WO2012175424A1 - Konfokales rastermikroskop und betriebsverfahren für ein solches sowie verfahren zum manipulieren einer probe - Google Patents

Konfokales rastermikroskop und betriebsverfahren für ein solches sowie verfahren zum manipulieren einer probe Download PDF

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WO2012175424A1
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photocathode
dynode
switch
target spot
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PCT/EP2012/061463
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English (en)
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Mirko Liedtke
Eva Simbürger
Daniel Schwedt
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Carl Zeiss Microscopy GmbH
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Carl Zeiss Microscopy GmbH
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    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
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    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
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    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J43/00—Secondary-emission tubes; Electron-multiplier tubes
    • H01J43/04—Electron multipliers
    • H01J43/30—Circuit arrangements not adapted to a particular application of the tube and not otherwise provided for

Definitions

  • the invention relates to a confocal scanning microscope comprising a light source, an adjustable beam deflecting unit and a photomultiplier tube (PMT) comprising a photocathode, a plurality of dynodes and an anode, an electrical circuit for biasing the dynodes with a respective (internal) voltage relative to the photocathode and a control unit for
  • PMT photomultiplier tube
  • Setting the deflection unit includes, as well as a control method for such
  • the first dynode is the one closest to the photocathode. It has the lowest electrical potential difference to the photocathode.
  • the voltages between the dynodes and between the first dynode and the photocathode are also referred to as internal voltages and the operating high voltage of the PMT also as external voltage.
  • a sample is scanned with a light beam, the target spot of the light beam shaving off a predetermined scanning field to take a picture pixel by pixel, and each pixel is accumulated by a photomicrograph during the so-called pixel dwell time of a PMT associated with electric charge corresponding light intensity.
  • LSM laser scanning microscopes
  • the dynodes of a PMT By applying the dynodes of a PMT with respective electrical voltages, light incidence in the photomultiplier leads to an avalanche of secondary electrons, which can be measured with high accuracy. As a result, photomultipliers are sensitive optoelectronic transducers. Typically, the dynodes are connected to a voltage divider chain, above which a
  • Photomultiplier downstream electronic gain to be regulated in order to obtain an optimal signal to be evaluated. It is also possible to influence the gain of a PMT by changing the high voltage, but this type of adjustment is sluggish. Strong light incidence on the photocathode leads to high electron beam densities within the evacuated multiplier tube. This increases the
  • Very high light intensities occur in confocal microscopes, in particular in the implementation of methods for measuring dynamic sample processes at the molecular level, in which fluorophores are selected in one or more
  • Regions of the sample are bleached specifically.
  • techniques include fluorescence recovery after photo-bleaching (FRAP), fluorescence loss in photo-bleaching (FLIP), and fluorescence localization after photo-bleaching (FLAP)
  • FRAP fluorescence recovery after photo-bleaching
  • FLIP fluorescence loss in photo-bleaching
  • FLAP fluorescence localization after photo-bleaching
  • Control circuits for photomultiplier are therefore usually with
  • FIG. 1 is intended to illustrate these consequences with an example. For a better understanding, the spatio-temporal relationships are simplified. A sample is scanned along a scanning field X with a light beam (directions of movement indicated by arrows). Meanwhile confocally become the local
  • Fluorescence intensities in the current target spot were recorded in pixel P by means of a PMT (not shown) with the high voltage switched on (indicated by a solid black line segment).
  • the illumination during scanning is bidirectional, the light beam and the detection are switched on over the entire scanning field X away.
  • subfigure 1 B the illumination and detection take place unidirectionally, the light beam is switched on at the beginning of the line and switched off during the line retrace; Pixels are recorded in only one direction in each line.
  • High voltage Interrupted section of the line
  • the protection circuit detects the falling light intensity based on the weak anode signal, whereupon the high voltage is turned on again. Due to the switching inertia, it takes some time (only about five pixels P through the simplification here) until the high voltage is established at time C (solid black line segment) and the PMT returns correct data. As a result, the pixels lying behind the region R in the scanning direction are not displayed correctly by the time C. Although it is possible to shut down the high-voltage protection shutdown in order to be able to record even such sample areas with low intensity following high intensity. Under the high load, however, the PMT suffers all the more. At the end of the scanning field X, the light beam and thus the resulting target spot is again conducted to the beginning of the scanning field X (dot-dashed line).
  • Protection shutdown can be dispensed with.
  • a second scanning unit for image recording so that a rastering operation for exposure and an independent rastering process for image recording is possible.
  • the light-receiving raster process is performed by means of the second scanning unit only when the bleaching / releasing / photoactivating scanning process is terminated by means of the first scanning unit.
  • Microscope arrangement is complicated. Another approach is to perform bleaching during unidirectional image pickup during the rewinding of the light beam. The disadvantages described above for the
  • Lifetime of the detector can also occur here, if the region to be intensified to be exposed ends near the end of the returning line. Incidentally, the time between exposure and image pickup can always be reduced by making the scanning field "cropped" on the region R to be observed so that fewer pixels are exposed and captured, and / or by reducing the resolution , in particular in connection with a change in the image scale (English, "zooming").
  • the invention has for its object to improve a scanning microscope of the type mentioned and to provide a corresponding control method that allow better protection of the PMT from overloading.
  • the object is achieved by a confocal scanning microscope, which has the features specified in claim 1, by a control method having the features specified in claim 12, and by a
  • a confocal scanning microscope has a switch which is switchable between an activated switching state and a deactivated switching state, reducing the (internal) voltage between the photocathode and the first dynode in the activated switching state compared to the deactivated switching state, and a control unit that is set up for
  • Target spot in a given region of the scan field activates the switch and deactivates the switch when leaving the region.
  • the activated switching state correspond to a closed switch position and the deactivated switching state of an open switch position or vice versa.
  • the switch for the voltage between the first dynode and the photocathode can be controlled in addition to the location dependence also in dependence of the anode signal to the PMT outside of predetermined regions before
  • comparators which compare the anode signal with at least one threshold value and, depending on the comparison result, the
  • Photocathode for example of +150 V of the first dynode over the
  • Photocathode to -150 V acts as an electron brake. This will get you
  • the anode signal disappears.
  • the amount of voltage between the first dynode and the photocathode does not have to remain constant during the "polarity reversal", but can be changed, for example reduced or increased with respect to the acceleration polarity however, more complicated than short-circuiting.
  • the electrical circuit is adapted to the photomultiplier regardless of the switching state of the switch with an outer
  • an embodiment is expedient in which the light source is adjustable with regard to its light output (optionally for image acquisition or for bleaching) and the control unit sets the light source at the entrance of the target spot in the predetermined region to a higher light output (for bleaching) and when leaving the Region to a lower light output (for image acquisition).
  • the control unit sets the light source at the entrance of the target spot in the predetermined region to a higher light output (for bleaching) and when leaving the Region to a lower light output (for image acquisition).
  • activated switching state and a deactivated switching state is switchable, wherein it reduces in the activated switching state, the (internal) voltage between the photocathode and the first dynode of the photomultiplier in question, in particular by a) electrically shorting the photocathode to the first dynode or b) the Voltage between the photocathode and the first dynode reversed, especially in combination with a reduction in their amount.
  • Photomultipliers preferably comprise the scanning microscope optics for the simultaneous imaging of multiple target spots on at least one respective
  • Photomultiplier wherein the control unit for each target spot, regardless of the other target spots when entering the predetermined region, the switches of this photomultiplier activated and deactivated on leaving.
  • This allows a fast scanning of the scanning field and correspondingly fast bleaching and / or fast image acquisition.
  • scanning and detection with a plurality of target spots is referred to DE 103 44 060 A1, EP 2187252 A1 and US 6,028,306, the disclosure of which is included as far as possible.
  • Such an embodiment expediently also includes optics for simultaneous illumination of the multiple target spots.
  • Photomultipliers include the scanning microscope (at least) an optical element that spatially-spectrally splits the target spot and several
  • Photomultiplier maps the control unit when entering the predetermined region, the switches of all these photomultiplier activated and deactivated on leaving.
  • the optical element may, for example, be a spectrally selective beam splitter or an angle-dispersive element such as a prism or a grating.
  • a spectrally selective beam splitter or an angle-dispersive element such as a prism or a grating.
  • Dispersion directions for example in the manner of an Echelle spectrometer.
  • the scanning microscope comprises an optics for imaging different solid angle segments of an input aperture on (at least) one respective photomultiplier, wherein the control unit when entering the
  • Preselected region activates the switches of all these photomultipliers and deactivates them when leaving.
  • Such an optical system is known, for example, from EP 1664889 A1, the disclosure content of which is included as far as possible here.
  • This embodiment can be combined with an embodiment in which multiple target spots are imaged simultaneously. Zeck Dislay then takes place in each partial beam path, a corresponding mapping of solid angle segments of the respective input aperture on a respective group of photomultipliers.
  • at least a subset of the photomultipliers may be integrated in a photomultiplier row.
  • Such lines are commercially available, for example from Hamamatsu.
  • control method according to the invention comprises the following steps:
  • a second light power for example, for bleaching
  • the above steps may be performed by a respective software module. It is also possible for a software module to perform several of the steps.
  • an outer one is provided to apply the first voltage.
  • Switching off the operating high voltage can advantageously be dispensed with.
  • Particularly advantageous embodiments are those in which the following substeps are additionally carried out during the movement of the target spot:
  • steps can also be performed, for example, by a respective software module. It is also possible for a software module to perform several of the steps.
  • the invention includes a method of manipulating a sample by irradiating various locations of the sample with a light beam
  • location-dependent light output by means of a confocal scanning microscope comprising a photomultiplier having a photocathode, a plurality of dynodes and an anode, wherein an electrical voltage between the photocathode and the first dynode is applied location-dependent, in particular at (substantially) constant external operating voltage of the photomultiplier ,
  • regions can be predetermined in the invention and the photocathode and the first dynode for these regions can be controlled identically.
  • simultaneous processes can be observed at different points of the sample.
  • the light output of the light source may preferably be adjustable electro-optically, for example by means of an electro-optical modulator, or acousto-optically, for example by means of an acousto-optical modulator.
  • the invention also includes a programmable control unit for a confocal scanning microscope or computer program for such a control unit, configured for carrying out a method according to the invention.
  • the switch has a response time of a maximum of 1 s.
  • an LSM is also possible for pixel-wise de-activation and reactivation of the PMT even with short pixel dwell times. It is particularly advantageous that also the
  • the high operating voltage ie typically less than 150 V, which can be separated by a switch with little effort.
  • the switch is against a high voltage of
  • the confocal scanning microscope according to the invention can advantageously be used in FLIP, FLAP, FRAP, photoactivation and / or uncaging.
  • the invention provides a location-dependent, rapid protection shutdown for PMT. It allows improved protection of the PMT, in particular in conjunction with a radiation with location-dependent light output.
  • FIG. 2 is a schematic circuit diagram of a laser scanning microscope
  • FIG. 3 is a simplified circuit diagram of a first PMT operating circuit
  • Fig. 5 shows schematically the scanning of a sample with bleaching of a sample region according to the invention.
  • like parts bear like reference numerals.
  • FIG. 1 shows the consequences of an idle protection shutdown of the operating high voltage of a PMT as a function of the anode signal of the PMT according to the prior art.
  • the PMT 2 shows the circuit diagram of a first exemplary operating circuit 1 for a PMT 2.
  • the PMT 2 comprises an evacuated housing (not shown), a photocathode 2.1, eight dynodes 2.2 ... 2.9 and an anode 2.10.
  • the operating circuit 1 comprises a high voltage source 3, whose voltage is applied across a series of resistors 4, so that at each resistor 4 and thus between adjacent dynodes 2.1 ... 2.10 a respective partial voltage drops.
  • the resulting potential cascade amplifies in a known manner the photoelectrons knocked out at the cathode 2.1.
  • the current pulse occurring thereby at the anode 2.10 can, for example, be converted into an electrical voltage as an anode signal D by means of a current-voltage conversion unit (not shown).
  • the circuit 1 has a high-voltage insulated switch 7, whose one pole is connected to the photocathode 2.1 and whose other pole is connected to the first dynode 2.2.
  • the switch 7 can be used, for example, as an optocoupler,
  • Isolation amplifier or relay be executed. It is expediently designed as a closer and causes in this embodiment in the closed (activated) switching state a short circuit between the photocathode 2.1 and first dynode 2.2 and thus deactivates the first acceleration stage of the PMT 2.
  • the switch 7 closes, as long as the output from the control unit 34
  • Switching signal Q for example, has at least a predetermined negative level. If the control unit 34 again opens the normally open contact of the switch 7, in which it outputs a more positive signal Q to it, for example, then the acceleration voltage between the cathode 2.1 and the first dynode 2.2 builds up again in the shortest possible time. The first acceleration stage is with it reactivated. During the entire process of deactivation and reactivation of the PMT 2, the high voltage HV of the voltage source 3 is maintained.
  • control unit 34 can also control the light source 25 with regard to the emitted light output. Preferably, it activates the switch 7 whenever it switches the light source 25 from a lower to a higher light output. Preferably, it deactivates the switch 7 whenever it switches the light source 25 from a higher to a lower light output.
  • Fig. 3 is a laser scanning microscope 10 with location-dependent, faster
  • the LSM 10 is modularly composed of an illumination module L with lasers 23, a scanning module S (English, “scanning module”), a detection module D and the microscope unit M with the microscope objective 31.
  • the light of the laser 23 can be detected by light flaps 24 and attenuator 25,
  • acousto-optic tunable filters may be influenced by the control unit 34 before being fed and combined into the scanning module S via optical fibers and coupling optics 20.
  • the control unit 34 may be influenced by the control unit 34 before being fed and combined into the scanning module S via optical fibers and coupling optics 20.
  • the main beam splitter 33 and the XY Scanning unit 30 (“scanner"), the two
  • the attenuators 25 will be referred to as the light source representative of the combination of the laser 23, the light flaps 24, and the attenuators 25.
  • Main beam splitter 33 in the detection module D may be formed, for example, as a dichroic color splitter.
  • the detection module D has a plurality of detection channels, each with a pinhole 31, a filter 28 and a PMT detector 2, which are separated by color divider 29.
  • pinhole apertures 31 instead of pinhole apertures 31, slit apertures (not shown) can also be used, for example in the case of line-shaped illumination.
  • the confocal pinholes 31 serve to discriminate sample light that does not originate from the focus volume surrounding the target spot T. The detectors 2 therefore detect
  • the detectors 2 comprise a respective operating circuit 1, which provides a high operating voltage and a switch (not shown for the sake of clarity) for influencing the
  • Voltage between the photocathode and the first dynode regardless of the operating high voltage includes, as well as a respective evaluation (not shown here). In other embodiments (not shown), the
  • Transmitter be offset from the detectors 2, in particular, it may be located outside of the detection module D.
  • the switch for influencing the voltage between the photocathode and the first dynode is connected, for example, to the photocathode and the first dynode in such a way that it electrically short-circuits the photocathode and the first dynode in an activated switching position, such that a first dynode and the photocathode Voltage of 0 V is applied, and in a deactivated
  • Shift position eliminates the short circuit, so that between the first dynode and the photocathode, the regular voltage is applied, for example +150 V.
  • the confocally illuminated and recorded target spot T in the sample 22 can be moved by means of the scanning unit 30 over or through the sample 22 in order to take a picture pixel by pixel, in which the galvanometer mirrors of the scanning unit 30 are purposefully rotated.
  • both the movement of the galvanometer mirrors and the switching of the illumination by means of the light flaps 24 or the attenuator 25 are controlled directly by the control unit 34.
  • Data acquisition from the detectors 2 is also carried out by the control unit 34, as well as the control of the switch for influencing the voltage between the photocathode and the first dynode.
  • the evaluation unit / control unit 34 can be, for example, a commercially available electronic computer ("computer").
  • a plurality of target spots T in the sample 22 can be illuminated simultaneously by an optical system in the illumination beam path, for example a lens array (Jens array).
  • an optical system in the illumination beam path for example a lens array (Jens array).
  • Detection beam path in multiple target spots, for example, in each
  • Partial beam path in front of the detector 2 (in the case of several target spots, for example in front of each detector), a spatial-spectral splitting takes place, for example by means of a respective angle-dispersive element.
  • the switch for influencing the voltage between the photocathode and the first dynode may, for example, be connected to the photocathode and the first dynode in such a way that a positive voltage of, for example, +150 V in an activated switching position is applied between the first dynode and the photocathode and in a deactivated switching position, a negative voltage of, for example -150 V between the first dynode and the photocathode is applied.
  • FIG. 4 An example of an operating circuit 1 of such an alternative embodiment, Fig. 4. It corresponds largely to the circuit 1 of FIG. 2, but here is the switch 7 for reversing the voltage between the first dynode 2.2 and
  • Dynodes 2.1 ... 2.10 to the voltage divider cascade. Due to the polarity reversal, the first acceleration stage in the activated switching state of the switch 7 acts as an electron brake and thus effectively prevents large photoelectron currents.
  • FIG. 5 shows the sequence of an exemplary control method for an LSM 10, for example according to FIG. 2.
  • the control unit 34 first acquires an overview image from the sample 22 in a manner known per se with a pure detection light power of the light source 25 presents it visually to the user.
  • the user can use a scanning field X and a
  • ROI region of interest
  • step S1 determines whether the user the scanning field X and / or the region R is already known. If the user the scanning field X and / or the region R is already known, step S1 can be omitted. In step S2, the control unit 34 takes from the user, for example, in a known manner an indication of the sample region R contrary. If the scanning field X and / or the region R of the control unit 34 from another source already exist as a record, the sub-step in question can be omitted.
  • control unit 34 sets in step S3
  • step S4 it moves the target spot T by means of the deflection unit 30 on the sample 22, while the accumulated by the detector 2 per pixel dwell time
  • step S4a Light intensities digitally corresponding pixels. Meanwhile, it compares continuously in step S4a the current position of the target spot T with the predetermined region R. Identifies them that the target spot T has exceeded an edge of the predetermined region R and thereby at least partially into the region
  • step S4 it activates the switch 7 and switches the light source 25 to bleaching light power. Also, during step S4, it continuously compares the current location of the target spot T with the predetermined region R in step S4b. If it identifies that the target spot T has crossed an edge of the predetermined region R and thereby completely left the region R, it deactivates it
  • step S4 switches the light source 25 to detection light power.
  • step S4 The movement of the target spot T over the sample 22 in step S4 is continued until the arrival of the end of the scanning field X is identified. Then, the target spot T is again moved to the beginning of the scanning field X in step S5, and in step S6, the sample is resampled with only the detection light power, thereby taking an image. To observe dynamic processes in the sample 22, it is expedient to repeat steps S5 and S6 several times.
  • FIG. 6 shows the advantageous consequences of using one of the operating circuits 1 described above in an LSM using the example of bleaching a given sample region R.
  • FIG. 6 shows the advantageous consequences of using one of the operating circuits 1 described above in an LSM using the example of bleaching a given sample region R.
  • FIG. 1 shows the prior art in contrast to the prior art (FIG. 1), FIG.
  • the switch 7 Activation of the switch 7 at time A with the entry of the target spot in the region to be bleached R, the shutdown of the detector with an error of less than a pixel dwell time. Together with the activation of the switch 7, the light source 25 is switched to bleaching light power. The reactivation of the detection by deactivating the switch 7 and the switching back of the light source 25 on the normal detection light power takes place at time B with the exit of the target spot from the region R. As a result, the following pixels can be regularly detected with a maximum error of one pixel.
  • the shutdown and reactivation in conjunction with the switching of the light power in all lines over which the region R extends.
  • sequences of shutdown and reactivation can occur several times per line.
  • the invention has the advantage that the image acquisition by activating the switch 7 pixel-accurately turned off when entering a predetermined region R and at exit by deactivating the switch 7 again pixel-precise
  • Region R is carried out with high accuracy, for example in the context of FLIP. This also applies to several regions R to be bleached.

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Abstract

Bei starker Übersteuerung eines Photovervielfachers (PMT) schalten bekannte Überlastschütze die Betriebshochspannung des PMT ab. Die Reaktionszeit der Hochspannung liegt dabei im Bereich von Millisekunden. Dadurch kommt es beim Bleichen mit einem Laser-Scanning-Mikroskop zu einer späten Abschaltung des PMT, wodurch dieser beschädigt werden kann, und einer noch stärker verzögerten Wiedereinschaltung des PMT, wodurch nachfolgende Probenbereiche nicht aufgenommen werden können. Die Erfindung soll einen PMT beim Bleichen besser vor Überlastung schützen und eine schnelle Wiedereinschaltung nach dem Ende des Bleichens ermöglichen. Zu diesem Zweck sind ein Schalter (7), der im aktivierten Schaltzustand im Vergleich zum desaktivierten Schaltzustand die Spannung zwischen der Photokathode (2.1) und der ersten Dynode (2.2) reduziert, und eine Steuereinheit (34), die eingerichtet ist zum Bewegen eines mittels der Lichtquelle bestrahlbaren Zielflecks über ein Abtastfeld mittels einer Ablenkeinheit, wobei die Steuereinheit (34) beim Eintritt des Zielflecks in eine vorgegebene Region des Abtastfeldes den Schalter (7) aktiviert und beim Verlassen der Region den Schalter (7) desaktiviert, vorgesehen.

Description

Konfokales Rastermikroskop und Betriebsverfahren für ein solches sowie Verfahren zum Manipulieren einer Probe
Die Erfindung betrifft ein konfokales Rastermikroskop, das eine Lichtquelle, eine einstellbare Strahl-Ablenkeinheit und einen Photovervielfacher (engl,„photo-multiplier tube"; PMT), der eine Photokathode, mehrere Dynoden und eine Anode aufweist, eine elektrische Schaltung zur Beaufschlagung der Dynoden mit einer jeweiligen (inneren) Spannung gegenüber der Photokathode und eine Steuereinheit zur
Einstellung der Ablenkeinheit umfasst, sowie ein Steuerverfahren für solche
Rastermikroskope. Die erste Dynode ist diejenige, die der Photokathode am nächsten ist. Sie weist die geringste elektrische Potentialdifferenz zur Photokathode auf. Im Sinne der Erfindung werden die Spannungen zwischen den Dynoden und zwischen der ersten Dynode und der Photokathode auch als innere Spannungen und die Betriebshochspannung des PMT auch als äußere Spannung bezeichnet.
In derartigen optischen Rastermikroskopen wird eine Probe mit einem Lichtstrahl abgetastet (engl,„scanned"), wobei der Zielfleck des Lichtstrahls ein vorgegebenes Abtastfeld abrasiert, um pixelweise ein Bild aufzunehmen. Jedem Pixel wird die der während der sogenannten Pixelverweilzeit von einem PMT durch Lichtaufnahme akkumulierten elektrischen Ladung entsprechende Lichtintensität zugeordnet.
Aufgrund der typischen Laser-Lichtquelle werden derartige Mikroskope auch als Laser-Scanning-Mikroskope (LSM) bezeichnet.
Durch die Beaufschlagung der Dynoden eines PMT mit jeweiligen elektrischen Spannungen kommt es bei Lichteinfall in den Photovervielfacher zu einer Lawine von Sekundärelektronen, die mit hoher Genauigkeit gemessen werden können. Dadurch sind Photovervielfacher empfindliche optoelektronische Wandler. Typischerweise sind die Dynoden an eine Spannungsteilerkette angeschlossen, über der eine
Hochspannung angelegt wird, so dass die Dynoden eine Potentialkaskade
darstellen. Je nach zu erwartender Photonenstromdichte kann eine dem
Photovervielfacher nachgeschaltete elektronische Verstärkung reguliert werden, um ein optimal auszuwertendes Signal zu erhalten. Es ist auch möglich, die Verstärkung eines PMT durch Veränderung der Hochspannung zu beeinflussen, diese Art der Einstellung ist jedoch träge. Bei starkem Lichteinfall auf die Photokathode kommt es innerhalb der evakuierten Vervielfacherröhre zu hohen Elektronenstrahldichten. Dadurch steigt die
Wahrscheinlichkeit für eine Stoßionisierung von Restgasmolekülen im Vakuum, die ihrerseits die Photokathode beschädigen können, was als Restgasionisierung (engl. Jon feedback") bezeichnet wird. Auch die Anode kann bei großen
Photoelektronenstromdichten beschädigt werden.
Zu sehr hohen Lichtintensitäten kommt es in konfokalen Mikroskopen insbesondere bei der Durchführung von Verfahren zur Messung dynamischer Proben prozesse auf Molekülebene, bei denen Fluorophore in einer oder mehreren ausgesuchten
Regionen der Probe gezielt gebleicht werden. Solche Verfahren sind beispielsweise „Fluorescence Recovery After Photo-bleaching" (FRAP),„Fluorescence Loss In Photo-bleaching" (FLIP) und„Fluorescence Localization After Photo-bleaching" (FLAP). Bei derartigen Verfahren besteht eine große Gefahr, dass ein konfokal detektierender PMT beschädigt wird. Dasselbe gilt für Verfahren, bei denen durch hohe Lichtintensitäten andere Stoffe in einer Probenregion manipuliert werden, beispielsweise das Öffnen von Käfigmolekülen durch hochintensives Licht, die daraufhin chemische Reagenzien oder Fluorophore freigeben (engl,„uncage").
Steuerschaltkreise für Photovervielfacher sind daher üblicherweise mit
Schutzabschaltungen für die Hochspannung ausgerüstet, die auf eine zu große Stromdichte reagieren. Eine solche Schutzabschaltung kann beispielsweise gemäß JP 2004 069752 A2 mittels eines Komparators in Abhängigkeit des Anodensignals erfolgen. Die Reaktionszeit der Hochspannung liegt dabei im Bereich von
Millisekunden, da die Hochspannung nach Abschaltung der Spannungsquelle nur langsam zusammenbricht und sich beim Einschalten entsprechend langsam wieder aufbaut. Das ist im Vergleich zur Pixelverweilzeit von typischerweise einigen
Mikrosekunden sehr träge. Dadurch kommt es beim Abtasten einer sehr hellen Stelle zu einer späten Abschaltung des PMT, wodurch die Gefahr einer Schädigung fortbesteht. Schließlich kommt es aufgrund der Trägheit zu einer noch stärker verzögerten Wiedereinschaltung des PMT, wodurch nachfolgende Probenbereiche überhaupt nicht aufgenommen werden können. Fig. 1 soll diese Folgen an einem Beispiel verdeutlichen. Zum besseren Verständnis sind die räumlich-zeitlichen Verhältnisse vereinfacht dargestellt. Eine Probe wird entlang eines Abtastfelds X mit einem Lichtstrahl abgetastet (Bewegungsrichtungen durch Pfeile angedeutet). Währenddessen werden konfokal die lokalen
Fluoreszenzintensitäten im momentanen Zielfleck mittels eines PMT (nicht abgebildet) mit eingeschalteter Hochspannung in Pixel P aufgenommen (durch durchgezogenen schwarzen Linienabschnitt angedeutet). In Teilfigur 1A erfolgt die Beleuchtung während Abtastung bidirektional, der Lichtstrahl und die Detektion sind über das gesamte Abtastfeld X hinweg eingeschaltet. In Teilfigur 1 B erfolgen die Beleuchtung und Detektion unidirektional, der Lichtstrahl wird am Anfang der Zeile ein- und beim Zeilenrücklauf ausgeschaltet; Pixel werden nur in jeder Zeile nur in einer Richtung aufgenommen.
Beim Eintritt des Zielflecks des Lichtstrahls in eine zu bleichende Region R
(Zeitpunkt A) wird in beiden Varianten die in die Probe eingestrahlte Lichtleistung stark erhöht, um dort vorhandene Fluorophore gezielt zu zerstören. Dadurch wird jedoch die vom PMT aufgenommene Lichtintensität so hoch, dass der PMT überlastet wird (durchgezogener weißer Linienabschnitt). Die Schutzabschaltung seiner Betriebshochspannung aufgrund seines starken Anodensignals dauert jedoch einige Zeit (durch die vereinfachte Darstellung hier nur etwa drei Pixel P), in der die Überlastung anhält, wodurch der PMT Empfindlichkeit einbüßt und seine
Lebensdauer verkürzt wird. Erst im Zeitpunkt B ist die Hochspannung
zusammengebrochen. Der Abtastvorgang wird dann mit abgeschalteter
Hochspannung (unterbrochener Abschnitt der Linie) fortgesetzt. Wenn der Zielfleck die zu bleichende Region R verlässt, wird die Lichtleistung wieder auf den ursprünglichen Wert herabgesetzt. Die Schutzschaltung detektiert daraufhin die abfallende Lichtintensität anhand des schwachen Anodensignals, woraufhin die Hochspannung wieder eingeschaltet wird. Aufgrund der Schaltträgheit dauert es einige Zeit (durch die Vereinfachung hier nur etwa fünf Pixel P), bis im Zeitpunkt C die Hochspannung aufgebaut ist (durchgezogener schwarzer Linienabschnitt) und der PMT wieder korrekte Daten liefert. Dadurch werden die in Abtastrichtung hinter der Region R liegenden Pixel bis zum Zeitpunkt C nicht korrekt abgebildet. Es ist zwar möglich, die Schutzabschaltung der Hochspannung stillzulegen, um auch solche Probenbereiche mit auf hohe Intensität folgender niedriger Intensität aufnehmen zu können. Unter der hohen Belastung leidet jedoch der PMT umso mehr. Am Ende des Abtastfeldes X wird der Lichtstrahl und damit der resultierende Zielfleck wieder zum Anfang des Abtastfeldes X geleitet (strichpunktierte Linie).
Während des Rücklaufs zum Anfang des Abtastfeldes X ist der Lichtstrahl
ausgeschaltet und der Zielfleck daher unbeleuchtet.
Als Alternative zur Abschaltung der Hochspannung ist es bekannt, einen
mechanischen Verschluss (engl,„shutter") vor einem PMT einzusetzen. Dabei kann die Hochspannung zwar angelegt bleiben. Mechanische Verschlüsse weisen jedoch eine noch längere Schaltzeit auf als eine rein elektrische Schutzabschaltung, so dass die Gefahr für eine Schädigung des PMT größer ist.
Beim Beobachten dynamischer Prozesse ist die Zeit, die zwischen dem Bleich-, Freisetzungs- oder Aktivierungsvorgang und der Bildaufnahme verstreicht, kritisch für den Erfolg des Experiments. Aufgrund der oben beschriebenen Trägheit der
Schutzabschaltung wurden andere Wege versucht, bei denen auf eine
Schutzabschaltung verzichtet werden kann. Beispielsweise ist es bekannt, zur Bildaufnahme eine zweite Abtasteinheit zu verwenden, so dass ein Rastervorgang zur Belichtung und ein unabhängiger Rastervorgang zur Bildaufnahme möglich ist. Der lichtaufnehmende Rastervorgang wird mittels der zweiten Abtasteinheit erst durchgeführt, wenn der bleichende/freisetzende/photoaktivierende Rastervorgang mittels der ersten Abtasteinheit beendet ist. Die dafür benötigte spezielle
Mikroskopanordnung ist jedoch aufwendig. Eine andere Vorgehensweise besteht darin, bei unidirektionaler Bildaufnahme das Bleichen während des Zeilenrücklaufs des Lichtstrahls durchzuführen. Die oben beschriebenen Nachteile für die
Lebensdauer des Detektors können hier ebenfalls auftreten, wenn die verstärkt zu belichtende Region nah am Ende der zurücklaufenden Zeile endet. Im übrigen kann die Zeit zwischen Belichtung und Bildaufnahme stets dadurch reduziert werden, dass das Abtastfeld auf die zu beobachtende Region R verkleinert (engl,„cropped") wird, so dass weniger Pixel belichtet und aufgenommen werden, und/oder indem die Auflösung verringert wird, insbesondere in Verbindung mit einer Veränderung des Abbildungsmaßstabs (engl,„zooming"). Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Rastermikroskop der eingangs genannten Art zu verbessern und ein entsprechendes Steuerverfahren anzugeben, die einen besseren Schutz des PMT vor Überlastung ermöglichen.
Die Aufgabe wird gelöst durch eine konfokales Rastermikroskop, welches die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale aufweist, durch ein Steuerverfahren, welches die in Anspruch 12 angegebenen Merkmale aufweist, und durch ein
Manipulationsverfahren, welches die in Anspruch 15 angegebenen Merkmale aufweist.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß weist ein konfokales Rastermikroskop einen Schalter auf, der zwischen einem aktivierten Schaltzustand und einem desaktivierten Schaltzustand umschaltbar ist, wobei er in dem aktivierten Schaltzustand im Vergleich zu dem desaktivierten Schaltzustand die (innere) Spannung zwischen der Photokathode und der ersten Dynode reduziert, und eine Steuereinheit, die eingerichtet ist zum
Bewegen (mindestens) eines mittels der Lichtquelle bestrahlbaren Zielflecks über ein Abtastfeld mittels der Ablenkeinheit, wobei die Steuereinheit beim Eintritt des
Zielflecks in eine vorgegebene Region des Abtastfeldes den Schalter aktiviert und beim Verlassen der Region den Schalter desaktiviert. Beispielsweise kann der aktivierte Schaltzustand einer geschlossenen Schalterstellung entsprechen und der desaktivierte Schaltzustand einer offenen Schalterstellung oder umgekehrt.
Entscheidend für die Gesamtverstärkung eines PMT ist die Funktion der ersten Beschleunigungsstufe der Dynodenkaskade. Durch Reduzieren der Spannung zwischen der ersten Dynode und der Photokathode mittels des Schalters kann die erste Beschleunigungsstufe mit extrem kurzen Reaktionszeiten von unter einer Mikrosekunde abgeschwächt, ausgeschaltet oder zur Elektronenbremsung umgepolt werden. Das ermöglicht die pixelgenaue Beeinflussung der
Sekundärelektronenvervielfachung und damit der Empfindlichkeit des PMT. Werden in der ersten Beschleunigungsstufe wenige oder keine Elektronen beschleunigt, kommen entsprechend wenige oder keine in die nächsten Stufen, so dass das Anodensignal wesentlich schwächer wird als bei normaler Spannung auf der ersten Beschleunigungsstufe. Dadurch ist der PMT insbesondere vor Restgasionisierung geschützt. Durch die ortsabhängige Aktivierung des Schalters wird die Reaktionszeit, die auf der im Stand der Technik bekannten Auswertung des Anodensignals beruht, vollständig vermieden.
Der Schalter für die Spannung zwischen der ersten Dynode und der Photokathode kann zusätzlich zur Ortsabhängigkeit auch in Abhängigkeit des Anodensignals gesteuert werden, um den PMT auch außerhalb vorgegebener Regionen vor
Überlastung zu schützen und den Aufnahmekontrast zu verbessern. Das gelingt beispielsweise mittels Komparatoren, die das Anodensignal mit mindestens einem Schwellwert vergleichen und in Abhängigkeit des Vergleichsergebnisses den
Schalter aktivieren oder desaktivieren.
Besonders vorteilhaft sind Ausführungsformen, bei denen der Schalter so
ausgebildet ist, dass er durch das Umschalten in den aktivierten Schaltzustand a) die Photokathode mit der ersten Dynode elektrisch kurzschließt oder b) die Spannung zwischen der Photokathode und der ersten Dynode umpolt, insbesondere in
Kombination mit einer Verringerung ihres Betrages. Diese Schaltwirkungen können mit geringem Schaltungsaufwand erreicht werden und ermöglichen eine besonders kurze Schaltzeit. Die Umpolung der Spannung zwischen erster Dynode und
Photokathode, beispielsweise von +150 V der ersten Dynode gegenüber der
Photokathode zu -150 V, wirkt als Elektronenbremse. Dadurch gelangen
näherungsweise keine Elektronen mehr zur Anode, das Anodensignal verschwindet. Auch dies stellt eine wirksame Abschaltung der ersten Beschleunigungsstufe dar. Im Sinne der Erfindung muss der Betrag der Spannung zwischen erster Dynode und Photokathode beim„Umpolen" nicht konstant bleiben, sondern kann verändert werden, beispielsweise gegenüber der Beschleunigungspolung verringert oder vergrößert werden. Das Umpolen ist jedoch aufwendiger als das Kurzschließen.
Vorzugsweise ist die elektrische Schaltung dazu ausgebildet, den Photovervielfacher unabhängig von dem Schaltzustand des Schalters mit einer äußeren
Betriebsspannung zu beaufschlagen - mit anderen Worten, die
Betriebshochspannung am PMT bleibt auch beim Aktivieren des Schalters aufrechterhalten. Dadurch steht auch bei reduzierter, ausgeschalteter oder bremsender erster Beschleunigungsstufe ein der einfallenden Lichtintensität proportionales Anodensignal zur Verfügung. Anhanddessen kann ortsunabhängig ein Ende eines sehr hellen Probenbereichs mit kurzer Reaktionszeit identifiziert werden. So kann die Bildaufnahme gleich nach Ende eines sehr hellen Probenbereichs wieder mit voller Empfindlichkeit fortgesetzt werden.
Zum Bleichen ist eine Ausführungsform zweckmäßig, in welcher die Lichtquelle hinsichtlich ihrer Lichtleistung (wahlweise zur Bildaufnahme oder zum Bleichen) einstellbar ist und die Steuereinheit die Lichtquelle beim Eintritt des Zielflecks in die vorgegebene Region auf eine höhere Lichtleistung (zum Bleichen) einstellt und beim Verlassen der Region auf eine niedrigere Lichtleistung (zur Bildaufnahme) einstellt. So können Überlastungsphasen beim Bleichen vollständig vermieden und damit die Genauigkeit des Überlastungsschutzes deutlich verbessert werden.
Besonders vorteilhaft sind Ausführungsformen mit mehreren Photovervielfachern, die jeweils einen erfindungsgemäßen Schalter aufweisen, der zwischen einem
aktivierten Schaltzustand und einem desaktivierten Schaltzustand umschaltbar ist, wobei er in dem aktivierten Schaltzustand die (innere) Spannung zwischen der Photokathode und der ersten Dynode des betreffenden Photovervielfachers reduziert, insbesondere, indem er a) die Photokathode mit der ersten Dynode elektrisch kurzschließt oder b) die Spannung zwischen der Photokathode und der ersten Dynode umpolt, insbesondere in Kombination mit einer Verringerung ihres Betrages. Durch die erfindungsgemäß verbesserte Lebenserwartung der
Photovervielfacher wird der Wartungsaufwand für das Mikroskop deutlich reduziert.
In einer ersten Ausgestaltung von Ausführungsformen mit mehreren
Photovervielfachern umfasst das Rastermikroskop dabei vorzugsweise Optiken zur simultanen Abbildung mehrerer Zielflecken auf mindestens einen jeweiligen
Photovervielfacher, wobei die Steuereinheit für jeden Zielfleck unabhängig von den anderen Zielflecken beim Eintritt in die vorgegebene Region die Schalter dieser Photovervielfacher aktiviert und beim Verlassen desaktiviert. Dies ermöglicht ein schnelles Abrastern des Abtastfeldes und entsprechend schnelles Bleichen und/oder eine schnelle Bildaufnahme. Zur Beleuchtung, Abtastung und Detektion mit mehreren Zielflecken wird auf DE 103 44 060 A1 , EP 2187252 A1 und US 6,028,306 verwiesen, deren Offenbarungsgehalt hier soweit als möglich einbezogen wird. Eine solche Ausführungsform umfasst zweckmäßigerweise auch Optiken zur simultanen Beleuchtung der mehreren Zielflecken.
In einer zweiten Ausgestaltung von Ausführungsformen mit mehreren
Photovervielfachern umfasst das Rastermikroskop (mindestens) ein optisches Element, das den Zielfleck räumlich-spektral aufspaltet und auf mehrere
Photovervielfacher abbildet, wobei die Steuereinheit beim Eintritt in die vorgegebene Region die Schalter aller dieser Photovervielfacher aktiviert und beim Verlassen desaktiviert. Das optische Element kann beispielsweise ein spektral selektiver Strahlteiler oder ein winkeldispersives Element wie ein Prisma oder ein Gitter sein. Zur räumlich-spektralen Aufspaltung mittels Strahlteilern wird auf DE 197 02 753 A1 verwiesen, deren Offenbarungsgehalt hier soweit als möglich einbezogen wird. Zur räumlich-spektralen Aufspaltung mittels winkeldispersiver Elemente wird auf
DE 100 33 180 A1 verwiesen, deren Offenbarungsgehalt hier soweit als möglich einbezogen wird. Es ist auch möglich, mehrere solche spektral aufspaltende
Elemente hintereinanderzuschalten, insbesondere mit unterschiedlichen
Dispersionsrichtungen, beispielsweise in Art eines Echelle-Spektrometers.
In einer dritten Ausgestaltung von Ausführungsformen mit mehreren
Photovervielfachern umfasst das Rastermikroskop eine Optik zum Abbilden verschiedener Raumwinkelsegmente einer Eingangsapertur auf (mindestens) einen jeweiligen Photovervielfacher, wobei die Steuereinheit beim Eintritt in die
vorgegebene Region die Schalter aller dieser Photovervielfacher aktiviert und beim Verlassen desaktiviert. Eine solche Optik ist beispielsweise aus EP 1664889 A1 bekannt, deren Offenbarungsgehalt hier soweit als möglich einbezogen wird. Diese Ausführungsform kann mit einer Ausführungsform kombiniert werden, in der mehrere Zielflecken simultan abgebildet werden. Zeckmäßigerweise erfolgt dann in jedem Teilstrahlengang eine entsprechende Abbildung von Raumwinkelsegmenten der betreffenden Eingangsapertur auf eine jeweilige Gruppe von Photovervielfachern. ln Ausführungsformen mit mehreren Photovervielfachern kann zumindest eine Untermenge der Photovervielfacher in einer Photovervielfacherzeile integriert sein. Derartige Zeilen sind kommerziell verfügbar, beispielsweise von Hamamatsu.
Das erfindungsgemäße Steuerverfahren umfasst folgende Schritte:
- Steuern der Lichtquelle zur Emission einer ersten Lichtleistung,
- Anlegen einer ersten elektrischen Spannung zwischen der Photokathode und der ersten Dynode zum Zweck einer Beschleunigung von Elektronen und
- Richten (mindestens) eines Lichtstrahls der Lichtquelle auf (mindestens) einen Zielfleck und Ablenken des Lichtstrahls derart, dass der Zielfleck sich über ein Abtastfeld bewegt (es abrasiert),
wobei während der Bewegung des Zielflecks folgende Unterschritte ausgeführt werden:
- Ermitteln einer Lage des Zielflecks,
- Identifizieren eines Erreichens einer vorgegebenen zu bleichenden Region des Abtastfelds anhand der Lage des Zielflecks und
- bei erfolgter Identifikation des Erreichens: Steuern der Lichtquelle zur Emission einer zweiten Lichtleistung (beispielsweise zum Bleichen), die größer ist als die erste Lichtleistung, und Anlegen einer zweiten elektrischen Spannung zwischen der Photokathode und der ersten Dynode anstelle der ersten Spannung, wobei die zweite Spannung niedriger ist als die erste Spannung, insbesondere durch genau einen der beiden Schritte„elektrisches Kurzschließen von Photokathode und erster Dynode" und„Umpolung der ersten Spannung, insbesondere in Kombination mit Verringerung ihres Betrages".
Die vorstehenden Schritte können beispielsweise von einem jeweiligen Software- Modul ausgeführt werden. Es ist auch möglich, dass ein Software-Modul mehrere der Schritte ausführt.
Vorzugsweise wird zum Anlegen der ersten Spannung eine äußere
Betriebsspannung an den Photovervielfacher angelegt wird, die beim Anlegen der zweiten Spannung (im wesentlichen) angelegt bleibt. Auf ein zeitintensives
Abschalten der Betriebshochspannung kann vorteilhafterweise verzichtet werden. Besonders vorteilhaft sind Ausführungsformen, bei denen während der Bewegung des Zielflecks zusätzlich folgende Unterschritte ausgeführt werden:
- Identifizieren eines Verlassens der vorgegebenen zu bleichenden Region des Abtastfelds anhand der Lage des Zielflecks und daraufhin
- bei erfolgter Identifikation: Steuern der Lichtquelle zur Emission der ersten
Lichtleistung und Anlegen der ersten Spannung zwischen der Photokathode und der ersten Dynode, insbesondere durch genau einen der beiden Schritte„Aufheben des Kurzschlusses von Photokathode und erster Dynode" und„Umpolung der zweiten Spannung, insbesondere mit Erhöhung ihres Betrages".
Auch diese Schritte können beispielsweise von einem jeweiligen Software-Modul ausgeführt werden. Es ist auch möglich, dass ein Software-Modul mehrere der Schritte ausführt.
Ganz allgemein umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Manipulieren einer Probe durch Bestrahlen verschiedener Orte der Probe mit einem Lichtstrahl bei
ortsabhängiger Lichtleistung mittels eines konfokalen Rastermikroskops, das einen Photovervielfacher, der eine Photokathode, mehrere Dynoden und eine Anode aufweist, umfasst, wobei eine elektrische Spannung zwischen der Photokathode und der ersten Dynode ortsabhängig angelegt wird, insbesondere bei (im wesentlichen) konstanter äußerer Betriebsspannung des Photovervielfachers.
Vorteilhafterweise können bei der Erfindung mehrere Regionen vorgegeben sein und die Photokathode und die erste Dynode für diese Regionen identisch angesteuert werden. So können simultan ablaufende Prozesse an unterschiedlichen Stellen der Probe beobachtet werden.
Die Lichtleistung der Lichtquelle kann vorzugsweise elektrooptisch, beispielsweise mittels eines elektrooptischen Modulators, oder akustooptisch, beispielsweise mittels eines akustooptischen Modulators, einstellbar sein.
Die Erfindung umfasst auch eine programmierbare Steuereinheit für ein konfokales Rastermikroskop oder Computerprogramm für eine solche Steuereinheit, eingerichtet zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Vorteilhafterweise weist der Schalter eine Reaktionszeit von maximal 1 s auf.
Dadurch ist einem LSM auch bei kurzen Pixelverweilzeiten eine pixelweise De- und Reaktivierung des PMT möglich. Besonders vorteilhaft ist, dass auch das
Wiederherstellen der normalen Spannung zwischen Photokathode und erster
Dynode mittels des Schalters beim Verlassen einer zu bleichenden Region und damit die Datenaufnahme mit ebenfalls mit extrem kurzen Reaktionszeiten von unter einer Mikrosekunde möglich ist. Zwischen zwei Dynoden liegt je nach PMT-Typ nur 1/9 bis 1/1 1 der Betriebshochspannung an, also typischerweise weniger als 150 V, was durch einen Schalter mit geringem Aufwand getrennt werden kann.
Zweckmäßigerweise ist der Schalter gegen eine Hochspannung des
Photovervielfachers isoliert.
Das erfindungsgemäße konfokale Rastermikroskop kann vorteilhafterweise in FLIP, FLAP, FRAP, Photoaktivierung und/oder Uncaging verwendet werden.
Die Erfindung stellt eine ortsabhängige, schnelle Schutzabschaltung für PMT dar. Sie ermöglicht einen verbesserten Schutz des PMT, insbesondere in Verbindung mit einer Bestrahlung mit ortsabhängiger Lichtleistung.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 schematisch das Abtasten einer Probe mit Bleichen einer Probenregion gemäß dem Stand der Technik,
Fig. 2 ein schematisches Schaltbild eines Laser-Scanning-Mikroskopes,
Fig. 3 ein vereinfachtes Schaltbild einer ersten PMT-Betriebsschaltung,
Fig. 4 ein vereinfachtes Schaltbild einer zweiten PMT-Betriebsschaltung und
Fig. 5 schematisch das Abtasten einer Probe mit Bleichen einer Probenregion gemäß der Erfindung. In allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen.
Fig. 1 zeigt die Folgen einer trägen Schutzabschaltung der Betriebshochspannung eines PMT in Abhängigkeit des Anodensignals des PMT gemäß dem Stand der Technik.
Fig. 2 zeigt das Schaltbild einer ersten beispielhaften Betriebsschaltung 1 für einen PMT 2. Zum besseren Verständnis sind nur solche Bestandteile dargestellt, die zum Verständnis der Erfindung beitragen. Der PMT 2 umfasst neben einem evakuierten Gehäuse (nicht dargestellt) eine Photokathode 2.1 , acht Dynoden 2.2...2.9 und eine Anode 2.10. Die Betriebsschaltung 1 umfasst eine Hochspannungsquelle 3, deren Spannung über einer Reihe von Widerständen 4 angelegt ist, so dass an jedem Widerstand 4 und den damit zwischen benachbarten Dynoden 2.1 ...2.10 eine jeweilige Teilspannung abfällt. Die resultierende Potentialkaskade vervielfältigt auf bekannte Weise die an der Kathode 2.1 ausgeschlagenen Photoelektronen. Der dadurch an der Anode 2.10 auftretende Strompuls kann beispielsweise mittels einer Strom-Spannungs-Wandlungseinheit (nicht abgebildet) in eine elektrische Spannung als Anodensignal D gewandelt werden.
Die Schaltung 1 weist einen hochspannungsisolierten Schalter 7 auf, dessen einer Pol mit der Photokatode 2.1 und dessen anderer Pol mit der ersten Dynode 2.2 verbunden ist. Der Schalter 7 kann beispielsweise als Optokoppler,
Isolationsverstärker oder Relais ausgeführt sein. Er ist zweckmäßigerweise als Schließer ausgebildet und bewirkt in diesem Ausführungsbeispiel im geschlossenen (aktivierten) Schaltzustand einen Kurzschluss zwischen Photokathode 2.1 und erster Dynode 2.2 und desaktiviert damit die erste Beschleunigungsstufe des PMT 2. Der Schalter 7 schließt, solange das von der Steuereinheit 34 ausgegebene
Schaltsignal Q beispielsweise mindestens eine vorgegebene negative Höhe aufweist. Öffnet die Steuereinheit 34 den Arbeitskontakt des Schalters 7 wieder, in dem sie beispielsweise ein positiveres Signal Q an ihn ausgibt, so baut sich die Beschleunigungsspannung zwischen Kathode 2.1 und erster Dynode 2.2 in kürzestmöglicher Zeit wieder auf. Die erste Beschleunigungsstufe ist damit reaktiviert. Während des gesamten Vorgangs der Des- und Reaktivierung des PMT 2 wird die Hochspannung HV der Spannungsquelle 3 aufrechterhalten.
Neben dem Schalter 7 kann die Steuereinheit 34 auch die Lichtquelle 25 hinsichtlich der abgegebenen Lichtleistung steuern. Vorzugsweise aktiviert sie den Schalter 7 immer dann, wenn sie die Lichtquelle 25 von einer niedrigeren auf eine höhere Lichtleistung umschaltet. Vorzugsweise desaktiviert sie den Schalter 7 immer dann, wenn sie die Lichtquelle 25 von einer höheren auf eine niedrigere Lichtleistung umschaltet.
In Fig. 3 ist ein Laser-Scanning-Mikroskop 10 mit ortsabhängiger, schneller
Schutzabschaltung gemäß Fig. 1 schematisch dargestellt. Das LSM 10 ist modular aus einem Beleuchtungsmodul L mit Lasern 23, einem Abtastmodul S (engl, „scanning module"), einem Detektionsmodul D und der Mikroskopeinheit M mit dem Mikroskopobjektiv 31 zusammengesetzt.
Das Licht der Laser 23 kann durch Lichtklappen 24 und Abschwächer 25,
beispielsweise akustooptische einstellbare Filter (engl,„acousto-optic tunable filter"; AOTF), von der Steuereinheit 34 beeinflusst werden, bevor es über Lichtleitfasern und Koppeloptiken 20 in das Abtastmodul S eingespeist und vereinigt wird. Über den Hauptstrahlteiler 33 und die X- Y-Abtasteinheit 30 (engl.„Scanner"), die zwei
Galvanometerspiegel aufweist (nicht dargestellt), gelangt es durch das
Mikroskopobjektiv 21 zur Probe 22, wo es einen Zielfleck T beleuchtet. Nachfolgend werden die Abschwächer 25 stellvertretend für die Kombination aus Laser 23, Lichtklappen 24 und Abschwächern 25 als Lichtquelle bezeichnet.
Von der Probe reflektiertes Licht oder emittiertes Fluoreszenzlicht gelangt durch das Mikroskopobjektiv 21 und weiter über die Abtasteinheit 30 durch den
Hauptstrahlteiler 33 in das Detektionsmodul D. Der Hauptstrahlteiler 33 kann beispielsweise als dichroitischer Farbteiler ausgebildet sein. Das Detektionsmodul D weist mehrere Detektionskanäle mit jeweils einer Lochblende 31 , einem Filter 28 und einem PMT-Detektor 2 auf, die durch Farbteiler 29 separiert sind. Anstelle von Lochblenden 31 können, beispielsweise bei linienförmiger Beleuchtung, auch Schlitzblenden (nicht abgebildet) verwendet werden. Die konfokalen Lochblenden 31 dienen der Diskriminierung von Probenlicht, das nicht aus dem den Zielfleck T umgebenden Fokusvolumen stammt. Die Detektoren 2 detektieren daher
ausschließlich Licht aus dem Fokusvolumen. Die Detektoren 2 umfassen eine jeweilige Betriebsschaltung 1 , die eine Betriebshochspannung bereitstellt und einen Schalter (der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt) zur Beeinflussung der
Spannung zwischen der Photokathode und der ersten Dynode unabhängig von der Betriebshochspannung umfasst, sowie eine jeweilige Auswerteelektronik (hier nicht näher dargestellt). In anderen Ausführungsformen (nicht dargestellt) kann die
Auswerteelektronik von den Detektoren 2 abgesetzt sein, insbesondere kann sie außerhalb des Detektionsmoduls D angeordnet sein.
Der Schalter zur Beeinflussung der Spannung zwischen der Photokathode und der ersten Dynode ist beispielsweise so mit der Photokathode und der ersten Dynode verbunden, dass er in einer aktivierten Schaltstellung die Photokathode und die erste Dynode elektrisch kurzschließt, so dass zwischen der ersten Dynode und der Photokathode eine Spannung von 0 V anliegt, und in einer desaktivierten
Schaltstellung den Kurzschluss aufhebt, so dass zwischen der ersten Dynode und der Photokathode die reguläre Spannung anliegt, beispielsweise +150 V.
Der konfokal beleuchtete und aufgenommene Zielfleck T in der Probe 22 kann mittels der Abtasteinheit 30 über oder durch die Probe 22 bewegt werden, um pixelweise ein Bild aufzunehmen, indem die Galvanometerspiegel der Abtasteinheit 30 gezielt verdreht werden. Sowohl die Bewegung der Galvanometerspiegel als auch das Schalten der Beleuchtung mittels der Lichtklappen 24 oder der Abschwächer 25 werden beispielsweise unmittelbar von der Steuereinheit 34 gesteuert. Die
Datenaufnahme von den Detektoren 2 erfolgt ebenfalls durch die Steuereinheit 34, ebenso die Steuerung des Schalters zur Beeinflussung der Spannung zwischen Photokathode und erster Dynode. Die Auswerteeinheit/Steuereinheit 34 kann beispielsweise ein handelsüblicher elektronischer Rechner (engl.„Computer") sein.
In einer alternativen Ausführungsform (nicht abgebildet) können durch eine Optik im Beleuchtungsstrahlengang, beispielsweise einem Linsenfeld (engl. Jens array"), simultan mehrere Zielflecken T in der Probe 22 beleuchtet werden.
Zweckmäßigerweise sind im Detektionsstrahlengang dann mehrere PMT 2 so angeordnet, dass sie in einem jeweiligen Teilstrahlengang jeweils genau einen der Zielflecken T konfokal detektieren. Zusätzlich oder alternativ kann im
Detektionsstrahlengang (bei mehreren Zielflecken beispielsweise in jedem
Teilstrahlengang) vor dem Detektor 2 (bei mehreren Zielflecken beispielsweise vor jedem Detektor) eine räumlich-spektrale Aufspaltung erfolgen, beispielsweise durch ein jeweiliges winkeldispersives Element.
In alternativen Ausführungsformen (in Fig. 3 nicht abgebildet) kann der Schalter zur Beeinflussung der Spannung zwischen der Photokathode und der ersten Dynode beispielsweise so mit der Photokathode und der ersten Dynode verbunden sein, dass in einer aktivierten Schaltstellung eine positive Spannung von beispielsweise +150 V zwischen der ersten Dynode und der Photokathode anliegt und in einer desaktivierten Schaltstellung eine negative Spannung von beispielsweise -150 V zwischen der ersten Dynode und der Photokathode anliegt.
Ein Beispiel für eine Betriebsschaltung 1 einer solchen alternativen Ausführung zeigt Fig. 4. Sie entspricht weitgehend der Schaltung 1 gemäß Fig. 2, jedoch ist hier der Schalter 7 zur Umpolung der Spannung zwischen erster Dynode 2.2 und
Photokathode 2.1 ausgebildet. Zu diesem Zweck schließt der Schalter 7 im
aktivierten Schaltzustand die Photokathode 2.1 mit der zweiten Dynode 2.3 elektrisch kurz. Im desaktivierten Schaltzustand besteht die reguläre Zuordnung der
Dynoden 2.1 ...2.10 zu der Spannungsteilerkaskade. Aufgrund der Umpolung wirkt die erste Beschleunigungsstufe im aktivierten Schaltzustand des Schalters 7 als Elektronenbremse und verhindert damit wirksam große Photoelektronenströme.
Fig. 5 zeigt den Ablauf eines beispielhaften Steuerverfahrens für ein LSM 10, beispielsweise gemäß Fig. 2. Die Steuereinheit 34 nimmt in Schritt S1 zunächst mit einer reinen Detektions-Lichtleistung der Lichtquelle 25 auf an sich bekannte Weise ein Übersichtsbild von der Probe 22 auf und stellt es dem Benutzer visuell dar.
Anhand des Übersichtsbildes kann der Benutzer ein Abtastfeld X und eine
darinliegende, ihn interessierende Region (engl,„region of interest", ROI), in der die Probe 22 mit höherer Lichtleistung belichtet werden soll als außerhalb dieser
Region R, ermitteln. Sofern dem Benutzer das Abtastfeld X und/oder die Region R bereits bekannt ist, kann Schritt S1 entfallen. In Schritt S2 nimmt die Steuereinheit 34 vom Benutzer beispielsweise auf an sich bekannte Weise eine Angabe über die Probenregion R entgegen. Wenn das Abtastfeld X und/oder die Region R der Steuereinheit 34 aus einer anderen Quelle schon als Datensatz vorliegen, kann der betreffende Teilschritt entfallen.
Auf Anweisung des Benutzers stellt die Steuereinheit 34 in Schritt S3 die
Lichtquelle 25 auf Detektions-Lichtleistung und desaktiviert den Schalter 7. In Schritt S4 bewegt sie den Zielfleck T mittels der Ablenkeinheit 30 über die Probe 22 und ordnet dabei die vom Detektor 2 pro Pixelverweilzeit akkumulierten
Lichtintensitäten digital entsprechenden Pixeln zu. Sie vergleicht währenddessen laufend in Schritt S4a die momentane Lage des Zielflecks T mit der vorgegebenen Region R. Identifiziert sie, dass der Zielfleck T einen Rand der vorgegebenen Region R überschritten hat und dadurch zumindest teilweise in die Region
eingetreten ist, aktiviert sie den Schalter 7 und schaltet die Lichtquelle 25 auf Bleich- Lichtleistung um. Ebenso vergleicht sie während Schritt S4 laufend in Schritt S4b die momentane Lage des Zielflecks T mit der vorgegebenen Region R. Identifiziert sie, dass der Zielfleck T einen Rand der vorgegebenen Region R überschritten und dadurch die Region R wieder vollständig verlassen hat, desaktiviert sie den
Schalter 7 und schaltet die Lichtquelle 25 auf Detektions-Lichtleistung um. Die Bewegung des Zielflecks T über die Probe 22 in Schritt S4 wird solange fortgesetzt, bis das Erreichen des Endes des Abtastfeldes X identifiziert wird. Dann wird der Zielfleck T in Schritt S5 wieder an den Anfang des Abtastfeldes X bewegt und in Schritt S6 die Probe ausschließlich mit Detektions-Lichtleistung erneut abgetastet und dabei ein Bild aufgenommen. Zur Beobachtung dynamischer Prozesse in der Probe 22 ist es zweckmäßig, die Schritte S5 und S6 mehrmals zu wiederholen.
Fig. 6 zeigt die vorteilhaften Folgen des Einsatzes einer der oben beschriebenen Betriebsschaltungen 1 in einem LSM am Beispiel des Bleichens einer vorgegebenen Probenregion R. Im Gegensatz zum Stand der Technik (Fig. 1 ) erfolgt durch
Aktivieren des Schalters 7 im Zeitpunkt A mit dem Eintritt des Zielflecks in die zu bleichende Region R die Abschaltung des Detektors mit einem Fehler von weniger als einer Pixelverweilzeit. Zusammen mit dem Aktivieren des Schalters 7 wird die Lichtquelle 25 auf Bleich-Lichtleistung umgeschaltet. Die Reaktivierung der Detektion durch Desaktivieren des Schalters 7 und die Zurückschaltung der Lichtquelle 25 auf die normale Detektions-Lichtleistung erfolgen im Zeitpunkt B mit dem Austritt des Zielflecks aus der Region R. Dadurch können die nachfolgenden Pixel mit einem Fehler von maximal einem Pixel regulär detektiert werden.
Da das Abtastfeld X spalten- und zeilenweise abgerastert und in Pixel aufgenommen wird, erfolgen die Abschaltung und Reaktivierung in Verbindung mit der Umschaltung der Lichtleistung in allen Zeilen, über die sich die Region R erstreckt. Bei mehreren vorgegebenen Regionen R im Abtastfeld X kann es - je nach relativer Lage der Regionen R - pro Zeile mehrfach zu Abfolgen von Abschaltung und Reaktivierung kommen.
Generell hat die Erfindung den Vorteil, dass die Bildaufnahme durch Aktivieren des Schalters 7 pixelgenau beim Eintritt in eine vorgegebenen Region R ausgeschaltet und beim Austritt durch Desaktivieren des Schalters 7 wieder pixelgenau
eingeschaltet werden kann, so dass auch in einem bleichenden Abtastdurchgang ein Bild der Probe 22 mit Ausnahme der Region R aufgenommen werden kann. Dadurch kann eine quantitative Auswertung eines Probenbereichs, der außerhalb der
Region R liegt, beispielsweise im Rahmen von FLIP, mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden. Das gilt auch bei mehreren zu bleichenden Regionen R.
Bezugszeichenliste
1 Betriebsschaltung
2 PMT
2.1 Photokathode
2.2...2.9 Dynode
2.10 Anode
3 Hochspannungsquelle
4 Widerstand
5 Erster Komparator
6 Zweiter Komparator
7 Schalter
10 Laser-Scanning-Mikroskop
20 Kollimationsoptik
21 Mikroskopobjektiv
22 Probe
23 Laser
24 Lichtklappe
25 Abschwächer
26 Faserkoppler
27 Tubuslinse
28 Filter
29 Dichroitischer Strahlteiler
30 Abtasteinheit
31 Lochblende
32 Photovervielfacher
33 Hauptstrahlteiler
34 Steuereinheit
35 Dispersives Element
A, B, C Zeitpunkte
D Anodensignal
X Schaltsignal
HV/gnd Hochspannung/Masse
P Pixel

Claims

Patentansprüche
1 . Konfokales Rastermikroskop (10), das eine Lichtquelle (23, 24, 25), eine
einstellbare Strahl-Ablenkeinheit (30) und einen Photovervielfacher (2), der eine Photokathode (2.1 ), mehrere Dynoden (2.2...2.9) und eine Anode (2.10) aufweist, eine elektrische Schaltung (1 ) zur Beaufschlagung der Dynoden (2.2...2.9) mit einer jeweiligen Spannung gegenüber der Photokathode (2.1 ) und eine
Steuereinheit (34) zur Einstellung der Ablenkeinheit (30) umfasst,
gekennzeichnet durch
- einen Schalter (7), der zwischen einem aktivierten Schaltzustand und einem desaktivierten Schaltzustand umschaltbar ist, wobei er in dem aktivierten
Schaltzustand im Vergleich zu dem desaktivierten Schaltzustand die Spannung zwischen der Photokathode (2.1 ) und der ersten Dynode (2.2) reduziert, und
- eine Steuereinheit (34), die eingerichtet ist zum Bewegen (mindestens) eines mittels der Lichtquelle bestrahlbaren Zielflecks (T) über ein Abtastfeld (S) mittels der Ablenkeinheit (30), wobei die Steuereinheit (34) beim Eintritt des Zielflecks in eine vorgegebene Region (R) des Abtastfeldes (S) den Schalter (7) aktiviert und beim Verlassen der Region (R) den Schalter (7) desaktiviert.
2. Konfokales Rastermikroskop (10) nach Anspruch 1 , wobei der Schalter (7) durch das Umschalten in den aktivierten Schaltzustand:
a) die Photokathode (2.1 ) mit der ersten Dynode (2.2) elektrisch kurzschließt oder b) die Spannung zwischen der Photokathode (2.1 ) und der ersten Dynode (2.2) umpolt, insbesondere in Kombination mit einer Verringerung ihres Betrages.
3. Konfokales Rastermikroskop nach Anspruch 1 oder 2, wobei die elektrische
Schaltung (1 ) dazu ausgebildet ist, den Photovervielfacher (2) unabhängig von dem Schaltzustand des Schalters (7) mit einer äußeren Betriebsspannung zu beaufschlagen.
4. Konfokales Rastermikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schalter (7) eine Schaltzeit von maximal 1 s aufweist.
5. Konfokales Rastermikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle (23, 24, 25) hinsichtlich ihrer Lichtleistung einstellbar ist und die Steuereinheit (34) die Lichtquelle (23, 24, 25) beim Eintritt des Zielflecks in die vorgegebene Region (R) auf eine höhere Lichtleistung einstellt und beim
Verlassen der Region auf eine niedrigere Lichtleistung einstellt.
6. Konfokales Rastermikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend mehrere Photovervielfacher (2), die jeweils einen Schalter (7) aufweisen, der zwischen einem aktivierten Schaltzustand und einem
desaktivierten Schaltzustand umschaltbar ist, wobei er in dem aktivierten
Schaltzustand die Spannung zwischen der Photokathode (2.1 ) und der ersten Dynode (2.2) des betreffenden Photovervielfachers (2) reduziert, insbesondere, indem er a) die Photokathode (2.1 ) mit der ersten Dynode (2.2) elektrisch kurzschließt oder b) die Spannung zwischen der Photokathode (2.1 ) und der ersten Dynode (2.2) umpolt, insbesondere in Kombination mit einer Verringerung ihres Betrages.
7. Konfokales Rastermikroskop (10) nach Anspruch 6, umfassend Optiken zur
simultanen Abbildung mehrerer Zielflecken (T) auf mindestens einen jeweiligen Photovervielfacher (2), wobei die Steuereinheit (34) für jeden Zielfleck (T) unabhängig von den anderen Zielflecken (T) beim Eintritt in die vorgegebene Region (R) die Schalter (7) dieser Photovervielfacher (2) aktiviert und beim
Verlassen desaktiviert.
8. Konfokales Rastermikroskop (10) nach Anspruch 6, umfassend (mindestens) ein optisches Element (35), das den Zielfleck (T) räumlich-spektral aufspaltet und auf mehrere Photovervielfacher (2) abbildet, wobei die Steuereinheit (34) beim Eintritt in die vorgegebene Region (R) die Schalter (7) aller dieser Photovervielfacher (2) aktiviert und beim Verlassen desaktiviert.
9. Konfokales Rastermikroskop (10) nach Anspruch 6, umfassend (mindestens) eine Optik zum Abbilden verschiedener Raumwinkelsegmente einer Eingangsapertur auf (mindestens) einen jeweiligen Photovervielfacher (2), wobei die Steuereinheit (34) beim Eintritt in die vorgegebene Region (R) die Schalter (7) aller dieser Photovervielfacher (2) aktiviert und beim Verlassen desaktiviert.
10. Konfokales Rastermikroskop (10) nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei
zumindest eine Untermenge der Photovervielfacher (2) in einer
Photovervielfacherzeile integriert ist.
1 1 .Verwendung eines konfokalen Rastermikroskops (10) nach einem der
vorhergehenden Ansprüche in FLIP, FLAP, FRAP, Photoaktivierung und/oder Uncaging.
12. Steuerverfahren für ein konfokales Rastermikroskop (10) mit einer Lichtquelle (23, 24, 25) und einem Photovervielfacher (2), der eine Photokathode (2.1 ), mehrere Dynoden (2.2...2.9) und eine Anode (2.10) aufweist, umfassend folgende
Schritte:
- Steuern der Lichtquelle (23, 24, 25) zur Emission einer ersten Lichtleistung,
- Anlegen einer ersten elektrischen Spannung zwischen der Photokathode (2.1 ) und der ersten Dynode (2.2) zum Zweck einer Beschleunigung von Elektronen und
- Richten (mindestens) eines Lichtstrahls der Lichtquelle (23, 24, 25) auf
(mindestens) einen Zielfleck (T) und Ablenken des Lichtstrahls derart, dass der Zielfleck (T) sich über ein Abtastfeld (S) bewegt (es abrasiert),
wobei während der Bewegung des Zielflecks (T) folgende Unterschritte
ausgeführt werden:
- Ermitteln einer Lage des Zielflecks (T),
- Identifizieren eines Erreichens einer vorgegebenen zu bleichenden Region (R) des Abtastfelds (S) anhand der Lage des Zielflecks (T) und
- bei erfolgter Identifikation des Erreichens: Steuern der Lichtquelle (23, 24, 25) zur Emission einer zweiten Lichtleistung zum Bleichen, die größer ist als die erste Lichtleistung, und Anlegen einer zweiten elektrischen Spannung zwischen der Photokathode (2.1 ) und der ersten Dynode (2.2) anstelle der ersten Spannung, wobei die zweite Spannung niedriger ist als die erste Spannung, insbesondere durch genau einen der beiden Schritte„elektrisches Kurzschließen von Photokathode (2.1 ) und erster Dynode (2.2)" und„Umpolung der ersten
Spannung, insbesondere in Kombination mit Verringerung ihres Betrages".
13. Steuerverfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei zum Anlegen der ersten Spannung eine äußere Betriebsspannung an den Photovervielfacher (2) angelegt wird, die beim Anlegen der zweiten Spannung (im wesentlichen) angelegt bleibt.
14. Steuerverfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei während der Bewegung des Zielflecks (T) zusätzlich folgende Unterschritte ausgeführt werden:
- Identifizieren eines Verlassens der vorgegebenen zu bleichenden Region (R) des Abtastfelds (S) anhand der Lage des Zielflecks (T) und daraufhin
- bei erfolgter Identifikation: Steuern der Lichtquelle (23, 24, 25) zur Emission der ersten Lichtleistung und Anlegen der ersten Spannung zwischen der
Photokathode (2.1 ) und der ersten Dynode (2.2), insbesondere durch genau einen der beiden Schritte„Aufheben des Kurzschlusses von Photokathode (2.1 ) und erster Dynode (2.2)" und„Umpolung der zweiten Spannung, insbesondere mit Erhöhung ihres Betrages".
15. Verfahren zum Manipulieren einer Probe (22) durch Bestrahlen verschiedener Orte der Probe (22) mit einem Lichtstrahl bei ortsabhängiger Lichtleistung mittels eines konfokalen Rastermikroskops (10), das einen Photovervielfacher (2), der eine Photokathode (2.1 ), mehrere Dynoden (2.2...2.9) und eine Anode (2.10) aufweist, umfasst, wobei eine elektrische Spannung zwischen der
Photokathode (2.1 ) und der ersten Dynode (2.2) ortsabhängig angelegt wird, insbesondere bei (im wesentlichen) konstanter äußerer Betriebsspannung des Photovervielfachers (2).
16. Gegenstand nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mehrere
Regionen (R) vorgegeben sind und die Photokathode (2.1 ) und die erste
Dynode (2.2) für diese Regionen (R) identisch angesteuert werden.
17. Gegenstand nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtleistung der Lichtquelle (23, 24, 25) elektrooptisch (mittels eines elektrooptischen Modulators) oder akustooptisch (mittels eines akustooptischen Modulators) einstellbar ist.
18. Programmierbare Steuereinheit (34) für ein konfokales Rastermikroskop (10) oder Computerprogramm für eine solche Steuereinheit (34), eingerichtet zur
Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden
Verfahrensansprüche.
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