DE10333388A1

DE10333388A1 - Verfahren zur Rastermikroskopie und Rastermikroskop

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Publication number: DE10333388A1
Application number: DE10333388A
Authority: DE
Inventors: Irmtraud Dr. Steinmetz; Paul Suckling
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2003-07-23
Filing date: 2003-07-23
Publication date: 2005-02-10
Anticipated expiration: 2023-07-24
Also published as: DE10333388B4

Abstract

Ein Verfahren zur Rastermikroskopie an einer Probe, die zumindest zwei Bereiche mit stark unterschiedlicher Fluoreszenzlichtausbeute aufweist, beinhaltet zunächst den Schritt des Aufnehmens eines Voransichtsbildes und den Schritt des Ermittelns der Bereiche unterschiedlicher Fluoreszenzlichtausbeute aus dem Voransichtsbild. In einem weiteren Schritt wird für jeden der ermittelten Bereiche eine geeignete Beleuchtungslichtleistung und/oder eine geeignete Detektionsempfindlichkeit ermittelt. Schließlich erfolgt das Aufnehmen eines Abbildes der Probe, wobei beim Abrastern der ermittelten Bereich die ermittelte, jeweils geeignete Beleuchtungslichtleistung und/oder Detektionsempfindlichkeit eingestellt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Rastermikroskopie an einer Probe, die zumindest zwei Bereiche mit unterschiedlicher Fluoreszenzlichtausbeute aufweist.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Rastermikroskop zur Untersuchung einer Probe, die zumindest zwei Bereiche mit unterschiedlicher Fluoreszenzlichtausbeute aufweist, mit Mitteln zum Aufnehmen eines Voransichtsbildes.
In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird beispielsweise über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt.
Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealer Weise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position, diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise Bilddatennahme zu ermöglichen, wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht verschoben und so die nächste abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
Bei vielen Anwendungen werden Proben mit mehreren Markern, beispielsweise mehreren unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoften präpariert. Diese Farbstoffe können sequentiell, beispielsweise mit Beleuchtungslichtstrahlen, die unterschiedliche Anregungswellenlängen aufweisen, angeregt werden. Auch eine simultane Anregung mit einem Beleuchtungslichtstrahl, der Licht mehrerer Anregungswellenlängen beinhaltet, ist üblich. Aus der Europäischen Patentanmeldung EP 0 495 930 : „Konfokales Mikroskopsystem für Mehrfarbenfluoreszenz" ist beispielsweise ein Anordnung mit einem einzelnen mehrere Laserlinien emittierenden Laser bekannt. Derzeit sind in der Praxis solche Laser meist als Mischgaslaser, insbesondere als ArKr-Laser, ausgebildet. Es ist auch möglich mehrere unterschiedliche Farbstoffe mit Beleuchtungslicht einer einzigen Wellenlänge anzuregen, wenn diese Wellenlänge innerhalb der Anregungsbänder der Farbstoffe liegt.
Aus der Offenlegungsschrift DE 19829981 A1 ist ein Verfahren zur konfokalen Mikroskopie bei dem Laserlicht in einen Mikroskopstrahlengang eingekoppelt, zeitlich nacheinander auf verschiedene Orte einer Probe gerichtet und aus dem von den beaufschlagten Orten reflexierten und/oder emitierten Licht ein Bild der abgetasteten Ebene generiert wird, bekannt. Hierbei ist vorgesehen, dass während der Ablenkung des Laserstrahles von Ort zu Ort eine Veränderung der spektralen Zusammensetzung und/oder der Intensität des Lichts vorgenommen wird, während die Ablenkung ununterbrochen fortgesetzt wird. Dadurch wird erreicht, dass mindestens zwei nebeneinander liegende Orte der Probe mit lichtunterschiedlichen Spektraleigenschaften und/oder mit Laserstrahlung unterschiedlicher Leistung beaufschlagt werden.
Aus der Offenlegungsschrift DE 10043992 A1 ist ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe mit einem konfokalen Scanmikroskop, das einen Laser zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahls und eine Strahlablenkeinrichtung zur Führung des Beleuchtungslichtstrahls über die Probe aufweist, bekannt. Bei diesem Verfahren erfolgt zunächst ein Aufnehmen eines Voransichtsbildes. Anschließend wird mindestens ein interessierender Bereich im Voransichtsbild markiert. Dann erfolgt ein Zuordnen individueller Beleuchtungslichtstrahlwellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahlleistungen zu dem Bereich. Anschließend erfolgt ein Beleuchten des Bereichs der Probe gemäß der Zuordnung. Schließlich wird das von der Probe ausgehende Reflexions- und/oder Fluoreszenzlicht detektiert.
In der Praxis kommt es häufig vor, dass eine Probe, die beispielsweise mit mehreren Farbstoffen markiert ist, Bereiche hoher und Bereiche niedriger Fluoreszenzlichtausbeute aufweist. Wenn diese Probe mit einem Beleuchtungslichtstrahl einer konstanten Beleuchtungslichtleistung abgerastert wird, erscheinen die Bereiche hoher Fluoreszenzlichtausbeute oft stark überleuchtet, während die Bereiche niedriger Fluoreszenzlichtausbeute kaum zu erkennen sind. Gelegentlich treibt die hohe Detektionslichtleistung beim Abrastern der Bereiche hoher Fluoreszenzlichtausbeute die Detektoren in die Sättigung, während das Detektionslicht aus den Bereichen niedriger Fluoreszenzlichtausbeute ein kaum registrierbares Signal erzeugt. Große Schwankungen der Fluoreszenzlichtausbeute innerhalb der Probe können auch durch die Art der Präparation oder durch die Beschaffenheit der Strukturen innerhalb der Probe hervorgerufen werden. Bislang wurden solche Proben nicht untersucht, insbesondere da aufgrund des massiven Dynamikproblems der Detektoren eine spektrale Separation der verwendeten Farbstoffe nicht möglich war.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, das die Untersuchung einer Probe, die mehrere Bereiche mit stark unterschiedlicher Fluoreszenzlichtausbeute aufweist, zu ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

– Aufnehmen eines Voransichtsbildes,
– Ermitteln der zumindest zwei Bereiche aus dem Voransichtsbild,
– Ermitteln je einer geeigneten Beleuchtungslichtleistung und/oder einer geeigneten Detektionsempfindlichkeit für die ermittelten Bereiche und
– Aufnehmen eines Abbildes der Probe, wobei beim Abrastern der ermittelten Bereichen die ermittelte jeweils geeignete Beleuchtungslichtleistung und/oder Detektionsempfindlichkeit eingestellt wird.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Rastermikroskop anzugeben, das die Untersuchung einer Probe ermöglicht, die mehrere Bereiche stark untschiedlicher Fluoreszenzlichtausbeute, aufweist.
Die Aufgabe wird durch ein Rastermikroskop gelöst, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Vorrichtung zum Ermitteln der zumindest zwei Bereiche aus dem Voransichtsbild, und eine Vorrichtung zum Ermitteln je einer geeigneten Beleuchtungslichtleistung und/oder einer geeigneten Detektionsempfindlichkeit für die ermittelten Bereiche vorgesehen ist und dass ein Abbild der Probe aufnehmbar ist, wobei beim Abrastern der ermittelten Bereiche die ermittelte jeweils geeignete Beleuchtungslichtleistung und/oder Detektionsempfindlichkeit einstellbar ist.
Die Erfindung hat den Vorteil, dass die Gesamtdynamik des Systems derart erhöht ist, dass spektrale Separation der verwendeten Farbstoffe leicht ermöglicht ist. Darüber hinaus ist wirksam ein Ausbleichen der Bereiche hoher Fluoreszenzlichtausbeute vermieden.
In einer Variante erfolgt das Ermitteln der zumindest zwei Bereiche aus dem Voransichtsbild durch den Benutzer. Dieser teilt dem System die ermittelten Bereiche durch Markieren derselben mit einem Zeigegerät, beispielsweise einer Maus, mit.
In einer anderen Variante werden die Bereiche nach Abscannen des Voransichtsbildes automatisch ermittelt. Dies kann vorzugsweise rechnergesteuert anhand der ortsabhängigen Detektionslichtleistung und/oder anhand der ortsabhängigen Wellenlänge des Detektionslichts geschehen. Vorzugsweise erfolgt das Ermitteln je einer geeigneten Beleuchtungslichtleistung und/oder einer geeigneten Detektionsempfindlichkeit für die ermittelten Bereiche automatisch. In einer einfachen Variante wird die Lichtleistung des Beleuchtungslichts zunächst so gewählt, das das Detektionslicht aus den Bereichen niedriger Fluoreszenzlichtausbeute optimal detektierbar ist. Anschließend wird die Lichtleistung soweit reduziert, bis auch in den Bereichen hoher Fluoreszenzlichtausbeute eine detektierbare Detektionslichtleistung erzielt ist. Das Abscannen der Bereiche niedriger und hoher Fluoreszenzlichtausbeute kann sequenziell erfolgen. Vorzugsweise wird jedoch der Beleuchtungslichtstrahl mäanderförmig über die gesamte Probe geführt, wobei während des Abrasterns die Beleuchtungslichtleistung und/oder die Detektionsempfindlichkeit in Abhängigkeit davon, welchen Bereich der Beleuchtungslichtstrahl gerade überstreicht, eingestellt wird.
Vorzugsweise erfolgt das Einstellen der jeweils geeigneten Beleuchtungslichtleistung und/oder Detektionsempfindlichkeit automatisch mit Hilfe eines elektronischen Rechnersystems. Vorzugsweise sind die Beleuchtungslichtleistung und die Detektionsempfindlichkeit automatisch dem Bleich- und Sättigungsverhalten der jeweiligen Bereiche anpassbar.
Bei den Bereichen kann es sich um zweidimensionale Bereiche, beispielsweise innerhalb eines Probenschnittes oder auch um dreidimensionale Bereiche handeln.
Vorzugsweise werden die Bereiche dem Benutzer in einer einzigen gemeinsamen Darstellung angezeigt. Es ist jedoch auch möglich, die Bereiche getrennt voneinander in unterschiedlichen Darstellungen abzubilden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Rastermikroskops ist zum Einstellen der jeweils geeigneten Beleuchtungslichtleistung ein akustooptisches Bauteil, beispielsweise ein AOTF oder ein AOM oder ein LCD-Element vorgesehen. Es ist jedoch auch möglich, die Beleuchtungslichtleistung durch Regeln der Lichtquellen selbst zu variieren.
Die Detektionsempfindlichkeit kann bei der Verwendung von Photomultipliern als Detektor beispielsweise durch Einstellen der Photomultiplierspannung vorgegeben werden. Es ist auch möglich, die Detektionsempfindlichkeit optisch beispielsweise durch das Einfügen von optischen Abschwächern, wie Neutralfiltern zu bewerkstelligen.
In einer ganz besonders bevorzugen Ausgestaltung ist das Rastermikroskop ein konfokales Rastermikroskop.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
1 ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
2 einen Probenschnitt mit Bereichen unterschiedlicher Fluoreszenzlichtausbeute.
1 zeigt ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop mit einem Laser 1, der einen Beleuchtungslichtstrahl 3 emittiert. Der Beleuchtungslichtstrahl 3 durchläuft einen AOTF 5 (Acousto optical tunable filter) und trifft anschließend auf den Hauptstrahlteiler 7, der den Beleuchtungslichtstrahl 3 zu der Strahlablenkeinheit 9 reflektiert. Die Strahlablenkeinheit 9 beinhaltet einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 11, der das Beleuchtungslicht durch die Scanlinse 13 und die Tubuslinse 15 und durch das Objektiv 17 weitgehend mäanderförmig über die Probe 19 führt. Das von der Probe 19 ausgehende Fluoreszenzlicht 21 gelangt auf dem selben Lichtweg, nämlich durch das Objektiv 17, die Tubuslinse 15, die Scanlinse 13 und über die Strahlablenkeinrichtung 9 zurück zum Hauptstrahlteiler 7, passiert diesen und trifft auf den Detektor 23, der als Multibanddetektor 25 ausgeführt ist. Der Multibanddetektor 25 beinhaltet mehrere spektral unterschiedliche Detektionskanäle, von denen jeder über einen nicht gezeigten Photomultiplier verfügt. Der Detektor 23 erzeugt elektrische zur Leistung des Detektionslichts proportionale Signale, die an die Verarbeitungseinheit 27 weitergegeben werden.
Nach dem Aufnehmen eines Voransichtsbildes ermittelt die Verarbeitungseinheit 27 aus den Daten des Voransichtsbildes die Bereiche mit unterschiedlicher Fluoreszenzlichtausbeute und ermittelt weiter für jeden der Bereiche eine geeignete Beleuchtungslichtleistung und/oder Detektionsempfindlichkeit. Beim Aufnehmen eines endgültigen Abbildes der Probe, also beim Abrastern steuert die Verarbeitungseinheit 27 sowohl die Spannungen der Photomultiplier des Multibanddetektors 25 als auch die Beleuchtungslichtleistung des Beleuchtungslichtstrahls 3. Hierzu variiert die Verarbeitungseinheit 27 die von einer Hochfrequenzquelle 29 auf den AOTF gegebene HF-Leistung. Das von dem AOTF 5 nicht in den Strahlengang des Rastermikroskops eingekoppelte Licht 31 wird in einer Strahlfalle 33 gefangen. Die Daten, die beim Abrastern der Probe gewonnen werden, werden an einen PC 35 weitergegeben, auf dessen Monitor 37 das Abbild der Probe dargestellt wird. Der PC 35 verfügt über ein Zeigegerät, nämlich eine Computermaus 39, mit der der Benutzer im Bedarfsfall die Bereiche unterschiedlicher Fluoreszenzlichtausbeute von Hand markieren kann.
2 zeigt den Schnitt durch eine Probe mit einem ersten Bereich 41, einem zweiten Bereich 43 und dem Umgebungsbereich 45, wobei der erste Bereich 41, der zweite Bereich 43 und der Umgebungsbereich unterschiedliche Fluoreszenzlichtausbeuten aufweisen. Bei dem ersten Bereich 41 handelt es sich z.B. um eine mit dem Farbstoff Alexa 488 markierte Struktur, während der zweite Bereich 43 ein mit GFP (Green Fluorescent Protein) markierter Bereich ist. Das Beleuchtungslicht, das eine Wellenlänge von 488 nm aufweist, wird entlang der mit dem Bezugszeichen 47 versehenen Scanlinie über den Probenschnitt geführt.
Aus einem Voransichtsbild wurden bereits die jeweils geeigneten Beleuchtungslichtleistungen und Detektionsempfindlichkeiten für den Umgebungsbereich 45, den ersten Bereich 41 und den zweiten Bereich 43 ermittelt. Beim Abfahren der Scanlinie 47 wird beim Überstreichen des ersten Bereichs 41 bzw. des zweiten Bereichs 43 automatisch von der für den Umgebungsbereich 45 vorgesehenen Beleuchtungslichtleistung bzw. Detektionsempfindlichkeit auf die für den ersten bzw. zweiten Bereich vorgesehene Beleuchtungslichtleistung bzw. Detektionsempfindlichkeit umgeschaltet.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.

1: Laser
3: Beleuchtungslichtstrahl
5: AOTF
7: Hauptstrahlteiler
9: Strahlablenkeinheit
11: Scanspiegel
13: Scanlinse
15: Tubuslinse
17: Objektiv
19: Probe
21: Fluoreszenzlicht
23: Detektor
25: Multibanddetektor
27: Verarbeitungseinheit
29: Hochfrequenzquelle
31: Licht
33: Strahlfalle
35: PC
37: Monitor
39: Computermaus
41: erster Bereich
43: zweiter Bereich
45: Umgebungsbereich
47: Scanlinie

Claims

Verfahren zur Rastermikroskopie an einer Probe, die zumindest zwei Bereiche mit unterschiedlicher Fluoreszenzlichtausbeute aufweist, gekennzeichnet durch folgende Schritte: – Aufnehmen eines Voransichtsbildes, – Ermitteln der zumindest zwei Bereiche aus dem Voransichtsbild, – Ermitteln je einer geeigneten Beleuchtungslichtleistung und/oder einer geeigneten Detektionsempfindlichkeit für die ermittelten Bereiche und – Aufnehmen eines Abbildes der Probe, wobei beim Abrastern der ermittelten Bereichen die ermittelte jeweils geeignete Beleuchtungslichtleistung und/oder Detektionsempfindlichkeit eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt – Markieren zumindest eines der ermittelten Bereiche.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Markieren das Umfahren des zumindest einen Bereichs mit einem Zeigegerät erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Ermitteln der Bereiche aus dem Voransichtsbild automatisch erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche aus dem Voransichtsbild an Hand der ortsabhängigen Detektionslichtleistung ermittelbar sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche aus dem Voransichtsbild an Hand der ortsabhängigen Wellenlänge des Detektionslichtes ermittelbar sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Ermitteln je einer geeigneten Beleuchtungslichtleistung und/oder einer geeigneten Detektionsempfindlichkeit für die ermittelten Bereiche automatisch erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass den Bereichen einer höheren Fluoreszenzlichtausbeute eine höhere Beleuchtungslichtleistung und/oder Detektionsempfindlichkeit zugeordnet wird, als den Bereichen einer niedrigeren Fluoreszenzlichtausbeute.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Einstellen der jeweils geeigneten Beleuchtungslichtleistung und/oder Detektionsempfindlichkeit automatisch erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe einen Fluoreszenzfarbstoff beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mehrere Fluoreszenzfarbstoffe beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche zweidimensional sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche dreidimensional sind.
Rastermikroskop zur Untersuchung einer Probe, die zumindest zwei Bereiche mit unterschiedlicher Fluoreszenzlichtausbeute aufweist, mit Mitteln zum Aufnehmen eines Voransichtsbildes, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorrichtung zum Ermitteln der zumindest zwei Bereiche aus dem Voransichtsbild, und eine Vorrichtung zum Ermitteln je einer geeigneten Beleuchtungslichtleistung und/oder einer geeigneten Detektionsempfindlichkeit für die ermittelten Bereiche vorgesehen ist und dass ein Abbild der Probe aufnehmbar ist, wobei beim Abrastern der ermittelten Bereiche die ermittelte jeweils geeignete Beleuchtungslichtleistung und/oder Detektionsempfindlichkeit einstellbar ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zum Ermitteln der zumindest zwei Bereiche und/oder die Vorrichtung zum Ermitteln je einer geeigneten Beleuchtungslichtleistung eine elektronische Rechnereinheit umfasst.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die ermittelten Bereiche markierbar sind.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zeigegerät zum markieren der ermittelten Bereiche vorgesehen ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die ermittelten Bereiche automatisch – vorzugsweise rechnergesteuert – markierbar sind.
Rastermikroskop nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche aus dem Voransichtsbild automatisch – vorzugsweise rechnergesteuert – ermittelbar sind.
Rastermikroskop nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche aus dem Voransichtsbild an Hand der ortsabhängigen Detektionslichtleistung ermittelbar sind.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 19 oder 20 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche aus dem Voransichtsbild an Hand der ortsabhängigen Wellenlänge des Detektionslichtes ermittelbar sind.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Ermitteln je einer geeigneten Beleuchtungslichtleistung und/oder einer geeigneten Detektionsempfindlichkeit für die ermittelten Bereiche automatisch – vorzugsweise rechnergesteuert – erfolgt.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Einstellen der jeweils geeigneten Beleuchtungslichtleistung und/oder Detektionsempfindlichkeit automatisch – vorzugsweise rechnergesteuert – erfolgt.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zum Einstellen der jeweils geeigneten Beleuchtungslichtleistung ein akustooptisches Bauteil, beispielsweise ein AOTF oder ein AOM, oder ein LCD-Element vorgesehen ist.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche zweidimensional sind.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche dreidimensional sind.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Rastermikroskop ein konfokales Rastermikroskop ist.