WO2012157237A1 - 骨形成促進剤 - Google Patents

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WO2012157237A1
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plexin
semaphorin
antibody
sema4d
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高柳　広
貴子 根岸
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国立大学法人東京医科歯科大学
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Definitions

  • the present invention relates to an osteogenesis promoter and a bone disease prevention / treatment agent. More specifically, the present invention relates to an osteogenesis promoting agent comprising a binding inhibitor of semaphorin 4D and plexin B1 as an active ingredient, and a prophylactic / therapeutic agent for bone diseases.
  • osteoblasts responsible for bone formation and osteoclasts responsible for bone resorption work in a coordinated manner to maintain the function of the bone tissue by performing a good balance between bone formation and bone resorption. If the balance of bone metabolism is disrupted by factors such as aging and decreased ovarian function, and bone formation is reduced or bone resorption is abnormally increased, bone mass (bone density) is reduced and various bone diseases occur. Arise.
  • bone diseases fractures, bone defects, osteoporosis, osteomalacia, osteopenia, low back pain, Paget's disease, ankylosing spondylitis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis and the like are known.
  • an elderly person suffers from a bone disease, even the level of exercise required for daily life becomes difficult, and in some cases, there is a risk that the person will be bedridden as it is. Therefore, in today's aging society, it is important to prevent and treat bone diseases.
  • Bone is continuously regenerated by a process called bone remodeling (bone remodeling) that repeats the bone resorption stage followed by the bone formation stage.
  • bone remodeling factors that are either secreted from bone cells involved in osteoclast-osteoblast communication or released from the bone matrix.
  • TGF- ⁇ and IGF-1 released during bone resorption are known to stimulate bone formation and are therefore called coupling factors.
  • Axon guidance molecules are widely expressed outside the nervous system, where they control cell migration, immune response, tissue development, angiogenesis, and the like (see Non-Patent Documents 1 and 2). Recent studies have suggested that axon guidance molecules such as semaphorin and ephrin are involved in intercellular communication between osteoclasts and osteoblasts (see Non-Patent Documents 3 to 5).
  • Semaphorin 4D is secreted from oligodendrocytes and is known to induce growth cone collapse in the central nervous system. Semaphorin 4D has also been shown to be important in maintaining immune responses and immune system homeostasis.
  • Plexin-B1 Plexin-B1 (Plexin-B1) is known as one of the receptors for semaphorin 4D (see Non-Patent Document 6).
  • Non-Patent Document 7 suggests that osteoclast-derived semaphorin 4D may promote osteoblast differentiation-inhibiting action and osteoclast formation via osteoblasts.
  • Non-Patent Document 8 discloses that semaphorin 4D is not detected in osteoblasts but present on the surface of osteoclasts, and that semaphorin 4D (Sema4D) is a female deficient in sema4D ⁇ / ⁇ . It is disclosed that an increase in bone mass was observed in mice compared to wild type mice.
  • An object of the present invention is to provide an osteogenesis promoter that directly promotes osteogenesis by osteoblasts, and a prophylactic / therapeutic agent for bone diseases.
  • osteoclast-derived semaphorin 4D binds to the plexin B1 receptor on osteoblasts. Inhibits osteogenesis by activating the small G protein RhoA that inhibits osteoblast differentiation, reducing IRS signals (signals that promote osteoblast differentiation) and suppressing osteoblast differentiation
  • the anti-semaphorin 4D antibody and the anti-plexin B1 antibody have been found to directly promote bone formation by osteoblasts, and the present invention has been completed.
  • the present invention is characterized in that (1) a bone formation promoter comprising as an active ingredient a binding inhibitor between semaphorin 4D and plexin B1, and (2) the binding inhibitor is an anti-semaphorin 4D antibody.
  • the osteogenesis promoter described in (1) above or (3) the binding inhibitor is an anti-plexin B1 antibody or a protein containing an extracellular region of plexin B1. It relates to the osteogenesis promoter described.
  • the present invention also relates to (4) a prophylactic / therapeutic agent for bone diseases comprising as an active ingredient a binding inhibitor between semaphorin 4D and plexin B1, and (5) the binding inhibitor is an anti-semaphorin 4D antibody.
  • the preventive / therapeutic agent for bone diseases according to (4) above, or (6) the binding inhibitor is an anti-plexin B1 antibody or a protein containing an extracellular region of plexin B1
  • the bone disease prevention / treatment agent according to (4) above, or (7) bone disease is fracture, bone defect, osteoporosis, osteomalacia, osteopenia, low back pain, Paget's disease of bone,
  • the present invention provides (8) determining whether or not the test substance is a binding inhibitor between semaphorin 4D and plexin B1, and when the test substance is the binding inhibitor, A method for determining a candidate substance of an active ingredient of an osteogenesis promoter, wherein the substance is determined as a candidate substance of an active ingredient of an osteogenesis promoter, and (9) the test substance is semaphorin 4D, plexin B1, and
  • the determination method according to the above (8), wherein the method for determining whether or not the substance is a binding inhibitor has the following steps (A) to (D): (A) A step of bringing semaphorin 4D into contact with plexin B1 in the presence: (B) a step of measuring the degree of binding between semaphorin 4D and plexin B1: (C) the degree measured in the above step (B); Process to compare with its degree in the absence of test substance (D) When the degree measured in the above step (B) is lower than that in the absence of the test substance, the test
  • the present invention also relates to a method for screening a candidate substance for an active ingredient of an osteogenesis promoter.
  • bone formation by osteoblasts can be directly promoted, and bone diseases can be prevented and / or treated.
  • FIG. 1 shows a schematic of plexin B1, a plexin B1 RA mutant with a mutation in the GAP domain (R1661 / 1662 / 1968A), and a truncated mutant of plexin B1 lacking a PDZ binding domain ( ⁇ PDZ). It is a diagram showing the bone mass in the [mu] CT WT mice (control mice) as measured by analytical and dominant-negative RhoA (RhoA DN OB) mice.
  • FIG. 24 It is a figure which shows the trabecular space in the OVX mouse
  • the upper panel of FIG. 24 is a diagram showing the results of examining calcification when mouse osteoblasts were cultured in the presence of WT or Sema4d ⁇ / ⁇ mouse osteoclasts and anti-Sema4D antibody. is there.
  • the lower panel of FIG. 24 is a diagram showing the results of examining calcification when mouse osteoblasts were cultured in the presence of Fc-sema4d and / or anti-plexin B1 antibody.
  • the “bone formation promoter” of the present invention and the “prophylactic / therapeutic agent for bone diseases” of the present invention include semaphorin 4D and plexin B1.
  • the agent of the present invention includes semaphorin 4D and plexin B1.
  • binding inhibitor in the present invention a binding inhibitor (hereinafter simply referred to as “binding inhibitor in the present invention”) is used as an active ingredient, and the binding inhibitor in the present invention includes any vertebrate semaphore.
  • the binding inhibitory substance in the present invention inhibits the binding between osteoclast-derived semaphorin 4D and plexin B1 receptor on osteoblasts, and inhibits RhoA activation and IRS signal decrease, It is considered that osteogenesis promotes bone formation by inhibiting cell differentiation inhibition.
  • the term “inhibition” and the term “suppression” are used without distinction.
  • the anti-semaphorin 4D antibody and the anti-plexin B1 antibody may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a functional fragment thereof, A monoclonal antibody is preferable in terms of high specificity.
  • the above anti-semaphorin 4D antibody and anti-plexin B1 antibody can be prepared by a conventionally known method using semaphorin 4D and plexin B1.
  • the functional fragment that is the antibody of the present invention means a fragment of an antibody that specifically binds to semaphorin 4D or plexin B1, which is an antigen to which the antibody of the present invention specifically binds.
  • Such an antibody fragment can be obtained by a conventional method, for example, digestion of an antibody molecule with a protease such as papain or pepsin, or a known genetic engineering technique.
  • a protease such as papain or pepsin
  • a known genetic engineering technique for example, digestion of an antibody molecule with a protease such as papain or pepsin, or a known genetic engineering technique.
  • the antibody of this invention does not interfere with the antibody binding ability of an antibody or its functional fragment, what added the peptide or protein to the antibody or its functional fragment is contained for convenience.
  • the antibody of the present invention includes a human antibody.
  • the “human antibody” means an antibody that is an expression product of a human-derived antibody gene.
  • a human antibody can be obtained by introducing a human antibody locus and administering semaphorin 4D or plexin B1 to a transgenic animal capable of producing a human-derived antibody.
  • An example of the transgenic animal is a mouse.
  • mice capable of producing human antibodies include, for example, chromosome 14 fragment (SC20) lacking endogenous mouse immunoglobulin (Ig) heavy chain and mouse ⁇ light chain and containing human Ig heavy chain gene (SC20) and human A mouse that simultaneously holds an Ig ⁇ chain transgene (KCo5) can be mentioned.
  • This mouse is produced by crossing a strain A mouse having a human Ig heavy chain locus with a strain B mouse having a human Ig kappa chain transgene.
  • Strain A is homozygous for both endogenous Ig heavy chain and kappa light chain disruption, and has a mouse strain (Tomizuka. Et al., Proc Natl Acad Sci) carrying a progeny chromosome 14 fragment (SC20). USA., 2000 Vol97: 722).
  • Line B is a mouse line (Nat Biotechnol., 1996 Vol14: 845) that is homozygous for both the endogenous mouse Ig heavy chain and ⁇ light chain deficient and carries the human Ig ⁇ chain transgene (KCo5). .
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced, for example, by the method described below. It is obtained by immunizing non-human mammals such as mice, rabbits, goats and horses with semaphorin 4D and plexin B1 together with an immunostimulant (Freund's Adjuvant, etc.) as necessary.
  • the monoclonal antibody of the present invention is prepared by preparing a hybridoma from an antibody-producing cell obtained from an immunized animal and a myeloma cell (myeloma cell) having no autoantibody-producing ability, cloning the hybridoma, and reacting against the antigen used for immunization. By selecting a clone that produces a monoclonal antibody exhibiting specific affinity.
  • the hybridoma can be prepared according to the method of Köhler and Milstein et al. (Nature, 1975 Vol. 256: 495-497) and the like.
  • Hybridoma clones that produce monoclonal antibodies are screened by culturing the hybridomas in, for example, a microtiter plate, and the reactivity of the culture supernatant in the wells in which the growth has been observed with an immunoantigen, for example, an enzyme immunoassay method such as ELISA. It can be carried out by measuring using an immunological method such as radioimmunoassay or fluorescent antibody method.
  • the hybridomas can be cultured in vitro and isolated from the culture supernatant. It can also be cultured in vivo in ascites of mice, rats, guinea pigs, hamsters or rabbits and isolated from ascites.
  • a gene encoding a monoclonal antibody is cloned from an antibody-producing cell such as a hybridoma and incorporated into an appropriate vector, which is then used as a host (for example, a mammalian cell line such as Chinese hamster ovary (CHO) cell, E. coli, yeast cell, insect).
  • Recombinant antibodies can be prepared using genetic recombination technology (PJDelves, ANTIBODYODPRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, 1997 WILEY, P.Shepherd and C.Dean, Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, JWGoding, Monoclonal Antibodies: principles and practice, 1993 ACADEMIC PRESS).
  • transgenic bovine, goat, sheep or pig in which the gene of the target antibody is incorporated into the endogenous gene is produced using a transgenic animal production technique, and the antibody gene is derived from the milk of the transgenic animal. It is also possible to obtain a large amount of antibody.
  • the antibody produced can be purified by an appropriate combination of methods well known in the art, such as chromatography using a protein A column, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, ammonium sulfate salting out method, gel filtration, affinity chromatography and the like. Can do.
  • the above-mentioned protein containing the extracellular region of plexin B1 can inhibit the binding between semaphorin 4D and plexin B1 by trapping semaphorin 4D.
  • a protein is not particularly limited as long as it is a protein containing the extracellular region of plexin B1, and a protein fused with an antibody constant region (preferably, an Fc fragment of any immunoglobulin) is preferably exemplified. can do.
  • an expression vector containing the sequence is prepared, and the expression vector is used as an appropriate host cell.
  • the DNA sequence (SEQ ID NO: 1) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of human semaphorin 4D can be found in, for example, GenBank Accession Number NM_001142287, and the DNA sequence (SEQ ID NO: 3) and amino acid sequence of human plexin B1 (SEQ ID NO: 3).
  • SEQ ID NO: 4 is disclosed, for example, in GenBank Accession Number_NM_001130082.
  • the extracellular region of human plexin B1 corresponds to amino acid numbers 1-1490 in the amino acid sequence of Accession ⁇ ⁇ Number NM_001130082 described above.
  • Whether or not a certain substance is a binding inhibitor between semaphorin 4D and plexin B1 is determined by, for example, measuring the binding between semaphorin 4D and plexin B1 by immunoblot analysis in the presence or absence of the substance. This can be easily confirmed by examining whether the binding decreases in the presence of the substance.
  • the osteogenesis promoting effect in the present invention means an effect of promoting osteogenesis, and more preferably includes an effect of promoting osteogenesis by inhibiting osteoblast differentiation. Whether a substance has an osteogenesis promoting effect is determined by administering the substance to a vertebrate (preferably osteoporosis patient, osteoporosis model vertebrate) whose bone mass is lower than normal, and Can be confirmed by examining whether increases.
  • a vertebrate preferably osteoporosis patient, osteoporosis model vertebrate
  • the bone disease prevention / treatment effect in the present invention means the effect of preventing and / or treating any bone disease in the present invention, or the effect of improving the symptoms thereof. Whether a substance has a therapeutic effect on bone disease is determined by administering the substance to a patient or a vertebrate suffering from a bone disease (preferably an osteoporosis patient or an osteoporosis model vertebrate). It can be confirmed by examining whether the bone disease is cured or ameliorated.
  • the agent of the present invention may contain only the binding inhibitor in the present invention, but a pharmaceutically acceptable normal carrier, antioxidant, binder, stabilizer, excipient, diluent, Various preparation blending components such as a pH buffer, a disintegrant, a solubilizer, a solubilizer, and an isotonic agent may be added.
  • the dosage form of the reducing agent of the present invention may be a solid preparation such as a powder, granule or capsule, or a liquid such as a solution, emulsion or suspension. These preparations can be appropriately prepared by subjecting the binding inhibitor in the present invention to treatment according to a conventional method.
  • the administration method of the agent of the present invention is not particularly limited as long as the desired bone formation promoting effect and the desired bone disease prevention / treatment effect are obtained, and may be parenteral or oral administration.
  • parenteral administration methods include intravascular administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, transdermal administration, nasal administration, and pulmonary administration.
  • intravascular administration is preferably exemplified.
  • intravenous administration can be exemplified more suitably.
  • the dose, frequency and dose of the agent of the present invention can be adjusted as appropriate according to the body weight of the administration subject, the type of bone disease, the degree of symptoms of bone disease, and the like.
  • vertebrates can be exemplified, among which animals belonging to mammals and animals belonging to birds can be preferably exemplified, among which humans, monkeys, mice, rats, A hamster, a guinea pig, a cow, a pig, a horse, a rabbit, a sheep, a goat, a cat, a dog, a chicken, a quail and the like can be preferably exemplified, and among them, humans, livestock and poultry can be exemplified more suitably.
  • the type of vertebrate from which the binding inhibitor in the present invention contained in the agent of the present invention is derived from semaphorin 4D or plexin B1 that exhibits a binding inhibitory action is the vertebrae to which the agent of the present invention is administered. It is preferable that it is consistent with the kind of animal from the viewpoint of obtaining a more stable and excellent bone formation promoting effect and a bone disease prevention / treatment effect.
  • the vertebrates from which semaphorin 4D is derived and the vertebrates from which plexin B1 is derived may be the same or different.
  • the type of bone disease in the present invention is not particularly limited as long as it is a bone disease caused by a decrease in bone formation or a bone disease related to a decrease in bone formation, but fractures, bone defects, osteoporosis, osteomalacia , Osteopenia, low back pain, Paget's disease of bone, ankylosing spondylitis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteogenesis imperfecta, osteoporosis, among which osteoporosis, Osteomalacia, osteopenia and osteogenesis imperfecta can be exemplified more suitably.
  • the determination method of the present invention determines whether or not a test substance is a binding inhibitor between semaphorin 4D and plexin B1, and when the test substance is the binding inhibitor, A method for determining a candidate substance for an active ingredient of an osteogenesis promoter, wherein the candidate substance is determined as a candidate substance for an active ingredient of an osteogenesis promoter.
  • a method having the following steps (A) to (D) is preferably exemplified. can do.
  • B A step of measuring the degree of binding between semaphorin 4D and plexin B1:
  • C A step of comparing the degree measured in the above step (B) with that in the absence of the test substance:
  • D When the degree measured in the above step (B) is lower than that in the absence of the test substance, the test substance is determined as a binding inhibitor between semaphorin 4D and plexin B1.
  • a labeled semaphorin 4D extracellular region or a fusion protein of an semaphorin 4D extracellular region and an immunoglobulin Fc region is expressed as plexin B1 on the cell surface.
  • plexin B1 labeled semaphorin 4D extracellular region or a fusion protein of an semaphorin 4D extracellular region and an immunoglobulin Fc region, etc., as semaphorin 4D, which is expressed on the cell surface, Each may be used to measure the degree of binding.
  • the test substance in the determination method of the present invention is not particularly limited, and may be a substance that has been previously known to be a substance having an activity of inhibiting the binding between semaphorin 4D and plexin B1, or such a substance. It may be a substance whose activity is unknown.
  • a plurality of test substances may be used simultaneously as the test substances. When using a plurality of test substances at the same time, a single test substance may be used at the same time in different samples, or a plurality of test substances may be used at the same time in a single sample. A plurality of single samples using the test substance may be prepared and used simultaneously.
  • the determination method of the present invention can also be used as a screening method for a candidate substance for an active ingredient of an osteogenesis promoter characterized by searching for a candidate substance for an active ingredient of an osteogenesis promoter from a test substance. it can.
  • the binding inhibitor in the present invention in the preparation of the above osteogenesis promoter and bone disease prevention / treatment agent, (b) the promotion of bone formation and bone disease prevention.
  • a binding inhibitor in the present invention for use in treatment (c) a method of using the binding inhibitor in the present invention for promoting bone formation or preventing or treating a bone disease, and (d) binding in the present invention. Examples include a method of promoting bone formation by administering an inhibitory substance to a target vertebrate, and (e) a method of preventing or treating a bone disease by administering the binding inhibitory substance of the present invention to the target vertebrate. it can.
  • Bone marrow chimeric mice were prepared by partially changing the method described in the literature (B. Zhao et al., Nat Med 15, 1066 (Sep, 2009)). That is, donor bone marrow cells (C57BL6-Ly5.2 background) of wild-type Sema4d ⁇ / ⁇ littermate mice were collected, and 2 ⁇ 10 6 cells obtained from each donor were wild-type exposed to lethal radiation. Recipient mice (3 weeks old, C57BL / 6-Ly5.1 background) or Sema4d ⁇ / ⁇ mice were administered intravenously into the tail vein. Eight weeks after bone marrow transplantation, a high level of donor-type chimerism (> 95%) was achieved.
  • GeneChip analysis was performed according to the method described in the literature (K. Nishikawa et al., J Clin Invest 120, 3455 (Oct 1, 2010)). That is, after synthesis of cDNA by reverse transcription using total RNA, biotinylated cRNA was synthesized by in vitro transcription. After cRNA fragmentation, hybridization using mouse A430 GeneChip (Affymetrix) was performed using literature (T. Koga et al., Nat Med 11, 880 (Aug, 2005), H. Takayanagi et al., Dev Cell. 3, 889 (Dec, 2002).
  • osteoclast supernatant was recovered from each culture of wild type and Sema4d ⁇ / ⁇ cells after stimulation with nuclear factor ⁇ B activating receptor ligand (RANKL; manufactured by Peprotech). Cultured osteoclasts were cultured in a collagen coated dish (manufactured by IWAKI) and collected by trypsin treatment two days after RANKL stimulation. The osteoclast supernatant was used as an osteogenic medium containing the above reagents and added to cultured osteoclasts (1 ⁇ 10 5 cells / well, 24-well plate) every 3 days.
  • plexin B1 wild type [Plexin-B1], a mutant that does not cause GTPase activation of R-Ras [Plexin-B1 RA]
  • PGFPin-B1 RA I. Oinuma, Y. Ishikawa, H. Katoh, M.
  • Calvarial cells were cultured for 2 days in osteogenic medium (50 ⁇ M ascorbic acid, 10 nM dexamethasone, and 10 mM ⁇ -glycerophosphate) and then stimulated with Fc-Sema4D.
  • Purified human IgG (Fc part) (manufactured by BECKMAN COULTER) was used as a negative control for pull-down analysis (time 0).
  • anti-Plexin-B1 antibody (clone A-8, Santa Cruz), anti-PDZ-RhoGEF antibody (polyclonal, ProteinExpress), anti-LARG antibody (polyclonal, LIFESPAN CIOSCIENCES) ), Anti-phospho-Akt antibody (Thr308) (polyclonal, Cell Signaling), anti-Akt antibody (polyclonal, Cell Signaling), anti-phosphor-ERK antibody (Thr202 / Tyr204) (polyclonal, Cell Signaling), Anti-ERK antibody (polyclonal, Cell Signaling), anti-Met antibody (clone 25H2) (Cell Signaling), anti-ErbB2 antibody (clone 29D8) (Cell Signaling), anti-Rac1 antibody (clone 102 / Rac1) ( BD Transduction laboratories), anti-RhoA antibody (clone55 / Rho) (BD Transduction laboratories), anti-cadherin-11 antibody (polyclonal, In
  • Phosphorylation of plexin B1, Met, ErbB2 and IRS1 was detected by anti-phosphotyrosine antibody (4G10, Upstate) after immunoprecipitation with specific antibodies against each.
  • anti-phosphotyrosine antibody 4G10, Upstate
  • cell lysates were incubated with Fc-sema4D (500 ng) bound to protein A-agarose beads and immunoblot analysis was performed using anti-Plexin-B1 antibody. .
  • Detection of GTPase activation was performed as described in the literature (M. Shinohara et al., J Biol Chem 282, 17640 (Jun 15, 2007)). That is, calvarial cells were treated with Fc-sema4D and harvested when indicated.
  • CD45.2 antibody FITC-conjugated anti-CD45.2 antibody (clone 104), eFluor450-conjugated anti-CD11b antibody (clone M1 / 70), PE-conjugated anti-CD105 antibody (clone MJ7 / 18), Anti-CD106 antibody conjugated with Alexa Fluor 647 (clone 4.29E + 02), anti-CD44 antibody conjugated with APC-Alexa Fluor 750, anti-CD44 antibody conjugated with AC-Cy7 (clone IM7), and APC conjugated Gated anti-Sca-1 antibody (clone D7) (manufactured by eBioscience)]. Then, flow cytometry analysis was performed using FACSCant II with Diva software (BD Biosciences).
  • Bone marrow-derived stromal cells are cultured in an osteogenic conditioned medium, and the cell growth rate before osteoblast differentiation (Day 0) or in the osteoblast differentiation process (Day 14) by semaphorin 4D stimulation is determined as the Fc portion of human IgG or Fc ⁇ . Analysis was performed using a cell proliferation ELISA kit (Roche) in the presence of Sema4D to detect 5-bromo-2′deoxyuridine (BrdU) incorporation.
  • CFU Colony forming unit
  • Fc-sema4D (I. Ishida et al., Int Immunol 15, 1027 (Aug, 2003)) was prepared, and then Fc-sema4D was treated with bone. Added to calvarial cells cultured under forming conditions. Addition of Fc-sema4D suppressed the expression of bone nodule formation (FIG. 6) and osteoblast marker genes (ALP activation, osteocalcin [Bglap] and collagen type I [Col1a1]) in a concentration-dependent manner. These results indicate that bone nodule formation was inhibited as a result of Sema4D inhibiting osteoblast differentiation.
  • osteoclasts were cultured in the presence of osteoclast culture supernatant or osteoclasts.
  • the culture supernatant of wild-type osteoclasts or co-culture with osteoclasts did not affect bone nodule formation, whereas Sema4d -/- osteoclast culture supernatant or Sema4d -/- osteoclast Bone nodule formation was significantly promoted by co-culture with cells.
  • These results indicate that osteoclasts suppress bone formation via semaphorin 4D, which is produced at least partially as soluble.
  • the osteoclast supernatant contains one or more factors that promote bone formation. It is considered that the bone formation promoting effect by such factors is exhibited when semaphorin 4D is not present.
  • Fc-sema4D As a result of pull-down analysis using Fc-sema4D, it was shown that semaphorin 4D interacts with plexin B1 (FIG. 8). Furthermore, Fc-sema4D has also been shown to induce phosphorylation of plexin B1. It is known that semaphorin 4D forms a complex with tyrosine kinase ErbB2 when binding to plexin B1, and ErbB2 phosphorylates itself and plexin B1 in a semaphorin 4D-dependent manner. In osteoblasts, inhibition of ErbB2 kinase activity resulted in a decrease in semaphorin 4D stimulation-dependent phosphorylation of plexin B1.
  • semaphorin 4D-plexin B1 converts to an inhibitory signal in osteoblasts?
  • the semaphorin-plexin system is known to regulate cell morphogenesis and cell migration by regulating actin cytoskeleton reorganization, primarily through Rho family small GTPases.
  • RhoA activity is stimulated in the presence of tyrosine kinase ErbB2
  • semaphorin 4D has the opposite effect in the presence of other tyrosine kinases Met.
  • RhoA selectively mediates the inhibitory effect of semaphorin 4D-plexin B1 on bone formation.
  • Plexin B1 has two RhoGTPase regulatory domains, a GTPase activating protein (GAP) domain and a PDZ-binding domain that binds to Rho-GEF (I. Oinuma, Y. Ishikawa, H. Katoh, M.
  • RhoA DN transgenic mice K. Kobayashi et al., J Neurosci 24, 3480 (Apr 7, 2004)
  • collagen ⁇ 1 (I) -Cre trans A transgenic mouse R. Dacquin, M. Starbuck, T. Schinke, G. Karsenty, Dev Dyn 224, 245 (Jun, 2002)
  • RhoA DN OB a transgenic mouse
  • RhoA DN OB mice were prepared. Bone formation (Fig. 15) and trabecular width (Fig. 16) of RhoA DN OB mice increased compared to wild type mice due to the promotion of bone formation by osteoblasts.
  • RhoA DN OB mice were remarkably increased as compared to wild type mice. There was no change in the parameters indicating bone resorption of the cells (osteoclast surface area, osteoclast number and eroded bone surface area).
  • Such bone phenotype was similar to that of Sema4d ⁇ / ⁇ and Plxnb1 ⁇ / ⁇ mice.
  • RhoA DN OB As the expression of RhoA DN OB increases during osteoblast differentiation, bone nodule formation and the expression of osteoblast marker genes (Alpl, Bglap and Col1a1) are markedly elevated in calvarial cells from RhoA DN OB mice did. In addition, the increased bone nodule formation in RhoA DN OB cells is not suppressed by Fc-sema4d, suggesting that RhoA mediates an inhibitory signal downstream of semaphorin 4D-plexin B1.
  • osteogenesis osteoblast surface area, increase in bone mass and bone formation rate, and decrease in trabecular spacing
  • bone formation was promoted (osteoblast surface area (FIG. 26), bone mass).
  • Fig. 27 and bone formation rate (Fig. 28) increased, and trabecular spacing decreased (Fig. 29)). Therefore, it was clarified that the bone that had once decreased recovered to the same level as when the anti-Sema4d antibody was administered weekly after the OVX treatment. In other words, recovery similar to that when bone loss was prevented was observed.
  • there was no change in the parameter indicating bone resorption of osteoclasts (eroded bone surface area).
  • the action point of semaphorin 4D in inhibiting osteoblast differentiation was analyzed in detail. That is, when the number of hematopoietic stem cells (Sca-1 + CD105 + CD106 + CD44 + CD45.2-CD11b) in bone marrow in Sema4d ⁇ / ⁇ mice was compared with wild type mice by flow cytometry analysis, there was no difference. Further, when cell proliferation analysis was performed, the number of osteoprogenitor cells in the bone marrow slightly increased by Sema4d before differentiation of osteoblasts (Day 0), but in the process of osteoblast differentiation, semaphorin 4D stimulated There was no change (Day 14). From CFU analysis, ALP expression and bone formation shown by Alizarin are suppressed by semaphorin 4D stimulation. These results suggest that semaphorin 4D acts on the osteoblast differentiation stage.
  • insulin-receptor substrate (IRS) signal by insulin-like growth factor (IGF) -1 promotes osteoblast differentiation. Therefore, when phosphorylation of Akt and ERK related to the IRS signal was examined by semaphorin 4D stimulation, the phosphorylation level was decreased. In addition, Tyr phosphorylation as an activation index of IRS is also decreased, and these results suggest that semaphorin 4D stimulation decreases IRS signal. It was also clarified that activated RhoA decreases phosphorylation of Akt and ERK, and conversely, RhoA inhibitors Y-27632 and RKI enhance these phosphorylations. Furthermore, it became clear that this RhoA inhibitor induces the enhancement of activated phosphorylation in the IRS signal. From these results, it was suggested that semaphorin 4D activates RhoA to induce a decrease in IRS signal and suppress osteoblast differentiation.
  • IGF insulin-like growth factor
  • osteoclast-derived semaphorin 4D was identified as an important mediator for osteoclast-osteoblast communication in bone remodeling.
  • Bone remodeling consists of three phases: initiation of bone resorption by osteoclasts, transition to new bone formation by osteoblasts, and termination of new bone synthesis (K. Matsuo, N.
  • RhoA activation has also been shown to inhibit osteoblast bone formation in vivo EphrinB2 / EphB4, which has been shown to be involved in the transitional phase, regulates bone formation RhoA is also used for this purpose (C. Zhao et al., Cell Metab 4, 111 (Aug, 2006)), suggesting that Rho family small GTPases act as coordinators of bone remodeling signaling.
  • RhoA-specific GEFArfgef12 (LARG) (JM Swiercz, R. Kuner, J. Behrens, S. Offermanns, Neuron 35, 51 (Jul 3, 2002), V. Perrot, J. Vazquez-Prado, JS Gutkind, J Biol Chem 277, 43115 (Nov 8, 2002)) was also shown to be highly expressed in osteoblasts, supporting the importance of the semaphorin 4D-plexin B1-RhoA pathway.
  • the present invention can be suitably used in the fields of promoting bone formation and preventing and / or treating bone diseases.

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Abstract

　本発明は、骨芽細胞による骨形成を直接促進する骨形成促進剤や、骨疾患の予防・治療剤を提供することを目的とするものである。セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質を用いることを特徴とする。かかる結合阻害物質としては、抗セマフォリン４Ｄ抗体、抗プレキシンＢ１抗体、プレキシンＢ１の細胞外領域を含むタンパク質などを好適に例示することができる。

Description

骨形成促進剤
　本発明は、骨形成促進剤や、骨疾患の予防・治療剤に関する。より詳細には、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質を有効成分とする骨形成促進剤や、骨疾患の予防・治療剤に関する。
　高齢化社会に伴い、骨折、骨粗しょう症、関節リウマチ、腰背痛などの骨疾患の患者が増加している。骨組織では、骨形成を担う骨芽細胞と、骨吸収を担う破骨細胞が協調して働き、骨形成と骨吸収とをバランス良く行うことによって、骨組織の機能を維持している。この骨代謝のバランスが、老化や卵巣機能の低下などの要因によって崩れ、骨形成が低下したり、あるいは骨吸収が異常亢進すると、骨量（骨密度）が低減して、様々な骨疾患が生じる。かかる骨疾患として、骨折、骨欠損、骨粗しょう症、骨軟化症、骨減少症、腰背痛、骨ページェット病、硬直性脊椎炎、関節リウマチ、変形性関節症などが知られている。特に高齢者が骨疾患を患うと、日常生活に必要なレベルの運動ですら困難となったり、場合によっては、そのまま寝たきりになる危険性もある。そのため、高齢化が進む現代社会において、骨疾患を予防・治療することには重要な意義がある。
　現在、骨疾患の治療剤として、活性型ビタミンＤ３剤、ビスホスホネート剤、カルシトニン製剤、エストラジオール含有のホルモン製剤、ビタミンＫ２剤などが一般に用いられている。また、副作用がより少なく、より効果的な治療剤として、エストラジオール誘導体、活性型ビタミンＤ３誘導体、ビスホスホネート誘導体などの開発が行われている（特許文献１参照）。しかし、ビタミンＤ３は血中のカルシウム濃度を高める作用を有しており、また、エストラジオールやビスホスホネートは骨吸収の阻害作用を有しているが、いずれも、骨芽細胞による骨形成を直接促進する作用はない。骨疾患、特に骨代謝疾患の治療には、多剤併用療法が主流になってきていることから、従来の予防・治療剤とは異なる作用機作をもつ新規な予防・治療剤の開発が期待されている。
　骨は、骨の吸収段階と、それに続く、骨の形成段階を繰り返す骨リモデリング（骨再構築）と呼ばれる工程によって連続的に再生されている。各段階及び段階の移行は、破骨細胞－骨芽細胞間のコミュニケーションに関与する骨細胞から分泌されるか、或いは骨基質から放出される骨再構築因子によって細かく制御されなければならない。骨吸収の間に放出されたＴＧＦ－β及びＩＧＦ－１は、骨形成を刺激することが知られており、そのためカップリング因子と呼ばれている。骨リモデリングに重要な候補分子のインビトロデータが豊富なのにも係わらず、インビボの証拠は十分に提供されていない。
　軸索ガイダンス分子は、神経系の外側で広く発現しており、そこで細胞遊走、免疫応答、組織発達及び血管形成などを制御している（非特許文献１及び２参照）。近年の研究により、セマフォリン及びエフリン等の軸索ガイダンス分子が、破骨細胞と骨芽細胞間の細胞間コミュニケーションに関与していることが示唆されている（非特許文献３～５参照）。
　セマフォリン４Ｄ（Semaphorin 4D）は、オリゴデンドロサイトから分泌され、中枢神経系において成長円錐の崩壊を誘導することが知られている。また、セマフォリン４Ｄは、免疫応答及び免疫系のホメオスタシスの維持に重要であることが明らかとなっている。セマフォリン４Ｄのレセプターの１つとして、プレキシンＢ１（Plexin-B1）が知られている（非特許文献６参照）。さらに、非特許文献７には、破骨細胞由来のセマフォリン４Ｄが、骨芽細胞分化抑制作用、および骨芽細胞を介した破骨細胞形成を促進する可能性が示唆されている。また、非特許文献８には、セマフォリン４Ｄが骨芽細胞では検出されず、破骨細胞の表面に存在すること、及び、セマフォリン４Ｄ（Sema4D）をホモ欠損させた雌のsema4D-/-マウスで、野生型マウスと比較して骨量の増加が認められたことが開示されている。
特表２００５－５０９６２９号公報
B. J. Dickson, Science 298, 1959 (Dec 6, 2002) A. B. Huber, A. L. Kolodkin, D. D. Ginty, J. F. Cloutier, Annu Rev Neurosci 26, 509 (2003) N. Takegahara et al., Nat Cell Biol 8, 615 (Jun, 2006) N. Irie et al., J Biol Chem 284, 14637 (May 22, 2009) C. Zhao et al., Cell Metab 4, 111 (Aug, 2006) I. Oinuma et al., Science, Vol. 305, no. 5685, pp. 862-865（August 6 2004） 石田真哉、金田利夫、武藤章弘、吉田正, 日本骨代謝学会学術集会プログラム抄録集, ２５巻, ２６６頁, ２００７年６月発行, 「破骨細胞由来ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ　４Ｄの骨代謝における生理作用の解析」 Romain DACQUIN, Chantal Domenget, Pierre Jurdic, Irma Machuca-Gayet, ASBMR 2010 Annual Meeting Abstracts, Presentation Number MO0152, "Physiological Control of Bone Resorption by Semaphorin4D is Dependent on Ovarian Function"
　本発明の課題は、骨芽細胞による骨形成を直接促進する骨形成促進剤や、骨疾患の予防・治療剤を提供することにある。
　本発明者らは、前述の背景技術に記載したような状況下、鋭意研究を行った結果、（ａ）破骨細胞由来のセマフォリン４Ｄが、骨芽細胞上のプレキシンＢ１受容体に結合すると、骨芽細胞分化を阻害するスモールＧタンパク質ＲｈｏＡを活性化して、ＩＲＳシグナル（骨芽細胞の分化を促進するシグナル）を低下させ、骨芽細胞の分化を抑制することによって、骨形成を阻害すること、及び、（ｂ）抗セマフォリン４Ｄ抗体や抗プレキシンＢ１抗体等が骨芽細胞による骨形成を直接促進することを見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、（１）セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質を有効成分とする骨形成促進剤や、（２）結合阻害物質が、抗セマフォリン４Ｄ抗体であることを特徴とする上記（１）に記載の骨形成促進剤や、（３）結合阻害物質が、抗プレキシンＢ１抗体、又は、プレキシンＢ１の細胞外領域を含むタンパク質であることを特徴とする上記（１）に記載の骨形成促進剤に関する。
　また、本発明は、（４）セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質を有効成分とする骨疾患の予防・治療剤や、（５）結合阻害物質が、抗セマフォリン４Ｄ抗体であることを特徴とする上記（４）に記載の骨疾患の予防・治療剤や、（６）結合阻害物質が、抗プレキシンＢ１抗体、又は、プレキシンＢ１の細胞外領域を含むタンパク質であることを特徴とする上記（４）に記載の骨疾患の予防・治療剤や、（７）骨疾患が、骨折、骨欠損、骨粗しょう症、骨軟化症、骨減少症、腰背痛、骨ページェット病、硬直性脊椎炎、関節リウマチ、及び、変形性関節症から選択されることを特徴とする上記（４）～（６）のいずれかに記載の骨疾患の予防・治療剤に関する。
　さらに、本発明は、（８）被検物質がセマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質であるか否かを決定し、前記被検物質が前記結合阻害物質である場合に、前記被検物質を骨形成促進剤の有効成分の候補物質と判定することを特徴とする、骨形成促進剤の有効成分の候補物質の判定方法や、（９）被検物質がセマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質であるか否かを決定する方法が、以下の工程（Ａ）～（Ｄ）を有することを特徴とする、上記（８）に記載の判定方法：（Ａ）被検物質の存在下に、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１とを接触させる工程：（Ｂ）セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合の程度を測定する工程：（Ｃ）上記工程（Ｂ）で測定した程度を、被検物質非存在下のその程度と比較する工程：（Ｄ）上記工程（Ｂ）で測定した程度が、被検物質非存在下のその程度よりも低下した場合に、その被検物質を、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質と決定する工程：や、（１０）上記（８）又は上記（９）に記載の判定方法を使用して、被検物質の中から骨形成促進剤の有効成分の候補物質を探索することを特徴とする、骨形成促進剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法に関する。
　本発明によると、骨芽細胞による骨形成を直接促進したり、骨疾患を予防及び／又は治療することができる。
マイクロＣＴ（microcomputed tomography）（μＣＴ）分析で測定した野生型（ＷＴ）マウス及びセマフォリン４Ｄノックアウト（Sema4d-/-）マウスにおける骨量を示す図である。 μＣＴ分析で測定したＷＴマウス及びSema4d-/-マウスにおける骨梁幅を示す図である。 ４日毎のカルセイン二重標識を行ったＷＴマウス及びSema4d-/- マウスにおける骨形態形成解析により測定した骨形成［骨芽細胞表面積（左）、石灰化した骨表面積（中央）及び骨形成率（右）］を示す図である。 ＷＴマウス及びSema4d-/-マウスにおける骨形態形成解析により測定した、破骨細胞表面積と細胞数（左及び中央）および骨吸収のパラメーター（右）を示す図である。 ＷＴマウス又はSema4d-/-マウスの骨髄細胞を養子免疫細胞移植したマウスの骨量を示す図である。左から２つのグラフは、ＷＴマウスに移植した場合のそのマウスの骨量を示し、右から２つのグラフは、Sema4d-/-マウスに移植した場合のそのマウスの骨量を示す。 骨形成条件下で培養した頭蓋冠細胞にFc-sema4D（ＩｇＧ１のＦｃ領域と融合した組み換えセマフォリン４Ｄ）を添加した際の骨結節数を示す図である。 骨芽細胞分化中のプレキシンＢ型及びcluster of differentiation 72（ＣＤ７２）のｍＲＮＡの発現を示す図である。 Fc-sema4Dを用いたプルダウン解析の結果を示す図である。右パネルはプルダウン前のサンプルの解析結果を表し、左パネルはプルダウン後のサンプルの解析結果を表す。 μＣＴ分析で測定したＷＴマウス及びプレキシンＢ１ノックアウト（Plxnb1-/-）マウスにおける骨量を示す図である。 μＣＴ分析で測定したＷＴマウス及びPlxnb1-/-マウスにおける骨梁幅を示す図である。 骨形態形成解析で測定したＷＴマウス及びPlxnb1-/-マウスにおける骨芽細胞表面積を示す図である。 骨形態形成解析で測定したＷＴマウス及びPlxnb1-/-マウスにおける石灰化した骨表面積を示す図である。 骨形態形成解析で測定したＷＴマウス及びPlxnb1-/-マウスにおける骨形成率を示す図である。 プレキシンＢ１、ＧＡＰドメインに変異を有するプレキシンＢ１のＲＡミュータント（Ｒ１６６１／１６６２／１９６８Ａ）、及びＰＤＺ結合ドメインが欠如している（ΔＰＤＺ）プレキシンＢ１の切断されたミュータントの概略を示す図である。 μＣＴ分析で測定したＷＴマウス（コントロールマウス）及びドミナントネガティブＲｈｏＡ（RhoA DNOB）マウスにおける骨量を示す図である。 μＣＴ分析で測定したＷＴマウス及びRhoA DNOBマウスにおける骨梁幅を示す図である。 骨形態形成解析で測定したＷＴマウス及びRhoA DNOBマウスにおける骨形成［骨芽細胞表面積］を示す図である。 骨形態形成解析で測定したＷＴマウス及びRhoA DNOBマウスにおける骨形成［石灰化した骨表面積］を示す図である。 骨形態形成解析で測定したＷＴマウス及びRhoA DNOBマウスにおける骨形成［骨形成率］を示す図である。 骨形態形成解析で測定した、卵巣摘出（ＯＶＸ）マウス及び抗Sema4D抗体で処理したＯＶＸマウスにおける骨芽細胞表面積を示す図である。 μＣＴ分析で測定したＯＶＸマウス及び抗セマフォリン４Ｄ抗体（抗Sema4D抗体）で処理したＯＶＸマウスにおける骨量を示す図である。 骨形態形成解析で測定した、ＯＶＸマウス及び抗Sema4D抗体で処理したＯＶＸマウスにおける骨形成［骨形成率］を示す図である。 μＣＴ分析で測定したＯＶＸマウス及び抗Sema4D抗体で処理したＯＶＸマウスにおける骨梁間隔を示す図である。 図２４の上パネルは、マウス骨芽細胞を、ＷＴマウス又はSema4d-/- マウスの破骨細胞、及び、抗Sema4D抗体の存在下で培養した場合の石灰化形成を調べた結果を示す図である。図２４の下パネルは、マウス骨芽細胞を、Fc-sema4d及び／又は抗プレキシンＢ１抗体の存在下で培養した場合の石灰化形成を調べた結果を示す図である。 ヒト骨芽細胞（HOS）を、破骨細胞若しくはその上清、及び／又は、抗Sema4D抗体等の存在下で培養した場合の石灰化形成を調べた結果を示す図である。 骨形態形成解析で測定した、卵巣摘出（ＯＶＸ）マウス及びＯＶＸ処理後６週から抗セマフォリン４Ｄ抗体（抗Sema4D抗体）で処理したＯＶＸマウスにおける骨芽細胞表面積を示す図である。 μＣＴ分析で測定したＯＶＸマウス及びＯＶＸ処理後６週から抗Sema4D抗体で処理したＯＶＸマウスにおける骨量を示す図である。 骨形態形成解析で測定した、ＯＶＸマウス及びＯＶＸ処理後６週から抗Sema4D抗体で処理したＯＶＸマウスにおける骨形成［骨形成率］を示す図である。 μＣＴ分析で測定したＯＶＸマウス及びＯＶＸ処理後６週から抗Sema4D抗体で処理したＯＶＸマウスにおける骨梁間隔を示す図である。
　本発明の「骨形成促進剤」や、本発明の「骨疾患の予防・治療剤」（以下、まとめて「本発明の剤」とも表示する。）としては、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質（以下、単に「本発明における結合阻害物質」とも表示する。）を有効成分としている限り特に制限されず、また、かかる本発明における結合阻害物質としては、いずれかの脊椎動物のセマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合を阻害する物質である限り特に制限されないが、抗セマフォリン４Ｄ抗体、抗プレキシンＢ１抗体、プレキシンＢ１の細胞外領域を含むタンパク質を好適に例示することができる。本発明における結合阻害物質は、破骨細胞由来のセマフォリン４Ｄと、骨芽細胞上のプレキシンＢ１受容体との結合を阻害し、ＲｈｏＡの活性化阻害とＩＲＳシグナルの低下阻害を経て、骨芽細胞の分化抑制を阻害することによって、骨芽細胞による骨形成を促進すると考えられる。なお、本明細書において、「阻害」なる語と、「抑制」なる語は特に区別なく用いられる。
　上記の抗セマフォリン４Ｄ抗体や、抗プレキシンＢ１抗体（以下、「本発明の抗体」）は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体およびその機能的断片のいずれであってもよいが、特異性が高いなどの点でモノクローナル抗体であることが好ましい。上記の抗セマフォリン４Ｄ抗体や、抗プレキシンＢ１抗体は、セマフォリン４ＤやプレキシンＢ１を用いて、従来公知の方法により作製することができる。本発明の抗体である機能的断片とは、本発明の抗体が特異的に結合する抗原であるセマフォリン４ＤやプレキシンＢ１に対して、特異的に結合する抗体の断片を意味し、より具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、disulphide-linked ＦＶ、Single-Chain ＦＶ（ｓｃＦＶ）およびこれらの重合体等が挙げられる（D.J.King,Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies,1998 T.J.International Ltd）。このような抗体断片は慣用法、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、あるいは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。なお、本発明の抗体には、抗体若しくはその機能的断片の抗体結合能を妨げない限り、抗体若しくはその機能的断片にペプチド又はタンパク質を付加したものも便宜上含まれる。
　また、本発明の抗体は、ヒト抗体を含む。ここで本発明において「ヒト抗体」とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意味する。ヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子座を導入し、ヒト由来抗体を産生する能力を有するトランスジェニック動物にセマフォリン４ＤやプレキシンＢ１を投与することにより得ることができる。該トランスジェニック動物の例として例えばマウスが挙げられる。ヒト抗体を産生し得るマウスとして、例えば、内在性マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）重鎖及びマウスκ軽鎖を欠損しており、かつ、ヒトＩｇ重鎖遺伝子を含む１４番染色体断片（ＳＣ２０）及びヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を同時に保持するマウスを挙げることができる。このマウスはヒトＩｇ重鎖遺伝子座を持つ系統Ａのマウスと、ヒトＩｇκ鎖トランスジーンを持つ系統Ｂのマウスとの交配により作製される。系統Ａは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウス系統（Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol97:722）である。また、系統Ｂは内在性マウスＩｇ重鎖及びκ軽鎖欠損の両者についてホモ接合体であり、ヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を保持するマウス系統（Nat Biotechnol., 1996 Vol14:845）である。
　本発明のポリクローナル抗体は、例えば、以下に述べる方法によって製造することができる。セマフォリン４ＤやプレキシンＢ１を、必要に応じて免疫賦活剤（Freund's Adjuvant等）とともに、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られる。本発明のモノクローナル抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって取得することができる。該ハイブリドーマの調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature,1975 Vol.256:495-497）およびそれに準じて行うことができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェル中の培養上清の免疫抗原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法などの免疫学的方法を用いて測定することにより行なうことができる。
　ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養して培養上清から単離することができる。また、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹水中等でのインビボで培養し、腹水から単離することもできる。また、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換型抗体を調製することができる（P.J.Delves,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES,1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean,Monoclonal Antibodies,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS、J.W.Goding,Monoclonal Antibodies:principles and practice,1993 ACADEMIC PRESS）。
　さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタを作製し、そのトランスジェニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来する抗体を大量に取得することも可能である。
　産生された抗体は、当該分野において周知の方法、例えばプロテインＡカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
　前述のプレキシンＢ１の細胞外領域を含むタンパク質は、セマフォリン４Ｄをトラップすることにより、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の結合を阻害することができる。かかるタンパク質としては、プレキシンＢ１の細胞外領域を含むタンパク質である限り特に制限されないが、さらに、抗体の定常領域（好ましくは、任意のイムノグロブリンのＦｃフラグメント）と融合しているタンパク質を好適に例示することができる。
　上記のセマフォリン４Ｄ、プレキシンＢ１、プレキシンＢ１の細胞外領域を含むタンパク質は、例えば、それらのタンパク質の配列情報に基づいて、その配列を含む発現ベクターを作製し、その発現ベクターを適当な宿主細胞に形質転換して細胞内で目的タンパク質を生成させ、その目的タンパク質を単離する方法などの従来公知の方法により入手することができる。例えばヒトのセマフォリン４ＤのＤＮＡ配列（配列番号１）やアミノ酸配列（配列番号２）は、例えばGenBankのAccession Number NM_001142287に、また、ヒトのプレキシンＢ１のＤＮＡ配列（配列番号３）やアミノ酸配列（配列番号４）は、例えばGenBankのAccession Number NM_001130082 に開示されている。また、ヒトのプレキシンＢ１の細胞外領域は、前述のAccession Number NM_001130082のアミノ酸配列のアミノ酸番号１～１４９０に相当する。
　ある物質がセマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質であるかどうかは、例えば、その物質の存在下及び非存在下で、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合をイムノブロット解析などで測定し、その物質の存在下においてその結合が低下するかどうかを調べることによって、容易に確認することができる。
　本発明における骨形成促進効果とは、骨形成を促進する効果を意味し、より好適には、骨芽細胞の分化抑制を阻害することによって、骨芽細胞による骨形成を促進する効果を含む。ある物質が骨形成促進効果を有しているかどうかは、骨量が通常よりも低い脊椎動物（好ましくは、骨粗しょう症患者、骨粗しょう症モデル脊椎動物）にその物質を投与して、骨量が増加するかどうかを調べることによって確認することができる。
　本発明における骨疾患の予防・治療効果とは、本発明におけるいずれかの骨疾患を予防及び／又は治療する効果、あるいはその症状を改善する効果を意味する。ある物質が骨疾患の治療効果を有しているかどうかは、骨疾患に罹患している患者又は脊椎動物（好ましくは、骨粗しょう症患者、骨粗しょう症モデル脊椎動物）にその物質を投与して、その骨疾患が治癒する、あるいは改善するかどうかを調べることによって確認することができる。
　本発明の剤は、本発明における結合阻害物質のみを含有していてもよいが、薬学的に許容される通常の担体、抗酸化剤、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加してもよい。本発明の低減剤の剤型としては、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固形製剤であってもよいし、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤であってもよい。これらの製剤は、本発明における結合阻害物質について、常法にしたがった処理を行うことによって、適宜作製することができる。
　本発明の剤の投与方法としては、所望の骨形成促進効果や、所望の骨疾患の予防・治療効果が得られる限り特に制限されず、非経口投与であっても経口投与であってもよい。非経口投与の方法としては、血管内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等を例示することができ、中でも、血管内投与を好適に例示することができ、中でも、静脈内投与をより好適に例示することができる。また本発明の剤の投与量や投与回数や投与濃度は、投与対象の体重や、骨疾患の種類、骨疾患の症状の程度等に応じて、適宜調節することができる。
　本発明の剤の投与対象としては、脊椎動物を例示することができ、中でも、哺乳類に属する動物や、鳥類に属する動物を好適に例示することができ、中でも、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ニワトリ、ウズラ等を好適に例示することができ、中でもヒトや家畜・家禽類をより好適に例示することができる。また、本発明の剤に含まれる本発明における結合阻害物質が、結合阻害作用を発揮するセマフォリン４Ｄや、プレキシンＢ１の由来である脊椎動物の種類は、本発明の剤の投与対象となる脊椎動物の種類と一致していることが、より安定し、優れた骨形成促進効果や、骨疾患の予防・治療効果を得る観点から好ましい。なお、セマフォリン４Ｄの由来となる脊椎動物と、プレキシンＢ１の由来となる脊椎動物の種類は同じであってもよいし、異なっていてもよい。
　本発明における骨疾患の種類としては、骨形成の低下を起因とする骨疾患あるいは骨形成の低下に関連する骨疾患である限り特に制限されないが、骨折、骨欠損、骨粗しょう症、骨軟化症、骨減少症、腰背痛、骨ページェット病、硬直性脊椎炎、関節リウマチ、変形性関節症、骨形成不全症、骨多孔症を好適に例示することができ、中でも、骨粗しょう症、骨軟化症、骨減少症、骨形成不全症をより好適に例示することができる。
　本発明の判定方法は、被検物質がセマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質であるか否かを決定し、前記被検物質が前記結合阻害物質である場合に、前記被検物質を骨形成促進剤の有効成分の候補物質と判定することを特徴とする、骨形成促進剤の有効成分の候補物質の判定方法である。上記の判定方法において、被検物質がセマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質であるか否かを決定する方法としては、以下の工程（Ａ）～（Ｄ）を有する方法を好適に例示することができる。
（Ａ）被検物質の存在下に、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１とを接触させる工程：
（Ｂ）セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合の程度を測定する工程：
（Ｃ）上記工程（Ｂ）で測定した程度を、被検物質非存在下のその程度と比較する工程：
（Ｄ）上記工程（Ｂ）で測定した程度が、被検物質非存在下のその程度よりも低下した場合に、その被検物質を、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質と決定する工程。
　上記判定方法では、セマフォリン４Ｄとして、標識化した、セマフォリン４Ｄ細胞外領域やセマフォリン４Ｄ細胞外領域とイムノグロブリンＦｃ領域等との融合タンパク質を、プレキシンＢ１として、それが細胞表面に発現しているものを、それぞれ用いて結合の程度を測定してもよい。または、プレキシンＢ１として、標識化した、プレキシンＢ１細胞外領域やプレキシンＢ１細胞外領域とイムノグロブリンＦｃ領域等との融合タンパク質を、セマフォリン４Ｄとして、それが細胞表面に発現しているものを、それぞれ用いて結合の程度を測定してもよい。
　本発明の判定方法における被検物質としては特に制限されず、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合を阻害する活性を有する物質であることが予め判明している物質であってもよいし、かかる活性を有するかどうか不明である物質であってもよい。また、被検物質として、複数の被検物質を同時に用いてもよい。複数の被検物質を同時に用いる際は、単独の被検物質をそれぞれ別のサンプル内で同時に用いてもよいし、複数の被検物質を単一サンプル内で同時に用いてもよいし、複数の被検物質を用いる単一のサンプルを複数用意して同時に用いてもよい。複数の被検物質を単一サンプル内で同時に用いるときは、それらの被検物質のいずれがセマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質であるかを１度の試験で決定することができない場合もあるが、被検物質を段階的に絞り込んで試験を複数回行えば、いずれの被検物質がその結合阻害物質であるかを決定することができる。本発明の判定方法は、被検物質の中から骨形成促進剤の有効成分の候補物質を探索することを特徴とする、骨形成促進剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法として使用することもできる。
　なお、本発明の他の態様として、（ａ）上記の骨形成促進剤や骨疾患の予防・治療剤の調製における本発明における結合阻害物質の使用、（ｂ）骨形成促進や骨疾患の予防・治療における使用のための、本発明における結合阻害物質、（ｃ）本発明における結合阻害物質を、骨形成の促進や、骨疾患の予防・治療に使用する方法、（ｄ）本発明における結合阻害物質を対象脊椎動物に投与することにより、骨形成を促進する方法、（ｅ）本発明における結合阻害物質を対象脊椎動物に投与することにより、骨疾患を予防・治療する方法を挙げることができる。
　以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［マウスと骨表現型の解析］
　Sema4d-/-、Plxnb1-/-、プレキシンＢ２ノックアウト（Plxnb2-/-）、CAT-RhoA DN及びα１(I)-Creマウスの作製は、文献に記載された方法にしたがって行った（W. Shi et al., Immunity 13, 633 (Nov, 2000)、R. H. Friedel et al., J Neurosci 27, 3921 (Apr 4, 2007)、R. H. Friedel et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102, 13188 (Sep 13, 2005)、K. Kobayashi et al., J Neurosci 24, 3480 (Apr 7, 2004)、R. Dacquin, M. Starbuck, T. Schinke, G. Karsenty, Dev Dyn 224, 245 (Jun, 2002)）。全てのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと８回以上戻し交配（backcross）させた。全てのマウスは、特異的病原菌のない状態で維持した。全ての動物実験は、東京医科歯科大学の動物実験委員会に承認され、関連ガイドライン及び法律に合致している。骨表現型はそれぞれの遺伝子改変マウスとその同腹マウスをコントロールとし、雌雄それぞれ８匹以上を解析した。三次元マイクロＣＴ（μＣＴ）分析及び組織形態計測的分析は、文献に記載された方法にしたがって行った（K. Nishikawa et al., J Clin Invest 120, 3455 (Oct 1，2010)、T. Koga et al., Nature 428, 758 (Apr 15, 2004)）。
［骨髄キメラマウス］
　骨髄キメラマウスの作製は、文献（B. Zhao et al., Nat Med 15, 1066 (Sep, 2009)）に記載された方法を一部変更して行った。すなわち、野生型Sema4d-/-同腹子マウスのドナー骨髄細胞（Ｃ５７ＢＬ６－Ｌｙ５．２バックグラウンド）を採取し、各ドナーから得られた２×１０６細胞を、致死的な放射線を浴びた野生型レシピエントマウス（３週齢、Ｃ５７ＢＬ／６－Ｌｙ５．１バックグラウンド）又はSema4d-/-マウスの尾静脈へ静脈内投与した。骨髄移植の８週後、高いレベルのドナー型キメリズム（＞９５％）が達成された。
［GeneChip解析］
　GeneChip解析は、文献（K. Nishikawa et al., J Clin Invest 120, 3455 (Oct 1，2010)）に記載された方法にしたがって行った。すなわち、全ＲＮＡを用いた逆転写によるｃＤＮＡ合成を行った後、インビトロで転写させることによりビオチン化標識したｃＲＮＡを合成した。ｃＲＮＡを断片化した後、マウスＡ４３０GeneChip（Affymetrix社製）を用いたハイブリダイゼーションを、文献（T. Koga et al., Nat Med 11, 880 (Aug, 2005)、H. Takayanagi et al., Dev Cell 3, 889 (Dec, 2002)の記載にしたがって行った。
［インビトロでの骨芽細胞への分化誘導］
　インビトロでの骨芽細胞及び破骨細胞への分化誘導は、文献（T. Koga et al., Nat Med 11, 880 (Aug, 2005)、H. Takayanagi et al., Dev Cell 3, 889 (Dec, 2002)）に記載された方法にしたがって行った。すなわち、頭蓋冠由来の細胞を骨形成培地（５０μＭのアスコルビン酸、１０ｎＭのデキサメタゾン、及び１０ｍＭのβ－グリセロリン酸塩）中で培養を行うことにより分化誘導を行い、分化誘導の確認は、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイ（７日後）及び骨結節形成解析（２１日後、アリザリンレッド染色）により行った。Fc-sema4D、抗Sema4d抗体及び抗プレキシンＢ１抗体（抗Plexin-B1抗体）は、３日毎に添加した。破骨細胞上清は、核内因子κＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ；Peprotech社製）刺激後に野生型及びSema4d-/-細胞の各培養液から回収した。培養破骨細胞を、コラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）で培養し、ＲＡＮＫＬ刺激の２日後にトリプシン処理により回収した。破骨細胞上清は、上記試薬を含む骨形成培地として使用され、３日毎に培養破骨細胞（１×１０５細胞／ウェル、２４ウェルプレート）へ添加した。
［定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析］
　定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、Light Cycler（Roche社製）装置とSYBRGreen（TOYOBO社製）を用いて製品プロトコールに従って行った。以下のプライマーを使用した。
Plxnb1センス：5’-tgggtcatgtgcagtacgat-3’（配列番号５）、
Plxnb1アンチセンス：5’-cactgctctccaggttctcc-3’（配列番号６）、
Plxnb2センス：5’-aggggagcctctctacaagc-3’（配列番号７）、
Plxnb2アンチセンス：5’-tcgatcccttcatcctgaac-3’（配列番号８）、
Plxnb3センス：5’-atatgctgagcgtgccttct-3’（配列番号９）、
Plxnb3アンチセンス：5’-tgctgttgagcaaattggag-3’（配列番号１０）、
ＣＤ７２センス：5’-gccttctcctgtcctgtctg-3’（配列番号１１）、
ＣＤ７２アンチセンス：5’-cctcctggaactgctgagac-3’（配列番号１２）、
Alplセンス：5’-aacccagacacaagcattcc-3’（配列番号１３）、
Alplアンチセンス：5’-gcctttgaggtttttggtca-3’（配列番号１４）、
Bglapセンス：5’-gcgctctgtctctctgacct-3’（配列番号１５）、
Bglapアンチセンス：5’-accttattgccctcctgctt-3’（配列番号１６）、
Col1a1センス：5’-gagcggagagtactggatcg-3’（配列番号１７）、
Col1a1アンチセンス：5’-gttcgggctgatgtaccagt-3’（配列番号１８）、
Gapdhセンス：5’-acccagaagactgtggatgg-3’（配列番号１９）、
Gapdhアンチセンス：5’-cacattgggggtaggaacac-3’（配列番号２０）。
ｍＲＮＡ発現のレベルは、Ｇａｐｄｈ発現のレベルにより標準化した。
［アデノウイルス及びレトロウイルス遺伝子導入］
　ＲｈｏＡ（Myc-V14Rho）及びＲａｃ１（hRac1 V12）の構成的活性型（ＣＡ）と、ＲｈｏＡ（Myc-N19Rho）及びＲａｃ１（hRac1 V12）のドミナントネガティブ型（ＤＮ）とを担持するアデノウイルスベクターの作製方法及びそれらの導入方法は、文献（Bito, H. et al. A critical role for a Rho-associated kinase, p160ROCK, in determining axonoutgrowth in mammalian CNS neurons. Neuron 26, 431-441 (2000)）に記載された方法にしたがって行った。緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）と同時に３種類のプレキシンＢ１（野生型［Plexin-B1］、R-RasのＧＴＰアーゼ活性化を引き起こさないミュータント［Plexin-B1 RA］及びＲｈｏＡを活性化することができないミュータント［Plexin-B1 DPDZ-EGFP］）が発現するレトロウイルスベクター（pMXs-Plexin-B1-EGFP、pMXs-Plexin-B1 RA-EGFP及びpMXs-Plexin-B1 DPDZ-EGFP）の作製は、pMXs-IRES-EGFPへそれぞれPlexin-B1、Plexin-B1 RA（I. Oinuma, Y. Ishikawa, H. Katoh, M. Negishi, Science 305, 862 (Aug6, 2004)）及びPlexin-B1 DPDZ（V. Perrot, J. Vazquez-Prado, J. S. Gutkind, J Biol Chem 277, 43115 (Nov 8, 2002)）のｃＤＮＡ断片を挿入することにより行った。リコンビナントなレトロウイルスの作製は、文献（S. Morita, T. Kojima, T. Kitamura, Gene Ther 7, 1063 (Jun, 2000)）に記載された方法にしたがって行った。すなわち、作製したレトロウイルスベクターをＰｌａｔ－Ｅ細胞へ導入することにより、レトロウイルスのパッケージングを行った。
［ＯＶＸ誘導骨量減少に対する抗Sema4D抗体処理］
　ＯＶＸ（卵巣摘出）によって誘導された骨粗しょう症モデルマウスの作製は、文献（M.Shinohara et al., J Biol Chem 282, 17640 (Jun 15, 2007)）に記載された方法にしたがって行った。すなわち、７週齢のメスのマウスに卵巣摘出又は偽手術を行った。これらのモデルマウスでは、各グループ６匹を超えるマウスを検査した。骨量減少に対して予防効果があるかどうかを調べるために、以下に示す方法をしたがって検証した。すなわち、ＯＶＸマウスに、術後３日から８週まで、１週間に１回尾静脈から、２０μｇの抗Sema4D抗体（ＭＢＬ社製）又は生理食塩水を静脈注入した。術後８週後に全てのマウスを犠牲にし、μＣＴ分析及び骨形態形成解析を行った。また、減少した骨量に対して促進効果があるかどうかを調べるために、以下に示す方法をしたがって検証した。すなわち、ＯＶＸの６週後、ＯＶＸマウスに３日毎に３週間尾静脈から２０μｇの抗Sema4D抗体（ＭＢＬ社製）又は生理食塩水を静脈注入した。術後９週後に全てのマウスを犠牲にし、μＣＴ分析に供した。
［イムノブロット解析、プルダウン解析及び免疫蛍光染色］
　頭蓋冠細胞を、骨形成培地（５０μＭのアスコルビン酸、１０ｎＭのデキサメタゾン、及び１０ｍＭのβ－グリセロリン酸塩）で２日間培養し、その後Fc-Sema4Dで刺激した。精製したヒトＩｇＧ（Ｆｃ部分）（BECKMAN COULTER社製）をプルダウン解析のネガティブコントロールに使用した（time 0）。表示された時点で細胞を採取し、抗Plexin-B1抗体（clone A-8、Santa Cruz社製）、抗PDZ-RhoGEF抗体（ポリクロナール、ProteinExpress社製）、抗LARG抗体（ポリクロナール、LIFESPAN CIOSCIENCES社製)、抗phospho-Akt抗体（Thr308）（ポリクロナール、Cell Signaling社製）、抗Akt抗体（ポリクロナール、Cell Signaling社製)、抗phosphor-ERK抗体（Thr202/Tyr204）（ポリクロナール、Cell Signaling社製)、抗ERK抗体（ポリクロナール、Cell Signaling社製）、抗Met抗体（clone 25H2)（Cell Signaling社製）、抗ErbB2抗体（clone 29D8）（Cell Signaling社製）、抗Rac1抗体（clone 102/Rac1) （BD Transduction laboratories社製)、抗RhoA抗体（clone55/Rho）（BD Transduction laboratories社製）、抗cadherin-11抗体（ポリクロナール、Invitrogen社製）、抗IRS1抗体（clone 58-10C-31）（MILLIPORE社製）、及び抗b-アクチン抗体（clone AC40）（Sigma-Aldrich社製）を用いたイムノブロット解析又はプルダウン解析を行った。プレキシンＢ１、Ｍｅｔ、ＥｒｂＢ２及びＩＲＳ１のリン酸化は、それぞれに対する特異的抗体を用いた免疫沈降後に、抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０、Upstate社製）によって検出された。セマフォリン４Ｄに結合したプレキシンＢ１を検出するために、細胞溶解物はプロテインＡ－アガロースビーズに結合したFc-sema4D（５００ｎｇ）とインキュベートし、抗Plexin-B1抗体を用いてイムノブロット解析を行った。ＧＴＰアーゼの活性化の検出は、文献（M. Shinohara et al., J Biol Chem 282, 17640（Jun 15, 2007））の記載通りに行った。すなわち、頭蓋冠細胞をFc-sema4Dで処理し、表示された時点で採取した。細胞溶解物をグルタチオン－セファローズglutathione sepharoseに結合したＧＳＴ－ＲＢＤ（ＲｈｏＡ用）又はＧＳＴ－ＰＡＫ１（Ｒａｃ１用）（２μｇ）とインキュベートし、それぞれ抗RhoA抗体又は抗Rac1抗体を用いたイムノブロット解析を行った。免疫蛍光染色用に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、透過処理し、その後Alexa Fluor ４８８標識二次抗体及びローダミン共役ファロイジン（Molecular Probes社製）で染色した。
［フローサイトメトリー］
　骨髄由来細胞及び頭蓋冠細胞を解析するために、骨髄及び頭蓋冠から調製された単個細胞浮遊液を、８種類の蛍光色素がコンジュゲートしたモノクローナル抗体［PerCP.Cy5.5がコンジュゲートした抗ＣＤ４５．２抗体、ＦＩＴＣがコンジュゲートした抗ＣＤ４５．２抗体（clone 104）、eFluor450がコンジュゲートした抗ＣＤ１１ｂ抗体（clone M1/70）、ＰＥがコンジュゲートした抗ＣＤ１０５抗体（clone MJ7/18）、Alexa Fluor 647がコンジュゲートした抗ＣＤ１０６抗体（clone 4.29E+02）、APC-Alexa Fluor 750がコンジュゲートした抗ＣＤ４４抗体、AC-Cy7がコンジュゲートした抗ＣＤ４４抗体（clone IM7）、及びＡＰＣがコンジュゲートした抗Sca-1抗体（clone D7）（eBioscience社製）］で染色した。その後、Diva software（BD Biosciences社製）でFACSCant IIを用いてフローサイトメトリー解析を行った。
［細胞増殖解析］
　骨髄由来間質細胞を骨形成条件培地で培養し、骨芽細胞分化前（Ｄａｙ０）又はセマフォリン４Ｄ刺激による骨芽細胞分化過程（Ｄａｙ１４）における細胞増殖率を、ヒトＩｇＧのＦｃ部分又はFc-Sema4Dの存在下で細胞増殖ＥＬＩＳＡキット（Roche社製）を用いて解析し、５－ブロモ－２’デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを検出した。
［コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）解析］
　骨髄細胞を、２４ウェルプレートに１ウェルあたり３×１０６細胞をプレーティングした後、１０％ウシ胎仔血清含有α－ＭＥＭで３日間培養し、その後骨形成条件培地に変えた。コロニー形成ユニット－アルカリホスファターゼ（ＣＦＵ－ＡＬＰ）が、７日目（day 7）にＡＬＰ陽性コロニーとして検出され、ＣＦＵ－骨芽細胞（ＣＦＵ－Ｏｂ）が２１日目（day 21）にアルザリンレッド陽性コロニーとして検出された。コロニーの総数（ＣＦＵ－線維芽細胞（ＣＦＵ－Ｆ））を７日目及び２１日目にトルイジンブルー染色で検出した。
［統計的分析］
　全てのデータは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）で示す。統計的分析は、Student’s t test ＡＮＯＶＡと、可能時にはBonferroni testを用いて行った（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５；ｎ．ｓ．，有意でない）。結果は、４回以上の別個の実験の代表例である。
［結果］
　軸索ガイダンス分子であるセマフォリン、エフリン、スリット及びネトリンが骨のリモデリングに関与しているかどうかを調べるために、破骨細胞及び骨芽細胞におけるｍＲＮＡのゲノムワイドなスクリーニングをGeneChip解析により行った。すなわち、２０種類のセマフォリン、１６種類のエフリン、６種類のスリット及び６種類ネトリンについて解析した結果、破骨細胞において、非常に高いセマフォリン４Ｄの発現が認められた。一方、骨芽細胞では、かかる発現は認められなかった。これらの結果は、破骨細胞形成過程において、セマフォリン４Ｄが選択的に発現誘導されることを示している。
　破骨細胞形成過程において、選択的に発現誘導されるセマフォリン４Ｄの機能を調べるために、Sema4d-/-マウスを用いた骨格系の機能解析を行った。μＣＴ及び骨形態形成解析により、Sema4d-/-マウスにおける骨量（図１）及び骨梁幅（図２）は、野生型マウス（ＷＴマウス）と比較して、著しく増加していることが示された。また、Sema4d-/-マウスの骨芽細胞表面積（図３、左）、石灰化した骨表面積（図３、中央）及び骨形成率（図３、右）は、野生型マウスと比較してそれぞれ顕著に上昇したが、破骨細胞の骨吸収を示すパラメーター（破骨細胞表面積（図４、左）、破骨細胞数（図４、中央）及び侵食された骨表面積（図４、右））に変化はなかった。さらに、Sema4d-/-細胞におけるインビトロの破骨細胞形成も、正常に観察された。これの結果は、セマフォリン４Ｄは破骨細胞特異的に発現しているにもかかわらず、Sema4d-/-マウスにおける高骨量の表現型は、骨芽細胞による骨形成の増加によることを示唆している。
　Sema4d-/-マウスの骨表現型が、骨髄細胞系列の異常に基づいたものかどうかを調べるために、破骨前駆細胞を含む骨髄細胞を用いて養子免疫細胞移植を行った。その結果、野生型マウスにSema4d欠損骨髄細胞を移植した場合、野生型骨髄細胞を移植した場合と比べ、骨量は増加していた（図５の左側２つのグラフ）。一方、Sema4d-/-マウスに野生型骨髄細胞を移植した場合、Sema4d欠損骨髄細胞を移植した場合と比べ、骨量は減少し正常に戻っていた（図５の右側２つのグラフ）。この結果から、Sema4d-/-マウスにおける骨表現型は、破骨細胞を含む造血系細胞における異常が原因であることが示された。また、Sema4d-/-頭蓋冠細胞の骨結節形成において、Sema4d-/-頭蓋冠細胞の骨結節の明らかな増加は認められなかった。これらの結果は、破骨細胞において発現するセマフォリン４Ｄは、骨芽細胞による骨形成を阻害する骨のリモデリング因子として機能することを示唆している。
　骨芽細胞に対するセマフォリン４Ｄの阻害効果を詳細に調べるために、Fc-sema4D（I. Ishida et al., Int Immunol 15, 1027 (Aug, 2003)）を作製した後、かかるFc-sema4Dを骨形成条件下で培養した頭蓋冠細胞へ添加した。Fc-sema4Dの添加は、骨結節形成（図６）及び骨芽細胞マーカー遺伝子（ＡＬＰの活性化、オステオカルシン［Bglap］及びコラーゲンＩ型［Col1a1］）の発現を濃度依存的に抑制した。これらの結果は、Sema4Dが骨芽細胞の分化誘導を阻害した結果、骨結節形成が阻害されたことを示している。さらに、破骨細胞由来のセマフォリン４Ｄが骨形成の調節へ関与しているかどうかを調べるために、破骨細胞の培養上清又は破骨細胞の存在下で、頭蓋冠細胞を培養した。野生型の破骨細胞の培養上清又は破骨細胞との共培養では、骨結節形成に影響はなかったのに対し、Sema4d-/-破骨細胞の培養上清又はSema4d-/-破骨細胞との共培養では、骨結節形成が顕著に促進された。これら結果から、破骨細胞は、少なくとも部分的に可溶性として生産されるセマフォリン４Ｄを介して骨形成を抑制することを示している。また、破骨細胞の上清には、骨形成を促進する１又は複数の因子が含まれていることも注目すべき点である。かかる因子による骨形成促進効果は、セマフォリン４Ｄが存在しない場合に発揮されると考えられる。
　骨芽細胞が発現するセマフォリン４Ｄレセプターを特定するために、非リンパ細胞及びリンパ細胞におけるセマフォリン４Ｄレセプターとして知られている（K. Suzuki, A. Kumanogoh, H. Kikutani, Nat Immunol 9, 17 (Jan, 2008)）プレキシンＢ型及びＣＤ７２のｍＲＮＡの発現を、定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより解析した。その結果、プレキシンＢ１発現量は、骨芽細胞分化中に顕著に増加していた（図７）。一方、プレキシンＢ２の発現量はかなり低く、またプレキシンＢ３及びＣＤ７２の発現はほとんど検出されなかった（図７）。また、Fc-sema4Dを用いたプルダウン解析を行った結果、セマフォリン４Ｄが、プレキシンＢ１と相互作用することが示された（図８）。さらに、Fc-sema4Dは、プレキシンＢ１のリン酸化を誘導することも示された。セマフォリン４Ｄは、プレキシンＢ１と結合する際に、チロシンキナーゼＥｒｂＢ２と複合体を形成し、ＥｒｂＢ２がセマフォリン４Ｄ依存的に自身とプレキシンＢ１とをリン酸化することが知られている。骨芽細胞において、ＥｒｂＢ２のキナーゼ活性を阻害した結果、プレキシンＢ１のセマフォリン４Ｄ刺激依存的なリン酸化が減少した。これらの結果から、プレキシンＢ１が骨芽細胞においてセマフォリン４Ｄの主要レセプターとして作用することが示唆された。そこで、Plxnb1-/-マウスの骨表現型を解析した。Sema4d-/-マウスと同様、Plxnb1-/-マウスの骨量（図９）及び骨梁幅（図１０）は、野生型マウスと比較して、骨芽細胞骨形成の上昇により著しく増加した。また、Plxnb1-/-マウスの骨芽細胞表面積（図１１）、石灰化した骨表面積（図１２）及び骨形成率（図１３）も、野生型マウスと比較してそれぞれ顕著に上昇したが、破骨細胞の骨吸収を示すパラメーター（破骨細胞表面積、破骨細胞数及び侵食された骨表面積）に変化はなかった。これらの結果から、Plxnb1-/-マウスにおける高骨量の表現型は、Sema4d-/-マウスの高骨量の表現型と同様に、骨芽細胞による骨形成の増加によるものであることが示唆された。Sema4d-/-破骨細胞で認められた、野生型骨芽細胞による骨結節形成への刺激効果は、Plxnb1-/-細胞では認められなかった。この結果は、プレキシンＢ１は、主にセマフォリン４Ｄを介して骨芽細胞を認識していることを示唆している。
　セマフォリン４Ｄ-プレキシンＢ１はどのようにして、骨芽細胞において阻害シグナルへ変換するのか。セマフォリン－プレキシンシステムは、主としてＲｈｏファミリー低分子ＧＴＰアーゼを介して、アクチン細胞骨格の再編成を調節することによって、細胞形態形成及び細胞遊走を調節することが知られている。また、セマフォリン４ＤがプレキシンＢ２に結合すると、チロシンキナーゼＥｒｂＢ２の存在下で、ＲｈｏＡ活性が刺激されるのに対し、セマフォリン４Ｄは、他のチロシンキナーゼＭｅｔの存在下では反対の作用を奏することが知られている（J. M. Swiercz, T. Worzfeld, S. Offermanns, J Biol Chem 283, 1893 (Jan 25, 2008)）。そこで、セマフォリン４ＤがＲｈｏＡを活性化する可能性について調べた。骨芽細胞におけるＥｒｂＢ２とＭｅｔの発現量を解析したところ、ＥｒｂＢ２はＭｅｔと比べ、かなり多く発現していることが示された。また、セマフォリン４Ｄ刺激は、ＥｒｂＢ２のリン酸化を誘導したが、Ｍｅｔのリン酸化は誘導しなかった。さらに、イムノブロット解析及びプルダウン解析から、セマフォリン４Ｄは、ＲｈｏＡのＧＴＰ結合活性型を増加させ、この活性は、特にPlxnb1-/-細胞で抑制されることが示された。一方、別のＲｈｏファミリーであるＲａｃ１の活性は、セマフォリン４Ｄ刺激に影響されなかった。この結果と一致して、アデノウイルスを用いて構成的活性型ＲｈｏＡを導入した場合、頭蓋冠細胞における骨結節形成は抑制されたのに対し、ドミナントネガティブＲｈｏＡを導入した場合、骨結節形成は促進された。一方、構成的活性型Ｒａｃ１やドミナントネガティブＲａｃ１は骨形成に影響を与えなかった。これらの結果から、ＲｈｏＡが、セマフォリン４Ｄ-プレキシンＢ１の骨形成への阻害効果を選択的に仲介することが示唆された。プレキシンＢ１は２つのＲｈｏＧＴＰアーゼ調節ドメイン、すなわちＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）ドメイン及びＲｈｏ-ＧＥＦに結合するＰＤＺ－結合ドメインを有する（I. Oinuma, Y. Ishikawa, H. Katoh, M. Negishi, Science 305,862 (Aug 6, 2004)、J. M. Swiercz, R. Kuner, J. Behrens, S. Offermanns, Neuron 35, 51 (Jul 3, 2002)、V. Perrot, J. Vazquez-Prado, J. S. Gutkind, J Biol Chem 277, 43115 (Nov 8, 2002)、M. H. Driessens, C. Olivo, K. Nagata, M. Inagaki, J. G. Collard, FEBS Lett 529, 168 (Oct 9, 2002)）。実際に、プルダウン解析及びイムノブロット解析から、Ｒｈｏ-ＧＥＦとして知られているＰＤＺ－ＲｈｏＧＥＦやＬＡＲＧ（leukemia associated RhoGEF）は、骨芽細胞においてもプレキシンＢ１と結合することが示された。そこで、上記ＧＡＰドメイン及びＰＤＺ－結合ドメインが、骨形成の抑制に重要であるかを判断するために、２種類のプレキシンＢ１のミュータント（PlexinB1-ΔPDZ及びPlexinB1-RA）（I. Oinuma, Y. Ishikawa, H. Katoh, M. Negishi, Science 305, 862 (Aug 6, 2004)）を作製した（図１４）。かかる２種類のプレキシンＢ１のミュータントとコントロールである野生型プレキシンＢ１（WT-Plexin-B1）がそれぞれ過剰発現するPlxnb1-/-頭蓋冠細胞を作製した後、Fc-sema4Dによって刺激し、骨芽細胞分化の阻害効果を評価した。Plxnb1-/-細胞において、骨芽細胞マーカー（Ａｌｐｌ、Ｂｇｌａｐ及びＣｏｌ１ａ１）のｍＲＮＡ発現で示されるFc-Sema4dの阻害効果は、WT-PlexinB1及びPlexinB1-RAの過剰発現により回復したが、PlexinB1-ΔPDZの過剰発現では回復しなかった。これらの結果は、ＲｈｏＡがセマフォリン４Ｄによる骨形成の阻害を特異的に媒介することを示唆する。
　骨芽細胞におけるＲｈｏＡのインビボでの役割を調べるため、CAT-RhoA DNトランスジェニックマウス（K. Kobayashi et al., J Neurosci 24, 3480 (Apr 7, 2004)）とコラーゲンα１（Ｉ）－Creトランスジェニックマウス（R. Dacquin, M. Starbuck, T. Schinke, G. Karsenty, Dev Dyn 224, 245 (Jun, 2002)）とを交配して、骨芽細胞でドミナントネガティブＲｈｏＡが特異的に発現する（RhoA DNOB）マウスを作製した。骨芽細胞による骨形成が促進したことにより、RhoA DNOBマウスの骨量（図１５）及び骨梁幅（図１６）は、野生型マウスと比較して増加した。また、RhoA DNOBマウスの骨芽細胞表面積（図１７）、石灰化した骨表面積（図１８）及び骨形成率（図１９）は、野生型マウスと比較して顕著に上昇したが、破骨細胞の骨吸収を示すパラメーター（破骨細胞表面積、破骨細胞数及び侵食された骨表面積）に変化はなかった。かかる骨表現型は、Sema4d-/-及びPlxnb1-/-マウスの骨表現型と同様であった。RhoA DNOBの発現が骨芽細胞分化中に増加するにしたがって、骨結節形成及び骨芽細胞マーカー遺伝子（Ａｌｐｌ、Ｂｇｌａｐ及びＣｏｌ１ａ１）の発現は、RhoA DNOBマウス由来の頭蓋冠細胞で顕著に上昇した。また、RhoA DNOB細胞において増加した骨結節形成は、Fc-sema4dによって抑制されないことから、ＲｈｏＡがセマフォリン４Ｄ-プレキシンＢ１の下流で阻害シグナルを媒介していることを示唆している。
　Sema4dの機能阻害が、骨粗しょう症にとって有効であるかどうかを調べるために、ＯＶＸ（卵巣摘出）処理した閉経後骨粗しょう症のモデルマウスを用いて検証した。すなわち、ＯＶＸ処理後のマウスに抗Sema4d抗体を毎週静脈内投与し、骨量の減少に対して予防効果があるかどうかを調べた。骨組織を解析した結果、抗Sema4d抗体を投与しない場合、骨量が減少するのに対し、抗Sema4d抗体を投与することにより、骨形成の促進（骨芽細胞表面積（図２０）、骨量の増加（図２１）及び骨形成率（図２２）の増加、並びに骨梁間隔の減少（図２３））が認められた。一方、破骨細胞の骨吸収を示すパラメーター（破骨細胞数及び侵食された骨表面積）に変化はなかった。これらの結果から、抗Sema4d抗体処理によりセマフォリン４Ｄの機能を阻害させると、骨粗しょう症における骨量低下を予防する効果があることが示された。さらに、セマフォリン４Ｄの機能阻害が、既に減少した骨量の治療に対しても効果があるかどうかを調べた。すなわち、ＯＶＸ処理後、骨量が減少した６週間後に抗Sema4d抗体を週に３日３週間、尾静脈より投与した。骨形成を示すパラメーター（骨芽細胞表面積、骨量の増加及び骨形成率の増加、並びに骨梁間隔の減少）を解析した結果、骨形成の促進（骨芽細胞表面積（図２６）、骨量の増加（図２７）及び骨形成率（図２８）の増加、並びに骨梁間隔の減少（図２９））が認められた。したがって、一度減少した骨は、上記ＯＶＸ処理後、毎週抗Sema4d抗体を投与した場合と同レベルまで回復していることが明らかとなった。すなわち骨量低下を予防した場合と同程度の回復を認めた。一方、破骨細胞の骨吸収を示すパラメーター（侵食された骨表面積）に変化はなかった。また、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の機能阻害が骨結節形成に与える影響を調べた。マウス骨芽細胞とＷＴマウスの破骨細胞を用いた場合は、抗Sema4D抗体の濃度依存的に骨結節形成が促進された（図２４の上パネルの左から１番目から３番目までのプレート）。一方、Fc-sema4dによって抑制された骨結節形成は、抗プレキシンＢ１抗体の濃度依存的に促進された（図２４の下パネル）。これらの結果から、抗Sema4d抗体処理あるいは抗プレキシンＢ１抗体処理により、セマフォリン４Ｄ－プレキシンＢ１相互作用を阻害させると、骨粗しょう症における骨量低下を抑制するだけでなく、骨量増加を促す効果があることが示された。さらに、ヒト骨芽細胞におけるセマフォリン４Ｄの機能阻害が骨結節形成に与える影響を調べた。すなわち、ヒト末梢血単球由来のＣＤ１４陽性細胞から分化させた破骨細胞（図２５、下段）やその培養上清（図２５、上段）を用いて検証したところ、かかる破骨細胞やその培養上清に加えて抗Sema4d抗体を骨芽細胞へ添加すると、抗Sema4d抗体の濃度依存的に骨結節形成が促進された（図２５）。この結果は、上記閉経後骨粗しょう症のモデルマウスにおける結果をヒト細胞においても支持するとともに、セマフォリン４Ｄ－プレキシンＢ１相互作用を阻害することが、骨形成を増加するための新たな戦略となることを示している。
　セマフォリン４Ｄの骨芽細胞分化阻害の作用点について、詳細に解析した。すなわち、フローサイトメトリー解析により、Sema4d-/-マウスにおける骨髄中造血幹細胞（Ｓｃａ－１＋ＣＤ１０５＋ＣＤ１０６＋ＣＤ４４＋ＣＤ４５．２－ＣＤ１１ｂ）数を野生型マウスと比較したところ、違いはなかった。また、細胞増殖解析を行ったところ、骨髄中の骨芽前駆細胞数は、骨芽細胞分化前にはSema4dによって若干増加するが（Ｄａｙ０）、骨芽細胞分化過程においては、セマフォリン４Ｄ刺激によって変化しなかった（Ｄａｙ１４）。なお、ＣＦＵ解析から、セマフォリン４Ｄ刺激によって、ＡＬＰ発現やAlizarinで示される骨形成は抑制されている。これらの結果は、セマフォリン４Ｄが骨芽細胞分化段階に作用していることを示唆している。
　Insulin-like growth factors（ＩＧＦ）－１によるInsulin receptor substrate（ＩＲＳ）シグナルは、骨芽細胞分化を促進することが知られている。そこで、セマフォリン４Ｄ刺激でＩＲＳシグナルに関するＡｋｔ及びＥＲＫのリン酸化を調べたところ、かかるリン酸化レベルは低下していた。また、ＩＲＳの活性化指標となるＴｙｒリン酸化も低下しており、これらの結果は、セマフォリン４Ｄ刺激は、ＩＲＳシグナルを低下させることを示唆している。また活性化型ＲｈｏＡは、Ａｋｔ及びＥＲＫのリン酸化を低下させ、逆にＲｈｏＡ阻害剤であるＹ－２７６３２及びＲＫＩはこれらのリン酸化を亢進させることが明らかとなった。さらに、かかるＲｈｏＡ阻害剤は、ＩＲＳシグナルにおける活性化型リン酸化の亢進を誘導することも明らかとなった。これらの結果から、セマフォリン４ＤはＲｈｏＡを活性化することによって、ＩＲＳシグナルの低下を誘導し、骨芽細胞分化を抑制することが示唆された。
［まとめ］
　以上の実験により、破骨細胞由来のセマフォリン４Ｄを、骨再構築における破骨細胞－骨芽細胞間の伝達に重要なメディエーターとして同定した。骨再構築は、３つの段階（破骨細胞による骨吸収の開始、骨芽細胞による新たな骨形成への移行、及び新しい骨の合成の終了（K. Matsuo, N. Irie, Arch Biochem Biophys 473, 201 (May 15, 2008)）からなるサイクルで行われる。破骨細胞において発現したSema4dは、破骨細胞吸収が完了するまで、骨芽細胞の分化が抑制される初期段階における骨形成の阻害因子として機能しうる。さらに、ＲｈｏＡの活性化が、インビボで骨芽細胞骨形成を阻害することも示した。移行段階に関与することが示されているＥｐｈｒｉｎＢ２／ＥｐｈＢ４は、骨形成を調節するためにＲｈｏＡも利用し（C. Zhao et al., Cell Metab 4, 111 (Aug, 2006)）、Ｒｈｏファミリー低分子ＧＴＰアーゼが、骨再構築シグナル伝達のコーディネーターとして作用することを示唆している。GeneChip解析により、ＰＤＺ含有ＲｈｏＡ特異的ＧＥＦＡｒｆｇｅｆ１２（ＬＡＲＧ)（J. M. Swiercz, R. Kuner, J. Behrens, S. Offermanns, Neuron 35, 51 (Jul 3, 2002)、V. Perrot, J. Vazquez-Prado, J. S. Gutkind, J Biol Chem 277, 43115 (Nov 8, 2002)）が、骨芽細胞で高発現することも示された。この結果は、セマフォリン４Ｄ-プレキシンＢ１-ＲｈｏＡ経路の重要性を裏付けている。また、免疫蛍光染色による解析から、Fc-sema4D刺激後にカドヘリン１１のダウンレギュレーションが観察され、調節されたギャップ結合機能の関与が示唆された。間欠的な副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）処理は、骨形成を増加させることが現在証明されている唯一の有効な方法である。開発中の抗Sost抗体は、新たな骨形成剤として注目されているのに対し、セマフォリン４Ｄ-プレキシンＢ１-ＲｈｏＡ経路に関わる因子をターゲットとする抗体、阻害剤等は、骨減少性疾患への新たな治療剤として期待できる。
　本発明は、骨形成の促進や、骨疾患の予防及び／又は治療の分野に好適に利用することができる。

Claims (10)

  1. セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質を有効成分とする骨形成促進剤。
  2. 結合阻害物質が、抗セマフォリン４Ｄ抗体であることを特徴とする請求項１に記載の骨形成促進剤。
  3. 結合阻害物質が、抗プレキシンＢ１抗体、又は、プレキシンＢ１の細胞外領域を含むタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の骨形成促進剤。
  4. セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質を有効成分とする骨疾患の予防・治療剤。
  5. 結合阻害物質が、抗セマフォリン４Ｄ抗体であることを特徴とする請求項４に記載の骨疾患の予防・治療剤。
  6. 結合阻害物質が、抗プレキシンＢ１抗体、又は、プレキシンＢ１の細胞外領域を含むタンパク質であることを特徴とする請求項４に記載の骨疾患の予防・治療剤。
  7. 骨疾患が、骨折、骨欠損、骨粗しょう症、骨軟化症、骨減少症、腰背痛、骨ページェット病、硬直性脊椎炎、関節リウマチ、及び、変形性関節症から選択されることを特徴とする請求項４～６のいずれかに記載の骨疾患の予防・治療剤。
  8. 被検物質がセマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質であるか否かを決定し、前記被検物質が前記結合阻害物質である場合に、前記被検物質を骨形成促進剤の有効成分の候補物質と判定することを特徴とする、骨形成促進剤の有効成分の候補物質の判定方法。
  9. 被検物質がセマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質であるか否かを決定する方法が、以下の工程（Ａ）～（Ｄ）を有することを特徴とする、請求項８に記載の判定方法：
    （Ａ）被検物質の存在下に、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１とを接触させる工程：
    （Ｂ）セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合の程度を測定する工程：
    （Ｃ）上記工程（Ｂ）で測定した程度を、被検物質非存在下のその程度と比較する工程：
    （Ｄ）上記工程（Ｂ）で測定した程度が、被検物質非存在下のその程度よりも低下した場合に、その被検物質を、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１との結合阻害物質と決定する工程：
  10. 請求項８又は９に記載の判定方法を使用して、被検物質の中から骨形成促進剤の有効成分の候補物質を探索することを特徴とする、骨形成促進剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法。
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