WO2013007944A9 - Matériau pour synthèse supportée et procédé de croissance d'oligonucléotides ou de peptides - Google Patents

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Gabriel DE CROZALS
Carole FARRE
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Universite Claude Bernard Lyon I
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Definitions

  • the present invention relates to the technical field of materials adapted to carry out supported synthesis, and more specifically to
  • Nanoparticles of the order of 2-100 nm are more and more studied for imaging and diagnostic applications because they offer a very large surface area, the increase in
  • the surface of a sphere is proportional to the square of its radius. Moreover, for in vivo applications, the mechanisms of tissue diffusion and cell penetration of nanoparticles are different from those of larger objects that are rapidly eliminated by the body. For such applications, it is often necessary that these
  • Nanoparticles carry oligonucleotides or peptides.
  • the inventors of the present patent application have been interested in the problem of preparing nanoparticles as a support for carrying out supported synthesis requiring chain reactions, as is the case, in particular, for the synthesis of oligonucleotides or
  • the highest biomolecules obtained by coupling techniques are of the order of 0.01-0.05 oligonucleotides / nm 2 (Y. Cheng, T. Stakenborg, PV Dorpe, L. Lagae, Wang M., Chen H., Borghs G., Anal Chem, 83 (2011) 1307-1314).
  • the synthesis supported by an automaton is not currently possible on nanoparticles because this strategy requires confinement of the nanoparticles in closed synthesis cells by porous filters of the sintered or porous membrane type, which poses two problems. major. Firstly, the minimum pore size of the porous filters required for the solvents and synthetic reagents to pass into the synthesis cell without changing the pressure of the circuit in which the solvents and reagents circulate (generally from 4 to 6 bar maximum) is 2 to 4 pm. A smaller pore size for porous filters causes an increase in pressure leading to lower flow rates, clogging of surface support materials and therefore poor quality syntheses.
  • porous filter that is both resistant to organic solvents used in such syntheses (which are generally acetonitrile, dichloromethane, pyridine, tetrahydrofuran, ...) and which has pores below one micron.
  • NOM for Nano-on-Micro
  • the inventors have already proposed assemblies, named NOM (for Nano-on-Micro) consisting of silica particles of micrometric size (2 to 4 ⁇ m) and of spherical shape, covered by a monolayer of nanoparticles that offer a global size. greater than 4 ⁇ m, theoretically compatible with the synthesis strategy supported in PLC.
  • Syntheses of deoxyribonucleic acid (DNA) fragments have been successfully performed (Farre et al., L_angmuir, 2010, 26 (7), 4941-4950, C. Farre, M. Lansalot, R. Bazzi, S. Roux, CA Marquette, G. Catanante, L. J. Blum, N. Charvet, C. Louis, C. Chaix, Langmuir, (2010) 26 (7) 4941-4950).
  • the proposed NOMs do not overcome some of the difficulties.
  • the NOMs still too small, tend to clog the filters and not resuspend properly between the various synthesis steps.
  • the present invention provides a solution to overcome these disadvantages.
  • the invention relates to a material consisting of a porous support on which functionalized nanoparticles are grafted by covalent bonding and wherein at least a portion of the covalently grafted nanoparticles are housed inside the surface pores of the support.
  • This support is based on silica and is in the form of porous particles of heterogeneous shape and size, the size of the particles being greater than 1 ⁇ m, and preferably belonging to the range from 5 to 200 ⁇ m. These particles are preferably made of silica or a silicate. Particle size is defined as their largest size and can be measured using a scanning electron microscope or optical microscope.
  • the size of the heterogeneously shaped objects is defined as the length of the largest side of the object.
  • a non-spherical particle having a maximum length of 10 ⁇ m, a width and a depth (height) of up to 5 ⁇ m will be characterized by a size of 10 ⁇ m.
  • the subject of the present invention is also a process for the growth of oligonucleotides or peptides in which the growth is carried out on a material consisting of a porous support on which functionalized nanoparticles are grafted by a covalent bond, characterized in that at least one part of the covalently bonded nanoparticles are housed inside the surface pores of the support.
  • the support used corresponds to a support according to the invention.
  • a support is preferably a silica-based mineral glass.
  • An example of a silica-based support is a silicate-based support.
  • the support consists exclusively of silica or consists exclusively of a silicate in which the silica is mixed with another or other oxides such as B 2 O 3 to form borosilicates or Al 2 O 3 to form aluminosilicates, optionally in admixture with Na 2 O.
  • CPG Controlled Pore Glass
  • MH Caruthers in Science (1985) 18 (230), 281-285
  • Gelb LD Gelb LD
  • Gubbins KE Characterization of porous glasses: Simulation models, adsorption isotherms, and the Brunauer- Emmet-Teller analysis method, Langmuir (1998), 14, 2097-2111 and Lit. No. DS1007EN00 Rev. B on the Millipore site www.miHipore.com can be used as immobilization support for nanoparticles.
  • This material is moreover conventionally used for the supported synthesis of fragments of nucleic acids on automaton. It consists of small porous silica stones of very heterogeneous form. The pore size is, however, controlled.
  • GC GC disclosed in US 346,608 and US 3,549,524 by Koster H. et al. in Tetrahedron (1984) 40 (1), 103-112 or those proposed by Millipore.
  • Figure 2 shows photographs taken under a scanning electron microscope at different magnifications of a CPG support (Fluka-CPG 3000, Ref 27732).
  • the carrier used in the context of the invention is a polymer, such as a polystyrene-co-divinylbenzene or polypropylene-codivinylbenzene polymer.
  • the supports in mineral glass and, in particular, GPC are preferred, the polymer materials may present risks of swelling and therefore less control of their porosity.
  • Figure 1 is a schematic representation of a material according to the invention on which the support bears the reference 1, the nanoparticles reference 2 and the pores reference 3. The grafting of the nanoparticles within the pores of the support protects them from friction mechanical effects resulting from the passage of synthetic fluids and argon flows in the synthesis cells during the syntheses implemented.
  • the nanoparticles remain accessible because, although housed inside the pores of the support, they remain close to the surface of the support, in the pores located on the surface of the support, even if some have been able to penetrate more deeply into the mass of the support.
  • the so-called surface pores are visible on the surface of the support and form holes or openings on the surface of the support.
  • the cavities or channels corresponding to such pores are therefore accessible from the surface of the support.
  • the average minimum size of the surface openings formed by the surface pores of the support is at least 3 times equal, preferably 5 to 30 times equal, to the size. average nanoparticles. There remains thus, within the pores, still enough volume to perform the desired supported syntheses.
  • the average minimum size of the surface apertures formed by the surface pores is the arithmetic mean of 50 measurements of the smallest size of the apertures corresponding to the pores that are visible on a support image by scanning electron microscopy.
  • the arithmetic mean is thus calculated from measurements of the smallest size measured on a 50 pore plate visible on the surface of the support.
  • the average size of the nanoparticles corresponds to the arithmetic average of the largest size or the largest side of 50 nanoparticles measured by transmission electron microscopy, previously calibrated, after stalling said nanoparticles of the support by a specific treatment adapted to the cleavage of the covalent bond formed between the support and the nanoparticles as detailed in the following. For example, treatment with 1% ammonia solution is applied for the break of an ester bond.
  • nanoparticles After stalling the nanoparticles and neutralizing the residual ammonia with an acid, for example a solution of acetic acid, a few microliters (typically 1 to 5 ⁇ ) of nanoparticle solution are deposited and left to air dry on a grid suitable for observation by transmission electron microscopy (for example, a copper or nickel grid coated with Formvar (polyvinyl formalin), collodion (cellulose nitrate) or carbon or a collodion-carbon mixture).
  • a grid suitable for observation by transmission electron microscopy for example, a copper or nickel grid coated with Formvar (polyvinyl formalin), collodion (cellulose nitrate) or carbon or a collodion-carbon mixture.
  • the nanoparticles used are essentially spherical, that is to say that their shape does not deviate by more than 10% from a perfect sphere. It is also possible that the nanoparticles are in the form of nanotubes. In this case, their largest size
  • the support used has at least one of the following characteristics or any combination of these characteristics:
  • the average pore diameter of the support used is in the range from 30 to 600 nm, and preferably from 100 to 400 nm.
  • the average pore diameter of the support is measured according to the mercury intrusion method or the nitrogen adsorption technique according to ISO 15901 (Pore size distribution and porosity of solid materials by mercury porosimetry and by adsorption of gas), the mercury intrusion method being preferred.
  • the support has a homogeneous porosity corresponding to the fact that at least 80% of the pores have a diameter whose value does not vary by more than 10% with respect to the average pore diameter.
  • the support has a pore volume per gram of 0.5 to 2 ml / g
  • the support has a specific surface area in the range from 5 to 80 m 2 / g, which makes it possible to graft a large number of nanoparticles per unit area.
  • Specific surface area is defined as the BET specific surface area determined by nitrogen adsorption according to ASTM D 3663-78, based on the BRUNAUER-EMMETT-TELLER method described in the periodical "The Journal of the American Chemical Society, 60, 309 (1938)".
  • GICs are materials of choice to present all of these characteristics.
  • the nanoparticles covalently immobilized on the support and at least partly on the surface of the pores of the support, so as to be housed, preferably entirely, in the latter, have at least one of the following characteristics or any combination of these characteristics;
  • the nanoparticles have an average size in the range from 2 to 100 nm
  • the nanoparticles are nanoparticles of silica, gold, silver, graphite, fluorescent nanocrystals (also called quantum dots), polystyrene, polypropylene or polybutadiene type polymer nanoparticles, or nanoparticles of metal oxide, in particular tin oxide, gadolinium, aluminum, titanium, cerium, erbium niobium, ytterbium, terbium, dysprosium, europium, or a mixture of these oxides, possibly coated to allow their functionalization,
  • the grafted nanoparticles are directly linked by covalent bonding to the support, ie without an intermediate nanoparticle providing said bond,
  • the nanoparticles are functionalized by reactive functions selected from alcohols, amines and thiols for the growth of oligonucleotides or peptides.
  • the nanoparticles carry hydrocarbon arms which may comprise one or more heteroatoms, in particular chosen from N and O, and terminating in -OH, NH 2 or SH respectively.
  • the nanoparticles are functionalized with free hydrophilic organic molecules, for example chosen from polyethylene glycol, polyethylamine, or by fluorescent organic molecules such as fluorescein, rhodamine, cyanines, the nanoparticles are functionalised, by covalent bonding, with biological ligands chosen from peptides and oligonucleotides.
  • the material according to the invention comprises a high density of biological ligands grafted on the surface of the nanoparticles corresponding to more than 0.1 molecule of biological ligand per nm 2 of nanoparticles. But some applications may require a lower grafting rate.
  • the degree of grafting may be less important, for example by decreasing the incorporation efficiency of the first peptide or nucleotide monomer, during the synthesis of the biomolecule.
  • the nanoparticles carrying biological ligands obtained are, in most cases, dissymmetrical, so that at least 90% of the biological ligands are grafted onto a substrate. continuous zone representing less than 70% of the surface of the nanoparticle on which they are grafted.
  • the materials according to the invention will combine the characteristics mentioned below or in the rest of the description for the support and those mentioned below or in the rest of the description for the nanoparticles.
  • the nanoparticles are grafted onto the support by a cleavable bond under mild conditions, for example by an ester bond, an alkoxysilyl bond, a disulfide bond, the 4- (2) acid linkage. -hydroxyethyl) -3-nitrobenzoic acid, the N- [9- (hydroxymethyl) -2-fluorenyl] succinamic acid linkage, the thiophosphoramidatehydroxypropyl linkage or a 2-propane diol activated amide linkage.
  • bonds are stable under the conditions subsequently implemented during supported syntheses of oligonucleotides or peptides in particular and may then be cleaved under mild conditions, that is to say under conditions that will not alter the molecules grafted on the surface of the nanoparticles and will not cut the covalent bonds existing between the latter and the nanoparticles.
  • the molecules of interest and in particular the biological ligands are grafted to the nanoparticles by a covalent bond resulting from the coupling of the first phosphoramidite nucleoside in the case of oligonucleotide synthesis on the reactive functions present on the surface of the nanoparticles, and in particular of the amine, thiol or alcohol type.
  • the covalent bond resulting from this coupling corresponds to a phophoramidate diester or a phosphorothioate diester or a phosphate diester.
  • This covalent coupling between the nanoparticles and the molecules which are grafted therein (and in particular the biological ligands) does not use the same type of binding as those used to bind the nanoparticles to the support.
  • the grafting of the nanoparticles on the support in particular of the CPG type, can be carried out via an ester bond which is cleavable in a basic medium.
  • the nanoparticles will be functionalized by alcohol arms with a hydroxylterminal function and the support with acid functions.
  • the covalent bond between the nanoparticles and the support may be obtained by coupling between an arm with an acid terminal function, located on the support, chosen from: - (CH 2) n -NH- CO- (CH 2) m-COOH, - (CH 2) n -COOH, - (CH 2) n -NH- (CH 2) m -COOH, with n an integer belonging to the range from 2 to 18 and m an integer in the range of 2 to 6,
  • nanoparticles chosen from:
  • the arms present on the nanoparticles do not all react with the arms present on the support to form an ester bond, it nanoparticles of the free arms which can react with the peptide or oligonucleotide monomers used subsequently to carry out peptide and oligonucleotide syntheses remain on the surface.
  • silica nanoparticles For the modification and Functionalization of silica nanoparticles can be found in the reviews of Oh, S. X, Hong, B. X, Choi, KY and Park JW Surface modification for DNA and protein microarrays, OMICS, Journal of Integrative Biology, 2006, 10 , 327; Trewyn, BG, Slowing, II, Giri, S., Chen, H.-T., Lin, VS-Y.
  • the -OH reactive functions used will not correspond to the silanol functions directly present on the surface of the silica nanoparticles or obtained after activation, for example by an acid or a base, the latter not allowing, thereafter, to have sufficiently stable bonds with the biomolecules of interest, of the peptide or oligonucleotide type in particular.
  • these silanol functions will be modified by reaction with an alkoxysilane group carrying a terminal-OH function which will itself be coupled to a nucleoside phosphoramidite to form a stable diester phosphate link.
  • the terminal -OH functions of the nanoparticles will be modified to -NH 2 functions by reaction of an amino alkyl phosphoramidite C3, C6, C12 or others, as sold by Glen Research (Sterling, Virginia, USA). These -NH 2 functions will allow the peptide synthesis to be initiated by reaction of a reactive amino acid to form a peptide bond (-NH-CO).
  • GPCs already functionalized with carboxylic acid or amine functions are, for example, marketed by PureBiotech LLC (752A Lincoln BI.Middlesex, NJ 08846).
  • LCAA-GCG Long Chain Alkylamine Controlled Pore Glass
  • Mellipore 290 Concord Road, Billerica, MA 01821
  • the LCAA-CPG is functionalized with amine functions that can be converted into a carboxylic acid function, for example by reaction with succinic anhydride.
  • the solvent used during the grafting of the nanoparticles on the support will be a solvent in which the nanoparticles are stable, that is to say not aggregated.
  • a solvent in which the nanoparticles are stable, that is to say not aggregated.
  • DMF dimethylformamide
  • silica nanoparticles dimethylformamide (DMF) may, for example, be used.
  • the grafting of the nanoparticles takes place both inside the pores and near the surface of the support. But in the context of the invention, the interest lies in the fact that at least a portion of the particles is grafted covalently inside the surface pores of the support while remaining accessible, and will thus be protected by following, when the particles will be subjected to mechanical stresses, thus avoiding their stall.
  • the nanoparticles are grafted onto the support, only a part of their surface will be accessible and will be able to be covalently linked with the desired peptides or oligonucleotides.
  • the nanoparticles obtained are dissymmetrical, with at least 90% of the biological ligands grafted onto a continuous zone representing less than 70% of the surface of the nanoparticle on which they are grafted.
  • the material according to the invention is therefore perfectly suitable for carrying out supported syntheses of oligonucleotides or peptides in particular.
  • the main interest of the supported synthesis is that it makes it possible to graft on the surface of an object, functional blocks from a basic support, according to demand and custom.
  • Another interest of the supported synthesis is the perfect control of the orientation of the grafted biomolecules.
  • the subject of the invention is also a process for the growth of oligonucleotides or peptides in which the growth is carried out on a material consisting of a porous support on which functionalized nanoparticles are grafted by a covalent bond, characterized in that at least a portion of the covalently bonded nanoparticles are housed within the surface pores of the support.
  • a material consisting of a porous support on which functionalized nanoparticles are grafted by a covalent bond characterized in that at least a portion of the covalently bonded nanoparticles are housed within the surface pores of the support.
  • such growth is achieved in an automated synthesizer in which the support is confined in a cell by means of a filter through which flows of argon and reagents flow alternately.
  • the covalent bond between the support and the nanoparticles is cleaved.
  • the cleavage can be carried out in a basic medium, for example in a solution of 1% NH 4 OH, at 60 ° C.
  • a basic medium for example in a solution of 1% NH 4 OH, at 60 ° C.
  • oligonucleotide denotes a sequence of at least 2 nucleotides (deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or both), natural or modified, capable of hybridizing, under appropriate hybridization conditions, with an at least partially complementary oligonucleotide.
  • nucleotide is meant an organic compound consisting of a purine base or pyrimidine bound to an ose (ribose or deoxyribose) and a phosphate group.
  • modified nucleotide is meant, for example, a nucleotide comprising a modified base and / or comprising a modification at the level of the internucleotide link and / or at the level of the backbone.
  • a modified base mention may be made of inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine and bromo-5-deoxyuridine.
  • modified internucleotide linkage mention may be made of phosphorothioate, N-alkylphosphoramidate, alkylphosphonate and alkylphosphoric ester linkages.
  • Alpha-oligonucleotides such as those described in FR-A-2 607 507 and the PNAs which are the subject of the article by M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114, 1895-1897, are examples of oligonucleotides consisting of nucleotides whose backbone is modified.
  • peptide means especially any sequence of at least two amino acids, such as protein, protein fragment, oligopeptide which has been extracted, separated, isolated or synthesized, as a peptide obtained by chemical synthesis or by expression in a recombinant organism.
  • nanoparticles functionalized with peptides or oligonucleotides can serve as markers or tracers, in particular in vivo applications.
  • nanoparticles obtained can be fluorescent, radioactive, conductive, magnetic, can serve as MRI contrast agents, ...
  • the GC used is CPG 3000 (Fluka-Ref 27732).
  • the average pore diameter given by the supplier is about 300 nm ⁇ 75 nm, which corresponds to a standard deviation of 25%.
  • the step of activating the CPG surface makes it possible to functionalize the CPG support with silanol groups (SiOH) that are reactive with respect to the arm and that will allow the nanoparticles to stick.
  • the activated GC obtained in paragraph 1) (2 g) is suspended in 15 ml of a 10% (v / v) aqueous solution of aminopropyltriethoxysilane (APTES) adjusted to pH 4 with hydrochloric acid.
  • the suspension is heated at 70 ° C. with rotary stirring for 2.5 hours.
  • the GC is heated in an oven at 120 ° C for 16 hours in a ceramic crucible.
  • the GC is then filtered and washed with acetone and dried in the open air.
  • the silica nanoparticles used are supplied by Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). These particles are heart-crown type, the fluorophore being incorporated into the heart as described in the Burns article for cyanine (AA Burns, J. Vider, H. Ow, E. Herz, 0. Penate-Medina, M. Baumgart, SM Larson, U. Wiesner, M. Bradbury, Fluorescent silicananoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine, Nano Letters (2009) 9 (1), 442-448).
  • the CPG prepared in paragraph 3 is suspended in anhydrous acetonitrile in the presence of 0- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate (HBTU), dimethylaminopyridine (DMAP) and triethylamine.
  • HBTU 0- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate
  • DMAP dimethylaminopyridine
  • triethylamine triethylamine
  • the GC obtained in paragraph 5 is suspended in anhydrous DMF and then the nanoparticle solution obtained in section 5.2 is added dropwise. The suspension is stirred at ambient temperature for 16 hours. The GC obtained is filtered and then washed with DMF and acetonitrile and dried in the open air. The entire process implemented is illustrated in Figure 4.
  • the carboxylic acids activated by the HBTU / DMAP mixture which have not reacted with the hydroxyl functions of the nanoparticles are blocked (capped) by the action of piperidine, in order to avoid the initiation of parasitic oligonucleotide syntheses on the surface of the CPG .
  • CPG is suspended in piperidine and the reaction medium is stirred at room temperature for several days.
  • nanoparticle-CPG support 30 mg is introduced into a synthesis column installed on an ABI 394 automated synthesizer (AppliedBiosystems).
  • the sequence of the oligodeoxyribonucleotide is: 5'-ATC TCG GGA ATC TCA ATG TTA GT -3 '
  • Oligodeoxyribonucleotide synthesis is performed with the Ipmole standard program using the iPr-Pac-dG, Ac-dC, Pac-dA and dT phosphoramidites (Glen Research).
  • the activator used is tetrazole for a coupling time of 60 s.
  • the average coupling yield per cycle is 97.5%.
  • Figure 5 shows scanning electron micrographs of the GC support; (A) before grafting the nanoparticles, (B) after grafting of the nanoparticles, (C) and (D) after synthesis of the oligonucleotides on the nanoparticles. The location of the nanoparticles in the pores of the support is well highlighted.
  • the synthesis of the oligoribonucleotide is carried out with the standard lpmole RNA program.
  • the coupling step is carried out with benzylthiotetrazole (Glen Research), with a coupling time of 240 s.
  • Phosphoramidites 2'-O-methylpurines and 2'-fluoropyrimidines are used.
  • the average coupling yield per cycle is 98.9%. 9.
  • the oligonucleotides obtained in section 7 or 8 are deprotected with a solution of 0.05M potassium carbonate in methanol at room temperature for a minimum of 6 hours.
  • the nanoparticles are then detached from the support by the action of 1% aqueous ammonia (500 ⁇ l per 30 mg of support) at 60 ° C. After 15 to 30 minutes, the nanoparticles are released in solution. The supernatant solution is then removed, the ammonia is neutralized by addition of a 0.05M acetic acid solution until a neutral solution (pH 7) is obtained.
  • a neutral solution pH 7
  • the number of nanoparticles present in the solution is estimated by measurement of fluorescence emission, the nanoparticles used having fluorophores (rhodamine or fluorescein) encapsulated in the silica core.
  • the number of oligonucleotides on the surface of each particle is evaluated by measuring UV absorbance at 260 nm. The recovery is estimated between 1000 and 5000 oligos per particle, which corresponds to 0.2 to 1 (if one takes into account half of the surface of a particle of 60 nm in diameter) oligonucleotides per nm 2 of nanoparticles. Finally, excellent stability of oligonucleotide-bearing nanoparticles was observed in PBS buffer and in water. No aggregation of the particles is observed after several weeks in suspension. The high density of biomolecules present on the surface stabilizes the nanoobjects obtained in solution.
  • conjugates obtained in paragraphs 8 and 9 have been shown to be active for targeting the corresponding biological targets (respectively, hepatitis B virus DNA and MMP-9 protein).

Abstract

L'invention concerne un matériau constitué d'un support poreux sur lequel des nanoparticules fonctionnalisées sont greffées par liaison covalente caractérisé en ce qu'au moins une partie des nanoparticules greffées par liaison covalente sont logées à l'intérieur des pores de surface du support et en ce que le support est à base de silice et se présente sous la forme de particules poreuses de forme et de taille hétérogènes, la taille des particules étant supérieure à 1 μm, et étant de préférence située dans la gamme allant de 5 à 200 μm. L'invention a également pour objet un procédé de croissance d'oligonucléotides ou de peptides caractérisé en ce que la croissance est réalisée sur un matériau constitué d'un support poreux sur lequel des nanoparticules fonctionnalisées sont greffées par liaison covalente caractérisé en ce qu'au moins une partie des nanoparticules greffées par liaison covalente sont logées à l'intérieur des pores de surface du support.

Description

MATERIAU POUR SYNTHESE SUPPORTEE ET PROCEDE DE CROISSANCE D ' OLIGONUCLEOTIDES OU DE PEPTIDES
La présente invention concerne le domaine technique des matériaux adaptés pour réaliser de la synthèse supportée, et plus précisément des
5 matériaux adaptés pour servir de support de synthèse, dans des synthétiseurs automatisés, pour des oligonucléotides ou des peptides.
Les nanoparticules de taille de l'ordre de 2-100 nm, notamment, sont de plus en plus étudiées pour des applications en imagerie et en diagnostic car elles offrent une très grande surface spécifique, l'augmentation de la
10 surface d'une sphère est proportionnelle au carré de son rayon. De plus, pour des applications in vivo, les mécanismes de diffusion dans les tissus et de pénétration dans les cellules des nanoparticules sont différents de ceux d'objets de taille plus importante qui sont rapidement éliminés par l'organisme. Pour de telles applications, il est souvent nécessaire que ces
15 nanoparticules soient porteuses d'oligonucléotides ou de peptides. Dans ce contexte, les inventeurs de la présente demande de brevet se sont intéressés à la problématique de préparer des nanoparticules en tant que support pour réaliser de la synthèse supportée requérant des réactions en chaîne, comme c'est le cas, en particulier, pour la synthèse d'oligonucléotides ou de
20 peptides.
Il est difficile de coupler des peptides ou oligonucléotides sur des nanoparticules car ces dernières sont difficiles à culotter au fond d'un tube (par centrifugation). Leur remise en solution est aussi très délicate et peut poser des problèmes d'agrégation irréversible. De plus, les conformations (ou
25 structures tri-dimentionnelles) que prennent les biomolécules en solution provoquent fréquemment un fort encombrement stérique autour des fonctions réactives nécessaires au greffage sur les nanoparticules. De ce fait, les rendements de couplage des biomolécules sur des objets de taille nanométrique sont faibles. Dans la littérature, les densités de greffage de
30 biomolécules les plus élevées obtenues par des techniques de couplage sont de l'ordre de 0,01-0,05 oligonucléotides/nm2 (Y. Cheng, T. Stakenborg, P.V. Dorpe, L. Lagae, M. Wang, H. Chen, G. Borghs, Anal Chem, 83 (2011) 1307- 1314).
De plus, la synthèse supportée en automate n'est pas envisageable à l'heure actuelle sur des nanoparticules car cette stratégie requiert un confinement des nanoparticules dans des cellules de synthèse fermées par des filtres poreux du type frittés ou membranes poreuses ce qui pose deux problèmes majeurs. Tout d'abord, la taille minimale des pores des filtres poreux requise pour que les solvants et réactifs de synthèse puissent passer dans la cellule de synthèse sans modifier la pression du circuit dans lequel les solvants et réactifs circulent (en général de 4 à 6 bars maximum) est de 2 à 4 pm. Une taille de pore plus petite pour les filtres poreux engendre une augmentation de la pression conduisant à des débits plus faibles, à des colmatages des matériaux support en surface et donc à des synthèses de mauvaise qualité. Ensuite, il n'existe pas de filtre poreux qui soit, à la fois, résistant aux solvants organiques utilisés dans de telles synthèses (qui sont en général de l'acétonitrile, du dichlorométhane, de la pyridine, du tétrahydrofurane, ...) et qui présente des pores inférieurs au micron.
Pour tenter de répondre à cette problématique, certains des inventeurs de la présente demande de brevet ont proposé de confiner les nanoparticules en les immobilisant temporairement sur des microparticules de silice. Ainsi, les inventeurs ont déjà proposé des assemblages, nommés NOM (pour Nano-on-Micro) constitués de particules de silice de taille micrométrique (2 à 4 pm) et de forme sphérique, recouvertes par une monocouche de nanoparticules qui offrent une taille globale supérieure à 4 pm, taille théoriquement compatible avec la stratégie de synthèse supportée en automate. Des synthèses de fragments d'acides désoxyribonucléiques (ADN) ont été effectuées avec succès (Farre et 3/.,l_angmuir, 2010, 26(7), 4941-4950, C. Farre, M. Lansalot, R. Bazzi, S. Roux, C.A. Marquette, G. Catanante, LJ. Blum, N. Charvet, C. Louis, C. Chaix, Langmuir, (2010) 26(7) 4941-4950).
Néanmoins, les NOM proposées ne permettent pas de surmonter certaines des difficultés. Tout d'abord, les NOM, de taille encore trop petite, ont tendance à colmater les filtres et à ne pas se remettre en suspension correctement, entre les différentes étapes de synthèse. De plus, les frottements mécaniques exercés sur les NOM, par les flux d'argon et le passage des différents réactifs et solvants utilisés lors des synthèses (qui agitent fortement les particules), entraînent le décrochage d'un grand nombre de nanoparticules, au cours de la synthèse. Il a ainsi été observé, par certains des inventeurs, une perte des nanoparticules au cours de la synthèse, ainsi qu'une mauvaise qualité des synthèses oligonucléotidiques effectuées sur les nanoparticules.
La présente invention propose une solution permettant de pallier à ces inconvénients. L'invention concerne un matériau constitué d'un support poreux sur lequel des nanoparticules fonctionnalisées sont greffées par liaison covalente et dans lequel au moins une partie des nanoparticules greffées par liaison covalente sont logées à l'intérieur des pores de surface du support. Ce support est à base de silice et se présente sous la forme de particules poreuses de forme et de taille hétérogènes, la taille des particules étant supérieure à 1 pm, et de préférence appartenant à la gamme allant de 5 à 200 pm. Ces particules sont, de préférence, constituées de silice ou d'un silicate. La taille des particules est définie comme leur plus grande taille et pourra être mesurée grâce à un microscope électronique à balayage ou un microscope optique. La taille des objets de forme hétérogène est définie comme la longueur du côté le plus grand de l'objet. Par exemple, une particule non sphérique ayant une longueur maximale de 10 pm, une largeur et une profondeur (hauteur) maximales de 5 pm sera caractérisée par une taille de 10 pm.
La présente invention a également pour objet un procédé de croissance d'oligonucléotides ou de peptides dans lequel la croissance est réalisée sur un matériau constitué d'un support poreux sur lequel des nanoparticules fonctionnalisées sont greffées par liaison covalente caractérisé en ce qu'au moins une partie des nanoparticules greffées par liaison covalente sont logées à l'intérieur des pores de surface du support. De manière privilégiée le support utilisé correspond à un support selon l'invention. Un tel support est, de préférence un verre minéral à base de silice. Un exemple de support à base de silice correspond à un support à base de silicate. En particulier, le support est constitué exclusivement de silice ou est constitué exclusivement d'un silicate dans lequel la silice est en mélange avec un autre ou d'autres oxydes tels B203 pour former des borosilicates ou Al203 pour former des aluminosilicates, éventuellement en mélange avec Na20.
Un matériau de verre à porosité contrôlée, nommé CPG (de l'anglais « Controlled Pore Glass ») et notamment décrit dans Masad J. Damha et al. dans Nucl. Acids Res. (1990)18(13), 3813-3821, MH Caruthers, dans Science (1985) 18 (230), 281-285, Gelb L. D., Gubbins K. E., Characterization of porous glasses : Simulation models, adsorption isotherms, and the Brunauer-Emmet-Teller analysis method, Langmuir (1998), 14, 2097-2111 et Lit. N°DS1007EN00 Rev. B sur le site Millipore www.miHipore.com peut être utilisé comme support d'immobilisation des nanoparticules. Ce matériau est d'ailleurs utilisé classiquement pour la synthèse supportée de fragments d'acides nucléiques sur automate. Il est constitué de petits cailloux poreux de silice de forme très hétérogène. La taille des pores est, par contre, contrôlée. Il est, par exemple possible d'utiliser la CPG décrite dans les documents US 346,608 et US 3,549,524, par Kôster H. et al. dans Tetrahedron (1984) 40 (1), 103-112 ou celles proposées par la société Millipore. La Figure 2 présente des photographies prises au microscope électronique à balayage à différents grossissements d'un support CPG (Fluka-CPG 3000, Réf 27732).
Il peut également être envisagé que le support utilisé dans le cadre de l'invention soit en un polymère, tel qu'en un polymère polystyrène- co- divinylbenzène ou polypropylène-codivinylbenzène. Néanmoins, les supports en verre minéral et, en particulier, en CPG sont préférés, les matériaux polymères pouvant présenter des risques de gonflement et donc une moins bonne maîtrise de leur porosité. La Figure 1 est une représentation schématique d'un matériau selon l'invention sur laquelle le support porte la référence 1, les nanoparticules la référence 2 et les pores la référence 3. Le greffage des nanoparticules au sein des pores du support les protège des frottements mécaniques résultant du passage des fluides de synthèse et des flux d'argon dans les cellules de synthèse lors des synthèses mises en œuvre. Néanmoins, les nanoparticules restent accessibles, car bien que logées à l'intérieur des pores du support, elles restent à proximité de la surface du support, dans les pores situées en surface du support, même si certaines ont pu pénétrer plus en profondeur dans la masse du support. Les pores dits de surface sont visibles en surface du support et forment des trous ou ouvertures en surface du support. Les cavités ou canaux correspondant à de tels pores sont donc accessibles à partir de la surface du support.
De façon avantageuse, et ce quels que soient le support et les nanoparticules utilisés, la taille minimale moyenne des ouvertures de surface formées par les pores de surface du support est au moins 3 fois égale, de préférence 5 à 30 fois égale, à la taille moyenne des nanoparticules. Il reste ainsi, au sein des pores, encore suffisamment de volume pour effectuer les synthèses supportées souhaitées.
Par taille minimale moyenne des ouvertures de surface formées par les pores de surface, on entend la moyenne arithmétique de 50 mesures de la plus petite taille des ouvertures de surface correspondant aux pores qui sont visibles sur un cliché du support par microscopie électronique à balayage. La moyenne arithmétique est donc calculée à partir des mesures de la plus petite taille mesurée sur un cliché de 50 pores visibles en surface du support.
La taille moyenne des nanoparticules correspond à la moyenne arithmétique de la plus grande taille ou du plus grand côté de 50 nanoparticules mesurée par microscopie électronique à transmission, préalablement étalonnée, après décrochage des dites nanoparticules du support par un traitement spécifique adapté au clivage du lien covalent formé entre le support et les nanoparticules comme détaillé dans la suite. Par exemple, un traitement par une solution d'ammoniaque à 1% est appliqué pour la coupure d'un lien ester. Après décrochage des nanoparticules et neutralisation de l'ammoniaque résiduelle par un acide, par exemple une solution d'acide acétique, quelques microlitres (typiquement 1 à 5 μΙ_) de solution de nanoparticules sont déposés et laissées séchés à l'air libre sur une grille adaptée à l'observation en microscopie électronique par transmission (par exemple, une grille de cuivre ou de nickel recouverte de Formvar (polyvinyl formol), de collodion (nitrate de cellulose) ou de carbone ou d'un mélange collodion-carbone). Le plus souvent, les nanoparticules utilisées sont essentiellement sphériques, c'est-à-dire que leur forme ne dévie pas de plus de 10% d'une sphère parfaite. Il est également possible que les nanoparticules soient sous la forme de nanotubes. Dans ce cas, leur plus grande taille correspond à leur longueur.
De façon avantageuse, le support utilisé présente au moins une des caractéristiques suivantes ou une quelconque combinaison de ces caractéristiques :
-le diamètre moyen des pores du support utilisé appartient à la gamme allant de 30 à 600 nm, et de préférence à la gamme allant de 100 à 400 nm. Le diamètre moyen des pores du support est mesuré selon la méthode d'intrusion de mercure ou la technique d'adsorption d'azote selon la norme ISO 15901 (Distribution des dimensions des pores et porosité des matériaux solides par porosimétrie au mercure et par adsorption de gaz), la méthode d'intrusion de mercure étant préférée.
-le support présente une porosité homogène correspondant au fait qu'au moins 80% des pores ont un diamètre dont la valeur ne varie pas de plus de 10% par rapport au diamètre moyen des pores.
- le support présente un volume de pores par gramme de 0,5 à 2 mL/g,
- le support présente une surface spécifique appartenant à la gamme allant de 5 à 80 m2/g, ce qui permet de greffer un nombre important de nanoparticules par unité de surface.
On entend par surface spécifique, la surface spécifique B. E. T. déterminée par adsorption d'azote conformément à la norme ASTM D 3663- 78 établie à partir de la méthode BRUNAUER-EMMETT-TELLER décrite dans le périodique "The Journal of the American Chemical Society, 60, 309 (1938)".
Les CPG, telles que précédemment définies, sont des matériaux de choix pour présenter l'ensemble de ces caractéristiques.
De façon avantageuse, les nanoparticules immobilisées par liaison covalente sur le support et au moins pour partie sur la surface des pores du support, de manière à être logées, de préférence entièrement, dans ces dernières, présentent au moins une des caractéristiques suivantes ou une quelconque combinaison de ces caractéristiques ;
- les nanoparticules ont une taille moyenne appartenant à la gamme allant de 2 à 100 nm,
- les nanoparticules sont des nanoparticules de silice, d'or, d'argent, de graphite, des nanocristaux fluorescents (également nommés quantum dots), des nanoparticules de polymère du type polystyrène, polypropylène ou polybutadiène, ou des nanoparticules d'oxyde métallique, notamment d'oxyde d'étain, de gadolinium, d'aluminium, de titane, de cérium, de niobium d'erbium, d'ytterbium, de terbium, de dysprosium, d'europium, ou d'un mélange de ces oxydes, éventuellement enrobées pour permettre leur fonctionnalisation,
- au moins 80%, et de préférence au moins 90% des nanoparticules greffées sont directement liées par liaison covalente au support, c'est à dire sans nanoparticule intermédiaire assurant ladite liaison,
- les nanoparticules sont fonctionnalisées par des fonctions réactives choisies parmi les alcools, les aminés et les thiols permettant la croissance d'oligonucléotides ou de peptides. On entend par là que les nanoparticules sont porteuses de bras hydrocarbonés pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, notamment choisis parmi N et O, et se terminant par une fonction -OH, NH2 ou SH respectivement.
- les nanoparticules sont fonctionnalisées avec des molécules organiques hydrophiles libres, par exemple choisies parmi le polyéthylène glycol, le polyéthylamine, ... ou par des molécules organiques fluorescentes telles que la fluorescéine, la rhodamine, les cyanines, - les nanoparticules sont fonctionnalisées, par liaison covalente, avec des ligands biologiques choisis parmi les peptides et les oligonucléotides. Selon un mode de réalisation particulier, le matériau selon l'invention comporte une densité importante de ligands biologiques greffés en surface des nanoparticules correspondant à plus de 0,1 molécule de ligand biologique par nm2 de nanoparticules. Mais certaines applications peuvent nécessiter un taux de greffage moins élevé. Dans ce cas, le taux de greffage pourra être moins important, par exemple en diminuant les rendements d'incorporation du premier monomère peptidique ou nucléotidique, lors de la synthèse de la biomolécule. Compte tenu du fait que les nanoparticules lors de la croissance des ligands biologiques sont fixées sur un support, les nanoparticules porteuses de ligands biologiques obtenues sont, le plus souvent, dissymétriques, de sorte qu'au moins 90% des ligands biologiques sont greffés sur une zone continue représentant moins de 70% de la surface de la nanoparticule sur laquelle ils sont greffés.
De manière préférée, les matériaux selon l'invention combineront les caractéristiques mentionnées ci-dessous ou dans le reste de la description pour le support et celles mentionnées ci-dessous ou dans le reste de la description pour les nanoparticules.
Selon des modes de réalisation préférés pouvant être combinés aux précédents, les nanoparticules sont greffées sur le support par un lien clivable dans des conditions douces, par exemple par un lien ester, un lien alkoxysilyl, un pont disulfure, le lien acide 4-(2-hydroxyéthyl)-3- nitrobenzoïque, le lien acide N-[9-(hydroxyméthyl)-2-fluorényl]succinamique, le lien thiophosphoramidatehydroxypropyl ou un lien amide activé par un groupement 2-propane diol. De tels liens sont stables dans les conditions mises en œuvre par la suite lors de synthèses supportées d'oligonucléotides ou de peptides notamment et pourront être clivés ensuite dans des conditions douces, c'est-à-dire dans des conditions qui n'altéreront pas les molécules greffées en surface des nanoparticules et ne couperont pas les liaisons covalentes existant entre ces dernières et les nanoparticules. Les molécules d'intérêt et notamment les ligands biologiques sont greffés aux nanoparticules par un lien covalent résultant du couplage du premier nucléoside phosphoramidite dans le cas de la synthèse oligonucléotidique sur les fonctions réactives présentes en surface des nanoparticules, et notamment du type aminé, thiol ou alcool. Le lien covalent résultant de ce couplage correspond à un phophoramidate diester ou un phosphorothioate diester ou un phosphate diester. Ce couplage covalent entre les nanoparticules et les molécules qui y sont greffées (et en particulier les ligands biologiques) ne met pas en œuvre le même type de liaison que celles utilisées pour lier les nanoparticules au support.
En particulier, le greffage des nanoparticules sur le support notamment du type CPG peut être effectué via un lien ester qui est clivable en milieu basique. Pour cela, les nanoparticules seront fonctionnalisées par des bras alcool avec une fonction hydroxylterminal et le support avec des fonctions acides.
En particulier, dans le cadre de l'invention, la liaison covalente entre les nanoparticules et le support pourra être obtenue par couplage entre un bras avec une fonction terminale acide, situé sur le support, choisi parmi :- (CH2)n-NH-CO-(CH2)m-COOH, -(CH2)n-COOH, -(CH2)n-NH-(CH2)m-COOH, avec n un entier appartenant à l'intervalle allant de 2 à 18 et m un entier appartenant à l'intervalle allant de 2 à 6,
et un bras avec une fonction terminale alcool, situé sur les nanoparticules, choisi parmi :
-(CH2)q-NH-CO-NH-(CH2)r-OH, -(CH2)s-OH, -(CH2)q-0-[(CH2)2-0]p-H et -(CH2)q-CONH-(CH2)r-OH, - (CH2)q-NH-(CH2)r-OH, -(CH2)q-CHOH-CH2- NH-(CH2)p-OH, -(CH2)q-[CH-(CH20H)]-NH-(CH2)p-OH , - (CH2)q-CHOH- CH2-0-(CH2)p-OH, -(CH2)q-[CH-(CH20H)]-0-(CH2)p-OH, -(CH2)q-CHOH- CH2-0-CO-NH-(CH2)p-OH
avec s un entier appartenant à l'intervalle allant 2 à 18, p un entier appartenant à l'intervalle allant 1 à 6, q un entier appartenant à l'intervalle allant 1 à 12, et r un entier appartenant à l'intervalle allant 1 à 12.
Etant donné que les bras présents sur les nanoparticules ne réagissent pas tous avec les bras présents sur le support pour former un lien ester, il reste en surface des nanoparticules des bras libres qui pourront réagir avec les monomères peptidiques ou oligonucléotidiques utilisés ensuite pour réaliser des synthèses peptidiques et oligonucléotidiques.
D'autres types de liens clivables dans des conditions douces peuvent également être envisagés :
- un lien alkoxysilyl résultant de la réaction d'un bras alcool sur des fonctions OH présentes en surface du support (notamment des silanols dans le cas des CPG) et qui se coupent dans des conditions basiques (Farre, C. et al., Langmuir, 2010, 26(7), 4941-4950),
- un lien oxalyl résultant de la réaction de l'acide oxalique et d'un bras alcool et qui se coupe en milieu basique (Pon, R. et Yu S., Nucl. Acids Res., 1997, 25, 18, 3629- 3635),
- un pont disulfure ou encore lien disulfide résultant de la réaction de deux fonctions thiol et qui se coupe en milieu réducteur (DTT) (Asseline, U. et al., Tetrahedron, 1992, 48, 1233-1254.),
- un lien thiophosphoramidatehydroxypropyl résultant d'une réaction entre une fonction aminé et un groupement hydroxypropylphosphoramidite suivie d'une oxydation du phosphite formé par un soufre et qui se coupe à 90°C dans des conditions neutres (Grajkowski, A. et al.,Bioconjugate, Chem. 2008, 19, 1696-1706),
- un lien amide activée par un groupement 2-propane diol qui se coupe dans des conditions basiques (Réf: Azhayev, A. V. et al., Tetrahedron, 2001, 57, 4977-4986).
Pour la modification et la fonctionnalisation des supports, on pourra se référer à Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Volume 1, Editors : S. L. Beaucage, D. E. Bergstrom, G. D. Glick, R. A. Jones, John Wiley & Sons, Inc., 2004. Pour la synthèse de nanoparticules de silice, on pourra se référer à l'article de Zou H., Wu S. and Shen J., Polymer/silica nanocomposites : préparation, characterization, properties and applications, Chem. Rev. (2008), 108(9), 3893-3957 et au livre de Bergna, Η.,Ε. et Roberts, W.O., Colloïdal silica fundamentals and applications, Surfactant Science Séries, Vol. 131, Taylor & Francis, CRC Press Book, 2006. Pour la modification et la fonctionnalisation des nanoparticules de silice, on pourra se référer aux revues de Oh, S. X, Hong, B. X, Choi, K. Y. and Park J. W. Surface modification for DNA and protein microarrays, OMICS, A journal of Integrative Biology, 2006, 10, 327; Trewyn, B. G., Slowing, I. I., Giri, S., Chen, H. -T., Lin, V. S. -Y. synthesis and functionalization of a mesoporous silica nanoparticle based on the sol-gel process and applications in controlled release, Acc. Chem. Res., 2007, 40, 846-853 ; et pour la fonctionnalisation de particules de métal ou d'oxyde de métal à la revue de Neouze, M. -A., Schubert, U., Surface modification and functionalization of métal and metaloxide nanoparticles by organic ligands, Monatsh, Chem., 2008, 139, 183-195. En particulier, dans le cas où les nanoparticules sont des nanoparticules de silice, les fonctions réactives -OH utilisées ne correspondront pas aux fonctions silanols directement présentes en surface des nanoparticules de silice ou obtenues après activation par exemple par un acide ou une base, ces dernières ne permettant pas, par la suite, d'avoir des liaisons suffisamment stables avec les biomolécules d'intérêt, de type peptide ou oligonucléotides notamment. Dans le cas de la synthèse oligonucléotidique, ces fonctions silanols seront modifiées par réaction avec un groupement alcoxysilane porteur d'une fonction-OH terminale qui sera elle-même couplée à un nucléoside phosphoramidite pour former un lien phosphate diester stable. Dans le cas de la synthèse peptidique, les fonctions -OH terminales des nanoparticules seront modifiées en fonctions -NH2 par réaction d'un amino alkyl phosphoramidite C3, C6, C12 ou autres, comme commercialisés par la société Glen Research (Sterling, Virginie, USA). Ces fonctions -NH2 permettront d'amorcer la synthèse peptidique par réaction d'un acide aminé réactif pour former une liaison peptidique (-NH-CO). Certaines CPG déjà fonctionnalisées avec des fonctions acide carboxylique ou aminés sont, par exemple, commercialisées par la société PureBiotech LLC (752A Lincoln BIvd.Middlesex, NJ 08846). Il est, par exemple, possible d'utiliser la LCAA-CPG (Long Chain Alkylamine Controlled Pore Glass), par exemple, commercialisée par Mïllipore (290 Concord Road, Billerica, MA 01821), qui est classiquement utilisée en synthèse oligonucléotidique. La LCAA-CPG est fonctionnalisée avec des fonctions aminé qui pourront être transformées en fonction acide carboxylique, par exemple par réaction avec de l'anhydride succinique.
De façon avantageuse, le solvant utilisé lors du greffage des nanoparticules sur le support sera un solvant dans lequel les nanoparticules sont stables, c'est-à-dire non agrégées. L'utilisation d'un tel solvant permet d'obtenir un recouvrement homogène du support avec des nanoparticules individualisées. Dans le cas de nanoparticules de silice, le diméthylformamide (DMF) pourra, par exemple, être utilisé.
Le greffage des nanoparticules a lieu à la fois à l'intérieur des pores et à proximité de la surface du support. Mais dans le cadre de l'invention, l'intérêt réside dans le fait qu'au moins une partie des particules est greffée de manière covalente à l'intérieur des pores de surface du support tout en restant accessible, et va ainsi être protégée par la suite, lorsque les particules seront soumises à des contraintes mécaniques, évitant ainsi leur décrochage.
Avant d'utiliser le support ainsi obtenu, présentant des nanoparticules greffées de manière covalente à l'intérieur des pores de surface, il est, le plus souvent, préférable de neutraliser ou désactiver les fonctions réactives résiduelles présentes en surface du support. De telles techniques sont connues de l'homme de l'art. Par exemple, dans le cas de fonctions acides carboxyliques, celles-ci pourront être bloquées par action de la pipéridine, afin d'éviter l'amorçage de réactions parasites ultérieures à la surface du support.
Après couplage entre les nanoparticules et le support, il reste des fonctions réactives libres en surface des nanoparticules qui vont pouvoir réagir, au sein d'une cellule d'un synthétiseur automatisé, avec la première brique (également nommé monomère) peptidique ou oligonucléotidique permettant la synthèse des peptides ou oligonucléotides souhaités. Le plus souvent, ces fonctions réactives qui vont permettre la fixation du 1er nucléotide ou du 1er acide aminé sont les mêmes que celles ayant permis de lier de manière covalente les particules au support. Néanmoins, deux fonctions réactives différentes pourraient être prévues en surface des nanoparticules, certaines pour permettre leur greffage au support, d'autres pour le greffage ultérieur de molécules d'intérêt. Etant donné que les nanoparticules sont greffées sur le support, seulement une partie de leur surface va être accessible et va pouvoir être liée de manière covalente avec les peptides ou oligonucléotides souhaités. En général, les nanoparticules obtenues sont dissymétriques, avec au moins 90% des ligands biologiques greffés sur une zone continue représentant moins de 70% de la surface de la nanoparticule sur laquelle ils sont greffés.
Le matériau selon l'invention est donc parfaitement adapté pour réaliser des synthèses supportées d'oligonucléotides ou de peptides notamment. L'intérêt principal de la synthèse supportée est qu'elle permet de greffer en surface d'un objet, des blocs fonctionnels à partir d'un support de base, suivant la demande et à façon. Un autre intérêt de la synthèse supportée est le parfait contrôle de l'orientation des biomolécules greffées.
Comme dit précédemment, l'invention a également pour objet un procédé de croissance d'oligonucléotides ou de peptides dans lequel la croissance est réalisée sur un matériau constitué d'un support poreux sur lequel des nanoparticules fonctionnalisées sont greffées par liaison covalente caractérisé en ce qu'au moins une partie des nanoparticules greffées par liaison covalente sont logées à l'intérieur des pores de surface du support. De façon avantageuse, une telle croissance est réalisée dans un synthétiseur automatisé dans lequel le support est confiné dans une cellule grâce à un filtre au travers duquel circulent alternativement des flux d'argon et de réactifs. Avant l'opération de croissance, il y a également des nanoparticules greffées de manière covalente, sur la surface externe du support ou à l'extérieur des pores, mais ces dernières sont, pour la plupart, éliminées après réaction dans le synthétiseur par les flux d'argon et de réactifs, seules les nanoparticules localisées à l'intérieur des pores étant conservées. Les méthodes classiques de synthèses peptidiques et oligonucléotidiques en synthétiseur automatisé pourront être mises en œuvre. Pour plus de détails sur la synthèse automatisée d'oligonucléotides, on pourra se référer au livre Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Volume 1, Editors : S. L. Beaucage, D. E. Bergstrom, G. D. Glick, R. A. Jones, John Wiley& Sons, Inc., 2004. Pour plus de détails sur la synthèse automatisée de peptides, on pourra se référer à la revue de Amblard, M., Fehrentz, J.-A., Martinez, J., Subra, G., Methods and protocols of modem solid phase peptide synthesis, Molecular Biotechnology, 2006, 33, 239-254.
Le plus souvent, une fois la croissance réalisée, la liaison covalente entre le support et les nanoparticules est clivée. Par exemple, dans le cas d'un lien ester, le clivage peut être réalisé en milieu basique, par exemple dans une solution de NH4OH 1%, à 60°C. Dans le cas des autres liens envisagés, on pourra se référer aux publications citées précédemment qui détaillent les conditions de clivage utilisables.
Dans le cadre de l'invention, le terme « oligonucléotide » désigne un enchaînement d'au moins 2 nucléotides (désoxyribonucléotides ou ribonucléotides, ou les deux), naturels ou modifiés, susceptibles de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un oligonucléotide au moins partiellement complémentaire. Par nucléotide, on entend un composé organique consistant en une base purine ou pyrimidine liée à un ose (ribose ou deoxyribose) et à un groupe phosphate. Par nucléotide modifié, on entend par exemple un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison internucléotidique et/ou au niveau du squelette. A titre d'exemple de base modifiée, on peut citer l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine et la bromo-5- désoxyuridine. Pour illustrer une liaison internucléotidique modifiée, on peut mentionner les liaisons phosphorothioate, N-alkylphosphoramidate, alkylphosphonate et alkylphosphotriester. Les alpha-oligonucléotides tels que ceux décrits dans FR-A-2 607 507 et les PNA qui font l'objet de l'article de M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114, 1895-1897, sont des exemples d'oligonucléotides constitués de nucléotides dont le squelette est modifié.
Le terme « peptide » signifie notamment tout enchaînement d'au moins deux acides aminés, tels que protéine, fragment de protéine, oligopeptide qui a été extrait, séparé, isolé ou synthétisé, comme un peptide obtenu par synthèse chimique ou par expression dans un organisme recombinant. Sont inclus aussi tous les peptides dans la séquence desquels un ou plusieurs acides aminés de la série L sont remplacés par un ou plusieurs acides aminés de la série série D, et vice-versa; tout peptide dont l'une au moins des liaisons CO-NH est remplacée par une liaison NH-CO; tout peptide dont l'une au moins des liaisons CO-NH est remplacée par une liaison NH-CO, la chiralité de chaque résidu aminoacyle, qu'il soit impliqué ou non dans une ou plusieurs desdites liaisons CO-NH, étant soit conservée, soit inversée par rapport aux résidus aminoacyle constituant un peptide de référence (ou immunorétroïdes) ; et tout mimotope.
Dans le cadre de l'invention, il est donc possible de préparer des nanoparticules fonctionnalisées avec des peptides ou des oligonucléotides, mais également avec d'autres molécules du type molécules fluorescentes. De telles nanoparticules, de par la nature même de la nanoparticule et des éléments qu'elles pourront incorporer, peuvent servir de marqueurs ou de traceurs, dans des applications in vivo, notamment. Les nanoparticules obtenues peuvent être fluorescentes, radioactives, conductrices, magnétiques, pourront servir d'agents de contraste IRM, ...
Différentes variantes peuvent être apportées à l'invention. Notamment, il est possible d'utiliser les mêmes fonctions présentes sur les nanoparticules, à la fois pour réaliser leur greffage sur le support et pour réaliser ensuite la croissance des peptides ou oligonucléotides. Il pourrait également être envisagé d'utiliser des fonctions différentes, par exemple en greffant successivement sur la surface des nanoparticules, différents blocs fonctionnels.
1. Activation de la surface du support CPG par l'acide nitrique
La CPG utilisée est de la CPG 3000 (Fluka-Réf 27732). Pour la CPG 3000, le diamètre moyen des pores donnée par le fournisseur est de 300 nm ± 75 nm environ, ce qui correspond à un écart-type de 25%. L'étape d'activation de la surface de CPG permet de fonctionnaliser le support CPG avec des groupements silanols (SiOH) réactifs vis-à-vis du bras qui va permettre l'accrochage des nanoparticules.
2 g de CPG 3000 sont chauffés dans 10 mL d'acide nitrique 68% à 100°C (montage à reflux) pendant lh. Après retour à température ambiante, le support est filtré puis lavé à l'eau distillée jusqu'à neutralité du pH du filtrat. L'activation peut également être réalisée en milieu basique, par exemple par action d'hydroxyde de sodium aqueux. 2. Fonctionnalisation du support CPG par des aminés primaires
La CPG activée obtenue au paragraphe 1) (2 g) est mise en suspension dans 15 mL d'une solution aqueuse d'aminopropyltriéthoxysilane (APTES) à 10% (v/v) ajustée à pH 4 par de l'acide chlorhydrique. La suspension est chauffée à 70°C sous agitation rotative pendant 2h30. Après avoir enlevé le liquide surnageant, la CPG est chauffée à l'étuve à 120°C pendant 16h dans un creuset en céramique. La CPG est ensuite filtrée et lavée par de l'acétone, puis séchée à l'air libre.
3. Fonctionnalisation du support CPG par des acides carboxyliques La CPG activée obtenue au paragraphe 2) (2 g) est mise en suspension dans 15 mL d'une solution d'anhydride succinique 1M dans l'acétone avec 1% de triéthylamine (v/v). La suspension est agitée pendant 5h à température ambiante. La CPG est filtrée et lavée à l'acétone, puis séchée à l'air libre.
Les fonctionnalisations obtenues aux paragraphes 1 à 3 sont schématiquement illustrées Figure 3.
4. Fonctionnalisation des nanoparticules
4.1 Synthèse d'un bras alcool
De l'aminohexanol (476 mg, 4,06 mmol) et du triéthoxysilylpropylisocyanate (1 mL, 4,06 mmol) sont mis en réaction dans l'isopropanol sous atmosphère d'argon et sous agitation magnétique à température ambiante pendant 30 min. Le bras alcool triéthoxysilylpropylhexanolurée ainsi formé est utilisé sans purification.
4.2 Fonctionnalisation des nanoparticules avec le bras alcool
Les nanoparticules de silice utilisées sont fournies par la société Nano-H (Saint Quentin Fallavier, France). Ces particules sont de type cœur-couronne, le fluorophore étant incorporé dans le cœur comme décrit dans l'article de Burns pour la cyanine 5 (A. A. Burns, J. Vider, H. Ow, E. Herz, 0. Penate- Medina, M. Baumgart, S. M. Larson, U. Wiesner, M. Bradbury, Fluorescent silicananoparticles with efficient urinary excrétion for nanomedicine, Nano Letters (2009) 9(1), 442-448).
Une solution de nanoparticules de silice porteuse de fonctions Si-OH en surface de 30 à 70 nm de diamètre dans le diméthylformamide (C=10 mg de NP/mL) est mise en réaction avec 95 équivalents de silane alcool précédemment formé au paragraphe 4.1 et 5 équivalents de 1,2- bis(triéthoxysilyl)éthane en présence de triéthylamine. Le mélange réactionnel est porté à reflux à 120°C pendant 16h. Après retour à température ambiante, les nanoparticules sont purifiées par centrifugation et redispersion dans du DMF (3 fois). 5. Activation des acides carboxyliques du support CPG
La CPG préparée au paragraphe 3 est mise en suspension dans l'acétonitrile anhydre en présence de 0-(benzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'- tetraméthyluroniumhexafluorophosphate (HBTU), de diméthylaminopyridine (DMAP) et de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 16h. La CPG obtenue est filtrée et lavée au DMF.
6. Greffage des nanoparticules sur le support CPG
La CPG obtenue au paragraphe 5 est mise en suspension dans du DMF anhydre puis la solution de nanoparticules obtenue au paragraphe 5.2 est ajoutée goutte à goutte. La suspension est agitée à température ambiante pendant 16h. La CPG obtenue est filtrée puis lavée au DMF et à l'acétonitrile et séchée à l'air libre. L'ensemble du procédé mis en œuvre est illustré Figure 4.
Les acides carboxyliques activés par le mélange HBTU/DMAP qui n'ont pas réagi avec les fonctions hydroxyle des nanoparticules sont bloqués (cappés) par action de la pipéridine, afin d'éviter l'amorçage de synthèses oligonucléotidiques parasites à la surface de la CPG.
La CPG est mise en suspension dans de la pipéridine et le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant plusieurs jours.
7. Exemple de synthèse d'un oligodésoxyribonucléotide 23mer sur le support nanoparticules- CPG obtenu au paragraphe 6
30 mg de support nanoparticules-CPG sont introduits dans une colonne de synthèse installée sur un synthétiseur automatisé ABI 394 (AppliedBiosystems).
La séquence de l'oligodésoxyribonucléotide est : 5'- ATC TCG GGA ATC TCA ATG TTA GT -3'
La synthèse de l'oligodésoxyribonucléotide est effectuée avec le programme standard Ipmole en utilisant les phosphoramidites iPr-Pac-dG, Ac-dC, Pac-dA et dT (Glen Research). L'activateur utilisé est le tétrazole pour un temps de couplage de 60 s. Le rendement moyen de couplage par cycle est de 97,5%. La Figure 5 présente des photographies prises au microscope électronique à balayage du support CPG ; (A) avant greffage des nanoparticules, (B) après greffage des nanoparticules, (C) et (D) après synthèse des oligonucléotides sur les nanoparticules. La localisation des nanoparticules au sein des pores du support est bien mise en évidence. Avant synthèse des oligonucléotides, il y a également des nanoparticules en sur les parties externes du support (Photo B), mais ces dernières sont éliminées (photos C et D) après réaction dans le synthétiseur par les flux d'argon et de réactifs, seules les nanoparticules localisées à l'intérieur des pores étant majoritairement conservées.
8. Exemple de synthèse d'un oligoribonucléotide 36mer modifié sur le support nanoparticules-CPG obtenu au paragraphe 6 30 mg de support nanoparticules-CPG sont introduits dans une colonne de synthèse installée sur un synthétiseur automatisé ABI 394 (AppliedBiosystems).
La synthèse de l'oligoribonucléotide est effectuée avec le programme standard ARN lpmole. L'étape de couplage est réalisée avec le benzylthiotétrazole (Glen Research), avec un temps de couplage de 240 s. Des phosphoramidites 2'-0-méthylpurines et 2'-fluoropyrimidines sont utilisées. Le rendement moyen de couplage par cycle est de 98,9%. 9. Déprotection des oligonucléotides et décrochage des nanoparticules
Les oligonucléotides obtenus au paragraphe 7 ou 8 sont déprotégés par une solution de carbonate de potassium 0,05M dans le méthanol à température ambiante pendant 6 heures minimum.
Les nanoparticules sont ensuite décrochées du support par l'action d'ammoniaque 1% aqueux (500pL pour 30 mg de support) à 60°C. Après 15 à 30 minutes, les nanoparticules sont libérées en solution. La solution surnageante est alors prélevée, l'ammoniaque est neutralisée par ajout d'une solution d'acide acétique 0,05M jusqu'à obtention d'une solution neutre (pH 7).
Le nombre de nanoparticules présentes dans la solution est estimé par mesure d'émission de fluorescence, les nanoparticules utilisées présentant des fluorophores (rhodamine ou fluorescéine) encapsulés dans le cœur de silice.
Le nombre d'oligonucléotides à la surface de chaque particule est évalué par mesure d'absorbance UV à 260 nm. Le recouvrement est estimé entre 1000 et 5000 oligos par particule, ce qui correspond à 0,2 à 1 (si on prend en compte la moitié de la surface d'une particule de 60 nm de diamètre) oligonucléotides par nm2 de nanoparticules. Enfin, une excellente stabilité des nanoparticules porteuses d'oligonucléotides a été observée dans un tampon PBS et dans l'eau. Aucune agrégation des particules n'est observée après plusieurs semaines en suspension. La densité importante des biomolécules présentes en surface stabilise les nanoobjets obtenus en solution.
De plus, les conjugués obtenus aux paragraphes 8 et 9 se sont révélés actifs pour le ciblage des cibles biologiques correspondantes (respectivement l'ADN du virus de l'hépatite B et la protéine MMP-9).

Claims

REVENDICATIONS
1 - Matériau constitué d'un support poreux sur lequel des nanoparticules fonctionnalisées sont greffées par liaison covalente caractérisé en ce qu'au moins une partie des nanoparticules greffées par liaison covalente sont logées à l'intérieur des pores de surface du support et en ce que le support est à base de silice et se présente sous la forme de particules poreuses de forme et de taille hétérogènes, la taille des particules étant supérieure à 1 μιη, et étant de préférence située dans la gamme allant de 5 à 200 pm.
2 - Matériau selon la revendication 1 caractérisé en ce que le support est un verre minéral, à base de silice ou de silicate.
3 - Matériau selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le support est constitué exclusivement de silice ou est constitué exclusivement d'un silicate dans lequel la silice est en mélange avec un autre ou d'autres oxydes tels B203 pour former des borosilicates ou Al203 pour former des aluminosilicates, éventuellement en mélange avec Na20.
4 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la taille minimale moyenne des ouvertures de surface formées par les pores de surface du support est au moins 3 fois égale à la taille des nanoparticules.
5 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le diamètre moyen des pores du support appartient à la gamme allant de 30 à 600 nm, et de préférence à la gamme allant de 100 à 400 nm.
6 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le support présente une porosité homogène correspondant au fait qu'au moins 80% des pores ont un diamètre dont la valeur ne varie pas de plus de 10% par rapport au diamètre moyen des pores.
7 - Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que dans le support présente un volume de pores par gramme de 0,5 à 1,5 mL/g.
8- Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le support présente une surface spécifique appartenant à la gamme allant de 5 à 80 m2/g. 9- Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules ont une taille moyenne appartenant à la gamme allant de 2 à 100 nm.
10- Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'au moins 80%, et de préférence au moins 90% des nanoparticules greffées sont directement liées par liaison covalente au support, c'est à dire sans nanoparticule intermédiaire assurant ladite liaison.
11- Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules sont des nanoparticules de silice, d'or, d'argent, de graphite, des nanocristaux fluorescents, des nanoparticules de polymère du type polystyrène, polypropylène ou polybutadiène, ou des nanoparticules d'oxyde métallique, notamment d'oxyde d'étain, de gadolinium, d'aluminium, de titane, de cérium, de niobium d'erbium, d'ytterbium, de terbium, de dysprosium, d'europium, ou d'un mélange de ces oxydes, éventuellement enrobées pour permettre leur fonctionnalisation.
12- Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules sont fonctionnalisées par des fonctions réactives choisies parmi les alcools, les aminés et les thiols permettant la croissance d'oligonucléotides ou de peptides.
13- Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules sont greffées sur le support par un lien clivable, dans des conditions n'altérant pas les ligands biologiques, par exemple par un lien ester, un lien alkoxysilyl, un pont disulfure, le lien acide 4-(2- hydroxyéthyl)-3-nitrobenzoïque, le lien acide N-[9-(hydroxyméthyl)-2- fluorényl]succinamique le lien thiophosphoramidatehydroxypropyl ou un lien amide activé par un groupement 2-propane diol.
14- Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la liaison covalente entre les nanoparticules et le support est obtenue par couplage entre un bras avec une fonction terminale acide, situé sur le support, choisi parmi :-(CH2)n-NH-CO-(CH2)m-COOH, -(CH2)n-COOH, - (CH2)n-NH-(CH2)m-COOH, avec n un entier appartenant à l'intervalle allant de 2 à 18 et m un entier appartenant à l'intervalle allant de 2 à 6, et un bras avec une fonction terminale alcool, situé sur les nanoparticules, choisi parmi :
-(CH2)q-NH-CO-NH-(CH2)r-OH, -(CH2)s-OH, -(CH2)q-0-[(CH2)2-0]p-H et -(CH2)q-CONH-(CH2)r-OH, - (CH2)q-NH-(CH2)r-OH, -(CH2)q-CHOH-CH2- NH-(CH2)p-OH, -(CH2)q-[CH-(CH20H)]-NH-(CH2)p-OH , -(CH2)q-CHOH- CH2-0-(CH2)p-OH, -(CH2)q-[CH-(CH20H)]-0-(CH2)p-OH, -(CH2)q-CHOH- CH2-0-CO-NH-(CH2)p-OH
avec s un entier appartenant à l'intervalle allant 2 à 18, p un entier appartenant à l'intervalle allant 1 à 6, q un entier appartenant à l'intervalle allant 1 à 12, et r un entier appartenant à l'intervalle allant 1 à 12.
15- Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules sont fonctionnalisées avec des molécules organiques hydrophiles libres, par exemple choisi parmi le polyéthylène glycol et la polyéthylamine ou par des molécules organiques fluorescentes telles que la Fluorescéine, Rhodamine ou les Cyanines.
16- Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les nanoparticules sont fonctionnalisées, par liaison covalente, avec des ligands biologiques choisis parmi les peptides et les oligonucléotides.
17- Matériau selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la liaison covalente entre les nanoparticules et les ligands biologiques correspond à un lien peptidique ou phosphate diester.
18- Matériau selon la revendication 16 ou 17 caractérisé en ce qu'il comporte une densité importante de ligands biologiques greffés en surface des nanoparticules correspondant à plus de 0,1 molécule de ligand biologique par nm2 de nanoparticules.
19- Matériau selon la revendication 16, 17 ou 18 caractérisé en ce que les nanoparticules sont dissymétriques, de sorte qu'au moins 90% des ligands biologiques sont greffés sur une zone continue représentant moins de 70% de la surface de la nanoparticule sur laquelle ils sont greffés.
20- Procédé de croissance d'oligonucléotides ou de peptides caractérisé en ce que la croissance est réalisée sur un matériau constitué d'un support poreux sur lequel des nanoparticules fonctionnalisées sont greffées par liaison covalente caractérisé en ce qu'au moins une partie des nanoparticules greffées par liaison covalente sont logées à l'intérieur des pores de surface du support.
21 - Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce que le support est en un polymère, en particulier en un polymère polystyrène-co- divinylbenzène ou polypropylène- divinylbenzène.
22 - Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce que la croissance est réalisée sur un matériau conforme aux revendications 1 à 19.
23 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 22 caractérisé en ce que la croissance est réalisée dans un synthétiseur automatisé dans lequel le support est confiné dans une cellule grâce à un filtre au travers duquel circulent alternativement des flux d'argon et de réactifs.
24 - Procédé selon la revendication 23 caractérisé en ce qu'une fois la croissance réalisée, la liaison covalente entre le support et les nanoparticules est clivée.
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