WO2013091801A1 - Adsorption von biomolekülen an calciumcarbonat - Google Patents

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WO2013091801A1
WO2013091801A1 PCT/EP2012/005158 EP2012005158W WO2013091801A1 WO 2013091801 A1 WO2013091801 A1 WO 2013091801A1 EP 2012005158 W EP2012005158 W EP 2012005158W WO 2013091801 A1 WO2013091801 A1 WO 2013091801A1
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calcium carbonate
biomolecules
adsorption
carbonate particles
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PCT/EP2012/005158
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Matthias Epple
Paulina KAEMPFE
Marijan Vucak
Christoph Nover
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Schaefer Kalk Gmbh & Co. Kg
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/04—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising compounds of alkali metals, alkaline earth metals or magnesium
    • B01J20/043—Carbonates or bicarbonates, e.g. limestone, dolomite, aragonite
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Definitions

  • the present invention relates to the use of calcium carbonate for the adsorption of biomolecules, in particular proteins, such as bovine
  • Serum albumin BSA
  • nucleic acids such as DNA
  • Calcium carbonate occurs in various polymorphic phases, with calcite and aragonite being the most stable and prominent representatives used in numerous industrial applications (see H. Nebel, M. Epple, Z.
  • Adsorption of molecules is influenced.
  • DOI: 10.1006 / jcis.1995.1373) was also investigated, as was the adsorption on metal oxide surfaces (see CE Giacomelli, MJ Avena, CP De Pauli, J. Colloid Interface Sci. 1997, 188 (2), 387. DOI:
  • Object of the present invention was to show very effective ways to adsorb biomolecules having a molecular weight greater than 1,000 g / mol and at least one amide group and / or at least one amidine group.
  • Biomolecules with a molecular weight greater than 1000 g / mol and with at least one amide group and / or at least one amidine group succeed in a surprising manner an extremely effective adsorption of these biomolecules.
  • the proposed use of calcium carbonate for the adsorption of biomolecules allows at least partial separation, immobilization, recovery or isolation of these substances in a relatively simple manner, quickly and cost-effectively.
  • the solution according to the invention can be used in particular for the at least partial separation, immobilization, recovery or isolation of proteins and / or nucleic acids, such as DNA, and for the comparatively selective separation, immobilization, recovery or isolation of proteins or nucleic acids from mixtures containing both proteins and nucleic acids be used.
  • the present invention relates to the use of calcium carbonate for the adsorption of biomolecules.
  • Adsorption means the accumulation of substances from gases or
  • the focus is in particular on the enrichment of the biomolecules from liquids on the surface of the calcium carbonate particles.
  • Biomolecules also called natural substances, are chemical substances that are formed by organisms to fulfill biological functions.
  • Biomolecules have a molecular weight greater than 1,000 g / mol, preferably greater than 2,500 g / mol, advantageously greater than 5,000 g / mol, advantageously greater than 10,000 g / mol, in particular greater than 20,000 g / mol.
  • biomolecules with a smaller molecular weight may also be adsorbed. However, this is not within the scope of the present invention in the foreground.
  • the biomolecules to be adsorbed further comprise at least one amide group and / or at least one amidine group, preferably at least two, suitably at least five, conveniently
  • the solution according to the invention is particularly suitable for the adsorption of proteins, such as bovine serum albumin (BSA), and nucleic acids, in particular of deoxyribonucleic acid (DNA), especially of human DNA.
  • proteins such as bovine serum albumin (BSA)
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • precipitated calcium carbonate particles For the adsorption of biomolecules precipitated calcium carbonate particles (PCC) are used in the present invention.
  • Precipitated calcium carbonate particles denote synthetically produced calcium carbonate particles and are to be distinguished from naturally occurring calcium carbonate.
  • the spherical equivalent particle size of the calcium carbonate particles is greater than 10.0 nm, preferably greater than 20.0 nm, in particular greater than 30.0 nm.
  • the sphere-equivalent particle size of the calcium carbonate particles is preferably less than 5.0 ⁇ m, preferably less than 1.0 ⁇ m, more preferably less than 500.0 nm, advantageously less than 250.0 nm, in particular less than 100.0 nm.
  • the sphere-equivalent particle size is very particularly preferably
  • Calcium carbonate particles in the range from greater than 10.0 nm to less than 5.0 ⁇ m, advantageously in the range from greater than 10.0 nm to less than 1.0 ⁇ m, preferably in the range from greater than 10.0 nm to less than 500.0 nm, Conveniently in the range of greater than 20.0 nm to less than 250.0 nm, in particular in the range of greater than 30.0 nm to less than 100.0 nm.
  • the spherical equivalent particle size of the calcium carbonate particles is in the
  • the specific surface area of the calcium carbonate particles is preferably greater than 0.5 m / g, advantageously greater than 3.0 m 2 / g, preferably greater than 5.0 m 2 / g, particularly preferably greater than 10.0 m 2 / g, advantageously greater 15.0 m 2 / g, in particular greater than 19.0 m 2 / g and is within the scope of a particularly preferred
  • Embodiment of the present invention in the range of greater than 3.0 m 2 / g to 100.0 m 2 / g, preferably in the range of greater than 5.0 m 2 / g to 50.0 m 2 / g, in particular in the range of greater 10.0 m 2 / g to 30.0 m / g.
  • Each sample is preferably degassed for adsorption measurements at 130 ° C for at least 3 hours.
  • the use of a FlowPrep 060 degasser is particularly favorable.
  • the morphology of the calcium carbonate can be chosen freely.
  • Crystal modifications here refer to those calcium carbonate modifications in which the atoms are at least partially ordered
  • Calcium carbonate modifications are greater than 50 wt .-%, more preferably greater than 70 wt .-%, most preferably greater than 85 wt .-%, in particular greater than 90 wt .-%, each based on the total weight of
  • Calcitic modifications preferably comprise more than 50% by weight, more preferably more than 70% by weight, most preferably more than 85% by weight, in particular more than 90% by weight, of calcite, based in each case on Total weight of calcium carbonate.
  • “Aragonitic” modifications preferably comprise more than 30% by weight, favorably more than 50% by weight, more preferably more than 70% by weight, very preferably more than 85% by weight, in particular more than 90% by weight. %, Aragonite, in each case based on the total weight of the calcium carbonate.
  • the shape of the calcium carbonate particles is not subject to any particular
  • the aspect ratio (aspect ratio) of the calcium carbonate particles is greater than 5.0, preferably greater than 6.0, more preferably greater than 7.0, more preferably greater than 8.0, even more preferably greater than 9, 0, in particular greater than 10.0.
  • Invention is the aspect ratio (aspect ratio) of the calcium carbonate particles less than 5.0, preferably less than 4.0, more preferably less than 3.0, favorably less than 2.0, even more preferably less than 1.5, in particular less than 1.1.
  • the "aspect ratio" of the calcium carbonate particles in this context refers to the quotients of maximum and minimum
  • Particle diameter expediently the size of the single crystals is examined. Crystal aggregates, i. Clusters of many closely packed crystal individuals are desirably ignored.
  • the aspect ratio is preferably determined by means of electron microscopy
  • Calcium carbonate particles in particular of acicular, aragonitic calcium carbonate particles.
  • the aspect ratio (aspect ratio) of these calcium carbonate particles is the aspect ratio (aspect ratio) of these calcium carbonate particles.
  • the calcium carbonate particles are preferably at least 0.2 ⁇ m, preferably at least 0.5 ⁇ m, in particular at least 0.8 ⁇ m, long and preferably at most 0.12 ⁇ m, preferably at most 0.10 ⁇ m, in particular at most 0.08 ⁇ m, thick.
  • preferably at least 90%, desirably at least 95% of all particles have an aspect ratio (aspect ratio) greater than 5.0, preferably greater than 6.0, more preferably greater than 7.0, favorably greater than 8.0, even more preferably greater than 9 , 0, in particular greater than 10.0, on.
  • calcitic calcium carbonate particles in particular of calcium carbonate particles with an aspect ratio of less than 5.0, preferably less than 4.0, more preferably less than 3.0, more preferably less than 2.0, even more preferably less than 1, 5, especially smaller 1, 1, particularly proven.
  • the above precipitated calcium carbonate particles can be prepared in a manner known per se. Usually they are going through a
  • Carbonatization process in which one passes a carbon dioxide-containing gas through an aqueous solution of calcium hydroxide or milk of lime in a carbonation reactor.
  • Other inorganic materials such as alum, may be co-precipitated with the PCC or precipitated onto the surface of the particles.
  • US Pat. No. 5,783,038 describes a particular method of producing PCC particles, although modifications in the actual synthetic route, optional additives or agents, other process conditions, and post-precipitation physical and chemical treatment methods may be used to determine the particle size, morphology, or type of calcium carbonate To change particles.
  • Precipitated calcium carbonate particles differ significantly from ground calcium carbonate in their physical and chemical properties.
  • the adsorption of the biomolecules is preferably carried out at a temperature in the range of greater than 0 ° C to less than 100 ° C, preferably in the range of 1 ° C to 50 ° C, in particular in the range of 2 ° C to 40 ° C.
  • the adsorption of the biomolecules takes place at a temperature in the range from 3 ° C. to less than 20 ° C., in particular in the range from 3.5 ° C. to 15 ° C.
  • the adsorption takes place the biomolecules at a temperature in the range of 20 ° C to less than 30 ° C, in particular in the range of 22 ° C to 27 ° C.
  • the adsorption of the biomolecules takes place at a temperature in the range from 30 ° C. to less than 50 ° C., in particular in the range from 35 ° C. to 40 ° C.
  • the adsorption of the biomolecules preferably takes place from an aqueous solution.
  • concentration of the biomolecules is preferably in the range of 0.01 g / l to 10.0 g / l, preferably in the range of 0.05 g / l to 5.0 g / l, in particular in the range of 0.075 g / l to 2.5 g / l, each based on the total weight of the aqueous solution.
  • the weight ratio of the at least one protein to the at least one nucleic acid is preferably in the range from 1:99 to 99: 1, preferably in the range from 1:50 to 50: 1,
  • the amount used of the precipitated calcium carbonate particles is preferably in the range of 1 part by weight to 100000 parts by weight, preferably in the range of 50 parts by weight to 25000 parts by weight, especially in the range of 400 parts by weight to 7500 parts by weight, in each case based on 100 parts by weight of biomolecules.
  • the amount of biomolecule (s) adsorbed, based on the initially introduced amount of biomolecule (s), is preferably greater than 10.0%, preferably greater than 20.0%, advantageously greater than 30.0%, particularly preferably greater than 40.0%. , suitably greater than 50.0%, very particularly preferably greater than 60.0%, even more preferably greater than 70.0%, advantageously greater than 80.0%,
  • an aqueous solution containing at least one protein and at least one nucleic acid, in particular DNA presents,
  • step b the solution from step a. contacted with the precipitated calcium carbonate particles having a spherical equivalent particle size greater than 10.0 nm,
  • calcitic calcium carbonate particles are used for adsorbing the biomolecules.
  • These can be nucleic acids, especially DNA, but none
  • Adsorb proteins to a greater extent. Desorption of the nucleic acids, in particular of the DNA, at a pH of less than 7.0, preferably less than 6.5, in particular less than or equal to 6.0, is possible.
  • the pH is known to denote the negative decadic logarithm of hydrogen ion activity. For more details will be on the common
  • the pH is preferably measured at the temperature at which the respective process step is carried out.
  • a measurement of the pH at a uniform temperature, especially at 25 ° C, has proven particularly useful.
  • step a the solution from step a. at a pH greater than 7.0, preferably greater than 7.5, in particular in the range from 7.5 to 10.0, contacted with the calcium carbonate particles,
  • the at least one nucleic acid is at least partially adsorbed to the Caiciumcarbonat- particles and
  • the at least one protein is at least partially isolated.
  • the amount of adsorbed nucleic acid is preferably greater than 10.0%, preferably greater than 20.0%, advantageously greater than 30.0%, particularly preferably greater than 40.0%. , suitably greater than 50.0%, very preferably greater than 60.0%, even more preferably greater than 70.0%, advantageously greater than 80.0%, in particular greater than 90.0%.
  • the amount of protein adsorbed, relative to the amount of protein originally present in the solution is preferably less than 10.0%, preferably less than 8.0%, favorably less than 6.0%, more preferably less than 4.0%, and more preferably less 3.0%, very particularly preferably less than 2.0%, even more preferably less than 1.0%, advantageously less than 0.5%, in particular less than 0.1%.
  • Nucleic acid are at least partially desorbed.
  • the amount of nucleic acid desorbable in this way is preferably greater than 10.0%, preferably greater than 20.0%, advantageously greater than 30.0%, particularly preferably greater than 40.0%. , suitably greater than 50.0%, very preferably greater than 60.0%, even more preferably greater than 70.0%, advantageously greater than 80.0%, in particular greater than 90.0%.
  • aragonitic calcium carbonate particles are used for adsorption of the biomolecules. These can adsorb both nucleic acids, in particular DNA, and proteins to a greater extent. A desorption of
  • Nucleic acids in particular DNA, at a pH of less than 7.0, preferably less than 6.5, in particular less than or equal to 6.0, are possible.
  • desorption of the proteins can only be achieved with dissolution of the calcium carbonate carrier at a pH of less than 5.0, preferably less than 4.5, in particular less than or equal to 4.0.
  • aragonitic calcium carbonate particles i. aragonitic calcium carbonate particles, ii. the at least one protein is at least partially adsorbed to the calcium carbonate particles,
  • the calcium carbonate particles at a pH less than 7.0, preferably less than 6.5, in particular less than or equal to 6.0, and expediently greater than 4.0, preferably greater than 4.5, in particular greater than 5.0, separated off and
  • step d. after step d. from the residue of the aqueous solution, the at least one nucleic acid isolated.
  • the amount of adsorbed protein (s), based on the amount of protein (s) originally present in the solution, is preferably greater than 10.0%, preferably greater than 20.0%, advantageously greater than 30.0%, particularly preferably greater than 40 , 0%, expediently greater than 50.0%, very particularly preferably greater than 60.0%, even more preferably greater than 70.0%, advantageously greater than 80.0%, in particular greater than 90.0%.
  • the amount of nucleic acid (s) adsorbed on the separated calcium carbonate particles based on the amount of nucleic acid (s) originally present in the solution is preferably less than 10.0%, preferably less than 8.0%, desirably less 6.0%, more preferably less than 4.0%,
  • This variant of the present invention is advantageous in particular for nucleic acid examinations, in particular for DNA examinations, for example in paternity tests, since the presence of significant amounts of proteins in the substance to be investigated frequently falsifies the results.
  • the at least one protein can be at least partially desorbed again.
  • the amount of protein (s) desorbable in this way is preferably greater than 10.0%, preferably greater than 20.0%, advantageously greater than 30.0%, especially preferably greater than 40.0%, advantageously greater than 50.0%, very preferably greater than 60.0%, even more preferably greater than 70.0%, advantageously greater than 80.0%, in particular greater than 90.0%.
  • the present invention will be further illustrated by several examples, without thereby restricting the
  • FTIR Infrared spectroscopy
  • SEM Scanning electron micrographs
  • AAS Atomic adsorption spectroscopy
  • CE Instruments CE Instruments
  • All elemental analyzes were performed in our DIN EN ISO / IEC 17025: 2005 certified laboratory for microanalytics.
  • the specific surface area (BET) was determined on a Micromeritics Gemini 2360 analyzer.
  • FIG. 1 shows SEM images of some calcium carbonate types from Table 1 (C3, C6, C7:
  • calcite A. aragonite
  • All analyzes gave the expected results for phase-pure calcite.
  • the aragonite phase contained small traces of calcite. These were in all cases materials with a high specific surface area, due to a small particle size ( ⁇ 1 pm).
  • the model biomolecules BSA and DNA were dissolved in distilled water and added to an aqueous dispersion of the appropriate calcium carbonate phase to obtain the desired concentration of biomolecules.
  • the dispersion was stirred at the chosen temperature for 24 h, since the strong sedimentation of the unfunctionalized particles no stable dispersion was formed and so the mixing should be improved. Subsequently, the solid was centrifuged for 10 minutes at 2540 g and the
  • the concentration of biomolecules was determined before and after each experiment by UV spectroscopy. The difference between the two values corresponds to the adsorbed amount.
  • Table 2 shows the results of the adsorption experiments. DNA adsorbed well on calcite and aragonite, while BSA adsorbed only on aragonite on a larger scale. The temperature increase to 37 ° C resulted in a significantly larger amount of adsorbed BSA. Because of this, all were
  • FITC-BSA After centrifuging the calcium carbonate together with adsorbate followed by redispersion in water, no desorption of FITC-BSA from the aragonite sample could be detected. At pH values between 6 and 10, no desorption of the protein occurred at any of the selected temperatures. Accordingly, FITC-BSA is very strongly bound to the surface of aragonite under these conditions and can only be released under dissolution of the carrier calcium carbonate at a pH of less than 4.
  • Table 1 morphology, polymorphic phase and specific surface area of the calcium carbonates used
  • CaCO 3 adsorbs adsorbed adsorbs desorption desorption molecule

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von gefälltem Calciumcarbonat-Teilchen mit einer kugeläquivalenten Teilchengröße größer 10,0 nm zur Adsorption von Biomolekülen, insbesondere Proteinen und/oder DNA, mit einem Molekulargewicht größer 1.000 g/mol sowie mit mindestens einer Amidgruppe und/oder mindestens einer Amidingruppe.

Description

Adsorption von Biomolekülen an Calciumcarbonat
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen, insbesondere von Proteinen, wie Bovinem
Serumalbumin (BSA), und Nukleinsäuren, wie DNA.
Calciumcarbonat kommt in verschiedenen polymorphen Phasen vor, wobei Calcit und Aragonit die stabilsten und prominentesten Vertreter sind, die in zahlreichen technischen Anwendungen eingesetzt werden (siehe H. Nebel, M. Epple, Z.
Anorg. Allg. Chem. 2008, 634 (8), 1439. DOI: 10.1002/zaac.200800134). Wenig bis gar keine praktische Bedeutung haben hingegen die metastabilen Phasen Vaterit (siehe D. Kralj, L. Brecevic, A. E. Nielsen, J. Cryst. Growth 1990, 104 (4), 793. DOI: 10.1016/0022-0248(90)90104-S) und amorphes Calciumcarbonat (ACC; siehe C. Günther, A. Becker, G. Wolf, M. Epple, Z. Anorg. Allg. Chem. 2005, 631 (13-14), 2830. DOI: 10.1002/zaac.200500164), sowie die Hydratphasen Monohydrocalcit (Calciumcarbonat-Monohydrat; siehe H. Effenberger, Monatsh. Chem. 1981 , 112 (8-9), 899. DOI: 10.1007/BF00905061 ; M. Neumann, M. Epple, Eur. J. Inorg. Chem. 2007, (14), 1953. DOI: 10.1002/ejic.200601033) und Ikait (Calciumcarbonat-Hexahydrat; siehe E. E. Coleyshaw, G. Crump, W. P. Griffith, Spectrochim. Acta Part A 2003, 59 (10), 2231. DOI: 10.1016/S1386- 1425(03)00067-2; K. F. Hesse, H. Kueppers, E. Suess, Z. Kristallogr. 1983, 163 (3-4), 227. DOI: 10.1524/zkri.1983.163.3-4.227). Diese verschiedenen kristallinen Phasen weisen unterschiedliche Oberflächenenergien auf, wodurch die
Adsorption von Molekülen beeinflusst wird.
Es besteht die Möglichkeit, Calciumcarbonat in der Papierchromatographie zu verwenden. So können Tricarbonsäuren, Dicarbonsäuren, Aminosäuren und Nukleotide voneinander getrennt werden (siehe H. S. Rathore, S. K. Sharma, K. Kumari, Anal. Lett. 1981 , 14 (16), 1327. DOI: 10.1080/00032718108081462; U. Lehmann, BioSystems 1985, 17 (3), 193. DOI: 10.1016/0303-2647(85)90074-7). Die selektive Trennung von L- und D-Aminosäuren an Calcit ist ebenfalls möglich. Dabei konnte an natürlich vorkommendem Calcit eine signifikante Adsorption und chirale Selektivität von D-und L-Enantiomeren an bestimmten Kristallflächen des Calcits beobachtet werden (siehe R. M. Hazen, T. R. Filley, G. A. Goodfriend, Proc. Natl. Acad. Sei. Uni. States A. 2001 , 98 (10), 5487. DOI:
10.1073ypnas.101085998). Die Adsorption von Benzoesäure an synthetischem Calcit, der in Cyclohexan dispergiert wurde, konnte bereits nachgewiesen werden (siehe L. Madsen, C. Gron, I. Lind, J. Engeil, J. Colloid Interface Sei. 1998, 205 (1), 53. DOI: 10.1006/jcis.1998.5592; L. Madsen, L. Grahl-Madsen, C. Gron, I. Lind, J. Engeil, Org. Geochem. 1996, 24 (12), 1151. DOI: 10.1016/S0146-
BESTÄTIGUNGSKOPIE 6380(96)00096-4). Es ist darüber hinaus bekannt, dass DNA an verschiedene Mineraloberflächen adsorbiert werden kann (siehe M. Bezanilla, S. Manne, D. E. Laney, Y. L. Lyubchenko, H. G. Hansma, Langmuir 1995, 11 (2), 655. DOI:
10.1021/la00002a050), z.B. an Tonerde (siehe E. Paget, L. J. Monrozier, P.
Simonet, FEMS Microbiol. Lett. 1992, 97 (1-2), 31. DOI: 10.1016/0378- 1097(92)90359-V) und an Bodenproben (siehe M. G. Lorenz, W. Wackernagel, Appl. Environ. Microbiol. 1987, 53 (12), 2948. DOI: 0099-2240/87/122948- 05$02.00/0; A. Ogram, G. S. Sayler, D. Gustin, R. J. Lewis, Environ. Sei. Technol. 1988, 22 (8), 982. DOI: 10.1021/es00173a020). Die Adsorption von Bovinem Serumalbumin (BSA) an Hydroxylapatit (HAP; siehe D. T. H. Wassell, R. C. Hall, G. Embery, Biomaterials 1995, 16 (9), 697. DOI: 10.1016/0142-9612(95)99697-K; K. Kandori, M. Saito, T. Takebe, A. Yasukawa, T. Ishikawa, J. Colloid Interface Sei. 1995, 174 (1), 124. DOI: 10.1006/jcis.1995.1373) wurde ebenso untersucht, wie die Adsorption an Metalloxidoberflächen (siehe C. E. Giacomelli, M. J. Avena, C. P. De Pauli, J. Colloid Interface Sei. 1997, 188 (2), 387. DOI:
10.1006/jcis.1996.4750; S. Fukuzaki, H. Urano, K. Nagata, J. Ferment. Bioeng. 1996, 81 (2), 163. DOI: 10.1016/0922-338X(96)87596-9).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, sehr effektive Möglichkeiten zur Adsorption von Biomolekülen mit einem Molekulargewicht größer 1.000 g/mol sowie mit mindestens einer Amidgruppe und/oder mindestens einer Amidingruppe aufzuzeigen.
Insbesondere wurden möglichst effektive Lösungen gesucht, um solche
Biomoleküle zumindest teilweise abtrennen, immobilisieren, gewinnen oder isolieren zu können. Dabei sollte sich die Abtrennung, Immobilisierung,
Gewinnung oder Isolierung der Biomoleküle auf möglichst einfache Art und Weise, schnell und kostengünstig realisieren lassen. Angestrebt wurden insbesondere Verfahren zur zumindest teilweisen Abtrennung, Immobilisierung, Gewinnung oder Isolierung von Proteinen und/oder Nukleinsäuren, wie DNA, sowie Möglichkeiten zur möglichst selektiven Abtrennung, Immobilisierung, Gewinnung oder Isolierung von Proteinen oder Nukleinsäuren aus Mischungen, die sowohl Proteine als auch Nukleinsäuren enthalten.
Gelöst werden diese Aufgaben durch die Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen gemäß dem vorliegenden Patentanspruch 1. Die auf Anspruch 1 rückbezogenen Unteransprüche beschreiben bevorzugte Varianten der vorliegenden Erfindung. Durch die Verwendung von gefälltem Calciumcarbonat-Teilchen mit einer kugeläquivalenten Teilchengröße größer 10,0 nm zur Adsorption von
Biomolekülen mit einem Molekulargewicht größer 1.000 g/mol sowie mit mindestens einer Amidgruppe und/oder mindestens einer Amidingruppe gelingt auf überraschende Art und Weise eine äußerst effektive Adsorption dieser Biomoleküle.
Die vorgeschlagene Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen erlaubt eine zumindest teilweise Abtrennung, Immobilisierung, Gewinnung oder Isolierung dieser Stoffe auf vergleichsweise einfache Art und Weise, schnell und kostengünstig. Dabei kann die erfindungsgemäße Lösung insbesondere zur zumindest teilweisen Abtrennung, Immobilisierung, Gewinnung oder Isolierung von Proteinen und/oder Nukleinsäuren, wie DNA, sowie zur vergleichsweise selektiven Abtrennung, Immobilisierung, Gewinnung oder Isolierung von Proteinen oder Nukleinsäuren aus Mischungen, die sowohl Proteine als auch Nukleinsäuren enthalten, genutzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen.
„Adsorption" bezeichnet die Anreicherung von Stoffen aus Gasen oder
Flüssigkeiten an der Oberfläche eines Festkörpers, allgemeiner an der
Grenzfläche zwischen zwei Phasen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt der Fokus insbesondere auf der Anreicherung der Biomoleküle aus Flüssigkeiten an der Oberfläche der Calciumcarbonat-Teilchen.
„Biomoleküle", auch Naturstoffe genannt, sind chemische Substanzen, die von Organismen gebildet werden, um biologische Funktionen zu erfüllen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung weisen die zu adsorbierenden
Biomoleküle ein Molekulargewicht größer 1.000 g/mol, bevorzugt größer 2.500 g/mol, zweckmäßigerweise größer 5.000 g/mol, günstigerweise größer 10.000 g/mol, insbesondere größer 20.000 g/mol, auf.
Sollten zusätzlich noch Biomoleküle mit einem kleineren Molekulargewicht vorliegen, so werden diese ggf. ebenfalls adsorbiert. Dies steht im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedoch nicht im Vordergrund.
Erfindungsgemäß umfassen die zu adsorbierenden Biomoleküle weiterhin mindestens eine Amidgruppe und/oder mindestens eine Amidingruppe, bevorzugt mindestens zwei, zweckmäßigerweise mindestens fünf, günstigerweise
mindestens zehn, insbesondere mindestens zwanzig Gruppen, bei denen es sich jeweils entweder um eine Amidgruppe oder um eine Amidingruppe handelt.
Die erfindungsgemäße Lösung eignet sich insbesondere für die Adsorption von Proteinen, wie Bovinem Serumalbumin (BSA), und Nukleinsäuren, insbesondere von Desoxyribonukleinsäure (DNA), vor allem von menschlicher DNA.
Zur Adsorption der Biomoleküle werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefällte Calciumcarbonat-Teilchen (PCC) eingesetzt. Gefällte Calciumcarbonat- Teilchen (PCC) bezeichnen synthetisch hergestellte Calciumcarbonat-Teilchen und sind von natürlich vorkommenden Calciumcarbonat zu unterscheiden.
Erfindungsgemäß ist die kugeläquivalente Teilchengröße der Calciumcarbonat- Teilchen größer 10,0 nm, bevorzugt größer 20,0 nm, insbesondere größer 30,0 nm.
Andererseits ist die kugeläquivalente Teilchengröße der Calciumcarbonat- Teilchen vorzugsweise kleiner 5,0 pm, bevorzugt kleiner 1 ,0 pm, besonders bevorzugt kleiner 500,0 nm, vorteilhafterweise kleiner 250,0 nm, insbesondere kleiner 100,0 nm.
Ganz besonders bevorzugt liegt die kugeläquivalente Teilchengröße der
Calciumcarbonat-Teilchen im Bereich von größer 10,0 nm bis kleiner 5,0 μητι, vorteilhafterweise im Bereich von größer 10,0 nm bis kleiner 1 ,0 pm, bevorzugt im Bereich von größer 10,0 nm bis kleiner 500,0 nm, günstigerweise im Bereich von größer 20,0 nm bis kleiner 250,0 nm, insbesondere im Bereich von größer 30,0 nm bis kleiner 100,0 nm.
Die kugeläquivalente Teilchengröße der Calciumcarbonat-Teilchen wird im
Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise mittels der folgenden Formel ermittelt: kugeläquivalente Teilchengröße [pm] = 2,2 / spezifische Oberfläche [m2/g].
Eventuelle Unterschiede, die sich aufgrund unterschiedlicher Dichten
verschiedener Kristallmodifikationen ergeben können, werden der Einfachheit halber vorzugsweise nicht berücksichtigt. Die spezifische Oberfläche der Calciumcarbonat-Teilchen ist vorzugsweise größer 0,5 m /g, vorteilhafterweise größer 3,0 m2/g, bevorzugt größer 5,0 m2/g, besonders bevorzugt größer 10,0 m2/g, zweckmäßigerweise größer 15,0 m2/g, insbesondere größer 19,0 m2/g und liegt im Rahmen einer besonders bevorzugten
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung im Bereich von größer 3,0 m2/g bis 100,0 m2/g, bevorzugt im Bereich von größer 5,0 m2/g bis 50,0 m2/g, insbesondere im Bereich von größer 10,0 m2/g bis 30,0 m /g.
Die spezifische Oberfläche der gefällten Calciumcarbonat-Teilchen wird
zweckmäßigerweise durch Messung der Stickstoffadsorption unter Verwendung des BET Verfahrens ermittelt. Die Verwendung eines Micromeritics Gemini 2360 Analysers ist in diesem Zusammenhang besonders vorteilhaft. Jede Probe wird vorzugsweise für die Adsorptionsmessungen bei 130°C für mindestens 3 h entgast. Die Verwendung eines FlowPrep 060 Degaser ist dabei besonders günstig.
Die Morphologie des Calciumcarbonats kann an sich frei gewählt werden.
Kristalline Modifikationen, insbesondere calcitische und aragonitische
Modifikationen, werden jedoch bevorzugt.
„Kristalline Modifikationen" bezeichnen an dieser Stelle solche Calciumcarbonat- Modifikationen, bei welchen die Atome zumindest teilweise eine geordnete
Struktur ausbilden und daher sowohl über eine Nahordnung, als auch über eine Fernordnung verfügen. Im Rahmen dieser bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung wird die Gegenwart von amorphen Bestandteilen jedoch nicht kategorisch ausgeschlossen. Bevorzugt ist der Anteil von kristallinen
Calciumcarbonat-Modifikationen jedoch größer 50 Gew.-%, besonders bevorzugt größer 70 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt größer 85 Gew.-%, insbesondere größer 90 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des
Calciumcarbonats.
„Calcitische" Modifikationen umfassen vorzugsweise mehr als 50 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 70 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt mehr als 85 Gew.-%, insbesondere mehr als 90 Gew.-%, Calcit, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des Calciumcarbonats.
.Aragonitische" Modifikationen umfassen vorzugsweise mehr als 30 Gew.-%, günstigerweise mehr als 50 Gew.-%, besonders bevorzugt mehr als 70 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt mehr als 85 Gew.-%, insbesondere mehr als 90 Gew - %, Aragonit, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des Calciumcarbonats. Für die Ermittlung der jeweiligen kristallinen Anteile hat sich die Röntgenbeugung mit einem internen Standard, vorzugsweise Quarz, in Verbindung mit einer
Rietveld-Verfeinerung ganz besonders bewährt.
Die Form der Calciumcarbonat-Teilchen unterliegt keinen besonderen
Beschränkungen. Besonders bevorzugt werden jedoch rhomboedrische, plättchenförmige, skalenoedrischen und nadeiförmige Teilchen.
Gemäß einer ersten besonders bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung ist das Aspekt Ratio (Seitenverhältnis) der Calciumcarbonat-Partikel größer 5,0, bevorzugt größer 6,0, besonders bevorzugt größer 7,0, günstigerweise größer 8,0, noch mehr bevorzugt größer 9,0, insbesondere größer 10,0.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Variante der vorliegenden
Erfindung ist das Aspekt Ratio (Seitenverhältnis) der Calciumcarbonat-Partikel kleiner 5,0, bevorzugt kleiner 4,0, besonders bevorzugt kleiner 3,0, günstigerweise kleiner 2,0, noch mehr bevorzugt kleiner 1 ,5, insbesondere kleiner 1 ,1.
Das„Aspekt Ratio" (Seitenverhältnis) der Calciumcarbonat-Partikel bezeichnet in diesem Zusammenhang den Quotienten aus maximalem und minimalem
Teilchendurchmesser, wobei zweckmäßigerweise die Größe der Einzelkristalle untersucht wird. Kristallaggregate, d.h. Anhäufungen von vielen dicht aufeinander gedrängten Kristall-Individuen werden zweckmäßigerweise nicht berücksichtigt.
Das Aspekt Ratio wird vorzugsweise mittels elektronenmikroskopischer
Aufnahmen als Mittelwert (Zahlenmittel) ermittelt. In diesem Zusammenhang werden vorzugsweise nur Teilchen mit einer Teilchengröße (längste Ausdehnung) im Bereich von 0,1 pm bis 10,0 pm berücksichtigt.
Ganz besonders vorteilhaft ist die Verwendung von aragonitischen
Calciumcarbonat-Teilchen, insbesondere von nadeiförmigen, aragonitischen Calciumcarbonat-Teilchen.
Das Aspekt Ratio (Seitenverhältnis) dieser Calciumcarbonat-Partikel ist
vorzugsweise größer 5,0, bevorzugt größer 6,0, besonders bevorzugt größer 7,0, günstigerweise größer 8,0, noch mehr bevorzugt größer 9,0, insbesondere größer 10,0. Weiterhin sind die Calciumcarbonat-Partikel vorzugsweise mindestens 0,2 pm, bevorzugt mindestens 0,5 pm, insbesondere mindestens 0,8 pm, lang und vorzugsweise höchstens 0,12 pm, bevorzugt höchstens 0,10 pm, insbesondere höchstens 0,08 pm, dick. Darüber hinaus weisen vorzugsweise mindestens 90 %, günstigerweise mindestens 95 % aller Teilchen, ein Aspekt Ratio (Seitenverhältnis) größer 5,0, bevorzugt größer 6,0, besonders bevorzugt größer 7,0, günstigerweise größer 8,0, noch mehr bevorzugt größer 9,0, insbesondere größer 10,0, auf.
Weiterhin hat sich der Einsatz von calcitischen Calciumcarbonat-Teilchen, insbesondere von Calciumcarbonat-Teilchen mit einem Aspekt Ratio kleiner 5,0, bevorzugt kleiner 4,0, besonders bevorzugt kleiner 3,0, günstigerweise kleiner 2,0, noch mehr bevorzugt kleiner 1 ,5, insbesondere kleiner 1 ,1 , besonders bewährt.
Die vorstehend genannten gefällten Calciumcarbonat-Teilchen können auf an sich bekannte Weise hergestellt werden. Üblicherweise werden sie durch ein
Carbonatisierungs-Verfahren erhalten, bei welchem man ein Kohlendioxid-haltiges Gas durch eine wässrige Lösung von Calciumhydroxid oder Kalkmilch in einem Carbonatisierungsreaktor leitet. Andere anorganische Materialien, wie Alaun, können mit dem PCC ggf. co-ausgefällt oder auf die Oberfläche der Teilchen ausgefällt werden. Beispielsweise beschreibt US 5,783,038 ein besonderes Verfahren zur Herstellung von PCC-Teilchen, obwohl Abwandlungen im konkreten Syntheseweg, optionale Additive oder Agenzien, andere Verfahrensbedingungen und physikalische und chemische Behandlungsverfahren nach der Fällung genutzt werden können, um die Partikelgröße, die Morphologie oder die Art der Calciumcarbonat-Teilchen zu verändern. Gefällte Calciumcarbonat-Teilchen (PCC) unterscheiden sich deutlich von gemahlenem Calciumcarbonat in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften.
Mögliche Einsatzgebiete der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann unmittelbar offensichtlich. Sie eignet sich insbesondere für alle Anwendungen, bei welchen Biomoleküle der zuvor beschriebenen Art immobilisiert oder zumindest teilweise abgetrennt oder aufgereinigt werden müssen. Besonders vorteilhaft ist sie für die zumindest teilweise Trennung einer Mischung, enthaltend mindestens ein Protein, bevorzugt mindestens ein menschliches Protein; und mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt DNA, besonders bevorzugt menschliche DNA.
Die Adsorption der Biomoleküle erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von größer 0°C bis kleiner 100°C, bevorzugt im Bereich von 1°C bis 50°C, insbesondere im Bereich von 2°C bis 40°C. Im Rahmen einer ersten ganz besonders bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt die Adsorption der Biomoleküle bei einer Temperatur im Bereich von 3°C bis kleiner 20°C, insbesondere im Bereich von 3,5°C bis 15°C. Im Rahmen einer weiteren ganz besonders bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt die Adsorption der Biomoleküle bei einer Temperatur im Bereich von 20°C bis kleiner 30°C, insbesondere im Bereich von 22°C bis 27°C. Im Rahmen noch einer weiteren ganz besonders bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt die Adsorption der Biomoleküle bei einer Temperatur im Bereich von 30°C bis kleiner 50°C, insbesondere im Bereich Von 35°C bis 40°C.
Die Adsorption der Biomoleküle erfolgt bevorzugt aus einer wässrigen Lösung. Die Konzentration der Biomoleküle liegt dabei vorzugsweise im Bereich von 0,01 g/l bis 10,0 g/l, bevorzugt im Bereich von 0,05 g/l bis 5,0 g/l, insbesondere im Bereich von 0,075 g/l bis 2,5 g/l, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der wässrigen Lösung.
Bei Mischungen, enthaltend mindestens ein Protein, bevorzugt mindestens ein menschliches Protein; und mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt DNA, besonders bevorzugt menschliche DNA, liegt das Gewichtsverhältnis des mindestens einen Proteins zu der mindestens einen Nukleinsäure vorzugsweise im Bereich von 1 :99 bis 99:1 , bevorzugt im Bereich von 1 :50 bis 50:1 ,
insbesondere im Bereich von 1 :25 bis 25:1.
Die Einsatzmenge der gefällten Caiciumcarbonat-Teilchen liegt vorzugsweise im Bereich von 1 Gew.-Teil bis 100000 Gew.-Teile, bevorzugt im Bereich von 50 Gew.-Teile bis 25000 Gew.-Teile, insbesondere im Bereich von 400 Gew.-Teile bis 7500 Gew.-Teile, jeweils bezogen auf 100 Gew.-Teile Biomoleküle.
Die Menge an adsorbierten Biomolekül(en), bezogen auf die ursprünglich vorgelegte Menge an Biomolekül(en), ist vorzugsweise größer 10,0 %, bevorzugt größer 20,0 %, günstigerweise größer 30,0 %, besonders bevorzugt größer 40,0 %, zweckmäßigerweise größer 50,0 %, ganz besonders bevorzugt größer 60,0 %, noch mehr bevorzugt größer 70,0 %, vorteilhafterweise größer 80,0 %,
insbesondere größer 90,0 %.
Erfindungsgemäß hat sich eine Vorgehensweise als ganz besonders vorteilhaft erwiesen, bei welcher man
a. eine wässrige Lösung, enthaltend mindestens ein Protein und mindestens eine Nukleinsäure, insbesondere DNA, vorlegt,
b. die Lösung aus Schritt a. mit den gefällten Caiciumcarbonat-Teilchen mit einer kugeläquivalenten Teilchengröße größer 10,0 nm kontaktiert,
c. die Biomoleküle teilweise an die gefällten Caiciumcarbonat-Teilchen adsorbiert und d. die Caiciumcarbonat-Teilchen mit den adsorbierten Biomolekülen anschließend wieder abtrennt.
Auf diese Weise gelingt es das oder die gewünschten Biomoleküle entweder im Rückstand der wässrigen Lösung oder auf den Caiciumcarbonat-Teilchen adsorbiert relativ rein zu erhalten. Die vorstehende Vorgehensweise kann daher dazu genutzt werden, das oder die gewünschten Biomoleküle zumindest teilweise abzutrennen, zu immobilisieren, zu gewinnen und/oder zu isolieren.
Im Rahmen einer besonders bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung werden calcitische Caiciumcarbonat-Teilchen zur Adsorption der Biomoleküle eingesetzt. Diese können Nukleinsäuren, insbesondere DNA, jedoch keine
Proteine in größerem Umfang adsorbieren. Eine Desorption der Nukleinsäuren, insbesondere der DNA, bei einem pH kleiner 7,0, bevorzugt kleiner 6,5, insbesondere kleiner gleich 6,0, ist dabei möglich.
Der pH-Wert bezeichnet bekannterweise den negativen dekadischen Logarithmus der Wasserstoffionen-Aktivität. Für weitere Details wird auf die gängige
Fachliteratur, insbesondere auf Römpp-Lexikon Chemie / Hrsg.: Jürgen Falbe; Manfred Regitz. Bearb. von Eckard Amelingmeier, Stuttgart, New York, Thieme, Band 4. M-Pk, 10. Auflage, 1998, Stichwort„pH", sowie auf die Norm DIN
19260:1971-03 verwiesen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfolgt die Messung des pH-Werts vorzugsweise bei der Temperatur, bei welcher der jeweilige Verfahrensschritt durchgeführt wird. Alternativ hat sich eine Messung des pH-Werts bei einer einheitlichen Temperatur, insbesondere bei 25°C, besonders bewährt.
Erfindungsgemäß ist die Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen im Rahmen eines Verfahrens besonders vorteilhaft, bei welchem man
i. calcitische Caiciumcarbonat-Teilchen einsetzt,
ii. die Lösung aus Schritt a. bei einem pH größer 7,0, bevorzugt größer 7,5, insbesondere im Bereich von 7,5 bis 10,0, mit den Caiciumcarbonat-Teilchen kontaktiert,
iii. die mindestens eine Nukleinsäure zumindest teilweise an die Caiciumcarbonat- Teilchen adsorbiert und
iv. nach dem Schritt d. aus dem Rückstand der wässrigen Lösung das mindestens eine Protein zumindest teilweise isoliert. Die Menge an adsorbierter Nukleinsäure, bezogen auf die ursprünglich in der Lösung vorliegende Menge an Nukleinsäure, ist in diesem Zusammenhang vorzugsweise größer 10,0 %, bevorzugt größer 20,0 %, günstigerweise größer 30,0 %, besonders bevorzugt größer 40,0 %, zweckmäßigerweise größer 50,0 %, ganz besonders bevorzugt größer 60,0 %, noch mehr bevorzugt größer 70,0 %, vorteilhafterweise größer 80,0 %, insbesondere größer 90,0 %.
Die Menge an adsorbiertem Protein, bezogen auf die ursprünglich in der Lösung vorliegende Menge an Protein, ist vorzugsweise kleiner 10,0 %, bevorzugt kleiner 8,0 %, günstigerweise kleiner 6,0 %, besonders bevorzugt kleiner 4,0 %, zweckmäßigerweise kleiner 3,0 %, ganz besonders bevorzugt kleiner 2,0 %, noch mehr bevorzugt kleiner 1 ,0 %, vorteilhafterweise kleiner 0,5 %, insbesondere kleiner 0,1 %.
Durch Behandlung der abgetrennten Calciumcarbonat-Teilchen mit einer wässrigen Zusammensetzung, die einen pH-Wert kleiner 7,0, bevorzugt kleiner 6,5, insbesondere kleiner gleich 6,0, aufweist, kann die mindestens eine
Nukleinsäure zumindest teilweise wieder desorbiert werden.
Die Menge an auf diese Weise desorbierbarer Nukleinsäure, bezogen auf die ursprünglich in der Lösung vorliegende Menge an Nukleinsäure, ist vorzugsweise größer 10,0 %, bevorzugt größer 20,0 %, günstigerweise größer 30,0 %, besonders bevorzugt größer 40,0 %, zweckmäßigerweise größer 50,0 %, ganz besonders bevorzugt größer 60,0 %, noch mehr bevorzugt größer 70,0 %, vorteilhafterweise größer 80,0 %, insbesondere größer 90,0 %.
Im Rahmen einer weiteren besonders bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung werden aragonitische Calciumcarbonat-Teilchen zur Adsorption der Biomoleküle eingesetzt. Diese können sowohl Nukleinsäuren, insbesondere DNA, als auch Proteine in größerem Umfang adsorbieren. Eine Desorption der
Nukleinsäuren, insbesondere der DNA, bei einem pH kleiner 7,0, bevorzugt kleiner 6,5, insbesondere kleiner gleich 6,0, ist dabei möglich. Eine Desorption der Proteine kann hingegen nur unter Auflösung des Calciumcarbonatträgers bei einem pH kleiner 5,0, bevorzugt kleiner 4,5, insbesondere kleiner gleich 4,0, erreicht werden.
Vor diesem Hintergrund hat sich die Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen im Rahmen eines Verfahrens besonders bewährt, bei welchem man
i. aragonitische Calciumcarbonat-Teilchen einsetzt, ii. das mindestens eine Protein zumindest teilweise an die Calciumcarbonat- Teilchen adsorbiert,
iii. die Calciumcarbonat-Teilchen bei einem pH kleiner 7,0, bevorzugt kleiner 6,5, insbesondere kleiner gleich 6,0, und zweckmäßigerweise größer 4,0, bevorzugt größer 4,5, insbesondere größer 5,0, abtrennt und
iv. nach dem Schritt d. aus dem Rückstand der wässrigen Lösung die mindestens eine Nukleinsäure isoliert.
Die Menge an adsorbierten Protein(en), bezogen auf die ursprünglich in der Lösung vorliegende Menge an Protein(en), ist vorzugsweise größer 10,0 %, bevorzugt größer 20,0 %, günstigerweise größer 30,0 %, besonders bevorzugt größer 40,0 %, zweckmäßigerweise größer 50,0 %, ganz besonders bevorzugt größer 60,0 %, noch mehr bevorzugt größer 70,0 %, vorteilhafterweise größer 80,0 %, insbesondere größer 90,0 %.
Die Menge an Nukleinsäure(n), die an den abgetrennten Calciumcarbonat- Teilchen adsorbiert sind, bezogen auf die ursprünglich in der Lösung vorliegende Menge an Nukleinsäure(n), ist vorzugsweise kleiner 10,0 %, bevorzugt kleiner 8,0 %, günstigerweise kleiner 6,0 %, besonders bevorzugt kleiner 4,0 %,
zweckmäßigerweise kleiner 3,0 %, ganz besonders bevorzugt kleiner 2,0 %, noch mehr bevorzugt kleiner 1 ,0 %, vorteilhafterweise kleiner 0,5 %, insbesondere kleiner 0,1 %.
Diese Variante der vorliegenden Erfindung ist insbesondere für Nukleinsäure- Untersuchungen, insbesondere für DNA-Untersuchungen, wie beispielsweise bei Vaterschaftstests, vorteilhaft, da bei der Anwesenheit von signifikanten Mengen an Proteinen in der zur untersuchenden Substanz die Ergebnisse häufig verfälscht werden.
Durch Behandlung der abgetrennten Calciumcarbonat-Teilchen mit einer wässrigen Zusammensetzung, die einen pH-Wert kleiner 5,0, bevorzugt kleiner 4,5, insbesondere kleiner gleich 4,0, aufweist, kann das mindestens eine Protein zumindest teilweise wieder desorbiert werden.
Die Menge an auf diese Weise desorbierbaren Protein(en), bezogen auf die ursprünglich in der Lösung vorliegende Menge an Protein(en), ist vorzugsweise größer 10,0 %, bevorzugt größer 20,0 %, günstigerweise größer 30,0 %, besonders bevorzugt größer 40,0 %, zweckmäßigerweise größer 50,0 %, ganz besonders bevorzugt größer 60,0 %, noch mehr bevorzugt größer 70,0 %, vorteilhafterweise größer 80,0 %, insbesondere größer 90,0 %. Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung durch mehrere Beispiele weiter veranschaulicht, ohne dass hierdurch eine Beschränkung des
Erfindungsgedankens erfolgen soll.
Pulverdiffraktogramme (XRD) wurden an einem Bruker D 8 Advance (Cu Ka- Strahlung, λ=1.54 A) Diffraktometer aufgenommen. Fourier-transformierte
Infrarotspektroskopie (FTIR) wurde mit einem Jasco FT/IR-430-Spektrometer durchgeführt. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen (REM) erfolgten an einem ESEM Quanta 400 FEG Mikroskop von FEI im Hochvakuum an mit Gold- Palladium bedampften Proben. Für die UV-Spektroskopie wurde ein Varian Cary WinUV-300-Bio-Spektrometer eingesetzt. Calcium wurde durch
Atomadsorptionsspektroskopie (AAS) an einem Gerät des Typs Thermo Electron Corporation, M-Series bestimmt. Kohlenstoff und Wasserstoffgehalte wurden durch Standardverbrennungsanalyse mit einem EA 1110 Gerät (CE Instruments) bestimmt. Alle Elementaranalysen wurden in unserem nach DIN EN ISO/IEC 17025:2005 zertifiziertem Labor für Mikroanalytik durchgeführt. Die Bestimmung der spezifischen Oberfläche (BET) erfolgte an einem Micromeritics Gemini 2360 Analyser.
Alle verwendeten Chemikalien wurden von Sigma Aldrich bezogen und ohne weitere Behandlung verwendet.
Für die Quantifizierung mittels UV-Spektroskopie wurde das Adsorptionsmaximum bei 496 nm für FITC-markiertes BSA (FITC: Fluoresceinisothiocyanat) und bei 260/280 nm für DNA nach gängigen Standardprotokollen verwendet. Bei den untersuchten Calciumcarbonaten handelte es ich um marktübliche Typen.
Alle Proben wurden ausführlich mit Rasterelektronenmikroskopie,
Elementaranalyse (Ca, C, H), Infrarotspektroskopie, Röntgenbeugung und BET- Adsorption charakterisiert. Die verschiedenen Calcitphasen wiesen
unterschiedliche Größen und Morphologien auf (siehe Tabelle 1). Fig. 1 zeigt REM-Aufnahmen einiger Calciumcarbonattypen aus Tabelle 1 (C3, C6, C7:
Calcitphasen; A. Aragonit). Alle Analysen ergaben die erwarteten Ergebnisse für phasenreinen Calcit. Die Aragonitphase enthielt geringe Spuren von Calcit. Es handelte sich in allen Fällen um Materialien mit hoher spezifischer Oberfläche, bedingt durch eine kleine Partikelgröße (< 1 pm).
Die Modell-Biomoleküle BSA und DNA wurden in destilliertem Wasser gelöst und zu einer wässrigen Dispersion der entsprechenden Calciumcarbonatphase gegeben, um die gewünschte Konzentration der Biomoleküle zu erhalten. Der pH- Wert der Mischung wurde zuvor mit Kaliumhydroxid auf 8 eingestellt (c=2 mol Γ1). Die Dispersion wurde bei der gewählten Temperatur für 24 h gerührt, da durch die starke Sedimentation der unfunktionalisierten Partikel keine stabile Dispersion gebildet wurde und so die Durchmischung verbessert werden sollte. Im Anschluss daran wurde der Feststoff 10 Minuten bei 2540 g abzentrifugiert und der
Überstand analysiert. Es wurden jeweils 0,1 g Calciumcarbonat in 20 ml einer wässrigen Lösung der Biomoleküle mit Konzentrationen von 0,8 bis 0,1 g 1 bei 25°C oder 37°C dispergiert.
Zur Desorption wurden die abzentrifugierten Feststoffe der vorangegangenen Adsorptionsexperimente in jeweils 20 ml Reinstwasser bei pH = 8 und pH = 6 und Temperaturen von 4°C, 25°C und 37°C für 24 h redispergiert. Die Konzentration der Biomoleküle wurde vor und nach jedem Experiment mittels UV-Spektroskopie bestimmt. Die Differenz beider Werte entspricht der adsorbierten Menge.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Adsorptionsexperimente. DNA adsorbierte gut an Calcit und Aragonit, während BSA in größerem Umfang nur an Aragonit adsorbierte. Die Temperaturerhöhung auf 37°C führte zu einer deutlich größeren Menge von adsorbiertem BSA. Aus diesem Grund wurden alle
Adsorptionsexperimente mit BSA bei dieser Temperatur durchgeführt. Die
Temperatur hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Adsorption von DNA.
Bei Verwendung einer Mischung von DNA und BSA wurden vergleichbare
Ergebnisse erzielt (siehe Tabelle 3). BSA adsorbierte deutlich schlechter an Calcit, während DNA an allen Calciumcarbonat-Substraten adsorbierte.
Nach dem Abzentrifugieren des Calciumcarbonats nebst Adsorbat, gefolgt von einer Redispersion in Wasser, konnte keine Desorption von FITC-BSA von der Aragonitprobe nachgewiesen werden. Bei pH-Werten zwischen 6 und 10 erfolgte bei keiner der gewählten Temperaturen eine Desorption des Proteins. FITC-BSA ist demnach unter diesen Bedingungen sehr stark an die Oberfläche von Aragonit gebunden und kann nur unter Auflösung des Trägers Calciumcarbonat bei einem pH-Wert von kleiner als 4 freigesetzt werden.
Im Gegensatz dazu konnte DNA bei 25°C wieder von der
Calciumcarbonatoberfläche entfernt werden. Bei einem pH-Wert von 8 war nur eine geringe Desorption der DNA zu erkennen, aber bei einem pH-Wert von 6 erfolgte eine nahezu quantitative Desorption der gebundenen DNA. Eine erneute Dispersion in frischem Wasser mit einem pH-Wert von 6 ergab keine Desorption von DNA mehr, d.h. die letzten 10 % bis 20 % der adsorbierten DNA sind offenbar 1
unter diesen Bedingungen irreversibel adsorbiert. Wie im Fall von FITC-BSA, führt auch hier eine vollständige Auflösung des Calciumcarbonats bei pH-Werten unterhalb von 4 zur vollständigen Freisetzung der DNA.
Tabelle 1 : Morphologie, polymorphe Phase und spezifische Oberfläche der eingesetzten Calciumcarbonate,
Spezifische Oberfläche
CaC03 Phase des Substrats
(B.E.T) / m2 g"
C1 Calcit, rhomboedrisch 26,0
C2 Calcit, rhomboedrisch 29,2
C3 Calcit, rhomboedrisch 34,6
C4 Calcit, rhomboedrisch 11 ,0
C5 Calcit, rhomboedrisch 54,5
C6 Calcit, plättchenförmig 18,2
C7 Calcit, skalenoedrisch 8,1
A Aragonit, nadeiförmig 10,2
Tabelle 2: Ergebnisse der Adsorptionsexperimente mit DNA (25°C) und BSA
(37°C) an verschiedenen Caiciumcarbonat-Proben bei pH 8.
c adsorbiert / c adsorbiert / g c adsorbiert / g
CaC03 Biomolekül
% mg m"2
DNA 88,05 17,6 6,77-10-4
C1 , Calcit
BSA 2,2 0,5 1.92-10"5
DNA 97,57 19,5 6.68-10-4
C2, Calcit
BSA 7,6 1 ,5 5.14-10-5
DNA 97,13 19,4 5,61 -10"4
C3, Calcit
BSA 4,5 0,9 2,60- 10'5
DNA 82,35 16,5 1 ,50-10"3
C4, Calcit
BSA 0 0 0
DNA 96,92 19,4 3.56-10-4
C5, Calcit
BSA 6,4 1 ,3 2,39-10"5
DNA 39, 19 7,8 4.29-10"4
C6, Calcit
BSA 4 0,8 4,40- 10-5
DNA 23,51 4,7 5,80- 10-4
C7, Calcit
BSA 1 ,8 0,4 4,94- 10"5
A, DNA 89,47 17,9 1.75-10"3
Aragonit BSA 61 ,9 12,4 1.22-10-3
Tabelle 3: Adsorption einer 1 :1 Mischung von DNA und FITC-BSA aus wässriger Lösung bei pH 8. Die Adsorption an Caicit (C1-C7) erfolgte bei 25°C, die
Adsorption an Aragonit (A) bei 37°C. Anschließende Desorption bei pH 6.
c c c c nach c nach
Bio¬
CaCO3 adsorbiert adsorbiert adsorbiert Desorption Desorption molekül
/ % / pg mg"1 / g m"2 / % / Mg mg"1
C1 , DNA 88,8 17,8 6,85· IGT4 11 ,8 9,08- 10"5
Caicit
BSA 0 0 0 0 0
DNA 87,8 17,6 6,03- 10" 18,95 1.30-10"4
C2,
Caicit BSA 1 ,2 0,2 6,85 1fJ6 0 0
C3, DNA 91 ,8 18,4 5,32· 10"4 37,99 2.20-10"4
Caicit BSA 6,7 1 ,3 3,76· 10'5 0 0
76,7
C4, DNA 15,4 1 ,40-1 er3 10,59 1 ,93 104
Caicit BSA 2 0,4 3,64- 10"5 0 0
DNA 90,1 18,0 3,30· 10"4 25,5 4,96· 10"4
C5,
Caicit BSA 2,3 0,5 9.17-10-6 0 0
C6, DNA 20,3 4,6 2,53- 10"4 10,47 9,36- 10"5
Caicit BSA 8 1 ,6 8,79· 10"5 0 0
C7, DNA 62,9 12,6 1.56-10"3 11 ,89 1 ,15 1ο"4
Caicit BSA 1 ,9 0,4 4,94· 10"5 0 0
A, AraDNA 88,6 17,72 1 ,74 10"3 25,31 2,94· 10"4 gonit BSA 53,4 10,68 1.05-10"3 0 0

Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass man gefällte Calciumcarbonat-Teilchen mit einer kugeläquivalenten Teilchengröße größer 10,0 nm zur Adsorption von
Biomolekülen mit einem Molekulargewicht größer 1.000 g/mol sowie mit mindestens einer Amidgruppe und/oder mindestens einer Amidingruppe einsetzt.
2. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man aragonitische
Calciumcarbonat-Teilchen einsetzt.
3. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man nadeiförmige, aragonitische Calciumcarbonat-Teilchen einsetzt.
4. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man calcitische Calciumcarbonat- Teilchen einsetzt.
5. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man calcitische Calciumcarbonat- Teilchen mit einem Aspekt Ration kleiner 5 einsetzt.
6. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man Calciumcarbonat-Teilchen mit einem Aspekt Ratio kleiner 1 ,5 einsetzt.
7. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man Proteine und/oder Nukleinsäuren, insbesondere DNA, adsorbiert.
8. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche im Rahmen eines
Verfahrens zur zumindest teilweisen Trennung einer Mischung, enthaltend mindestens ein Protein und mindestens eine Nukleinsäure, insbesondere DNA.
9. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen im Rahmen eines Verfahrens gemäß Anspruch 8, bei welchem man
a. eine wässrige Lösung, enthaltend mindestens ein Protein und mindestens eine Nukleinsäure, insbesondere DNA, vorlegt,
b. die Lösung aus Schritt a. mit den gefällten Calciumcarbonat-Teilchen mit einer kugeläquivalenten Teilchengröße größer 10,0 nm kontaktiert, c. die Biomoleküle teilweise an die gefällten Calciumcarbonat-Teilchen
adsorbiert und
d. die Calciumcarbonat-Teilchen mit den adsorbierten Biomolekülen
anschließend wieder abtrennt.
10. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen im
Rahmen eines Verfahrens gemäß Anspruch 9, bei welchem man
i. calcitische Calciumcarbonat-Teilchen einsetzt,
ii. die Lösung aus Schritt a. bei einem pH größer 7,0 mit den
Calciumcarbonat-Teilchen kontaktiert,
iii. die mindestens eine Nukleinsäure zumindest teilweise an die
Calciumcarbonat-Teilchen adsorbiert und
iv. nach dem Schritt d. aus dem Rückstand der wässrigen Lösung das
mindestens eine Protein isoliert.
11. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen im
Rahmen eines Verfahrens gemäß Anspruch 10, bei welchem man die abgetrennten Calciumcarbonat-Teilchen mit einer wässrigen
Zusammensetzung behandelt, die einen pH-Wert kleiner 7,0 aufweist, und so die mindestens eine Nukleinsäure zumindest teilweise wieder desorbiert.
12. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen im
Rahmen eines Verfahrens gemäß Anspruch 9, bei welchem man
i. aragonitische Calciumcarbonat-Teilchen einsetzt,
ii. das mindestens eine Protein zumindest teilweise an die Calciumcarbonat- Teilchen adsorbiert,
iii. die Calciumcarbonat-Teilchen bei einem pH kleiner 7,0 abtrennt und iv. nach dem Schritt d. aus dem Rückstand der wässrigen Lösung die
mindestens eine Nukleinsäure isoliert.
13. Verwendung von Calciumcarbonat zur Adsorption von Biomolekülen im
Rahmen eines Verfahrens gemäß Anspruch 12, bei welchem man die abgetrennten Calciumcarbonat-Teilchen mit einer wässrigen Zusammensetzung behandelt, die einen pH-Wert kleiner 5,0 aufweist, und so das mindestens eine Protein zumindest teilweise wieder desorbiert.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020173817A1 (en) * 2019-02-28 2020-09-03 Novozymes A/S Calcite binding proteins

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5783038A (en) 1995-03-17 1998-07-21 Minerals Technologies, Inc. Ink jet recording paper incorporating novel precipitated calcium carbonate pigment

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5783038A (en) 1995-03-17 1998-07-21 Minerals Technologies, Inc. Ink jet recording paper incorporating novel precipitated calcium carbonate pigment

Non-Patent Citations (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. OGRAM; G. S. SAYLER; D. GUSTIN; R. J. LEWIS, ENVIRON. SCI. TECHNOL., vol. 22, no. 8, 1988, pages 982
BEZANILLA M ET AL: "ADSORPTION OF DNA TO MICA, SILYLATED MICA AND MINERALS: CHARACTERIZATION BY ATOMIC FORCE MICROSCOPY", LANGMUIR, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, NEW YORK, NY; US, vol. 11, no. 2, 1 February 1995 (1995-02-01), pages 655 - 659, XP001065240, ISSN: 0743-7463, DOI: 10.1021/LA00002A050 *
C. E. GIACOMELLI; M. J. AVENA; C. P. DE PAULI, J. COLLOID INTERFACE SEI, vol. 188, no. 2, 1997, pages 387
C. GÜNTHER; A. BECKER; G. WOLF; M. EPPLE; Z. ANORG, ALLG.CHEM, vol. 631, no. 13-14, 2005, pages 2830
D. KRALJ; L. BRECEVIC; A. E. NIELSEN, J. CRYST. GROWTH, vol. 104, no. 4, 1990, pages 793
D. T. H. WASSELL; R. C. HALL; G. EMBERY, BIOMATERIALS, vol. 16, no. 9, 1995, pages 697
E. E. COLEYSHAW; G. CRUMP; W. P. GRIFFITH, SPECTROCHIM. ACTA PARTA, vol. 59, no. 10, 2003, pages 2231
E. PAGET; L. J. MONROZIER; P. SIMONET, FEMS MICROBIOL. LETT., vol. 97, no. 1-2, 1992, pages 31
FUJII A ET AL: "Cross-linked DNA capsules templated on porous calcium carbonate microparticles", COLLOIDS AND SURFACES. A, PHYSICACHEMICAL AND ENGINEERING ASPECTS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 356, no. 1-3, 5 March 2010 (2010-03-05), pages 126 - 133, XP026888204, ISSN: 0927-7757, [retrieved on 20100205], DOI: 10.1016/J.COLSURFA.2010.01.008 *
H. EFFENBERGER, MONATSH. CHERN, vol. 112, no. 8-9, 1981, pages 899
H. NEBEL; M. EPPLE; Z. ANORG, ALLG. CHEM, vol. 634, no. 8, 2008, pages 1439
H. S. RATHORE; S. K. SHARMA; K. KUMARI, ANAL LETT., vol. 14, no. 16, 1981, pages 1327
HELEN M. BURT ET AL: "Activation of Human Neutrophils by Calcium Carbonate Polymorphs", DIGESTIVE DISEASES AND SCIENCES, vol. 42, no. 6, 1 June 1997 (1997-06-01), pages 1283 - 1289, XP055054791, ISSN: 0163-2116, DOI: 10.1023/A:1018870511257 *
K. F. HESSE; H. KUEPPERS; E. SUESS, Z. KRISTALLOGR, vol. 163, no. 3-4, 1983, pages 227
K. KANDORI; M. SAITO; T. TAKEBE; A. YASUKAWA; T. ISHIKAWA, J. COLLOID INTERFACE SCI, vol. 174, no. 1, 1995, pages 124
L. MADSEN, C; GRØN, I; LIND, J, ENGELL, J. COLLOID INTERFACE SCI., vol. 205, no. 1, 1898, pages 53
L. MADSEN; L. GRAHL-MADSEN; C. GRØN; I. LIND; J. ENGELL, ORG. GEOCHEM., vol. 24, no. 12, 1996, pages 1151
M. BEZANILLA; S. MANNE; D. E. LANEY; Y. L. LYUBCHENKO; H. G. HANSMA, LANGMUIR, vol. 11, no. 2, 1995, pages 655
M. G. LORENZ; W. WACKERNAGEL, APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 53, no. 12, 1987, pages 2948
M. NEUMANN; M. EPPLE, EUR. J. INORG. CHEM., no. 14, 2007, pages 1953
PETROV ALEXANDER I ET AL: "Protein-calcium carbonate coprecipitation: a tool for protein encapsulation", BIOTECHNOLOGY PROGRESS, AMERICAN INSTITUTE OF CHEMICAL ENGINEERS, US, vol. 21, no. 3, 1 May 2005 (2005-05-01), pages 918 - 925, XP002475725, ISSN: 8756-7938, [retrieved on 20050426], DOI: 10.1021/BP0495825 *
R. M. HAZEN; T. R. FILLEY; G. A. GOODFRIEND, PROC. NATL. ACAD. SCI. UNI. STATES A, vol. 98, no. 10, 2001, pages 5487
S. FUKUZAKL; H. URANO; K. NAGATA, J. FERMENT. BIOENG, vol. 81, no. 2, 1996, pages 163
SHAN ET AL: "Development of amperometric biosensor for glucose based on a novel attractive enzyme immobilization matrix: Calcium carbonate nanoparticles", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, ELSEVIER BV, NL, vol. 22, no. 8, 2 February 2007 (2007-02-02), pages 1612 - 1617, XP005870753, ISSN: 0956-5663, DOI: 10.1016/J.BIOS.2006.07.019 *
U. LEHMANN, BIOSYSTEMS, vol. 17, no. 3, 1985, pages 193

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020173817A1 (en) * 2019-02-28 2020-09-03 Novozymes A/S Calcite binding proteins

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