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Die
Anwendung der Gentherapie bei der Behandlung menschlicher Krankheiten
hat stetig zugenommen, seitdem im Jahr 1989 der erste Versuch einer
menschlichen Gentherapie durchgeführt wurde. Bis zum heutigen
Tage wurden mehr als 100 Gentherapieprotokolle und klinische Versuche
zur Behandlung von Erb- und erworbenen Krankheiten durch das Beratungskomitee
für rekombinante
DNA (RAC) genehmigt. Trotz der veröffentlichten Fortschritte bei
der Gentherapietechnologie und der Zunahme von Genehmigungen bei
Gentherapieprotokollen bleiben noch Hindernisse bestehen, einschließlich der
Schwierigkeiten bei der effizienten Abgabe exogener Gene in vivo.
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Im
Allgemeinen umfasst die Gentherapie die Einführung eines exogenen Genes
in ein Tier und die Expression eines exogenen Genes in einem Tier,
um ein defektes oder fehlendes Gen zu supplementieren oder zu ersetzen,
oder um ein Produkt zum Behandeln einer erworbenen Krankheit herzustellen.
Während
einige Debatten hinsichtlich der Frage bleiben, welche Vektoren
unter welchen Umständen
am nützlichsten
sind, besteht die sich entfaltende Herausforderung nicht darin,
ob die Gentherapie funktionieren wird, sondern vielmehr darin, zu
bestimmen, welche Vektoren die wirksamsten sind und welche Abgabesysteme
zum Ausführen der
Gentherapie am wirksamsten sind.
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Unter
den Schwierigkeiten beim Abgeben exogener Gene an Zellen zur Gentherapie
befindet sich die Zellwand selbst. Einige Vektoren und nackte DNA
durchdringen die Wände
von Säugetierzellen
nicht effizient. Dies ist weniger bei ex vivo-Anwendungen ein Problem,
für die
eine Vielzahl von biochemischen und mechanischen Technologien zum
Einführen
von Genen in Zellen entwickelt worden sind. Viele dieser Techniken
können
jedoch nicht in vivo angewendet werden. Ein anderes Problem bei
der in vivo-Abgabe von Genen an Zellen besteht darin, dass es komplexen
Strukturen wie beispielsweise Vektoren, die Gene unter der Kontrolle
von Promotoren enthalten, in bestimmten physiologischen Umgebungen
nicht gut ergeht und sie zerstört
werden. Diese größeren, komplexen
DNA-Moleküle
sind anders als kurze Antisense-Oligonukleotide, die typischerweise
modifiziert sind, um sie vor einem physiologischen Abbau zu schützen.
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Die
Bedingungen, die ein funktionsfähiges
Gen in vivo zerstören
können,
sind nicht die einzigen Hindernisse bei der Abgabe von Genen bei
der Gentherapie. Die präparativen
Techniken zum Formulieren von Abgabesystemen können auf die DNA ebenfalls
zerstörerisch
wirken. Zum Beispiel erfordern zahlreiche Prozeduren zum Herstellen
von Mikropartikeln hohe Temperaturen und/oder hohe Scherkräfte und/oder
Ultraschallbehandlung. Derartige Bedingungen würden typischerweise einen Vektor,
der ein Gen enthält,
zerstören oder
zu einem Durchtrennen eines großen
Stückes
DNA führen.
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Obwohl
sie für
den Patienten am praktischsten sind, unterliegen orale Formulierungen
von Wirkstoffen beim Abgeben der Wirkstoffmoleküle an die Zielzellen ernsthaften
Hindernissen. Dies gilt besonders für labile Wirkstoffe wie beispielsweise
Stücke
von DNA oder Genen. Ein erstes Hindernis ist der Magen. Die Umgebung im
Magen ist für
DNA extrem zerstörerisch,
und die meiste DNA (und insbesondere große DNA-Stücke) würden die Umgebung im Magen
nicht überleben.
Selbst wenn die DNA die Umgebung im Magen überleben würde, müsste sie anschließend von
den Zellen, die den Dick- und Dünndarm
auskleiden, aufgenommen werden oder zwischen ihnen hindurchwandern.
Die Aufnahme von Material über
eine Schleimhautepithelbarriere ist ein selektives Ereignis, und
man würde
erwarten, dass nicht alle Moleküle
durch absorbierende und nicht absorbierende Epithelzellen und/oder
in den systemischen Kreislauf aufgenommen werden würden. Selbst
wenn dieses Hindernis überwunden
wird, muss die DNA anschließend
immer noch der Zerstörung
widerstehen, wenn sie sich im allgemeinen Kreislauf befindet. Die
DNA muss auch Zugang über
die Membran der Zielzelle erhalten, in die sie transplantiert werden
soll. Schließlich
muss die DNA in einer Weise präsentiert
werden, die für
den Patienten nicht toxisch ist. Zum Beispiel wurde von einigen
viralen Vektoren gezeigt, dass sie schwere immunologische Reaktionen
bei den Empfängern
induzieren, und von einigen Liposomen wurde gezeigt, dass sie für Empfänger toxisch
sind.
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Das
an Tice erteilte
US-Patent 5,075,109 mit
dem Titel „METHOD
FOR POTENTIATING AN IMMUNE RESPONSE" ist auf Verfahren zur oralen Verabreichung
eines bioaktiven Agens gerichtet, das in Mikropartikeln enthalten
ist, um das Agens während
seiner Wanderung durch den Gastrointestinaltrakt vor einem Abbau zu
schützen.
Das Patent ist insbesondere auf ein Verfahren zur oralen Immunisierung
gerichtet, das das Schleimhautimmunsystem wirksam stimulieren und
das Problem des Abbaus des bioaktiven Bestandteils während seiner
Wanderung durch den Gastrointestinaltrakt zu den Peyer'schen Drüsen überwinden
wird. Das '109-Patent
umfasst das Verabreichen bioaktiver Agenzien, die in Mikrokapseln
enthalten sind und eine Größe von zwischen
ungefähr
einem und zehn Mikrometer aufweisen. Die Mikrokapseln überleben
die Umgebung im Magen anscheinend und werden durch die Peyer'schen Drüsen aufgenommen,
um die Immunreaktion zu stimulieren. Das '109-Patent umfasst den Begriff „Nukleinsäuren" als Mitglied einer
langen Liste von Materialien, die als „bioaktive Agenzien" betrachtet werden.
Das '109-Patent
erwähnt
nicht die Abgabe von Genen, die Abgabe von Genen unter der Kontrolle
eines Promotors oder die Abgabe von Vektoren, die Gene umfassen.
Dies ist vielleicht der Fall, weil die von Tice beim Herstellen
der Mikropartikel verwendete Methode für Herstellungstechniken des
Standes der Technik typisch ist, d.h. es werden aggressive Emulgierungsbedingungen
wie beispielsweise solche angewandt, die große Stücke DNA zerstören würden, um
die Mikropartikel herzustellen.
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WO 95/24929 offenbart ein
Mittel zum Erhalten einer effizienten Einführung von exogenen Genen in einen
Patienten. Das unter der Kontrolle eines Promotors stehende Gen
ist innerhalb einer biokompatiblen, bevorzugterweise biologisch
abbaubaren polymerischen Matrix verkapselt oder verteilt, wobei
das Gen in der Lage ist, über
eine verlängerte
Zeitspanne aus der Matrix zu diffundieren. Die Matrix liegt bevorzugterweise
in der Form eines Mikropartikels vor, bevorzugterweise mit einem
Durchmesser zwischen 0,5 und 100 μm,
und wird über
eine Injektion oder Inhalation verabreicht.
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WO 94/23738 offenbart Mikropartikel,
die genetisches Material verkapseln und zur gesteuerten Freisetzung
des Materials geeignet sind. Die Mikropartikel weisen einen Durchmesser
im Bereich von 1 μm
bis 500 μm
auf, und es ist vorgesehen, dass sich invasiv implantierte Mikropartikel,
wenn sie sich erst einmal innerhalb des Körpers befinden, langsam auflösen würden, um
das mikroverkapselte Material freizusetzen.
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In
keinem Dokument des Standes der Technik, von dem die Anmelder Kenntnis
haben, ist die Idee einer oralen Abgabe in Mikropartikeln von Genen
unter der Kontrolle von Promotoren offenbart.
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Es
ist ein Ziel die Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung
für ein
nicht invasives Verfahren zum Ausführen einer Gentherapie bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der Erfindung besteht darin, eine pharmazeutische
Zusammensetzung für
eine Gentherapie bereitzustellen, die zur oralen Verabreichung geeignet ist.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind
durch ein Verfahren zum Mikroverkapseln großer Stücke DNA herstellbar, wie beispielsweise
Genen unter der Kontrolle von Promotoren und Vektoren, in einer
Weise, die die DNA nicht zerstört
und eine hohe Ausbeute an DNA innerhalb der Mikrokapsel hervorruft.
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Die
Erfindung umfasst die Entdeckung eines Verfahrens zum Verkapseln
von Oligonukleotiden auf eine nicht zerstörerische Weise und mit hoher
Ausbeute. Die Erfindung umfasst weiterhin die Entdeckung, dass Mikropartikel
verwendet werden können,
um diese Oligonukleotide oral und in funktioneller Form nicht nur
an intestinale Epithelzellen, sondern auch an Nichtephithelzellen
innerhalb des Gastrointestinalsystems (zum Beispiel Peyer'sche Drüsen) und
selbst an Zellen abzugeben, die von dem intestinalen Epithel weit
entfernt sind, wie beispielsweise Milz- oder Leberzellen. Die Erfindung
umfasst weiterhin die Entdeckung, dass bioadhäsive Mikrokügelchen, anstatt einfach die
Verbleibzeit nach dem Anheften an ein Schleimhautepithel zu verlängern, überraschend:
(1) in die Epithelzellen aufgenommen werden, die absorbierende intestinale
Epithelzellen umfassen; (2) in mit dem Darm assoziierte Zellen des
Lymphgewebes aufgenommen werden; und (3) selbst zu Zellen transportiert
werden, die vom Schleimhautepithel weit entfernt sind. Die Mikropartikel,
die die Oligonukleotide enthalten, sind zwischen 10 Nanometer und
1 μm groß (durchschnittliche
Partikelgröße). Bevorzugtesterweise
werden die Mikropartikel durch die Nanoverkapselung mittels Phaseninversion
hergestellt. Die Oligonukleotide liegen in bioaktiver Form vor,
wenn sie aus den Mikropartikeln freigesetzt werden.
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Wir
haben überraschend
etabliert, dass Gene unter der Kontrolle von Promotoren in geschützter Weise
in Mikropartikeln enthalten sein können und in funktionsfähiger Form
an Zellen abgegeben werden können, wodurch
eine nicht invasive Genabgabe zur Gentheraphie erhalten wird. Die
Erfindung überwindet
außergewöhnliche
Hindernisse: (1) die Gene werden durch die Herstellungstechnik zum
Herstellen der Mikropartikel nicht zerstört, unterbrochen oder inaktiviert;
(2) die Mikropartikel schützen
die Gene vor der zerstörerischen Umgebung
im Magen; (3) die Mikropartikel treten in die Zielzellen ein; (4)
die Mikropartikel bewirken eine Transfektion der Zellen mit den
Genen; (5) die Mikropartikel können
die Gene an Stellen abgeben, die von dem Schleimhautepithel weit
entfernt sind, d.h. sie können
die Epithelbarriere überwinden,
in den allgemeinen Kreislauf eintreten und dadurch Zellen an anderen
Stellen transfizieren.
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In
einem ersten Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung
zur Gentherapie bereitgestellt, die eine Vielzahl bioadhäsiver Mikropartikel
umfasst, welche ein intaktes isoliertes Gen unter der Kontrolle
eines Promotors enthalten, worin die Mikropartikel eine durchschnittliche
Partikelgröße von 10
nm-1 um aufweisen.
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Gemäß eines
zweiten Aspektes der Erfindung wird die Verwendung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung gemäß einem
ersten Aspekt der Erfindung zur Herstellung eines Medikamentes zur
Verabreichung an eine Schleimhautepitheloberfläche eines Patienten bereitgestellt,
um ein intaktes Gen bei einem Gentherapieverfahren an eine Zelle
des Patienten abzugeben.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung in jedem ihrer verschiedenen Aspekte sind wie unten beschrieben
oder wie in den Unteransprüchen
definiert.
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Eine
wirksame Menge bioadhäsiver
Mikropartikel, die ein isoliertes Gen unter der Kontrolle eines
Promotors enthalten, wird nicht invasiv an eine Schleimhautepitheloberfläche eines
Patienten verabreicht, der eine Gentherapie benötigt. Die bioadhäsiven Mikropartikel
bestehen aus Mikropartikeln, die eine durchschnittliche Partikelgröße von zwischen
10 Nanometern und 1 μm
aufweisen.
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Die
bevorzugten bioadhäsiven
Mikropartikel umfassen Polyanhydride, am bevorzugtesten Poly(fumarsäure-co-sebacinsäure)anhydrid.
Bevorzugterweise enthalten sie auch Metalloxide oder -hydroxide.
Bevorzugterweise enthalten sie weiterhin Anhydridoligomere. Am bevorzugtesten
weisen die bioadhäsiven
Mikropartikel bioadhäsive
Eigenschaften auf, die wenigstens so stark wie die von 20 : 80 Poly(fumarsäure-co-sebacinsäure)anhydrid
sind.
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Die
Mikropartikel können
nicht invasiv verabreicht werden, wie beispielsweise durch orale
Formulierung und durch Aerosole für den Atemwegstrakt. Die Gene
können
an eine Epithelzelle abgegeben werden und sie transformieren. Die
Gene können
auch an eine Nichtepithelzelle abgegeben werden und sie transformieren.
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Eine
wirksame Menge an Mikropartikeln, die ein isoliertes Gen unter der
Kontrolle eines Promotors enthalten, wird oral an einen Patienten
verabreicht, der eine Gentherapie benötigt.
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Die
Mikropartikel können
an eine Epithelzelle abgegeben werden und sie transfizieren oder
können über derartige
Epithelzellen an Nichtepithelzellen abgegeben werden, die durch
das Gen transformiert werden.
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Die
Zelle kann eine mit dem Darm assoziierte Zelle des Lymphgewebes
oder eine absorbierende Epithelzelle sein. Der Mikropartikel kann
in den systemischen Kreislauf aufgenommen werden, und die transfizierte
Zelle ist eine Nichtepithelzelle, die von der Epithelbarriere weit
entfernt ist, wie beispielsweise z. B. eine Milzzelle oder eine
Leberzelle.
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1 ist
eine Kurve, die einen luminometrischen Test auf bakterielle β-Galactosidase-Aktivität in Gewebehomogensten
zeigt, die durch die orale Abgabe von β-Galactosidasegen in Mikropartikeln
bewirkt wird.
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Die
pharmazeutischen Zubereitungen der vorliegenden Erfindung sind durch
ein mildes Verfahren zur Mikroverkapselung von DNA und insbesondere
von Genen unter der Kontrolle von Promotoren und Vektoren, die Gene
unter der Kontrolle von Promotoren enthalten, herstellbar.
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Mikropartikel,
Mikrokapseln und Mikrokügelchen
(hier und danach als „Mikropartikel" bezeichnet) wurden
in der pharmazeutischen, landwirtschaftlichen, Textil- und Kosmetikindustrie
als Abgabevehikel verwendet. Mikropartikel einer sehr geringen Größe wurden
nicht nur für
die Verkapselung von Genen unter der Kontrolle von Promotoren verwendet.
Es sind viele Mikroverkapselungstechniken vorhanden, die unter verschiedenen
Bedingungen eine Vielzahl von Partikeltypen und -größen herstellen
können.
Diejenigen Verfahren, die aggressive Emulgierungsprozeduren oder
andere Prozeduren umfassen, die dazu neigen würden, Gene unter der Kontrolle
von Promotoren durchzutrennen, abzubauen oder auf eine andere Weise
zu inaktivieren, sind gemäß der vorliegenden
Erfindung nicht nützlich.
Die vorliegende Erfindung wurde teilweise durch die Entdeckung eines
neuen Verfahrens zum Herstellen von Mikropartikeln unter extrem
milden Verarbeitungsbedingungen angeregt, die eine Größe von 5
Mikrometern oder weniger aufweisen.
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Es
wurde überraschend
entdeckt, dass Gene unter der Kontrolle von Promotoren in funktionsfähiger Form
nicht invasiv an Epitheloberflächen
zur Gentherapie abgegeben werden können: Die Gene in den Mikropartikeln
erhalten, wenn sie über
den systemischen Kreislauf transportiert werden, nicht nur Zugang
zu Epithelzellen und transfizieren sie, sondern durchwandern auch
Epithelbarrieren und erhalten dabei Zugang zu Zellen und transfizieren
Zellen, die nahe bei den Epithelzellen liegen, und selbst Zellen,
die von den Epithelbarrieren weit entfernt sind. Es ist noch überraschender,
dass entdeckt wurde, dass Gene an solche Zellen abgegeben werden
und sie transfizieren können,
wenn sie oral verabreicht werden. Man glaubt, dass dies die erste
Demonstration einer oralen Genabgabe an intestinale Epithelzellen,
Peyer'sche Drüsen, Milzzellen,
Leberzellen und dergleichen ist.
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Das
Herstellungsverfahren, tituliert als „Nanoverkapselung mittels
Phaseninversion" oder „PIN", unterscheidet sich
von vorhandenen Verfahren zum Verkapseln dahingehend, dass es im
Wesentlichen ein Verfahren mit einem Schritt ist, nahezu augenblicklich
abläuft
und nicht die Emulgierung des Lösungsmittels
erfordert. Unter geeigneten Bedingungen können Polymerlösungen mit
geringer Viskosität
gezwungen werden, eine Phaseninversion zu fragmentierten kugelförmigen Polymerpartikeln
zu durchlaufen, wenn sie zu geeigneten Nichtlösungsmitteln hinzugegeben werden.
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Das
Phaseninversionsphänomen
wurde angewandt, um makro- und mikroporöse Polymermembranen und Hohlfasern
zu erzeugen. Die Grundlage für
die Herstellung solcher Membranen oder Fasern und für das Verfahren
der Erfindung hängt
von dem Mechanismus der Mikrophasentrennung ab. Eine vorherrschende Theorie
zur Mikrophasentrennung beruht auf der Vorstellung, dass sich als
das anfängliche
Präzipitierungsereignis,
das aus der Entfernung des Lösungsmittels
folgt, „primäre" Partikel mit einem
Durchmesser von etwa 50 nm bilden. Man glaubt, dass primäre Partikel
kollidieren und sich vereinigen, wenn der Vorgang weiterläuft und
dabei „sekundäre" Partikel mit Ausmaßen von
ungefähr
200 nm bilden, die sich schließlich
mit anderen Partikeln zusammenschließen, um die Polymermatrix zu
bilden. Eine alternative Theorie, „Keimbildung und Wachstum", beruht auf der
Vorstellung, dass ein Polymer um eine Kernmizellstruktur präzipitiert
(im Gegensatz zu dem Vereinigen von primären Partikeln).
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Die
Tatsache, dass sich eine sehr einheitliche Größenverteilung kleiner Partikel
ergibt, die sich bei geringeren Polymerkonzentrationen ohne Vereinigen
bilden, stützt
die Keimbildungs- und
Wachstumstheorie, während
sie ein Vereinigen bei höheren
Polymerkonzentrationen (z. B. größer als
10 % Gewicht pro Volumen) nicht ausschließt, bei denen größere Partikel
und sogar Aggregate gebildet werden können. (Das Lösungsmittel
würde aus
größeren Partikeln
langsamer extrahiert werden, so dass zufällige Kollisionen von teilweise
solvatisierten Kügelchen
zu einem Vereinigen und letztendlich zur Bildung von faserartigen
Netzwerken führen würde.) Durch
das Anpassen der Polymerkonzentration, des Molekulargewichts des
Polymers, der Viskosität, der
Mischbarkeit und der Volumenverhältnisse
von Lösungsmittel
zu Nichtlösungsmittel,
unter Verwendung von Phaseninversion werden die für Membranen
charakteristischen interfibrillären
Zwischenverbindungen vermieden, wobei das Ergebnis darin besteht,
dass Mikropartikel spontan gebildet werden. Wie aus den Beispielen
unten und aus der folgenden Diskussion ersichtlich sein wird, hängen die
vorangehenden Parameter voneinander ab, und die Anpassung des einen
wird den für
einen anderen zugelassenen absoluten Wert beeinflussen.
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In
einem bevorzugten Verarbeitungsverfahren wird eine Mischung des
zu verkapselnden Agens, eines Polymeres und eines Lösungsmittels
für das
Polymer hergestellt. Das zu verkapselnde Agens kann in flüssiger oder
fester Form vorliegen. Es kann in dem Lösungsmittel gelöst oder
verteilt sein. Das Agens kann somit in Mikrotröpfchen enthalten sein, die
in dem Lösungsmittel
verteilt sind, oder es kann in der Form von festen Mikropartikeln
im Lösungsmittel
verteilt sein. Der Phaseninversionsverfahren kann somit verwendet
werden, um eine große
Vielzahl von Agenzien dadurch zu verkapseln, dass sie entweder in
mikronisierter fester Form oder in sonstiger emulgierter flüssiger Form
von der Polymerlösung
umfasst werden. Der Beladungsbereich hinsichtlich des Agens in den
Mikrokapseln liegt zwischen 0,01 bis 80 % (Gewicht des Agens/Polymergewicht). Wenn
mit Nanokügelchen
gearbeitet wird, liegt ein optimaler Bereich zwischen 0,1 bis 5
% (Gewicht/Gewicht).
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Das
Agens wird zu dem Polymerlösungsmittel
hinzugegeben, bevorzugterweise nachdem das Polymer in dem Lösungsmittel
gelöst
wurde. Das Lösungsmittel
ist jegliches geeignete Lösungsmittel
zum Auflösen des
Polymers. Typischerweise wird das Lösungsmittel ein übliches
organisches Lösungsmittel
wie beispielsweise ein halogenierter aliphatischer Kohlenwasserstoff
wie beispielsweise Methylenchlorid, Chlorophorm und dergleichen,
ein Alkohol, ein aromatischer Kohlenwasserstoff wie beispielsweise
Toluol, ein halogenierter aromatischer Kohlenwasserstoff, ein Ether
wie beispielsweise Methyl-t-butyl, ein zyklischer Ether wie beispielsweise
Tetrahydrofuran, Ethylazetat, Diethylcarbonat, Azeton oder Cyklohexan
sein. Die Lösungsmittel
können alleine
oder in Kombination verwendet werden. Das gewählte Lösungsmittel muss in der Lage
sein, das Polymer aufzulösen,
und es ist wünschenswert,
dass das Lösungsmittel
hinsichtlich des verkapselt werdenden Agens und des Polymers inert
ist.
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Das
Polymer kann jegliches geeignete Mikroverkapselungsmaterial sein,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf nicht biologisch angreifbare und biologisch angreifbare Polymere.
Solche Polymere wurden sehr detailliert im Stand der Technik beschrieben.
Eine Liste geeigneter Polymere wird unten bereitgestellt.
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Der
Arbeitsbereich mit Hinblick auf das Molekülgewicht des Polymers liegt
in der Größenordnung
von 1 kDa bis 150.000 kDa, obwohl der optimale Bereich 2 kDa bis
50 kDa beträgt.
Der Arbeitsbereich der Polymerkonzentration für das Phaseninversionsverfahren
beträgt
0,01 bis 50% (Gewicht/Volumen), und hängt primär vom Molekulargewicht des
Polymers und der resultierenden Viskosität der Polymerlösung ab.
Im Allgemeinen erlauben die Polymere mit geringem Molekulargewicht
die Verwendung einer höheren
Konzentration eines Polymers. Der bevorzugte Konzentrationsbereich
gemäß der Erfindung
wird in der Größeordnung
von 0,1 % bis 10 % (Gewicht/Volumen) liegen, während die optimale Polymerkonzentration
typischerweise unter 5 % liegen wird. Es wurde festgestellt, dass
Polymerkonzentrationen in der Größenordnung
von 1 bis 5 % besonders nützlich
sind.
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Die
Viskosität
der Polymerlösung
beträgt
bevorzugterweise weniger als 3,5 Zentipoise und bevorzugtererweise
weniger als 2 Zentipoise, obwohl höhere Viskositäten wie
beispielsweise 4 oder sogar 6 Zentipoise in Abhängigkeit von einer Anpassung
anderer Parameter wie beispielsweise dem Molekulargewicht des Polymers
möglich
sind. Das Molekulargewicht des Polymers wird die Partikelgröße ebenfalls
beeinflussen. Es wird durch Fachleute auf dem Gebiet anerkannt werden,
dass die Polymerkonzentration, das Moleklargewicht eines Polymers
und die Viskosität
voneinander abhängen
und dass das Verändern
des einen wahrscheinlich die anderen beeinflussen wird.
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Das
Nichtlösungsmittel
oder Extrahierungsmedium wird auf der Grundlage seiner Mischbarkeit
mit dem Lösungsmittel
gewählt.
Somit werden das Lösungsmittel
und das Nichtlösungsmittel
als „Paare" betrachtet. Wir
haben bestimmt, dass die Löslichkeitsparameter
(δ (cal/cm3)½) ein nützlicher
Indikator für
die Eignung der Lösungsmittel/Nichtlösungsmittel-Paare
sind. Der Löslichkeitsparameter
ist ein wirksamer Vorhersager der Mischbarkeit von zwei Lösungsmitteln,
und im Allgemeinen zeigen höhere
Werte eine hydrophilere Flüssigkeit an,
während
niedrigere Werte eine hydrophobere Flüssigkeit (z. B. δi Wasser
= 23,4 (cal/cm3)½ darstellen,
wohingegen δi Hexan = 7,3 (cal/cm3)½).
Wir haben bestimmt, dass Lösungsmittel/Nichtlösungsmittel-Paare
nützlich
sind, wenn 0 < δ Lösungsmittel – δ Nichtlösungsmittel < 6 (cal/cm3)½. Obwohl nicht gewünscht wird,
dass man an irgendeine Theorie gebunden ist, liegt eine Interpretation
dieser Erkenntnis darin, dass die Mischbarkeit des Lösungsmittel
und des Nichtlösungsmittel
für die
Bildung von Präzipitierungskeimen
wichtig ist, die letztendlich als Fokussierungspunkte für das Partikelwachstum
dienen. Wenn die Polymerlösung
mit dem Nichtlösungsmittel
völlig
unmischbar ist, dann tritt keine Lösungsmittel-Extrahierung auf,
und es werden keine Nanopartikel gebildet. Ein Fall dazwischen würde ein
Lösungsmittel/Nichtlösungsmittel-Paar
mit geringer Mischbarkeit umfassen, bei dem die Geschwindigkeit
der Lösungsmittelentfernung
nicht hoch genug wäre,
um getrennte Mikropartikel zu bilden, was zu einer Aggregation der
Vereinigung der Partikel führt.
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Es
wurde überraschend
entdeckt, dass unter Verwendung von „hydrophilen" Lösungsmittel/Nichtlösungsmittel-Paaren
(z. B. ein in Methylenchlorid mit Ethanol als das Nichtlösungsmittel
gelöstes
Polymer) erzeugte Nanopartikel ungefähr zu 100 % kleinere Partikel
ergaben, als wenn „hydrophobe" Lösungsmittel/Nichtlösungsmittel-Paare
verwendet wurden (z. B. das gleiche Polymer aufgelöst in Methylenchlorid
mit Hexan als das Nichtlösungsmittel).
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In ähnlicher
Weise wurde überraschend
entdeckt, dass das Lösungsmittel
zu Nichtlösungsmittel-Volumenverhältnis beim
Bestimmen wichtig war, ob Mikropartikel ohne Partikelaggregation
oder -vereinigung gebildet werden würden. Ein geeigneter Arbeitsbereich
hinsichtlich des Volumenverhältnisses
von Lösungsmittel zu
Nichtlösungsmittel
liegt, wie man glaubt, bei 1:40 bis 1:1.000.000. Ein optimaler Arbeitsbereich
für die
Volumenverhältnisse
von Lösungsmittel
zu Nichtlösungsmittel
liegt, wie man glaubt, bei 1:50 bis 1:200 (Volumen pro Volumen).
Verhältnisse
von weniger als ungefähr
1:40 führten
zur Partikelvereinigung, vermutlich aufgrund von unvollständiger Lösungsmittelextrahierung
oder ansonsten einer geringeren Geschwindigkeit der Lösungsmitteldiffusion
in die Hauptphase des Nichtlösungsmittels.
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Es
wird von Fachleuten auf dem Gebiet verstanden werden, dass die oben
angegebenen Bereiche nicht absolut sind, sondern dass sie stattdessen
voneinander abhängen.
Zum Beispiel ist es möglich,
obwohl man glaubt, dass das minimale Lösungsmittel zu Nichtlösungsmittel-Volumenverhältnis in
der Größenordnung von
1:40 liegt, dass Mikropartikel bei niedrigeren Verhältnissen
wie beispielsweise 1:30 immer noch gebildet werden könnten, wenn
die Polymerkonzentration extrem niedrig ist, die Viskosität der Polymerlösung extrem niedrig
ist und die Mischbarkeit des Lösungsmittel
und des Nichtlösungsmittels
hoch ist. Somit wird das Polymer in einer wirksamen Menge des Lösungsmittel
gelöst,
und die Mischung des Agens, des Polymers und des Polymerlösungsmittels
wird in eine wirksame Menge eines Nichtlösungsmittels eingebracht, so
dass Polymerkonzentrationen, Viskositäten und Volumenverhältnisse
von Lösungsmittel
zu Nichtlösungsmittel
hervorgerufen werden, die die spontane und praktisch augenblickliche
Bildung von Mikropartikeln bewirken.
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Wie
aus den unten angegebenen Beispielen ersichtlich sein wird, wurde
eine Vielzahl von Polymeren überprüft, die
Polyester wie beispielsweise Poly(milchsäure), Poly(lactid-co-glycolid) in molaren
Verhältnissen von
50:50 und 75:25, Polycaprolacton, Polyanhydride wie beispielsweise
Poly(fumar-co-sebacin)säure
oder P(FA:SA) in molaren Verhältnissen
von 20:80 und 50:50, Poly(carboxyphenoxpropan-co-sebacin)säure oder P(CPP:SA)
in einem molaren Verhältnis
von 20:80 und Polystyrole oder PS umfassen.
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Nanokügelchen
und Mikrokügelchen
im Bereich von 10 nm bis 10 μm
wurden hergestellt.
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Das
Verwenden von anfänglichen
Polymerkonzentrationen im Bereich vom 1 bis 2 % (Gewicht/Volumen)
und von Lösungsviskositäten von
1 bis 2 Zentipoise mit einem „guten" Lösungsmittel
wie beispielsweise Methylenchlorid und einem starken Nichtlösungsmittel
wie beispielsweise Petroleumether oder Hexan in einem optimalen
Volumenverhältnis
von 1:100, erzeugt Partikel mit Größen, die im Bereich von 100
bis 500 nm liegen. Unter ähnlichen
Bedingungen erzeugen anfängliche
Polymerkonzentrationen von 2 bis 5% (Gewicht/Volumen) und Lösungsviskositäten von
2 bis 3 Zentipoise typischerweise Partikel mit Größen von
500 bis 3000 nm. Unter Verwendung von Polymeren mit sehr geringem Molekulargewicht
(weniger als 5 kDa) kann die Viskosität der anfänglichen Lösung niedrig genug sein, um
die Verwendung von höheren
anfänglichen
Polymerkonzentrationen als 10% (Gewicht/Volumen) zu ermöglichen,
die im Allgemeinen zu Mikrokügelchen
mit Größen führen, die
im Bereich von 1 bis 10 μm
liegen. Im Allgemeinen ist es wahrscheinlich, dass sich bei Konzentrationen
von 15 % (Gewicht/Volumen) und Lösungsviskositäten von
mehr als 3,5 Zentipoise keine getrennten Mikrokügelchen bilden werden, sondern
dass sie sich stattdessen irreversibel zu komplexen, miteinander
verbundenen, fibrillären
Netzwerken mit einer Dicke in der Dimension von Mikrometern vereinigen
werden.
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Es
ist zu beachten, dass nur eine begrenzte Anzahl von Mikroverkapselungstechniken
Partikel erzeugen können,
die kleiner als 10 μm
sind, und dass diese Techniken mit erheblichen Verlusten an Polymer,
dem zu verkapselndem Material oder beiden verbunden sind. Dies ist
besonders problematisch, wenn das aktive Agens ein Gen unter der
Kontrolle eines Promotors ist, deren große DNA-Moleküle bei Herstellungsverfahren besonders
labil und extrem teuer herzustellen sind. Das Verfahren stellt bei
minimalen Verlusten Partikel im Nano- bis Mikro-Größenbereich
her. Die beschriebenen Verfahren können zu Produktausbeuten von
mehr als 80 % führen.
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Die
Verfahren können
auch Mikropartikel herstellen, die durch eine homogene Größenverteilung
gekennzeichnet sind. Typische Mikroverkapselungstechniken stellen
heterogene Größenverteilungen
her, die in Größenbereichen
von 10 μm
bis mm liegen. Methoden des Standes der Technik versuchen, die Partikelgröße durch
Parameter wie beispielsweise die Rührgeschwindigkeit, die Temperatur,
das Polymer/Suspensionsbad-Verhältnis, etc.
zu steuern. Solche Parameter haben jedoch zu keinem erheblichen
Einengen der Größenverteilung
geführt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
können
zum Beispiel Partikel im Nanometer-Größenbereich umfassen, die hinsichtlich
der Größe vergleichsweise
monodispers sind. Durch das Herstellen eines Mikropartikels, der
eine gut definierte und weniger variable Größe aufweist, können die
Eigenschaften des Mikropartikels, wenn er z. B. für die Freisetzung
eines bioaktiven Agens verwendet wird, besser gesteuert werden.
Somit sind Verbesserungen bei der Herstellung von Formulierungen zur
anhaltenden Freisetzung zur Verabreichung an Patienten erlaubt.
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Wie
oben erwähnt,
können
die Verfahren in vielen Fällen
in weniger als 5 Minuten vollständig
ausgeführt
werden. Es ist typisch, dass die Herstellungszeit irgendeine Zeitdauer von
einer Minute bis zu mehreren Stunden betragen kann, in Abhängigkeit
von der Löslichkeit
des Polymers und des gewählten
Lösungsmittels, davon,
ob das Agens in dem Lösungsmittel
gelöst
oder verteilt sein wird usw. Nichtsdestotrotz beträgt die tatsächliche
Verkapselungszeit typischerweise weniger als 30 Sekunden.
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Nach
der Bildung der Mikrokapseln werden diese durch Zentrifugation,
Filtration und dergleichen gewonnen. Das Filter und Trocknen kann
mehrere Minuten bis eine Stunde lang dauern, in Abhängigkeit
von der Menge des verkapselten Materials und den Verfahren, die
für das
Trocknen des Nichtlösungsmittels
verwendet werden. Das ganze Verfahren kann ein diskontinuierliches
oder ein kontinuierliches Verfahren sein.
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Weil
das Verfahren nicht erfordert, dass das Lösungsmittel eine Emulsion bildet,
kann es allgemein gesagt als ein milderes Verfahren betrachtet werden
als diejenigen, die eine Emulgierung erfordern. Als Ergebnis können Materialien
wie beispielsweise ganze Plasmide, die Gene unter der Kontrolle
von Promotoren umfassen, ohne die Zerstörung der DNA als Ergebnis des
Emulgierungsverfahrens verkapselt werden. Somit ist das Verkapseln
von Oligonukleotiden wie beispielsweise Plasmiden, Vektoren, externen
Führungssequenzen für RNAaseP,
Ribozymen oder anderen empfindlichen Oligonukleotiden vorgesehen,
deren Struktur und Funktion durch aggressive Emulgierungsbedingungen
und andere, für
bestimmte Verfahren des Standes der Technik typische Parameter schädlich beeinflusst
werden könnte.
Die Abgabe von Antisense ist natürlich
ebenfalls möglich.
-
In
Tabelle I unten sind Beispiele für
eine Vielzahl von Polymeren, Lösungsmitteln,
Viskositäten,
Nichtlösungsmitteln
und Konzentrationen umfasst, die in dem für das Herstellen von Mikropartikeln
verwendeten Phaseninversionsverfahren überprüft wurden.
| Tabelle
1 |
| Polymer | MW | Konzentration | Viskosität | Lösungsmittel | Nichtlösungsmittel | Wirkstoff | Konzentration | Produkt |
| Polystyrol | 2 K | 5% | | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | |
| Polystyrol | 2 K | 10% | | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | |
| Polystyrol | 50
K | 1% | | MeCl2 | Petroleumether | keiner | 0,1% | |
| Polystyrol | 50
K | 1% | | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 1-5 μm |
| Polystyrol | 50
K | 3% | | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | |
| Polystyrol | 50
K | 5% | | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 500
nm-2 μm |
| Polystyrol | 50
K | 10% | | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 1-4 μm |
| Polystyrol | 50
K | 15% | | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 1-10 μm & aggr |
| Polystyrol | 50
K | 20% | | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | großes Aggregat |
| Polystyrol | 50
K | 1% | | MeCl2 | Ethanol | Rhodamin | 0,1% | |
| Polystyrol | 50
K | 5% | | MeCl2 | Ethanol | Rhodamin | 0,1% | < 100 nm |
| Polystyrol | 50
K | 10% | | MeCl2 | Ethanol | Rhodamin | 0,1% | < 100nm-3 μm |
| Polycaprolacton | 72
K | 1% | 3,188 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 1-3 μm |
| Tabelle
1 |
| Polycaprolacton | 72 K | 5% | 7,634 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 1-3 μm großes Aggregat |
| Polycaprolacton | 112
K | 1% | 4,344 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 500 nm-5μm |
| Polycaprolacton | 112
K | 5% | | MeCl2 | Ethanol | Rhodamin | 0,1% | großes Aggregat |
| Polyvinylphenol | 1,5-7 K | 1% | | Azeton | Petroleumether | keiner | - | 250
nm-1 μm |
| Polyvinylphenol | 1,5-7 K | 5% | | Azeton | Petroleumether | keiner | - | |
| Polyvinylphenol | 1,5-7 K | 10% | '' | Azeton | Petroleumether | keiner | - | |
| Polyvinylphenol | 9-11
K | 1% | | Azeton | Petroleumether | keiner | - | 100
nm- 2 μm |
| Polyvinylphenol | 9-11
K | 5% | | Azeton | Petroleumether | keiner | - | 250nm-2,5 μm |
| Polyvinylphenol | 9-11
K | 10% | | Azeton | Petroleumether | keiner | - | 500nm-10 μm |
| Polymilch säure | 2
K | 1% | 0,876 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 100nm |
| Polymilch säure | 2
K | 5% | 1,143 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 500nm- 2μm |
| Polymilch säure | 2
K | 10% | 2,299 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 1-10 μm spröde |
| Polymilch | 24
K | 1% | 1,765 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 100
nm |
| Polymilch säure | 24
K | 5% | 2,654 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 500
nm-1 μm |
| Polymilch säure | 24
K | 10% | 3,722 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 10 μm aggr |
| Tabelle
1 |
| Polymilch säure | 40-100 K | 1% | 2,299 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | |
| Polymilch säure | 40-100 K | 5% | 2,832 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | |
| Polymilch säure | 40-100 K | 10% | 6,122 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | |
| Polymilch säure | 100
K | 1% | 2,566 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 100
nm |
| Polymilch säure | 100
K | 5% | 4,433 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | 500
nm-2 μm aggr |
| Polymilch säure | 100
K | 10% | 8,256 | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | Film/aggr |
| Ethylenvinyl azetat | 55 K | 1% | | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | Globuläre Stränge |
| Ethylenvinyl azetat | 55 K | 5% | | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | Vereinigte
Stränge |
| Ethylenvinyl acetat | 55 K | 10% | | MeCl2 | Petroleumether | Rhodamin | 0,1% | Kontinuier
-liches Blatt |
| PAN/PVC | | 1% | 2,566 | Azeton | Petroleumether | keiner | - | grob 1-20
m |
| PAN/PVC | | 5% | 15,903 | Azeton | Petroleumether | keiner | - | 100 μm aggr |
-
Es
wird von den Fachleuten auf dem Gebiet verstanden werden, dass die
Mikropartikel durch andere Verfahren wie beispielsweise durch bestimmte
Spraytrocknungs-Technologien erzeugt werden können. Spraytrocknen ist typischerweise
ein Verfahren für
das Herstellen von Mikrokügelchen
einer Größe von 1-10
Mikrometer, bei dem das Kernmaterial, das verkapselt werden soll,
in der Polymerlösung
(typischerweise wässrig) verteilt
oder aufgelöst
wird. Die Lösung
oder Dispersion wird durch eine mikronisierende Düse gepumpt,
die durch einen Fluss von komprimiertem Gas angetrieben wird, und
das sich dabei ergebende Aerosol wird in einem erhitzten Luftzyklon
suspendiert, was dem Lösungsmittel
gestattet, aus den Mikrotröpfchen
zu verdampfen. Die verfestigten Partikel treten in eine zweite Kammer
ein und werden in einem Sammelbehälter eingefangen.
-
Es
können
zahlreiche Polymere verwendet werden, um DNA enthaltende Mikropartikel
herzustellen. Sie umfassen, sind aber nicht beschränkt auf
Polyamide, Polycarbonate, Polyalkandiyle, Polyalkandiylglykole, Polyalkandiyloxide,
Polyalkandiylterepthalate, Polyvinylalkohole, Polyvinylether, Polyvinylester,
Polyvinylhalide, Polyvinylpyrrolidon, Polyglykolide, Polysiloxane,
Polyurethane und Copolymere davon, Alkylcellulose, Hydroxyalkylcellulosen,
Celluloseether, Celluloseester, Nitrocellulosen, Polymere von Acryl- und Methacrylestern,
Methylcelluslose, Ethylcellulose, Hydroxypropycellulose, Hydroxypropylmethylcellulose,
Hydroxybutylmethylcellulose, Celluloseazetat, Cellulosepropionat,
Celluloseazetatbutyrat, Celluloseazetatphthalat, Carboxylethylcellulose,
Cellulosetriazetat, Cellulosesulfat-Natriumsalz, Poly(methylmethacrylat),
Poly(ethylmethacrylat), Poly(butylmethacrylat), Poly(isobutylmethacrylat),
Poly(hexylmethacrylat), Poly(isodecylmethacrylat), Poly(laurylmethacrylat),
Poly(phenylmethacrylat), Poly(methylacrylat), Poly(isopropylacrylat),
Poly(isobutylacrylat), Poly(octadecylacrylat), Polyethylen, Polypropylen,
Poly(ethylenglykol), Poly(ethylenoxid), Poly(ethylenterephthalat),
Poly(vinylalkohole), Poly(vinylazetat, Polyvinylchlorid, Polystyrol
und Polyvinylpryrrolidon.
-
Beispiele
bevorzugter nicht biologisch abbaubarer Polymere umfassen Ethylenvinylazetat,
Poly(meth)acrylsäure,
Polyamide, Copolymere und Mischungen davon.
-
Beispiele
bevorzugter biologisch abbaubarer Polymere umfassen synthetische
Polymere wie beispielsweise Polymere der Milchsäure und der Glykolsäure, Polyanhydride,
Poly(ortho)ester, Polyurethane, Poly(buticsäure), Poly(valeriansäure), Poly(caprolacton),
Poly(hydroxybutyrat), Poly(lactid-co-glykolid) und Poly(lactid-co-caprolacton)
und natürliche
Polymere wie beispielsweise Alginat und andere Polysaccharide einschließlich Dextran
und Cellulose, Kollagen, chemische Derivate davon (Substitutionen,
Additionen von chemischen Gruppen, z. B. Alkyl, Alkandiyl, Hydroxylierungen,
Oxidationen und andere Modifikationen, die von Fachleuten auf dem
Gebiet routinemäßig vorgenommen
werden), Albumin und andere hydrophile Proteine, Zein und andere
Prolamine und hydrophobe Proteine, Copolymere und Mischungen davon.
Im Allgemeinen werden diese Materialien entweder durch enzymatische
Hydrolyse oder Exponierung gegenüber
Wasser in vivo durch Oberflächen-
oder Hauptphasen-Angriff abgebaut. Die vorangehenden Materialien
können
allein, als physikalische Mischungen (Mischungen) oder als Co-Polymer
verwendet werden. Die bevorzugtesten Polymere sind Polyester, Polyanhydride,
Polystyrole und Mischungen davon.
-
Besonders
bevorzugt sind bioadhäsive
Polymere. Ein bioadhäsives
Polymer ist eines, das unter normalen physiologischen Bedingungen
an ein Schleimhautepithel bindet. Bioadhäsion im Gastrointestinaltrakt verläuft in zwei
Schritten: (1) Viskoelastische Deformierung an der Kontaktstelle
des synthetischen Materials mit dem Schleimsubstrat und (2) Bildung
von Bindungen zwischen dem adhäsiven
synthetischen Material und dem Schleim oder den Epithelzellen. Im
Allgemeinen kann die Adhäsion
von Polymeren an Gewebe durch (i) physikalische oder mechanische
Bindungen, (ii) primäre
oder kovalente chemische Bindungen, und/oder (iii) durch sekundäre chemische
Bindungen (z. B. ionische) erreicht werden. Physikalische oder mechanische
Bindungen können
von der Ablagerung und dem Einschluss des adhäsiven Materials in den Ritzen
des Schleims oder den Faltungen der Schleimhaut bewirkt werden.
Sekundäre
chemische Bindungen, die zu den bioadhäsiven Eigenschaften beitragen,
bestehen aus dispersiven Wechselwirkungen, (d. h. Van der Waals-Wechselwirkungen)
und stärkeren
spezifischen Wechselwirkungen, einschließlich Wasserstoffbrückenbindungen.
Die hydrophilen funktionalen Gruppen, die primär für das Bilden von Wasserstoffbrückenbindungen
verantwortlich sind, sind die Hydroxyl- und die Carboxylgruppen.
Zahlreiche bioadhäsive
Polymere werden in dieser Anmeldung besprochen. Repräsentative
bioadhäsive
Polymere von besonderem Interesse umfassen biologisch angreifbare
Hydrogele, die durch H.S. Sawhney, C.P. Pathak und J.A. Hubell in
Macromolecules, 1993, 26:581-587, beschrieben sind, Polyhyaluronsäuren, Casein,
Gelatine, Glutin, Polyanhydride, Polyacrylsäure, Alginat, Chitosan, Poly(methylmethacrylate),
Poly(ethylmethacrylate), Poly(butylmethacrylat), Poly(isobutylmethacrylat),
Poly(hexylmethacrylat), Poly(isodecylmethacrylat), Poly(laurylmethacrylat),
Poly(phenylmethacrylat), Poly(methylacrylat), Poly(isopropylacrylat),
Poly(isobutylacrylat), und Poly(octadecylacrylat). Am bevorzugtesten
ist Poly(fumar-co-sebacin)säure.
-
Polymere
mit verstärkten
bioadhäsiven
Eigenschaften können
bereitgestellt werden, wobei Anhydridmonomere oder -oligomere in
das Polymer eingebaut werden. Die Oligomerbindemittel können in
eine weite Auswahl von hydrophilen und hydrophoben Polymeren eingemischt
oder eingebaut werden, die Proteine, Polysaccharide und synthetische biokompatible
Polymere umfassen. Anhydridoligomere können mit Metalloxidpartikeln
verbunden werden, um die Bioadhäsion
noch stärker
als mit den organischen Zusatzstoffen alleine zu verbessern. Organische
Farbstoffe können
die bioadhäsiven
Eigenschaften von Polymeren aufgrund ihrer Elektronenladung und
ihrer Hydrophobie/Hydrophilie entweder erhöhen oder erniedrigen, wenn
sie in die Polymere eingebaut werden. Der Einbau von Oligomerverbindungen
in eine weite Vielzahl von verschiedenen Polymeren, die normalerweise
nicht bioadhäsiv
sind, erhöht
ihre Adhäsion
an Gewebeoberflächen
wie beispielsweise Schleimhautmembranen dramatisch.
-
Wie
hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Anhydridoligomer" eine zweiprotonige Säure oder
Poly-zweiprotonige Säuren,
die durch Anhydridbindungen verbunden sind, und Carboxy-Endgruppen
aufweisen, die an mit einer einprotonigen Säure wie beispielsweise Essigsäure durch
Anhydridbindungen verbunden sind. Die Anhydridoligomere weisen ein
Molekulargewicht von weniger als 5000, typischerweise eines zwischen
100 und 5000 Daltons auf, oder sind derart definiert, dass sie etwa
zwischen eine bis etwa zwanzig Einheiten zweiprotoniger Säuren umfassen,
die durch Anhydridbindungen verbunden sind. In einer Ausführungsform
sind die zweiprotonigen Säuren
diejenigen, die normalerweise im Krebs-Glykolysezyklus gefunden
werden. Die Anhydridoligomerverbindungen weisen eine hohe chemische
Reaktionsfähigkeit
auf.
-
Die
Oligomere können
in einer Rückflussreaktion
der zweiprotonigen Säure
mit einem Überschuss
Essigsäureanhydrid
gebildet werden. Der Essigsäureanhydridüberschuss
wird im Vakuum verdampft, und das sich dabei ergebende Oligomer,
das eine Mischung von Spezies ist, die zwischen etwa eine bis zwanzig
Einheiten zweiprotoniger Säuren
umfassen, die durch Anhydridbindungen verbunden sind, wird durch
Umkristallisieren gereinigt, zum Beispiel aus Toluol oder anderen
organischen Lösungsmitteln.
Das Oligomer wird durch Filtration gewonnen und gewaschen, zum Beispiel
in Ethern. Die Reaktion stellt Anhydridoligomere von Mono- und Polysäuren mit
terminalen Carboxylsäuregruppen
her, die durch Anhydridbindungen miteinander verbunden sind.
-
Das
Anhydridoligomer ist hydrolytisch labil. Wie durch Gelpermeationschromatographie
analysiert wurde, kann das Molekulargewicht zum Beispiel beim Fumarsäureoligomer
(FAPP) in der Größenordnung
von 200-400 und beim Sebacinsäureoligomer
(SAPP) 2000-4000
liegen. Die Anhydridbindungen können
durch Fourier- Transformationsinfrarotspektroskopie
durch den charakteristischen Doppelpeak bei 1750 cm-1 und 1820
cm-1 mit einem entsprechenden Verschwinden
des Carboxylsäurepeaks,
der normalerweise bei 1700 cm-1 liegt, nachgewiesen
werden.
-
In
einer Ausführungsform
können
die Oligomere aus zweiprotonigen Säuren hergestellt werden, die zum
Beispiel im
US-Patent Nr. 4,757,128 ,
erteilt an Domb et al., im
US-Patent
Nr. 4,997,904 , erteilt an Domb, und im
US-Patent Nr. 5,175,235 , erteilt an
Domb et al., beschrieben sind. Zum Beispiel können Monomere wie beispielsweise
Sebacinsäure,
bis(p-Carboxy-phenoxy)propan,
Isophthalsäure,
Fumarsäure,
Maleinsäure,
Adipinsäure
oder Dodecansäure
verwendet werden.
-
Organische
Farbstoffe können
die bioadhäsiven
Eigenschaften einer Vielzahl von Polymeren aufgrund ihrer Elektronenladung
und Hydrophilie/Hydrophobie verändern,
wenn sie in die Polymermatrix eingebaut werden oder an die Oberfläche des
Polymers gebunden werden. Eine teilweise Auflistung von Farbstoffen,
die die bioadhäsiven
Eigenschaften beeinflussen, umfasst, ist aber nicht beschränkt auf:
Fuchsinsäure,
Alcianblau, Alizarinrot s, Auramin o, Azur a und b, Bismarckbraun
y, Brillantcresylblau ald, Brillantgrün, Carmin, Cibacronblau 3GA,
Kongorot, Cresylviolettazetat, Kristallviolett, Eosin b, Eosin y,
Erythrosin b, Schnellgrün
fcf, Giemsa, Hämatoylin,
Indigocarmin, Janusgrün
b, Jenner's Färbung, Malachitgrünoxalat,
Methylblau, Methylenblau, Methylgrün, Methylviolett 2b, Neutralrot,
Nilblau a, Orange II, Orange G, Orcein, Paraosanilinchlorid, Phloxin
b, Pyronin b und y, Reaktivblau 4 und 72, Reaktivbraun 10, Reaktivgrün 5 und
19, Reaktivrot 120, Reaktivgelb 2, 3, 13 und 86, Rosenbengal, Safranin
o, Sudan III und IV, Sudanschwarz B und Toluidinblau.
-
Die
bioadhäsiven
Eigenschaften eines Polymers werden durch das Einbauen einer Metallverbindung in
das Polymer verstärkt,
um die Fähigkeit
des Polymers zu verstärken,
an eine Gewebeoberfläche
wie beispielsweise eine Schleimhautmembran zu adhärieren.
Metallverbindungen, die die bioadhäsiven Eigenschaften eines Polymers
verstärken,
sind bevorzugterweise wasserunlösliche
Metallverbindungen wie beispielsweise wasserunlösliche Metalloxide und -hydroxide.
Die Metallverbindungen können
innerhalb einer weiten Vielzahl von hydrophilen und hydrophoben
Polymeren eingebaut werden, die Proteine, Polysaccharide und synthetische
biokompatible Polymere umfassen. Wie hierin definiert, ist eine
wasserunlösliche
Metallverbindung als eine Metallverbindung mit geringer oder gar
keiner Löslichkeit
in Wasser definiert, z. B. weniger als etwa 0,0-0,9 mg/ml.
-
Die
wasserunlöslichen
Metallverbindungen, wie beispielsweise Metalloxide, können durch
einen der folgenden Mechanismen eingebaut werden: (a) physikalische
Mischungen, die zum Einfangen der Metallverbindung führen; (b)
ionische Wechselwirkung zwischen Metallverbindung und Polymer; (c)
Oberflächenmodifikation
der Polymere, die zu einer exponierten Metallverbindung auf der
Oberfläche
führen
würde;
und (d) Beschichtungstechniken wie beispielsweise mit fluidisierten
Kugeln, Kollerbeschichtung und jegliche ähnliche Verfahren, die Fachleuten
auf dem Gebiet bekannt sind und die eine mit einer Metallverbindung
angereicherte Schicht auf der Oberfläche der Vorrichtung hervorrufen.
-
Bevorzugte
Eigenschaften, die die Metallverbindung definieren, umfassen: (a)
wesentliche Unlöslichkeit
in wässrigen
Umgebungen wie beispielsweise sauren oder basischen wässrigen
Umgebungen (wie beispielsweise diejenigen, die im Magenlumen vorhanden
sind); und (b) ionisierbare Oberflächenladung beim pH der wässrigen
Umgebung.
-
Die
wasserunlöslichen
Metallverbindungen können
von Metallen abgeleitet sein, die Kalzium, Eisen, Kupfer, Zink,
Cadmium, Zirconium und Titan umfassen. Zum Beispiel kann eine Vielzahl
von wasserunlöslichen
Metalloxidpulvern verwendet werden, um die bioadhäsiven Eigenschaften
von Polymeren, wie beispielsweise Eisen(III)oxid, Zinkoxid, Titanoxid,
Kupferoxid, Bariumhydroxid, Zinnoxid, Aluminiumoxid, Nickeloxid, Zirkoniumoxid
und Cadmiumoxid zu verbessern. Der Einbau von wasserunlöslichen
Metallverbindungen, wie beispielsweise Eisen(III)oxid, Kupferoxid
und Zinkoxid kann die Adhäsion
des Polymers an Gewebeoberflächen,
wie beispielsweise Schleimhautmembranen, zum Beispiel im Gastrointestinalsystem,
erheblich verbessern. Die Polymere mit einer eingebauten Metallverbindung
können
somit verwendet werden, um zum Verbessern ihrer bioadhäsiven Eigenschaften
Wirkstoffabgabevorrichtungen zu bilden oder zu beschichten.
-
Die
Metallverbindung kann in der Form einer feinen partikulären Dispersion
eines wasserunlöslichen Metalloxides
bereitgestellt werden, das durch das Polymer durchgehend oder wenigstens
auf der Oberfläche des
Polymeres eingebaut ist, das an die Gewebeoberfläche adhäriert werden soll. Zum Beispiel
werden wasserunlösliche
Metalloxidpartikel in ein Polymer eingebaut, das einen Mikropartikel
definiert oder beschichtet. Bevorzugterweise liegt das Metalloxid
in der Form von einer feinen partikulären Dispersion auf der Oberfläche des
Mikropartikels vor.
-
Die
feinen Metalloxidpartikel können
zum Beispiel durch das Mikronisieren eines Metalloxides durch Mörser- und
Stößelbehandlung
hergestellt werden, um Partikel herzustellen, deren Größe z. B.
von 10,0-300 nm reicht. Die Metalloxidpartikel können in das Polymer eingebaut
werden, zum Beispiel durch das Auflösen oder Verteilen der Partikel
in einer Lösung
oder Dispersion des Polymers vor der Mikropartikelbildung, und sie können dann
während
der Mikropartikelbildung unter Verwendung einer Prozedur zum Erzeugen
eines Mikropartikels wie beispielsweise derjenigen in das Polymer
eingebaut werden, die hierin beschrieben ist. Der Einbau von Metalloxidpartikeln
an der Oberfläche
des Mikropartikels verstärkt
in vorteilhafter Weise die Fähigkeit des
Mikrokügelchens,
an Schleimhautmembranen oder andere Gewebeoberflächen zu binden, und verbessert die
Wirkstoffabgabeeigenschaften des Mikropartikels.
-
Während man
nicht auf irgendeine Theorie beschränkt ist, ist es möglich, dass
das verbesserte Binden des Polymers, das eine eingebaute Metallverbindung
enthält,
durch die Anwesenheit von teilweise ionisierten Metallverbindungen
wie beispielsweise divalenten oder trivalenten Kationen auf der
Oberfläche
des Polymers verursacht wird, die, zum Beispiel über eine ionische Bindungsanziehung
mit negativ geladenen Glykosubstanzen wie beispielsweise Sialinsäure und
L-Fucose-Gruppen auf der Schleimhautmembranoberfläche, Wechselwirken.
Multivalente Ionen, wie beispielsweise divalente oder trivalente
Kationen in den Metallverbindungen, weisen im Allgemeinen die stärkste Affinität zu den
negativ geladenen Mucinketten auf.
-
Wie
hierin verwendet, ist ein „Gen" ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mit einer
Länge von
mehr als dreißig
Nukleotiden, typischererweise von einhundert Nukleotiden oder mehr.
Es wird im Allgemeinen unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors
stehen, der induzierbar, unterdrückbar
oder konstitutiv sein kann. Jegliche Gene, die beim Ersetzen oder
Supplementieren einer erwünschten
Funktion oder beim Erzielen einer erwünschten Wirkung, wie beispielsweise
der Inhibierung eines Tumorwachstums, nützlich wären, könnten unter Verwendung der
hierin beschriebenen Mikropartikel eingeführt werden. Die Promotoren
können
allgemeine Promotoren sein, die eine Expression in einer Vielzahl
von Säugetierzellen
ergeben, oder sie können
zellspezifisch oder sogar Kern-gegen-Zytoplasma spezifisch sein.
Diese sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und können unter
Verwendung von standardgemäßen Protokollen
der Molekularbiologie konstruiert werden.
-
Eine
Liste von Genen, die während
der Jahre 1990 und 1994 zur Gentherapie durch das RAC genehmigt
wurden, ist in Tabelle 2 bereitgestellt. Tabelle
2 Vom
RAC genehmigte Protokolle zur menschlichen Gentherapie: 1990-1994
| Schwere
kombinierte | Autologe
Lymphozyten, transduziert mit | 7/31/90 |
| Immundefizienz
(SCID) | menschlichem
ADA-Gen | |
| aufgrund
von | | |
| Adenosindeaminase
(ADA)- | | |
| Defizienz | | |
| Fortgeschrittener
Krebs | Tumorinfiltrierende
Lymphozyten, transduziert | 7/31/90 |
| | mit
Tumornekrosefaktorgen | |
| Fortgeschrittener
Krebs | Immunisierung
mit autologen Krebszellen, | 10/07/91 |
| | transduziert
mit Tumornekrosefaktorgen | |
| Fortgeschrittener
Krebs | Immunisierung
mit autologen Krebszellen, | 10/07/91 |
| | transduziert
mit Interleukin-2-Gen | |
| Familiäre Hypercholesterolämie | Ex
vivo-Gentherapie | 10/08/91 |
| Malignität | In
vivo-Gentransfer in Tumore | 2/10/92 |
| Krebs | Genübertragung | 2/10/92 |
| Wiederkehrendes/Refraktäres | Mit
einem Zytokin-Gen modifizierte autologe | 6/01/92 |
| Neuroblastom | Neuroblastomzellen
(Phase I-Studie) | |
| Gehirntumore | Intratumorale
Transduktion mit | 6/01/92 |
| | Thymidinkinasegen
und intravenösem | |
| | Ganciclovir | |
| Metastatisches
Melanom | Immunisierung
mit zu HLA-A2 passenden | 6/02/92 |
| | allogenen
Melanomzellen, die Interleukin-2 | |
| | sekretieren | |
| Fortgeschrittenes
Renalzellenkarzinom | Immunisierung
mit Interleukin-2 sekretierenden allogenen zu HLA-A2 passenden Renalzellen-Karzinomzellen | 6/02/92 |
| Krebs | Antitumorimpfstoff
mit modifiziertem | 9/15/92 |
| | Interleukin-4-Gen
(Pilotstudie) | |
| Zystische
Fibrose | Replikationsdefizienter
rekombinanter | 12/03/92 |
| | Adenvirus,
der die cDNA von normalem | |
| | menschlichen
zystische Fibrose-Transmembran- | |
| | Leitungs-Regulator
(CFRT)-Gen trägt; | |
| | Einzelverabreichung
an die Lunge (Phase I- | |
| | Studie) | |
| Zystische
Fibrose | Adenovirusvektor
mit deletiertem E1 zum | 12/03/92 |
| | Abgeben
des CFTR-Gens (Phase I-Studie) | |
| Zystische
Fibrose | Adenovirusvektor,
verwendet zum Abgeben des | 12/04/92 |
| | CFTR-Gens
an das Nasenepithel | |
| Rekurrentes
Glioblastom | In
vivo-Tumortransduktion unter Verwendung | 3/01/93 |
| (Gehirntumor) | des
Herpes simplex-Thymidinkinase- | |
| | Gens/Ganciclovir-Systems | |
| Metastatisches | Injektion
nicht replizierender autologer | 3/01/93 |
| Renalzellenkarzinom | Tumorzellen
hergestellt +/- Granuolozyten- | |
| | Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor- | |
| | Transduktion
(Phase I-Studie) | |
| Zystische
Fibrose | Verwendung
von replikationsdefizientem | 3/02/93 |
| | rekombinantem
Adenovirusvektor, um | |
| | menschliche
CFTR-cDNA an die Lungen | |
| | abzugeben
(Phase I-Studie) | |
| Zystische
Fibrose | Verwendung
von Adenvirus mit deletiertem | 3/02/93 |
| | E1
zur Abgabe von CFTR-Gen an die | |
| | Nasenhöhle (Phase
I-Studie) | |
| Disseminiertes
malignes | Menschliche
Gamma-Interferon-transduzierte | 6/07/93 |
| Melanom | autologe
Tumorzellen (Phase I-Studie) | |
| Krebs
der Eierstöcke | Verwendung
von modifizierten Retroviren, um | 6/07/93 |
| | Chemotherapie-Resistenzsequenzen
in normale | |
| | hämatopoetische
Zellen zur Chemoprotektion | |
| | einzuführen (Pilotstudie) | |
| Krebs | Immuntherapie
durch direkten Gentransfer in | 6/07/93 |
| | Tumore | |
| Gaucher'sche Krankheit | Ex
vivo-Genübertragung
und autologe | 6/07/93 |
| | Transplantation
von CD34+-Zellen | |
| Gaucher'sche Krankheit | Retroviral
vermittelte Übertragung
von cDNA | 6/07/93 |
| | für menschliche
Glucocerebrosidase in | |
| | hämatopoetische
Stammzellen | |
| Asymptomatische
Patienten, | Muriner
retroviraler Vektor, der für HIV-I-Gene | 6/07/93 |
| infiziert
mit HIV-I | kodiert
[HIV-IT(V)] | |
| AIDS | Wirkungen
einer transdominanten Form des | 6/07/93 |
| | rev-Gens
auf AIDS-Eingriff | |
| Rekurrente
pädiatrische
maligne | In
vivo-Tumortransduktion mit Herpes simplex- | 6/08/93 |
| Astrocytoma | Thymidinkinasegen | |
| Fortgeschrittener
Krebs | Menschliche
multiple Wirkstoffresistenz | 6/08/93 |
| | (MDR)-Genübertragung | |
| Gehirntumore | Auf
Episom basierende Antisense-cDNA- | 6/08/93 |
| | Transkription
von insulinartigem | |
| | Wachstumsfaktor
I | |
| Kleinzelliger
Lungenkrebs | Krebszellen
transfiziert mit und exprimierend | 9/09/93 |
| | Interleukin-2-Gen
(Phase I-Studie) | |
| Brustkrebs | Retroviral
vermittelte Übertragung
des | 9/09/93 |
| (nach
Chemotherapie) | menschlichen
MDR-Gens in hämatopoetische | |
| | Stammzellen
(autologe Transplantation) | |
| Rekurrente
pädiatrische | Intratumorale
Transduktion mit Thymidin- | 9/09/93 |
| Gehirntumore | Kinase-Gen
und intravenöse
Verabreichung von | |
| | Ganciclovir | |
| Malignes
Melanom | Immunisierung
mit Interleukin-2 sekretierenden | 9/10/93 |
| | allogenen
menschlichen Melanomzellen | |
| HIV-Infektion | Autologe
Lymphozyten, transduziert mit | 9/10/93 |
| | katalytischem
Ribozym, das HIV- 1-RNA | |
| | spaltet
(Phase I-Studie) | |
| Metastatisches
Melanom | Genetisch
veränderte
autologe | 9/10/93 |
| | Tumorimpfstoffe,
die Interleukin-2 herstellen | |
| Leptomeningele
Karzinomatose | Intrathekale
Gentherapie | 12/02/93 |
| Kolonkarzinom | Injektion
mit autolog bestrahlten Tumorzellen | 12/2/93 |
| | und
Fibroblasten, die genetisch modifiziert sind, | |
| | um
Interleukin-2 zu sekretieren | |
| Gaucher'sche Krankheit | Retroviral
vermittelte Übertragung
von cDNA | 12/3/93 |
| | für menschliche
Glucocerebrosidase in | |
| | peripheres
Blut, das die Zellen von Patienten | |
| | wieder
besiedelt | |
| HIV-Infektion | Muriner
retroviraler Vektor, der für HIV-IT(V)- | 12/03/93 |
| | Gene
kodiert (offene Label-Phase I/II-Versuch) | |
| Fortgeschrittenes
(Phase IV) | Induktion
von zellvermittelter Immunität gegen | 12/03/93 |
| Melanom | tumorassoziierte
Antigene durch B7- | |
| | transfizierte,
lethal bestrahlte allogene | |
| | Melanomzelllinien
(Phase I-Studie) | |
| Fortgeschrittenes
kolorektales | Immuntherapie
durch direkten Gentransfer in | 12/03/93 |
| Karzinom | Lebermetastasen
(Phase I-Studie) | |
| Melanom | Adoptive
Immuntherapie mit aktivierten | 12/03/93 |
| | Lymphknotenzellen,
in vivo mit autologen | |
| | Tumorzellen
geprägt,
die mit dem Interleukin- | |
| | 4-Gen
transduziert wurden | |
| Zystische
Fibrose | Durch
kationische Liposomen vermittelte | 12/03/93 |
| | Übertragung
von CFTR-Gen an Nasenluftwege | |
| | (Phase
I-Studie) | |
| Zystische
Fibrose | Adenovirusvermittelte Übertragung
von CFTR- | 12/03/93 |
| | Gen
an das Nasenepithel und die Kieferhöhle | |
| Pädiatrisches
Neuroblastom | Immunisierung
mit mit Gamma-Interferon | 3/03/94 |
| | transduzierten
Neuroblastomzellen (ex vivo) | |
| | (Phase
I) | |
| HIV-Infektion
(identische | Adoptiver Übergang
von erbgleichen | 3/03/94 |
| Zwillinge) | zytotoxischen
T-Lymphozyten (Phase I/II- | |
| | Pilotstudie) | |
| Emphysem | Expression
eines exogen verabreichten | 3/03/94 |
| | menschlichen
alpha-I-Antitrypsin-Gens im | |
| | Verdauungstrakt | |
| Metastatisches | Immuntherapie
durch direkte Genübertragung | 3/04/94 |
| Renalzellenkarzinom | in
metastatische Läsionen
(Phase I-Studie) | |
| Malignes
Melanom | Immuntherapie
durch direkte Genübertragung | 3/04/94 |
| | (Phase
I-Studie) | |
| Nichtkleinzelliger
Lungenkrebs | Modifikation
von Onkogen- und | 3/04/94
(erneut vorgelegtes Protokoll) |
| | Tumorsuppressorgen-Expression
(erste | |
| | Antisense-Therapie;
ursprüngliches
Protokoll | |
| | genehmigt
von RAC 9/15/92, aber | |
| | Genehmigung
dann zurückgezogen 12/03/93) | |
| Metastatischer
Kolorektalkrebs | Polynukleotidverstärkte anti-Tumor- | 6/09/94 |
| | Immunisierung
an menschliches | |
| | karzinoembryogenisches
Antigen (Phase I) | |
| Rheumatoide
Arthritis | Transduktion
Interleukin-I- | 6/09/94 |
| | Rezeptorantagonistengen
an menschliche | |
| | Gelenke | |
| Brustkrebs
(Chemoschutz während
der Therapie) | Verwendung
von modifiziertem Retrovirus, um | 6/09/94 |
| | Chemotherapieresistenzsequenzen
in normale | |
| | hämatopoetische
Zellen einzuführen | |
| | (Pilotstudie) | |
| Fanconi'sche Anämie | Retroviral
vermittelter Gentransfer der Fanconi- | 6/09/94 |
| | Anämie-Komplementationsgruppe C-Gen
an | |
| | hämatopoetische
Vorläufer | |
| Nichtkleinzelliger
Lungenkrebs | Modifikation
der Tumorsuppressorgen- | 6/10/94 |
| | Expression
und Induktion von Apoptose mit | |
| | Adenovirusvektor,
der Wildtyp p53 exprimiert, | |
| | und
Cisplatin | |
| Glioblastom | Injektion
von Tumorzellen, die genetisch | 6/10/94 |
| | verändert sind,
um Interleukin-2 zu sekretieren | |
| | (Phase
I-Studie) | |
| Krebs | Direkte
Injektion von Tumoren mit autologen | 6/10/94 |
| | Fibroblasten,
die verändert
sind, so dass sie das | |
| | Interleukin-12-Gen
enthalten | |
| Metastatisches | Mit
autologer menschlicher Granulozyten- | ORDA/ |
| Prostatakarzinom | Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor-Gen transduzierter
Prostatakrebsimpfstoff | NIH
8/03/94* |
| | *
(erstes Protokoll, das unter dem | |
| | beschleunigten
Begutachtungsverfahren | |
| | genehmigt
wurde; ORDA = Office of | |
| | Recombinate
DNA Activities) | |
| Zystische
Fibrose (Erwachsene | Adenassoziiertes
Virus-Vektor, um das CFTR- | 9/12/94 |
| mit
mildem Krankheitsverlauf) | Gen
an Zellen in Nase und Lunge abzugeben | |
| | (Phase
I-Studie) | |
| Metastatischer
Brustkrebs | In
vivo-Infektion mit auf die Brust zielendem | 9/12/94 |
| | retroviralen
Vektor, der Antisense c-fox- oder | |
| | Antisense
c-myc-RNA exprimiert | |
| Zystische
Fibrose | Wiederholte
Verabreichung von | 9/12/94 |
| | replikationsdefizientem
rekombinanten | |
| | Adenvirus,
der normale CFTR-cDNA enthält, | |
| | an
die Luftwege des Patienten | |
| Metastatischer
Brustkrebs | Nichtvirales
System (auf Liposomen basierend) | 9/12/94 |
| (refraktär oder rekurrent) | zum
Abgeben des menschlichen Interleukin-2- | |
| | Gens
an autologe Tumorzellen (Pilotstudie) | |
| Mildes
Hunter-Syndrom | Retroviral
vermittelte Übertragung
des | 9/13/94 |
| (Mucopolysaccharidose
Typ II) | Iduronat-2-Sulfatasegens
in Lymphozyten | |
| Periphere
Arterienkrankheit | Arterielle
Genübertragung
für therapeutische | 9/13/94 |
| | Angiogenese | |
| Fortgeschrittene
CNS- | Verwendung
von rekombinantem Adenvirus | 9/13/94 |
| Malignität | (Phase
I-Studie) | |
| Fortgeschrittenes
Mesotheliom | Verwendung
von rekombinantem Adenvirus | 9/13/94 |
| | (Phase
I-Studie) | |
-
Die
vorangehenden stellen nur Beispiele für Gene dar, die abgegeben werden
können.
-
Geeignete
Promotoren, Enhancer, Vektoren, etc. für solche Gene sind in der mit
den vorangehenden Versuchen assoziierten Literatur veröffentlicht.
Im Allgemeinen ersetzen oder supplementieren nützliche Gene eine Funktion,
einschließlich
Gene, die für
fehlende Enzyme wie beispielsweise die Adenosindeaminase (ADA) kodieren,
die in klinischen Studien verwendet wurde, um eine ADA-Defizienz
zu behandeln, und Cofaktoren wie beispielsweise Insulin und Koagulationsfaktor
VIII. Gene, die die Regulierung beeinflussen, können ebenfalls alleine oder
in Kombination mit einem Gen verabreicht werden, das eine spezifische
Funktion supplementiert oder ersetzt. Zum Beispiel kann ein Gen,
das für
ein Protein kodiert, welches die Expression eines bestimmten proteinkodierenden
Genes supprimiert, durch die Mikropartikel der Erfindung verabreicht
werden. Weil das Schleimhautepithel reich an Zellen des Immunsystems
ist, ist die Erfindung besonders beim Abgeben von Genen nützlich,
die die Immunreaktion stimulieren, einschließlich Gene, die für virale
Antigene, Tumorantigene, Zytokine (z. B. Tumornekrosefaktor) und
Induktoren von Zytokinen (z. B. Endotoxin) kodieren. Weil das Schleimhautepithel
einen Weg zum systemischen Kreislauf darstellt, kann die Erfindung
verwendet werden, um Gene abzugeben, die für verschiedene pharmakologische
Agenzien kodieren. Diese Gene können
Zellen lokal innerhalb des Schleimhautepithels zur Freisetzung des
Genproduktes an den systemischen Kreislauf transfizieren, oder die
Gene können
Zellen transfizieren, die von dem Schleimhautepithel weit entfernt
sind, wobei sie Z. B. über
den systemischen Umlauf der Mikropartikel an die weit entfernte
Stelle abgegeben werden.
-
Gene
können
aus einer Vielzahl von Quellen erhalten oder abgeleitet werden,
die Literaturstellen, Genbank oder kommerzielle Lieferanten umfassen.
Sie können
unter Verwendung von Festphasensynthese synthetisiert werden, falls
sie vergleichsweise klein sind, aus hinterlegten Proben wie denjenigen
erhalten werden, die bei der American Type Culture Collection, Rockville,
MD, hinterlegt sind, oder unter Verwendung von veröffentlichten
Sequenzinformationen de novo isoliert werden.
-
Die
hierin beschriebenen Gene unterscheiden sich von kurzen Oligonukleotiden
wie beispielsweise Antisense-Oligonukleotiden und Ribozymen durch
ihre Länge
und Funktion. Anders als solche kurzen Oligonukleotide kodieren
Gene für
Protein und werden daher typischerweise eine minimale Länge von
mehr als 100 Basenpaaren aufweisen, typischererweise hunderte von
Basenpaaren. Es war nicht vorhersehbar, dass diese langen Nukleinsäuresequenzen,
die gegen Spaltung und Verdrehung von Sekundär- und Tertiär-Sequenz höchst empfindlich
sind, ohne Beschädigung
in Mikropartikel eingebaut werden könnten, und es war nicht vorhersehbar,
dass die verkapselte DNA die Umgebung im Magen überleben würde und intrazellulär in ihrer
aktiven Form zur Transfektion von Zellen abgegeben und freigesetzt
werden könnte.
-
Wie
hierin verwendet, sind Vektoren Agenzien, die das Gen ohne Abbau
in eine Zelle transportieren und einen Promotor umfassen, der die
Expression des Gens in den Zellen bewirkt, in die es abgegeben wird. Vektoren
werden in zwei Klassen unterteilt:
- A) Biologische Agenzien,
die aus viralen, bakteriellen oder anderen Quellen stammen.
- B) Chemische/physikalische Verfahren, die das Potenzial der
Genaufnahme erhöhen,
das Gen direkt in den Nukleus einführen oder das Gen auf einen
Zellrezeptor zielen.
-
Virale
Vektoren weisen höhere
Transaktions (Fähigkeit,
Gene einzuführen)-Fähigkeiten
als die meisten chemischen oder physikalischen Verfahren auf, um
Gene in Zellen einzuführen.
-
Retrovirale
Vektoren sind die Vektoren, die am häufigsten für klinische Versuche verwendet
werden, weil sie eine größere genetische
Ladung als andere virale Vektoren tragen. Sie sind bei nicht proliferierenden Zellen
jedoch nicht nützlich.
-
Adenvirus-Vektoren
sind vergleichsweise stabil, und es ist leicht, mit ihnen zu arbeiten,
sie weisen hohe Titer auf und können
in einer Aerosol-Formulierung abgegeben werden. Viele Leute können jedoch
vorher vorhandene Antikörper
aufweisen, die die Wirksamkeit verhindern, und es ist schwer, sie
in Mengen herzustellen.
-
Pockenvirale
Vektoren sind groß und
weisen verschiedene Stellen zum Einfügen von Genen auf, sie sind
thermostabil und können
bei Raumtemperatur gelagert werden. Sie können jedoch nicht von Wirt
zu Wirt übertragen
werden, und es bestehen einige Sicherheitsbedenken, weil sie in
andere Zellen eintreten können.
-
Plasmide
sind doppelsträngige
DNA, die in supergecoilten, linearen, offen zirkulären oder
denaturierten Konformationen vorliegen kann. Für einen Gentransfer verwendete
Plasmide enthalten typischerweise das interessierende Gen, einen
Promotor/Enhancer, eine Poly (A)-Terminierungssequenz,
einen Replikationsursprung, ein Intron und/oder ein Reportergen.
Plasmide sind nicht in das Genom integriert, und die weite Mehrzahl
von ihnen liegt nur für
einen Zeitraum von einigen Wochen bis mehreren Monaten vor, so dass
sie typischerweise sehr sicher sind. Sie weisen jedoch geringere
Expressionsmengen als Retroviren auf, und da die Zellen die Fähigkeit
haben, die Expression von fremden Genen zu bemerken und schließlich abzustellen,
kann die kontinuierliche Freisetzung von DNA aus dem Polymer an die
Zielzellen die Dauer der funktionellen Expression wesentlich erhöhen, während sie
den Nutzen der Sicherheit, die mit nichtviralen Transfektionen verbunden
ist, beibehält.
-
Andere
Verfahren, um Gene direkt in Zellen einzuführen oder Rezeptoren auf der
Oberfläche
von Zellen auszunutzen, umfassen die Verwendung von Liposomen und
Lipiden, Liganden für
spezifische Zelloberflächenrezeptoren,
Zellrezeptoren und Kalziumphosphat und andere chemische Vermittler,
Mikroinjektionen direkt in einzelne Zellen, Elektroporation und
homologe Rekombination. Die chemischen/physikalischen Verfahren
weisen jedoch eine Anzahl von Problemen auf und werden typischerweise
nicht mit den hierin beschriebenen Mikropartikeln verwendet werden.
Zum Beispiel sind chemische Vermittler für die Verwendung in vivo unpraktisch:
wenn Kalziumphosphat verwendet wird, scheint es eine sehr geringe
Transduktionsrate zu geben, wenn Natriumbutyrat verwendet wird,
ist das eingefügte
Gen hochgradig instabil, und wenn Glycerin verwendet wird, geht
das eingefügte
Gen schnell verloren.
-
Es
ist möglich,
Nukleinsäuremoleküle in Liposomen
einzubauen oder Komplexe von ihnen mit Liposomen herzustellen, die
dann zur Abgabe an Zellen in die Mikropartikel eingebaut werden.
Das Verhältnis
von Liposom zu Polymerlösung
ist beim Bestimmen, ob die Liposomen während des Verfahrens zum Einbau
in die Mikropartikel als getrennte Einheiten bestehen bleiben werden,
wichtig. Wenn das Verhältnis
des Lösungsmittels
zu hoch ist, wird sich das Phospholipid in dem Polymerlösungsmittel
auflösen,
anstatt als Teil der Liposomendoppelschicht bestehen zu bleiben.
Dies ist eine Funktion der Liposomenzusammensetzung, der Polymerkonzentration
und der Lösungsmittelzusammensetzung.
Die Lipsomen können
die Effizienz der Übertragung von
der DNA in die Zellen erhöhen,
wenn die Liposomen aus den Mikropartikeln freigesetzt werden. Liposomen
sind von Gibco BRL im Handel erhältlich,
zum Beispiel als LIPOFECTIN® und LIPOFECTACE®,
die aus kationischen Lipiden wie beispielsweise N-[1-(2,3-dioleyloxy)-propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchlorid
(DOTMA) und Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDAB) hergestellt
sind. Es sind auch zahlreiche Verfahren zum Herstellen von Liposomen
veröffentlicht,
die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
-
Tabelle
2 stellt eine Zusammenfassung der Funktionen einiger Vektoren dar,
die zurzeit bei der Gentherapie verwendet werden. Tabelle
2
| Zusammenfassung
von verschiedenen Vektoren, die zurzeit bei der Gentherapie verwendet
werden |
| | Größenbeschränkungen | Spezifität des Zielsuchens | Immunogenität/Toxizität | Anhaltende/Hohe/Niedrige/Gesteuerte
Expression |
| Retrovirus | 7
Kb | keine | keine | geringe,
ungesteuerte transiente Transfektion |
| Adenvirus | 7
Kb | keine | hohe
Immunogenität | geringe,
ungesteuerte transiente Transfektion |
| Liposom | keine | keine | bei
hohen Dosen toxisch | geringe,
ungesteuerte transiente Transfektion |
-
Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung werden an Patienten
verabreicht. Wie hierin verwendet, bedeuten Patienten Menschen,
nichtmenschliche Primaten, Pferde, Ziegen, Kühe, Schafe, Schweine, Hunde,
Katzen und Nagetiere.
-
Wenn
sie therapeutisch verwendet werden, werden die Verbindungen der
Erfindung in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht. Im Allgemeinen
bedeutet eine therapeutisch wirksame Menge jene Menge, die notwendig
ist, um den Ausbruch des bestimmten behandelt werdenden Zustandes
zu verzögern,
sein Fortschreiten zu inhibieren, seine Symptome zu lindern oder
ihn völlig
zum Anhalten zu bringen. Sie ist geringer als die Menge, die medizinisch
unannehmbare Nebenwirkungen hervorruft. Im Allgemeinen wird eine
therapeutisch wirksame Menge mit dem Alter des Patienten, seinem
Zustand, seinem Geschlecht, genauso wie mit der Natur und dem Umfang
der Krankheit bei dem Patienten schwanken, Faktoren, die alle durch
den Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden können. Die Dosierung kann durch
den jeweiligen Arzt oder Tierarzt angepasst werden, insbesondere
für den
Fall irgendeiner Komplikation. Eine therapeutisch wirksame Menge schwankt
typischerweise zwischen 0,0001 mg/kg (aktives Agens/Körpergewicht)
und ungefähr
1000 mg/kg, bevorzugterweise zwischen ungefähr 0,1 mg/kg bis ungefähr 20 mg/kg
bei einer oder mehr als einer täglichen Dosisverabreichung
an einem oder mehr als einem Tag.
-
Die
Therapeutika der Erfindung können über jeglichen
herkömmlichen
Weg verabreicht werden. Der bevorzugte Weg ist das Schleimhautepithel
wie beispielsweise bei einer oralen Formulierung, einem Aerosol für die Abgabe
an den Atemwegstrakt, einer vaginalen Formulierung, rektalen Formulierung,
nasalen Formulierung, bukkalen Formulierung oder okkularen Fomulierung.
Die Verabreichung kann jedoch über
jeglichen herkömmlichen
Weg erfolgen, einschließlich
intramuskuläre,
intrakavitäre,
subkutane oder transdermale Verabreichung. Techniken zum Herstellen
von Aerosolabgabesystemen sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt.
Im Allgemeinen sollten solche Systeme Bestandteile verwenden, die
die biologischen Eigenschaften des Therapeutikums nicht erheblich
einschränken
(siehe zum Beispiel Sciarra und Cutie, „Aerosols," in Reminton's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe,
1990, S. 1694-1712).
-
Das
PIN-Verfahren zum Herstellen der Mikropartikel der Erfindung ist
besonders zum Herstellen von Aerosolen geeignet. Fachleute auf dem
Gebiet können
die verschiedenen Parameter und Bedingungen zum Herstellen von Aerosolen
oder anderen Formulierungen leicht ohne Zurückgreifen auf unangemessenes
Experimentieren bestimmen.
-
Orale
Formulierungen sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und
umfassen Tabletten, Kapseln oder Flüssigkeiten mit Geschmacksstoffen,
Stabilisatoren und dergleichen. Zubereitungen für eine parenterale Verabreichung
umfassen sterile wässrige
oder nichtwässrige
Lösungen,
Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nichtwässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol,
Polyethylenglykol, Pflanzenöle
wie beispielsweise Olivenöl
und injizierbare organische Ester wie beispielsweise Ethyloleat.
Wässrige
Träger
umfassen Wasser, alkoholische/wässrige
Lösungen,
Emulsionen und Suspensionen, einschließlich Saline und gepufferte
Medien. Parenterale Vehikel umfassen Natriumchloridlösung, Ringer'sche Dextrose, Dextrose
und Natriumchlorid, Ringer-Laktat-Lösung
oder fette Öle.
Intravenöse
Vehikel umfassen Flüssigkeits-
und Nährstoff-Wiederauffüller, Elektrolyt-Wiederauffüller (wie
beispielsweise diejenigen, die auf Ringer'scher Dextrose basieren) und dergleichen.
Konservierungsmittel und andere Zusatzstoffe, wie zum Beispiel antimikrobielle Mittel,
Antioxidanzien, chelatbildende Agenzien und inerte Gase und dergleichen
können
ebenfalls vorhanden sein.
-
Die
pharmazeutische Zubereitung von Mikropartikeln kann alleine oder
in Kombination mit einem therapeutischen Agens zum Behandeln der
Krankheit oder des Zustandes verwendet werden, für die die Mikropartikel verabreicht
werden. Bekannte Therapeutika sind in medizinischen Lehrbüchern wie
beispielsweise Harrisons, Principles of Internal Medicine (McGraw
Hill, Inc., New York) beschrieben. Das bestimmte verwendete Therapeutikum
hängt von
der Natur der behandelt werdenden Krankheit oder des behandelt werdenden
Zustandes ab.
-
In
einigen Ausführungsformen
würde ein übliches
Verabreichungsvehikel (z. B. Pille, Tablette, Implantat, injizierbare
Lösung,
etc.) sowohl die Mikropartikel als auch das therapeutische Agens
zum Behandeln der Krankheit oder des Zustandes enthalten. Somit
stellt die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen
zur medizininschen Verwendung bereit, die die Mikropartikel der
Erfindung zusammen mit einem oder mehr als einem pharmazeutisch
akzeptablen Träger
davon und optional anderen therapeutischen Zutaten umfasst.
-
Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen sollten eine therapeutisch wirksame
Menge der Mikropartikel in einer Gewichtseinheit oder Volumeneinheit
enthalten, die zur Verabreichung an einen Patienten geeignet ist.
Der Begriff „pharmazeutisch
akzeptabel" bedeutet
ein nichttoxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen
Aktivität
der aktiven Bestandteile nicht stört. Die Charakteristika des
Trägers
werden von dem Verabreichungsweg abhängen. Pharmazeutisch akzeptable
Träger
umfassen Verdünnungsmittel,
Füllmittel, Salze,
Puffer, Stabilisatoren, Löslichmacher
und andere Materialien, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind.
-
Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung erlauben die nicht
invasive Abgabe von Genen unter der Kontrolle von Promotoren zur
Transfektion von Zellen in vivo. Die Materialien der Erfindung können auf
Epitheloberflächen,
einschließlich
das Schleimhautepithel, angewandt werden. Wie aus den Beispielen
unten ersichtlich sein wird, können
sowohl Epithel- als auch Nichtepithelzellen transformiert werden. Bei
der oralen Abgabe können
z. B. absorbierende und nichtabsorbierende intestinale Epithelzellen
transfiziert werden, genauso wie mit dem Darm assoziierte Zellen
des Lymphgewebes und Leberzellen.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1: Mikrokügelchen, die durch Verkapselung
mittels Phaseninversion hergestellt wurden, zeigen eine erhöhte Bioverfügbarkeit
von verkapselten Wirkstoffen in vivo (Beispiel zur Information/als
Hintergrund zur vorliegenden Erfindung bereitgestellt):
-
1. Orale Abgabe von Mikropartikeln:
-
Es
wurden Studien durchgeführt,
um das Schicksal von oral verabreichten P(FA:SA)20:80-Mikropartikeln zu
bestimmen. Die Mikropartikel enthielten Rhodamin und wiesen einen
Partikelgrößenbereich
zwischen 0,1 und 1,0 Mikrometern auf. Ratten wurden mit einer einzelnen
Dosis von 3 mg solcher Mikropartikel gefüttert. Nicht später als
eine Stunde nach dem Verfüttern
einer einzelnen Dosis wurde beobachtet, dass die Mikropartikel das
Schleimhautepithel durch das Durchwandern zwischen absorbierenden
Zellen (parazellulärer
Weg) durchquerten. Zusätzlich
wurde das Durchqueren von Mikropartikeln des follikelassoziierten
Epithels (FAE) und in die Peyer'schen
Drüsen
beobachtet. Nach drei und sechs Stunden wurde eine noch größere Anzahl
an Mikropartikeln zwischen Epithelzellen und in den Peyer'schen Drüsen beobachtet.
Die Konzentrationsbereiche zeigten massive Mengen nichtselektiver
Aufnahme sowohl durch absorbierende Zellen als auch durch Peyer'sche Drüsen. Leberproben
zeigten große
Anzahlen von Nanokügelchen
mit anscheinend normal aussehenden Hepatozyten. Milzschnitte zeigten
ebenfalls Nanokügelchen,
aber weniger als in der Leber. Nach zwölf Stunden wurden immer noch
große
Anzahlen von Kügelchen
zwischen zottenreichen Epithelzellen und in den Peyer'schen Drüsen beobachtet. Ähnliche
Schnitte wurden selbst vierundzwanzig Stunden nach dem Flitter beobachtet.
-
Dieses
Experiment zeigte eine umfangreiche Aufnahme von Mikropartikeln,
die nach einer einzelnen oralen Dosis über einen Zeitraum von mindestens
vierundzwanzig Stunden andauerte. Die Mikropartikel durchquerten
die Epithelbegrenzung anscheinend durch das Durchwandern zwischen
Zellen. Die beobachtete Aufnahme schien nicht durch die FAE begrenzt
zu sein, die die Peyer'schen
Drüsen
bedecken; die Aufnahme fand diffus genauso durch das absorbierende
Epithel wie durch das FAE statt.
-
Es
wurden auch Transmissionselektronenmikroskopie-Experimente unter
Verwendung von für
Elektronen undurchsichtigen Markierern wie beispielsweise mikronisiertem
Eisen(III)oxid oder 5 nm-kolloidalem Gold durchgeführt, das
mit bioadhäsivem
P(FASA) 20:80 mikroverkapselt worden war, durchgeführt. Die
Ergebnisse zeigten, dass Nanokügelchen
tatsächlich
in großer
Anzahl durch den Dünndarm
auskleidende absorbierende Epithelzellen aufgenommen worden waren.
In einem typischen dünnen
Schnitt einer absorbierenden Zelle konnten bis zu einhundert Nanokügelchen
gezählt
werden. Während
die Ergebnisse der Lichtmikroskopie ein parazelluläres Eintrittsmittel
anzeigten, zeigten diese Elektronenmikrographen viele Mikropartikel
innerhalb von Zellen. Der Eintrittsmechanismus ist nicht bekannt,
obwohl mehrere Partikel gelegentlich in deutlichen „endozytotischen" Vesikeln beobachtet
wurden, die direkt unter der terminalen Membranregion nahe der apikalen
mikrovillösen
Grenze lagen. Der Bereich der Partikelgrößen, die im Zytoplasma von
Zellen beobachtet wurden, betrug 40-120 nm, deutlich unter der Auflösung von
Optiken mit normalem Licht und daher durch Lichtmikroskopie nicht
nachweisbar. Die Nanopartikel wurden im Zytoplasma, innerhalb von
membranösen Profilen
des endoplasmatischen Retikulums und des Golgi-Apparates und im
Allgemeinen im supranukleären (apikalen)
Teil der absorbierenden Zelle visualisiert. Gelegentlich wurden
Nanopartikel nahe den basalen Aspekten der Zelle beobachtet. Die
Kügelchen
wurden oft nahe den seitlichen Grenzen der Zelle, in den intrazellulären Räumen und
in naher Apposition zu den Tight junctions gefunden. Diese Ergebnisse
legen nahe, dass die Translokation von Nanokügelchen zusätzlich zur parazellulären Bewegung über den
transzellulären
Weg stattfand.
-
2. Orale Abgabe von Insulin:
-
Insulin
wurde unter Verwendung der Nanoverkapselungsverfahren mittels Phaseninversion
in P(FA)-PLGA(50:50)-Polymermischungen verkapselt. Nach dem Messen
der Blutglukosekonzentrationen nach dem Fasten wurde Ratten nach
dem Fasten eine anfängliche
Glukoseladung subkutan injiziert, und an sie wurde anschließend entweder
eine Suspension von Nanokügelchen
verfüttert,
die 20 IU Zink-Insulin (mikronisiertes FeO wurde als elektronendichter
Markierer eingeschlossen) in Saline enthielt, oder sie erhielten
ansonsten eine Scheinfütterung
nur mit Saline. Die Blutglukosekonzentrationen (BGL) wurden nach
dem Füttern
in Intervallen getestet.
-
Die
Kontrollen zeigten die erwartete Reaktion auf die Glukoseladung.
Die BGL stiegen nach drei Stunden um 40 mg/dL an und begannen dann
langsam, zur Basislinie zurückzukehren.
Im Gegensatz dazu wiesen mit der verkapselten Insulinformulierung
gefütterte
Tiere bei drei der vier Zeitpunkte, bei denen Proben genommen wurden,
konsistent geringere Blutglukosekonzentrationen auf als die Kontrolltiere.
Nach 1,5 Stunden betrugen die BGL 20 mg/dL unter der Basislinie
an im Vergleich zu 30 mg/dL über
der Basislinie bei Kontrolltieren. Nach drei Stunden stiegen die
BGL der mit Nanopartikeln behandelten Tiere auf 20 mg/dL über die
Basislinie im Vergleich zu einem Anstieg von 40 mg/dL bei den Kontrolltieren
(statistisch nicht unterschiedlich). Nach vier Stunden lagen die
BGL der mit Nanopartikeln gefütterten
Tiere fast 30 mg/dL unter der Basislinie im Vergleich zu einem BGL
von 20 mg/dL über
der Basislinie bei den Kontrolltieren. Nach fünf Stunden lagen die Glukosekonzentrationen
der Testgruppe niedriger als nach vier Stunden, während die
Konzentrationen bei den Kontrolltiere immer noch bei 35 mg/dL über der
Basislinie lagen. Weil die mit der verkapselten Insulinzubereitung gefütterten
Tiere besser in der Lage waren, die Glukoseladung zu regulieren,
ist es klar, dass das Insulin durch das Verkapselungsverfahren nicht
beschädigt
wurde, dass das Insulin die Umgebung im Magen überlebte, dass das Insulin
die Darmbarriere durchquerte und dass das Insulin aus den Nanopartikeln
in einer bioaktiven Form freigesetzt wurde. Eine weit verbreitete
Verteilung von mit Insulin beladenen Nanokügelchen wurde ebenfalls beobachtet.
Die Kügelchen
wurden in großen
Anzahlen beobachtet und durchwanderten das Schleimhautepithel im
Dünndarm,
in die Peyer'schen
Drüsen,
in die Lamina propria, in die Lymphgefäße und in die Blutgefäße der Darmwand.
Auch in der Milz und in anderen Gewebeproben wurden Nanopartikel
beobachtet. Somit wurde eine systemische Abgabe sowohl von Insulin
als auch Nanopartikeln gezeigt.
-
3. Verkapselung und orale Abgabe von Dicumarol:
-
Dicumarol
enthaltende Mikrokügelchen
wurden wie unten in Beispiel 2, Unterabschnitt 1, beschrieben, hergestellt.
Gleiche Dosen Dicumarol, spraygetrocknetes Dicumarol und Polyanhydrid
(FA:SA) 20:80 verkapseltes Dicumarol (25 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht),
suspendiert in 1,5 ml Ahornsirup, wurden an katheterisierte Ratten
(250-350 g) verfüttert.
In regelmäßigen Intervallen
wurden Blutproben abgenommen, und das Serum wurde unter Verwendung
eines UV-spektrophotometrischen Verfahrens auf die Konzentrationen
von Dicumarol getestet.
-
Die
Ergebnisse der in vivo-Versuche zeigen an, dass die Polyanhydrid
(FA:SA)-Mikrokapsel-Formulierung
im Vergleich zu den nicht verkapselten Formulierungen, einschließlich dem
mikronisierten Wirkstoff, eine erheblich erhöhte Bioverfügbarkeit aufwies. 12 Stunden
nach dem Verfüttern
waren die Serumkonzentrationen bei den Polyanhydrid (FA:SA)-Formulierungen erheblich
höher als
bei den Kontrollen. 48 Stunden nach dem Verfüttern waren die Serumkonzentrationen
von Dicumarol bei den Kontrollen zur Basislinie zurückgekehrt, während diejenigen
Tiere, die mit der bioadhäsiven
Polyanhydridformulierung gefüttert
worden waren, 72 Stunden lang nachweisbare Wirkstoffkonzentrationen
aufwiesen. ORALE BIOVERFÜGBARKEIT VON DICUMAROL
| Tabelle
1 |
| | VORRAT
DICUMAROLKONTROLLE | SPRAY
DICUMAROLKONTROLLE | P(FA:SA)
20:80 „PIN"-VERKAPSELTES DICUMAROL |
| C
MAX (ug/ml) | 11,53 ± 1,10* | 17,94 ± 1,22 | 18,63 ± 1,76* |
| T
MAX (Std.) | 9,87 ± 1,76 | 9,42 ± 1,36 | 10,61 ± 0,02 |
| t ½ (Halbwertszeit)
(Std.) | 18,25 ± 3,30 | 16,21 ± 0,87 | 17,92 ± 0,41 |
| AUC
(Bereich unter der Kurve) (ug/ml-Std.) | 171,48 ± 33,16 | 232,10 ± 19,2≠ | 363,59 ± 70,95≠ |
-
- * = Signifikant verschieden bei p < ,03
- ≠ = Signifikant
verschieden bei p < ,005
- (Mittel ± Standardabweichung)
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Verkapselung von Wirkstoffen mittels
Phaseninversion in bioadhäsiven
Formulierungen, wie beispielsweise der Polyanhydrid (FA:SA)-Formulierung,
die Bioverfügbarkeit
erhöhen
können.
-
Beispiel 2: Einbau von DNA in polymerische
Nanokügelchen
mittels Phaseninversion
-
Dieses
Beispiel stellt eine Beschreibung des Einbaus von Plasmid-DNA in
Poly(fumarsäure:sebacinsäure) 20:80
(P(FA:SA)) unter Verwendung einer Phaseninversionstechnik bereit.
-
- Materialien. P(FA:SA) 20:80 (synthetisiert durch ein Verfahren
von A. Domb & R.
Langer, Journal of Polymer Science, 1987, V. 25, S. 3373-3386),
ein Reporterplasmid pCMV/βgal
(Clonetech), Methylenchlorid (Fisher) und Petroleumether (Fisher)
wurden verwendet, um die Nanokügelchen
zu konstruieren.
-
- Methoden. 200 mg P(FA:SA) in Methylenchlorid (1 % Gew./Vol.)
werden mit 2 mg pCMV/βgal
in destilliertem Wasser (1 mg/ml) gevortext (30 Sek.), in flüssigen Stickstoff
gefroren und über
Nacht lyophilisiert, um die DNA in dem Polymer zu verteilen. Der
Zweck dieses Schrittes bestand darin, die Partikelgröße zu verringern
und die Aggregation der DNA zu verhindern. In der verteilten Phase
der Emulsion vorhandene DNA wäre
aufgrund der physikalischen Trennung, die durch die kontinuierliche
Polymerphase induziert wird, nicht in der Lage, zu aggregieren.
Die sich ergebende Mischung wurde wieder in 2 ml Methylenchlorid
aufgelöst,
in 200 ml Petroleumether gegossen und gefiltert, um Mikrokügelchen
zu gewinnen, die die DNA verkapseln.
-
- Ergebnisse. Unter Verwendung dieser Technik hergestellte
Polymernanopartikel wurden analysiert, um zu bestimmen, ob die DNA
innerhalb der Mikropartikel verkapselt war. Die Plasmid-DNA wurde
aus den Nanopartikeln extrahiert und einer Agarosegelelektrophorese
unterzogen. Die Ergebnisse zeigen, dass die DNA ohne Abbau verkapselt
wurde. Somit kann die Phaseninversionstechnik verwendet werden,
um intakte Plasmid-DNA mit sehr großem Molekulargewicht (7,2 × 106 Dalton) in bioabbaubare Nanopartikel einzubauen.
-
Beispiel 3: Freisetzung von pCMV/βgal aus P(FA:SA)-Nanopartikeln
-
Dieses
in vitro-Beispiel zeigt, dass Plasmid-DNA aus P(FA:SA)-Nanopartikeln
freigesetzt werden kann.
-
- Materialien. P(FA:SA)-pCMV/βgal-Nanopartikel wurden wie
in Beispiel 1 angegeben hergestellt, und der Freisetzungspuffer
war Tris-EDTA 10 mM, pH 7,4, 0,02 % Natriumazid.
-
- Methoden. Die Freisetzung von Plasmid-DNA aus diesen Nanopartikeln
wurde unter Verwendung eines standardgemäßen Wirkstofffreisetzungstests
bestimmt. Kurz gesagt wurden 10 mg der P(FA:SA)-pCMV/βgal-Nanopartikel
bei Raumtemperatur in 0,5 ml des Freisetzungspuffers inkubiert.
Die 0,25 ml des Überstandes
wurden gesammelt und periodisch durch frischen Freisetzungspuffer
ersetzt und auf die Anwesenheit von Plasmid-DNA analysiert. Der
gesammelte Überstand
wurde nach 24 Std., 72 Std., 1 Woche und 2 Wochen unter Verwendung
von Agarosegelelektrophorese analysiert.
-
- Ergebnisse. Die folgenden Proben wurden durch Agarosegelelektrophorese
analysiert 1) λ Hind
III-Leiter; 2) unverkapselter Stamm-pCMV/βgal; 3) 24 Stunden; 4) 72 Stunden;
5) 1 Woche; 6) 2 Wochen. Das Bandenmuster der freigesetzten Plasmid-DNA
zeigte an, dass die Plasmide strukturell intakt und nicht abgebaut
waren. Es wurde beobachtet, dass der verkapselte pCMV/βgal ohne
Abbau freigesetzt wurde und im Freisetzungspuffer in der offen zirkulären und
der supergecoilten Konformation vorhanden war. Diese Ergebnisse
zeigen an, dass Plasmid-DNA aus den abbaubaren P(FA:SA)-Nanopartikelformulierungen
freigesetzt werden kann.
-
Beispiel 4: Wirksamkeit von oral verabreichten
P(FA:SA)-pCMV/βgal-Nanopartikeln
beim in vivo-Gentransfer
-
Diese
Studie wurde durchgeführt,
um die Machbarkeit des in vivo-Gentransfers durch eine orale Verabreichung
von Genen zu zeigen, die in Polymer-Nanopartikelformulierungen eingebaut
sind.
-
- Materialien. P(FA:SA)-pCMV/βgal-Nanopartikel wurden wie
in Beispiel 1 angegeben hergestellt, und männliche Sprague-Dawley-Ratten – 400 Gramm – wurden
für die
in vivo-Überprüfung verwendet.
-
- Methoden. 500 μg
von in P(FA:SA)-Nanopartikeln verkapseltem unverkapseltem pCMV/βgal wurden
durch eine Magensonde in Form einer einzelnen Dosis an Ratten nach
dem Fasten verabreicht. Die Dosierung des verkapselten Plasmids
wurde bei einem Zehntel der Dosis des Kontrollplasmids gegeben,
um die Wirksamkeit des bioadhäsiven
Abgabesystems zu überprüfen und
die schützenden
Nutzwirkungen der Verkapselung zu zeigen. Die Tiere wurden nach
5 Tagen geopfert, und der Magen, der Dünndarm und die Leber wurden
ausgeschnitten und auf β-Galactosidaseexpression
getestet. Der Dünndarm
und der Magen wurden vorsichtig mit physiologischer Saline gespült, um Restfutterinhalte
und anhaftenden Schleim zu entfernen, die die Hintergrund-Enzymkonzentrationen
fälschlich
erhöhen
könnten.
Eine zusätzliche
Probe von unbehandelten Tieren wurde als Kontrolle eingeschlossen,
um die Hintergrundaktivität
der Galaktosidase abzuschätzen.
Die minimale Probengröße betrug
3 Tiere. Die Expression des Reportergenproduktes wurde getestet
durch: 1) Quantifizierung der β-Galaktosidaseaktivität und 2)
histologische Identifikation von transfizierten Zelltypen unter
Verwendung eines standardgemäßen histochemischen
Substrates (X-gal) der β-Galaktosidase.
-
- Ergebnisse. Ein luminometrischer Test auf die Aktivität der bakteriellen β-Galaktosidase
in Gewebehomogensten wurde durchgeführt, um die Menge der Reportergenaktivität zu bestimmen,
die in verschiedenen Gewebetypen nach der Verabreichung von nicht
verkapseltem und in P(FA:SA) verkapseltem pCMV/βgal zu bestimmen. Der Magen,
der Dünndarm
und die Leber wurden aus den Tieren ausgeschnitten, die entweder
mit dem in P(FA:SA) 20:80-„PIN"-Nanokügelchen
verkapselten pCMV/βgal
oder ansonsten mit dem nicht verkapselten Plasmid (Kontrolle) gefüttert worden
waren. Die Gewebe wurden in Lysepuffer homogenisiert, der 0,1 %
Triton (Gew./Vol.), PMSF und Leupeptin enthielt, um die Proteolyse
zu inhibieren, und bei 48 °C
1 Std. lang inkubiert, um endogene β-Galaktosidaseaktivität zu deaktivieren. Die Gewebehomogenste
wurden in Galacto-Light-Substrat
inkubiert, und die Lumineszenz wurde unter Verwendung eines Berthold-Luminometers gemessen.
-
Fünf Tage
nach einer einzelnen oralen Dosis von mit Plasmid beladenen PIN-Nanokügelchen
und nicht verkapseltem pCMV/βgal
wurde die β-Galaktosidaseaktivität im Magen,
im Dünndarm
und in der Leber quantifiziert (1). Tiere,
die mit verkapseltem pCMV/βgal
gefüttert
worden waren, zeigten sowohl im Dünndarm als auch in der Leber
im Vergleich zu nicht verkapseltem pCMV/βgal genauso wie zu nicht gefütterten Tieren
erhebliche Ausmaße
an β-Galaktosidaseaktivität. Die Aktivität des Reportergens,
die in Tieren gemessen wurde, die den verkapselten pCMV/βgal erhielten,
war im Darmgewebe am höchsten
(höher
als 54 mU im Vergleich zu 24 mU beim nicht verkapseltem Plasmid
und 18 mU bei den Hintergrundmengen an Aktivität, die in unbehandelten Kontrolltieren
gefunden wurden).
-
Diese
gleichen Tiere wiesen eine durchschnittliche Aktivität von 11
mU in der Leber im Vergleich zu weniger als 1 mU bei mit einfachem
CMV gefütterten
oder unbehandelten Kontrolltieren auf. Die Reportergenexpression
in Magenhomogensten war nicht unterschiedlich und in allen Gruppen
im Allgemeinen gering. Die Mengen bei mit verkapseltem und nacktem
Plasmid gefütterten
Gruppen waren identisch und betrugen 1 mU und waren tatsächlich niedriger
als die unbehandelten Kontrollen mit Mengen von 11 mU. Die Reportergenexpression,
die in Tieren nach oraler Verabreichung von verkapseltem pCMV/βgal nachgewiesen
wurde, zeigt an, dass das „PIN"-System verwendet
werden kann, um Plasmid-DNA in Darm- und Lebergewebe abzugeben.
-
Die
visuelle Lokalisierung von transfizierten Zellen nach oraler Verabreichung
wurde unter Verwendung von histochemischen Techniken mit X-gal sowohl
am ganzen Gewebe als auch an gefrorenen Schnitten angewandt. Das
Ganzgewebefärben
von Darmsegmenten aus Tieren, die verkapselten pCMV/βgal erhielten, zeigte
eine gelegentliches positives Färben
von villösem
Epithel des Darmes genauso wie von der äußeren Serosaoberfläche von
Peyer'schen Drüsen auf β-Galaktosidase
an. Es wurde jedoch gezeigt, dass einige Populationen von Ratten-Darmgewebe,
primär
die Epithelzellen an der villösen
apikalen Spitze, endogene Laktose enthalten, die die Differenzierung
zwischen transfizierter bakterieller β-Galaktosidase und Hintergrundaktivität schwierig
macht. Aufgrund der Schwierigkeiten, die mit der schlüssigen Identifizierung
von transfizierten Zellen innerhalb der Darmvilli verbunden sind,
konzentrierten wir uns auf andere Zellpopulationen, die keine Hintergrundaktivitäten aufweisen,
die Peyer'schen
Drüsen.
-
Das
Färben
des ganzen Gewebes mit X-gal zeigte, dass die Serosaoberfläche des
Dünndarms
aus mit verkapselter β-Galaktosidase
gefütterten
Ratten sich an lokalisierten Bereichen intensiv färbte, die
Bereichen entsprachen, die Peyer'sche
Drüsen
enthalten. Ein ähnliches
histochemisches X-gal-Färben
von gefrorenen Schnitten, die dem Bereich der Peyer'schen Drüsen entsprachen,
zeigte, dass, obwohl es einige β-Galaktosidase-positive
Zellen innerhalb der zentralen Lymphgewebemasse gab, die Mehrheit
der transfizierten Zellen in der Muskelfaserschicht der Darmschleimhaut
und der Advertitia unter den Peyer'schen Drüsen lokalisiert war. Diese
Verteilung der Färbung
war mit früheren
Studien konsistent, die eine Zurückhaltung
von Nanokügelchen
in den Peyer'schen
Drüsen
zeigten. Keine der Gruppen mit Kontrolltieren (nicht verkapselter pCMV/βgal oder
nicht gefütterte
normale Ratten) zeigten irgendeine fälschlich positive β-Galaktosidasefärbung im
Bereich der Peyer'schen Drüsen. Eine
histologische Untersuchung des Gewebes zeigte eine nahezu normale
Histologie bei allen experimentellen Gruppen ohne Belege für eine Schleimhautverletzung
oder -entzündung.
-
Das
Verkapseln von Plasmid-DNA mit dem „PIN"-System bietet zwei primäre Nutzwirkungen:
1) Schutz vor schnellem Abbau, wenn sie oral verabreicht wird, und
2) das Zielen der Transfektion auf bestimmte Zelltypen. Die Ergebnisse
der in vivo-Studie bestätigten,
dass Plasmid-DNA über
den oralen Weg unter Verwendung der bioadhäsiven „PIN"-Nanopartikelformulierungen abgegeben
werden kann. Die verkapselte DNA wird in Zellen im Dünndarm und
in Leberzellen eingebaut und kann funktionelle Genprodukte in Konzentrationen
exprimieren, die unter Verwendung üblicher histologischer und
luminometrischer Techniken leicht nachweisbar sind.