CN105555291B - 用于治疗雄性不育症的抗体、化合物及其衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及选择性地与RANKL/OPGbp结合并且调节RANKL/OPGbp与RANK/OPG之间的相互作用的拮抗剂或抑制剂。具体地讲，本发明涉及用于治疗、预防或减轻雄性不育症或雄性生育力降低，例如，少精子症或无精子症的、与RANKL/OPGbp肽具有免疫反应性的抗体或抗原结合域、其片段或衍生物。

Description

用于治疗雄性不育症的抗体、化合物及其衍生物
技术领域
本发明涉及选择性地与RANKL/OPGbp结合并且调节RANKL/OPGbp与RANK/OPG之间的相互作用的拮抗剂或抑制剂。特别地，本发明涉及用于治疗、预防或减轻雄性不育症或雄性生育力降低(例如，少精子症或无精子症)的、与RANKL/OPGbp肽具有免疫反应性的抗体或抗原结合域、其片段或衍生物。
背景技术
NF-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)系统被认为对骨的体内稳态很重要并且包括三个重要因子。RANKL是与邻近细胞上的特异性受体(NF-κB的受体活化因子(RANK))结合的跨膜配体，该特异性受体随后活化NFKB并且通过调节细胞周期(即，增殖、分化和细胞凋亡)来调节细胞活化。OPG是结合RANKL并且抑制其信号传导的内源性分泌蛋白。
RANK/RANKL触发促进破骨细胞分化的TRAF介导的激酶级联的网络。RANKL在成骨细胞上表达并且其受体，Rank，在前破骨细胞上表达。RANKL表达受到许多因子的刺激，例如，IL-1、IL-6、IL-11、IL-17、TNF-α、维生素D、Ca2+、甲状旁腺、糖皮质激素、前列腺素E2和免疫抑制药物，并且TGF-α下调RANKL表达。RANK/RANKL的相互作用诱导多核的成熟破骨细胞的分化和形成，从而导致骨重吸收。第三蛋白激动剂，骨保护素(OPG)，也由成骨细胞产生，并且已知对前破骨细胞的分化过程发挥抑制作用。OPG通过结合到RANKL，也称为骨保护素结合蛋白(OPGbp)，抑制RANK/RANKL相互作用和后续的破骨细胞生成。OPG因此是非常有效的抗吸收剂。它也用作肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的诱饵受体并且通过阻碍这种配体的细胞凋亡作用来增加细胞存活率。小鼠中OPG的过表达导致重度骨硬化病并且OPG缺失的小鼠患有骨质疏松症的事实证明了OPG的生理学重要性。缺失RANK或RANKL诱导小鼠的骨硬化病。
因此，RANK/RANKL系统对骨再吸收细胞(破骨细胞)的活化至关重要。在骨中，骨合成细胞(成骨细胞)表达向未成熟的破骨细胞上的RANK传导信号的RANKL。这诱导细胞的增殖和活化，并且它们开始增殖并再吸收骨。OPG由骨中的体细胞产生并且这种产生受到性激素、TGF-B和各种其他物质的调节。现在，人们制备了抗RANKL的重组抗体，狄诺塞麦(denosumab)用于治疗骨质疏松症，因为它抑制RANKL的信号传导并且因此引起人体中的更少的骨再吸收。RANKL信号传导在健康人体中仅具有两种另外的已知的额外功能，因为它涉及哺乳细胞和免疫细胞。
最近，已经公开了使用RANK/RANKL拮抗剂治疗神经肌肉疾病、遗传性肌病和/或非遗传性肌病，和/或用于调节骨骼肌和心肌废用、疾病和老化(WO 2013/067639 A1)。
降低的精液质量是雄性不育症的主要因素。精液质量是精液完成受精的能力的度量标准。如今雄性生育潜力的评价基本上通过精液分析进行。精液分析评价雄性精液的某些特性以及精液中包含的精子。评价精子质量所测量的最常见的变量是：精子计数、运动性和形态。
然而，当今无法治疗射精没有精子的男性或者没有能够增加精子数量的药物。
发明内容
在患有生精障碍或具有原位瘤的重度睾丸发育不全的活组织检查中，似乎看来在管周细胞中不产生OPG。这表明有可能用RANKL的拮抗剂或抑制剂(例如，拮抗性的抗RANKL抗体)治疗人，这些拮抗剂或抑制剂可以影响生殖细胞的增殖和细胞凋亡。因此，拮抗性的抗RANKL抗体，例如，狄诺塞麦，可以具有新适应症作为没有精子但是睾丸中存在生殖细胞的男性的治疗。可替代地，相对物(RANKL)可以用于获得相反效果的男性生育控制。
本发明人现在已经解释了RANKL、RANK和OPG在人和小鼠的睾丸中在RNA和蛋白水平均表达。塞尔托利氏细胞表达RANKL，而生殖细胞表达RANK并且管周细胞表达OPG。正常地，RANKL活化NFKB，并且在雄性性腺中此途径的活化决定了睾丸细胞在睾丸中是增殖还是经历细胞凋亡。因此，此途径似乎是生殖细胞增殖的新的调节子。这在实施例3-5中有进一步记载，实施例3-5显示了特异性化合物(以OPG说明)和特异性抗体(以狄诺塞麦说明)能够正面影响精液质量。
本发明的目的是提供拮抗剂或抑制剂，例如，调节RANKL和RANK之间的相互作用的抗体或抗原结合域，特别是阻碍RANKL和RANK之间的相互作用和/或抑制RANKL的至少一种活性(其导致雄性不育症或雄生育力降低)的抗体或抗原结合域。本发明的另外的目的是提供可用于治疗、预防或减轻雄性不育或雄性生育力降低的抗体或抗原结合域、其片段或衍生物。本发明的另外的目的是提供调节睾丸中RANKL和RANK的相互作用并且中和RANKL的至少一种活性的抗体、抗原结合域或其片段或变体。所述抗体或抗原结合域、其片段或衍生物可用于治疗、预防或减轻男性不育或男性生育力降低，例如精子减少症或无精子症。
附图说明
图1示出了来自标记为1-23的人样本的选择的转录物的RT-PCR。两个不同的引物集(primerset)检测正常的和病态的睾丸组织中的RANKL的两种不同的同种型。RANK和OPG也在正常的和病态的睾丸样本中表达，并且与正常睾丸相比OPG表达在CIS和精原细胞瘤中消失。有趣的是，仅一种RANKL同种型仅在塞尔托利氏细胞中表达，并且这种同种型在表示性别特异性的RANKL同种型的卵巢中不表达。这种同种型在NTera2细胞中不表达，而在TCAM2细胞中表达。RANK在非精原细胞瘤中不存在或者弱表达，而NFKB和RELa+b在所有样本中均表达。
图2A示出了来自具有正常维生素D受体(Vdr wt)或具有突变的和无活性维生素D受体(Vdr KO)的瑞士小鼠的选择的转录物的RT-PCR。引物集检测正常小鼠中的RANKL，而表达在Vdr KO小鼠中很低或不存在。RANK、OPG、RELa在所有动物中均表达，而NFKB看起来在Vdr KO小鼠中表达较低。
图2B示出了来自具有正常Vdr(wt)、一个无活性等位基因(+/-)或两个失活的等位基因(-/-)的小鼠的RANKL的定量PCR。杂合和纯合突变小鼠中的RANKL的显著下调表明主同种型为RANKL1，因为它由维生素D调节，而同种型3并非如此。
图3示出了RANKL和RANK除在正常小鼠的睾丸中表达之外在从人获得的正常睾丸和原位癌小管中的免疫组织化学表达。RANK在生殖细胞中表达，而RANKL在塞尔托利氏细胞和生殖细胞的后期阶段中表达。
图4：在正常培养基中生长14小时+4小时的NT2细胞在用刃天青染料处理20小时之后的存活率/增殖。所有处理的浓度为100ng/ml。值为平均值±标准差(n＝8)，其中*表示在t检验之后的显著性差异p<0.05。
图5：在正常培养基中生长10小时+6.5小时的TCam-2细胞在用刃天青染料处理4小时和20小时之后的存活率/增殖。所有处理的浓度为100ng/ml。值为平均值±标准差(n＝8)，其中*表示在t检验之后的显著性差异p<0.05。
图6示出了在人的离体模型中的生殖细胞增殖。生殖细胞增殖在用媒介物(DMSO)、100ng/ml RANKL或100ng/ml狄诺塞麦对人的睾丸样本(N＝3)进行48小时处理之后通过BrdU合并进行评估，还与用50ng/ml OPG、100ng/ml CSF-1和100ng/ml PTHrP处理的一个睾丸进行比较。数据表示为增殖+标准误差的平均变化，并且数据归一化为载体处理的样本。
图7示出了在包含管内原位癌细胞的离体人睾丸模型中用RANKL、CSF-1、狄诺塞麦和对照处理的增殖(上)和细胞凋亡(下)的影响。已经统计了表达BrdU或半胱天冬酶3的生殖细胞的平均数以比较处理之间的效果。
图8示出了用媒介物、OPG或RANKL处理的小鼠的总睾丸重量。在15只小鼠经过14天处理(5只小鼠随机进行每项处理：媒介物、RANKL或OPG)之后评估睾丸重量。数据表示为平均值+标准误差，并且数据归一化为媒介物处理的样本。*表示p<0.05并且***表示p<0.001。
图9示出了用媒介物、OPG或RANKL处理的小鼠的总附睾重量。在15只小鼠经过14天处理(5只小鼠随机进行每项处理：媒介物、RANKL或OPG)之后评估睾丸重量。数据表示为平均值+标准误差，并且数据归一化为媒介物处理的样本。NS表示p>0.05并且*表示p<0.05。
图10示出了10周龄小鼠的睾丸形态测量数据。来自10周龄小鼠的睾丸固定在波恩氏溶液中并且评估具有生殖细胞上皮(6-12阶段)的生精小管(每个处理组N＝3)。用媒介物或OPG处理14天的小鼠的小管直径(上)和生殖细胞上皮宽度(下)的比较。竖条表示平均值±标准误差。
图11示出了用媒介物或OPG处理的小鼠的精子计数。将附睾尾部剁碎置于1ml的PBS中，随后评估精子计数(5只小鼠随机用媒介物或OPG处理)。数据表示为平均值+标准误差，并且*表示p<0.05。
现在将在下文中更详细地描述本发明。
具体实施方式
定义
在更详细地讨论本发明之前，将首先定义以下术语和约定：
本发明的抗体和抗原结合域选择性地结合到RANKL/OPGbp，其以比其他抗原更大的结合亲和力优先结合到RANKL/OPGbp。该抗体可以选择性地结合到人的RANKL/OPGbp，而且还可检测地结合到非人RANKL，例如，鼠RANKL。可替代地，该抗体可以排他地结合到人的RANKL或RANK，而不分别可检测地结合到非人RANKL或RANK。
术语“单克隆抗体”指的是从基本上同质的抗体群体获得的抗体，其中每个单克隆抗体通常将识别抗原上的单个表位。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。例如，本发明的单克隆抗体可以通过如Kohler等人(Nature256,495(1975))描述的杂交瘤方法制备，或者可以例如使用如本文所述的技术从噬菌体文库中分离。
术语“抗原结合域”或“抗原结合区”或“其片段或衍生物”指的是包含与抗原相互作用并且在结合剂上赋予其针对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的选择结合剂的部分(例如抗体分子)。优选地，抗原结合区将具有人类起源。在其他实施方式中，抗原结合区可以源自于其他动物物种，特别是家畜和啮齿动物，例如，兔子、大鼠或仓鼠。
术语“有效量”和“治疗有效量”在关于抗体或抗原结合区、其片段或衍生物、与RANKL肽具有免疫反应性使用时指的是支持在RANKL的一个或多个生物活性水平的可观察的变化有用或必要的选择结合剂的量，其中所述变化可以是RANKL活性水平的增大或减小。
在本发明的上下文中，术语“序列同一性”表示两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的同源性程度的定量测量。如果将要比较的两个序列不具有相同的长度，那么它们必须比对以得到最佳的可能匹配，从而允许在多肽序列或核苷酸序列的端部插入空位或可替代地截尾。序列同一性可以计算为
Figure BDA0000923916850000061
其中Ndif是两个序列在比对时的不同残基的总数，并且其中Nref是一个序列中的残基数量。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC具有75％的序列同一性(Ndif＝2并且Nref＝8)。空位计算为具体残基的不同一性，即，DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC具有75％的序列同一性(Ndif＝2并且Nref＝8)。
相对于涉及氨基酸序列或核苷酸序列的本发明的所有实施方式，一个或多个序列之间的序列同一性的百分比也可以基于使用clustalW软件(http：/www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html)(默认设置)的比对。对于核苷酸序列比对，这些设置是：比对(Alignment)＝3Dfull，空位开放(Gap Open)10.00，空位延伸(Gap Ext.)0.20，空位分隔距离(Gap separation Dist.)4，DNA权矩阵(DNA weight matrix)：同一性(IUB)。对于氨基酸序列比对，这些设置如下：比对(Alignment)＝3Dfull，空位开放(Gap Open)10.00，空位延伸(Gap Ext.)0.20，空位分隔距离(Gap separation Dist.)4，蛋白质权矩阵(Proteinweight matrix)：Gonnet。
可替代地，核苷酸序列可以通过使用程序DNASIS Max进行分析，并且可以在http：//www.paralign.org/完成序列比较。这种服务基于两种比较算法，称为Smith-Waterman(SW)和ParAlign。第一种算法由Smith和Waterman出版(1981)，并且是寻找两个序列的最佳局部比对的成熟方法。另一种算法，ParAlign，是用于序列比对的探索法，Rognes(2001)出版了这些方法的细节。使用得分矩阵和空位罚分以及E值(E-value)的默认设置。
用于医疗用途的化合物
在第一方面，本发明提供了一种化合物，该化合物是与NF-κB(RANK)的受体活化剂结合的NF-κB配体(RANKL)的骨保护素结合蛋白(OPGbp)/受体活化剂的拮抗剂或抑制剂，用于刺激睾丸中的(生殖)细胞增殖，和/或用于治疗和/或预防哺乳动物的雄性不育症，和/或用于诱导或提高哺乳动物的雄性生育力。
该化合物特别地可以是能够与RANKL结合的试剂。
另外，该化合物可以是选择性结合到RANKL的蛋白质结合剂。
因此，根据本发明的特定实施方式，如上所述供使用的化合物选自由OPG、包括OPG的融合蛋白(例如，Fc-OPG)和人免疫球蛋白G1组成的组。在实施例4和图6中，提供了表示OPG对生殖细胞增殖的影响的数据。在实施例5和图8至图11中，提供了示出在体内实验中OPG对小鼠的睾丸参数的影响的数据。
在本发明的具体方面，本发明涉及用于刺激睾丸中的(生殖)细胞增殖和/或用于治疗和/或预防哺乳动物的雄性不育症和/或用于诱导或提高哺乳动物(例如少精子症或无精子症)的雄性生育力的OPG、包括OPG的融合蛋白(例如，Fc-OPG)和人免疫球蛋白G1。
在SEQ ID NO：1和3中分别示出了鼠和人RANKL的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。此外，在SEQ ID NO 2和4中分别示出了鼠和人RANKL氨基酸序列。
RANKL序列的计算机分析表明RANKL是2型跨膜蛋白。因此，根据预测，鼠RANKL蛋白包括47个氨基酸的胞内域、21个氨基酸的跨膜域以及247个氨基酸的胞外域。根据预测，人RANKL蛋白包括47个氨基酸的胞内域、21个氨基酸的跨膜域以及249个氨基酸的胞外域。
可溶的RANKL包括信号肽和胞外域或其片段。
RANKL类似于在跨膜域与受体结合域之间具有生物活性似乎不需要的氨基酸区的TNF家族的其他成员。基于氨基酸序列的比对，预期，人RANKL的受体结合域是从以许多家族成员中的高度保守的Ala残基(即，SEQ ID NO：4的氨基酸162)开始的SEQ ID NO：4的约氨基酸162至约氨基酸317。鼠受体结合域从SEQ ID NO：2的约氨基酸139至约氨基酸294。
然而，本领域技术人员将认识到实际的受体结合域可以不同于通过比对和计算机分析所预测的受体结合域。
预期可溶的RANKL多肽的N端氨基酸在任一侧的保守的Ala残基的约五个氨基酸内。可替代地，所有或一部分间隔区可以被包括在可溶的RANKL肽的N端中，如同所有或一部分跨膜和/或胞内域可能的情形，条件是所得的可溶的RANKL不是膜相关的。
因此，可溶的RANKL多肽将具有选自由与SEQ ID NO：2的氨基酸1至139对应的SEQID NO：4的氨基酸1至162组成的组的N端氨基酸。可替代地，N端氨基酸在与SEQ ID NO：2(鼠RANKL)的氨基酸48至139对应的SEQ ID NO：4(人RANKL)的69至162之间。
同样地，C端氨基酸可以在SEQ ID NO：4的氨基酸313至317之间。
由于发现OPG-RANK-RANKL的信号传导途径，已经评估和/或开发了RANKL功能和信号传导的几种抑制剂作为临床应用的候选。Lacey等人(Nature Reviews,(2012),Vol.11,401-419)提供了开发RANKL抑制剂的综述。这些抑制剂包括重组的全长OPG和RANK-Fc，后者是包括RANK的四个胞外CRD和人IgGd的Fc部分的融合蛋白。
能够结合RANKL的抗体或其片段
根据本发明的其他实施方式，如上所述的供使用的化合物是与OPGbp/RANKL肽，特别是人OPGbp/RANKL肽具有免疫反应性的化合物。可替代地，抗体可以与RANK肽，特别是人RANK肽具有免疫反应性。免疫反应性化合物可以特别地选自由以下各项组成的组：抗体、抗原结合域、抗体或抗原结合域的片段、或抗体或抗原结合域的衍生物。
本发明的化合物与OPGbp/RANKL肽具有免疫反应性，所述化合物例如，所述抗原结合域、所述抗体所述抗原结合域的片段、或所述抗体或所述抗原结合域的衍生物，可以是拮抗剂化合物，所述拮抗剂化合物降低RANKL的至少一种生物活性的水平。RANKL的拮抗剂抗体也可以称为RANKL的抑制性抗体或中和抗体。
同样地，本发明的化合物与RANK肽具有免疫反应性，所述化合物例如，所述抗原结合域、所述抗体或所述抗原结合域的片段、所述抗体或所述抗原结合域的衍生物，可以是拮抗剂化合物，所述拮抗剂化合物降低RANK的至少一种生物活性的水平。RANK的拮抗剂抗体也可以称为RANK的抑制性抗体或中和抗体。
特别地，根据本发明的供使用的化合物可以是RANKL信号传导的抑制剂。在本发明的上下文中，包括所述抗原结合域、抗体或抗原结合域的所述片段、抗体或抗原结合域的衍生物的化合物可以基本上能够抑制配体与受体的结合，例如，RANKL与RANK的结合。
当过量的抗体使结合到反受体或配体上的受体的量降低至少约20％、40％、60％、80％、85％、90％或更多(根据体外竞争性结合试验的测量结果)时，抗体基本上抑制配体与受体的结合。
根据本发明的供使用的化合物可以是选自由以下组成的组的化合物：多克隆抗体、单克隆抗体、其中重链和轻链由柔性接头连接的抗体、Fv分子、抗原结合片段、Fab片段、Fab'片段、F(AB')2分子、全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体。
术语所述抗体的“重链”和“轻链”各自包括具有足以赋予针对OPGbp/RANKL肽的特异性的可变区序列的任何多肽。全长重链包括可变区域VH以及三个恒定区域，CH1、CH2和CH3。
VH域在多肽的氨基端，并且CH3域在羧基端。如本文所用的术语“重链”包含全长重链及其片段。全长轻链包括可变区域，VL，以及恒定区域，CL。与重链一样，轻链的可变区域在多肽的氨基端。如本文所用的术语“轻链”包含全长轻链及其片段。Fab片段由一个轻链，以及一个重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链无法形成与另一个重链分子的二硫键。Fab'片段在CH1和CH2域之间包含一个轻链和一个重链，该重链包含更多个恒定区，使得在两个重链之间可以形成链间的二硫键以形成F(ab')2分子。Fv区包括来自重链和轻链两者的可变区，但是缺乏恒定区。单域抗体是Fv分子，其中重链可变区和轻链可变区已经由柔性接头连接以形成构成抗原结合区的单个多肽链。在WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203中详细讨论了单链抗体。
如上所述，已经鉴定了抑制OPGbp/RANKL的至少一种活性的抗RANKL/OPGbp抗体和抗原结合域。本发明的实施方式包括抗体，该抗体包括重链Fab，并且还包括κ或λ轻链序列。本发明的抗体还包括来自任何同种型，IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的人Fc区。优选地，Fc区来自人IgG，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明还提供了包括本文公开的Fab序列的片段、变体或衍生物的抗体或抗原结合域。片段可以包括通常结合到轻链恒定区或重链恒定区的轻链或重链Fab序列的可变区。抗体通常可以与重链和轻链的恒定区相连以形成全长抗体。
本发明的抗体、抗原结合域及其片段、变体和衍生物将保留选择性地结合到RANKL多肽，优选地，结合到人RANKL多肽的能力。在一种实施方式中，抗体和抗原结合域、及其片段、变体和衍生物将以解离常数(KD)结合RANKL多肽，该解离常数为约≤1nM，或可替代地≤0.1nM，或可替代地≤10pM或可替代地≤10pM。
本发明的抗体包括多克隆的，单特异性多克隆的，单克隆的，重组的，嵌合的，人源化的，全人的，单链和/或双特异性抗体。抗体片段包括与RANKL多肽上的表位结合的抗RANKL抗体的这些部分。这样的片段的实例包括Fab F(ab')、F(ab)'、Fv和sFv片段。抗体可以由全长抗体的酶裂解产生或者通过重组DNA技术产生，例如，通过包括编码抗体可变区的核酸序列的重组质粒的表达产生。
多克隆抗体是从用抗原免疫的动物的血清得到的抗体分子的异质群体。抗原是抗体能够结合的分子或分子的一部分，其额外地能够诱导动物产生能够与抗原的表位结合的抗体。抗原可以具有一个或多个表位。以上提到的特异性反应的意思是表示抗原将以高度选择性的方式与其对应的抗体反应并且不与可以由其他抗原诱发的多种其他抗体反应。
在动物(例如，兔子或小鼠)中通过多次皮下注射或腹膜内注射RANKL和佐剂提高一般针对RANKL多肽的多克隆抗体。根据本发明，使RANKL多肽或其变体、片段或衍生物与在待免疫的物种中具有免疫原性的载体蛋白(例如，匙孔血蓝蛋白、血清、白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合可能是有用的。另外，使用聚合剂例如明矾来增强免疫反应。在免疫之后，使动物流血并且测定血清的抗RANKL抗体滴度。
多克隆抗体(mAb)包含对抗原特异性的抗体的基本上同质的群体，这种群体包含基本上类似的表位结合位点。这些抗体可以具有任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和它们的任何亚类。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以在体外、原位或体内培养。体内或原位高滴度生产是优选的生产方法。
使用通过培养中的传代细胞系提供抗体分子生产的任何方法生产针对OPGbp/RANKL的单克隆抗体。用于制备单克隆抗体的适当方法的实例包括Kohler等人(Nature256,495-497(1975))的杂交瘤方法以及人B细胞杂交瘤方法，Kozbor(J.Immunol.133,3001(1984))、Brodeur等人(单克隆抗体制备技术和应用(Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications),pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))、以及Harlow和Lane(抗体：实验室手册，冷泉港实验室(Antibodies：A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory)(1988))，这些参考文献的内容通过引用的方式全部并入本申请中。
用于生产针对OPGbp/RANKL的单克隆抗体的特别优选的方法涉及用OPGbp/RANKL肽，例如，全长人RANKL蛋白，按照Green,LL(J.Immunol.Methods(1999),Vol.231,11-25)所述免疫XenoMouse。
优选的抗RANKL或抗RANK抗体包括会部分或完全抑制人RANKL与其同源受体RANK结合的单克隆抗体，或具有基本上相同的特异性结合特性的抗体，以及其片段和区域。用于通过竞争性抑制确定单克隆抗体的特异性和亲和力的优选方法可以见于Harlow等人(抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社(Antibodies：A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press),Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)、Colligan等人主编的免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)(Greene Publishing Assoc and WileyInterscience,N.Y.,(1992,1993))以及Muller(Meth.Enzymol.,92：589-601(1983))。
嵌合抗体是不同部分来源于不同动物物种的分子，例如，具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。嵌合抗体主要用于降低应用中的免疫原性并且增加生产收率，例如，来自杂交瘤的鼠单克隆抗体具有更高的收率，但是人类中具有更高的免疫原性，使得使用人/鼠嵌合单克隆抗体。
本领域中已知嵌合抗体以及它们的生产方法。参见Cabilly等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：3273-3277(1984))、Morrison等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))、Boulianne等人(Nature,312：643-646(1984))、Neuberger等人(Nature,314：268-270(1985))、Liu等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84：3439-3443(1987))以及Harlow和Lane(抗体：实验手册，冷泉港实验室(Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory)(1988))。
例如，本发明的嵌合单克隆抗体可以用作治疗剂。在这种嵌合抗体中，重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于一个特定的抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链(一个或多个)的剩余部分与来源于其它物种或属于另一个抗体类或亚类的抗体以及这样的抗体的片段中的相应的序列相同或同源，只要它们表现出希望的生物活性(参见美国专利4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,81,6851-6855(1985))。
如本文所用的术语“嵌合抗体”包括单价、二价或多价免疫球蛋白。单价嵌合抗体是由通过二硫键与嵌合L链相连的嵌合H链形成的二聚体(HL)。二价嵌合抗体是由通过至少一个二硫键相连的两个HL二聚体形成的四聚体(H2L2)。多价嵌合抗体也可以生产，例如通过采用聚集的CH区(例如，来自IgM H链或[微]链)。
本发明的鼠抗体和嵌合抗体、片段和区可以包括单独的免疫球蛋白重(H)和/或轻(L)链。嵌合H链包括源自于对RANKL特异性的非人抗体的H链的抗原结合区，该抗原结合区连接至人H链C区(CR)例如，CH1或CH2的至少一部分。
根据本发明的嵌合L链包括源自于对RANKL具有特异性的非人抗体的L链的抗原结合区，该抗原结合区连接至人L链C区(CL)的至少一部分。
具有相同或不同的可变区结合特异性的嵌合H链和L链的选择性结合剂，例如，抗体、片段或衍生物，也可以根据已知的方法步骤，例如，根据Ausubel等人(编辑)(分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology),Wiley Interscience,N.Y.(1993))和Harlow等人(抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社(Antibodies：ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press),Cold Spring Harbor,N.Y.(1988))，通过适当连接单独的多肽链制备。这些参考文献的内容通过引用的方式全部并入本申请中。使用该方法，从表达嵌合L链(或它们的衍生物)的宿主单独培养表达嵌合H链(或它们的衍生物)的宿主，并且单独恢复且随后连接免疫球蛋白链。可替代地，可以共同培养宿主，并且在培养基中允许链自主连接，随后恢复组装的免疫球蛋白、片段或衍生物。
例如，本发明的选择性结合剂(例如，嵌合抗体)的抗原结合区优选地源自于对人RANKL具有特异性的非人抗体。编码这样的非人抗体的DNA的优选来源包括产生抗体的细胞系，例如，通常称为杂交瘤的杂交细胞系。
本发明还提供了抗RANKL抗体的片段、变体和衍生物以及融合物，其中术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“融合物”如上所述。本发明提供了抗RANKL抗体的片段、变体和衍生物以及融合物，它们在功能上与未修饰的抗RANKL抗体类似，也就是说，它们保持未修饰的抗体的至少一种活性。除了如上所述的修饰之外，还包括增加编码细胞毒性蛋白，例如植物和细菌毒素的基因序列。从本发明的宿主中的任一个可以产生抗RANKL抗体的片段、变体、衍生物和融合物。
合适的片段包括，例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和scFv。这些片段缺乏完整抗体的Fc片段，从循环中更快地清除，并且可以具有比完整抗体更低的非特异性组织结合。参见Wahl等人(J.Nucl.Med.,24：316-325(1983))。通过使用本领域中熟知的方法，例如，通过与例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段)的酶发生蛋白水解裂解，从完整抗体产生这些片段。由本发明的单克隆抗体识别的这些抗原结合区和/或表位的鉴定提供了对产生具有与本申请的实施方式类似的相似的结合特性和治疗或诊断效用的额外的单克隆抗体必要的信息。
在特定实施方式中，根据本发明的所述抗体或抗原结合域、其片段或衍生物与包括或由选自由以下各项组成的组的氨基酸序列组成的肽或多肽具有免疫反应性：
i)在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中示出的氨基酸序列；
ii)由包括SEQ ID NO：3的核苷酸1至951中所示的核苷酸序列的DNA分子编码的氨基酸序列；
iii)在SEQ ID NO：11中示出的氨基酸序列；
iv)在i)至iii)中示出的序列中的任一个的子序列，所述子序列能够与SEQ IDNO：11中示出的RANK多肽结合；以及
v)与i)至iii)中示出的序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；例如与i)至iii)中示出的序列中的任一个具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。
在具体实施方式中，如上所述子序列中的氨基端氨基酸残基是SEQ ID NO.4中编号1至162的氨基酸残基中的任一个。
根据另外的实施方式，所述子序列中的羧基端氨基酸残基是SEQ ID NO 4中编号313至317的氨基酸残基中的任一个。
此外，所述子序列可以是由包括SEQ ID NO：3的核苷酸484至951中所示的核苷酸序列的DNA编码的氨基酸序列。
本发明提供了识别并结合到RANKL/OPGbp上的抑制和/或中和表位的抗RANKL/OPGbp抗体或抗原结合域。由于这种结合，抗RANKL抗体可以部分或完全抑制RANKL与其受体的结合，或者可以继而部分或完全增加精子形成。更具体地讲，本发明提供了识别并结合到包括RANKL/OPGbp的DE域的氨基酸序列的一部分的表位(“DE表位”)的抗RANKL抗体。RANKL的DE区大致跨越D和Eβ片区和间插环序列(“DE环”)。人RANKL的DE域包括从约氨基酸残基212至约氨基酸残基250(包括两端点)。人RANKL/OPGbp DE域显示于SEQ ID NO：5中。然而，人RANKL的DE域的氨基酸序列和端点仅仅是示例性的，并且应当理解，DE域可以具有不同于人RANKL的序列和端点的序列和端点。本发明涵盖与这样的可变的DE域结合的抗体。
尽管可以预期抗RANKL/OPGbp抗体或抗原结合域可以在DE域内的任何位置结合，但是优选的实施方式是与DE环的至少一部分结合的抗RANKL/OPGbp抗体。人RANKL的DE环大致跨越五个氨基酸，并且约位于残基230至234(包括两端点)。人RANKL/OPGbp的DE环具有DLATE序列。然而，人RANKL/OPGbp的DE环的氨基酸序列和端点仅仅是示例性的，并且应当理解，DE环可以具有不同于人的序列和端点的序列和端点。本发明涉及与这些可变的DE环结合的抗体。
尽管本发明的抗体的特征部分地在于与它们结合的RANKL/OPGbp上的氨基酸序列，但是本领域技术人员应当理解的是，抗体识别的RANKL/OPGbp上的DE表位通常包括可能涉及DE域外侧的氨基酸的三维结构。在RANKL/OPGbp序列的线性表示中，包括DE表位的氨基酸可以离DE域较远，但是在RANKL/OPGbp的三维结构中，DE表位的氨基酸将很可能接近DE域。因此，应当理解，抗RANKL/OPGbp抗体与DE表位的结合可以涉及除DE区的氨基酸之外的氨基酸。尽管如此，已经表明，在与RANKL/OPGbp结合的抗体以及RANKL/OPGbp活性的抑制中涉及到DE环中的氨基酸残基，尤其是DLATE序列中的残基中的一些或所有。
还提供了选择性结合剂的变体。在一种实施方式中，抗体和抗原结合域的变体包括天然存在的或通过使用重组DNA技术在体外改造天然序列所引入的轻链和/或重链氨基酸序列的改变。天然存在的变体包括在响应于外源抗原产生抗体期间在体内相应的生殖细胞系的核苷酸序列中产生的“体细胞”变体。
也通过本领域中已知的诱变技术制备抗RANKL/OPGbp抗体和抗原结合域的变体。在一个实例中，可以在整个抗体编码区中随机引入氨基酸变化，并且可以针对所需的活性，例如，对RANKL/OPGbp的结合亲和力，筛选所得的变体。可替代地，可以在抗RANKL/OPGbp抗体的选择的区域，例如，在轻链和/或重链CDR和构架区中，引入氨基酸变化，并且可以针对与RANKL的结合或一些其他的活性筛选所得的抗体。氨基酸变化包括CDR中一个或多个氨基酸取代，在给定CDR，例如，CDR3内从单个氨基酸差异变化到引入所有可行的氨基酸排列。在另一种方法中，通过用丙氨酸取代CDR内的至少一个残基(Lewis等人，Mol.Immunol.32.1065-1072(1995))可以评估CDR内的每个残基对RANKL/OPGbp结合的贡献。然后可以改变对与RANKL结合并非最佳的残基，以便确定更佳的序列。还包括通过插入氨基酸以增加CDR(例如，CDR3)的尺寸所产生的变体。例如，大部分轻链CDR3序列的长度为9个氨基酸。抗体中比9个氨基酸短的轻链CDR3序列可以通过插入合适的氨基酸以增加CDR的长度来针对与RANKL/OPGbp的结合进行优化。
在一种实施方式中，抗体或抗原结合域变体包括在重链或轻链CDR1、CDR2或CDR3中的一个或多个，以及任选地，重链或轻链构架区FR1、FR2或FR3中的一个或多个中的一种或多种氨基酸变化。氨基酸变化包括取代、缺失和/或插入氨基酸残基。上述“AT”重链和轻链可变区变体可以进一步包括构架区中的一种或多种氨基酸变化。在一个实例中，可以引入一种或多种氨基酸变化以在此位置用生殖细胞系残基取代体细胞突变的构架残基。当上述氨基酸变化是取代时，变化可以是保守或非保守取代。
在特定实施方式中，本发明的抗体或抗原结合域与选自由以下各项组成的组的氨基酸序列具有免疫反应性：
i)在SEQ ID NO：5中示出的氨基酸序列(人RANKL D-E域：GFYYLYANICFRHHETSGDLATEYLQLMVYVTKTSIKIP)；以及
ii)在i)中的氨基酸的子序列，所述子序列或变体包括在SEQ ID NO.：6中示出的序列(人DE表位DLATE)。
在另一种实施方式中，根据本发明的抗体或抗原结合域是人单克隆抗体或抗原结合域。所述抗体也可以是全长人单克隆IgG2。
一般来讲，IgG2同种型的抗体是优选的，因为此同种型的抗体具有很小的相关效应子功能(例如，抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性)。
在具体实施方式中，根据本发明的抗体具有包括选自由以下各项组成的组的氨基酸的重链：
i)在SEQ ID NO：7中示出的氨基酸序列(αRANKL-1的重链)；
ii)在SEQ ID NO：7中示出的氨基酸序列的子序列；以及
iii)与i)和ii)中示出的氨基酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；例如与i)和ii)中示出的序列中的任一个具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的氨基酸序列。
根据另一种实施方式，在SEQ ID NO：7中示出的氨基酸序列的子序列包括在SEQID NO：8中示出的序列(重链的可变区)。
在另外特定的实施方式中，根据本发明的抗体具有包括选自由以下各项组成的组的氨基酸序列的轻链：
i)在SEQ ID NO：9中示出的氨基酸序列(αRANKL-1的轻链)；
ii)在i)中示出的氨基酸序列的子序列；以及
iii)与i)和ii)中示出的氨基酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；例如与i)和ii)中示出的序列中的任一个具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的氨基酸序列。
上述在SEQ ID NO：9中示出的氨基酸序列的子序列包括在SEQ ID NO：10中示出的序列(轻链的可变区)。
在优选实施方式中，根据本发明的供使用的抗体是狄诺塞麦(denosumab)。在实施例4和图6和图7中，提供了示出狄诺塞麦对生殖细胞增殖的影响的数据。这些结果与针对OPG所示的结果一致。
因此，本发明的具体方面涉及用于刺激睾丸中的(生殖)细胞增殖和/或用于治疗和/或预防哺乳动物的雄性不育症和/或用于诱导或提高哺乳动物(例如，少精子症或无精子症)的雄性生育力的狄诺塞麦。
狄诺塞麦是具有144.7kDa的摩尔质量的抗RANKL的全人单克隆抗体的通用名(也称为异名AMG162)。狄诺塞麦以商品名Prolia、Xgeva和Ranmark XGEVA进行销售。狄诺塞麦可以通过以下标识符更进一步鉴定：狄诺塞麦的CAS登记号是615258-40-7，解剖学治疗化学(ATC)的分类系统代码M05BX04，ChEMBL化合物ID是CHEMBL1237023，特殊成分标识(UNII)是4EQZ6YO2HI，KEGG代码(基因和基因组的京都百科全书)是D03684。
根据本发明的化合物用于预防和/或治疗少精子症或预防和/或治疗无精子症。
此外，根据本发明的化合物可以通过静脉内或皮下给药。特别地，所述化合物可以通过皮下、睾丸内(intra-intesticularly)或在生殖区给药，每2至8周给药一次，优选地，每4周给药一次，剂量为20mg至120mg，优选地，60mg至120mg。根据本发明的化合物也可以在阴囊区给药。
特别地，雄性受试者可以是在取自睾丸的组织活检中在管周细胞中存在精子产生障碍和/或在管周细胞中OPG表达减少的受试者。
因此，在具体实施方式中，根据本发明的化合物可以给药于在任何阶段没有患睾丸癌的雄性受试者，所述睾丸癌通过所述受试者，例如，年龄为15至55岁的人类男性受试者的睾丸的组织样本的组织学分析可检测到。
本发明还涉及包含根据本发明的化合物的组合物，所述组合物用于治疗和/或预防哺乳动物的雄性不育症，和/或用于提高哺乳动物的雄性生育力。
本发明的组合物可以是药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种生理学可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。此外，所述组合物可以包含一种或多种稳定剂和/或一种或多种缓冲剂。
此外，本发明的组合物可以包含至少一种稳定剂，例如，表面活性剂，特别是选自聚山梨醇酯和聚氧丙烯-聚乙烯酯
Figure BDA0000923916850000181
的表面活性剂。所述表面活性剂也可以选自聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80。
所述表面活性剂存在的浓度可以是0.001％至1％，例如，0.002％至0.5％，例如0.004％，或0.01％。
此外，根据本发明的组合物可以包含山梨糖醇、乙酸盐(acetate)、氢氧化钠和注射用水。所述组合物的pH优选为5.2至6.5，例如，5.5至6.5，例如，4.5至5.5，例如，6.3，或例如，5.2。
最后，所述组合物可以另外包含选自钙和维生素D的一种或多种组分。
本发明还提供了治疗和/或预防哺乳动物的雄性不育症和/或用于提高哺乳动物的雄性生育力的方法，所述方法包括给药治疗有效量的根据本发明的化合物或组合物。
所述哺乳动物可以是在任何阶段没有患睾丸癌的男性(人类)受试者，所述睾丸癌通过所述受试者，例如，年龄为15至55岁的人类男性受试者的睾丸的组织样本的组织学分析可检测到。
在一种实施方式中，所述哺乳动物选自由人类、猪、猴子、牛、绵羊、小鼠和马组成的组。
根据本发明的方法包括将本发明的化合物或组合物通过静脉内或皮下给药。特别地，本发明的化合物或组合物可以通过皮下、睾丸内或在生殖区给药，每2至12周给药一次，优选地，每4周给药一次，剂量为20mg至120mg，优选地，60mg至120mg。根据本发明的化合物或组合物也可以在阴囊区给药。
应该注意的是，在本发明的方面或实施方式之一的上下文中描述的实施方式和特征也可以应用于本发明的其他方面或实施方式。
在本申请中引用的所有专利和非专利参考文献通过引用的方式全部并入本申请中。
现在将在以下非限制性实施例中更加详细地描述本发明。
实施例
实施例1
此实施例说明抗RANKL的单克隆抗体的制备。
例如，纯化的重组RANKL，或表达高水平RANKL的固定的细胞(transfixed cell)的制备用于使用常规技术，例如，美国专利4,411,993中公开的技术，产生抗RANKL的单克隆抗体。编码RANKL的DNA也可以用作免疫原，例如，如Pardoll和Beckerleg在《免疫力》(Immunity)(3：165,1995)中所综述的。这些抗体很可能用于干扰RANKL信号传导(拮抗性或封闭性抗体)。
为了对啮齿类动物免疫，RANKL免疫原在佐剂(例如完全或不完全弗氏佐剂、明矾，或另一种佐剂，如RIBI佐剂R700(Ribi,Hamilton,MT)中乳化，并以10至100头(pig)的量皮下注入选择的啮齿动物，例如，BALB/c小鼠或Lewis大鼠体内。DNA可以通过皮下(Raz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9519,1994)或肌内(Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：4156,1993)给药，发现生理盐水是DNA基抗原的合适的稀释剂。在10天至3周之后，用附加的免疫原加强免疫的动物，并且此后每周、每两周或每三周免疫计划周期性地加强免疫的动物。
通过斑点印迹试验(抗体夹心法)、ELISA(酶联免疫吸附试验)、免疫沉淀或其他合适的试验，包括FACS分析，通过眼眶出血或用于测试的尾尖切除定期采集血清样本。
检测合适的抗体滴度之后，阳性的动物通过静脉注射给予生理盐水中的抗原。3至4天后，处死动物，收获脾细胞，并且与鼠源骨髓瘤细胞系(例如，NS 1，或优选地，Ag 8.653[ATCC CRL 1580])融合。将此过程中产生的杂交瘤细胞系在选择性培养基(例如，包含含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷或HAT的培养基)中铺板于多个微量滴定板上以抑制未融合细胞、骨髓瘤-骨髓瘤杂交体、和脾细胞-脾细胞杂交体的增殖。
例如，可以通过Engvall等人(Immunochem.8：871(1971))和美国专利4,703,004公开的技术的改编，针对与RANKL的反应性通过ELISA筛选由此产生的杂交瘤。优选的筛选技术是Beckman等人(J.Immunol.144：4212(1990))描述的抗体捕获技术。然后将阳性克隆注入同基因的啮齿动物的腹膜腔中以产生包含高浓度(>1mg/ml)抗RANK单克隆抗体的腹水。通过硫酸铵沉淀来纯化所得的单克隆抗体，随后进行凝胶排阻色谱法。可替代地，也可以使用基于抗体与蛋白A或蛋白G的结合的亲和力色谱法，如同可以使用基于与RANKL蛋白的结合的亲和力色谱法。使用本文描述的方法以监测mAbs的活性，分离封闭抗体(即，与RANKL结合并且抑制与RANK结合的抗体)和未封闭抗体(即，与RANKL结合并且不抑制结合的抗体)。
实施例2
引言
RANKL信号传导对骨的体内稳态、免疫系统和泌乳很重要。RANKL是具有特异性结合到RANK(位于邻近的细胞的膜中的受体)的胞外配体域的跨膜蛋白。RANK的结合和活化诱导通常通过NFKB活化的胞内信号传导，这影响细胞周期。由于OPG与RANKL的胞外域结合并且阻止RANK活化，因此通过由附近的细胞分泌OPG来调节RANKL与RANK之间的相互作用。所以，RANKL的生物效应取决于RANKL、RANK和OPG的存在和丰度。使事情更加复杂的是，RANKL存在3种不同的同种型1、2和3。一种跨膜形式，一种细胞质形式，另一种为分泌形式。不同的同种型并非总是诱导相同的效果，并且细胞质的非分泌形式通常是RANKL表达的抑制剂。这意味着根据模型中具体同种型的表达，RANKL的抑制潜在得到相反的效果。
RANK的下游信号传导受到TRAF1-6的存在和活性的影响。根据存在哪种辅因子，RANK将发送不同的信号，并且因此对同一外部刺激介导不同的响应。除TRAF之外，RANK还受到REL a和b以及存在关键的下游信号传导机制NFKB的影响。
我们此前已经解释了维生素D受体(VDR)，并且在雄性射精管、生殖细胞和成熟精子中表达所有维生素D新陈代谢酶。RANKL是经典的维生素D调节基因，因为它在启动子中包含维生素D应答元件，并且维生素D诱导RANKL基因的转录。RANKL此前从未与睾丸功能和雄性生育力关联上，并且从未表明在性腺中表达。消除小鼠中的RANKL、RANK或OPG不会明显引起雄性不育症，但是到目前为止尚未对精液质量进行生育力研究或作出任何报道。
狄诺塞麦是人RANKL信号传导的人造特异性抑制剂，因为它不抑制鼠RANKL或TRAIL信号传导。在猴子中，比常规剂量高10倍的狄诺塞麦没有引起任何主要的睾丸组织学异常或精子活动力低下，但是没有进行生育力测试。在我们研究VDR期间，我们发现RANKL在RNA水平表达，并且这里，我们研究了RANKL、RANK和OPG是否在小鼠和男性的性腺中表达。
材料和方法
人组织样本
在得到当地伦理委员会的批准后，根据赫尔辛基宣言，在丹麦哥本哈根大学医院(Rigshospitalet)从男科门诊招募患者。从因TGCT而执行睾丸切除术的样品获得成年人的睾丸样本。肿瘤周围的组织包括具有CIS细胞或正常/受损的精子形成的小管。每个样本切成碎片，这些碎片速冻并且在-80℃存储用于RNA提取，亦或在4℃的福尔马林或多聚甲醛中固定过夜并随后包埋在石蜡中。有经验的病理学家评价所有样本，并且使用免疫组织化学(IHC)标记物用于TGCT以确保肿瘤的病理亚型。
小鼠组织样本
产生Leuven Vdr-/-小鼠和对照并且用标准啮齿动物饲料(1.0％钙，0.7％磷，Sniff R/M-H)饲养。根据国家实验室动物护理和使用健康指导协会处理所有动物，并且所有实验得到鲁汶的“动物实验伦理委员会”的批准。分别杀死在10或15周龄的代表组的小鼠。小鼠在麻醉状态下抽血，并且收集血清用于激素测量。每个睾丸切成碎片，这些碎片速冻并且在-80℃存储用于RNA或蛋白提取，亦或在4℃的多聚甲醛(PFA)或波恩氏溶液(Bouin's solution)中固定过夜并包埋在石蜡中。
进行组织制备，定量RT–PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹RNA和cDNA制备，并且随后进行qRT-PCR。使用靶向每个mRNA的特异性引物进行qRT-PCR。对来自每种引物组合的代表带进行测序以供验证(Eurofins MWG GmbH,Germany)。通过与RPS20或B2m(β2-微球蛋白)进行比较来确定基因表达的变化。
免疫组织化学(IHC)
所有组织针对RANKL、OPG和RANK进行免疫组织化学染色。简而言之，根据标准间接过氧化物酶方法来进行免疫组织化学染色并用Meyer苏木精进行复染色。在没有第一抗体的情况下，用阴性对照染色进行所有实验。连续切片用于检查RANKL、RANK和OPG的伴随表达。通过在TEG缓冲液(Tris 6.06g和EGTA 0.95g的5L溶液，pH 9.0)中对切片施加微波15分钟来完成抗原修复。切片用2％的过氧化氢清洗以阻断内源性过氧化物酶。此后，所有切片用在Tris缓冲盐溶液(TBS)中的2％的非免疫山羊血清或小鼠血清(Zymed Histostainkit,San Francisco,CA,USA)温育以使交叉反应性最小化。从Santa Cruz BiotechnologyInc.(Santa Cruz,CA)采购第一抗体。通过免疫印迹检测所有抗体，并且在使用不同的抗体稀释液(1：50至1：500)、不同的缓冲液(TEG、柠檬酸盐(citrate)、尿素)以及使用不同的固定液(福尔马林、乙醇和无)进行初始实验。在4℃温育16小时之后，在过氧化物酶缀合的链霉亲和素复合物(Zymed Histostain kit)被用作第三层之前，用生物素化山羊抗兔IgG(Zymed Histostain kit)或生物素化驴抗山羊IgG(1：400)温育切片。用氨基乙酯咔唑(amino ethyl carbasole)(Zymed Histostain kit)进行可视化。在温育步骤之间用TBS清洗载玻片(slide)。
结果：
人类
在RNA水平，我们发现RANKL、RANK和OPG在包括具有完整精子形成的正常小管的睾丸中的标记表达(图1)。RANKL的所有同种型都在睾丸中表达。仅一种同种型只在塞尔托利氏细胞中表达，这不同于在卵巢中表达的同种型。在蛋白水平，我们发现RANKL在成熟的塞尔托利氏细胞和男性生殖细胞中表达(图3)。这种表达是细胞质的且跨膜的。
染色的强度从非常低变化到正常，但是在绝大部分塞尔托利氏细胞和许多生殖细胞中可检测到RANKL表达。仅在小管的塞尔托利氏细胞中存在RANKL表明一种同种型对塞尔托利氏细胞具有特异性，而其他形式也可以存在于生殖细胞中。
RANK在生殖细胞中唯一地表达，并且在精原细胞和精母细胞中显著表达。再者，这种表达是混合细胞质的和膜质的。OPG主要在管周细胞中表达，并且这种表达主要是细胞质的。有趣的是，OPG的表达在包含CIS的组织中降低，这可能将CIS细胞暴露于具有更高的RANKL暴露中。
小鼠
在RNA水平，我们发现RANKL、RANK和OPG在来自10和15周年龄的动物的睾丸中标记表达(图2)。RANKL的所有同种型都在睾丸中表达。在蛋白水平，我们发现RANKL在来自两种不同的小鼠品系的成熟的塞尔托利氏细胞中表达。这种表达是混合细胞质的且跨膜的。染色的强度从非常低变化到正常，但是在绝大部分塞尔托利氏细胞中可检测到RANKL表达。RANKL似乎在Vdr KO小鼠中下调，表明在睾丸中的RANKL也由维生素D调节。这表明存在的主要的RANKL同种型是同种型1，因为骨中的维生素D不调节RANKL同种型3，并且RANKL在切除Vdr后下降10倍相当可观。
特异性受体蛋白RANK在生殖细胞中唯一地表达，并且在精原细胞和精母细胞中显著表达。再者，这种表达是混合细胞质的和膜质的。OPG主要在管周细胞中表达，并且这种表达主要是细胞质的。在RAN水平，TRAf1-6和NFKβ也在小鼠的性腺中表达，表明这些细胞能够介导RANK下游信号传导。
讨论
在这里我们示出了RANKL、RANK和OPG在睾丸中表达。似乎存在RANKL的同种型唯一地在塞尔托利氏细胞中表达，而RANK在生殖细胞中表达，并且OPG在管周细胞中表达。这种表达模式从小鼠到人类保守，这表明精子形成中可能涉及RANKL信号传导。已知来自管周细胞和塞尔托利氏细胞的信号传导决定生殖细胞命运，并且据我们所知，这是涉及管周细胞、塞尔托利氏细胞和生殖细胞的第一信号传导。
RANKL系统对骨的体内稳态很重要。涉及的因素包括结合并活化破骨细胞中的特异性受体RANK的成骨细胞中的跨膜RANKL蛋白，该蛋白诱导不成熟的成骨细胞的分化并且导致骨再吸收。OPG是结合RANKL配体域并且因此抑制RANK活化以及后续破骨细胞分化和活化(损害骨吸收)的内源性分泌信号传导分子。美国制药公司Amgen开发了具有长半衰期的合成OPG类似物(狄诺塞麦)，并且EMEA和FDA批准了用于治疗骨质疏松的药物。狄诺塞麦现在在临床上使用并且具有非常小的副作用，因为RANKL被认为仅在除骨之外的免疫细胞、牙齿和乳房中表达。FDA或EMEA并不要求在可以临床使用药物之前进行雄性生育力研究，因为骨质疏松患者通常是女性并且是老年人。
我们有新数据表明RANKL的一种同种型在雄性性腺中表达，但是不在雌性的相对物中表达。这种RANKL同种型似乎在塞尔托利氏细胞中表达，而特异性受体RANK在精原细胞中表达，并且OPG在管周细胞中表达。在小鼠和男性中均发现了这些蛋白的表达，并且RANKL和RANK也在发育不全的小管的塞尔托利氏细胞和生殖细胞以及癌前期睾丸细胞(CIS)中表达，而CIS小管具有低的OPG表达。在啮齿动物和男性的睾丸中也表达RANK信号传的所有下游介导物导(TRAF1-6和NFKβ)，并且已知NFKβ对雄性性腺中的增殖-细胞凋亡开关很重要。因此Rankl信号传导可以是生殖细胞增殖的重要调节因子。抑制正常睾丸中的RANKL可以主要是塞尔托利氏特异性形式，因为它可到达血睾屏障的邻近位点，而循环中的狄诺塞麦可能不可到达在精子形成的后期阶段中表达的假定的细胞质形式。由于Amgen提示与OPG不同的狄诺塞麦不阻碍对雄性生殖细胞凋亡很重要的TRAIL，而是仅阻碍RANKL，因此使用OPG处理无法从实验中直接适用狄诺塞麦的效果。
在小鼠中，RANKL、RANK和OPG的表达保守，并且从Vdr KO小鼠得到的经验表明维生素D调节睾丸的RANKL。RANKL基因具有两个VDRE，并且Vdr KO小鼠中的显著下调支持以下实事：RANKL的下调不太可能引起精子形成的大量减少，因为这些小鼠具有正常的睾丸史，尽管它们具有中度受损的生育力，这可能是由于RANKL或更有可能是其他原因(参见BlombergJensen M等人，在Leuven Vdr缺陷型小鼠模型中睾丸、附睾和内分泌表型的表征：靶向雌性激素信号传导(Characterization of the testicular,epididymal and endocrinephenotypes in the Leuven Vdr-deficient mouse model：targeting estrogensignalling),Mol Cell Endocrinol.2013 Jul 11；377(1-2)：93-102)。此外，在骨中，RANKL同种型1由维生素D调节，而同种型3并非如此，并且这表明，Vdr突变体的大量下调表明RANKL同种型1是存在的主要同种型。
总而言之，此前从未表明性腺中存在RANKL、RANK和OPG，并且它们的表达表明在调节生殖细胞的增殖中可能涉及通过NFKβ的RANKL信号传导。这意味着RANKL系统的调节可能在临床上相关，因为它可以降低或增加精子的产生。
实施例3
引言
RANKL信号传导对骨的体内稳态、免疫系统和泌乳很重要。RANKL是具有特异性结合到RANK(位于邻近的细胞的膜中的受体)的胞外配体域的跨膜蛋白。RANK的结合和活化诱导通常通过NFKB活化的胞内信号传导，这影响细胞周期。由于OPG与RANKL的胞外域结合并且阻止RANK活化，因此通过由附近的细胞分泌的OPG来调节RANKL与RANK之间的相互作用。因此，RANKL的生物效应取决于RANKL、RANK和OPG的存在和丰度。使事情更加复杂的是，RANKL存在3种不同的同种型1、2和3。一种跨膜形式，一种细胞质形式，另一种为分泌形式。不同的同种型并非总是诱导相同的效果，并且细胞质的非分泌形式通常是RANKL表达的抑制剂。这意味着根据模型中具体同种型的表达，RANKL的抑制潜在地得到相反的效果。两种细胞系TCAM2和NTERA2表达RANKL的两种不同的同种型，并且调节在这些生殖细胞得到的细胞中的这种信号传导可以表明RANKL在睾丸中的效果。
狄诺塞麦是人RANKL信号传导的人造特异性抑制剂，因为它不抑制鼠RANKL或TRAIL信号传导。在猴子中，比常规使用的计量高10倍的狄诺塞麦没有引起任何主要组织学睾丸异常或精子活动力低下，但是没有进行生育力测试。
材料和方法
人细胞系
在此研究中使用保留较少生殖细胞特性的EC衍生的细胞系NTera2以及保留生殖细胞特性的精原细胞瘤衍生的TCam-2细胞系。细胞在补加谷氨酰胺(58.5mg/ml)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100mg/ml)(均为Gibco)的DMEM(NTera2)或RPMI 1640(TCam-2)中在37℃的5％CO2气氛的标准条件下生长。为了研究对增殖的影响，单独地或与培养基结合添加RANKL(100ng/ml)、CSF-1(100ng/ml)、Denosumab(100ng/ml)。DMSO用作溶剂，并且所有对照样本是处理的DMSO。将细胞铺板在25-cm2的烧瓶中，并且在37℃下使用0.05％的胰蛋白酶-EDTA分离5分钟。一部分离心沉淀并且细胞沉淀速冻用于RNA纯化以及RT-PCR的cDNA合成。通过使用靶向每个mRNA的特异性引物进行qRT-PCR。对来自每种引物组合的代表带进行测序以供验证(Eurofins MWG GmbH,Germany)。
存活率测定
存活率测定通过测量氧化形式的刃天青的减少以及荧光中间体的同时增加来确定活细胞的新陈代谢活性。在Bürker-Türk计数室(Tiefe 0.100mm、0.0025mm2)中手动计数细胞，并且5×103个细胞/孔接种到96孔板的孔中，并且在处理之前温育过夜。对于共同处理实验，1×103个细胞/孔铺板于96孔板中，在用100ng/ml的选择的化合物进行初始处理20小时之前过夜温育。所有平板上包括阴性对照(仅培养基)和阳性对照(普通培养基中1×103个细胞)。根据制造商的说明，在体外毒性测定(Sigma Aldrich)中使用TOX-8确定细胞的存活率。在处理结束时，向培养基中添加来自测定的刃天青染料，随后温育4至6小时。然后在ELISA微量板读数器(Tecan,Sunrise)上测量滴定板。为了计算存活率百分比，原始吸收值是从参考波长和空白样本(仅培养基)中减去的值。对所得的值取平均值(每次处理n＝8)以产生最终的吸收值。未处理过的细胞被认为是100％存活率，并且用于计算处理过的细胞的存活率百分比。在独立实验中，每个实验重复至少三次。
结果：
NTera2细胞表达与TCAM2细胞不同的RANKL的一种同种型。TCAM2细胞中表达的同种型类似于仅在塞尔托利氏细胞(SCO)中的塞尔托利氏细胞特异性同种型，这不同于在卵巢中表达的同种型。这种同种型可以在正常睾丸的塞尔托利氏细胞中表达，然而，不能排除正常且仅SCO的塞尔托利氏细胞具有不同的RANKL同种型。在两种细胞系中均表达RANK和下游的信号传导机制，这意味着它们都响应于RANKL处理(图1)。OPG在NTera2细胞中唯一地表达，这意味着它们对RANKL具有天生的抑制剂并且可以适应增加的暴露并且更为不敏感，而TCAM2不表达OPG。
在NTERA2细胞(图4)中，我们发现异常的响应，因为狄诺塞麦和RANKL两者处理在4小时和20小时之后诱导细胞增殖。狄诺塞麦具有最强的效果，但是不太清楚为什么两种化合物诱导增殖。一种可能性是狄诺塞麦阻碍NTera2细胞上的RANKL的特异性跨膜同种型，这由此诱导增殖。尽管外源性RANKL刺激作为细胞质同种型的RANK并且从而占据受体，但是这阻碍了内源性跨膜RANKL激活相邻细胞上的RANK。外源性RANKL的响应可以因此模仿分泌的同种型的效果，因此其是拮抗性的并且诱导增殖。OPG的产生还可以影响数据，并且它可以抑制内源性RANKL，当增加外源性RANKL时，可以降低这种抑制。
在TCAM2细胞中(图5)，表达了另一种同种型，并且正如所预期的，这里RANKL处理降低增殖，而狄诺塞麦再次刺激增殖，尽管在4小时之后仅中度刺激。所有包含RANKL的处理在20小时之后显著降低增殖，而狄诺塞麦在20小时之后表现出朝着更多增殖的微不足道的倾向，但是它在4小时之后很显著。这种差异的另一个原因在于，TCAM2细胞不表达OPG，并且因此无法消除外源性RANKL处理的影响，这可以影响它们的对处理的高敏感性。
讨论
这些数据清晰地表明RANKL途径的调节影响来源于生殖细胞肿瘤的癌细胞的细胞存活率。RANKL和狄诺塞麦处理两者均诱导细胞存活率的明显变化。观察到的响应中的一些差异可能是由于两种细胞中不同的RANKL同种型。尽管OPG的存在也不同，但是这明显影响结果。生殖细胞增殖的变化诱导极快并且支持以下事实：RANKL和狄诺塞麦两者均可以诱导对生殖细胞存活率的强效且迅速的影响。
从CIS和正常生殖细胞的悬滴培养得到的结果清晰地证明塞尔托利氏细胞和生殖细胞之间的RANKL信号传导对生殖细胞存活和增殖很重要。RANKL通过诱导细胞凋亡来减少增殖，而狄诺塞麦具有相反的作用。这些结果可以部分地外推到正常的睾丸，但是精原细胞并不像大多数CIS细胞一样具有强的RANKL表达，这可能影响正常生殖细胞中的结果。然而，结果清晰地表明，对正常的体细胞环境中的生殖细胞的狄诺塞麦和RANKL处理调节生殖细胞增殖。
总而言之，通过使用具有不同的RANKL同种型、存在或不存在内源性OPG、不同的细胞系的两种不同模型，我们已经显示了狄诺塞麦调节生殖细胞增殖。
实施例4
用狄诺塞麦和RANKL对人睾丸进行离体处理
引言
RANKL信号传导对骨的体内稳态、免疫系统和泌乳很重要。RANKL是具有特异性结合到RANK(位于邻近的细胞的膜中的受体)的胞外配体域的跨膜蛋白。RANK的结合和活化诱导通常通过NFKB活化的胞内信号传导，这影响细胞周期。由于OPG与RANKL的胞外域结合并且阻止RANK活化，因此通过由附近的细胞分泌的OPG来调节RANKL与RANK之间的相互作用。所以，RANKL的生物效应取决于RANKL、RANK和OPG的存在和丰度。使事情更加复杂的是，RANKL存在3种不同的同种型1、2和3。一种跨膜形式，一种细胞质形式，另一种为分泌形式。不同的同种型并非总是诱导相同的效果，并且细胞质的非分泌形式通常是RANKL表达的抑制剂。这意味着根据模型中具体同种型的表达，RANKL的抑制潜在地得到相反的效果。我们已经发现RANK在生殖细胞中唯一地表达，因此生殖细胞是能够直接响应于RANKL和狄诺塞麦处理的唯一细胞。RANKL在塞尔托利氏细胞和生殖细胞两者中表达，而OPG在管周细胞中表达。我们最近建立了这样的器官培养模型：其中在最佳培养基的“悬滴”中培养小组织片段。这种培养方法适用于人的睾丸组织、包含CIS的组织以及从患有睾丸癌的患者的睾丸切除术样本获得的睾丸癌肿瘤。我们已经成功地培养了正常的睾丸、患有CIS的组织和TGCT高达2周，而没有观察到任何消极变化。这种器官培养模型允许以动态且功能方式对RANKL信号传导途径的机制进行研究，并且由于模型保持组织的完整性，所以它的优点是生殖细胞维持在它们的体细胞微环境(somatic niche)(塞尔托利氏细胞和管周细胞)中，从而允许在处理实验期间与体细胞进行连续的相互作用。狄诺塞麦是人RANKL信号传导的人造特异性抑制剂，因为它不抑制鼠RANKL或TRAIL信号传导，如同内源性产生的OPG。在猴子中，比常规使用的剂量高10倍的狄诺塞麦没有引起任何主要的睾丸组织学异常或精子活动力低下，但是没有进行生育力测试。
材料和方法
人组织样本收集和制备
在得到本地伦理委员会的批准后(许可号H-1-2012-007)，并根据赫尔辛基宣言，从哥本哈根大学医院的生长和生殖部的男科门诊(丹麦)招募患者。在用于治疗睾丸癌的睾丸切除术之前，所有参与者给予知情同意。睾丸切除术样本在手术摘除之后立即送往病理科，并且分成肿瘤和宏观正常区。大部分组织分配用于诊断分析，剩余的部分用于研究。分配用于研究的样本部分立即置于培养基(见下文)中并且送往实验室。在外科手术摘除的2小时内，将样本切成～1mm3的块(生精小管的平均直径为150μm)，并且置于具有10％胎牛血清(FBS)或0.1％牛血清白蛋白(BSA)的、包含DMEM F12、青霉素(100U/ml-1)、链霉素(100mg/ml-1)、胰岛素、铁转蛋白和硒(×1)的培养基的悬滴培养物中。在培养条件最优化的初始阶段，检测几种不同的基本培养基，包括DMEN、RPMI-1640和MEMα，但是没有观察到存活率或组织形态的明显差异(数据未显示)。所有细胞培养基和补加物来自Gibco(Naerum,Denmark)，除BSA(Sigma-Aldrich,Broendby,Denmark)之外。为了设置培养物，在培养皿(NUNC细胞培养培养皿)的盖上制备30μl滴剂的培养基。将单独的组织块置于每滴中，然后小心地颠倒培养皿以保持滴液完好无损，且组织悬浮。将DPBS(10ml)添加到培养皿的底部以防止脱水。在34℃下在5％的CO2中培养组织高达14天，每48小时更换一次培养基。实验设置包括对于以下各项中的每项，至少三次重复从相同原始组织块切下的组织块：固定、RNA纯化和存活率测定。当完成培养时间时，样本收集到4％的多聚甲醛(PFA)固定液(室温下30分钟，4℃过夜)中，随后用石蜡包埋用于组织学分析和免疫组织化学，置于RNAlater(Ambion,Austin,TX,USA)中用于RNA纯化和实时PCR分析或存活率测定中的设置。
存活率测定
为了评价组织块是否包含活细胞，根据制造商的说明，存活率测定用于通过在体外毒性测定(Sigma Aldrich)中使用TOX-8来确定总的代谢活性。简而言之，组织块转移到具有90μl培养基和10μl刃天青染料(Sigma-Aldrich)的96孔培养皿中，并与所有培养板上包括的阴性实验对照(培养基+刃天青染料，无组织)一起在34℃下温育5小时。然后根据制造商的说明(Sigma-Aldrich)，在ELISA微量板读数器(Tecan Sunrise,
Figure BDA0000923916850000291
Switzerland)上测量氧化形式的刃天青(蓝色)的减少以及荧光中间体(红色)的伴随增多。
免疫组织化学
简而言之，石蜡切片脱石蜡和再水化。通过在修复缓冲液中对切片施加15分钟的微波来完成抗原修复。然后，使用2％的非免疫山羊血清(Zymed Histostain kit,SanFrancisco,CA,USA)或在Tris缓冲盐溶液(TBS)中稀释的0.5％奶粉温育切片以使交叉反应性最小化。第一抗体、稀释液和修复缓冲液在4℃温育16小时并且在室温下温育1小时之后，在过氧化物酶缀合的链霉亲和素复合物(Zymed Histostain kit)被用作第三层(tertiarylayer)之前，用生物素标记的山羊抗兔IgG(Zymed Histostain kit)或生物素标记的山羊抗鼠IgG(1：400)温育切片。用氨基乙酯咔唑(amino ethyl carbasole)(AEC)(ZymedHistostain kit)进行可视化，从而得到深红色。在温育步骤之间用TBS清洗载玻片(slide)。对于阴性对照，处理连续切片，第一抗体替换成单独的稀释缓冲液。对照载玻片均没有表现出任何染色。用Mayer苏木精进行对比染色。连续切片用于检测PLAP(在CIS和精原细胞瘤细胞中检测到的信号)、KI-67、BrdU结合、激活型半胱天冬酶、KIT和AP2γ的表达。两个独立的研究者评估所有的染色。在Nikon Microphot-FXA显微镜(日本东京)上手动研究所有切片，然后在NanoZoomer 2.0HT(Hamamatsu Photonics,Herrsching am Ammersee,Germany)上进行扫描，并且使用软件NDPview(版本1.2.36)(Hamamatsu Photonics)进行分析。为了以更加定量的方式评价免疫组织化学(IHC)染色，通过细胞计数来确定KI-67-、BrdU-、KIT和AP2γ染色的细胞的百分比。增殖标记物KI-67和BrdU仅在正常生殖细胞和恶性生殖细胞中表达，仅观察到非常少的弱KI-67染色的塞尔托利氏细胞。在具有完整的精子形成的正常睾丸样本中，我们仅计数精原细胞和精母细胞；在包含CIS的样本中，我们还确定染色的CIS细胞的百分比。对于所有定量(KI-67、BrdU、KIT和AP2γ)，由两个不同的研究者评价来自每个患者的每次处理的三个组织片段中的每一个的最小3.5mm2的组织。包括来自至少三个不同患者的组织块用于载体、RANKL和狄诺塞麦处理。计数阳性细胞和阴性细胞两者以计算染色的细胞的百分比。
增殖测定
BrdU结合测定用于确定刚好在培养期结束之前是否存在增殖的生殖细胞。BrdU标记试剂(Invitrogen,Camarillo,CA,USA)用培养基以1：100稀释，并且建立组织块作为包含BrdU的培养基中的悬滴培养物，3小时。然后组织块用PBS清洗组织块两次，每次5分钟，随后按照如上所述方式固定并且用石蜡包埋。按照免疫组织化学部分中描述的方式使用BrdU抗体，通过免疫组织化学法对BrdU进行可视化，并且阳性染色的细胞被认为是增殖。
结果
具有包含完整精子形成的区域的组织(称为正常睾丸组织(NT))以及具有包含CIS细胞的小管的睾丸组织的整体形态在悬滴组织培养物中维持多达14天。用苏木精-伊红(HE)对NT组织染色，证明存在所有的生殖细胞类型，并且用CIS标记物PLAP染色确认是否存在CIS细胞。在培养7-10天之后，在来自一些患者的组织中观察到损失更加分化的生殖细胞，特别是减数分裂后的精子细胞，但是这不是一致的发现。在包含具有CIS细胞的小管的组织中，用HE和PLAP染色证明，小管主要包含CIS细胞(针对PLAP为阳性)和塞尔托利氏细胞，并且在多达14天的培养期间保留组织的形态。
在本研究中应用细胞增殖的两种测量：用KI-67染色的IHC和BrdU结合测定。为了直接比较增殖测量，对组织块的连续切片进行KI-67和BrdU染色。一般而言，与BrdU相比，通过KI-67的检测发现明显(P<0.05)更多数量的标记的细胞。这些数据还表明BrdU结合，随后是抗体检测，是比KI-67染色更具有特异性的细胞增殖的标记物。这正是所预料的，因为BruD仅在培养期的最后3小时的细胞周期的S期过程中结合到DNA中作为胸腺嘧啶核苷类似物。相比之下，KI-67在除G0/G1期停滞之外的细胞周期的所有期中表达，并且后续结果仅表现为BrdU结合。
处理悬滴培养物中的人睾丸样本的结果表明生殖细胞增殖的显著变化。总而言之，我们使用来自4位男性的睾丸，但是仅3位男性的睾丸组织存在于样本中。用于每次处理的每个样本的尺寸的平均值为5,92mm2。每次处理持续48小时，并且我们使用来自所有睾丸的两个对照样本以避免系列切片中的不同组织偏差。使用这种方法，我们确保生殖细胞保持在它们的正常管周微环境中与塞尔托利氏细胞接触。这意味着细胞暴露于RANKL的塞尔托利氏特异性形式。两个样本包含正常组织和癌变前CIS细胞，而一个样本不包含正常的精子形成，但是仅发现的生殖细胞是CIS细胞。用狄诺塞麦和OPG处理显著增加了生殖细胞的增殖，而已知影响骨CSF-1和PTHrP中的RANKL信号传导的RANKL和其他药物没有类似效果，并且根据BrdU结合的评估(图6)，其处理不能诱导生殖细胞增殖中的显著变化。狄诺塞麦在患者中的两位中诱导增殖生殖细胞的比率增加超过70％，而狄诺塞麦在患有在组织结构上非常严重的睾丸表型的最后一位患者中诱导增加11倍。狄诺塞麦的阳性效果与OPG-FC的效果相当，狄诺塞麦除了抑制RANKL之外，还阻碍TRAIL。
CIS细胞类似于胎儿生殖细胞，并且不同于精原细胞，因为一些CIS细胞表达RANKL本身。然而，它们位于与精原细胞一样恰当的微环境中，并且以类似于正常生殖细胞的方式响应，因为RANKL通过诱导半胱天冬酶依赖性细胞凋亡来降低增殖，而狄诺塞麦通过抑制半胱天冬酶依赖性细胞凋亡来增加增殖(图7)。效果迅速且显著，并且外源性RANKL处理的相反效果是体内处理的可增殖效果的强烈指标，因为细胞暴露于它们的自然环境中。
讨论
不受理论的约束，这些数据清晰地表明RANKL途径的调节影响生殖细胞存活率和增殖。RANKL和狄诺塞麦处理两者诱导细胞存活率的明显变化。观察到的响应中的一些差异可能是由于睾丸中存在不同的RANKL同种型。生殖细胞增殖的变化如预期的那样极快地诱导，并且支持以下事实：RANKL和狄诺塞麦两者可以诱导对生殖细胞存活的强烈且迅速的作用。
从CIS和正常生殖细胞的悬滴培养得到的结果清晰地证明塞尔托利氏细胞和生殖细胞之间的RANKL信号传导对生殖细胞存活和增殖很重要。结果清晰地表明，正常的体细胞环境中的生殖细胞的狄诺塞麦和RANKL处理调节生殖细胞增殖，而已知影响骨CSF-1和PTHrP中的RANKL信号传导的其他药物没有类似效果(图6)。
总而言之，通过使用位于它们的正常体细胞环境(environmental niece)中的生殖细胞，我们已经解释了狄诺塞麦和OPG诱导生殖细胞增殖。
实施例5
通过在14天的时间段内使人OPG-FC、RANKL以及媒介物与小鼠融合的睾丸RANKL抑制的体内抑制效果
小鼠是用于医疗的药效动力学和药代动力学研究的公认模型。遗憾的是，我们无法检测狄诺塞麦的效果，因为狄诺塞麦无法阻碍小鼠RANKL。相反，我们使用人OPG，其有效地阻碍小鼠RANKL的效果，并且可以以与如此前在实施例4中所示的狄诺塞麦相似的方式发挥作用。
材料和方法
动物
C57BL/6J小鼠，15只，雄性，7-8周龄，得自Taconic Europe A/S。小鼠关在欧洲标准笼II型寝具Jeluxyl HW 300/500(Jelu,J.Ehrler GmbH&Co KG,Ludwigsmühle,D-73494Rosenberg,Germany)中。寝具在层流单元中每周更换一次。空气每小时稳定地更换大约12次。温度为20℃至24℃，并且通过环境通风系统进行控制。光循环为12小时暗，12小时亮(06.00开灯)。Diet Altromin 1324由Altromin(Im Seelenkamp 20,32791Lage,Germany)生产。水经过紫外线消毒，并且在适应环境和实验期间必要时再装满水瓶。
自由饮食。
使用以下是测试制品：
组号 测试制品1(ID) 接收的量 储存 特殊
1 OPG-FC(cyt-177-c) 2mg -20℃ 粉末(化合物)
2 RANKL(cyt-692-b) 200μl(20μg/40μl) -20℃ 液体
3 媒介物(PBS) - 室温 液体
使用以下剂量的溶剂：
组号 测试制品1(ID) 浓度 剂量体积 剂量 途径
1 OPG-FC(cyt-177-c) 0.2mg/ml 5ml/kg 1mg/kg 腹腔给药
2 RANKL(cyt-692-b) 8μg/ml 5ml/kg 40μg/kg 腹腔给药
3 媒介物 - 0.1ml/小鼠 - 腹腔给药
实验设计
十五(15)只小鼠(1至3组)随机分成3组，每组5只。按照下表所示的方式对小鼠进行处理。监测小鼠反常的临床症状。在每轮给药之前确定体重。在14天给药之后终止小鼠。在终止时，小鼠通过颈脱位法实施安乐死。从每只动物采集三百(300)μl血液，并且制备100-150μl血清。自由切开肾和睾丸并称重。按照以下方式保存样本：肾样本：一个速冻，一个浸泡在福尔马林或PFA中；睾丸样本：一个睾丸浸泡在福尔马林或PFA中，1/2个睾丸浸泡在波恩氏固定液中，并且1/2个睾丸速冻。附睾速冻。
组号 n 测试制品1(ID) 剂量 途径 频率 特殊
1 5 OPG-FC(cyt-177-c) 1mg/kg 腹腔给药 每周2次
2 5 RANKL(cyt-692-b) 40μg/kg 腹腔给药 每周3次
3 5 媒介物 - 腹腔给药 每周3次
临床观察
每天检查所有动物的一般情况。记录任何临床体征或行为异常。
将附睾尾部剁碎置于1ml的PBS 1×中，在1小时之后计数释放的细胞数量。通过使用血球计估计最终悬浮液中的总精子数量。
人道终点和早期终止
表现出超过轻度疼痛或中度痛苦的临床体征的任何动物将被人道地安乐死。这包括表现出超过人道终点的极限的临床体征的动物。如果在研究期间发现动物死亡或过早安乐死，则尽可能准确地记录死亡时间。在安乐死之前或者在发现死亡动物时测量体重。若有可能，对动物进行尸体解剖。将根据“尸体解剖计划表”检查并描述动物的外部形貌和内部形貌以及关键器官，并且记录器官重量。关键器官将保存在福尔马林中，每只动物一个小瓶。在对照组终止时，将基于对照组动物对动物进行相同的尸体解剖。这使得进一步研究成为可能。
结果
体重和痛苦
在用媒介物、RANKL或OPG进行处理后的体重没有主要区别。动物没有表现出痛苦的征象。
睾丸尺寸和附睾
不进行雄性生育力潜能的综合评价，但是用OPG处理的小鼠的生殖器官(睾丸和附睾)的重量显著高于分别用媒介物和RANKL处理的小鼠的生殖器官的重量(图8和图9)。此外，在OPG处理的小鼠中比用RANKL和媒介物处理的10周龄小鼠中有更多小管表现出更宽(图10，上)，并且生殖细胞的上皮宽度明显更宽，而不受OPG处理的小鼠的精子形成的阶段的影响(图10，下)。OPG处理的小鼠中增加的生殖细胞可以解释附睾重量的差异，这可能是由于OPG处理的小鼠中比RANKL处理的小鼠中更多数量的累积的精子。
精子计数
为了验证这一点，我们从媒介物和OPG两者处理的小鼠的附睾尾部释放精子，因为这些精子完全成熟并且准备射精，因此是它们生育力潜能的间接标记。我们发现精子浓度的显著差别。OPG处理的小鼠的平均精子浓度为25.3百万个/ml，明显高于(p＝0.02)媒介物处理的小鼠的平均精子浓度13.4百万个/ml(图11)。OPG和媒介物处理的小鼠之间的精子数量的显著差异与睾丸和附睾的器官重量以及睾丸中生殖细胞层的宽度的显著差异一致，这强力有力地支持OPG处理的小鼠具有更好的精液质量并且因此具有更好的生殖力潜能。
讨论
不受理论的约束，在用外源性RANKL、OPG或媒介物处理小鼠的生殖器官两周的这种综合研究中，我们解释了通过使用OPG处理抑制RANKL信号传导导致睾丸和附睾的重量和组织结构的显著差异。这与RANKL在睾丸中表达的以上记录显示的此前结果一致。此外，上述体内和离体数据表明用狄诺塞麦或OPG抑制RANKL导致生殖细胞增殖。根据OPG处理的小鼠中的生殖细胞层比媒介物和RANKL处理的小鼠明显更宽，表明睾丸重量的增加是由于生殖细胞的数量增加。尤其是附睾重量在RANKL和OPG处理的小鼠之间存在明显差异，这可能是由于RANKL处理的小鼠比OPG处理的小鼠的附睾中的更低的精子数量。再者，这些结果与表明OPG处理的小鼠的精子计数比媒介物处理的小鼠的精子计数明显更高的结果一致，这强有力地支持OPG处理提高小鼠的生育力潜能。
总而言之，OPG和媒介物处理的小鼠之间的精子计数的显著差异与睾丸和附睾的器官重量以及睾丸中生殖细胞层的宽度的显著差异一致，这强力有力地支持OPG处理的小鼠具有更好的精液质量并且因此具有更好的生殖力潜能。
因此，提供了表明鼠睾丸中存在RANKL、RANK和OPG可能具有临床重要性并且用OPG和/或狄诺塞麦的外源性处理可以用作提高生育力的药物的证据。
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Claims (23)

1.一种化合物在制备用于刺激睾丸中的生殖细胞增殖、和/或用于治疗和/或预防哺乳动物的雄性不育症、和/或用于诱导或提高哺乳动物的雄性生育力的药物中的用途，其中所述化合物与RANKL结合并且选自由狄诺塞麦或其抗原结合域组成的组，或者所述化合物选自由OPG、OPG-FC组成的组。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述化合物是狄诺塞麦。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述化合物是RANKL信号传导的抑制剂。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物用于预防和/或治疗少精子症。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物用于预防和/或治疗无精子症。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述化合物通过静脉内或皮下给药。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述化合物通过皮下给药。
8.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述化合物通过睾丸内给药或在生殖区给药。
9.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述化合物在阴囊区给药。
10.根据权利要求1或2所述的用途，所述化合物给药于在任何阶段的没有患睾丸癌的雄性受试者，所述睾丸癌通过所述受试者的睾丸的组织样本的组织学分析能够被检测到。
11.一种组合物在制备用于治疗和/或预防哺乳动物的雄性不育症和/或用于提高哺乳动物的雄性生育力的药物中的用途，所述组合物包含根据权利要求1至3中任一项中所述的化合物。
12.根据权利要求11所述的用途，所述组合物是药物组合物。
13.根据权利要求11或12所述的用途，所述组合物包含一种或多种生理学可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
14.根据权利要求11或12所述的用途，所述组合物包含一种或多种稳定剂和/或一种或多种缓冲剂。
15.根据权利要求14所述的用途，其中至少一种稳定剂是表面活性剂。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述表面活性剂选自聚山梨醇酯和聚氧丙烯-聚乙烯酯。
17.根据权利要求15所述的用途，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯。
18.根据权利要求15所述的用途，其中所述表面活性剂的浓度是0.001％至1％。
19.根据权利要求11或12所述的用途，所述组合物包含山梨糖醇、乙酸盐、氢氧化钠和注射用水。
20.根据权利要求11或12所述的用途，所述组合物的pH为5.2至6.5。
21.根据权利要求11或12所述的用途，所述组合物包含选自钙和维生素D的一种或多种组分。
22.OPG或OPG-FC在制备用于刺激睾丸中的生殖细胞增殖、和/或用于治疗和/或预防和/或减轻哺乳动物的雄性不育症、和/或用于诱导或提高哺乳动物的雄性生育力的药物中的用途。
23.狄诺塞麦在制备用于刺激睾丸中的生殖细胞增殖、和/或用于治疗和/或预防和/或减轻哺乳动物的雄性不育症、和/或用于诱导或提高哺乳动物的雄性生育力的药物中的用途。
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