WO2013022083A1 - 新規抗ヒトｎｇｆ抗体 - Google Patents

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蒲原　正純
祐嗣 田中
由香里 神谷
高崎　淳
敦夫 米澤
英治 吉見
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アステラス製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a novel anti-human NGF antibody, and more specifically to an Fab ′ fragment of the anti-human NGF antibody.
  • Nerve growth factor is one of the humoral factors collectively called neurotrophic factor, and plays an important role in the generation, differentiation and maintenance of neurons in vivo.
  • NGF nerve growth factor
  • As a receptor for NGF a high affinity trkA receptor (receptor tyrosine kinase) and a low affinity p75NTR receptor are known. Of these, p75NTR has been reported to bind to all neurotrophic factors and participate in apoptosis during neuronal development, but its role has not yet been fully elucidated.
  • p75NTR has been reported to bind to all neurotrophic factors and participate in apoptosis during neuronal development, but its role has not yet been fully elucidated.
  • knockout mice of NGF and trkA receptor show similar phenotypes (Non-patent Document 1), and it is considered that the physiological action of NGF is mainly expressed through trkA receptor.
  • Non-patent Document 2 Pain was induced by administration of NGF to rats (Non-patent Document 2), and then systemic muscle pain was caused by intravenous administration of NGF to humans, and by local administration. In addition to systemic effects, it has been reported to induce hyperalgesia and allodynia at the injection site (Non-patent Document 3). Furthermore, it has been reported that there is no pain sensation in trkA receptor knockout mice (Non-Patent Document 4), and NGF is considered to be a molecule strongly involved in the development of pain.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to NGF and has an activity that inhibits its action can be developed, it is useful for the treatment, prevention, and diagnosis of various diseases related to NGF including pain. It is expected that
  • Tanezumab examples include humanized anti-human NGF antibodies Tanezumab (Patent Document 1) and PG110 (Patent Document 2), and fully human anti-human NGF antibodies REGN475 ( Patent Document 3), Fulluranum (Patent Document 4), and MEDI-578 (Patent Document 5) have been reported.
  • Tanezumab is the most advanced development, and its clinical results show that it has a powerful and wide-ranging analgesic effect on pain such as joint pain associated with osteoarthritis, chronic low back pain, and bladder pain associated with interstitial cystitis. Have been reported (Non-Patent Documents 9 to 11).
  • the main factors that define the effective dose of an antibody drug include neutralizing activity against the antigen possessed by the antibody and the amount of antigen present in the body. It can be said that this is a very beneficial improvement that leads to a reduction in the patient's economic burden and medical costs.
  • subcutaneous administration can be performed. Subcutaneous administration has the maximum merit that self-injection can be performed at home if certain conditions are met.In general, intravenous administration is often administered by infusion over a certain period of time, whereas subcutaneous administration is The ability to be administered as a bolus is also useful, and it is desirable for both physicians and patients to be able to choose between intravenous and subcutaneous formulations.
  • the volume that can be administered at a time is as small as about 1 mL in subcutaneous administration, and it is necessary to include sufficient antibody in the liquid volume to express the drug effect.
  • bioavailability must also be considered. That is, in order to realize a preparation for subcutaneous administration, it is required to produce an antibody that is excellent in solubility and exhibits a sufficient drug effect even at a low dose. Therefore, obtaining an antibody having a higher neutralizing activity against NGF than conventional antibodies is useful for treatment of diseases related to NGF and improvement of its convenience.
  • NGF is an important factor for neuron development.
  • a drug that inhibits the function of NGF sufficient examination is necessary from the viewpoint of safety.
  • one of the matters to be considered regarding safety is the effect on the fetus.
  • NGF mutations are the cause of congenital analgesia with respect to NGF function inhibition (Non-patent Document 5), and in animal experiments, autologous antibodies against NGF are produced in pregnant guinea pigs to increase NGF in vivo. It has been reported that the newborn guinea pigs exhibit painless symptoms when inhibited (Non-patent Document 12).
  • Non-Patent Documents 4 and 13 tests using NGF and trkA-deficient mice have also demonstrated that the lack of NGF action inhibits the development of embryonic sensory and sympathetic neurons.
  • diseases related to NGF include interstitial cystitis (more than half of patients are under 44 years old, 90% of patients are women (Non-patent Document 14)), chronic low back pain (average age is 40-50) More than 50% of patients are women (Non-patent Documents 15 to 17)), migraine (frequently aged 15 to 40 years, 80% of patients are women (Non-patent Document 18)), etc.
  • diseases that occur at a high rate in women Under these circumstances, when developing anti-NGF antibodies as pharmaceuticals, it is extremely important to avoid the risk of side effects on the fetus in pregnant women.
  • IC immune complexes
  • An immune complex in which an antibody and an antigen are bound is usually processed in an intraretinal system such as the spleen or liver, but the IC is soluble when the pathological condition such as an immune abnormality occurs or when the formed IC size is large. Loss and increase the risk of thrombus formation, and it is said that it accumulates in the glomeruli of the kidney and is associated with the development of nephritis.
  • IgG is a divalent antibody, but when the antigen is multivalent, the IC can take various sizes due to lattice formation.
  • An object of the present invention is to provide an anti-human NGF antibody excellent in safety or an antigen-binding fragment thereof that retains high neutralizing activity and has reduced risk of side effects such as effects on the fetus and thrombus formation. .
  • the present invention includes the following inventions as medically or industrially useful substances and methods.
  • An anti-human NGF antibody Fab ′ fragment comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the Fab ′ fragment of [1] wherein the heavy chain constant region of the Fab ′ fragment is a human Ig ⁇ 1 constant region.
  • the Fab ′ fragment of [1] wherein the light chain constant region of the Fab ′ fragment is a human Ig ⁇ constant region.
  • [7] A polynucleotide comprising a sequence encoding a heavy chain fragment of the Fab ′ fragment of any one of [1] to [6].
  • [8] A polynucleotide comprising a sequence encoding the light chain of the Fab ′ fragment of any one of [1] to [6].
  • An expression vector comprising the polynucleotide of [7] and / or [8].
  • [10] A host cell transformed with the expression vector of [9].
  • the host cell according to [10] which is selected from the group consisting of the following (a) and (b).
  • A an expression vector comprising a polynucleotide comprising a sequence encoding the heavy chain fragment of the Fab ′ fragment of any one of [1] to [6] and a polynucleotide comprising a sequence encoding the light chain of the Fab ′ fragment
  • An expression vector comprising a polynucleotide comprising a sequence encoding a heavy chain fragment of the Fab ′ fragment of any one of [1] to [6] and (b) a light chain of the Fab ′ fragment A host cell transformed with an expression vector comprising a polynucleotide comprising a sequence encoding [12]
  • a pain therapeutic agent comprising the Fab ′ fragment of any one of [1] to [6].
  • the therapeutic agent according to [13], wherein the pain is arthralgia associated with osteoarthritis.
  • a method for preventing or treating pain comprising a step of administering the Fab ′ fragment of any one of [1] to [6].
  • the method of [15], wherein the pain is arthralgia associated with osteoarthritis.
  • the Fab ′ fragment of [17], wherein the pain is arthralgia associated with osteoarthritis.
  • the present invention is described in detail below. As a result of repeated considerable inventive studies in the production of anti-human NGF antibodies or antigen-binding fragments thereof, the present inventors have reduced the risk of side effects such as fetal effects and thrombus formation while retaining high neutralizing activity. Succeeded in producing an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment excellent in safety.
  • the basic structure of the antibody molecule is common to each class, and consists of a heavy chain with a molecular weight of 50,000 to 70,000 and a light chain with 20,000 to 30,000.
  • the heavy chain is usually composed of a polypeptide chain containing about 440 amino acids, has a characteristic structure for each class, and corresponds to IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ . It is called a chain.
  • IgG includes IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, which are called ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, and ⁇ 4, respectively.
  • the light chain is usually composed of a polypeptide chain containing about 220 amino acids, and two types of L-type and K-type are known and are called ⁇ and ⁇ chains, respectively.
  • the peptide structure of the basic structure of an antibody molecule has a molecular weight of 150,000 to 190,000, in which two heavy chains and two light chains that are homologous are linked by a disulfide bond (SS bond) and a non-covalent bond, respectively. .
  • the two light chains can be paired with any heavy chain.
  • Each antibody molecule always consists of two identical light chains and two identical heavy chains.
  • the region between the C H 1 domain and C H 2 domain of the heavy chain constant region of an antibody is called the hinge region, and this region contains a number of proline residues and a plurality of chains connecting two heavy chains. Includes inter-SS bond.
  • each of the human IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 hinge regions has two, four, eleven, and two cysteine residues that constitute SS bonds between heavy chains, respectively.
  • the hinge region is a region that is highly sensitive to proteolytic enzymes such as papain and pepsin.
  • the F (ab ′) 2 fragment is a dimeric fragment in which two Fab ′ fragments are joined by an inter-heavy chain SS bond in the hinge region.
  • the Fab ′ fragment is composed of a heavy chain fragment comprising a light chain, a heavy chain variable region (V H ), a C H 1 domain, and a part of the hinge region. The cysteine residues that made up the S bond are included.
  • the Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, and Fab ′ fragment all contain a variable region and have antigen binding activity.
  • the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention that has been successfully produced by the present inventors is a Fab ′ fragment having the following characteristics.
  • An anti-human NGF antibody Fab ′ fragment comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the present inventors have produced antibodies using human monoclonal antibody development technology “Velosimune antibody technology; Regeneron (US Pat. No. 6,596,541)” mice, and conducted various biological activity tests and physical properties.
  • the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention was successfully identified by screening the antibody using the test.
  • Verosimune technology a mouse that expresses an antibody after immunization of a transgenic mouse in which the variable regions of endogenous immunoglobulin heavy and light chains are replaced with the corresponding human variable regions, for example, human ⁇ NGF
  • the hybridoma is prepared by obtaining the lymphoid cells and fusing with mouse myeloma cells.
  • the hybridoma cells are then screened for specific binding to the antigen of interest and production of antibodies having the desired neutralizing activity.
  • the antibody produced here is an antibody having a variable region of a human antibody and a constant region of a mouse antibody (also referred to herein as a chimeric antibody). Then, when an antibody that specifically binds to the antigen of interest and has a desired neutralizing activity is identified, DNA encoding the variable regions of the heavy and light chains of the antibody is isolated from the hybridoma cell, and the DNA Is linked to DNA encoding the constant regions of the desired class of human antibody heavy and light chains. The genes encoding the heavy and light chains thus obtained are expressed intracellularly (eg, CHO cells) to produce antibody molecules.
  • the heavy and light chains of the antibody produced by this method are the heavy and light chains of “fully human” antibodies derived from human immunoglobulin genes.
  • the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention can be obtained by a person skilled in the art using methods known in the art based on the sequence information of the heavy chain variable region and the light chain variable region disclosed herein. Can be easily produced.
  • the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region of a portion of a heavy chain constant region of a human antibody (C H 1 domain and a hinge region comprising a hinge region cysteine). And a light chain constant region, respectively, to produce a fully human antibody Fab ′ fragment.
  • the heavy chain variable region gene fragment having a base sequence encoding the heavy chain variable region amino acid (SEQ ID NO: 6) of the Fab ′ fragment of the present invention, and the light chain variable region amino acid of the Fab ′ fragment of the present invention ( A light chain variable region gene fragment having a base sequence encoding SEQ ID NO: 4) is prepared. Then, the heavy chain and light chain variable region genes are linked to the appropriate classes of heavy chain constant region and light chain constant region genes of a human antibody to produce a fully human antibody Fab ′ fragment gene. . This gene is then ligated to an appropriate expression vector and introduced into cultured cells. Finally, the cultured cells can be cultured to obtain a monoclonal Fab ′ fragment from the culture supernatant.
  • variable region gene fragment and the human antibody constant region gene are ligated to produce a fully human antibody Fab 'fragment gene.
  • the constant region of a human antibody can be selected from any subclass constant region (eg, ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3 or ⁇ 4 as the heavy chain, ⁇ or ⁇ chain constant region as the light chain), but preferably the heavy region.
  • Human Ig ⁇ 1 can be used as the chain constant region, and human Ig ⁇ can be used as the light chain constant region.
  • cultured cells into which the expression vector is introduced for example, cultured cells such as CHO-K1SV cells, CHO-DG44 cells, and 293 cells can be used, and these can be cultured by a conventional method.
  • the Fab ′ fragment of the present invention can be prepared using the recombinant expression method as described above, but once prepared as a full-length antibody, digested with pepsin and the resulting F (ab ′) 2 fragment
  • a Fab ′ fragment may be prepared by treatment with a reducing agent such as 2-mercaptoethanol.
  • the cultured cells are cultured, and the Fab ′ fragment can be easily obtained by purifying the Fab ′ fragment from the obtained culture.
  • the DNA containing the base sequence encoding the heavy chain variable region amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the DNA containing the base sequence encoding the light chain variable region amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the “Fab ′ fragment” is a monovalent composed of a heavy chain fragment comprising a light chain, a heavy chain variable region (V H ), a C H 1 domain and a part of the hinge region.
  • This hinge region includes at least one cysteine residue (in the present specification, “hinge” other than the cysteine residue constituting the SS bond between the heavy chain and the light chain). Also referred to as “region cysteine”).
  • the hinge region cysteine can be used as a modification site with polyethylene glycol described below.
  • the number of hinge region cysteines in the Fab ′ fragment can vary between one and several depending on the class of antibody used, but can be readily adjusted by one skilled in the art.
  • Fab ′ fragment of the human IgG1 class (usually having two hinge region cysteines in the hinge region)
  • the coding region of the first hinge region cysteine and the second in the heavy chain hinge region By inserting a stop codon between the coding region of the hinge region cysteine, a Fab ′ fragment having one hinge region cysteine in the hinge region can be produced. By subsequently inserting a stop codon, a Fab ′ fragment having two hinge region cysteines in the hinge region can be generated.
  • a preferred anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is described in the Examples below.
  • fully human 1-15 (N52D) antibody Fab ′ fragment A preferred anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is described in the Examples below.
  • fully human type 1-15 (N52D-A) antibody Fab ′ fragment is described in the Examples below.
  • a preferred anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention comprising a heavy chain fragment consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is described in the Examples below.
  • the present invention relates to CDR1 consisting of the 31st to 35th amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, CDR2 consisting of the 50th to 65th amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and CDR3 consisting of the 98th to 110th amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • a heavy chain variable region comprising: CDR1 consisting of the 24th to 39th amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, CDR2 consisting of the 55th to 61st amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and 94th to 102nd amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • anti-human NGF antibody Fab ′ fragments comprising a light chain variable region comprising CDR3. Such Fab'fragments can also be readily generated by those skilled in the art according to procedures as described above.
  • the anti-human NGF antibody Fab 'fragment of the present invention may be modified by binding polyethylene glycol (PEG) via its hinge region cysteine. Conjugation of PEG to the Fab 'fragment can be performed using methods known in the art (eg, European Patent EP 0 948 544).
  • PEG polyethylene glycol
  • linear or branched PEG having an arbitrary average molecular weight or a derivative thereof can be used, and can be easily selected by those skilled in the art depending on the purpose of use. For example, at the time of tumor tissue or inflammatory reaction, vascular permeability is remarkably enhanced as compared with normal tissue, and the reached substance tends to leak out of the blood vessel and accumulate in the tumor or inflammatory tissue (EPR effect) .
  • the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention includes Fab ′ fragments that bind to NGF derived from other animals (for example, mouse NGF) in addition to human NGF, and have binding activity to these proteins. You may measure.
  • the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention has neutralizing activity against human NGF.
  • neutralizing activity of an anti-human NGF antibody Fab ′ fragment means an activity that inhibits any biological activity mediated by NGF upon binding to NGF, One or more biological activities can be assessed as an indicator. Examples of such neutralizing activity include binding inhibitory activity between NGF and its receptor trkA, NGF-trkA signal-mediated intracellular calcium influx inhibitory activity, NGF-dependent cell survival signal inhibitory activity, Evaluation can be performed by using a method as described in Examples below.
  • In vivo tests can be used to evaluate the effects of the anti-human NGF antibody Fab 'fragment of the present invention in more detail. For example, as described in Examples below, it is possible to evaluate the in vivo drug efficacy of the Fab ′ fragment using an analgesic effect test using a mouse arthritis model, and using a lesion migration test, The lesion tissue retention effect can also be evaluated.
  • the side effect risk may be evaluated for the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention.
  • the possibility of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention affecting the fetus by using a placental passage test after administration of the Fab ′ fragment in pregnant animals is used. Can be evaluated.
  • the size of IC formed between the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention and NGF is measured using an immune complex (IC) formation test with NGF. The possibility of inducing thrombus formation can be evaluated.
  • the present invention also provides a polynucleotide comprising a sequence encoding the anti-human NGF antibody Fab 'fragment of the present invention and an expression vector comprising the same.
  • the present invention also includes a polynucleotide comprising a sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention, and a sequence encoding the light chain variable region of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention.
  • Polynucleotides comprising, as well as expression vectors comprising either or both of them are provided.
  • the expression vector of the present invention expresses a gene encoding the Fab ′ fragment of the present invention or its heavy chain variable region and / or light chain variable region in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells.
  • the polypeptide can be produced.
  • a plasmid vector, a viral vector (for example, adenovirus, retrovirus) and the like can be mentioned.
  • the expression vector of the present invention comprises a polynucleotide comprising a heavy chain fragment of the Fab ′ fragment of the present invention or a sequence encoding the light chain, or encodes a heavy chain fragment of the Fab ′ fragment of the present invention.
  • a polynucleotide comprising a sequence encoding the light chain of the Fab ′ fragment of the present invention.
  • promoters for expression in yeast include PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, and ADH promoter.
  • promoters for expression in Bacillus include SL01 promoter, SP02 promoter, and penP promoter.
  • examples include SV40-derived promoters, retroviral promoters, heat shock promoters, and the like.
  • the expression vector of the present invention may further contain a start codon, a stop codon, a terminator region, and a replicable unit.
  • yeast, animal cells or insect cells are used as the host, the expression vector of the present invention may contain a start codon and a stop codon.
  • the enhancer sequence, the 5 ′ and 3 ′ untranslated regions of the gene encoding the Fab ′ fragment of the present invention or its heavy chain variable region or light chain variable region, secretory signal sequence, splicing junction It may contain a polyadenylation site or a replicable unit. Further, it may contain a selection marker (for example, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, neomycin resistance gene, dihydrofolate reductase gene) that is usually used depending on the purpose.
  • a selection marker for example, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, neomycin resistance gene, dihydrofolate reduc
  • the present invention also introduces a gene encoding the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention or a gene encoding the heavy chain variable region and / or light chain variable region of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention.
  • a transformant is provided. Such a transformant can be produced, for example, by transforming a host cell with the expression vector of the present invention.
  • the host cell used for the preparation of the transformant is not particularly limited as long as it is compatible with the above expression vector and can be transformed. Natural cells or artificially used usually in the technical field of the present invention can be used.
  • Examples include various cells such as established cells (for example, bacteria (Escherichia, Bacillus), yeasts (Saccharomyces, Pichia, etc.), animal cells, insect cells (eg, Sf9), etc.). Transformation can be performed by a method known per se.
  • established cells for example, bacteria (Escherichia, Bacillus), yeasts (Saccharomyces, Pichia, etc.), animal cells, insect cells (eg, Sf9), etc.
  • Transformation can be performed by a method known per se.
  • the transformant of the present invention comprises a polynucleotide comprising a sequence encoding the heavy chain variable region of the Fab ′ fragment of the present invention and a polynucleotide comprising a sequence encoding the light chain variable region of the Fab ′ fragment.
  • An expression vector comprising a polynucleotide comprising a sequence encoding a heavy chain variable region of the Fab ′ fragment of the present invention and a light chain variable region of the Fab ′ fragment.
  • the transformant of the present invention comprises a polynucleotide comprising a sequence encoding the heavy chain fragment of the aforementioned Fab ′ fragment of the present invention and a polynucleotide comprising a sequence encoding the light chain of the Fab ′ fragment.
  • An expression vector comprising a polynucleotide comprising a sequence encoding a heavy chain fragment of the aforementioned Fab ′ fragment of the present invention, and a light chain of the Fab ′ fragment.
  • the present invention also provides a host cell with a gene encoding the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention or a gene encoding the heavy chain variable region and / or light chain variable region of the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention.
  • a method for producing the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention which comprises expression, that is, using such a transformant.
  • the host cell used in the method is a host cell transformed with the aforementioned expression vector of the present invention, and a polynucleotide comprising a sequence encoding the heavy chain variable region of the Fab ′ fragment of the present invention; Polynucleotides comprising sequences encoding the light chain variable region of the Fab ′ fragment may be included separately or simultaneously.
  • nutrients eg, inorganic salts (eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride), vitamins, antibiotics (eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.) are included. Also good.
  • inorganic salts eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride
  • antibiotics eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.
  • the culture of the transformant is performed by a method known per se.
  • the culture conditions such as temperature, pH of the medium and culture time are appropriately selected.
  • the medium includes MEM medium (Science, Vol. 122, p. 501, 1952) containing about 5-20% fetal bovine serum, DMEM medium (Virology, Vol. 8, p. 396, 1959), RPMI 1640 medium (J. Am. Med. Assoc., Vol. 199, p. 519, 1967), 199 medium (proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 73, p. 1). , 1950) or the like.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to 8, and the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 72 hours, and if necessary, aeration and agitation can be performed.
  • the host is an insect cell, for example, Grace's medium containing fetal bovine serum (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 8404, 1985) and the like can be mentioned. 8 is preferred.
  • the culture is usually carried out at about 20 to 40 ° C. for 15 to 100 hours, and if necessary, aeration or agitation can be performed.
  • a liquid medium containing the above nutrient source is appropriate.
  • a medium having a pH of 5 to 8 is preferable.
  • the host is E. coli.
  • preferable examples include LB medium, M9 medium (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 431, 1972) and the like.
  • the culture can be performed usually at 14 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours with aeration and agitation, if necessary.
  • the treatment can be performed usually at 30 to 40 ° C.
  • the medium include Burkholder minimum medium (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, p. 4505, 1980), and the pH is 5-8. Is desirable.
  • the culture is usually carried out at about 20 to 35 ° C. for about 14 to 144 hours, and if necessary, aeration or agitation can be performed.
  • the anti-human NGF antibody Fab ′ fragment of the present invention can be recovered, preferably isolated and purified from the transformant by culturing the transformant as described above.
  • isolation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, methods using differences in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. , Methods using charges such as ion exchange chromatography and hydroxylapatite chromatography, methods using specific affinity such as affinity chromatography, methods using hydrophobicity differences such as reverse phase high performance liquid chromatography, etc. Examples thereof include a method using the difference in isoelectric point such as electric point electrophoresis.
  • Example 1 Immunization to Velosymune mice
  • Antibodies against human NGF were obtained by immunizing Velosymune mice.
  • the present inventors examined a plurality of immunization methods, administration routes, adjuvants, immunization periods, and the like in order to increase the diversity of antibodies obtained.
  • an immunogen human ⁇ NGF (R & D System) was used, human ⁇ NGF was dissolved and mixed with an adjuvant, and then used for immunization. (10 minutes treatment) and then mixed with an adjuvant to examine the immunization method.
  • administration routes footpad administration and intraperitoneal administration were examined.
  • TiterMax Gold (CytRx Corporation), complete Freund's adjuvant (Sigma), incomplete Freund's adjuvant (Sigma), and RIBI adjuvant (Corixa Corporation) were examined. Furthermore, CpG oligonucleotide and Aluminum Phosphate Gel (BRENNTAG) were examined as an immunostimulant to be added. The immunization period was examined from 3 to 14 weeks. After several immunizations, blood was collected from the tail vein of the mouse and the titer was monitored to select a velocimun mouse that produces an antibody that binds to human NGF.
  • Example 2 Production of anti-human NGF antibody-producing hybridoma
  • Final immunization (intravenous or intraperitoneal administration of antigen) was performed on the mice selected after confirming the increase in antibody titer.
  • the spleen, lymph node, etc. of the immunized mouse were removed, lymphocytes were collected, and this was cell-fused with mouse myeloma cells SP2 / 0 to prepare a hybridoma.
  • the hybridoma was limited-diluted to form a single clone, and then the antibody was purified from the supernatant using a protein A or protein G column (GE Healthcare Japan).
  • Example 3 NGF-trkA binding inhibition evaluation
  • Human ⁇ NGF R & D System
  • EZ-LINK 5- (biotinamido) pentylamine PIERCE
  • Biotin-labeled human ⁇ NGF was obtained.
  • the produced biotin-labeled human ⁇ NGF was confirmed in Examples 6 and 7 below that the biological activity was equivalent to that of the original human ⁇ NGF.
  • Inhibitory activity was measured using the following method. 60 ng / well of human trkA (R & D Systems) was added to a white Maxisorp 384 plate (Nunc) and incubated overnight at 4 ° C. for immobilization. On the next day, the plate was washed once with a TBST washing solution, then a blocking agent (20% Blocking One (Nacalai Tesque) -containing TBST) was added, and the plate was allowed to stand at room temperature for 1 hour. Next, the biotin-labeled human ⁇ NGF (0.2 ⁇ g / ml) prepared above and the antibody obtained in Example 2 were added to the trkA solid phase plate after blocking.
  • the plate was washed 3 times with a TBST washing solution, and alkaline phosphatase-labeled streptavidin (PIERCE) was added. After incubating at room temperature for 1 hour, the plate was washed three times with a TBST washing solution, APU4 (BioFX) as a chemiluminescence detection reagent was added, and the chemiluminescence amount was measured with an EnVision counter (Perkin Elmer).
  • PIERCE alkaline phosphatase-labeled streptavidin
  • Example 4 Evaluation of species crossing property
  • an antibody has a cross-reactivity with mouse ⁇ NGF
  • Example 5 Evaluation of binding specificity
  • NT-3 which is a family molecule having the highest homology with NGF
  • 20 ng of human NT-3 (PeproTech) was added per well in the method of Example 1 and immobilized on a plate. And evaluated.
  • NGF-trkA signal inhibition evaluation The inhibitory activity of the antibody against the NGF-trkA signal was evaluated.
  • NGF causes an increase in intracellular calcium (Ca 2+ ) concentration through its receptor trkA.
  • Ca 2+ concentration change under the presence of calcium indicator, intracellular Ca 2+ concentration measurement system; can be evaluated and used (FLIPR Molecular Devices).
  • Inhibitory activity was measured using the following method.
  • HEK293 cells (WO2009 / 054468) stably expressing human trkA were transferred to a 96-well poly-D-lysine-coated plate (Nippon Becton Dickinson) at 2 ⁇ 10 4 cells / well on the day before the experiment. Dispensing and culturing overnight. The next day, the medium was replaced with a DMEM medium (containing 3.6 mM sodium hydroxide (NaOH) and 2.5 mM probenecid (Sigma)) containing calcium indicator (Fluo4-AM; Dojindo) and left at 37 ° C. for 30 minutes. did.
  • DMEM medium containing 3.6 mM sodium hydroxide (NaOH) and 2.5 mM probenecid (Sigma)
  • Ca indicator Fruo4-AM; Dojindo
  • HBSS Hanks Balanced Salt Solution
  • HEPES Hypothalamic Acid
  • 3.6 mM sodium hydroxide 2.5 mM probenecid (Sigma)
  • 0.1% bovine serum albumin 0.1% bovine serum albumin
  • the cell plate was set in the FLIPR.
  • 50 ⁇ l / well of the mixed solution of the antibody obtained in Example 2 and NGF was added (NGF final concentration 100 ng / ml), and the change in intracellular Ca 2+ concentration was measured. The difference between the maximum value and the minimum value of intracellular Ca 2+ concentration change was calculated and stored as measurement data.
  • Example 7 NGF-dependent cell survival signal inhibition evaluation
  • PC12 cells that naturally express trkA and p75 receptors are cultured in serum-free conditions, NGF can maintain cell survival for several days.
  • the following methods were used to evaluate the inhibitory activity of antibodies against NGF-dependent cell survival signals.
  • PC12 cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 cells per well in a 96-well collagen-coated plate (Asahi Techno), and F12K medium (Invitrogen) containing 2.5% fetal bovine serum and 15% horse-inactivated serum (Invitrogen) was used. And overnight at 37 ° C., 5% CO 2 . The next day, the medium was replaced with serum-free conditions of F12K only. After 1 hour, antibody and human ⁇ NGF (final concentration 50 ng / ml) were added and cultured for 72 hours. Thereafter, the culture broth was removed with an aspirator, and the cell viability was measured with a cell endogenous ATP quantitative reagent (CellTiter Glo; Promega).
  • F12K medium Invitrogen
  • Human ⁇ NGF final concentration 50 ng / ml
  • Example 8 Production of Fab fragment
  • a digestive enzyme papain-binding gel was added to 1 mg / ml of the antibody, followed by treatment at 37 ° C. for 3 hours.
  • the treated reaction solution was added to a protein G column (GE Healthcare Japan), and the cleaved Fc and unreacted IgG were adsorbed on the column to be removed, and an elution fraction was collected to obtain a Fab fragment. .
  • the obtained Fab fragments were evaluated in the tests described in Example 3, Example 6, and Example 7.
  • the antibody named 1-15 (chimeric antibody) has high neutralizing activity, species crossing property, and binding specificity, and is also high when it is a monovalent antibody fragment. It was confirmed that the neutralizing activity was retained.
  • Example 9 Determination of antibody gene sequence
  • the inventors cloned the genes encoding the heavy and light chains of the antibody from the hybridoma. Specifically, 1 ⁇ 10 5 or more hybridoma clones were prepared, suspended in the RLT buffer attached to RNeasy Mini Kit (QIAGEN), and then disrupted using QIAshredder (QIAGEN). Subsequently, RNA was extracted according to the protocol, and cDNA was synthesized using the extracted RNA as a template using a DNA amplification kit (SMARTer RACE cDNA Amplification kit; Clontech). A PCR reaction was performed using the obtained cDNA, and the heavy and light chain variable regions were extended and amplified.
  • SMARTer RACE cDNA Amplification kit Clontech
  • the PCR product was directly sequenced with a sequencer (ABI PRISM 3100; Applied Biosystems).
  • the PCR product was recombined into a PCR product subcloning vector such as pCR3.1-TOPO (Invitrogen), and then the gene sequence was analyzed and sequenced.
  • the determined nucleotide sequence of the heavy chain variable region of the 1-15 antibody is SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 2, the nucleotide sequence of the light chain variable region of the antibody is SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 4 respectively.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 of the heavy chain variable region of the 1-15 antibody are the 31st to 35th, 50th to 65th, and 95th to 102nd regions of the heavy chain variable region based on Kabat numbering, respectively. It consists of the 31st to 35th, 50th to 65th, and 98th to 110th amino acid sequences of SEQ ID NO: 2, respectively.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain variable region of the 1-15 antibody are the 24th to 34th, 50th to 56th, and 89th to 97th regions of the light chain variable region based on Kabat numbering, respectively.
  • Each consists of the amino acid sequences of 24th to 39th, 55th to 61st, and 94th to 102nd of SEQ ID NO: 4.
  • the heavy chain variable region amino acid (SEQ ID NO: 2) of the aforementioned 1-15 antibody contains the N-type sugar chain modification motif sequence of NX- (T / S). Specifically, the 52nd Asn (N52) based on Kabat numbering in the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 2 corresponds to the sugar chain modification site.
  • N52 52nd Asn
  • the present inventors produced 1-15 (N52D) in which a mutation was introduced into N52 in the heavy chain variable region of the 1-15 antibody.
  • the base sequence of the prepared heavy chain variable region of 1-15 (N52D) is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6, respectively.
  • the CDR1, CDR2, and CDR3 of the heavy chain variable region of the 1-15 (N52D) antibody are the 31st to 35th, 50th to 65th, and 95th to 102nd regions of the heavy chain variable region based on Kabat numbering, respectively. And consists of the 31st to 35th, 50th to 65th, and 98th to 110th amino acid sequences of SEQ ID NO: 6.
  • Example 11 Preparation of fully human antibody Fab ′ fragment
  • Each fully human antibody Fab ′ fragment was prepared using the heavy chain variable region of 1-15 and 1-15 (N52D) and the light chain variable region of 1-15 described above.
  • a signal sequence is connected to the 5 ′ side of the 1-15 light chain variable region gene and a human ⁇ chain constant region gene (Man Sung Co et al., Supra) is connected to the 3 ′ side. It was inserted into the GS vector pEE12.4 (Lonza Biologics).
  • the Fab ′ fragment was expressed by two methods, transient expression and constant expression.
  • transient expression the above-mentioned heavy chain fragment and light chain GS vector were used in 293 fectin for FreeStyle 293 cells (Invitrogen) cultured at about 1 million cells / mL in FreeStyle 293 Expression medium (Invitrogen). (Invitrogen) and transfected for 7 days.
  • both GS vectors described above were cleaved with NotI and PvuI, ligated using a DNA ligation kit (Takara Bio Inc.), and inserted into both heavy chain and light chain genes.
  • a vector was constructed.
  • This expression vector encodes a heavy chain fragment and a light chain and glutamine synthetase, and was expressed by transfection into CHO-K1SV cells. After expression by each method, the culture supernatant was purified using KappaSelect (GE Healthcare Japan) to obtain each Fab 'fragment.
  • the base sequence of the heavy chain fragment of the prepared fully human 1-15 antibody Fab ′ fragment (also referred to as 1-15-Fab ′) is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8, respectively.
  • the base sequence of the heavy chain fragment of the prepared fully human 1-15 (N52D) antibody Fab ′ fragment (also referred to as 1-15 (N52D) -Fab ′) is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 10, respectively. .
  • each Fab 'fragment is common, the base sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 12.
  • Example 12 Neutralization activity and expression level evaluation of fully human antibody Fab ′ fragment
  • 1-15-Fab ′ and 1-15 (N52D) -Fab ′ obtained in Example 11 were evaluated by the tests described in Example 3 and Example 6.
  • the IC50s of 1-15-Fab ′ and 1-15 (N52D) -Fab ′ were 0.17 ⁇ g / ml and 0.18 ⁇ g / ml, respectively.
  • the IC50s of 1-15-Fab ′ and 1-15 (N52D) -Fab ′ were 0.021 ⁇ g / ml and 0.018 ⁇ g / ml, respectively. From these results, 1-15 (N52D) -Fab ′ has the same neutralizing activity as that of 1-15-Fab ′ before modification, and the introduction of mutations does not affect the neutralizing activity. Was confirmed.
  • each Fab 'fragment was constitutively expressed, and the amount of antibody produced in the supernatant of the stable expression cell pool culture was measured.
  • concentrations of 1-15-Fab ′ and 1-15 (N52D) -Fab ′ in each culture supernatant were 86 mg / L and 106 mg / L, respectively, and 1-15 (N52D) -Fab ′ was It was shown that the antibody was produced in an amount higher than that of 1-15-Fab ′ before modification.
  • Example 13 Preparation of PEGylated Fab ′ fragment and evaluation of neutralizing activity
  • the present inventors introduced PEG into the aforementioned 1-15 (N52D) -Fab ′.
  • the Fab ′ fragment was reduced to a PEGable structure by reducing with TCEP hydrochloride (Tris (2-carboxyethyl) phosphine HCl).
  • TCEP was added so that it might become 1 mM to the Fab 'fragment solution adjusted to 1.2 mg / ml with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8), and it was made to react at 37 degreeC for 2 hours. After that, it was diluted with 20 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) to adjust the pH. This was adsorbed on a cation exchange resin (SP-5PW; manufactured by Tosoh Corporation) and eluted with a NaCl gradient to recover the main peak. The obtained Fab ′ fragment was diluted with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) to 1 mg / ml, adjusted to pH 6.8, and allowed to stand overnight at 4 ° C.
  • SP-5PW cation exchange resin
  • the neutralizing activity of the PEGylated 1-15 (N52D) -Fab ′ before and after PEGylation was evaluated by the method shown in Example 3.
  • the IC50 of 1-15 (N52D) -Fab ′ was 0.15 ⁇ g / ml
  • the IC50 of 1-15 (N52D) -Fab′-PEG was 0.12 ⁇ g / ml (Fab ′ fragment). It was confirmed that 1-15 (N52D) -Fab ′ was not affected by neutralization activity even by addition of PEG.
  • the neutralizing activities of 1-15 (N52D) -Fab′-PEG and the preceding anti-human NGF antibody Tanezumab against human and mouse NGF were compared.
  • the IC50 of 1-15 (N52D) -Fab′-PEG was 0.051 ⁇ g / ml for human NGF and 0.069 ⁇ g / ml for mouse NGF
  • the IC50 for Tanezumab was , 0.17 ⁇ g / ml for human NGF, 0.23 ⁇ g / ml for mouse NGF
  • 1-15 (N52D) -Fab′-PEG for both human and mouse NGF It was confirmed to have neutralization activity about 3.3 times stronger than tanezumab.
  • Example 14 Analgesic effect test using mouse adjuvant-induced arthritis model
  • the present inventors evaluated the analgesic effect of the aforementioned 1-15 (N52D) -Fab′-PEG on a mouse adjuvant-induced arthritis model.
  • Example 15 Rat placenta passage test
  • 1-15 (N52D) -Fab′-PEG or Tanezumab is administered intravenously (100 mg / kg, dose volume 10 mL / kg) in maternal and fetal blood after 3 days.
  • Antibody concentration was measured.
  • Antibody concentration was measured as follows. To the MULTI-ARRAY Plate (Standard) 96 plate (Meso Scale Discovery), 25 ng of human ⁇ NGF (R & D Systems) was added per well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour to be solid-phased. After the plate was washed 3 times with TBST washing solution, a blocking agent (1% casein TBS; Thermo Fisher) was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Next, a blood sample obtained by diluting blood collected over time was added to the human ⁇ NGF solid phase plate after blocking.
  • a blocking agent 1% casein TBS; Thermo Fisher
  • the plate After reacting for 60 minutes with stirring at room temperature, the plate was washed three times with a TBST washing solution, and a biotin-labeled anti-human kappa antibody (Immuno-Biological Laboratories) was added. After reacting for 60 minutes with stirring at room temperature, it was washed 3 times with TBST washing solution, and SULFO-TAG labeled streptavidin (Meso Scale Discovery) was added. After reacting for 60 minutes with stirring at room temperature, the plate was washed 3 times with TBST washing solution, Read Buffer T (Meso Scale Discovery) was added, and the amount of electrochemiluminescence was measured with SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery). .
  • the antibody concentrations of 1-15 (N52D) -Fab′-PEG and Tanezumab in the rat maternal blood after 3 days averaged 12.1 ⁇ g / ml and 7.1 ⁇ g, respectively. / Ml.
  • the blood concentration of 1-15 (N52D) -Fab′-PEG was the limit of quantification in all cases. Whereas it was 0.01 ⁇ g / ml or less, the blood concentration of Tanezumab averaged 5.39 ⁇ g / ml.
  • the fetal migration rate of Tanezumab was 75.9%, while the fetal migration rate of 1-15 (N52D) -Fab'-PEG was a migration rate of 0.08% or less of the detection limit.
  • 1-15 (N52D) -Fab′-PEG is an excellent drug that avoids the risk of side effects due to NGF inhibition in the fetus and is excellent in safety.
  • Example 16 Formation of immune complex (IC)
  • 1-15 (N52D) -Fab′-PEG forms an IC or the size of the formed IC.
  • 1-15 (N52D) -Fab′-PEG 1 mg / ml and human ⁇ NGF (R & D Systems) were mixed at a molar ratio of 1: 1, and incubated at room temperature for 3 hours.
  • An IC was formed.
  • the particle size and distribution of IC were measured for this reaction solution using an instrument Zetasizer Nano (Malvern) for measuring dynamic light scattering.
  • Zetasizar v6.01 Zetasizar v6.01 (Malvern) was used, and the particle size was shown as a value (d. Nm) analyzed by Intensity (%).
  • the measured particle sizes are shown in Table 1 below.
  • the average particle size of NGF alone was 6.2 nm.
  • Tanezumab alone a peak diameter appeared at 11.7 nm.
  • the peak diameter was shifted to 91.3 nm.
  • an antibody that does not bind to NGF was used as a control antibody, the peak diameter remained at 11.7 nm.
  • Tanezumab and NGF each became a large molecule in which a plurality of molecules were combined to form a large-sized IC.
  • Example 17 Focal tissue migration
  • a 1 1 emulsion of collagen (bovine joint-derived type 2 collagen, 10 mg / mL; collagen technical workshop) and complete Freund's adjuvant (0.5 mg / mL; DIFCO) was subcutaneously administered to the male DBA / 1 mouse ankle joint.
  • a collagen-induced arthritis model was prepared. Four weeks after the induction, the emulsion was administered again to develop arthritis. The degree of onset of hind limb arthritis (score and magnitude of swelling) was observed, and mice were divided into groups.
  • Fig. 1 shows the change over time in the amount of antibody retention in the sole of the foot.
  • 1-15 (N52D) -Fab'-PEG showed a clear lesion tissue retention effect compared to Tanezumab, which lasted up to 48 hours. From these results, it is considered that 1-15 (N52D) -Fab′-PEG exhibits an effective analgesic effect, and it can be expected to be effective at a dose lower than the drug efficacy strength. It can be expected to be a drug with excellent safety.
  • Example 18 Preparation of amino acid adduct of Fab ′ fragment
  • A alanine
  • P proline
  • Fab ′ fragments with were prepared, expressed and purified.
  • a method similar to that of Example 11 was used, in which two alanines after the codon of the carboxyl-terminal Cys residue of the heavy chain fragment of 1-15 (N52D) -Fab ′.
  • a proline codon was inserted, followed by a stop codon.
  • Nucleotide sequence of heavy chain fragment of 1-15 (N52D) -Fab ′ (fully human type 1-15 (N52D-A) antibody Fab ′ fragment; also referred to as 1-15 (N52D-A) -Fab ′) with alanine added Is shown in SEQ ID NO: 13, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14, respectively.
  • Nucleotide sequence of heavy chain fragment of proline-added 1-15 (N52D) -Fab ′ (fully human 1-15 (N52D-P) antibody Fab ′ fragment; also referred to as 1-15 (N52D-P) -Fab ′) Is shown in SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16, respectively.
  • the light chain of each Fab 'fragment is the same as the light chain of 1-15 (N52D) -Fab', the base sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 12.
  • Example 19 Preparation of PEGylated 1-15 (N52D-A) -Fab ′ and neutralizing activity and pharmacological evaluation
  • 1-15 (N52D-A) -Fab ′ was PEGylated 1-15 (N52D-A) -Fab ′ (hereinafter referred to as 1- (N52D-A) -Fab ′) by coupling 40 kDa PEG using the same method as in Example 13.
  • 15 (N52D-A) -Fab′-PEG was PEGylated 1-15 (N52D-A) -Fab ′ (hereinafter referred to as 1- (N52D-A) -Fab ′) by coupling 40 kDa PEG using the same method as in Example 13. 15 (N52D-A) -Fab′-PEG).
  • the neutralizing activity of 1-15 (N52D-A) -Fab′-PEG was evaluated using the method shown in Example 3. As a result, the IC50 of 1-15 (N52D) -Fab′-PEG was 0.081 ⁇ 0.034 ⁇ g / ml, whereas the IC50 of 1-15 (N52D-A) -Fab′-PEG was 0. 0.04 ⁇ 0.021 ⁇ g / ml. At this time, the IC50 of Tanezumab was 0.410 ⁇ 0.099 ⁇ g / ml.
  • Example 14 the analgesic effect in the adjuvant-induced arthritis model was evaluated using the method shown in Example 14.
  • Example 20 Evaluation of binding affinity of 1-15 (N52D-A) -Fab′-PEG
  • ITC isothermal titration calorimetry
  • the Kd value of Tanezumab was 20.41 nM, whereas the Kd value of 1-15 (N52D-A) -Fab′-PEG was 1.49 nM, and 1-15 (N52D-A) —
  • the binding affinity of Fab′-PEG was more than 10 times stronger than that of Tanezumab.
  • Example 21 Production of PEGylated 1-15 (N52D-A) -Fab ′ of various PEG sizes and evaluation of neutralizing activity
  • 5 kDa PEG or 10 kDa PEG was coupled to 1-15 (N52D-A) -Fab ′ prepared in Example 18 using the same procedure as in Example 13.
  • the Fab ′ fragment solution prepared with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) was reduced with TCEP, and then the Fab ′ fragment was recovered using a desalting column.
  • PEG SUNBRIGHT GL2-50MA or SUNBRIGHT GL2-100MA; both were NOF CORRATION
  • Example 6 the neutralization activity of each PEGylated Fab 'fragment was compared.
  • 1-15 (N52D-A) -Fab′-PEG prepared in Example 19 (40 kDa PEG bound; hereinafter also referred to as 1-15 (N52D-A) -Fab′-40kPEG) was used.
  • the final NGF concentration was 50 ng / ml.
  • the IC50s of 1-15 (N52D-A) -Fab′-5kPEG, 1-15 (N52D-A) -Fab′-10kPEG, and 1-15 (N52D-A) -Fab′-40kPEG are respectively 0.030 ⁇ g / ml, 0.028 ⁇ g / ml, and 0.023 ⁇ g / ml. From this result, it was found that the PEG size does not affect the neutralization activity of the Fab 'fragment at a size of 5 kDa to 40 kDa.
  • Example 22 Mouse PK evaluation of PEGylated 1-15 (N52D-A) -Fab ′ of various PEG sizes)
  • Mouse PK evaluation of various PEGylated 1-15 (N52D-A) -Fab ′s was performed. Specifically, 0.3 mg / kg of various PEGylated 1-15 (N52D-A) -Fab ′ were administered intravenously, and 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, And blood was collected every 168 hours. The amount of test antibody in the obtained blood was measured using a sandwich ELISA method. Specifically, the test antibody was added to an MSD plate on which NGF had been immobilized (manufactured by Meso Scale Discovery).
  • T1 / 2 T1 / 2 of 1-15 (N52D-A) -Fab′-5kPEG, 1-15 (N52D-A) -Fab′-10kPEG, and 1-15 (N52D-A) -Fab′-40kPEG is 13.8 ⁇ 2.2 hours, 17.7 ⁇ 0.4 hours, and 39.2 ⁇ 3.7 hours, respectively.
  • Example 23 Analgesic effect test using rat sole incision model
  • rat post foot incision pain model (Brennan et al. Current Protocols in Pharmacology 2004; 5.34.1-5.34.8) that reflects postoperative pain in the clinic
  • 1-15 (N52D- The analgesic effect of A) -Fab′-5kPEG and 1-15 (N52D-A) -Fab′-10kPEG on postoperative pain was evaluated.
  • each group consists of 8 animals, and 1-15 (N52D-A) -Fab′-5kPEG or -10kPEG is administered intravenously to rats (0.1 mg / kg, 0.3 mg / kg, 1 mg / kg).
  • the administration volume was 1 mL / kg)
  • the right hind foot sole was incised linearly in the direction of 10 mm from the tip of the heel to the tip of the 10 mm toe and immediately stitched with two nylon mattresses to induce pain. Pain thresholds near the surgical site were measured 5 days after challenge, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, and 5 days.
  • the measurement was performed using a Dynamic plant anesthesiometer manufactured by Ugo Basile Co., Ltd., and a pressure indicating escape behavior against pressurization on the sole of the rat was measured.
  • a comparative control the preceding antibody Tanezumab was used.
  • Example 24 Evaluation of aggregation stability
  • 1-15 (N52D-A) -Fab′-40kPEG was dissolved at 1 mg / ml and 10 mg / ml at pH 5, pH 6, pH 7.4, and pH 9, respectively. Each of these was placed under the condition of 50 ° C., and the aggregation stability after 2 weeks was evaluated.
  • the aggregation property was evaluated by size exclusion chromatography and measured using Agilent 1100. As the measurement conditions, 0.1 M sodium phosphate (containing 0.2 M arginine) (pH 6.8) was used as a mobile phase buffer, and TSK gel Super Sw3000 (TOSOH, 2.0 mm ID ⁇ 300 mm) was used as a column. The detection wavelength was 280 nm.
  • the anti-human NGF antibody of the present invention is useful for the prevention or treatment of various diseases in which human NGF is involved in pathogenesis.

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Abstract

【課題】　高い中和活性を保持しつつ、胎児への影響や血栓形成などの副作用リスクを低減した、安全性に優れた抗ヒトＮＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメント、並びに、該抗体またはその抗原結合フラグメントを用いた、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防または治療手段の提供。 【解決手段】　配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメント。

Description

新規抗ヒトＮＧＦ抗体
　本発明は、新規な抗ヒトＮＧＦ抗体、より具体的には、抗ヒトＮＧＦ抗体のＦａｂ’フラグメントに関する。
　神経成長因子（ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）は、神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）と総称される液性因子の一つであり、生体内においてニューロンの発生、分化、機能維持において重要な役割を担っている。ＮＧＦの受容体としては、高親和性のｔｒｋＡ受容体（受容体型チロシンキナーゼ）と低親和性のｐ７５ＮＴＲ受容体が知られている。このうちｐ７５ＮＴＲは全ての神経栄養因子と結合し、ニューロンの発生過程においてアポトーシスに関与していることが報告されているが、その役割は未だ十分に解明されていない。一方、ＮＧＦとｔｒｋＡ受容体のノックアウトマウスは同様のフェノタイプを示すことが知られており（非特許文献１）、ＮＧＦの生理作用は主にｔｒｋＡ受容体を介して発現すると考えられている。
　１９９３年にラットへのＮＧＦの投与により痛みが誘発されることが報告され（非特許文献２）、その後、ヒトへのＮＧＦの静脈内投与により全身性の筋肉痛を生じること、また局所投与により全身的な効果に加え、注射部位の痛覚過敏及び異痛症を誘発することが報告されている（非特許文献３）。さらに、ｔｒｋＡ受容体のノックアウトマウスで痛覚が欠如することが報告され（非特許文献４）、ＮＧＦは痛みの発現に強く関わる分子であると考えられている。ヒト疼痛病態との関連性については、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＯＡ）の関節軟骨でＮＧＦ／ｔｒｋＡの発現が亢進していることや（非特許文献６）、リウマチ性関節炎（非特許文献７）や間質性膀胱炎（非特許文献８）の患者でＮＧＦレベルの上昇が実証されている。
　これらのことから、ＮＧＦに特異的に結合し、その作用を阻害する活性を有するモノクローナル抗体を開発することができれば、疼痛をはじめとする、ＮＧＦに関連する各種疾患の治療、予防、診断に有用であることが期待される。
　現在までに臨床開発が進められているヒトＮＧＦに対する抗体としては、ヒト化抗ヒトＮＧＦ抗体であるＴａｎｅｚｕｍａｂ（特許文献１）及びＰＧ１１０（特許文献２）、完全ヒト型抗ヒトＮＧＦ抗体であるＲＥＧＮ４７５（特許文献３）、Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ（特許文献４）、及びＭＥＤＩ－５７８（特許文献５）が報告されている。その中でもＴａｎｅｚｕｍａｂは最も開発が先行しており、その臨床結果から、変形性関節症に伴う関節痛、慢性腰痛、間質性膀胱炎に伴う膀胱痛などの疼痛に対して、強力で幅広い鎮痛効果を示すことが報告されている（非特許文献９～１１）。
　一般に、抗体医薬の有効投与量を規定する主な要因としては、抗体が有する抗原に対する中和活性や、体内に存在する抗原の量が挙げられるが、中和活性を向上させることは投与量の低減に繋がり、結果として患者の経済的な負担や医療コストの低減にも繋がる極めて有益な改良であると言える。また、投与量の低減が実現できれば、皮下投与を行うことも可能となる。皮下投与は、一定の条件を満たせば在宅で自己注射できる最大のメリットを有し、また、一般に静脈内投与では多くの場合、一定時間をかけて点滴投与されるのに対して、皮下投与ではボーラスで投与できる点も有用であり、医師と患者双方にとって静脈内投与製剤と皮下投与製剤を選択できることは望ましいことである。しかし、一般に、皮下投与では１回に投与できる容量が１ｍＬ程度と少量であり、この液量中に薬効を発現するのに十分な抗体が含まれる必要がある。また、静脈内投与とは異なり、バイオアベイラビリティも考慮しなければならない。すなわち、皮下投与の製剤を実現するためには、溶解性に優れ、かつ低用量でも十分な薬効を発現する抗体を作製することが求められる。従って、従来の抗体よりもＮＧＦに対する中和活性がより高い抗体を取得することは、ＮＧＦに関連する疾患の治療およびその利便性向上に有用である。
　また、前述のように、ＮＧＦはニューロンの発達に重要な因子であるが、ＮＧＦの機能を阻害する医薬品の開発においては安全性の観点からも十分な検討が必要となる。特に、安全性に関して検討すべき事項の１つとして、胎児への影響が挙げられる。現在までに、ＮＧＦの機能阻害に関して、ＮＧＦ変異が先天性無痛症の原因であることや（非特許文献５）、動物実験において、妊娠モルモットにＮＧＦに対する自己抗体を産生させて生体内のＮＧＦを阻害すると、出産した新生仔モルモットが無痛症状を呈すること（非特許文献１２）が報告されている。また、ＮＧＦやｔｒｋＡの欠損マウスを用いた試験からも、ＮＧＦ作用の欠失により、胚の感覚神経及び交感神経のニューロンの発達が阻害されることが実証されており（非特許文献４及び１３）、これらのことからも、ＮＧＦが発生初期の神経発達に必須の因子であることが理解される。一方、ＮＧＦが関連する疾患には、間質性膀胱炎（患者の半数以上が４４歳以下であり、患者の９０％が女性（非特許文献１４））、慢性腰痛（平均年齢は４０～５０歳であり、患者の５０％強が女性（非特許文献１５～１７））、偏頭痛（１５～４０歳で好発し、患者の８０％が女性（非特許文献１８））など、妊娠適齢期の女性に高い割合で発生する疾患も含まれる。このような状況から、抗ＮＧＦ抗体を医薬品として開発する場合に、妊娠中の女性における胎児への副作用リスクを回避することが極めて重要となる。
　また、抗ＮＧＦ抗体を医薬品として開発する場合の別のリスク要因として、免疫複合体（ＩＣ）の形成が挙げられる。抗体と抗原が結合した免疫複合体は、通常、脾臓や肝臓などの網内系で処理されるが、免疫異常等の病態時や、形成されるＩＣサイズが大きい場合には、ＩＣが可溶性を失い、血栓形成のリスクが高まるほか、腎糸球体に蓄積し、腎炎の発症に関連すると言われている。ＩｇＧは２価抗体であるが、抗原が多価である場合、ＩＣは格子形成（ｌａｔｔｉｃｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により様々なサイズを取り得る。ＩＣのサイズは、抗体と抗原の量や比、抗体の親和性等に依存し、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（商品名：アバスチン）は、ＩｇＧ１抗体であり、これは、二量体のＶＥＧＦと結合してＩＣを形成し、血栓形成を誘発するとの報告がある。具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩα受容体ＴｇマウスにアバスチンとＶＥＧＦを投与すると肺動脈血栓が形成されることが観察されている（非特許文献１９）。さらに、化学療法とアバスチンの治療を受けた転移性癌の患者は、化学療法のみのプラセボ群と比べて動脈血栓の発生率が高いことが報告されている（非特許文献２０）。ＮＧＦも生体内では二量体を形成して生理作用を発揮することから、抗ＮＧＦ抗体の医薬品開発においても、ＩＣ形成のリスクを回避し、安全性をより高めることが望ましい。
　これらのことから、高い中和活性を保持しつつ、胎児への影響や血栓形成などの副作用リスクを低減した、安全性に優れた抗ＮＧＦ抗体を取得することが、ＮＧＦに関連する各種疾患の治療または予防において極めて重要である。
WO2004/058184 WO2005/061540 WO2009/023540 WO2005/019266 WO2006/077441
Conover JC, et al, Rev Neurosci. 1997, 8:13-27. Lewin GR, et al, J Neurosci. 1993, 13:2136-48. Petty BG, et al, Ann Neurol. 1994, 36:244-6. Smeyne RJ, et al, Nature. 1994, 368:246-9. Indo Y, et al, Nat Genet. 1996, 13:485-8. Iannone F, et al, Rheumatology 2002, 41:1413-8. Aloe L, et al, Clin Exp Rheumatol. 1997, 15:433-8. Lowe EM, et al, Br J Urol. 1997, 79:572-7. Lane NE, et al, N Engl J Med. 2010, 363:1521-31. Evans RJ, et al, J Urol. 2011, 185:1716-21. Katz N, et al, Pain. 2011, in press Johnson EM Jr, et al, Science. 1980, 210:916-8. Crowley C, et al, Cell. 1994, 76:1001-11. Payne CK, et al, J Urol. 2007, 177:2042-9. Manchikanti L, et al, Pain Physician. 2010, 13:E279-92. Wilkens P, et al, JAMA. 2010, 304:45-52. Buynak R, et al, Expert Opin Pharmacother. 2010, 11:1787-804. Sakai F, et al, Cephalalgia. 1997, 17:15-22. Meyer T, et al, J Thromb Haemost. 2009, 7:171-81. Scappaticci FA, et al, J Natl Cancer Inst. 2007, 99:1232-9.
　本発明の課題は、高い中和活性を保持しつつ、胎児への影響や血栓形成などの副作用リスクを低減した、安全性に優れた抗ヒトＮＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供することにある。
　本発明は、医学上又は産業上有用な物質・方法として以下の発明を含むものである。
［１］配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
［２］前記Ｆａｂ’フラグメントの重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域である、［１］のＦａｂ’フラグメント。
［３］前記Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、［１］のＦａｂ’フラグメント。
［４］前記Ｆａｂ’フラグメントの重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域であり、前記Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、［１］のＦａｂ’フラグメント。
［５］配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［１］のＦａｂ’フラグメント。
［６］ポリエチレングリコールを結合させた、［１］～［５］のいずれかのＦａｂ’フラグメント。
［７］［１］～［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［８］［１］～［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
［９］［７］及び／又は［８］のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１０］［９］の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［１１］以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、［１０］の宿主細胞。
（ａ）［１］～［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）［１］～［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。
［１２］［１０］又は［１１］の宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを発現させる工程を包含する、［１］～［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントを生産する方法。
［１３］［１］～［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントを含む、疼痛治療薬。
［１４］前記疼痛が変形性関節症に伴う関節痛である、［１３］の治療薬。
［１５］［１］～［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメントを投与する工程を包含する、疼痛を予防または処置するための方法。
［１６］前記疼痛が変形性関節症に伴う関節痛である、［１５］の方法。
［１７］疼痛の予防または処置に使用するための、［１］～［６］のいずれかのＦａｂ’フラグメント。
［１８］前記疼痛が変形性関節症に伴う関節痛である、［１７］のＦａｂ’フラグメント。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防または治療に有用である。このような本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、その高い中和活性により、投与量の低減、投与間隔の拡大、投与方法の改善（例えば、皮下注射剤）等の臨床適用における優れた改善をもたらすとともに、胎児への影響や血栓形成などの副作用リスクが低減された、安全性に非常に優れたものであり、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防や治療において大きく貢献するものである。
マウスコラーゲン誘発関節炎モデルの足底における抗体滞留量の経時的変化を示す。
　以下に、本発明について詳述する。
　本発明者らは、抗ヒトＮＧＦ抗体またはその抗原結合フラグメントの作製において相当の創意検討を重ねた結果、高い中和活性を保持しつつ、胎児への影響や血栓形成などの副作用リスクを低減した、安全性に優れた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを作製することに成功した。
　抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万～７万の重鎖と２～３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖および２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）および非共有結合によって結合され、分子量１５万～１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
　鎖内Ｓ－Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００～１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶH）および軽鎖可変領域（ＶL）とよばれている。これよりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、ＣH１、ＣH２、ＣH３あるいはＣLと表される。
　抗体の抗原決定部位はＶHおよびＶLによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。重鎖と軽鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
　抗体の重鎖定常領域のＣH１ドメインとＣH２ドメインとの間にある領域はヒンジ領域とよばれ、この領域は、プロリン残基を多く含み、２本の重鎖をつなぐ複数の鎖間Ｓ－Ｓ結合を含む。例えば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の各ヒンジ領域には、重鎖間のＳ－Ｓ結合を構成している、それぞれ、２個、４個、１１個、２個のシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、パパインやペプシン等のタンパク質分解酵素に対する感受性が高い領域である。抗体をパパインで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ－Ｓ結合よりもＮ末端側の位置で重鎖が切断され、２個のＦａｂフラグメントと１個のＦｃフラグメントに分解される。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶH）、ＣH１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される。抗体をペプシンで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ－Ｓ結合よりもＣ末端側の位置で重鎖が切断され、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントが生成される。Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ－Ｓ結合で結合した二量体構造のフラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶH）、ＣH１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成され、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ－Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントは、いずれも可変領域を含み、抗原結合活性を有する。
　本発明者らが作製に成功した本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、以下の特徴を有するＦａｂ’フラグメントである。
　配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
　具体的には、本発明者らは、ヒトモノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社（米国特許６５９６５４１号））マウスを用いて抗体を作製し、各種生物学的活性試験及び物性試験を用いた抗体のスクリーニングによって、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを同定することに成功した。ベロシミューン技術では、内因性の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域が対応するヒト可変領域で置換されたトランスジェニックマウスを目的の抗原（例えば、ヒトβＮＧＦ）で免疫した後、抗体を発現するマウスのリンパ系細胞を取得し、マウスミエローマ細胞と細胞融合することによってハイブリドーマを作製する。次いで、このハイブリドーマ細胞を、目的の抗原に特異的に結合し、所望の中和活性を有する抗体を産生するか否かについてスクリーニングする。ここで産生される抗体は、ヒト抗体の可変領域とマウス抗体の定常領域を有する抗体（本明細書中、キメラ抗体とも称する）である。次いで、目的の抗原に特異的に結合し、所望の中和活性を有する抗体が同定された場合、そのハイブリドーマ細胞から抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、そのＤＮＡを所望のクラスのヒト抗体重鎖及び軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡに連結する。このようにして得られた重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を細胞内（例えば、ＣＨＯ細胞）で発現させて、抗体分子を産生する。当該方法により作製された抗体の重鎖及び軽鎖は、ヒト免疫グロブリン遺伝子に由来する「完全ヒト型」抗体の重鎖及び軽鎖である。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、本願明細書に開示される、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。好ましくは、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をヒト抗体の重鎖定常領域の一部分（ＣH１ドメインと、ヒンジ領域システインを含むヒンジ領域の一部とを含む）及び軽鎖定常領域にそれぞれ連結して、完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメントとして作製することができる。具体的には、本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖可変領域アミノ酸（配列番号６）をコードする塩基配列を有する重鎖可変領域遺伝子断片、及び本発明のＦａｂ’フラグメントの軽鎖可変領域アミノ酸（配列番号４）をコードする塩基配列を有する軽鎖可変領域遺伝子断片を作製する。そして、この重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子をヒト抗体の適当なクラスの重鎖定常領域部分及び軽鎖定常領域の各遺伝子と連結させて、完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメントの遺伝子を作製する。次いで、この遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、培養細胞中に導入する。最後にこの培養細胞を培養して培養上清からモノクローナルＦａｂ’フラグメントを得ることができる。
　本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸をコードする遺伝子断片は、例えば、該重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
　次いで、上記の可変領域遺伝子断片とヒト抗体の定常領域遺伝子とを連結させて完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメント遺伝子を作製する。ヒト抗体の定常領域は、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖としてγ１、γ２、γ３またはγ４、軽鎖としてλまたはκ鎖の定常領域）も選択可能であり得るが、好ましくは重鎖定常領域としてはヒトＩｇγ１が、軽鎖定常領域としてはヒトＩｇκを用いることができる。
　この完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメント遺伝子の作製につづく、当該遺伝子の発現ベクターへの導入、発現ベクターの培養細胞への導入、培養細胞の培養、Ｆａｂ’フラグメントの精製等については、当該分野で公知の種々の方法を使用して行うことができる。
　上記のようにして得られた遺伝子と連結される発現ベクターとしては、例えば、ＧＳベクターｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）が挙げられるが、抗体遺伝子を発現することができるものであれば特に制限されない。また、ＡＧ－γ１やＡＧ－κ（例えば、ＷＯ９４／２０６３２を参照）等の予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を有するものを利用することもできる。
　上記の発現ベクターは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等により、培養細胞中に導入される。
　発現ベクターを導入する培養細胞としては、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、２９３細胞等の培養細胞が使用でき、これを常法により培養すればよい。
　上記培養後、培養上清中に蓄積されたＦａｂ’フラグメントは、各種カラムクロマトグラフィーにより精製することができ、例えば、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ等によるカラムクロマトグラフィーを使用することができる。
　本発明のＦａｂ’フラグメントは、前述のような組換え発現法を用いて作製することもできるが、一旦全長抗体として作製した後にペプシンで消化して、得られたＦ（ａｂ’）2フラグメントを２－メルカプトエタノールのような還元剤で処理して、Ｆａｂ’フラグメントとして作製してもよい。
　好ましくは、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、当該分野で公知の方法を用いて、配列番号６に示される重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及び配列番号４に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを合成し、これらを適当なクラスのヒト抗体定常領域遺伝子、好ましくは重鎖についてはヒトＩｇγ１定常領域遺伝子、軽鎖についてはヒトＩｇκ定常領域遺伝子と連結して完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメント遺伝子を構築し、当該分野で公知の種々の方法を用いて、該遺伝子を発現ベクターへ導入し、該発現ベクターを培養細胞に導入して該培養細胞を培養し、得られる培養物からＦａｂ’フラグメントを精製することによって、容易に取得することができる。好ましくは、配列番号６に示される重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号５に示される塩基配列を含む。好ましくは、配列番号４に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号３に示される塩基配列を含む。
　本明細書中、「Ｆａｂ’フラグメント」とは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶH）、ＣH１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖のフラグメントから構成される、１価の抗体のフラグメントであり、このヒンジ領域の部分には、重鎖－軽鎖間のＳ－Ｓ結合を構成しているシステイン残基以外の少なくとも１つのシステイン残基（本明細書中、「ヒンジ領域システイン」とも称する）が含まれる。ヒンジ領域システインは、後述のポリエチレングリコールでの修飾部位として使用することができる。Ｆａｂ’フラグメント中のヒンジ領域システインの数は、使用する抗体のクラスによって１～数個の間で異なり得るが、当業者によって容易に調整可能である。例えば、ヒトのＩｇＧ１クラス（通常、ヒンジ領域において、２個のヒンジ領域システインを有する）のＦａｂ’フラグメントを作製する場合、重鎖のヒンジ領域において、最初のヒンジ領域システインのコード部位と２番目のヒンジ領域システインのコード部位との間に停止コドンを挿入することによって、ヒンジ領域中に１個のヒンジ領域システインを有するＦａｂ’フラグメントを作製することができ、２番目のヒンジ領域システインのコード部位の後に停止コドンを挿入することによって、ヒンジ領域中に２個のヒンジ領域システインを有するＦａｂ’フラグメントを作製することができる。
　配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とヒトＩｇγ１定常領域の部分とを含む、本発明の好ましい抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントは、配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントである。好ましくは、配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号９、配列番号１３、又は配列番号１５に示される塩基配列を含む。配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とヒトＩｇκ定常領域とを含む、本発明の好ましい抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖である。好ましくは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号１１に示される塩基配列を含む。
　配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントと、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明の好ましい抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとしては、後記実施例に記載される完全ヒト型１－１５（Ｎ５２Ｄ）抗体Ｆａｂ’フラグメントが挙げられる。配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントと、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明の好ましい抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとしては、後記実施例に記載される完全ヒト型１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）抗体Ｆａｂ’フラグメントが挙げられる。配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントと、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明の好ましい抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとしては、後記実施例に記載される完全ヒト型１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ｐ）抗体Ｆａｂ’フラグメントが挙げられる。
　本発明は、配列番号６の３１～３５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６の５０～６５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６の９８～１１０番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号４の２４～３９番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４の５５～６１番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４の９４～１０２番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントをも包含する。このようなＦａｂ’フラグメントもまた、前述のような手順に従って当業者に容易に作製され得る。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、そのヒンジ領域システインを介して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させて修飾してもよい。Ｆａｂ’フラグメントへのＰＥＧの結合は、当該分野で公知の方法を使用して実施可能である（例えば、欧州特許ＥＰ０９４８５４４）。本発明においては、直鎖又は分枝鎖の、任意の平均分子量のＰＥＧ又はその誘導体が使用可能であり、使用目的に応じて当業者により容易に選択され得る。例えば、腫瘍組織や炎症反応時においては、正常組織と比べて血管透過性が著しく亢進しており、到達した物質は血管外に漏出し、腫瘍や炎症組織に蓄積する傾向がある（ＥＰＲ効果）。また、分子量が小さい物質は血管へ再吸収されやすく、分子量が大きい物質は再吸収されにくいことも知られている。従って、Ｆａｂ’フラグメントの病巣組織での滞留性を改善するために、高い平均分子量（例えば、約４００００Ｄａ）のＰＥＧを結合してもよく、体外への速やかな排泄が望ましい場合には、低い平均分子量（例えば、約１００００Ｄａ）のＰＥＧを結合してもよい。また、ヒンジ領域システインへのＰＥＧの結合を容易にするために、ＰＥＧの誘導体を使用してもよい。例えば、後述の実施例に記載のように、マレイミドのようなチオール反応基を結合させたＰＥＧ誘導体を使用し、ヒンジ領域システインのチオール基とマレイミド基を共有結合させることができる。一般的にＰＥＧの平均分子量は、約５００Ｄａ～約５００００Ｄａであり、好ましくは、約５０００Ｄａ～約４００００Ｄａであり、より好ましくは、約１００００Ｄａ～約４００００Ｄａの範囲である。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、ヒトＮＧＦに結合する。得られた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントのヒトＮＧＦに対する結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡやＦＡＣＳ等の方法がある。例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒトβＮＧＦをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、これに対してＦａｂ’フラグメントを添加して反応させた後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で標識した抗ｋａｐｐａ抗体等の二次抗体を反応させ、洗浄した後、その活性を検出する試薬（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ＴＭＢ発色試薬）等を用いた活性測定により、二次抗体の結合を同定する。また、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントには、ヒトＮＧＦに加え、他の動物由来のＮＧＦ（例えば、マウスＮＧＦ）にも結合するＦａｂ’フラグメントも含まれ、これらのタンパク質に対する結合活性を測定してもよい。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、ヒトＮＧＦに対する中和活性を有している。本明細書中で使用される場合、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの「中和活性」とは、ＮＧＦへの結合によりＮＧＦを介してもたらされる任意の生物活性を阻害する活性を意味し、ＮＧＦの１つ又は複数の生物活性を指標に評価することができる。このような中和活性としては、例えば、ＮＧＦとその受容体であるｔｒｋＡとの結合阻害活性、ＮＧＦ－ｔｒｋＡシグナル媒介細胞内カルシウム流入阻害活性、ＮＧＦ依存性の細胞生存シグナル阻害活性が挙げられ、後記実施例に記載されるような方法を用いることによって評価することができる。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの効果をより詳細に評価するために、ｉｎ　ｖｉｖｏでの試験を用いることもできる。例えば、後記実施例に記載のように、マウス関節炎モデルを用いる鎮痛効果試験等を用いて、Ｆａｂ’フラグメントのｉｎ　ｖｉｖｏでの薬効を評価することができ、また、病巣移行性試験を用いて、その病巣組織滞留効果を評価することもできる。
　さらに、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントについて、副作用リスクを評価してもよい。例えば、後記実施例に記載のように、妊娠中の動物におけるＦａｂ’フラグメント投与後の胎盤通過試験を使用することによって、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントが胎児に影響を及ぼす可能性について評価することができる。また、後記実施例に記載のように、ＮＧＦとの免疫複合体（ＩＣ）形成試験を用いて、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントとＮＧＦとの間で形成されるＩＣのサイズを測定し、血栓形成を誘発する可能性について評価することができる。
　その他、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの各種安定性（例えば、熱安定性、長期保存安定性、高濃度安定性）を評価する方法としては、例えば、示差走査熱量測定や、保存中の凝集体形成の測定を利用する方法が挙げられる。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、必要に応じて精製された後、常法に従って製剤化され、変形性関節症に伴う関節痛（ＯＡ疼痛）、リウマチに伴う関節痛、癌性疼痛、神経因性疼痛、慢性腰痛、術後疼痛、帯状疱疹後神経痛、有痛性糖尿病性神経障害、骨折痛、膀胱痛症候群等の疼痛や、間質性膀胱炎、急性膵炎、慢性膵炎、子宮内膜症等のＮＧＦが病態形成に関連する疾患の治療に用いることができる。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、好ましくは、疼痛治療剤、より好ましくは、変形性関節症に伴う関節痛治療剤として用いることができる。これら治療剤等の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤とすることができ、静脈内投与、皮下投与等により投与することが好ましい。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。
　上記製剤化に当たっての本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
　本発明はまた、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチド及びそれを含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド、及び本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド、並びにそれらのいずれか又は両方を含む発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明のＦａｂ’フラグメントあるいはその重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現し、これらポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げることができる。好ましくは、本発明の発現ベクターは、前述の本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメント又は軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むか、あるいは本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドと本発明のＦａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む。
　本発明の発現ベクターは、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントをコードする遺伝子、あるいは本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子、及び当該遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。細菌中で本発明のＦａｂ’フラグメントあるいはその重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、宿主がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母中での発現用プロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、バチルス属菌での発現用プロモーターとしては、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
　宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明のＦａｂ’フラグメントあるいはその重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
　本発明はまた、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントをコードする遺伝子あるいは本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子が導入された形質転換体を提供する。このような形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより作製できる。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）など）が例示される。形質転換は自体公知の方法により行われ得る。
　好ましくは、本発明の形質転換体は、本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞であるか、又は、本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。より好ましくは、本発明の形質転換体は、前述の本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞であるか、又は、前述の本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
　本発明はまた、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントをコードする遺伝子あるいは本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする遺伝子を宿主細胞に発現させること、即ち、このような形質転換体を用いることを含む、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの生産方法を提供する。好ましくは、該方法で使用される宿主細胞は、前述の本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞であり、本発明のＦａｂ’フラグメントの重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを、別々にか又は同時に含んでもよい。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントの生産において、形質転換体は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
　形質転換体の培養は自体公知の方法により行われる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨおよび培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５～２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．５０１，１９５２）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，ｐ．１，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６～８であるのが好ましく、培養は通常約３０～４０℃で約１５～７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．８４０４，１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５～８であるのが好ましい。培養は通常約２０～４０℃で１５～１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば、上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５～８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４３１，１９７２）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４～４３℃、約３～２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０～４０℃、約１６～９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５，１９８０）が挙げられ、ｐＨは５～８であることが望ましい。培養は通常約２０～３５℃で約１４～１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、上述のような形質転換体を培養し、該形質転換体から回収、好ましくは単離、精製することができる。単離、精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
　本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
　市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。
（実施例１：ベロシミューンマウスへの免疫）
　ヒトＮＧＦに対する抗体を、ベロシミューンマウスに免疫することによって取得した。本発明者らは、得られる抗体の多様性を高めるために、複数の免疫方法、投与経路、アジュバント、免疫期間等を検討した。免疫原としては、ヒトβＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ社）を使用し、ヒトβＮＧＦを溶解してアジュバントと混和した後に免疫に使用する方法と、ヒトβＮＧＦを熱変性（０．５％ＳＤＳ溶液下、８０℃、１０分処理）した後にアジュバントと混和して免疫する方法を検討した。投与経路としては、足蹠投与と腹腔内投与を検討した。アジュバントとしては、ＴｉｔｅｒＭａｘ　Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ社）、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ社）、及びＲＩＢＩアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を検討した。さらに添加する免疫賦活剤としては、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとＡｌｕｍｉｎｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｇｅｌ（ＢＲＥＮＮＴＡＧ社）を検討した。免疫期間としては，３週間～１４週間まで検討した。数回免疫した後、マウス尾静脈より採血を行い、力価をモニターすることで、ヒトＮＧＦに結合する抗体を産生するベロシミューンマウスの選択を行った。
　力価測定は以下の標準的なＥＬＩＳＡ方法を用いて測定した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４プレート（Ｎｕｎｃ社）にヒトβＮＧＦを１ウェルあたり１０ｎｇ添加し、４℃にて一晩インキュベートして固相化した。翌日、プレートを洗浄液（ＴＢＳＴ：０．０５％　Ｔｗｅｅｎ－２０含有トリスバッファー（ＴＢＳ））で１回洗浄後、ブロッキング剤（２０％　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ（ナカライテスク社）含有ＴＢＳＴ）を添加し室温にて１時間静置した。ＴＢＳＴ洗浄液で１回洗浄後、採血した血液の希釈系列を作製して添加した。室温にて１時間インキュベート後、ＴＢＳＴ洗浄液にて３回洗浄し、５％　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ含有ＴＢＳＴ洗浄液で２０００倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ＨＲＰ－ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　Ｉｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｚｙｍｅｄ社）を添加した。室温にて１時間インキュベートした後、ＴＢＳＴ洗浄液で３回洗浄した。ＴＭＢ発色試薬（住友ベークライト社）を加えて室温で１０分静置した後、停止液（２ｍｏｌ／Ｌ　硫酸）を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（実施例２：抗ヒトＮＧＦ抗体産生ハイブリドーマの作製）
　抗体価の上昇を確認して選択したマウスに最終免疫（抗原の静脈内投与または腹腔内投与）を行った。定法に従い、免疫したマウスの脾臓やリンパ節等を摘出しリンパ球を収集し、これをマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマを限界希釈し、単一クローンにしたうえで、上清からプロテインＡ又はプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて抗体を精製した。
（実施例３：ＮＧＦ－ｔｒｋＡ結合阻害評価）
　ヒトβＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ社）とＥＺ－ＬＩＮＫ　５－（ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）ｐｅｎｔｙｌａｍｉｎｅ（ＰＩＥＲＣＥ社）を室温暗所にて３０分反応させてビオチン標識を行い、脱塩カラムにて過剰量のビオチンを除去し、ビオチン標識ヒトβＮＧＦを取得した。なお、作製したビオチン標識ヒトβＮＧＦについては、生物活性が元のヒトβＮＧＦと同等であることを以下の実施例６及び実施例７で確認した。
　阻害活性を以下の方法を用いて測定した。白色Ｍａｘｉｓｏｒｐ３８４プレート（Ｎｕｎｃ社）にヒトｔｒｋＡ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を１ウェルあたり６０ｎｇ添加し、４℃にて一晩インキュベートして固相化した。翌日、プレートをＴＢＳＴ洗浄液で１回洗浄後、ブロッキング剤（２０％　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ（ナカライテスク社）含有ＴＢＳＴ）を添加し室温にて１時間静置した。次に、上記で作製したビオチン標識ヒトβＮＧＦ（０．２μｇ／ｍｌ）と実施例２で得た抗体を混和したものを、ブロッキング後のｔｒｋＡ固相プレートに添加した。室温にて１時間インキュベート後、ＴＢＳＴ洗浄液にて３回洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社）を添加した。室温にて１時間インキュベート後、ＴＢＳＴ洗浄液にて３回洗浄し、化学発光検出試薬であるＡＰＵ４（ＢｉｏＦＸ社）を加えて、その化学発光量をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。
（実施例４：種交差性評価）
　抗体がマウスβＮＧＦに対して交差性を有する場合、当該抗体を用いてマウス病態モデルでの薬効評価を行うことが可能となる。そこで、実施例３の方法において、マウスβＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてビオチン標識マウスβＮＧＦを作製することによって、抗体のマウスβＮＧＦに対する交差性を評価した。
（実施例５：結合特異性評価）
　実施例１に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて、抗体のＮＧＦへの結合特異性を評価した。具体的には、ＮＧＦと最も相同性の高いファミリー分子であるＮＴ－３を用いて、実施例１の方法においてヒトＮＴ－３（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）を１ウェルあたり２０ｎｇ添加してプレートに固相化して評価した。
（実施例６：ＮＧＦ－ｔｒｋＡシグナル阻害評価）
　抗体のＮＧＦ－ｔｒｋＡシグナルの阻害活性について評価した。ＮＧＦはその受容体であるｔｒｋＡを介して細胞内カルシウム（Ｃａ2+）濃度の上昇を引き起こす。通常、このＣａ2+濃度変化は、カルシウム指示薬存在下のもとで、細胞内Ｃａ2+濃度測定システム（ＦＬＩＰＲ；モレキュラーデバイス社）を用いると評価できる。
　阻害活性を以下の方法を用いて測定した。ヒトｔｒｋＡを安定的に発現させたＨＥＫ２９３細胞（ＷＯ２００９／０５４４６８）を、実験前日に２×１０4細胞／ウェルとなるように、９６ウェル　ポリ－Ｄ－リジン－コートプレート（日本ベクトンディッキンソン社）に分注し、一晩培養した。翌日、培地をカルシウム指示薬（Ｆｌｕｏ４－ＡＭ；同仁堂社）を含むＤＭＥＭ培地（３．６ｍＭ　水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、２．５ｍＭ　プロベネシド（Ｓｉｇｍａ社）含有）に置き換え、３７℃にて３０分静置した。次いで、洗浄液（ハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）（２０ｍＭ　２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３．６ｍＭ　水酸化ナトリウム、２．５ｍＭ　プロベネシド（Ｓｉｇｍａ社）、０．１％　ウシ血清アルブミン））にて細胞を２回洗浄し、培地をこの洗浄液１５０μｌ／ウェルで置き換えた。細胞プレートをＦＬＩＰＲ内にセットした。ＦＬＩＰＲの操作により、実施例２で得た抗体とＮＧＦとの混和液を５０μｌ／ウェル添加し（ＮＧＦ最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）、細胞内Ｃａ2+濃度変化を測定した。細胞内Ｃａ2+濃度変化の最大値と最小値の差を算出し、測定データとして保存した。
（実施例７：ＮＧＦ依存性細胞生存シグナル阻害評価）
　天然にｔｒｋＡおよびｐ７５受容体を発現しているＰＣ１２細胞を無血清条件で培養した場合、ＮＧＦは細胞の生存を数日間維持できる。以下の方法を用いて、抗体のＮＧＦ依存的細胞生存シグナルに対する阻害活性を評価した。
　９６ウェルのコラーゲンコートプレート（旭テクノ社）にＰＣ１２細胞を１ウェルあたり１×１０4細胞で播き、２．５％ウシ胎仔血清および１５％ウマ非働化血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＦ１２Ｋ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて３７℃、５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。翌日、培地をＦ１２Ｋのみの無血清条件に置換した。１時間後、抗体およびヒトβＮＧＦ（最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、７２時間培養を行った。その後、培養液をアスピレーターにて除去し、細胞の内在性ＡＴＰ定量試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ　Ｇｌｏ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）により細胞の生存能を測定した。
（実施例８：Ｆａｂフラグメントの作製）
　Ｆａｂプレパレーションキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用し、抗体１ｍｇ／ｍｌに消化酵素パパイン結合ゲルを加え、３７℃、３時間処理した。処理した反応液をプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）に添加し、切断されたＦｃおよび未反応のＩｇＧをカラムに吸着させて除去し、溶出画分を回収することでＦａｂフラグメントを得た。得られたＦａｂフラグメントについて、実施例３、実施例６、及び実施例７に記載した試験で評価を行った。
　実施例３～８による評価の結果、１－１５と命名した抗体（キメラ抗体）が、高い中和活性、種交差性、結合特異性を有するとともに、１価の抗体フラグメントにした場合にも高い中和活性を保持することが確認された。
（実施例９：抗体遺伝子配列の決定）
　同定された１－１５抗体について、本発明者らはハイブリドーマから抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をクローニングした。具体的には、ハイブリドーマクローンを１×１０5以上準備し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）に添付のＲＬＴ　ｂｕｆｆｅｒで懸濁後、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて細胞の破砕を行った。その後プロトコールに従ってＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡ増幅キット（ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行い、重鎖及び軽鎖の可変領域を伸長及び増幅した。このＰＣＲ産物を直接シークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００；Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で配列解析を行った。また、ＰＣＲ産物をｐＣＲ３．１－ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等のＰＣＲ産物サブクローニング用ベクターへ組み換えた後、遺伝子配列を解析して配列決定を行った。
　決定された１－１５抗体の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に、該抗体の軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。１－１５抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、Ｋａｂａｔ番号付けに基づく重鎖可変領域の３１～３５番目、５０～６５番目、及び９５～１０２番目の領域であり、それぞれ、配列番号２の３１～３５番目、５０～６５番目、及び９８～１１０番目のアミノ酸配列からなる。１－１５抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、Ｋａｂａｔ番号付けに基づく軽鎖可変領域の２４～３４番目、５０～５６番目、及び８９～９７番目の領域であり、それぞれ、配列番号４の２４～３９番目、５５～６１番目、及び９４～１０２番目のアミノ酸配列からなる。
（実施例１０：可変領域の糖鎖修飾部位の変異体作製）
　前述の１－１５抗体の重鎖可変領域アミノ酸（配列番号２）には、Ｎ－Ｘ－（Ｔ／Ｓ）のＮ型糖鎖修飾モチーフ配列が含まれている。具体的には、配列番号２で示す重鎖可変領域における、Ｋａｂａｔ番号付けに基づく５２番目のＡｓｎ（Ｎ５２）が糖鎖修飾部位に該当する。糖鎖修飾部位が存在すると細胞培養の間に抗体への糖鎖の付加が起こるが、糖鎖の付加は培養条件や発現させる宿主に依存することが知られている。すなわち、樹立した同一の抗体産生細胞であっても、培養条件（培地、細胞密度など）によって糖鎖付加の程度が変わる可能性があり、均一な品質の抗体医薬品を取得することが困難となる可能性がある。そこで、本発明者らは、１－１５抗体の重鎖可変領域におけるＮ５２に変異を導入した１－１５（Ｎ５２Ｄ）を作製した。
　作製した１－１５（Ｎ５２Ｄ）の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示す。１－１５（Ｎ５２Ｄ）抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、Ｋａｂａｔ番号付けに基づく重鎖可変領域の３１～３５番目、５０～６５番目、及び９５～１０２番目の領域であり、配列番号６の３１～３５番目、５０～６５番目、及び９８～１１０番目のアミノ酸配列からなる。
（実施例１１：完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメントの作製）
　前述の１－１５及び１－１５（Ｎ５２Ｄ）の重鎖可変領域と１－１５の軽鎖可変領域を用いて、各々の完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメントを作製した。
　１－１５及び１－１５（Ｎ５２Ｄ）の各重鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列を、そして３’側にヒトＩｇγ１の定常領域遺伝子（Ｍａｎ　Ｓｕｎｇ　Ｃｏら，（１９９２）　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１４８（４）：１１４９－１１５４）をそれぞれ繋げ、この重鎖フラグメント遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）に挿入した。ここで、Ｆａｂ’フラグメントとして発現させるために、重鎖定常領域遺伝子において、ＥＵインデックスに基づく２２６番目のＣｙｓ（後述の配列番号８及び１０のアミノ酸配列中の２３０番目のＣｙｓに対応）のコドンの後に停止コドンを挿入した。また、１－１５の軽鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列を、そして３’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子（Ｍａｎ　Ｓｕｎｇ　Ｃｏら，前出）をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）に挿入した。
　一過性発現及び恒常的発現の２種類の方法でＦａｂ’フラグメントの発現を行った。一過性発現については、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で約１００万個／ｍＬに培養されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に対し、前述の重鎖フラグメント及び軽鎖のＧＳベクターを２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクトし、７日間培養した。恒常的発現については、前述の両ＧＳベクターをＮｏｔＩとＰｖｕＩで制限酵素切断し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社）を用いてライゲーションを行い、重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを構築した。この発現ベクターは、重鎖フラグメント及び軽鎖とグルタミン合成酵素（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）をコードしており、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞へのトランスフェクションにより発現させた。各方法で発現させた後、培養上清をＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて精製し、各Ｆａｂ’フラグメントを得た。
　作製した完全ヒト型１－１５抗体Ｆａｂ’フラグメント（１－１５－Ｆａｂ’とも称する）の重鎖フラグメントの塩基配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８にそれぞれ示す。
　作製した完全ヒト型１－１５（Ｎ５２Ｄ）抗体Ｆａｂ’フラグメント（１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’とも称する）の重鎖フラグメントの塩基配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１０にそれぞれ示す。
　各Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖は共通で、その塩基配列は配列番号１１に、アミノ酸配列は配列番号１２にそれぞれ示す。
（実施例１２：完全ヒト型抗体Ｆａｂ’フラグメントの中和活性及び発現量評価）
　実施例１１で取得した１－１５－Ｆａｂ’と１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’について、実施例３及び実施例６に記載した試験で評価した。実施例３の試験において、１－１５－Ｆａｂ’及び１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’のＩＣ５０は、それぞれ０．１７μｇ／ｍｌ及び０．１８μｇ／ｍｌであった。実施例６の試験において、１－１５－Ｆａｂ’及び１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’のＩＣ５０は、それぞれ０．０２１μｇ／ｍｌ及び０．０１８μｇ／ｍｌであった。これらの結果から、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’は、改変前の１－１５－Ｆａｂ’と同程度の中和活性を保持し、変異の導入によっても中和活性に影響を与えないことが確認された。
　また、各Ｆａｂ’フラグメントの恒常的発現を行い、安定発現細胞プール培養の上清中における抗体産生量を測定した。その結果、１－１５－Ｆａｂ’及び１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’の各培養上清中の濃度は、それぞれ８６ｍｇ／Ｌ及び１０６ｍｇ／Ｌであり、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’は、改変前の１－１５－Ｆａｂ’よりも高い量で産生される抗体であることが示された。
（実施例１３：ＰＥＧ化Ｆａｂ’フラグメントの作製と中和活性評価）
　次いで、本発明者らは、前述の１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’に対してＰＥＧの導入を行った。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔで精製後、Ｆａｂ’フラグメントをＴＣＥＰ塩酸塩（Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ　ＨＣｌ）により還元反応をすることで、ＰＥＧ化可能な構造体にした。
　具体的には、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）にて１．２ｍｇ／ｍｌに調整したＦａｂ’フラグメント溶液に、１ｍＭとなるようにＴＣＥＰを添加して、３７℃で２時間反応させたのち、２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で希釈しｐＨを整えた。これを陽イオン交換樹脂（ＳＰ－５ＰＷ；東ソー製）に吸着させ、ＮａＣｌグラジエントで溶出し、メインピークを回収した。得られたＦａｂ’フラグメントを２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）で１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、ｐＨを６．８に調整後、４℃で一晩以上静置し自然酸化させた。これに終濃度０．１ｍＭとなるように４０ｋＤａ　ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＧＬ２－４００ＭＡ；ＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を添加し、室温で２時間静置後、４℃で一晩静置した。同ＰＥＧは末端にマレイミド基を有しているので、重鎖フラグメントのカルボキシル末端のＣｙｓ（ＥＵインデックスに基づくＣ２２６；配列番号１０の２３０番目のＣｙｓ）と速やかに反応する。これを２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）で希釈してｐＨを調整後、再度陽イオン交換樹脂（ＳＰ－５ＰＷ；東ソー製）に吸着させ、ＮａＣｌのグラジエントで溶出、メインピークを回収した。このようにしてＰＥＧ化したＦａｂ’フラグメントを精製した。このＰＥＧ化した１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’を、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧとも称する。
　ＰＥＧ化前及びＰＥＧ化した１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’について、実施例３に示す方法で中和活性を評価した。その結果、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’のＩＣ５０が０．１５μｇ／ｍｌであったのに対し、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧのＩＣ５０は０．１２μｇ／ｍｌ（Ｆａｂ’フラグメント濃度として）であり、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’は、ＰＥＧの付加によっても中和活性に影響を受けないことが確認された。
　また、実施例６の方法を用いて、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧと先行抗ヒトＮＧＦ抗体Ｔａｎｅｚｕｍａｂのヒト及びマウスＮＧＦに対する中和活性を比較した。その結果、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧのＩＣ５０が、ヒトＮＧＦに対して０．０５１μｇ／ｍｌ、マウスＮＧＦに対して０．０６９μｇ／ｍｌであったのに対し、ＴａｎｅｚｕｍａｂのＩＣ５０は、ヒトＮＧＦに対して０．１７μｇ／ｍｌ、マウスＮＧＦに対して０．２３μｇ／ｍｌであり、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧが、ヒト及びマウスのいずれのＮＧＦに対しても、Ｔａｎｅｚｕｍａｂより３．３倍程度強力な中和活性を有することが確認された。
（実施例１４：マウスアジュバント誘発関節炎モデルによる鎮痛効果試験）
　本発明者らは、前述の１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧについて、マウスアジュバント誘発関節炎モデルに対する鎮痛効果を評価した。
　１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧをマウス静脈内に投与し（０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、投与容量は１０ｍＬ／ｋｇ）、後肢足蹠にフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ社）１ｍｇ／ｍＬを２５μＬ投与して疼痛を惹起した。惹起２４時間に２０分間の立ち上がり行動を測定した。具体的には、スーパーメックス自発運動量測定システム（室町機械）を用いて、マウスの自発的な立ち上がり行動の回数を赤外線ビームセンサーで２０分間自動計測した（Ｍａｔｓｏｎら、ＪＰＥＴ　３２０：１９４－２０１，２００７）。比較対照として、先行抗体Ｔａｎｅｚｕｍａｂを用いた。その結果、Ｔａｎｅｚｕｍａｂの静脈内投与での鎮痛効果がＥＤ５０＝０．２７ｍｇ／ｋｇだったのに対し、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧは、ＥＤ５０＝０．１１ｍｇ／ｋｇで鎮痛効果を発揮し、約３倍の有効性を示した。
（実施例１５：ラット胎盤通過試験）
　雌性ラットの妊娠１７日目に、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧ又はＴａｎｅｚｕｍａｂを静脈内に投与し（１００ｍｇ／ｋｇ、投与容量１０ｍＬ／ｋｇ）、３日後の母体および胎仔の血液中の抗体濃度を測定した。
　抗体濃度の測定は以下のように行った。ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ　Ｐｌａｔｅ（Ｓｔａｎｄａｒｄ）９６プレート（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）にヒトβＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を１ウェルあたり２５ｎｇ添加して、室温にて１時間静置することで固相化した。プレートをＴＢＳＴ洗浄液で３回洗浄後、ブロッキング剤（１％カゼイン　ＴＢＳ；サーモフィッシャー社）を添加し、室温にて１時間静置した。次に、経時的に採血した血液を希釈した血液サンプルを、ブロッキング後のヒトβＮＧＦ固相プレートに添加した。室温で撹拌しながら６０分反応後、ＴＢＳＴ洗浄液にて３回洗浄し、ビオチン標識抗ヒトカッパ抗体（免疫生物研究所）を添加した。室温で撹拌しながら６０分反応後、ＴＢＳＴ洗浄液にて３回洗浄し、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識ストレプトアビジン（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）を添加した。室温で撹拌しながら６０分反応後、ＴＢＳＴ洗浄液にて３回洗浄し、Ｒｅａｄ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｔ（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）を加えて、その電気化学発光量をＳＥＣＴＯＲ　Ｉｍａｇｅｒ　６０００（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）で測定した。
　本試験を３匹のラット母体において行った結果、３日後のラット母体血中における１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧ及びＴａｎｅｚｕｍａｂの抗体濃度は、それぞれ平均１２．１μｇ／ｍｌ及び７．１μｇ／ｍｌであった。一方、各ラット母体から３例ずつ胎仔を摘出（合計９例）した胎仔血中における抗体濃度については、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧの血中濃度が、全例で定量限界の０．０１μｇ／ｍｌ以下であったのに対し、Ｔａｎｅｚｕｍａｂの血中濃度は、平均５．３９μｇ／ｍｌであった。すなわち、Ｔａｎｅｚｕｍａｂの胎仔移行率は７５．９％であったのに対し、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧの胎仔移行率は検出限界の０．０８％以下の移行率であった。このことから、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧは、胎児におけるＮＧＦ阻害による副作用リスクを回避し、安全性に優れる薬剤であることが示唆された。
（実施例１６：免疫複合体（ＩＣ）の形成）
　１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧがＩＣを形成するか否か、あるいは形成されるＩＣのサイズがどの程度になるかを評価した。具体的には、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧを１ｍｇ／ｍｌとヒトβＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を、モル比で１：１になるように混和し、室温で３時間インキュベートしてＩＣを形成させた。この反応液を、動的光散乱を測定する機器Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ社）を用い、ＩＣの粒子径と分布を測定した。解析にはＺｅｔａｓｉｚａｒ　ｖ６．０１（Ｍａｌｖｅｒｎ社）を用い、粒子径はＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（％）で解析した値（ｄ．ｎｍ）で示した。
　測定された粒子サイズを以下の表１に示す。この実験において、ＮＧＦ単独の粒子径は平均で６．２ｎｍであった。Ｔａｎｅｚｕｍａｂ単独では１１．７ｎｍにピーク径が出現した。ＴａｎｅｚｕｍａｂとＮＧＦをインキュベートしてＩＣを形成させたものを測定すると、ピーク径が９１．３ｎｍにシフトした。一方、コントロール抗体としてＮＧＦと結合しない抗体を用いた場合、ピーク径は１１．７ｎｍのままであった。シフト幅から考えると、ＴａｎｅｚｕｍａｂとＮＧＦはそれぞれ複数分子を結合した巨大分子となり、巨大サイズのＩＣを形成していると推測された。これに対して、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧとＮＧＦとのＩＣの形成を測定した結果、ピーク径が１８．１ｎｍから２４．４ｎｍへとシフトした。シフト幅から考察すると、１：１結合のみを反映し、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧでは格子形成されないことが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例１７：病巣組織移行性）
　雄性ＤＢＡ／１マウス足関節にコラーゲン（ウシ関節由来タイプ２コラーゲン、１０ｍｇ／ｍＬ；コラーゲン技術研修会）および完全フロイントアジュバント（０．５ｍｇ／ｍＬ；ＤＩＦＣＯ社）の１：１のエマルジョンを皮下投与し、コラーゲン誘発関節炎モデルを作製した。惹起４週間後に再度、エマルジョンを投与し、関節炎を発症させた。後肢関節炎の発症程度（スコア・腫脹の大きさ）を観察し、マウスの群分けを行った。１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧおよびＴａｎｅｚｕｍａｂの１ｍｇ／ｍｌ　ＰＢＳ溶液について、ＳＡＩＶＩTM　Ｒａｐｉｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて蛍光標識を行った。それぞれを２ｍｇ／ｋｇにて尾静脈から投与を行った（Ｎ＝４）。腫脹した足底に蓄積してくる蛍光を、ＩＶＩＳ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ／Ｘｅｎｏｇｅｎ社）を用いて、投与後１時間から５０時間まで解析し、蛍光強度を数値化した。
　図１に足底の抗体滞留量の経時的変化を示す。１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧはＴａｎｅｚｕｍａｂに比較して明らかな病巣組織滞留効果を示し、その効果は４８時間まで持続した。この結果から、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧは効率的に鎮痛効果を発揮する考えられ、薬効強度以上に低用量で鎮痛効果期待できること、さらには、病巣部位選択的に集積するので安全性に優れる薬剤となりうることが期待できる。
（実施例１８：Ｆａｂ’フラグメントのアミノ酸付加体の作製）
　本発明者らは、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’において、ＰＥＧの導入効率を改善するために、重鎖フラグメントのカルボキシル末端のＣｙｓ残基の後に２個のアラニン（Ａ）又はプロリン（Ｐ）を付加したＦａｂ’フラグメントを作製し、発現及び精製した。これらのＦａｂ’フラグメントの作製においては、実施例１１と同様の方法を用い、ここで、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’の重鎖フラグメントのカルボキシル末端Ｃｙｓ残基のコドンの後に２個のアラニン又はプロリンのコドンを挿入し、その後に停止コドンを挿入した。
　アラニン付加した１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’（完全ヒト型１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）抗体Ｆａｂ’フラグメント；１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’とも称する）の重鎖フラグメントの塩基配列を配列番号１３に、アミノ酸配列を配列番号１４にそれぞれ示す。プロリン付加した１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’（完全ヒト型１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ｐ）抗体Ｆａｂ’フラグメント；１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ｐ）－Ｆａｂ’とも称する）の重鎖フラグメントの塩基配列を配列番号１５に、アミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。なお、各Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖は、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’の軽鎖と同じであり、その塩基配列は配列番号１１に、アミノ酸配列は配列番号１２にそれぞれ示される。
（実施例１９：ＰＥＧ化１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’の作製並びに中和活性及び薬理評価）
　１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’に対して、実施例１３と同様の方法を用いて４０ｋＤａ　ＰＥＧを結合させ、ＰＥＧ化した１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’（以下、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧとも称する）を得た。
　１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧについて、実施例３に示す方法を用いて中和活性を評価した。その結果、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧのＩＣ５０が０．０８１±０．０３４μｇ／ｍｌであったのに対し、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧのＩＣ５０は０．０７４±０．０２１μｇ／ｍｌであった。また、このときＴａｎｅｚｕｍａｂのＩＣ５０は０．４１０±０．０９９μｇ／ｍｌであった。
　次に、実施例６に示す方法を用いて中和活性を比較した。その結果、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧのＩＣ５０が、ヒトＮＧＦに対して０．０６１±０．０１１μｇ／ｍｌであったのに対し、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧのＩＣ５０は０．０６４±０．０２８μｇ／ｍｌであった。
　さらに、実施例１４に示す方法を用いてアジュバント誘発関節炎モデルにおける鎮痛効果を評価した。その結果、１－１５（Ｎ５２Ｄ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧは、ＥＤ５０＝０．１４ｍｇ／ｋｇで鎮痛効果を発揮したのに対し、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧは、ＥＤ５０＝０．２１ｍｇ／ｋｇで鎮痛効果を発揮した。
　以上より、カルボキシル末端のＣｙｓ残基の後に２個のアラニンを付加することによっても、中和活性及び薬理活性に影響を受けないことが確認された。
（実施例２０：１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧの結合親和性の評価）
　１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧ及びＴａｎｅｚｕｍａｂのＮＧＦ抗原に対する結合熱力学を等温滴定型熱量測定（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；ＩＴＣ）によって検討した（Ｓｃａｐｐａｔｉｃｃｉ　ＦＡ，Ｊ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．２００７，９９：１２３２－９．Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ－Ｃａｍｐｏｙ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ，Ｃｕｒｒ　Ｐｒｏｔｏｃ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２００４，Ｃｈａｐｔｅｒ　１７，Ｕｎｉｔ　１７－１８．）。すべての測定はＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＡｕｔｏ－ｉＴＣ２００を用いて行った。実験では１価のＦａｂ’フラグメントと１分子の抗原間の結合を評価すべく、以下の濃度で試験を行い、試験は全てＰＢＳ溶媒中で行った。具体的には、滴定用シリンジに入ったヒトβＮＧＦ　４４μＭ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社）を１．４μＬずつ３０回にわたって抗体試料（３μＭの１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧ又は１．５μＭのＴａｎｅｚｕｍａｂ）を満たした熱量計セルに滴定し、その際に生じた熱量を検出した。得られたデータを装置付属のソフトを用いＳｉｎｇｌｅ　ｓｉｔｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｅｌによって解析することで、抗原－抗体結合に伴われる結合親和力（Ｋｄ）、結合比（ｎ）、結合自由エネルギー（ΔＧ）、結合エンタルピー（ΔＨ）、及び結合エントロピー（－ＴΔＳ）を見積もった。結果を表２に示す。
　その結果、ＴａｎｅｚｕｍａｂのＫｄ値が２０．４１ｎＭであったのに対し、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧのＫｄ値は１．４９ｎＭであり、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧの結合親和性はＴａｎｅｚｕｍａｂよりも１０倍以上強力であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例２１：各種ＰＥＧサイズのＰＥＧ化１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’の作製及び中和活性評価）
　実施例１８で作製した１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’に対して、実施例１３と同様の手順を用いて、５ｋＤａ　ＰＥＧ又は１０ｋＤａ　ＰＥＧを結合させた。具体的には、２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．４）にて調製したＦａｂ’フラグメント溶液をＴＣＥＰで還元させた後、脱塩カラムを用いてＦａｂ’フラグメントを回収した。得られたＦａｂ’フラグメントにＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＧＬ２－５０ＭＡ又はＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＧＬ２－１００ＭＡ；いずれもＮＯＦ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を添加し、４℃で一晩静置した。このようにして得られた、５ｋＤａ　ＰＥＧ又は１０ｋＤａ　ＰＥＧを結合させた１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’を、それぞれ１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－５ｋＰＥＧ、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧと称する。
　次に、実施例６に示す方法を用いて、各ＰＥＧ化Ｆａｂ’フラグメントの中和活性を比較した。比較対照として、実施例１９で作製した１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－ＰＥＧ（４０ｋＤａ　ＰＥＧを結合；以下、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－４０ｋＰＥＧとも称する）を用いた。今回の実験ではＮＧＦ最終濃度を５０ｎｇ／ｍｌで実施した。その結果、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－５ｋＰＥＧ、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧ、及び１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－４０ｋＰＥＧのＩＣ５０は、それぞれ０．０３０μｇ／ｍｌ、０．０２８μｇ／ｍｌ、及び０．０２３μｇ／ｍｌであった。この結果から、ＰＥＧサイズは５ｋＤａから４０ｋＤａのサイズにおいてはＦａｂ’フラグメントの中和活性に影響しないことがわかった。
（実施例２２：各種ＰＥＧサイズのＰＥＧ化１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’のマウスＰＫ評価）
　各種ＰＥＧ化１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’のマウスＰＫ評価を行った。具体的には、０．３ｍｇ／ｋｇの各種ＰＥＧ化１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’を静脈内に投与し、投与後１、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、及び１６８時間毎に採血した。得られた血液中の被検抗体量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。具体的には、被検抗体を、ＮＧＦを固定化したＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ　Ｓｃａｌｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）に添加した。プレートに結合した被検抗体をビオチン標識抗ヒトカッパ抗体で認識し、これをＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識ストレプトアビジンで検出した。血中濃度の算出は、各標準品で検量線を作製して求めた。算出した血中濃度より血中半減期（Ｔ１／２：時間）を計算した。その結果、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－５ｋＰＥＧ、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧ、及び１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－４０ｋＰＥＧのＴ１／２は、それぞれ１３．８±２．２時間、１７．７±０．４時間、及び３９．２±３．７時間であった。
（実施例２３：ラット足裏切開モデルによる鎮痛効果試験）
　臨床における術後痛を反映するとされるラット足裏切開後痛モデル(Ｂｒｅｎｎａｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　２００４；５．３４．１－５．３４．８)を用いて、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－５ｋＰＥＧ及び１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－１０ｋＰＥＧの術後痛に対する鎮痛効果を評価した。
　具体的には、各群８匹とし、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－５ｋＰＥＧ又は－１０ｋＰＥＧをラット静脈内に投与し（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、投与容量は１ｍＬ／ｋｇ）、右後肢足裏を踵先端から５ｍｍ部分を起点として１０ｍｍつま先方向へ直線的に切開して直ちにナイロン糸で２か所マットレス縫合することで疼痛を惹起した。惹起５時間、１日、２日、３日、４日、及び５日に術部位付近の疼痛閾値を測定した。測定は、Ｕｇｏ　Ｂａｓｉｌｅ社製Ｄｙｎａｍｉｃ　ｐｌａｎｔａｒ　ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒを用いて、ラットの足裏への加圧に対する逃避行動を示す圧力を測定した。比較対照として、先行抗体Ｔａｎｅｚｕｍａｂを用いた。
　その結果、術後１日のＴａｎｅｚｕｍａｂの静脈内投与での鎮痛効果がＥＤ５０＝０．２６ｍｇ／ｋｇであったのに対し、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－５ｋＰＥＧ又は－１０ｋＰＥＧは、いずれもＥＤ５０＝０．１５ｍｇ／ｋｇで鎮痛効果を発揮し、約２倍の有効性を示した。また、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－５ｋＰＥＧ又は－１０ｋＰＥＧの有意な鎮痛効果は、それぞれ術後３日あるいは４日まで観察された。
（実施例２４：凝集安定性評価）
　１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－４０ｋＰＥＧを、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７．４、及びｐＨ９の各条件で１ｍｇ／ｍｌ及び１０ｍｇ／ｍｌに溶解した。これらをそれぞれ５０℃の条件におき、２週間後の凝集安定性について評価を行った。凝集性の評価はサイズ排除クロマトグラフィーにより行い、Ａｇｉｌｅｎｔ社製１１００を用いて測定した。測定条件は、移動相のバッファーとして０．１Ｍリン酸ナトリウム（０．２Ｍアルギニン含有）（ｐＨ６．８）を用い、カラムはＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｓｕｐｅｒ　Ｓｗ３０００（ＴＯＳＯＨ,２．０ｍｍＩＤ×３００ｍｍ）を用いた。検出波長は２８０ｎｍで行った。１ｍｇ／ｍｌでの試験では、比較抗体としてＴａｎｅｚｕｍａｂを用い、その結果を表３に示す。１０ｍｇ／ｍｌでの試験では、比較抗体としてＴａｎｅｚｕｍａｂ及びＲＥＧＮ４７５を用い、その結果を表４に示す。
　その結果、Ｔａｎｅｚｕｍａｂ及びＲＥＧＮ４７５は２週間後に顕著な凝集体の産生上昇が観察されたのに対し、１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’－４０ｋＰＥＧでは凝集体が殆ど検出されなかった。この結果から、ＰＥＧ化１－１５（Ｎ５２Ｄ－Ａ）－Ｆａｂ’は、保存安定性に優れる医薬品になりうる可能性が高いことが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 －　試験せず
　本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体、より具体的には、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントは、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する各種疾患の予防または治療に有用である。

Claims (12)

  1. 　配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント。
  2. 　前記Ｆａｂ’フラグメントの重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域である、請求項１に記載のＦａｂ’フラグメント。
  3. 　前記Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、請求項１に記載のＦａｂ’フラグメント。
  4. 　前記Ｆａｂ’フラグメントの重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域であり、前記Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、請求項１に記載のＦａｂ’フラグメント。
  5. 　配列番号１０、配列番号１４、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載のＦａｂ’フラグメント。
  6. 　ポリエチレングリコールを結合させた、請求項１～５のいずれか１項に記載のＦａｂ’フラグメント。
  7. 　請求項１に記載のＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
  8. 　請求項１に記載のＦａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
  9. 　請求項７及び／又は８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  10. 　請求項９に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  11. 　以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
    （ａ）請求項１に記載のＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
    （ｂ）請求項１に記載のＦａｂ’フラグメントの重鎖フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。
  12. 　請求項１０又は１１に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを発現させる工程を包含する、請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメントを生産する方法。
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ZA2014/00741A ZA201400741B (en) 2011-08-11 2014-01-30 Novel anti-human ngf antibody
IL230797A IL230797A (en) 2011-08-11 2014-02-03 Human anti-ngf antibodies, polynucleotide encoding them, vectors and host cells containing them and methods for their production
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9127055B2 (en) 2013-02-08 2015-09-08 Astellas Pharma Inc. Method of treating pain with anti-human NGF antibody
WO2016190263A1 (ja) * 2015-05-22 2016-12-01 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント
WO2017164349A1 (ja) 2016-03-25 2017-09-28 アステラス製薬株式会社 ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメント含有医薬組成物
WO2019221097A1 (ja) 2018-05-15 2019-11-21 アステラス製薬株式会社 抗ヒトｎｇｆ抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分とする心房細動の抑制用医薬組成物

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
AU2011336470B8 (en) 2010-12-01 2017-09-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
JP6135161B2 (ja) * 2013-02-08 2017-05-31 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトｎｇｆ抗体
CN109929035B (zh) * 2017-12-15 2022-06-28 安源医药科技（上海）有限公司 抗人ngf抗体及其制备方法和用途

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990007861A1 (en) 1988-12-28 1990-07-26 Protein Design Labs, Inc. CHIMERIC IMMUNOGLOBULINS SPECIFIC FOR p55 TAC PROTEIN OF THE IL-2 RECEPTOR
WO1994020632A1 (en) 1993-03-11 1994-09-15 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic R Esearch Insitute Anti-hiv monoclonal antibody
EP0948544A1 (en) 1996-12-10 1999-10-13 Celltech Therapeutics Limited Monovalent antibody fragments
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
WO2004058184A2 (en) 2002-12-24 2004-07-15 Rinat Neuroscience Corp. Anti-ngf antibodies and methods using same
WO2005019266A2 (en) 2003-07-15 2005-03-03 Amgen Inc. Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
WO2005061540A2 (en) 2003-12-24 2005-07-07 Lay Line Genomics S.P.A. Method for the humanization of antibodies and humanized antibodies thereby obtained
WO2006077441A1 (en) 2005-01-24 2006-07-27 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for ngf
WO2009023540A1 (en) 2007-08-10 2009-02-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human nerve growth factor
WO2009054468A1 (ja) 2007-10-24 2009-04-30 Astellas Pharma Inc. アゾールカルボキサミド化合物又はその塩

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ529612A (en) 2001-05-30 2006-03-31 Genentech Inc Anti-NGF antibodies for the treatment of various disorders
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
SG175436A1 (en) 2009-05-04 2011-12-29 Abbott Res Bv Antibodies against nerve growth factor (ngf) with enhanced in vivo stability

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990007861A1 (en) 1988-12-28 1990-07-26 Protein Design Labs, Inc. CHIMERIC IMMUNOGLOBULINS SPECIFIC FOR p55 TAC PROTEIN OF THE IL-2 RECEPTOR
WO1994020632A1 (en) 1993-03-11 1994-09-15 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic R Esearch Insitute Anti-hiv monoclonal antibody
EP0948544A1 (en) 1996-12-10 1999-10-13 Celltech Therapeutics Limited Monovalent antibody fragments
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
WO2004058184A2 (en) 2002-12-24 2004-07-15 Rinat Neuroscience Corp. Anti-ngf antibodies and methods using same
WO2005019266A2 (en) 2003-07-15 2005-03-03 Amgen Inc. Human anti-ngf neutralizing antibodies as selective ngf pathway inhibitors
WO2005061540A2 (en) 2003-12-24 2005-07-07 Lay Line Genomics S.P.A. Method for the humanization of antibodies and humanized antibodies thereby obtained
WO2006077441A1 (en) 2005-01-24 2006-07-27 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for ngf
WO2009023540A1 (en) 2007-08-10 2009-02-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human nerve growth factor
JP2010535509A (ja) * 2007-08-10 2010-11-25 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト神経成長因子に対する高親和性ヒト抗体
WO2009054468A1 (ja) 2007-10-24 2009-04-30 Astellas Pharma Inc. アゾールカルボキサミド化合物又はその塩

Non-Patent Citations (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALOE L ET AL., CLIN EXP RHEUMATOL., vol. 15, 1997, pages 433 - 8
BOSTIAN, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 77, 1980, pages 4505
BRENNAN ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN PHARMACOLOGY, 2004, pages 5.34.1 - 5.34.8
BUYNAK R ET AL., EXPERT OPIN PHARMACOTHER., vol. 11, 2010, pages 1787 - 804
CONOVER JC ET AL., REV NEUROSCI., vol. 8, 1997, pages 13 - 27
CROWLEY C ET AL., CELL, vol. 76, 1994, pages 1001 - 11
EVANS RJ ET AL., J UROL., vol. 185, 2011, pages 1716 - 21
GARBER KEN: "Fate of novel painkiller mAbs hangs in balance", NAT. BIOTECHNOL., vol. 29, no. 3, March 2011 (2011-03-01), pages 173 - 174, XP008166148 *
IANNONE F ET AL., RHEUMATOLOGY, vol. 41, 2002, pages 1413 - 8
INDO Y ET AL., NAT GENET., vol. 13, 1996, pages 485 - 8
J. AM. MED. ASSOC., vol. 199, 1967, pages 519
JOHNSON EM JR ET AL., SCIENCE, vol. 210, 1980, pages 916 - 8
KATZ N ET AL., PAIN, 2011
LANE NE ET AL., N ENGL J MED., vol. 363, 2010, pages 1521 - 31
LEWIN GR ET AL., J NEUROSCI., vol. 13, 1993, pages 2136 - 48
LOWE EM ET AL., BR J UROL., vol. 79, 1997, pages 572 - 7
MAN SUNG CO. ET AL., J IMMUNOL., vol. 148, no. 4, 1992, pages 1149 - 1154
MANCHIKANTI L ET AL., PAIN PHYSICIAN., vol. 13, 2010, pages E279 - 92
MATSON ET AL., JPET, vol. 320, 2007, pages 194 - 201
MEYER T ET AL., J THROMB HAEMOST., vol. 7, 2009, pages 171 - 81
MILLER ET AL.: "Exp. Mol. Genet", 1972, COLD SPRING HARBOR LABORATORY, pages: 431
PAYNE CK ET AL., J UROL., vol. 177, 2007, pages 2042 - 9
PETTY BG ET AL., ANN NEUROL., vol. 36, 1994, pages 244 - 6
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 8404
PROC. SOC. EXP. BIOL. MED., vol. 73, 1950, pages 1
SAKAI F ET AL., CEPHALALGIA, vol. 17, 1997, pages 15 - 22
SCAPPATICCI FA ET AL., J NATL CANCER INST., vol. 99, 2007, pages 1232 - 9
SCAPPATICCI FA, J NATL CANCER INST., vol. 99, 2007, pages 1232 - 9
SCIENCE, vol. 122, 1952, pages 501
SMEYNE RJ ET AL., NATURE, vol. 368, 1994, pages 246 - 9
VELAZQUEZ-COMPOY, A. ET AL.: "Curr Protoc Cell Biol.", 2004
VIROLOGY, vol. 8, 1959, pages 396
WILKENS P ET AL., JAMA, vol. 304, 2010, pages 45 - 52

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9127055B2 (en) 2013-02-08 2015-09-08 Astellas Pharma Inc. Method of treating pain with anti-human NGF antibody
WO2016190263A1 (ja) * 2015-05-22 2016-12-01 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント
KR20180006391A (ko) 2015-05-22 2018-01-17 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤 신규 항 인간 NGF 항체 Fab 프래그먼트
JPWO2016190263A1 (ja) * 2015-05-22 2018-04-12 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント
RU2729825C2 (ru) * 2015-05-22 2020-08-12 Астеллас Фарма Инк. Новый fab-фрагмент антитела к человеческому ngf
US11260124B2 (en) 2015-05-22 2022-03-01 Astellas Pharma Inc. Anti-human NGF antibody Fab fragment and methods for treating postoperative pain related to NGF
WO2017164349A1 (ja) 2016-03-25 2017-09-28 アステラス製薬株式会社 ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ'フラグメント含有医薬組成物
JPWO2017164349A1 (ja) * 2016-03-25 2019-02-07 アステラス製薬株式会社 ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント含有医薬組成物
JP2022023223A (ja) * 2016-03-25 2022-02-07 アステラス製薬株式会社 ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント含有医薬組成物
JP7215555B2 (ja) 2016-03-25 2023-01-31 アステラス製薬株式会社 ＰＥＧ化抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂ’フラグメント含有医薬組成物
WO2019221097A1 (ja) 2018-05-15 2019-11-21 アステラス製薬株式会社 抗ヒトｎｇｆ抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分とする心房細動の抑制用医薬組成物

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