液滴Ｌｂが吐出されて塗布膜Ｌ１上に塗布される。これにより、図６（Ｃ）に示すように、酸性モノマー溶液と塩基性モノマー溶液とが混合した混合モノマー溶液の塗布膜Ｌ２が基材Ｓの一端Ｓ1側に形成される。　
　そして、基材Ｓの一端Ｓ1が第３インクジェットヘッド３３ｂのノズル孔群ＨＧの真下位置まで移動したところで、第３インクジェットヘッド３３ｂから重合開始剤の微小液滴Ｌｃが吐出されて塗布膜Ｌ２上に塗布される。これにより、前記混合モノマー溶液と重合開始剤とが混合した重合開始剤入りゲル材料液の塗布膜Ｌ３（図７参照）が基材Ｓの一端Ｓ1側に形成され、このようにして基材Ｓの一端Ｓ1側から他端Ｓ2側に向かって連続的に塗布膜Ｌ３が形成されていく。
　そして、基材Ｓの他端Ｓ2が第１～第３インクジェットヘッド３１ｂ～３３ｂを順次通過した時点で、図７に示すように、第１～第３インクジェットヘッド３１ｂ～３３ｂからの液滴吐出が順次停止する。その後、支持台４０ａが待機位置まで戻り、塗布工程が終了する。塗布工程において、第１および第２インクジェットヘッド３１ｂ、３２ｂからの酸性モノマー溶液（微小液滴Ｌａ）および塩基性モノマー溶液（微小液滴Ｌｂ）の吐出量は、ゲル化工程後に得られるゲル層の長手方向（矢印Ｍ方向）のｐＨ傾斜が所定の傾斜となるように調整される。なお、このような塗布工程における試験具製造装置の一連の動作は、所定のプログラムに基づいて制御部が各駆動部を制御することにより行われる。
　塗布工程後、ケース５０の扉を開けて基材Ｓを取り出し、ゲル化工程用のケース内に収納し、そのケース内で塗布膜Ｌ３のゲル化工程を常温下で行う。なお、常温下でのゲル化完了までには3~5時間程度の時間を要する。ゲル化完了後は、図８（Ａ）および（Ｂ）に示すように、四方の端部に丸みを有する蒲鉾形のゲル層Ｇが基材Ｓ上に形成された等電点電気泳動用試験具Ｔが得られる。なお、本発明において、この等電点電気泳動用試験具Ｔは未完成品である。
　次に、得られた等電点電気泳動用試験具Ｔのゲル層Ｇの外周部全周を基材Ｓと共に切断する工程が行われる。この工程では、図８（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ゲル層Ｇにおける中央部の膜厚が、切断後に得られるゲル層（図９（Ａ）および（Ｂ）に示すゲル層Ｇ1）の外周端部の膜厚の１１０～１２０％となる位置（点線の位置）で等電点電気泳動用試験具Ｔを切断する。具体的には、例えば、幅3ｍｍ×長さ70ｍｍの基材Ｓ上にゲル層Ｇを形成する場合、基材Ｓの四方の外周端面Ｓａから内側へ0.17～0.5ｍｍの寸法Ｗで入り込んだ位置（点線の位置）で等電点電気泳動用試験具Ｔを切断する。これにより、等電点電気泳動用試験具Ｔのゲル層Ｇの丸みを帯びた外周部が切除され、図１（Ａ）、図９（Ａ）および（Ｂ）に示す等電点電気泳動用試験具ＧＰ1が得られる。
　そして、この等電点電気泳動用試験具ＧＰ1のゲル層Ｇ1を乾燥することにより、図１（Ｂ）に示す完成品としての本発明の等電点電気泳動試験具ＧＰＤ1が得られる。この乾燥工程において、ゲル層Ｇ1を乾燥する方法は特に限定されず、例えば、ゲル層Ｇ1をヒータにて加熱する、あるいはゲル層Ｇ1に熱風を吹き付けて乾燥する方法が挙げられる。さらに、乾燥工程後に、乾燥膜Ｄ1を－２０℃以下に冷却する冷却工程を行ってもよい。あるいは、乾燥工程および冷却工程の代わりに、フリーズドライ工程を行ってもよい。
（実施形態２）
　図１０は実施形態２の等電点電気泳動用試験具の製造時に用いられるステージおよびその上に設置される枠体を示す斜視図であり、図１１は実施形態２の等電点電気泳動用試験具の製造工程の一部を示す説明図である。以下、実施形態２における実施形態１と異なる点を主に説明する。
　実施形態２の場合、図１０および図１１に示す枠体Ｆが、図１で示した試験具製造装置におけるステージ１０上に設置して用いられる。この枠体Ｆは、基材Ｓまたはステージ１０と同じ材料にて形成され、基材Ｓと同じサイズおよび形状の凹部Ｆａを有しており、その凹部Ｆａの内周面Ｆａ1は疎水処理されている。
　製造開始前に、ステージ１０上に枠体Ｆが設置され、枠体Ｆの凹部Ｆａ内に基材Ｓがセットされる。その後、枠体Ｆが存在すること以外は、実施形態１と同様にして、基材Ｓ上に酸性モノマー溶液、塩基性モノマー溶液および重合開始剤の順（あるいは塩基性モノマー溶液、酸性モノマー溶液および重合開始剤の順）にこれらを塗布して塗布膜Ｌ３を形成する。このとき、枠体Ｆの内周面Ｆａ1が疎水性処理されているため、塗布膜Ｌ３の液面は緩やかな凸曲面となる。すなわち、塗布膜Ｌ３の液面の外周部は中央部よりも低くなる。
　塗布工程後、試験具製造装置内から枠体Ｆを取り出し、枠体Ｆ内で基材Ｓ上の塗布膜Ｌ３を常温下でゲル化させる。これにより、塗布膜Ｌ３と同じ断面形状のゲル層が形成される。このゲル層は、実施形態１におけるゲル層Ｇ1と同様に、前記条件（１）～（４）を満たすものである。
　その後、基材Ｓと共にゲル層を枠体Ｆ内から取り出して乾燥させることにより、基材Ｓ上に乾燥膜が形成された実施形態１（図１（Ｂ）参照）と同様の等電点電気泳動用試験具が得られる。実施形態２の製造方法によれば、実施形態１で行われていた切断工程を省略することができる。
（他の実施形態）
１．実施形態１および２では、塗布工程において、基材上に常温状態の塗布膜を形成する場合を例示したが、ペルチェ素子やタンク冷却部を備えた装置を用い、基材上に冷却下で塗布膜を形成してもよい。また、実施形態１では、塗布工程において大気下で塗布膜を形成する場合を例示したが、窒素雰囲気下で塗布膜を形成してもよい。
２．実施形態１および２では、モノマー溶液と重合開始剤を個別に基材上へ塗布する場合を例示したが、重合開始剤入りゲル材料液を基材上へ塗布してもよい。この場合、塗布工程中に重合開始剤入りゲル材料液のゲル化が進行しないよう、冷却状態の重合開始剤入りゲル材料液が用いられる。例えば、塗布部において、冷却されたモノマー溶液と冷却された重合開始剤とをノズル付近で混合し、さらにはノズル付近も冷却して吐出前の重合開始剤入りゲル材料液も冷却する。それに加え、基材を冷却してもよい。
３．基材上に予め水膜を形成し、この水膜上に実施形態１の如くモノマー溶液と重合開始剤を個別に塗布してもよく、あるいは重合開始剤入りゲル材料液を塗布してもよい。
４．実施形態１では、吐出ヘッドユニットＵの下を基材Ｓが１度通過することにより塗布膜Ｌ３が形成される場合を例示したが、基材Ｓを１往復以上移動させて塗布膜Ｌ３を形成してもよい。この場合、重合開始剤の塗布時期を、例えば、毎回の移動時、所定回の移動時、あるいは最後の移動時に設定することができる。
　Ｄ1　乾燥膜
　ＧＰ1　使用可能な状態となった等電点電気泳動用試験具（ゲルプレート）
　ＧＰＤ1　保存可能な状態となった等電点電気泳動用試験具
　Ｇ1　ゲル層
　Ｇ1a　外周端面
　Ｓ、Ｓｘ　基材
　Ｓａ　外周端面
　Ｔ1　ゲル層における外周端部の膜厚
　Ｔ2　ゲル層における中央部の膜厚

Claims (6)

  1. 　ゲル層を乾燥した乾燥膜が基材上に形成されてなる等電点電気泳動用試験具であって、前記乾燥膜は、膨潤させたときに
    （１）ゲル層が、前記基材に対して垂直方向の外周端面を有し、
    （２）ゲル層の前記外周端面と基材の外周端面とは同一面上にあり、
    （３）ゲル層における外周端部の膜厚が最も薄くかつ中央部の膜厚が最も厚く、
    （４）ゲル層における前記中央部の膜厚が前記外周端部の膜厚の１１０～１２０％であるの条件（１）～（４）を満たすゲル層となることを特徴とする等電点電気泳動用試験具。
  2. 　前記ゲル層における前記基材と反対側の面が、緩やかな凸曲面に形成されている請求項１に記載の等電点電気泳動用試験具。
  3. 　前記ゲル層の前記外周端部の膜厚が180～840μｍである請求項１または２に記載の等電点電気泳動用試験具。
  4. 　基材上にゲル材料液を塗布しゲル化させてゲル層を形成する工程と、前記ゲル層の外周部全周を基材と共に切断する工程と、前記ゲル層を乾燥する工程とを含むことを特徴とする等電点電気泳動用試験具の製造方法。
  5. 　ゲル層における中央部の膜厚が、切断後に得られるゲル層の外周端部の膜厚の１１０～１２０％となる位置で切断する請求項４に記載の等電点電気泳動用試験具の製造方法。
  6. 　枠体に囲まれた基材上にゲル材料液を塗布しゲル化させてゲル層を形成する工程と、前記枠体を取り外して前記ゲル層を乾燥する工程とを含み、
    　前記枠体は、前記ゲル材料液と接する疎水処理された内周面を有していることを特徴とする等電点電気泳動用試験具の製造方法。
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