WO2013053483A1 - Verfahren zur herstellung von kunststoffen enthaltend nukleinsäuren in komplexierter form - Google Patents

Verfahren zur herstellung von kunststoffen enthaltend nukleinsäuren in komplexierter form Download PDF

Info

Publication number
WO2013053483A1
WO2013053483A1 PCT/EP2012/004270 EP2012004270W WO2013053483A1 WO 2013053483 A1 WO2013053483 A1 WO 2013053483A1 EP 2012004270 W EP2012004270 W EP 2012004270W WO 2013053483 A1 WO2013053483 A1 WO 2013053483A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
plastic
nucleic acid
liquid
dna
complexes
Prior art date
Application number
PCT/EP2012/004270
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans Kosak
Marcus WEICHERT
Original Assignee
Secutech International Pte. Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Secutech International Pte. Ltd. filed Critical Secutech International Pte. Ltd.
Priority to EP12772238.7A priority Critical patent/EP2766057A1/de
Publication of WO2013053483A1 publication Critical patent/WO2013053483A1/de

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L17/00—Materials for surgical sutures or for ligaturing blood vessels ; Materials for prostheses or catheters
    • A61L17/005—Materials for surgical sutures or for ligaturing blood vessels ; Materials for prostheses or catheters containing a biologically active substance, e.g. a medicament or a biocide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
    • A61L29/08—Materials for coatings
    • A61L29/085—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
    • A61L29/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. lubricating compositions
    • A61L29/16—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/08—Materials for coatings
    • A61L31/10—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L31/16—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/258—Genetic materials, DNA, RNA, genes, vectors, e.g. plasmids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2420/00—Materials or methods for coatings medical devices
    • A61L2420/02—Methods for coating medical devices

Definitions

  • the present application relates to processes for producing a plastic containing complexes of at least one nucleic acid and at least one organic cation.
  • the plastic thus produced may be used as a coating or component of a medical device, e.g. a stent, be realized, for example, can return the nucleic acids after contact of the plastic with cells or tissue.
  • DE 601 15203T2 describes a coated implant, wherein the coating consists of a plastic with zwitterionic and cationic groups and contains nucleic acid.
  • This implant is made by dipping the plastic-coated implant into an aqueous solution containing nucleic acids dissolved in water. The nucleic acids are absorbed and bound by the plastic. The implant can be dried and sterilized after contact with the aqueous nucleic acid solution.
  • a disadvantage of this method is that it is limited to a plastic with zwitterionic and cationic groups, so that other suitable for a coating plastics are not used.
  • Another disadvantage is that the described plastic has cationic groups. As a result, cells that have phosphates on their surface are bound to this plastic. This property may be opposite to the effect to be achieved.
  • Another disadvantage of the method described in DE 601 1 5203T2 is the contact which is used to take up the nucleic acids in the plastic.
  • the contact to the recording The nucleic acids in the plastic are made in DE 601 15203T2 in an aqueous medium.
  • a disadvantage of contact in an aqueous medium is that, for example, when using a siRNA as a therapeutic nucleic acid, a very high effort must be made to suppress the activity of ubiquitously occurring in aqueous media nucleases, especially RNAses. Nucleases can degrade the nucleic acids contained in both the production and the storage of the implants and thus adversely affect the effect and reliability of the therapeutic nucleic acids.
  • a further aim is to describe a nucleic acid-containing plastic which promotes the stability of the nucleic acids both during production and in the finished implant and in particular protects the nucleic acids against nuclease degradation.
  • a further disadvantage of the method described in DE 601 15203 T2 is that no release agents for receiving the nucleic acids are available when the nucleic acid is released.
  • the nucleic acid is released as a free, so-called naked nucleic acid, which allows only a small uptake into tissue cells.
  • Another object is to describe a nucleic acid-containing plastic which actively promotes the uptake of nucleic acids into cells.
  • US 2004/0058374 A1 discloses a method for mixing nucleic acid with a water-insoluble medium, in which nucleic acid solution can be mixed by adding a so-called intermediate solution into a water-insoluble medium.
  • nucleic acid solution can be mixed by adding a so-called intermediate solution into a water-insoluble medium.
  • DNA can be dissolved in water and mixed with a mixture of ethanol and acetone as an intermediate solution and then mixed with organic solvent such as chloroform.
  • organic solvent such as chloroform.
  • a plastic such as polystyrene can be solved.
  • This solution can be used to label solids or articles by applying the solution to it.
  • a disadvantage of the method of US 2004/0058374 A1 is that most of the nucleic acid in the aqueous phase remains outside of the optionally present plastic, i. is not installed efficiently in these.
  • nucleic acid loaded microparticles of polymers containing nucleic acid loaded microparticles of polymers. These are prepared by mixing an aqueous nucleic acid solution with a solvent such as dichloromethane, which is insoluble in water and in which a polymer is dissolved, and the water is then removed by freeze-drying. The thus-formed nucleic acid-polymer complex is disclosed in Solvent and mixed with another liquid such as petroleum ether to produce the desired microparticles.
  • a disadvantage of this method is that the nucleic acid is unprotected on the surface of the microparticles and thus accessible to enzymatic degradation. Another disadvantage is that there is no mediator for incorporating the microparticles into the target cells.
  • the object of the present invention is to provide further processes for the production of plastics with nucleic acids contained therein.
  • the present invention relates to methods of producing a plastic containing complexes of at least one nucleic acid and at least one organic cation.
  • the nucleic acid is complexed such that the negative charges of the nucleic acids are substantially completely compensated by positive charges of the organic cations.
  • the eligible plastics or articles provided with appropriate plastics are incubated with an organic solvent in which the abovementioned complexes are present in dissolved form.
  • Nucleic acids, which are otherwise insoluble in organic solvents can be dissolved in high amounts in organic solvents if their negative charges are neutralized by appropriate cations.
  • the nucleic acid complexes then penetrate into the plastic, possibly with the aid of the solvent (for example via diffusion).
  • the nucleic acids are not immobilized in the plastic by means of this method, the nucleic acids can also be released back into the environment in the same way (for example by diffusion) at a later time.
  • the nucleic acids or nucleic acid complexes are located substantially within the plastic polymer and not, at least not predominantly, on the surface of the plastic polymer.
  • a method according to the present invention comprises the following steps: a) Contacting:
  • a liquid comprising at least one organic solvent, wherein the liquid is selected so that the complexes of i) dissolve upon contact with the liquid in the organic solvent;
  • iii) at least one article comprising plastic and / or plastic, wherein the plastic in the liquid of ii) is swellable but preferably insoluble;
  • the processes of the present invention comprise three "components", namely the plastic, the solvent and the nucleic acid complexes
  • the contacting of the individual components can be carried out in parallel (all three components are brought together at the same time) or sequentially (two components are first brought in contact and the third subsequently added).
  • a method according to the invention can e.g. the following steps comprise: a) providing a liquid comprising at least one organic solvent, wherein the organic solvent contains therein dissolved complexes of at least one nucleic acid and at least one organic cation, b) contacting a plastic and / or a plastic comprising Article with the liquid, wherein the plastic in the liquid is swellable but preferably not soluble;
  • the following sequence can be chosen: a) provision of complexes of at least one nucleic acid and at least one organic cation,
  • ii) contains an article comprising plastic or plastic, wherein the plastic is swellable but preferably insoluble in the liquid; c) optionally separating the plastic from the liquid.
  • the contacting (that is, the step in which all three components are present together) preferably comprises an incubation phase of 1 minute or more, e.g. 5 minutes or more, 10 minutes or more, 20 minutes or more, 30 minutes or more, one hour or more, two hours or more, or even 12 hours or more.
  • plastics may arise which have a concentration gradient with respect to the nucleic acid complexes, i. the concentration of nucleic acid complexes decreases from the surface of the plastic (i.e., the solvent side) towards the center of the plastic.
  • concentration gradient will usually occur frequently.
  • concentration equilibrium will increasingly set in. For thin plastic films, which are incubated from both sides, this is e.g. quickly accessible, with thicker layers, which only come in contact with the solvent on one side, this is achieved much later.
  • plastic is understood to mean an organic homopolymer or copolymer or higher copolymer (for example a terpolymer) which is normally present as a solid (under standard conditions) and whose backbone is prepared synthetically or semi-synthetically from monomeric organic molecules.
  • plastic also refers to those polymers which originate from natural sources but have been modified chemically-synthetically, possibly even only slightly.
  • the plastics of present invention comprise more than 20 monomer units. Monomors or oligomers (with up to 20 monomers) according to the invention are not covered by the definition of plastic.
  • plastic does not include nucleic acid and protein polymers, even if they are synthetically produced.
  • the plastic need not be isolated, but may for example be part of an article or a device.
  • plastic coated (or corresponding plastic components having) implants such as endoprostheses, surgical suture material, stents, catheters or contact lenses are treated.
  • a plastic is understood to mean a solid, but not a plastic in solution.
  • the negative charges of the nucleic acid are preferably substantially completely compensated by positive charges of organic cations.
  • “Substantially completely compensated” here means in particular that the ratio of the number of positive charges of the cations to negative charges of the nucleic acid is preferably greater than or equal to 0.5, preferably greater than or equal to 0.6, preferably greater than or equal to 0.7, preferably greater than or equal to 0.8, preferably greater than or equal to 0.9, preferably is greater than or equal to 0.91, preferably greater than or equal to 0.92, preferably greater than or equal to 0.93, preferably greater than or equal to 0.94, preferably greater than or equal to 0.95, preferably greater than or equal to 0, Is 96, preferably greater than or equal to 0.97, preferably greater than or equal to 0.98, preferably gr SSER or equal to 0.985, is preferably greater than or equal to 0.99, is preferably greater than or equal to 0.995, or
  • the ratio of the number of positive charges of the cations to negative charges of the nucleic acid may, for example, be in the range 0.5-2, for example in the range 0.6-1.8, in the range 0.7-1.3 lie in the range of 0.5-1 Range from 0.8 to 1.2, range from 0.9 to 1.1, range from 0.91 to 1.9, range 0.92 to 1.08, range 0.93 to 1 07, lie in the range 0,94 - 1, 06, lie in the range 0,95 - 1, 05, lie in the range 0,96 - 1, 04, lie in the range 0,96 - 1, 04, in the range 0.97-1.30, in the range 0.98-1.02, in the range 0.99-1.0, in the range 0.995-1.005, or even equal to 1.
  • At least one organic cation means that at least one type of organic cation is present (eg, CTAB), but there may also be cation mixtures of two or more, three or more, four or more, five or more, etc. different organic cations ( For example, CTAB besides DDAB.)
  • CTAB Besides DDAB.
  • the at least one organic cation is simply positively charged, and it will be apparent to those skilled in the art that the term is not indicative of the amount of substance.
  • At least one organic solvent means that at least one organic solvent is present, but also solvent mixtures (eg, forming a homogeneous phase) of an organic solvent having one or more, two or more, three or more, four or more, five or more more, etc., of the other solvents, in particular other organic solvents
  • solvent mixtures eg, forming a homogeneous phase
  • the nucleic acid complexes would be present in the oil phase.
  • the plastic may e.g. as an independent solid, but it can also be used e.g. as part of an article or device, e.g. in the form of a coating.
  • the plastic in the method according to the invention is incubated directly with the solvent with the nucleic acid complexes contained therein. In such embodiments, not only is there no other organic solvent, but no other solvent at all.
  • the optional step provided in the method of separating the plastic from the liquid comprising at least one organic solvent may mean, for example, that the plastic is separated (at least substantially) from the at least one organic solvent, ie, for example, a plastic-containing article from the solvent bath is removed.
  • the step does not mean that it is absolutely necessary to remove solvents that have penetrated into the plastic. Of course, it is also possible to reduce or remove these amounts of residual solvent, for example by drying the plastic.
  • "At least one nucleic acid” means that at least one nucleic acid is present, but there may also be nucleic acid mixtures of two or more, three or more, four or more, five or more, etc. different nucleic acids. eg DNA in addition to RNA) and / or the sequence of the nucleic acids (length and / or base sequence).
  • nucleic acid is to be understood as meaning a nucleic acid whose nucleosides are linked to one another by phosphate groups, the phosphate residues involved being usually negatively charged, as is the case with naturally occurring DNA or RNA.
  • the charged nucleic acids are polyanionic acids (polyelectrolytes) in which the anionic groups are formed by the negatively charged oxygen radicals of the phosphate groups forming the phosphorus bonds.
  • the residues of the nucleic acids carrying the negative charges may also be the negative residues of phosphorothioates or phosphorodithioates or also other negatively charged groups of nucleic acids.
  • a nucleic acid or nucleic acid complex of nucleic acid and organic cation is considered to be dissolved within the meaning of the invention if it can not be centrifuged off by centrifugation at 15,000 ⁇ g for 5 minutes.
  • the size of the nucleic acid is not critical according to the invention.
  • the nucleic acid is an oligonucleotide, ie single-stranded or double-stranded DNA or RNA (or DNA / RNA hybrids) having a chain length of about 2 to about 150 nucleotides, preferably of about 5 to about 100 nucleotides, preferably about 10 to about 80 nucleotides, more preferably about 20 to about 60 nucleotides.
  • the oligonucleotide is preferably a synthetically produced oligonucleotide of known sequence.
  • the nucleic acids may be, for example, DNA, cDNA, mRNA, sRNA, ribozymes, antisense DNA, RNA, antisense RNA, siRNA, decoys, tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, or miRNA.
  • the nucleic acid is not siRNA.
  • the nucleic acids contain at least part of a sequence of a (eg human or animal) genome or gene.
  • the cosmetic application it can in turn, be advantageous if the nucleic acids do not contain a sequence of a (human) genome or gene.
  • the nucleic acid is a vector or a plasmid, e.g. with a size of more than 1 kb (1000 nucleotides).
  • the size of the vector or plasmid will typically be greater than 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 1k, 12kb, 13kb, 14 kb, 15 kb or even more than 20 kb. It may be with the nucleic acid to be introduced into the plastic, e.g. is a gene therapy vector which is administered for expression in a mammal.
  • Viral vectors are derived from various viruses, e.g. of retroviruses, herpesviruses, adenoviruses or adeno-associated viruses (AAV), see Lundstrom, Trends Biotechnol. (2003), 21 (3): 1 1 7-22.
  • the viral vectors are those that are no longer able to replicate in the cells transfected therewith.
  • non-viral vectors e.g. eukaryotic expression vectors into which cells or tissues are introduced.
  • the vectors or plasmids preferably comprise a eukaryotic promoter that is active in the mammal.
  • Suitable organic cations in the context of the present invention are, for example, cationic detergents, lipids and nitrogen compounds with quaternary nitrogen, for example organic ammonium salts.
  • one or more compounds of formula NR 4 X may be used as a source of organic cations, each R independently being a hydrocarbon radical of 1 to 20 carbon atoms which may be branched or unbranched, and X is a halogen selected from the group consisting of from chlorine, bromine, iodine, in particular chlorine or bromine, preferably bromine.
  • the hydrocarbon radical preferably contains only C and H atoms.
  • the source of the at least one organic cation may be one or more compounds of the formula NR 1 R 2 R 3 R 4 X, where R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are organic radicals, in particular hydrocarbon radicals, such as defined above, and wherein at least R 1 is a C 1 radical and R 2 to R 4 are longer-chain radicals, or
  • R 1 and R 2 are each a C 1 radical and R 3 and R 4 are longer chain radicals, or
  • R ⁇ R 2 and R 3 are each a C1 radical and R 4 is a longer chain radical.
  • radicals R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each and independently of one another as defined below for "R".
  • R in the compounds of the formula NR 4 X is preferably an alkyl radical having 1 to 20 carbon atoms, which may be branched or unbranched.
  • one or more, especially two or three, of R may be relatively short chain radicals such as C1 to C3, such as methyl, ethyl and propyl, while an R may be a longer radical such as C8 or C10 to C20, especially C10 to C16, such as octyl , Nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, cetyl, heptadecyl, icosanyl, stearyl or nonadecyl.
  • radicals R is three methyl radicals and one long-chain radical, in particular a C10 to C20 hydrocarbon radical as defined above, in particular a cetyl radical as in cetyltrimethylammonium bromide (CTAB).
  • R does not comprise aromatic and / or non-aromatic ring systems.
  • the at least one organic cation is one or more quaternary amines, with CTAB being particularly preferred.
  • CTAB is one or more quaternary amines
  • Other compounds which are suitable according to the invention for complexing the nucleic acids include benzethonium chloride, benzalkonium, benzalkonium chloride, didecyldimethylammonium bromide (DCAB), dodecyltrimethylammonium bromide (DCTAB), DOTAP, lipofectin, lipofectamine N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] - N, N, N-trimethylammonium chlorides (DOTMA), dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB), dioleyldimethylammonium chlorides (DODAC), 2,3-dioleoyloxy-N- [2- (spermidinecarboxamido) ethyl] -N-dimethyl -1-prop
  • a suitable method for preparing complexes of at least one nucleic acid and at least one organic cation comprises the solution of at least one nucleic acid in an aqueous liquid, in particular water (eg demineralized water), and precipitation of the at least one nucleic acid by addition of at least one organic cation which forms a complex insoluble in the aqueous solution with the nucleic acid.
  • the complexes thus obtained can then be dissolved in an organic solvent and then optionally mixed with other liquids.
  • such a method may comprise the following steps:
  • d ' optionally dissolving the complexes in at least one organic solvent
  • e' optionally mixing the at least one organic solvent from d ') with the complexes dissolved therein with a further liquid.
  • the complexing agent is added to the aqueous liquid in step b ') in dissolved form.
  • the nucleic acid is thereby preferably complexed with the at least one organic cation such that a ratio of substantially 1: 1 (ie substantially completely compensated) between the negative charges (ie the anionic groups) of the at least one nucleic acid and the charges of the at least one organic cation is present.
  • organic cations such as those mentioned above, e.g. CTAB, are able to approximate the positively charged group in a sufficiently small distance to the negatively charged oxygen atom of the nucleic acid, so that a sufficient (local) shielding of the total charge of both ions is effected.
  • An advantage of the setting of such a ratio is that the total of organic cations and nucleic acid is approximately charge neutral, that is essentially completely complexed.
  • the complexed nucleic acid is therefore insoluble in an aqueous medium and can be separated in the preparation in aqueous media as an insoluble precipitate. This feature thus facilitates the production of the desired, stoichiometrically complexed nucleic acid.
  • the separation of the complexes according to step c ') is therefore preferably carried out by Zentrifugati on or filtration. These methods are a particularly simple and efficient way of separating the precipitated complexes.
  • the precipitate may be separated by centrifugation for 1 to 10 minutes, preferably 5 minutes, at 10,000 to 20,000 g, preferably 15,000 g. If necessary, this process can be carried out several times after re-inclusion of the precipitate precipitated in water.
  • An advantage of setting such a ratio is further that upon contact of the thus complexed nucleic acid with a living cell or an organ of a living organism no or only a few free organic cations can interact with the cells or the organism. As a result, the organic cations can not elicit cytotoxic effects or other metabolic disorders in the cells, which otherwise can be common.
  • Another advantage of adjusting a stoichiometric complexation is the resulting solubility in a variety of organic solvents, including those generally considered to be nucleic acid aqueous solution precipitants. This applies in particular to the use of lower alcohols such as ethanol, propanol or butanol. In such solvents, even a concentration of complexed nucleic acid as in neutral or aqueous media can be achieved, i. concentrations of more than 10 ⁇ g nucleic acid per ⁇ solvent can be achieved, for example in methanol, ethanol, butanol, dimethyl sulfoxide or ethylene glycol ethyl ether (EGE).
  • organic solvents including those generally considered to be nucleic acid aqueous solution precipitants. This applies in particular to the use of lower alcohols such as ethanol, propanol or butanol.
  • concentrations of more than 10 ⁇ g nucleic acid per ⁇ solvent can be achieved, for example in methanol, ethanol, butanol
  • nucleic acids are inactive in non-aqueous environment. This is particularly important when using ribonucleic acid (RNA) as the nucleic acid, since in all aqueous systems with a high RNAse activity must be expected. Outside of a special, RNAse-free environment, which can be realized practically only under special laboratory conditions, otherwise a rapid degradation of the RNA is to be expected, which in particular the use of RNA as a drug difficult. This problem is solved by the complexing used in the present invention with subsequent incorporation into a plastic.
  • RNA ribonucleic acid
  • the stability of the complexed, dissolved nucleic acids is also increased by the fact that in the organic solvent or plastic used no acidic or alkaline Environment is more present. This avoids any acid or alkaline hydrolysis of the nucleic acid structures.
  • the optical properties of the solvent or of the plastic are characterized by a comparatively higher UV radiation absorption.
  • the otherwise possible UV damage of the nucleic acid structures when using aqueous media is reduced or completely avoided.
  • the use of plastics containing aromatic structures that absorb at a wavelength of about 260 nm results in a most extensive shielding of the UV radiation that is damaging to the nucleic acid.
  • various organic cations may be used by adding mixtures of different organic cations to the nucleic acid-containing aqueous liquid to precipitate the nucleic acid complexes.
  • the complexes obtained by precipitation are preferably dissolved in an organic solvent or solvent mixture. After uptake in an organic solvent or solvent mixture, this essentially essentially contains no organic cations which go beyond the amount required to compensate for the negative charges of the nucleic acid. This means that the number of total positive charges of the organic cations in the organic solvent or solvent mixture is substantially identical to the number of negative charges of the nucleic acid.
  • Organic solvents which are particularly suitable for incorporation of the nucleic acid complexes include in particular monohydric or polyhydric alcohols or partially etherified alcohols. Therefore, the additional solvent or solvents preferably contain at least one ether group and / or at least one hydroxyl group.
  • Particularly suitable as solvents (amphiphilic) compounds can be described by the formula HO-R1 -O-R2. In this case, R 1 and R 2 are each a hydrocarbon radical having 1 to 100 carbon atoms.
  • C1 to C5 alcohols are suitable, such as, for example, methanol, ethanol, 1-propanol or 2-propanol, butanol, such as 1-butanol, or pentadiol, such as 1-pentadiol.
  • polyhydric alcohols such as ethylene glycol or partially etherified derivatives thereof, such as ethylene glycol, which is etherified with methanol, ethanol, propanol or butanol, such as ethylene glycol ethers, in particular ethylene glycol monobutyl ether, ethyl ether or methyl ether, usable.
  • saturated or unsaturated hydrocarbons such as pentane, hexane or heptane, or benzene-based aromatic hydrocarbons, such as xylene or styrene, ie in particular benzenes substituted by C1 to C3 radicals.
  • halogen-containing solvents such as chloroform, dichloromethane or carbon tetrachloride or other heteroatom-containing solvents such as dimethylformamide or tetrahydrofuran may be used.
  • carboxylic acid derivatives such as esters such as in particular ethyl acetate or, methyl methacrylate, ketones such as acetone, butanone, amines such as ethanolamine, amides such as ⁇ , ⁇ -dimethylformamide; Sulfoxides such as dimethylsulfoxide; Nitriles, such as acetonitrile; Fats and oils, such as almond oil, safflower oil, walnut oil, wheat germ oil, linseed oil, or castor oil are used.
  • Table 1 gives an overview of the solubility of complexed nucleic acid exemplified by DNA in a number of specific solvents.
  • this can be processed according to the invention by contacting with a plastic to the plastic according to the invention.
  • a plastic to the plastic according to the invention.
  • the complexed nucleic acid prepared as described above is brought into direct contact with the plastic body and incubated.
  • the plastics used may be homopolymers, ie polymers having units derived from only one monomer, or copolymers, ie plastics having different units derived from two or more monomers.
  • Suitable polymers or copolymers are, for example, polyolefins having aliphatic or aromatic units, polyalkylenes, polyalkylenes with unsaturations, halogen-substituted polyalkylenes, polyoxyalkylenes, polystyrene and styrene copolymers, polyesters, polyethers, polyamides, polycarbonates, polyurethanes, polysiloxanes, poly (meth) acrylic acid and their Esters and other derivatives such as polyacrylonitrile, polyvinyl materials such as polyvinyl acetates, alcohols, halides, etc.
  • the nucleic acid complexes are introduced into plastics which are swellable in the solvent used correspondingly for the solution of the nucleic acid complexes, but are preferably not soluble under the conditions of contact with the dissolved nucleic acid complexes. If the plastic should be soluble in the chosen solvent, the incubation time between nucleic acid complex solution and plastic is chosen so that the plastic (at least substantially) is not yet dissolved and can still be separated as a solid. Because the plastic is not to be released, the plastic or plastic-containing article thus preferably retains, at least substantially, its shape, e.g. the form necessary for his (medical) use. A plastic contact lens remains a plastic contact lens, a surgical plastic thread remains a plastic thread, etc. Alternatively, the corresponding solution-endangered plastics can also be used as cross-linked plastics, so that the solution of the plastic is no longer given.
  • the final optional separation of the solvent is then carried out, for example, by stripping under vacuum or by washing in a physiological solution such as 0.9% (w / v) saline.
  • a physiological solution such as 0.9% (w / v) saline.
  • the plastic is not first polymerized while being contacted with the complexed nucleic acid.
  • the plastics according to the invention can advantageously be present, for example, as microparticles, nanoparticles, pellets, granules, fibers (for example as filaments), films, etc., or be processed correspondingly to same after incorporation of the nucleic acid complexes.
  • the plastics may thus be, for example, implants, heart valves, prostheses and similar articles, or be parts thereof or be processed to and / or applied to these articles as coatings.
  • a plastic made according to the invention having a complexed DNA encoding proteins may be used as part (e.g., as a coating or as a component) of an implant to facilitate better growth in the body. Likewise, a settling of cells on the implant can be prevented.
  • the plastics according to the invention do not necessarily have to be further processed, e.g. if the plastic is already a plastic-containing end product that is only intended to absorb nucleic acids.
  • At least one pharmaceutically or cosmetically acceptable excipient is added in the preparation of the plastics according to the invention, e.g. to ensure later the pharmaceutical or cosmetic effectiveness of a nucleic acid released by the plastic.
  • the skilled worker is aware of numerous such auxiliaries.
  • the excipient is particularly preferably a pharmaceutically or cosmetically acceptable oil, wax or fat.
  • Suitable oils which can be used as adjuvant include, for example, synthetic, animal and vegetable oils.
  • suitable waxes or fats comprise synthetic, animal and / or vegetable waxes or synthetic, animal and / or vegetable fats.
  • oils are not synthetic oils, but, for example, animal and / or vegetable oils.
  • Suitable vegetable oils are, for example, nut oils and seed oils.
  • Suitable vegetable oils include, in particular, peanut oil, walnut oil, almond oil, hazelnut oil, coconut oil, soybean oil, olive oil, poppy seed oil, hemp seed oil, pumpkin seed oil, Sunflower seed oil, sesame seed oil, cottonseed oil, thistle oil, linseed oil, rapeseed oil, castor oil and the like.
  • Germ oil derived from grain can also be used herein as a carrier.
  • Preferred seed oils include, for example, those derived from corn, wheat, oats, rye, rice and triticale.
  • coconut fat or cocoa butter may be used as suitable vegetable fats.
  • Possible vegetable waxes include, for example, sugarcane wax, carnauba wax, jojoba oil, candelilla wax and Japan wax.
  • oils In addition to vegetable oils, waxes and fats, animal fats, waxes and oils, e.g. Fish oils or oils and fats derived from mink or deer. Cod liver oil and whale oil (such as spermaceti) are examples of fish oils that may be used herein. Possible sources of animal waxes include spermaceti, wool wax and beeswax. Suitable processes for recovering pure oils, waxes and fats of animal origin are known in the art.
  • Suitable synthetic oils and fats are based, for example, on silicone or paraffin compounds.
  • An example is Vaseline.
  • Soya wax can be obtained by hydrogenation from soy and is an example of a synthetic wax.
  • the excipient can be processed at an appropriate time in the production of plastics.
  • the nucleic acid complexes may be dissolved in a mixture of organic solvent and oil prior to contact with the plastic, e.g. a DMSO oil mixture.
  • the excipient is then taken up together with the nucleic acids in the plastic.
  • the adjuvant can be added to the plastic, e.g. the plastic be coated with an oil that may possibly solve the nucleic acids back out of the plastic.
  • the present invention relates to a plastic which has been produced according to a method according to the invention.
  • the present invention therefore also relates to a plastic which describes nucleic acid complexes as described herein and optionally comprises an organic solvent, wherein the plastic preferably has a concentration gradient with respect to the nucleic acid complexes (see above).
  • the present invention relates to the use of a plastic produced according to the invention in a method for the surgical or therapeutic treatment of the human or animal body, or for use in a diagnostic method that is performed on the human or animal body.
  • FIG. 1 Introduction of complexed DNA into surgical threads (polyamide thread); FIG. A) EtBr CTAB DNA in methanol; B) EtBr CTAB DNA in ethanol; C) EtBr-CTAB DNA in butanol; D) EtBr CTAB DNA in DMSO; E) EtBr CTAB DNA in EGE; F) Control ethanol without EtBr CTAB DNA. The detection was carried out by fluorescence microscopy.
  • FIG. 2 introduction of complexed DNA into contact lenses;
  • FIG. A Contact lens after incubation in ethanol with EtBr-CTAB-DNA (left) and without EtBr-CTAB-DNA (right);
  • Fig. 3 recording of complexed DNA in plastic granules with various solvents
  • herring sperm DNA 1 g was dissolved in 100 ml of demineralized water. 0.5 ml each was transferred to plastic reaction tubes. Into each tube was added 0.5 ml of aqueous 100 mM CTAB solution. The tubes were vortexed. A white precipitate formed, which was sedimented by centrifugation for 5 min at 10,000 x g. The supernatant was discarded, the precipitate suspended in water and recentrifuged. The supernatant was again discarded and the precipitate dried overnight under vacuum.
  • 300mg of salmon sperm DNA was introduced into a 50ml screw-capped tube and dissolved in 30ml of water.
  • the DNA solution was mixed with 20 ml of a 100 mM CTAB solution containing 5 mM ethidium bromide and mixed.
  • the resulting turbidity of the ethidium CTAB DNA was precipitated by centrifugation at 5000 x g for 15 min.
  • the precipitate was suspended in 30 ml of water and recentrifuged. The supernatant was discarded and the ethidium-CTAB-DNA precipitate dried overnight in the Speedvac.
  • the dried precipitate was taken up in the desired solvent (ethanol, DMSO) to a concentration of 1 or 10 mg / ml.
  • Ethidium bromide CTAB DNA (EtBr-CTAB DNA) was prepared as described in Example 4 and added to a 1% (w / v) CTAB-DNA solution in DMSO.
  • Per 10 ⁇ 1% EtBr-CTAB DNA in DMSO were mixed with 90 ⁇ of the following solvents: methanol, ethanol, butanol, benzyl alcohol, DMSO, ethylene glycol monoethyl ether (EGE).
  • solvents methanol, ethanol, butanol, benzyl alcohol, DMSO, ethylene glycol monoethyl ether (EGE).
  • EGE ethylene glycol monoethyl ether
  • a polyamide thread (Ethilon, Ethicon, Norderstedt, Germany) was cut into approximately 0.5 cm long pieces. One thread each was applied in a 500 ⁇ plastic tube containing 100 ⁇ of the various EtBr-CTAB-DNA-containing solutions.
  • filaments were introduced in the same volume of solvent without EtBr-CTAB DNA. The samples were incubated for 24 hrs at RT ° C. To remove the free EtBr CTAB DNA, the filaments were rinsed with ethanol. To detect the uptake of the EtBr CTAB DNA, the filaments were observed in a fluorescence microscope and photographed. The EtBr CTAB DNA was detected by contact of the filaments with the EtBr-CTAB DNA-containing solutions in the filaments by their fluorescence. The controls without EtBr-CTAB DNA showed no fluorescence.
  • EtBr-CTAB DNA was prepared as described above and added to a 0.1% (w / v) EtBr-CTAB-DNA solution in ethanol.
  • a contact lens (Biomedics 55, Ocufilcon D, copolymer of 2-hydroxyethyl methacrylate and methacrylic acid, Lensshop24.de, Vechelde, Germany) was transferred to a 2 ml plastic tube and covered with EtBr-CTAB-DNA solution in ethanol. The contact lens was incubated overnight in the solution at room temperature. The incubation made the lens clearly red. The contact lens was removed from the plastic vessel and rinsed several times in ethanol to remove free EtBr-CTAB-DNA solution in ethanol.
  • the contact lens was photographed on a UV box. Based on the fluorescence of the EtBr-CTAB-DNA, the uptake of the complexed DNA could be detected.
  • a contact lens treated in ethanol without EtBr-CTAB DNA as described above did not show any fluorescence.
  • the lens was placed in 1.5ml 0.9% (w / v) saline. By incubation in saline, a portion of EtBr-CTAB DNA could be eluted again.
  • Another contact lens was cut into several fragments and incubated in the wells of a 96 well microtitre plate with 0.1% EtBr-CTAB DNA in various solvents overnight.
  • the following solvents were used: methanol; Ethanol, butanol, chloroform DMS, ethyl glycol monoethyl ether (EGE) and benzyl alcohol. Thereafter, the fragments were washed with methanol and photographed on a UV box. Based on the fluorescence, the EtBr-CTAB DNA could be detected in all fragments.
  • EtBr-CTAB DNA was prepared as described above and inoculated into a 1% (w / v) CTAB-DNA solution in DMSO.
  • Per ⁇ ⁇ 1% (w / v) EtBr-CTAB-DNA in DMSO were mixed with 900 ⁇ of the following solvents: methanol, ethanol, butanol, benzyl alcohol, DMSO, ethylene glycol monoethyl ether.
  • solutions with a concentration of 0.1% (w / v) EtBr-CTAB DNA were formed in the above-mentioned solvents with 10% (v / v) DMSO content.
  • the same mixtures with the solvents were prepared with DMSO without EtBr-CTAB DNA.
  • polypropylene plastic tubes were each 5 granules particles (size about 2mm x 1 mm x 1 mm) of a polyamide granules (PA-6, Zytel 7335F, DuPont, Bad Homburg, Germany) and a polycarbonate granules ( PC, Makroion AL2647, Bayer, Leverkusen, Germany).
  • the granules were mixed with about 1.5 ml of the 0.1% EtBr-CTAB-DNA solutions in the abovementioned solvents.
  • the tubes were incubated for several days at room temperature.
  • CTAB DNA particle size is important. Smaller particles can easily penetrate the skin and be absorbed by the cell membrane. Therefore, CTAB DNA particle size was determined by dynamic light scattering.
  • the CTAB DNA solution in DMSO was diluted 1:10 with DMSO and water to produce various DMSO-water mixtures in the concentration range with a DMSO content (v / v) of between 10-100%.
  • a DMSO content (v / v) of between 10-100% 0.5 ml each of the different CTAB-DNA solutions in the DMSO-water mixtures was transferred to plastic cuvettes and the particle size was measured by means of dynamic light scattering with a (Zetasizer, Malvern Instruments GmbH, 71083 Berlinberg).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind Verfahren zur Herstellung eines Kunststoffs enthaltend Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation.

Description

Verfahren zur Herstellung von Kunststoffen enthaltend Nukleinsäuren in
komplexierter Form
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind Verfahren zur Herstellung eines Kunststoffs enthaltend Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation. Der so hergestellte Kunststoff kann als Beschichtung oder Bestandteil einer medizinischen Vorrichtung, z.B. eines Stents, realisiert sein, der beispielsweise nach Kontakt des Kunststoffs mit Zellen oder Gewebe die Nukleinsäuren wieder abgeben kann.
Stand der Technik
DE 601 15203T2 beschreibt ein beschichtetes Implantat, wobei die Beschichtung aus einem Kunststoff mit zwitterionischen und kationischen Gruppen besteht und Nukleinsäure enthält. Hergestellt wird dieses Implantat dadurch, dass das kunststoffbeschichtete Implantat in eine wässrige Lösung getaucht wird, die in Wasser gelöste Nukleinsäuren enthält. Dabei werden die Nukleinsäuren von dem Kunststoff aufgenommen und gebunden. Das Implantat kann nach dem Kontakt mit der wässrigen Nukleinsäure-Lösung getrocknet und sterilisiert werden. Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass es auf einen einem Kunststoff mit zwitterionischen und kationischen Gruppen beschränkt ist, so dass andere für eine Beschichtung geeignete Kunststoffe nicht zur Verwendung kommen. Weiterhin nachteilig ist, dass der beschriebenen Kunststoff kationische Gruppen besitzt. Dadurch werden Zellen, die an ihrer Oberfläche Phosphate besitzen an diesen Kunststoff gebunden. Diese Eigenschaft kann der zu erzielenden Wirkung entgegengesetzt sein.
Ein weiterer Nachteil an dem in DE 601 1 5203T2 beschriebenen Verfahren ist der Kontakt der zur Aufnahme der Nukleinsäuren in den Kunststoff genutzt wird. Der Kontakt zur Aufnahme der Nukleinsäuren in den Kunststoff wird in DE 601 15203T2 in einem wässrigen Medium vorgenommen. Nachteilig an einem Kontakt in wässrigem Medium ist, dass z.B. bei der Verwendung einer siRNA als therapeutischer Nukleinsäure ein sehr hoher Aufwand betrieben werden muss, um die Aktivität von ubiquitär in wässrigen Medien vorkommenden Nukleasen, insbesondere RNAsen, zu unterdrücken. Nukleasen können sowohl bei der Herstellung als auch bei der Lagerung der Implantate die enthaltenen Nukleinsäuren abbauen und somit die Wirkung und Zuverlässigkeit der therapeutischen Nukleinsäuren negativ beeinflussen. Ein weiteres Ziel ist es einen nukleinsäurehaltigen Kunststoff zu beschreiben, der sowohl bei der Herstellung als auch im fertigen Implantat die Stabilität der Nukleinsäuren fördert und insbesondere die Nukleinsäuren gegen Nuklease-Abbau schützt.
Ein weiterer Nachteil der an dem in DE 601 15203T2 beschriebenen Verfahren ist, das bei der Freisetzung der Nukleinsäure keine Hilfsmittel zur Aufnahme der Nukleinsäuren zur Verfügung stehen. In dem besagten Verfahren wird die Nukleinsäure als freie, sogenannte nackte Nukleinssäure freigesetzt, die nur eine geringe Aufnahme in Gewebezellen ermöglicht. Ein weiteres Ziel ist es einen nukleinsäurehaltigen Kunststoff zu beschreiben, der die Aufnahme der Nukleinsäuren in Zellen aktiv fördert.
Aus der US 2004/0058374 A1 ist eine Methode zum Mischen von Nukleinsäure mit einem wasserunlöslichen Medium bekannt, bei der Nukleinsäurelösung durch die Zugabe einer sogenannten intermediären Lösung in ein wasserunlösliches Medium eingemischt werden kann. Beispielsweise kann DNA in Wasser gelöst und mit einer Mischung aus Ethanol und Aceton als intermediärer Lösung gemischt und sodann mit organischem Lösungsmittel wie Chloroform gemischt werden. In Letzterem kann auch ein Kunststoff wie Polystyrol gelöst sein. Diese Lösung kann zum Markieren von Feststoffen oder Gegenständen verwendet werden, indem die Lösung darauf aufgetragen wird. Nachteilig an dem Verfahren der US 2004/0058374 A1 ist, dass der größte Teil der Nukleinsäure in der wässrigen Phase außerhalb des gegebenenfalls vorhandenen Kunststoffs verbleibt, d.h. in diesen nicht effizient eingebaut wird.
Die DE 696 37 1 71 T2 betrifft Zusammensetzungen zur Gentherapie, die mit Nukleinsäure beladene Mikropartikel aus Polymeren enthalten. Diese werden hergestellt, indem eine wässrige Nukleinsäurelösung mit einem Lösungsmittel wie Dichlormethan, das in Wasser nicht löslich ist und in dem ein Polymer gelöst ist, gemischt wird und das Wasser sodann durch Gefriertrocknung entzogen wird. Der so gebildete Nukleinsäure-Polymerkomplex wird in Lösungsmittel aufgenommen und mit einer weiteren Flüssigkeit wie Petrolether gemischt, um die gewünschten Mikropartikel zu erzeugen. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Nukleinsäure ungeschützt auf der Oberfläche der Mikropartikel angeordnet und damit einem enzymatischen Abbau zugänglich ist. Ein weiterer Nachteil ist, dass keine Vermittler zur Aufnahme der Mikropartikel in die Zielzellen vorhanden ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere Verfahren zur Herstellung von Kunststoffen mit darin enthaltenen Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Kunststoffe mit darin enthaltenen Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die für medizinische und pharmazeutische Anwendungen geeignet sind, oder die zu therapeutischen Zwecken mit Zellen oder Gewebe von Mensch und Tier in Kontakt gebracht werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung eines Kunststoffs, der Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation enthält. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure derart komplexiert, dass die negativen Ladungen der Nukleinsäuren durch positive Ladungen der organischen Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert sind. Im Prinzip werden bei diesem Verfahren die in Frage kommenden Kunststoffe oder mit entsprechenden Kunststoffen versehenen Gegenstände mit einem organischen Lösungsmittel inkubiert, in dem die vorgenannten Komplexe in gelöster Form vorliegen. Nukleinsäuren, die ansonsten in organischen Lösungsmitteln nicht löslich sind, können in hohen Mengen in organischen Lösungsmitteln gelöst werden, wenn Ihre negativen Ladungen durch entsprechende Kationen neutralisiert werden. Die Nukleinsäurekomplexe dringen dann, ggf. mit Hilfe des Lösungsmittels, in den Kunststoff ein (z.B. über Diffusion). Da die Nukleinsäuren im Wege dieses Verfahrens nicht im Kunststoff immobilisiert werden, können die Nukleinsäuren auch zu einem späteren Zeitpunkt wieder in gleicher Weise (z.B. per Diffusion) wieder an die Umgebung abgegeben werden. In den Kunststoffen des vorliegenden Verfahrens befinden sich die Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäurekomplexe im Wesentlichen innerhalb des Kunststoffpolymers und nicht, zumindest nicht vorwiegend, auf der Oberfläche des Kunststoffpolymers.
Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst folgende Schritte: a) In-Kontakt-Bringen:
i) von Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation;
ii) einer Flüssigkeit umfassend mindestens ein organisches Lösungsmittel, wobei die Flüssigkeit so gewählt ist, dass sich die Komplexe aus i) bei Kontakt mit der Flüssigkeit in dem organischen Lösungsmittel lösen; und
iii) mindestens einem Kunststoff und/oder einem Kunststoff umfassenden Gegenstand wobei der Kunststoff in der Flüssigkeit aus ii) quellbar aber vorzugsweise nicht löslich ist;
c) ggf. Abtrennen des Kunststoffs von der Flüssigkeit.
Im Prinzip umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung drei„Komponenten", nämlich den Kunststoff, das Lösungsmittel und die Nukleinsäurekomplexe. Das In-Kontakt-Bringen der einzelnen Komponenten kann parallel (alle 3 Komponenten werden gleichzeitig zusammengebracht) oder sequentiell erfolgen (2 Komponenten werden zunächst in Kontakt gebracht und die Dritte anschließend hinzugegeben).
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann z.B. die folgenden Schritte umfassen: a) Bereitstellen einer Flüssigkeit umfassend mindestens ein organisches Lösungsmittel, wobei das organische Lösungsmittel darin gelöste Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation enthält, b)ln-Kontakt-Bringen eines Kunststoffs und/oder eines einen Kunststoff umfassenden Gegenstands mit der Flüssigkeit, wobei der Kunststoff in der Flüssigkeit quellbar aber vorzugsweise nicht löslich ist;
c) ggf. Abtrennen des Kunststoffs von der Flüssigkeit.
Ebenso kann beispielsweise folgende Reihenfolge gewählt werden: a) Bereitstellen von Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation,
b) In-Kontakt-Bringen der Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation mit einer Flüssigkeit, die: i) mindestens ein organisches Lösungsmittel enthält, wobei bei Kontakt der Flüssigkeit mit den Komplexen aus a) diese Komplexe in dem organischen Lösungsmittel löslich sind, und
ii) einen Kunststoff oder einen Kunststoff umfassenden Gegenstand enthält, wobei der Kunststoff in der Flüssigkeit quellbar aber vorzugsweise nicht löslich ist; c) ggf. Abtrennen des Kunststoffs von der Flüssigkeit.
In den erfindungsgemäßen Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen (also den Schritt, in dem alle 3 Komponenten zusammen vorliegen) vorzugsweise eine Inkubationsphase von 1 Minute oder mehr, z.B. 5 Minuten oder mehr, 10 Minuten oder mehr, 20 Minuten oder mehr, 30 Minuten oder mehr, eine Stunde oder mehr, zwei Stunden oder mehr, oder ggf. sogar 12 Stunden oder mehr.
Je nach Inkubationszeit, Dicke und Dichte des zu durchdringenden Kunststoffs und der Flüssigkeit mit dem Lösungsmittel zugänglichen Oberfläche etc., können Kunststoffe entstehen, die einen Konzentrationsgradienten hinsichtlich der Nukleinsäurekomplexe aufweisen, d.h. die Konzentration der Nukleinsäurekomplexe nimmt ausgehend von der Oberfläche des Kunststoffs (d.h. der Einwirkungsseite des Lösungsmittels) hin zum Zentrum des Kunststoffs ab. In der Anfangsphase der Inkubation wird in der Regel häufig ein derartiger Konzentrationsgradient auftreten. Mit längerer Inkubationsdauer wird sich zunehmend ein Konzentrationsgleichwicht einstellen. Bei dünnen Kunststofffolien, die von beiden Seiten inkubiert werden, ist dies z.B. schnell erreichbar, bei dickeren Schichten, die nur einseitig mit dem Lösungsmittel in Berührung kommen, ist dies erst deutlich später erreicht.
Bevorzugte Ausführungsformen sind in der nachfolgenden Beschreibung offenbart. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird unter Kunststoff ein organisches Homopolymer oder Copolymer oder höheres Copolymer (z.B. ein Terpolymer) verstanden, das normalerweise als Festkörper (bei Standardbedingungen) vorliegt und dessen Grundgerüst synthetisch oder halbsynthetisch aus monomeren organischen Molekülen hergestellt wird. Mit Kunststoff werden vorliegend auch solche Polymere bezeichnet, die aus natürlichen Quellen stammen, aber chemisch-synthetisch, gegebenenfalls auch nur geringfügig, modifiziert worden sind. Die Kunststoffe der vorliegenden Erfindung umfassen mehr als 20 Monomereinheiten. Monomore oder Oligomere (mit bis zu 20 Monomeren) fallen erfindungsgemäß nicht unter die Definition Kunststoff. Ferner fallen unter den Begriff Kunststoff keine Nukleinsäure- und Proteinpolymere, selbst wenn sie synthetisch hergestellt sind. Ferner muss der Kunststoff nicht isoliert vorliegen, sondern kann beispielsweise Bestandteil eines Gegenstands bzw. einer Vorrichtung sein. So können beispielsweise mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Kunststoff beschichtete (oder entsprechende Kunststoffbauteile aufweisende) Implantate wie Endoprothesen, chirurgisches Nahtmaterial, Stents, Katheter oder Kontaktlinsen behandelt werden. Ferner wird erfindungsgemäß unter einem Kunststoff ein Feststoff verstanden, nicht aber ein Kunststoff in Lösung.
In den Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation sind die negativen Ladungen der Nukleinsäure vorzugsweise durch positive Ladungen organischer Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert.„Im Wesentlichen vollständig kompensiert" bedeutet hier insbesondere, dass das Verhältnis der Anzahl an positiven Ladungen der Kationen zu negativen Ladungen der Nukleinsäure vorzugsweise größer oder gleich 0,5 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,6 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,7 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,8 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,9 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,91 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,92 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,93 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,94 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,95 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,96 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,97 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,98 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,985 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,99 ist, vorzugsweise größer oder gleich 0,995 ist, oder sogar gleich 1 ist. Das Verhältnis der Anzahl an positiven Ladungen der Kationen zu negativen Ladungen der Nukleinsäure kann beispielsweise in dem Bereich 0,5 - 2 liegen, z.B. im Bereich 0,6 - 1 ,8 liegen, im Bereich 0,7 - 1 ,3 liegen, im Bereich 0,8 - 1 ,2 liegen, im Bereich 0,9 - 1 ,1 liegen, im Bereich 0,91 - 1 ,09 liegen, im Bereich 0,92 - 1 ,08 liegen, im Bereich 0,93 - 1 ,07 liegen , im Bereich 0,94 - 1 ,06 liegen, im Bereich 0,95 - 1 ,05 liegen, im Bereich 0,96 - 1 ,04 liegen, im Bereich 0,96 - 1 ,04 liegen, im Bereich 0,97 - 1 ,03 liegen, im Bereich 0,98 - 1 ,02 liegen, im Bereich 0,99 - 1 ,01 liegen, im Bereich 0,995 - 1 ,005 liegen, oder sogar gleich 1 ist. Letzterer Wert wird insbesondere dann erzielt, wenn Kationen bei der Fällung der Nukleinsäure im Überschuss vorliegt und das Präzipitat aus organischen Kation und Nukleinsäure mit Wasser gewaschen wird „Mindestens ein organisches Kation" bedeutet, dass mindestens ein Typ an organischem Kation vorliegt (z.B. CTAB). Es können aber auch Kationengemische von zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, etc. unterschiedlichen organischen Kationen vorliegen (z.B. CTAB neben DDAB). Üblicherweise ist das mindestens eine organische Kation einfach positiv geladen. Dem Fachmann ist klar, dass der Ausdruck nicht auf die Stoffmenge abstellt.
„Mindestens ein organisches Lösungsmittel" bedeutet, dass mindestens ein organisches Lösungsmittel vorliegt. Es können aber auch Lösungsmittelgemische (z.B. unter Bildung einer homogenen Phase) eines organischen Lösungsmittels mit einem oder mehr, zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, etc. weiteren Lösungsmitteln, insbesondere weiteren organischen Lösungsmitteln vorliegen. Die Nukleinsäuren werden dann entsprechend in diesen Lösungsmittelgemischen gelöst. Bei Vorliegen eines nichthomogenen Gemisches mit mehreren Phasen liegen die Nuklei nsäurekomplexe erfindungsgemäß in einer organischen Phase eines organischen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches innerhalb des nichthomogenen Gemisches vor. Bei einem Öl/Wasser Gemisch würden erfindungsgemäß beispielsweise die Nukleinsäurekomplexe in der Ölphase vorliegen.
. Der Kunststoff kann z.B. als eigenständiger Feststoff vorliegen, er kann aber auch z.B. als Bestandteil eines Gegenstands oder einer Vorrichtung vorliegen, z.B. in Form einer Beschichtung. Üblicherweise wir der Kunststoff in den erfindungsgemäßen Verfahren direkt mit dem Lösungsmittel mit den darin enthaltenen Nukleinsäurekomplexen inkubiert. In solchen Ausführungsformen liegt nicht nur kein anderes organisches Lösungsmittel vor, sondern gar kein anderes Lösungsmittel.
Der im Verfahren vorgesehene optionale Schritt des Abtrennens des Kunststoffs von der Flüssigkeit umfassend mindestens einen organischen Lösungsmittel kann z.B. bedeuten, dass der Kunststoff von dem mindestens einen organischen Lösungsmittel (zumindest im Wesentlichen) abgetrennt wird, d.h. zum Beispiel ein kunststoffhaltiger Gegenstand aus dem Lösungsm ittel bad entnommen wird. Der Schritt soll nicht bedeuten, dass zwingend auch Lösungsmittel, dass in den Kunststoff eingedrungen ist, entfernt werden muss. Selbstverständlich ist es aber auch möglich, diese Restlösungsmittelmengen ebenfalls zu verringern oder zu entfernen, z.B. durch Trocknung des Kunststoffs. „Mindestens eine Nukleinsäure" bedeutet, dass mindestens eine Nukleinsäure vorliegt. Es können aber auch Nukleinsäuregemische von zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, etc. unterschiedlichen Nukleinsäuren vorliegen. Der Unterschied kann beispielsweise im Typ der Nukleinsäure (z.B. DNA neben RNA) und/oder der Sequenz der Nukleinsäuren (Länge und/oder Basenabfolge) begründet sein.
Unter einer „Nukleinsäure" ist erfindungsgemäß eine Nukleinsäure zu verstehen, deren Nukleoside durch Phosphatgruppen miteinander verknüpft sind, wobei die beteiligten Phosphatreste üblicherweise negativ geladen sind, wie es bei natürlich verkommender DNA oder RNA der Fall ist.
Mit anderen Worten handelt es sich bei den geladenen Nukleinsäuren um polyanionische Säuren (Polyelektrolyte), in denen die anionischen Gruppen durch die negativ geladenen Sauerstoffreste der Phosphatgruppen gebildet werden, die die Phosphordiestherbindungen bilden. Grundsätzlich kann es sich bei den die negativen Ladungen tragenden Resten der Nukleinsäuren auch um die negativen Reste von Phosphorthioaten oder Phosphordithioaten oder auch um andere negativ geladene Gruppen von Nukleinsäuren handeln.
Eine Nukleinsäure bzw. ein Nuklei nsäurekomplex aus Nukleinsäure und organischem Kation wird im Sinne der Erfindung als gelöst erachtet, wenn sie/er sich durch eine 5-minütige Zentrifugation bei 15000 x g nicht abzentrifugieren lässt.
Die Größe der Nukleinsäure ist erfindungsgemäß unkritisch. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Nukleinsäure um ein Oligonukleotid, d.h. um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA (oderDNA/RNA Hybride) mit einer Kettenlänge von etwa 2 bis etwa 150 Nukleotiden, bevorzugt von etwa 5 bis etwa 100 Nukleotiden, bevorzugt etwa 10 bis etwa 80 Nukleotiden, besonders bevorzugt etwa 20 bis etwa 60 Nukleotiden. Das Oligonukleotid ist vorzugsweise ein synthetisch hergestelltes Oligonukleotid mit bekannter Sequenz. Bei den Nukleinsäuren kann es sich beispielsweise um DNA, cDNA, mRNA, sRNA, Ribozyme, Antisense-DNA, RNA, Antisense RNA, siRNA, Decoys, tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, oder miRNA handeln. In einer besonderen Ausführungsform ist die Nukleinsäure keine siRNA. Für eine therapeutische Anwendung ist es besonders vorteilhaft, wenn die Nukleinsäuren zumindest einen Teil einer Sequenz eines (z.B. humanen oder tierischen) Genoms oder auch Gens enthalten. Für die kosmetische Anwendung kann es wiederum vorteilhaft sein, wenn die Nukleinsäuren keine Sequenz eines (humanen) Genoms oder auch Gens enthalten.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Nukleinsäure um einen Vektor oder um ein Plasmid, z.B. mit einer Größe von mehr als 1 kb (1000 Nukleotide). Die Größe des Vektors oder des Plasmids wird in der Regel mehr als 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 1 1 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb oder sogar mehr als 20 kb betragen. Es kann sich bei der Nukleinsäure, die in den Kunststoff eingebracht werden soll, z.B. um einen Gentherapie-Vektor handeln, der für die Expression in einem Säugetier verabreicht wird. Beispiele für Gentherapie-Vektoren, die sich für die erfindungsgemäße Einbringung eignen, umfassen beispielsweise virale und nicht-virale Vektoren. Virale Vektoren leiten sich von verschiedenen Viren ab, z.B. von Retroviren, Herpesviren, Adenoviren oder von Adeno- assoziierten Viren (AAV), siehe Lundstrom, Trends Biotechnol. (2003), 21 (3):1 1 7-22. Vorzugsweise handelt es sich bei den viralen Vektoren um solche, die nicht mehr in der Lage sind, sich in den damit transfizierten Zellen zu replizieren. Neben den viralen Vektoren können auch nicht-virale Vektoren, z.B. eukaryontische Expressionsvektoren, in die Zellen oder Gewebe eingebracht werden. Die Vektoren oder Plasmide umfassen vorzugsweise einen eukaryotischen Promotor, der in dem Säugetier aktiv ist.
Geeignete organische Kationen im Rahmen der vorliegenden Erfindung (bzw. Quellen für die Kationen) sind dabei beispielsweise kationische Detergenzien, Lipide und Stickstoffverbindungen mit quartärem Stickstoff, wie z.B. organische Ammoniumsalze. Insbesondere können als Quelle für organische Kationen eine oder mehrere Verbindungen der Formel NR4X verwendet werden, wobei R jeweils unabhängig voneinander ein Kohlen wasserstoffrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, der verzweigt oder unverzweigt sein kann, ist und X ein Halogen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlor, Brom, lod ist, insbesondere Chlor oder Brom, vorzugsweise Brom. Insbesondere enthält der Kohlenwasserstoffrest jedoch vorzugsweise nur C- und H-Atome.
Gemäß weiteren Ausführungsformen der Erfindung können die Quelle für das mindestens eine organische Kation eine oder mehrere Verbindungen der Formel NR1R2R3R4X sein, wobei R1, R2, R3 und R4 organische Reste darstellen, insbesondere Kohlenwasserstoffreste wie vorstehend definiert, und wobei zumindest R1 ein C1 -Rest ist und R2 bis R4 längerkettige Reste sind, oder
R1 und R2 jeweils ein C1 -Rest sind und R3 sowie R4 längerkettige Reste sind, oder
R\ R2 und R3 jeweils ein C1 -Rest sind und R4 ein längerkettiger Rest ist.
Insbesondere sind die Reste R1, R2, R3 und R4 jeweils und unabhängig voneinander wie nachstehend für "R" definiert.
R ist in den Verbindungen der Formel NR4X vorzugsweise ein Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, der verzweigt oder unverzweigt sein kann. Insbesondere können einer oder mehrere, insbesondere zwei oder drei, von R relativ kurzkettige Reste wie C1 bis C3, wie Methyl, Ethyl und Propyl sein, während ein R ein längerer Rest wie C8 oder C10 bis C20, insbesondere C10 bis C1 6, wie Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Cetyl, Heptadecyl, Icosanyl, Stearyl oder Nonadecyl ist. Eine bevorzugte Kombination von Resten R ist drei Methylreste und ein längerkettiger Rest, insbesondere ein wie vorstehend definierter C10 bis C20-Kohlenwasserstoffrest wie insbesondere ein Cetylrest wie in Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB). Vorzugsweise umfasst R keine aromatischen und/oder nicht-aromatischen Ringsysteme.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem mindestens einen organischen Kation (bzw. der Quelle für das Kation) um ein oder mehrere quartäre Amine, wobei CTAB besonders bevorzugt ist. Andere Verbindungen, die sich erfindungsgemäß für die Komplexierung der Nukleinsäuren eignen, umfassen Benzethoniumchlorid, Benzalkonium, Benzalkoniumchlorid, Didecyldimethylammoniumbromid (DCAB), Dodecyltrimethylammoniumbromid (DCTAB), DOTAP, Lipofectin, Lipofectamin N-[1 -(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium- chloride (DOTMA), Dimethyldioctadecyl-ammoniumbromid (DDAB), dioleyl- dimethylammoniumchloride (DODAC), 2,3-Dioleoyloxy-N-[2-(spermidin carboxy- amido)ethyl]-N-Ndimethyl-1 -propaniniumtrifluoracetat (DOSPA), Diheptadecylamidoglycyl- spermidin (DHGS) und Ähnliche. Vorzugsweise ist das organische Kation nicht Polylysin und oder TC-Chol.
Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung von Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischem Kation umfasst die Lösung mindestens einer Nukleinsäure in einer wässrigen Flüssigkeit, insbesondere Wasser (z.B. demineralisiert.es Wasser), und Präzipitation der mindestens einen Nukleinsäure durch Zugabe von mindestens einem organischem Kation, das mit der Nukleinsäure einen in der wässrigen Lösung unlöslichen Komplex bildet. Die derartig gewonnen Komplexe kann dann in einem organischen Lösungsmittel gelöst werden und anschließend ggf. mit weiteren Flüssigkeiten vermischt werden.
Insbesondere kann ein solches Verfahren die folgenden Schritte umfassen:
a') Bereitstellen einer Lösung mit mindestens einer in einer wässrigen Flüssigkeit gelösten Nukleinsäure,
b') Präzipitieren der mindestens einen Nukleinsäure durch Zusatz mindestens eines mit der Nukleinsäure in der wässrigen Flüssigkeit unlösliche Komplexe bildenden organischen Kations (Komplexbildner) zu der wässrigen Flüssigkeit,
c') Abtrennen der Komplexe von der wässrigen Flüssigkeit, und
d') optional Lösen der Komplexe in mindestens einem organischen Lösungsmittel, und e') ggf. Vermischen des mindestens einen organischen Lösungsmittels aus d') mit den darin gelösten Komplexen mit einer weiteren Flüssigkeit.
Vorzugsweise wird der Komplexbildner der wässrigen Flüssigkeit in Schritt b') in gelöster Form zugesetzt. Dadurch wird eine schnellere Präzipitation ermöglicht als beim Zusatz eines ungelösten Komplexbildners. Die Nukleinsäure wird dabei mit dem mindestens einen organischen Kation vorzugsweise so komplexiert, dass ein Verhältnis von im Wesentlichen 1 :1 (d.h. im Wesentlichen vollständig kompensiert) zwischen den negativen Ladungen (d.h. den anionischen Gruppen) der mindestens einen Nukleinsäure und den Ladungen des mindestens einen organischen Kations vorliegt. Insbesondere organische Kationen wie die oben erwähnten, z.B. CTAB, sind in der Lage, die positiv geladene Gruppe in einen ausreichend kleinen Abstand an das negativ geladene Sauerstoffatom der Nukleinsäure anzunähern, sodass eine ausreichende (lokale) Abschirmung der Gesamtladung beider Ionen bewirkt wird.
Vorteilhaft an der Einstellung eines solchen Verhältnisses ist, dass der Komplex aus organischen Kationen und Nukleinsäure insgesamt annähernd ladungsneutral ist, d.h. im Wesentlichen vollständig komplexiert ist. Die komplexierte Nukleinsäure ist daher in einem wässrigen Medium unlöslich und kann bei der Herstellung in wässrigen Medien als unlösliches Präzipitat abgetrennt werden. Diese Eigenschaft erleichtert somit die Herstellung der gewünschten, stöchiometrisch komplexierten Nukleinsäure. Das Abtrennen der Komplexe gemäß Schritt c') erfolgt daher vorzugsweise mittels Zentrifugati on oder Filtration. Diese Verfahren stellen eine besonders einfache und effiziente Art der Abtrennung der präzipitierten Komplexe dar. Das Präzipitat kann z.B. durch Zentrifugation zum Beispiel für 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, bei 10000 bis 20000 g, vorzugsweise 15000 g, abgetrennt werden. Gegebenenfalls kann dieser Vorgang nach erneuter Aufnahme des gefällten Niederschlags in Wasser mehrmals durchgeführt werden. Vorteilhaft an der Einstellung eines solchen Verhältnisses ist ferner, dass bei Kontakt der so komplexierten Nukleinsäure mit einer lebenden Zelle oder einem Organ eines Lebewesens keine bzw. nur wenige freie organische Kationen mit den Zellen oder dem Organismus wechselwirken können. Als Folge davon können die organischen Kationen keine cytotoxischen Effekte oder andere Störungen des Metabolismus bei den Zellen auslösen, was ansonsten häufig vorkommen kann.
Ein weiterer Vorteil der Einstellung einer stöchiometrischen Komplexierung ist die resultierende Löslichkeit in einer Vielzahl von organischen Lösungsmitteln einschließlich solchen, die allgemein als Fällungsmittel für Nukleinsäure aus wässriger Lösung gelten. Dies betrifft insbesondere die Verwendung von niederen Alkoholen wie Ethanol, Propanol oder Butanol. In derartigen Lösungsmitteln kann sogar eine Konzentration an komplexierter Nukleinsäure wie in neutralen oder wässrigen Medien erreicht werden, d.h. es können Konzentrationen von mehr als 10 pg Nukleinsäure pro μΙ Lösungsmittel erreicht werden, zum Beispiel in Methanol, Ethanol, Butanol, Dimethylsulfoxid oder Ethylenglykolethylether (EGE).
Ein weiterer Vorteil der Einarbeitung von Nukleinsäuren in organische Lösungsmittel ist die daraus resultierende Stabilität. Dies ist im Wesentlichen darauf zurückzuführen, dass Nukleasen in nicht-wässriger Umgebung inaktiv sind. Dies ist vor allem bei Verwendung von Ribonukleinsäure (RNA) als Nukleinsäure von Bedeutung, da in allen wässrigen Systemen mit einer hohen RNAse-Aktivität gerechnet werden muss. Außerhalb einer speziellen, RNAse-freien Umgebung, die praktisch nur unter speziellen Laborbedingungen realisiert werden kann, ist ansonsten mit einem schnellen Abbau der RNA zu rechnen, was insbesondere den Einsatz von RNA als Pharmakon erschwert. Dieses Problem wird durch die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Komplexierung mit anschließendem Einbau in einen Kunststoff gelöst.
Ferner ist die Stabilität der komplexierten, gelösten Nukleinsäuren auch dadurch erhöht, dass in dem eingesetzten organischen Lösungsmittel bzw. Kunststoff keine saure oder alkalische Umgebung mehr vorliegt. Dies vermeidet eine etwaige saure oder alkalische Hydrolyse der Nukleinsäurestrukturen.
Schließlich wirkt es sich auf die Stabilität der Nukleinsäure vorteilhaft aus, dass verglichen mit Wasser die optischen Eigenschaften des Lösungsmittels bzw. des Kunststoffs durch eine vergleichsweise höhere UV-Strahlungsabsorption gekennzeichnet sind. Dadurch wird die bei Verwendung von wässrigen Medien ansonsten mögliche UV-Schädigung der Nukleinsäurestrukturen vermindert bzw. vollständig vermieden. Zum Beispiel führt die Verwendung von Kunststoffen, die aromatische Strukturen enthalten, die bei einer Wellenlänge von um 260 nm absorbieren, zu einer weitestgehenden Abschirmung der für die Nukleinsäure schädigenden UV-Strahlung.
Im Zuge der Komplexierung der mindestes einen Nukleinsäuren können selbstverständlich wie oben erwähnt auch verschiedene organische Kationen Verwendung finden, indem man Mischungen unterschiedlicher organischer Kationen zu der nukleinsäurehaltigen wässrigen Flüssigkeit gibt, um die Nukleinsäure-Komplexe zu präzipitieren.
Die durch Präzipitation erhaltenen Komplexe werden bevorzugt in einem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch gelöst. Nach Aufnahme in einem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch enthält dieses im Wesentlichen vorzugsweise keine organischen Kationen, die über die zur Kompensation der negativen Ladungen der Nukleinsäure erforderliche Menge hinaus gehen. Dies bedeutet, dass die Anzahl der gesamten positiven Ladungen der organischen Kationen in dem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch im Wesentlichen mit der Anzahl der negativen Ladungen der Nukleinsäure identisch ist.
Organische Lösungsmittel, die besonders geeignet zur Aufnahme der Nuklei nsäurekomplexe sind, umfassen insbesondere ein- oder mehrwertige Alkohole oder teilweise veretherte Alkohole. Bevorzugt enthalten das oder die zusätzlichen Lösungsmittel daher mindestens eine Ether-Gruppe und/oder mindestens eine Hydroxyl-Gruppe. Als Lösungsmittel besonders gut geeignete (amphiphile) Verbindungen können durch die Formel HO-R1 -O-R2 beschrieben werden. Dabei ist R1 und R2 jeweils ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen. Insbesondere sind C1 bis C5-Alkohole geeignet, wie z.B. Methanol, Ethanol, 1 -Propanol oder 2-Propanol, Butanol, wie 1 -Butanol, oder Pentadiol, wie 1 -Pentadiol. Ferner sind mehrwertige Alkohole, wie Ethylenglykol oder teilweise veretherte Derivate davon, wie z.B. Ethylenglykol, das mit Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol verethert ist, wie beispielsweise Ethylenglykolether, wie insbesondere Ethylenglykolmonobutylether, -ethylether oder methylether, verwendbar. Alternativ können gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffe, wie Pentan, Hexan oder Heptan oder auf Benzol basierende aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Xylol oder Styrol, verwendet werden, also insbesondere mit C1 bis C3- Resten substituierte Benzole. Alternativ können halogenhaltige Lösungsmittel wie Chloroform, Dichlormethan oder Tetrachlorkohlenstoff oder andere heteroatomhaltige Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, verwendet werden. Ferner können Carbonsäurederivate wie Ester wie insbesondere Essigsäureethylester oder, Methacrylsäuremethylester, Ketone wie Aceton, Butanon, Amine, wie Ethanolamin, Amiden, wie Ν,Ν-Dimethylformamid; Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid; Nitrile, wie Acetonitril; Fette und Öle, wie Mandelöl, Distelöl, Walnussöl, Weizenkeimöl, Leinöl, oder Rizinusöl Verwendung finden.
Die nachstehende Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die Löslichkeit komplexierter Nukleinsäure am Beispiel von DNA in einer Reihe von speziellen Lösungsmitteln.
Tabelle 1 :
Figure imgf000016_0001
Nach Herstellung der komplexierten Nukleinsäure kann diese erfindungsgemäß durch Kontaktierung mit einem Kunststoff zu dem erfindungsgemäßen Kunststoff verarbeitet werden. Dazu wird im Allgemeinen vorzugsweise die wie zuvor beschrieben hergestellte komplexierte Nukleinsäure mit dem Kunststoffkörper unmittelbar in Kontakt gebracht und inkubiert.
Wie oben erwähnt, können als Kunststoffe Homopolymere, d.h. Polymere mit Einheiten, die von nur einem Monomer abgeleitet sind, oder Co-Polymere eingesetzt werden, d.h. Kunststoffe die von zwei oder mehreren Monomeren abgeleitete unterschiedliche Einheiten aufweisen. Geeignete Polymere bzw. Copolymere sind beispielsweise Polyolefine mit aliphatischen oder aromatischen Einheiten, Polyalkylene, Polyalkylene mit Ungesättigtheiten, halogensubstituierte Polyalkylene, Polyoxyalkylene, Polystyrol und Styrol-Copolymere, Polyester, Polyether, Polyamide, Polycarbonate, Polyurethane, Polysiloxane, Poly(meth)acrylsäure und deren Ester und weitere Derivate wie Polyacrylnitril, Polyvinylmaterialen wie Polyvinylacetate, -alkohole, -halogenide, etc. und Copolymere oder höhere Copolymere mit einer Kombination von Einheiten der vorstehenden Polymere wie Styrol-Acrylnitril-Copolymere oder Acrylnitril- Butadien-Styrol-Terpolymere sowie von natürlichen Polymeren abgeleitete Kunststoffe wie Celluloseester oder -ether. Besonders vorteilhaft ist, dass auch biologisch abbaubare Polymere wie z.B. Polylactide Verwendung finden können. Geeignet für dieses Verfahren sind alle Kunststoffe die in der genannten mindestens ein organisches Lösungsmittel umfassenden Flüssigkeit quellbar sind. Unter der Quellbarkeit ist die Aufnahme der Flüssigkeit in den Kunststoff zu verstehen. Geeignet sind alle Kunststoffe, die bei Kontakt mit der Flüssigkeit die Flüssigkeit zu einer Konzentration von mehr als 0,1 Gewichtsprozent (1 mg Flüssigkeit mit komplexierter Nukleinsäure) aufnehmen können.
Erfindungsgemäß werden die Nukleinsäurekomplexe in Kunststoffe eingebracht, die im entsprechend für die Lösung der Nukleinsäure-Komplexe verwendeten Lösungsmittel quellbar aber vorzugsweise unter den Bedingungen des Kontakts mit den gelösten Nukleinsäurekomplexen nicht löslich sind. Falls der Kunststoff im gewählten Lösungsmittel löslich sein sollte, so wird die Inkubationszeit zwischen Nukleinsäurekomplexlösung und Kunststoff so gewählt, dass der Kunststoff (zumindest im Wesentlichen) noch nicht gelöst ist und noch als Feststoff abgetrennt werden kann. Weil der Kunststoff nicht gelöst werden soll, behält der Kunststoff bzw. kunststoffhaltige Gegenstand also vorzugsweise - zumindest im Wesentlichen - seine Form, z.B. die für seine (medizinische) Nutzung notwendige Form. Eine Kunststoffkontaktlinse bleibt eine Kunststoffkontaktlinse, ein chirurgischer Kunststofffaden bleibt ein Kunststofffaden, etc. Alternativ können die entsprechenden lösungsgefährdeten Kunststoffe auch als quervernetzte Kunststoffe eingesetzt werden, so dass die Lösung des Kunststoffs nicht mehr gegeben ist.
Die folgende Liste von Kunststoffen in Tabelle 2 nennt erfindungsgemäß geeignete Beispiele für Kunststoffe, wobei diese Liste nicht einschränkend zu verstehen ist. Die nachstehende Tabelle gibt ferner Lösungsmittel an, die zur Lösung des jeweiligen Kunststoffs führen könnten.
Tabelle 2:
Polymer Losung sjrflittel
Dimethyl-
Dichlormethan formamid Methanol Tetrahydrofuran Xylol
Acylnitril-Butadien-Styrol x X X
Celluloseacetat X X X X
Cellulosetriacetat X
Cellulosemethylether X
Polyacrylester X
Polyacrynitril X
Polyacrylsäure X X
Polyacrylsäureester X X
Polymethacrylsäureester X X
Polybutadien X X X X
Polybuten-1 X
Polycarbonat X X X
Poly-e-caprolacton X
Polydimethylsiloxan X
Polyester
(aliphatisch) X
Polyethylen X
Polyethylenoxid X
Polyformaldehyd X
Polyisobutylen X
Polymethacrylat X X X
Polyoxymethylen X X
Polypropylen
(isotaktisch) X
Polystyrol X X X X X
Polytrifluorchlorethylen X
Polyvinylacetat X X
Polyvinylalkohol X
Polyvinylchlorid X X
Polyvinylfluorid X
Polyisobutylether X
Styrol-Acrylnitril-
Copolymere X X X X
Polylactid X
Die abschließende optional Abtrennung des Lösungsmittels erfolgt dann beispielsweise durch Abziehen unter Vakuum oder durch Waschen in einer physiologischen Lösung wie z.B. 0,9% (w/v) Kochsalzlösung. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Es ist bevorzugt, wenn bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung der Kunststoff nicht erst polymerisiert wird, während er mit der komplexierten Nukleinsäure kontaktiert wird.
Die erfindungsgemäßen Kunststoffe können vorteilhaft beispielsweise als Mikropartikel, Nanopartikel, Pellets, Granulat, Faser (z.B. als Faden), Folie etc. vorliegen oder entsprechend zu selbigen nach Aufnahme der Nukleinsäurekomplexe verarbeitet werden. Die Kunststoffe können so beispielsweise Implantate, Herzklappen, Prothesen und ähnlichen Gegenstände sein oder Teile davon sein oder dazu verarbeitet werden und/oder auf diesen Gegenständen als Beschichtungen aufgebracht werden. Z.B. kann ein erfindungsgemäß hergestellter Kunststoff mit einer komplexierten DNA, die für Proteine kodiert, als Teil (z.B. als Beschichtung oder als Bauteil) eines Implantats verwendet werden, um ein besseres Anwachsen im Körper zu ermöglichen. Genauso kann ein Ansiedeln von Zellen auf dem Implantat verhindert werden. Z.B. ist eine Ansiedlung von Zellen auf Stents unerwünscht. Wie bereits erwähnt müssen die erfindungsgemäßen Kunststoffe nicht notwendigerweise weiterverarbeitet werden, z.B. wenn es sich bei dem Kunststoff bereits um ein kunststoffhaltiges Endprodukt handelt, dass nur noch Nukleinsäuren aufnehmen soll.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Kunststoffe noch mindestens ein pharmazeutisch oder kosmetisch verträglicher Hilfsstoff zugesetzt, z.B. um später die pharmazeutische bzw. kosmetische Wirksamkeit einer vom Kunststoff freigesetzten Nukleinsäure zu gewährleisten. Dem Fachmann sind zahlreiche derartige Hilfsstoffe bekannt. Besonders bevorzugt ist der Hilfsstoff ein pharmazeutisch oder kosmetisch verträgliches Öl, Wachs oder Fett.
Geeignete Öle, die als Hilfsstoff Anwendung finden können, umfassen beispielsweise synthetische, tierische und pflanzliche Öle. Ebenso umfassen geeignete Wachse bzw. Fette synthetische, tierische und/oder pflanzliche Wachse bzw. synthetische, tierische und/oder pflanzliche Fette.
Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn die Öle keine synthetischen Öle sind, sondern z.B. tierische und/oder pflanzliche Öle. Geeignete pflanzliche Öle sind z.B. Nussöle und Samenöle. Geeignete pflanzliche Öle umfassen insbesondere Erdnussöl, Walnussöl, Mandelöl, Haselnussöl, Kokosnussöl, Sojabohnenöl, Olivenöl, Mohnöl, Hanföl, Kürbiskernöl, Sonnenblumensamenöl, Sesamsamenöl, Baumwollsamenöl, Distelöl, Leinöl, Rapsöl, Ricinusöl und Ähnliche. Auch aus Getreide gewonnene Keimöle können vorliegend als Träger verwendet werden. Bevorzugte Keimöle umfassen z.B. solche, die aus Mais, Weizen, Hafer, Roggen, Reis und Triticale gewonnen werden. Als geeignete pflanzliche Fette können beispielsweise Kokosfett oder Kakaobutter verwendet werden. Mögliche pflanzliche Wachse umfassen bspw. Zuckerrohrwachs, Carnaubawachs, Jojobaöl, Candelillawachs und Japanwachs.
Neben pflanzlichen Ölen, Wachsen und Fetten können auch tierische Fette, Wachse und Öle, wie z.B. Fischöle oder aus Nerzen oder Hirschen gewonnene Öle und Fette, eingesetzt werden. Lebertran und Walöl (wie beispielsweise aus Spermaceti) sind Beispiele für Fischöle, die vorliegend verwendet werden können. Mögliche Quellen für tierische Wachse sind beispielsweise Walrat, Wollwachs und Bienenwachs. Geeignete Verfahren zur Gewinnung reiner Öle, Wachse und Fette tierischen Ursprungs sind im Stand der Technik bekannt.
Ggf. können auch pharmazeutisch bzw. kosmetisch verträgliche synthetische Öle, Fette und Wachse eingesetzt werden. Geeignete synthetische Öle und Fette basieren zum Beispiel auf Silikon- oder Paraffinverbindungen. Ein Beispiel ist Vaseline. Sojawachs kann durch Hydrierung aus Soja gewonnen werden und ist ein Beispiel für ein synthetisches Wachs.
Der Hilfsstoff kann zu einem geeigneten Zeitpunkt bei der Herstellung der Kunststoffe mit verarbeitet werden. Z.B. können die Nuklei nsäurekomplexe vor Kontakt mit dem Kunststoff gelöst in einem Gemisch aus organischem Lösungsmittel und Öl vorliegen, z.B. einem DMSO- Öl Gemisch. Der Hilfsstoff wird dann gemeinsam mit den Nukleinsäuren in den Kunststoff aufgenommen. Alternativ kann der Hilfsstoff beispielsweise nachträglich dem Kunststoff zugesetzt werden, z.B. der Kunststoff mit einem Öl beschichtet werden, dass ggf. die Nukleinsäuren wieder aus dem Kunststoff lösen kann.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Kunststoff, der gemäß einem erfindungsgemäßem Verfahren hergestellt wurde. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung daher auch einen Kunststoff, der Nukleinsäurekomplexe wie hierein beschrieben und ggf. ein organisches Lösungsmittel umfasst, wobei der Kunststoff vorzugsweise einen Konzentrationsgradienten bzgl. der Nukleinsäurekomplexe aufweist (siehe oben). Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäß hergestellten Kunststoffs in einem Verfahren zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, oder zur Verwendung in einem Diagnostizierverfahren, das am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1 Einbringung von komplexierter DNA in chirurgische Fäden (Polyamid-Faden); A) EtBr- CTAB-DNA in Methanol; B) EtBr-CTAB-DNA in Ethanol; C) EtBr-CTAB-DNA in Butanol; D) EtBr-CTAB-DNA in DMSO; E) EtBr-CTAB-DNA in EGE; F) Kontrolle Ethanol ohne EtBr-CTAB-DNA. Der Nachweis erfolgte über Fluoreszenzmikroskopie.
Fig. 2 Einbringung von komplexierter DNA in Kontaktlinsen; A) Kontaktlinse nach Inkubation in Ethanol mit EtBr-CTAB-DNA (links) und ohne EtBr-CTAB-DNA (rechts); B) Freigabe der EtBr-CTAB-DNA. Gezeigt ist das Eluat nach 2 Monaten Elution in Kochsalzlösung mit behandelter Linse (links) und die Kontrolle (rechts); C) Segmente einer Kontaktlinse nach Inkubation in verschiedenen EtBr-CTAB-DNA-haltigen Flüssigkeiten: obere Reihe von links nach rechts: Methanol; Ethanol; Butanol; Chloroform; untere Reihe von links nach rechts: DMSO, EGE; Benzylalkohol.
Fig. 3 Aufnahme von komplexierter DNA in Kunststoffgranulate mit verschiedenen Lösungsmitteln; A) Aufnahme in Polyamid, PA-6: Von links nach rechts: Kontrolle; Methanol; Ethanol; Butanol; leer; DMSO; EGE; Chloroform; Kontrolle; B)Aufnahme in Polycarbonat PC: Von links nach rechts: Kontrolle; Methanol; Ethanol; Butanol; Benzylalkohol; leer; EGE; leer; Kontrolle.
Die folgenden Ausführungsbeispiele veranschaulichen weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Beispiele
Soweit nicht anders bezeichnet stammen alle Chemikalien von der Firma Sigma Aldrich Chemie GmbH, Eschenstrasse 5, 82024 Taufkirchen, Deutschland. Beispiel 1
Herstellung von komplexierter Nukleinsäure in Butanol
10 mg Heringssperma DNA wurden in 1 ml demineralisiertem Wasser gelöst.. Zu der entstandenen Lösung wurde ein gleiches Volumen 100 mM wässriger Lösung von Cetyltrimethylammoniumbromid gegeben und die Flüssigkeit gemischt. Es entstand ein gelber Niederschlag, der durch 5 min Zentrifugation bei 15.000 Upm abzentrifugiert wurde. Die flüssige Oberphase wurde verworfen und der Niederschlag in 1 ml demineralisiertem Wasser suspendiert und erneut wie oben zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde verworfen und der Niederschlag über Nacht im Vakuum getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde in 1 ml Butanol gelöst.
Beispiel 2
Herstellung von komplexierter Nukleinsäure in Ethylenglycolmonoethylether
10mg Heringssperma DNA wurden in 1 ml demineralisiertem Wasser gelöst. Zu der entstandenen Lösung wurde ein gleiches Volumen 100 mM wässriger Lösung von Cetyltrimethylammoniumbromid gegeben und die Flüssigkeit gemischt. Es entstand ein gelber Niederschlag, der durch 5 min. Zentrifugation bei 15.000 g abzentrifugiert wurde. Die flüssige Oberphase wurde verworfen und der Niederschlag in 1 ml demineralisierten Wasser suspendiert und erneut wie oben zentrifugiert. Die wässriger Phase wurde verworfen und der Niederschlag über Nacht im Vakuum getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde in 1 ml Ethylenglycolmonoethylether gelöst.
Beispiel 3
Ermittlung der Mindestlöslichkeit von komplexierter Nukleinsäure in verschiedenen Lösungsmitteln
1 g Heringssperma-DNA wurden in 100 ml demineralisiertem Wasser gelöst. Je 0,5 ml wurden in Kunststoffreaktionröhrchen überführt. In jedes Röhrchen wurde 0,5 ml wässrige 100mM CTAB-Lösung zugefügt. Die Röhrchen wurden gevortext. Es entstand ein weißer Niederschlag, der durch Zentrifugation für 5 min bei 10.000 x g sedimentiert wurde. Der Überstand wurde verworfen, der Niederschlag in Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut verworfen und der Niederschlag über Nacht unter Vakuum getrocknet.
Je 0,5 ml der folgenden Lösungsmittel: Methanol, Ethanol, Butanol, Ethylenglykolmonobutylether, Propanol wurden in jeweils ein Röhrchen gegeben und mit dem Niederschlag bei Raumtemparatur geschüttelt. Der Niederschlag wurde durch die Lösungsmittel gelöst. Um zu prüfen, ob die komplexierte Nukleinsäure als Suspension vorliegt, wurden die Röhrchen für 5min bei 10.000xg zentrifugiert. Nach der Zentrifugation war kein Niederschlag sichtbar.
Je 100 μΙ der komplexierten DNA in Butanol und Ethylenglykolmonobutylether (10 mg/ml) wurden zu je 900 μΙ der folgenden Lösungsmittel:, Chloroform, Dichlormethan, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, , Styrol, Tetrachlorkohlenstoff, Tetrahydrofuran gegeben und gemischt. Es entstanden klare Lösungen. Um zu prüfen, ob die komplexierte Nukleinsäure als Suspension vorliegt, wurden die Röhrchen für 5 min bei 10.000 xg zentrifugiert. Nach der Zentrifugation war kein Niederschlag sichtbar.
Beispiel 4
Herstellung von CTAB-DNA mit Ethidiumbromid
In ein 50ml Schraubdeckel-Röhrchen wurde 300mg Lachssperm-DNA eingeführt und in 30ml Wasser gelöst. Die DNA-Lösung wurde mit 20ml einer 100mM CTAB- Lösung, die 5mM Ethidiumbromid enthielt versetzt und gemischt. Die entstandene Trübung der Ethidium-CTAB- DNA wurde durch 15min Zentrifugation bei 5000 x g niedergeschlagen. Der Niederschlag wurde in 30ml Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der der Ethidium-CTAB-DNA-Niederschlag im Speedvac über Nacht getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde in den gewünschten Lösungsmittel (Ethanol, DMSO) zu einer Konzentration von 1 oder 10mg/ml aufgenommen.
Beispiel 5
Einbringung von komplexierter DNA in chirurgische Fäden
Ethidiumbromid-CTAB-DNA (EtBr-CTAB-DNA) wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt und zu einer 1 % (w/v) CTAB-DNA Lösung in DMSO aufgenommen. Je 10μΙ 1 % EtBr-CTAB- DNA in DMSO wurden mit je 90μΙ folgender Lösungsmittel versetzt: Methanol, Ethanol, Butanol, Benzylalkohol, DMSO, Ethylenglycolmonoethylether (EGE). So entstanden Lösungen mit einer Konzentration von 0,1 % (w/v) EtBr-CTAB-DNA in den oben genannten Lösungsmitteln mit 10% (v/v) DMSO-Anteil. Die gleichen Mischungen mit den Lösungsmitteln wurden mit DMSO ohne EtBr-CTAB-DNA hergestellt.
Ein Polyamid-Faden (Ethilon, Ethicon, Norderstedt, Deutschland) wurde in ca. 0,5cm lange Stücke zerschnitten. Je ein Faden wurde in einem 500μΙ Kunststoff-Röhrchen mit je 100μΙ der verschiedenen EtBr-CTAB-DNA -haltige Lösungen aufgebracht. Parallel wurden Fäden im gleichen Volumen Lösungsmittel ohne EtBr-CTAB-DNA eingebracht. Die Proben wurden 24 Std. bei RT°C inkubiert. Zur Entfernung der freien EtBr-CTAB-DNA wurde die Fäden mit Ethanol gespült. Zum Nachweis der Aufnahme der EtBr-CTAB-DNA wurde die Fäden im Floureszenzmikroskop beobachtet und fotografiert. Die EtBr-CTAB-DNA konnte nach Kontakt der Fäden mit den EtBr-CTAB-DNA-haltigen Lösungen in den Fäden anhand ihrer Fluoreszenz nachgewiesen werden. Die Kontrollen ohne EtBr-CTAB-DNA zeigten keine Fluoreszenz. Beispiel 6
Einbringung von komplexierter DNA in Kontaktlinsen
EtBr-CTAB-DNA wurde wie oben beschrieben hergestellt und zu einer 0,1 % (w/v) EtBr- CTAB- DNA Lösung in Ethanol aufgenommen. Eine Kontaktlinse (Biomedics 55, Ocufilcon D, Copolymer von 2-Hydroxyethylmethacrylat und Methacrylsäure, Lensshop24.de, Vechelde, Deutschland ) wurde in ein 2ml Kunststoffgefäß überführt und mit EtBr- CTAB-DNA Lösung in Ethanol überschichtet. Die Kontaktlinse wurde über Nacht in der Lösung bei Raumtemperatur inkubiert. Durch die Inkubation wurde die Linse deutlich rot gefärbt. Die Kontaktlinse wurde aus dem Kunststoffgefäß entnommen und mehrfach in Ethanol gespült, um freies EtBr- CTAB- DNA Lösung in Ethanol zu entfernen. Zum Nachweis der aufgenommenen EtBr-CTAB-DNA wurde die Kontaktlinse auf einem UV-Kasten fotografiert. Anhand der Fluoreszenz der EtBr- CTAB-DNA konnte die Aufnahme der komplexierten DNA nachgewiesen werden. Eine Kontaktlinse, die wie oben beschrieben in Ethanol ohne EtBr- CTAB-DNA behandelt war, zeigte keinerlei Fluoreszenz. Um die Freigabe der EtBr-CTAB-DNA zu beobachten wurde die Linse in 1 ,5ml 0,9% (w/v) Kochsalzlösung eingelegt. Durch die Inkubation in Kochsalzlösung konnte ein Anteil der EtBr-CTAB-DNA wieder eluiert werden.
Eine weitere Kontaktlinse wurde in mehrere Fragmente zerschnitten und diese in den Vertiefungen einer 96well-Mikrotitelplatte mit 0,1 % EtBr-CTAB-DNA in verschiedenen Lösungsmitteln über Nacht inkubiert. Folgende Lösungsmittel wurden verwendet: Methanol; Ethanol, Butanol, Chloroform DMS, Ethylglycolmonoethylether (EGE) und Benzylalkohol. Danach wurden die Fragmente mit Methanol gewaschen und auf einem UV-Kasten fotografiert. Anhand der Fluoreszenz konnte in allen Fragmente die EtBr-CTAB-DNA nachgewiesen werden.
Beispiel 7
Aufnahme von komplexierter DNA in Kunststoffgranulate
EtBr-CTAB-DNA wurde wie oben beschrieben hergestellt und einer 1 % (w/v) CTAB-DNA Lösung in DMSO aufgenommen. Je Ί ΟμΙ 1 % (w/v) EtBr-CTAB-DNA in DMSO wurden mit je 900μΙ folgender Lösungsmittel versetzt: Methanol, Ethanol, Butanol, Benzylalkohol, DMSO, Ethylenglycolmonoethylether. So entstanden Lösungen mit einer Konzentration an 0,1 % (w/v) EtBr-CTAB-DNA in den oben genannten Lösungsmitteln mit 10% (v/v) DMSO-Anteil. Die gleichen Mischungen mit den Lösungsmitteln wurden mit DMSO ohne EtBr-CTAB-DNA hergestellt.
In je sieben 2ml Polypropylen-Kunststoff-Röhrchen wurden je 5 Granulatpartikel (Größe ca. 2mm x 1 mm x 1 mm) eines Polyamid-Granulats (PA-6, Zytel 7335F; DuPont, Bad Homburg, Deutschland) und eines Polycarbonat-Granulates (PC, Makroion AL2647, Bayer, Leverkusen, Deutschland) eingeführt. Die Granulate wurden mit ca. 1 ,5ml der 0,1 %igen EtBr-CTAB-DNA- Lösungen in den oben genannten Lösungsmitteln versetzt. Die Röhrchen wurden über mehrere Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Nach definierten Zeiten (1 Std, 2 Std, 1 Tag, 4 Tage und 5 Tage) wurden je ein Granulat entnommen und das anhaftende Lösungsmittel durch Spülen mit Methanol entfernt. Die Granulate wurde auf einen UV-Kasten überführ und unter UV-Licht fotografiert. Als Kontrollen wurden Granulate verwendet. Anhand der Fluoreszenz zeigte es sich, dass sowohl das Polyamid-Granulat als auch das Polycarbonat-Granulat die Granulate bereits nach einer Inkubation von einer Std. EtBr-CTAB-DNA aufgenommen hatten.
Beispiel 8
Bestimmung der CTAB-DNA-Partikelgröße in DMSO-Wasser Mischungen
Für die Einbringung der Nukleinsäuren in Säugerzellen über die Haut ist die Partikelgröße der CTAB-DNA-Partikel von Bedeutung. Kleinere Partikel können leichte die Haut durchdringen und von der Zellmembran aufgenommen werden. Daher wurde die CTAB-DNA-Partikelgröße mittels dynamischer Lichtstreuung bestimmt.
200μΙ einer 1 % (w/v) Lachssperma-DNA - entsprechend 2mg - in Wasser wurden in ein 2ml Röhrchen eingefüllt. Die DNA wurde mit einem gleichem Volumen 100mM CTAB ausgefällt und der Niederschlag durch Zentrifugation (5min, 10.000 x g) präzipitiert. Das Pellet wurde in 500μΙ Wasser suspendiert und erneut zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde über Nacht im Speedvac getrocknet. In das Röhrchen wurde ein Volumen von 2ml DMSO eingefüllt und das CTAB-DNA-Pellet über Nacht geschüttelt (800 Upm). Es entstand eine klare Lösung. Die CTAB- DNA-Lösung in DMSO wurde 1 :10 mit DMSO und Wasser verdünnt, so dass verschiedene DMSO-Wasser-Mischungen im Konzentrationsbereich mit einem DMSO-Gehalt (v/v) zwischen 10 - 100% entstanden. Je 0,5 ml der verschiedenen CTAB-DNA Lösungen in den DMSO- Wasser Mischungen wurde in Kunststoffküvetten überführ und die die Partikelgröße mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung mit einem (Zetasizer, Malvern Instruments GmbH, 71083 Herrenberg ) gemessen.
Es ergab sich bei hohen DMSO-Konzentrationen größer als 80% (v/v) DMSO ein mittlerer Partikeldurchmesser von ca. 10nm, der sich bei zunehmendem Wassergehalt auf mehr als das 10fache erhöhte.
DMSO H20
Konzentration mittlerer Konzentration
Vol. Konz. Partikeldurchmesser Vol. Konz.
% (v/v) Nm (SD) % (v/V)
10 227 (6,7) 90
20 139 (7,1 ) 80
33 154 (5,5) 66
40 183 (6,2) 60
50 168 (4,0) 50
60 8 (3) 40
60 10 (3,1 ) 40
70 60 (4,5) 30
80 7 (1,5) 20
90 13 (2,1 ) 10
100 10 (1 ,2) 0

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Herstellung nukleinsäurehaltiger Kunststoffe, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) In-Kontakt-Bringen:
i) von Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation;
ii) einer Flüssigkeit umfassend mindestens ein organisches Lösungsmittel, wobei die Flüssigkeit so gewählt ist, dass sich die Komplexe aus i) bei Kontakt mit der Flüssigkeit in dem organischen Lösungsmittel lösen; und
iii) mindestens einem Kunststoff und/oder einem Kunststoff umfassenden Gegenstand wobei der Kunststoff in der Flüssigkeit aus ii) quellbar aber unter den Bedingungen des In-Kontakt-Bringens nicht löslich ist;
b) ggf. Abtrennen des Kunststoffs von der Flüssigkeit.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
a) Bereitstellen einer Flüssigkeit umfassend mindestens ein organisches Lösungsmittel, wobei das organische Lösungsmittel darin gelöste Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation enthält,
b) In-Kontakt-Bringen eines Kunststoffs und/oder eines einen Kunststoff umfassenden Gegenstands mit der Flüssigkeit, wobei der Kunststoff in der Flüssigkeit quellbar aber unter den Bedingungen des In-Kontakt-Bringens nicht löslich ist;
c) ggf. Abtrennen des Kunststoffs von der Flüssigkeit.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
a) Bereitstellen von Komplexen aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation,
b) In-Kontakt-Bringen der Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem organischen Kation mit einer Flüssigkeit die: i) mindestens ein organisches Lösungsmittel enthält, wobei bei Kontakt der Flüssigkeit mit den Komplexen aus a) diese Komplexe in dem organischen Lösungsmittel löslich sind, und
ii) einen Kunststoff oder einen Kunststoff umfassenden Gegenstand enthält, wobei der Kunststoff in der Flüssigkeit quellbar aber unter den Bedingungen des In-Kontakt-Bringens nicht löslich ist;
c) ggf. Abtrennen des Kunststoffs von der Flüssigkeit.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure derart komplexiert ist, dass die negativen Ladungen der Nukleinsäure durch positive Ladungen organischer Kationen im Wesentlichen vollständig kompensiert sind, insbesondere wobei das Molverhältnis zwischen den anionischen Ladungen der mindestens einen Nukleinsäure und den Ladungen der organischen Kationen im Wesentlichen 1 :1 beträgt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schritt des InKontakt-Bringens eine Inkubationsphase von 1 Minute oder mehr, bevorzugt 5 Minuten oder mehr, besonders bevorzugt 10 Minuten oder mehr, besonders bevorzugt 1 Stunde oder mehr umfasst.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kunststoff entweder in der Flüssigkeit unlöslich ist oder der Schritt des In-Kontakt-Bringens eine Inkubationsphase umfasst, die so gewählt ist, dass der Kunststoff in der Flüssigkeit nicht vollständig in Lösung geht.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die organischen Kationen quartäre Amine umfassen, insbesondere wobei die organischen Kationen Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) umfassen.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Flüssigkeit umfassend mindestens ein organisches Lösungsmittel mindestens ein synthetisches, pflanzliches oder tierisches Öl und/oder synthetisches, pflanzliches oder tierisches Fett und/oder synthetisches, pflanzliches oder tierisches Wachs umfasst.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der mindestens einen Nukleinsäure um DNA, RNA, oder DNA/RNA Hybride handelt, insbesondere wobei es sich bei der mindestens einen Nukleinsäure um DNA, RNA, oder DNA/RNA Hybride einer Größe von 10-100 Basen handelt.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kunststoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polymeren von Hydroxyethylmethacrylat und/oder Methacrylsäure, Polyamid, Polystyrol, Polycarbonat, SAN-Polymeren (Styrol-Acrylnitril- Copolymere), Acryl-Butadien-Styrol-Copolymer, Polymethylmethacrylat, biologisch abbaubarem Kunststoff wie Polylactiden, und Kunststoff mit Estergruppen.
1 1 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine organische Lösungsmittel ein Alkohol, wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, oder DMF, DCM, THF, Heptan, Xylol, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, und/oder Dimethylsulfoxid umfasst.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kunststoff als Mikropartikel, Nanopartikel, Pellet, Faser (z.B. als Faden) oder Folie vorliegt.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kunststoff Bestandteil eines medizinischen Gegenstands ist, insbesondere wobei der medizinische Gegenstand zumindest teilweise mit dem Kunststoff beschichtet ist oder ein entsprechendes Kunststoffbauteil aufweist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der medizinische Gegenstand ein Implantat, eine Endoprothese, ein chirurgisches Nahtmaterial, ein Stent, ein Katheter oder eine Kontaktlinse ist.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kunststoff in der Flüssigkeit unter der Aufnahme der Flüssigkeit von größer als 0,1 % (w/w) quellbar ist.
16. Kunststoff hergestellt nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 15.
1 7. Medizinischer Gegenstand umfassend einen Kunststoff nach Anspruch 16.
18. Kunststoff nach Anspruch 16 oder medizinischer Gegenstand nach Anspruch 1 7 zur Verwendung in einem Verfahren zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, oder zur Verwendung in einem Diagnostizierverfahren, das am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen wird.
PCT/EP2012/004270 2011-10-11 2012-10-11 Verfahren zur herstellung von kunststoffen enthaltend nukleinsäuren in komplexierter form WO2013053483A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12772238.7A EP2766057A1 (de) 2011-10-11 2012-10-11 Verfahren zur herstellung von kunststoffen enthaltend nukleinsäuren in komplexierter form

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11008200 2011-10-11
EP11008200.5 2011-10-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013053483A1 true WO2013053483A1 (de) 2013-04-18

Family

ID=47018134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2012/004270 WO2013053483A1 (de) 2011-10-11 2012-10-11 Verfahren zur herstellung von kunststoffen enthaltend nukleinsäuren in komplexierter form

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP2766057A1 (de)
WO (1) WO2013053483A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102017007181A1 (de) 2017-07-28 2019-01-31 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Herstellung und fälschungssicheren Authentifizierung eines Medizinprodukts durch Verwendung einer Nukleinsäure mit bekannter Teilsequenz

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040058374A1 (en) 2002-08-30 2004-03-25 Jun-Jei Sheu Method for mixing nucleic acid with a water insoluble medium and appalication thereof
DE60115203T2 (de) 2000-01-24 2006-08-03 Biocompatibles Uk Ltd., Farnham Beschichtete implantate
DE69637171T2 (de) 1995-07-21 2008-03-20 Brown University Research Foundation Zusammensetzungen zur gentherapie die nukleinsäure-beladenen polymer-mikropartikeln enthalten
US20100260846A1 (en) * 2009-04-08 2010-10-14 Surmodics, Inc. Particles for delivery of nucleic acids and related devices and methods
EP2380602A1 (de) * 2010-04-14 2011-10-26 Secutech International Pte. Ltd. Kunststoffe enthaltend Nukleinsäuren in komplexierter Form und Verfahren zu deren Herstellung

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69637171T2 (de) 1995-07-21 2008-03-20 Brown University Research Foundation Zusammensetzungen zur gentherapie die nukleinsäure-beladenen polymer-mikropartikeln enthalten
DE60115203T2 (de) 2000-01-24 2006-08-03 Biocompatibles Uk Ltd., Farnham Beschichtete implantate
US20040058374A1 (en) 2002-08-30 2004-03-25 Jun-Jei Sheu Method for mixing nucleic acid with a water insoluble medium and appalication thereof
US20100260846A1 (en) * 2009-04-08 2010-10-14 Surmodics, Inc. Particles for delivery of nucleic acids and related devices and methods
EP2380602A1 (de) * 2010-04-14 2011-10-26 Secutech International Pte. Ltd. Kunststoffe enthaltend Nukleinsäuren in komplexierter Form und Verfahren zu deren Herstellung

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VON RETROVIREN; HERPESVIREN: "Adenoviren oder von Adenoassoziierten Viren (AAV), siehe Lundstrom", TRENDS BIOTECHNOL., vol. 21, no. 3, 2003, pages 117 - 22

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102017007181A1 (de) 2017-07-28 2019-01-31 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Herstellung und fälschungssicheren Authentifizierung eines Medizinprodukts durch Verwendung einer Nukleinsäure mit bekannter Teilsequenz
DE102017007181B4 (de) 2017-07-28 2022-12-22 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Herstellung und fälschungssicheren Authentifizierung eines Medizinprodukts durch Verwendung einer Nukleinsäure mit bekannter Teilsequenz

Also Published As

Publication number Publication date
EP2766057A1 (de) 2014-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60115203T2 (de) Beschichtete implantate
DE69535540T9 (de) Zusammensetzung enthaltend nukleinsäuren und kationische polymere, zubereitung und verwendung
Chauhan et al. Optimization and characterization of rivastigmine nanolipid carrier loaded transdermal patches for the treatment of dementia
EP1313768A2 (de) Antisense oligonukleotide gegen vr 1
DE102009006606A1 (de) Nicht-virales Transfektionsmittel
DE60038664T2 (de) Genträger
CN110974778B (zh) 一种高载药量的缓释微凝胶药膏及其制备方法与应用
DE69925757T2 (de) Dextran-maleinsäuremonoester und hydrogele daraus
CN111989123A (zh) 用于药物递送的组合物和方法
EP1061904A1 (de) Nanopartikel, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
WO2013053481A1 (de) Dimethylsulfoxid als lösungsmittel für nukleinsäuren
WO2013053480A1 (de) Zusammensetzung zur einbringung von nukleinsäuren in zellen
EP2760437A1 (de) Sprühsystem zur erzeugung einer in situ gebildeten matrix
WO2013053483A1 (de) Verfahren zur herstellung von kunststoffen enthaltend nukleinsäuren in komplexierter form
DE10226702A1 (de) Antisense Oligonukleotide gegen PIM1
WO2005033310A1 (de) Pim-1-spezifische dsrna-verbindungen
EP1487514B1 (de) Abscheidungsverfahren für endoprothesen zur gleichmässigen medikamentenabgabe
EP2380602B1 (de) Kunststoffe enthaltend Nukleinsäuren in komplexierter Form und Verfahren zu deren Herstellung
CH639560A5 (en) Pharmaceutical preparation having a prolonged uniform active compound release
WO2018130247A1 (de) Nanostrukturiertes wirkstoffträgersystem
EP2777723B1 (de) Implantierbarer Gegenstand umfassend gezielt degradierbare Co-Polymere zur verbesserten Explantierbarkeit
WO2004020623A2 (de) Verfahren zur herstellung von biologisch abbaubaren, funktionalisierten polymerpartikeln und deren verwendung als arzneimittelträger
EP2719762A1 (de) Tyrosinaseinhibitoren zur Depigmentierung oder Haarentfernung
DE102020114183B4 (de) Mittel zur transfektion von nukleinsäuren in zellen
DE69835525T2 (de) Verminderungsregulation der genexpression durch kolorektale verabreichung von synthetischen oligonukleotiden

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12772238

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012772238

Country of ref document: EP