KR20120112527A - 중화 프로락틴 수용체 항체 및 이의 치료 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 중화 프로락틴 수용체 항체 006-H08, 및 그의 성숙 형태, 및 항원-결합 단편, 이를 함유하는 제약 조성물 및 프로락틴 수용체에 의해 매개되는 양성 장애 및 적응증, 예컨대 자궁내막증, 자궁선근증, 비-호르몬성 여성 피임, 양성 유방 질환 및 유방통, 젖분비 억제, 양성 전립선 비대증, 유섬유종, 고- 및 정상 프로락틴혈증성 탈모의 치료 또는 예방, 및 유선 상피 세포 증식을 억제하기 위한 조합 호르몬 요법에서의 공동 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 프로락틴 수용체-매개 신호전달을 차단한다.

Description

중화 프로락틴 수용체 항체 및 이의 치료 용도{NEUTRALIZING PROLACTIN RECEPTOR ANTIBODIES AND THEIR THERAPEUTIC USE}
본 발명은 프로락틴 수용체 항체 006-H08에 관한 것이고, 프로락틴 수용체에 특이적으로 결합하여 중화시키는 재조합 항원-결합 영역 및 상기 항원-결합 영역을 함유하는 항체 및 기능적 단편, 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열, 이를 함유하는 벡터, 이를 함유하는 제약 조성물 및 프로락틴 수용체 매개 신호전달의 억제로부터 유익을 얻는 양성 질환 및 적응증, 예컨대 자궁내막증, 자궁선근증, 비-호르몬성 여성 피임, 양성 유방 질환, 유방통, 젖분비 억제, 양성 전립선 비대증, 유섬유종 및 고- 및 정상 프로락틴혈증성 탈모의 치료 또는 예방, 및 유선 상피 세포 증식을 억제하기 위한 조합 호르몬 요법에서의 공동 치료에서의 이들의 용도를 제공한다.
다양한 양성 질환 및 적응증, 예컨대 자궁내막증, 자궁선근증, 비-호르몬성 여성 피임, 양성 유방 질환, 유방통, 젖분비 억제, 양성 전립선 비대증, 유섬유종, 고- 및 정상 프로락틴혈증성 탈모의 치료, 및 조합 (즉, 에스트로겐 + 프로게스틴) 호르몬 요법에서 유선 상피 세포 증식의 억제를 위한 의학적 필요성이 충족되지 않고 있다.
프로락틴 (PRL)은 199개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드 호르몬이다. PRL은 성장 호르몬 (GH)인 폴리펩티드 호르몬의 태반 락토겐 (PL) 패밀리이고, 뇌하수체의 프로락틴 분비 세포에서 및 몇몇의 뇌하수체외 조직, 예컨대 림프구, 유선 상피 세포, 자궁근층, 및 전립선에서 합성된다. 2개의 상이한 프로모터가 뇌하수체 및 뇌하수체외 PRL 합성을 조절한다 (BioEssays 28:1051-1055, 2006).
PRL은 클래스 1 시토킨 수용체 수퍼패밀리에 속하는 단일 막횡단 수용체인 PRL 수용체 (PRLR)에 결합한다 (Endocrine Reviews 19:225-268, 1998). PRLR은 세포질 테일 (tail)의 길이에 의해 구분될 수 있는 3개의 상이한 이소형, 즉 짧은, 긴, 및 중간 형태로 존재한다. 리간드 결합시에, 순차적인 과정이 PRLR 활성화를 유도한다. PRL은 하나의 PRLR 분자와 그의 결합 부위 1을 통해 상호작용하고, 그의 결합 부위 2를 통해 제2 수용체 분자를 유인하여 PRLR의 활성 이량체를 형성한다. PRLR 이량체화는 JAK/STAT (야누스 (Janus) 키나제/신호전달인자 및 전사 활성인자) 경로의 우세한 활성화를 유도한다. 수용체 이량체화시에, 수용체와 회합된 JAK (우세하게 JAK2)는 서로 인산을 전달하고 활성화시킨다. 또한, PRLR은 또한 인산화되고, 단백질, 예컨대 STAT를 함유하는 SH2-도메인에 결합할 수 있다. 수용체 결합 STAT는 후속적으로 인산화되고, 수용체로부터 해리되고, 핵으로 이동하고, 여기서 표적 유전자의 전사를 자극한다. 또한, PRLR에 의한 Ras-Raf-MAPK 경로의 활성화 및 세포질 src 키나제의 활성화가 문헌에 기재되어 있다 (Endocrine Reviews 19:225-268, 1998).
PRLR-매개 신호전달은 다양한 과정, 예컨대 유선 발달, 젖분비, 생식, 유선 및 전립선 종양 성장, 자가면역 질환, 전체적인 성장 및 대사, 및 면역조절에서 기능한다 ([Endocrine Reviews 19:225-268, 1998]; [Annu. Rev. Physiol. 64:47-67, 2002]).
현재, PRLR-매개 신호전달의 완전한 저해는 불가능하다. PRLR-매개 신호전달을 저해하는 유일한 방법은 브로모크립틴 및 다른 도파민 수용체 2 효능제의 사용에 의한 뇌하수체 PRL 분비의 억제이다 (Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism 2(10): 571-581, 2006). 그러나, 상기 작용제는 뇌하수체 PRL 합성의 억제를 성공적으로 보상할 수 있는 뇌하수체외 PRL 합성을 억제하지 않아, 거의 비손상된 PRLR-매개 신호전달을 유도한다 (Endocrine Reviews 19:225-268, 1998). 따라서, 프로락틴이 그 질환에 관련되더라도, 도파민 타입 2 수용체 효능제가 유방암 또는 자가면역 질환, 예컨대 전신성 루푸스 또는 류마티스성 관절염으로 고통받는 환자에 유용하지 않았음 ([Breast Cancer Res. Treat. 14:289-29, 1989]; [Lupus 7:414-419, 1998])은 놀랍지 않다. 각각 유선 암종 또는 자가면역 질환에서 중추적인 기능을 수행하는 유방암 세포 또는 림프구에서 국소 프로락틴 합성은 도파민 수용체 효능제에 의해 차단되지 않았다.
양성 질환 및 적응증, 예컨대 자궁내막증, 자궁선근증, 비-호르몬성 여성 피임, 양성 유방 질환 및 유방통, 젖분비 억제, 양성 전립선 비대증, 유섬유종, 고- 및 정상 프로락틴혈증성 탈모의 치료 또는 예방, 및 유선 상피 세포 증식의 억제를 위한 조합 호르몬 요법의 공동 치료를 위한 수단을 제공하기 위한 상기 시도에도 불구하고, 어떠한 화합물도 상기 필요성을 충족하기 위해 이용가능하지 않았다. 따라서, 본 발명의 목적은 양성 질환 및 적응증에 대한 치료제인 화합물을 제공함으로써 상기 문제를 해결하는 것이다.
이제, PRLR에 특이적이고 높은 친화도를 갖고, 그에 따라 PRLR-매개 신호전달을 중화하고 대상체에게 치료 이익을 전달할 수 있는 신규한 항체가 확인되었다.
중화 PRLR 항체에 의한 PRLR 활성화의 차단은 PRLR-매개 신호전달의 완전한 억제를 유도한다. 반대로, 도파민 수용체 효능제는 상승된 뇌하수체 프로락틴 분비에 반응하여 향상된 PRLR-매개 신호전달만을 저해할 수 있고, 활성화 PRLR 돌연변이에 의한 또는 국소적으로 상승된 프로락틴 생산에 의한 향상된 PRLR-매개 신호전달은 저해하지 못한다.
따라서, 문제는 높은 친화도로 PRLR에 결합하고 PRLR-매개 신호전달을 효율적으로 중화하고 바람직하게는 다른 종, 예컨대 마카카 물라타 (Macacca mulatta) 및 마카카 파시쿨라리스 (Macacca fascicularis), 무스 무스쿨루스 (Mus musculus) 또는 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus)로부터의 PRLR에 대해서 교차반응성인, 상기 언급된 양성 질환 및 적응증의 치료를 위한 항체 006-H08, 및 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 변이체의 제공에 의해 해결된다.
일부 PRLR 항체는 특허 출원 WO2008/022295 (노파르티스 (Novartis)) 및 미국 특허 7,422,899 (바이오겐 (Biogen))에 이미 기재되어 있다.
본 발명은 PRLR에 특이적이고 높은 친화도를 갖고 그에 따라 PRLR-매개 신호전달을 중화하고 대상체에게 치료 이익을 전달할 수 있는 신규한 항체의 발견을 기초로 한다 (신규한 항체의 서열은 서열 34, 40, 46, 및 52에 제시된다). 인간 또는 인간화 또는 키메라 (chimeric) 또는 인간 조작된 항체일 수 있는 본 발명의 항체는 본원에서 보다 충분히 설명되는 많은 측면에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 프로락틴 수용체-매개 신호전달에 대해 길항작용을 하는 항체 또는 항원-결합 단편이다.
신규한 항체 '002-H06', '002-H08', '006-H07', '001-E06', '005-C04'는 상응하는 출원의 주제이다.
뮤린 질환 모델에서 상기 항체의 생체내 특성화는 뮤린 프로락틴 수용체에 대한 교차반응성을 보이는 항체를 사용할 경우에만 가능하다. 상응하는 출원에 개시된 항체 005-C04만이 뮤린 프로락틴 수용체에 대한 충분한 교차반응성을 보이고, 따라서, 뮤린 생체내 모델에서 사용될 수 있는 유일한 항체이다. 상기 항체를 사용하여 얻은 결과는 따라서 분석된 질환 모델에서 상응하는 출원에 개시된 다른 모든 중화 프로락틴 수용체 항체에 대한 일반적인 효능을 대용물로서 증명한다.
항체는 그의 종 특이성 및 그의 효력 및 PRLR-매개 신호전달의 불활성화를 처리하는 상이한 판독 패러다임에서의 효능을 결정하기 위해 몇몇의 세포 시스템에서 특성화되었다 (실시예 5 - 10 참조). 증식 검정은 인간 PRLR (실시예 5, 도 5) 또는 뮤린 PRLR (실시예 10, 도 10)로 안정적으로 형질감염된 래트 Nb2-11 세포 (실시예 6, 도 6) 또는 Ba/F 세포를 사용하여 수행하였다. 노파르티스 항체 XHA 06.983은 래트 및 뮤린 PRLR에 대한 활성을 보이지 않은 반면, 노파르티스 항체 XHA06.642는 래트 PRLR에는 활성을 보였지만 뮤린 PRLR에는 보이지 않았다. XHA 06.642는 인간 PRLR-매개 신호전달을 억제하였다 (실시예 5, 7, 8). 신규한 본 발명의 항체 006-H08은 인간 PRLR로 안정적으로 형질감염된 Ba/F 세포의 증식 억제에 대해 최고 효력을 보였다 (실시예 5, 도 5). 상응하는 출원의 신규한 항체 005-C04는 뮤린 (실시예 10, 9) 및 인간 PRLR (실시예 5, 7, 8)에 대한 교차반응성을 보이는 유일한 항체이었다. 노파르티스 항체 XHA06.642와 달리, 신규한 항체 005-C04는 따라서 뮤린 모델에서 PRLR-매개 신호전달의 억제 시험에 적합하다. 본원에서 또는 상응하는 출원에서 기재되는 모든 다른 항체는 인간 PRLR에 특이적이다. 세포 증식 검정 (실시예 5, 6, 10) 이외에, 루시퍼라제 리포터 검정은 인간 (실시예 8) 또는 뮤린 (실시예 9) PRLR로 안정적으로 형질감염되고 LHRE (젖분비자극 호르몬 반응 요소)의 제어 하에 루시퍼라제 리포터 유전자로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포를 사용하여 수행하였다. 이들 시스템을 사용하여 뮤린 PRLR-매개 신호전달을 효율적으로 차단하는 노파르티스 항체 XHA06.642의 능력의 결여가 다시 분명해졌다 (실시예 9). 이와 대조적으로, 신규한 항체 005-C04 (대응하는 출원)는 뮤린 PRLR에 의한 루시퍼라제 리포터 유전자 활성화를 차단하였다 (실시예 9). 인간 T47D 세포에서의 STAT5 인산화를 인간 PRLR에 대한 항체의 억제 활성을 분석하기 위한 추가의 판독으로 사용하였다 (실시예 7, 도 7). 예상한 바와 같이, 비특이적 항체는 분석된 모든 실험 패러다임에서 불활성이었다.
본 발명은 항-PRLR 항체를 제공함으로써 PRLR-양성 세포의 성장 및 상기 언급된 양성 질환 및 적응증의 진행을 억제하는 방법에 관한 것이다. 문헌 [PNAS 105 (38), 14533, 2008], 및 [J. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (1), 271, 2010]에 기재된 PRLR의 세포외 도메인 (ECD) (서열 70) 또는 서열 70의 인간 다형성 변이체, 예컨대 I146L 및 I76V 변이체에 특이적으로 결합하는, 인간 모노클로날 항체, 그의 항원-결합 단편, 및 항체 및 단편의 변이체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 목적은 프로락틴 수용체의 세포외 도메인의 에피토프 및 그의 인간 다형성 변이체에 결합하는 항체이고, 여기서 프로락틴 수용체의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열 70에 상응하고, 핵산 서열은 서열 71에 상응한다.
본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 및 항체 및 단편의 변이체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역으로 이루어진다. 본 발명에서 고려되는 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체는 PRLR에 대한 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 결합 활성이 유지되는 분자이다 (서열에 대해서는 표 5 참조).
따라서, 본 발명의 목적은 항체 006-H08 또는 그의 규정된 성숙 변이체에 경쟁하는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 이 항체 및 그의 성숙 변이체의 서열은 표 5에 제시된다.
추가의 하나의 실시양태에서, 다음 특성을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편이 개시된다:
a. 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 아미노산 서열이, 가변 중쇄 도메인의 경우 서열 34에, 및 가변 경쇄 도메인의 경우 서열 40에 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 또는 90%, 또는 훨씬 더 바람직하게는 95% 동일하거나, 또는
b. 가변 중쇄 및 경쇄 도메인의 아미노산 서열이 항체 006-H08의 성숙 형태에 대해 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 또는 90%, 또는 훨씬 더 바람직하게는 95% 동일하거나, 또는
c. CDR의 아미노산 서열이 중쇄 도메인의 경우 서열 1, 7, 및 13에, 및 가변 경쇄 도메인의 경우 서열 18, 24, 및 29에 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 또는 훨씬 더 바람직하게는 95% 동일하다.
추가의 실시양태에서, 다음 특성을 갖는 항체 006-H08의 CDR을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편이 개시된다:
a. 가변 중쇄가 서열 1, 7 및 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 및 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나, 또는
b. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 78, 24, 90에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
c. 가변 중쇄가 서열 1, 75, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 82, 24, 91에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
d. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 82, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
e. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 86, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
f. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 87, 24, 100에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
g. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 87, 24, 92에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
h. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 89, 24, 93에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
i. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 79, 24, 101에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
j. 가변 중쇄가 서열 1, 76, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 89, 24, 90에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
k. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 100에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
l. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 97에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
m. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 98에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
n. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 83, 24, 99에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
o. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 96에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
p. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 94에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
q. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 88, 24, 90에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
r. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 81, 24, 95에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
s. 가변 중쇄가 서열 1, 75, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
t. 가변 중쇄가 서열 1, 77, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
u. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 80, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
v. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 85, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
w. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 84, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유한다.
한 실시양태에서, 다음 특성을 갖는 인간 항체 006-H08, 또는 그의 성숙 형태가 개시된다:
a. 항체 006-H08은 서열 46에 따른 핵산 서열, 및 서열 34에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 52에 따른 핵산 서열, 및 서열 40에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
b. 항체 006-H08-12-2는 서열 331에 따른 핵산 서열, 및 서열 353에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 165에 따른 핵산 서열, 및 서열 143에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
c. 항체 006-H08-13-2는 서열 332에 따른 핵산 서열, 및 서열 354에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 166에 따른 핵산 서열, 및 서열 144에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
d. 항체 006-H08-13-6-1은 서열 333에 따른 핵산 서열, 및 서열 355에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 167에 따른 핵산 서열, 및 서열 145에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
e. 항체 006-H08-14-6-0은 서열 334에 따른 핵산 서열, 및 서열 356에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 168에 따른 핵산 서열, 및 서열 146에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
f. 항체 006-H08-15-5는 서열 335에 따른 핵산 서열, 및 서열 357에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 169에 따른 핵산 서열, 및 서열 147에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
g. 항체 006-H08-19-1은 서열 336에 따른 핵산 서열, 및 서열 358에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 170에 따른 핵산 서열, 및 서열 148에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
h. 항체 006-H08-29-1은 서열 337에 따른 핵산 서열, 및 서열 359에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 171에 따른 핵산 서열, 및 서열 149에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
i. 항체 006-H08-32-2는 서열 338에 따른 핵산 서열, 및 서열 360에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 172에 따른 핵산 서열, 및 서열 150에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
j. 항체 006-H08-33-0은 서열 339에 따른 핵산 서열, 및 서열 361에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 173에 따른 핵산 서열, 및 서열 151에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
k. 항체 006-H08-33-16-0은 서열 340에 따른 핵산 서열, 및 서열 362에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인 및 서열 174에 따른 핵산 서열, 및 서열 152에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
l. 항체 006-H08-35-17-1은 서열 341에 따른 핵산 서열, 및 서열 363에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 175에 따른 핵산 서열, 및 서열 153에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
m. 항체 006-H08-35-17-4는 서열 342에 따른 핵산 서열, 및 서열 364에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 176에 따른 핵산 서열, 및 서열 154에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
n. 항체 006-H08-35-1은 서열 343에 따른 핵산 서열, 및 서열 365에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 177에 따른 핵산 서열, 및 서열 155에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
o. 항체 006-H08-36-17-0은 서열 344에 따른 핵산 서열, 및 서열 366에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 178에 따른 핵산 서열, 및 서열 156에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
p. 항체 006-H08-37-19-0은 서열 345에 따른 핵산 서열, 및 서열 367에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 179에 따른 핵산 서열, 및 서열 157에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
q. 항체 006-H08-39-7은 서열 346에 따른 핵산 서열, 및 서열 368에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 180에 따른 핵산 서열, 및 서열 158에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
r. 항체 006-H08-48-5는 서열 347에 따른 핵산 서열, 및 서열 369에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 181에 따른 핵산 서열, 및 서열 159에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
s. 항체 006-H08-53-27-0은 서열 348에 따른 핵산 서열, 및 서열 370에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 182에 따른 핵산 서열, 및 서열 160에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
t. 항체 006-H08-59-30-0은 서열 349에 따른 핵산 서열, 및 서열 371에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 183에 따른 핵산 서열, 및 서열 161에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
u. 항체 006-H08-63-32-4는 서열 350에 따른 핵산 서열, 및 서열 372에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 184에 따른 핵산 서열, 및 서열 162에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
v. 항체 006-H08-65-33-2는 서열 351에 따른 핵산 서열, 및 서열 373에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 185에 따른 핵산 서열, 및 서열 163에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
w. 항체 006-H08-68-35-2는 서열 352에 따른 핵산 서열, 및 서열 374에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 186에 따른 핵산 서열, 및 서열 164에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 다음 특성을 갖는 상기 언급된 항체의 항체 또는 항원-결합 단편이 개시된다:
a. 항체는 서열 1, 7, 13, 18, 24, 29에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나, 또는
b. 항체는 서열 1, 74, 13, 78, 24, 90에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나, 또는
c. 항체는 서열 1, 75, 13, 82, 24, 91에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나, 또는
d. 항체는 서열 1, 7, 13, 82, 24, 29에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나, 또는
e. 항체는 서열 1, 7, 13, 86, 24, 29에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나, 또는
f. 항체는 서열 1, 74, 13, 87, 24, 100에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나, 또는
g. 항체는 서열 1, 74, 13, 87, 24, 92에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
h. 항체는 서열 1, 74, 13, 89, 24, 93에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
i. 항체는 서열 1, 74, 13, 79, 24, 101에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
j. 항체는 서열 1, 76, 13, 89, 24, 90에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
k. 항체는 서열 1, 7, 13, 18, 24, 100에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
l. 항체는 서열 1, 7, 13, 18, 24, 97에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
m. 항체는 서열 1, 7, 13, 18, 24, 98에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
n. 항체는 서열 1, 74, 13, 83, 24, 99에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
o. 항체는 서열 1, 7, 13, 18, 24, 96에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
p. 항체는 서열 1, 7, 13, 18, 24, 94에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
q. 항체는 서열 1, 74, 13, 88, 24, 90에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
r. 항체는 서열 1, 74, 13, 81, 24, 95에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
s. 항체는 서열 1, 75, 13, 18, 24, 29에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
t. 항체는 서열 1, 77, 13, 18, 24, 29에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
u. 항체는 서열 1, 7, 13, 80, 24, 29에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
v. 항체는 서열 1, 7, 13, 85, 24, 29에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유하거나 또는
w. 항체는 서열 1, 7, 13, 84, 24, 29에 상응하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 함유한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항체 006-H08은 서열 70, 아미노산 위치 1 내지 210에 제시된 아미노산 서열을 갖는 PRLR의 하나 이상의 영역에 특이적으로 결합하거나 고 친화도를 갖는 항원-결합 영역으로 이루어지고, 여기서 친화도는 적어도 100 nM, 바람직하게는 약 100 nM 미만, 보다 바람직하게는 약 30 nM 미만, 훨씬 더 바람직하게는 친화도는 약 10 nM 미만 또는 훨씬 더 바람직하게는 친화도는 1 nM 미만, 또는 훨씬 더 바람직하게는 친화도는 30 pM 미만이다.
또한, 본 발명의 목적은 중쇄 불변 영역이 변형 또는 비변형된 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 상기 언급된 항체 006-H08이다.
표 1은 직접 고정된 항체에 대해 PRLR의 단량체 세포외 도메인 (서열 70)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (비아코어 (Biacore))에 의해 결정된, 본 발명의 대표적인 항체의 해리 상수 및 해리 속도의 요약을 제시한다.
Figure pct00001
IgG1 포맷을 스캐챠드 (Scatchard) 분석과 조합된 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 결정된 세포 기반 친화도 결정에 사용하였다.
표 2는 대표적인 IgG 항체의 인간 유방암 세포주 T47D 및 래트 림프종 세포주 Nb2에 대한 결합 강도를 나타낸다.
Figure pct00002
항체 생성
인간 및 뮤린 PRLR을 기능적으로 차단할 수 있는 일군의 항체를 단리하기 위해, 각각 scFv 및 Fab 단편을 발현하는, 바이오인벤트 (Bioinvent)의 n-CoDeR®로 불리는 합성 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 2개의 포맷 (Soederlind et al., 2000, Nature BioTechnology. 18, 852-856)을 동시에 조사하였다. scFv 또는 Fab 선택을 위해 사용된 표적은 비오티닐화된 (NHS-LC 비오틴, 피어스 (Pierce)) 및 비-비오티닐화된 변이체로서 적용된 인간 PRLR (서열 70의 아미노산 위치 1 내지 210) 및 마우스 PRLR (서열 72의 아미노산 위치 1 내지 210)의 가용성 ECD, 및 PRLR을 발현하는 인간 유방암 세포주 T47D이었다.
파지-디스플레이 기술 (PDT)의 다양한 접근법의 조합이, 단백질 및 전체 세포 패닝 (panning)의 조합에 의해 및 특이적 도구의 개발을 통해 고 친화도의 PRLR-특이적 인간 모노클로날 항체를 단리하기 위해 사용되었다. 패닝 도구 및 스크리닝 방법은 Fc 도메인 (알&디 시스템즈 (R&D Systems), 각각 카탈로그 번호 1167-PR 및 1309-PR; 각각 인간 IgG1 Fc 도메인, 인간 IgG1의 위치 100 내지 330에 각각 융합된 서열 70 및 72의 위치 1-216)과 융합되어 재조합 방식으로 발현된 인간 및 마우스 PRLR의 ECD, 6개-히스티딘 태그와 융합되어 재조합 방식으로 발현된 인간 PRLR의 세포외 도메인 (서열 70), 각각 인간 및 뮤린 PRLR로 안정적으로 형질감염된 HEK293 및 뮤린 림프종 세포주 Ba/F, 및 각각 천연적으로 PRLR을 발현하는 유방암 세포주 T47D 및 래트 림프종 세포 Nb2, 및 세포 표면에 제시되는 PRLR에 우선적으로 결합하고 마우스 및 래트로부터의 PRLR에 교차반응성인 중화 항체를 확인할 수 있는 패닝 절차 및 스크리닝 검정의 개발을 포함한다 (실시예 6 및 10 참조).
스크리닝은 먼저 재조합 방식으로 발현된 항원을 사용하여 ELISA 시험에서 인간 PRLR 및 최종적으로 마우스 PRLR에 대한 결합제를 확인함으로써 수행하였다. 이어서, Fab 및 scFv 단편의 T47D 세포에 대한 세포 결합을 FACS 분석, 이어서 세포내 신호전달에 대한 이들 작용제의 중화 활성을 시험함으로써 조사하였다. 이를 위해, T47D 세포에서 PRLR, STAT5 및 ERK1/2의 인산화의 억제를 결정하였다 (실시예 14 참조). 최고의 기능 차단 scFv 및 Fab는 전체 IgG1 분자로 전환되고, 루시퍼라제 리포터 유전자 검정에서 및 프로락틴에 의존하여 성장하는 세포를 사용한 증식 검정에서 PRLR의 ECD에 대한 1가 친화도 및 억제 활성에 대해 시험하였다. 상기 특정 방법의 조합을 통해 본 발명의 주제 대상인 신규한 항체 '006-H08', 및 상응하는 출원의 주제 대상인 항체 '002-H06', '002-H08', '006-H07', '001-E06', '005-C04'를 단리할 수 있었다.
펩티드 변이체
본 발명의 항체는 본원에서 제시된 구체적인 펩티드 서열로 제한되지 않는다. 오히려, 본 발명은 이들 폴리펩티드의 변이체도 포함한다. 본원의 개시내용 및 통상적으로 이용가능한 기술 및 참고문헌을 참고로 하여, 당업자는 본원에 개시된 항체의 기능적 변이체를 제조, 시험 및 이용할 수 있을 것이고, PRLR에 결합하고 이를 기능적으로 차단하는 능력을 갖는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함됨을 이해할 것이다.
변이체는 예를 들어 본원에 개시된 펩티드 서열과 비교하여 적어도 하나의 변경된 상보성 결정 영역 (CDR) (초가변) 및/또는 프레임워크 (FR) (가변) 도메인/위치를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 상기 개념을 보다 잘 예시하기 위해, 항체 구조에 대한 간단한 설명을 아래에 제시한다.
항체는 각각 하나의 (경쇄) 또는 3개의 (중쇄) 불변 도메인 및 가변 영역 (VL, VH)을 함유하는 2개의 펩티드 사슬로 이루어지고, 여기서 가변 영역은 각각의 경우에 4개의 FR 영역 (VH: HFR1, HFR2, HFR3, HFR4; VL: LFR1, LFR2, LFR3, LFR4) 및 3개의 산재된 CDR (VL: LCDR1, LCDR2, LCDR3; VH: HCDR1, HCDR2, HCDR3)로 이루어진다. 항원-결합 부위는 하나 이상의 CDR에 의해 형성되지만, FR 영역은 CDR에 대한 구조적 프레임워크를 제공하고, 따라서 항원 결합에서 중요한 역할을 수행한다. CDR 또는 FR 영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경함으로써, 당업자는 통상적으로 예를 들어 새로운 또는 개선된 특성에 대해 항원에 대해 스크리닝될 수 있는 돌연변이된 또는 다양한 항체 서열을 생성할 수 있다.
도 12는 가변 도메인 VL 및 VH 내의 각각의 아미노산 위치를 넘버링하기 위한 방식을 제공한다. 표 3 (VH) 및 4 (VL)는 본 발명의 특정 항체에 대한 CDR 영역을 설명하고, 제시된 위치의 아미노산을 서로 및 상응하는 컨센서스 또는 "마스터 유전자" 서열과 비교하며, 여기서 CDR 영역은 'X'로 표시된다. 표 5 및 6은 본 발명에서 제시되는 항체, 항체 단편 및 PRLR 변이체에 대한 서열 번호의 지정을 돕는다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
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당업자는 본 발명의 범위 내에 포함되는 펩티드 변이체를 설계하기 위해 표 3, 4 및 5의 데이터를 사용할 수 있다. 변이체는 하나 이상의 CDR 영역 내의 아미노산을 변경함으로써 구축하는 것이 바람직하고; 변이체는 또한 하나 이상의 변경된 프레임워크 영역 (FR)을 가질 수 있다. 예를 들어, 펩티드 FR 도메인은 배선 (germline) 서열에 비해 잔기의 변이가 존재하도록 변경될 수 있다.
도 12에 나열된 상응하는 컨센서스 또는 "마스터 유전자" 서열에 대한 신규한 항체의 비교를 참고로 하여, 변경될 수 있는 후보 잔기는 예를 들어 다음의 것을 포함한다:
- VH 006-H08 (서열 34)에서 위치 75의 잔기 리신 (K)의 글루타민 (Q)으로의 변경
- VH 006-H08 (서열 34)에서 위치 108의 잔기 류신 (L)의 메티오닌 (M)으로의 변경
- VH 006-H08 (서열 34)에서 위치 110의 잔기 트레오닌 (T)의 이소류신 (I)으로의 변경
- VH 002-H08 (서열 36)에서 위치 67에서 잔기 페닐알라닌 (F)의 류신 (L)으로의 변경.
또한, 변이체는 성숙화에 의해, 즉 하나의 항체를 최적화를 위한 출발점으로 사용하여, 항체 내의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 하나 이상의 CDR 내의 아미노산 잔기를 다양화하고 생성되는 항체 변이체의 집합체를 대상으로 개선된 특성을 갖는 변이체에 대해 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. VL의 LCDR3, VH의 HCDR3, VL의 LCDR1 및/또는 VH의 HCDR2 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 다양화가 특히 바람직하다. 다양화는 트리뉴클레오티드 돌연변이 유발 (TRIM) 기술을 사용하여 DNA 분자의 집합체를 합성함으로써 수행될 수 있다 [Virnekaes, B., Ge, L, Plueckthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G., and Moroney S.E. (1994) Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucl. Acids Res. 22, 5600].
보존적 아미노산 변이체
본원에서 설명되는 항체 펩티드 서열의 전체적인 분자 구조를 보존하는 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있다. 개개의 아미노산의 특성을 고려하여, 몇몇의 합리적인 치환을 당업자는 알 것이다. 아미노산 치환, 즉, "보존적 치환"은 예를 들어 관련 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성의 유사성을 기초로 하여 실시할 수 있다.
예를 들어, (a) 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; (b) 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하고; (c) 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하고; (d) 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 치환은 일반적으로 군 (a)-(d) 내에서 이루어질 수 있다. 또한, 글리신 및 프롤린은 α-나선을 파괴하는 그의 능력을 기초로 하여 서로 치환될 수 있다. 이와 유사하게, 특정 아미노산, 예컨대 알라닌, 시스테인, 류신, 메티오닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 및 리신은 α-나선에서 보다 통상적으로 발견되고, 발린, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 트레오닌은 β-병풍 (pleated) 시트에서 보다 통상적으로 발견된다. 글리신, 세린, 아스파르트산, 아스파라긴, 및 프롤린은 통상적으로 회전 (turn)에서 발견된다. 몇몇의 바람직한 치환은 다음 군 중에서 이루어질 수 있다: (i) S 및 T; (ii) P 및 G; 및 (iii) A, V, L 및 I. 공지의 유전자 코드, 및 재조합 및 합성 DNA 기법을 고려하여, 당업자는 보존적 아미노산 변이체를 코딩하는 DNA를 쉽게 구축할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열 사이에 동일한 아미노산의 비율을 나타낸다. "서열 상동성"은 동일하거나 또는 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 비율을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드 서열은 적어도 60%, 보다 바람직하게는, 적어도 70% 또는 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 CDR 영역 내의 서열 동일성을 갖는다. 또한, 바람직한 항체는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 90% 및 가장 바람직하게는 95%의 CDR 영역 내의 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 모든 상기 개시된 분자는 프로락틴 수용체 매개 신호전달을 차단한다.
본 발명의 DNA 분자
또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 분자에 관한 것이다. 상기 서열은 서열 46 및 52, 및 331 내지 374에 제시된 DNA 분자를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 DNA 분자는 본원에서 개시된 서열로 제한되지 않고, 그의 변이체를 포함한다. 본 발명 내의 DNA 변이체는 혼성화에서 그의 물리적 특성과 관련하여 기재될 수 있다. 당업자는 핵산 혼성화 기법을 사용하여 그의 상보체, 및 DNA가 이중 가닥이기 때문에 그의 등가물 또는 상동체를 확인하기 위해 DNA가 사용될 수 있음을 알 것이다. 또한, 혼성화는 100% 미만의 상보성에서 발생할 수 있음을 알 것이다. 그러나, 조건에 대한 적절한 선택이 주어지면, 특정 프로브에 대한 그의 구조적 관련성을 기초로 하여 혼성화 기법을 사용하여 DNA 서열을 구분할 수 있다. 상기 조건에 대한 지침에 대해서는, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA)] 및 [Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons]를 참조한다.
2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 구조적 유사성은 2개의 서열이 서로 혼성화하는 조건의 "엄격성"의 함수로서 표현될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "엄격성"은 조건이 혼성화에 불리한 정도를 의미한다. 엄격한 조건은 혼성화에 크게 불리하고, 구조적으로 가장 관련된 분자만이 상기 조건 하에서 서로 혼성화할 것이다. 이와 반대로, 엄격하지 않은 조건은 보다 낮은 정도의 구조적 관련성을 보이는 분자의 혼성화에 유리하다. 따라서, 혼성화 엄격성은 2개의 핵산 서열의 구조적 관계와 직접적으로 상관된다. 다음 관계는 혼성화 및 관련성을 상관시키는데 유용하다 (여기서, Tm은 핵산 이중체의 용융 온도임):
a. Tm = 69.3 + 0.41 (G+C)%
b. 이중체 DNA의 Tm은 미스매치된 염기쌍 수의 1% 증가시마다 1℃ 감소한다.
c. (Tm)μ2-(Tm)μ1 = 18.5 log10μ2/μ1
여기서, μ1 및 μ2는 2개의 용액의 이온 강도이다.
혼성화 엄격성은 총 DNA 농도, 이온 강도, 온도, 프로브 크기 및 수소 결합을 붕괴시키는 작용제의 존재를 비롯한 많은 인자의 함수이다. 혼성화를 촉진하는 인자는 높은 DNA 농도, 높은 이온 강도, 낮은 온도, 보다 긴 프로브 크기 및 수소 결합을 붕괴시키는 작용제의 부재를 포함한다. 혼성화는 일반적으로 2개의 단계, 즉 "결합" 단계 및 "세척" 단계로 수행된다.
먼저, 결합 단계에서, 프로브는 혼성화에 유리한 조건 하에 표적에 결합한다. 엄격성은 대체로 온도를 변경함으로써 상기 단계에서 제어된다. 고 엄격성을 위해, 온도는 짧은 (< 20 nt) 올리고뉴클레오티드 프로브가 사용되지 않는 한 대체로 65℃ 및 70℃이다. 대표적인 혼성화 용액은 6x SSC, 0.5% SDS, 5x 덴하르트 (Denhardt) 용액 및 100 ㎍의 비특이적 담체 DNA를 포함한다 [문헌 (Ausubel et al., section 2.9, supplement 27 (1994)) 참조]. 물론, 많은 상이한, 기능적으로 동등한 완충제 조건이 알려져 있다. 관련성 정도가 보다 낮은 경우, 보다 낮은 온도가 선택될 수 있다. 저 엄격성 결합 온도는 약 25℃ 내지 40℃이다. 중간 엄격성은 적어도 약 40℃ 내지 약 65℃ 미만이다. 고 엄격성은 적어도 약 65℃이다.
두번째로, 과량의 프로브를 세척에 의해 제거한다. 보다 엄격한 조건이 대체로 적용되는 것은 이 단계에서이다. 따라서, 혼성화를 통해 관련성을 결정할 때 상기 "세척" 단계가 가장 중요하다. 세척 용액은 일반적으로 보다 낮은 염 농도를 함유한다. 한 예시적인 중간 엄격성 용액은 2X SSC 및 0.1% SDS를 함유한다. 고 엄격성 세척 용액은 약 0.2X SSC 미만의 등가물 (이온 강도에서)을 함유하고, 바람직한 엄격한 용액은 약 0.1X SSC를 함유한다. 다양한 엄격성과 연관된 온도는 상기 "결합"에 대해 논의된 바와 동일하다. 또한, 세척 용액은 일반적으로 세척 동안 다수회 교체된다. 예를 들어, 전형적인 고 엄격성 세척 조건은 55℃에서 30분 동안 2회 및 60℃에서 15분 동안 3회 세척을 포함한다.
따라서, 본 발명의 대상은 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 항체를 코딩하는 상기 언급된 단리된 핵산 서열이고, 여기서 핵산 서열은 표 5에 제시된 바와 같다.
따라서, 본 발명은 고 엄격성 결합 및 세척 조건 하에 표 5에 제시된 분자에 혼성화하는 핵산 분자를 포함하고, 여기서 상기 핵산 분자는 본원에서 설명되는 특성을 갖는 항체 또는 그의 기능적 단편을 코딩한다.
바람직한 분자 (mRNA 관점으로부터)는 본원에서 설명되는 DNA 분자의 하나와 적어도 75% 또는 80% (바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95%)의 서열 동일성을 갖는 것이다. 분자는 프로락틴 수용체 매개 신호전달을 차단한다.
기능적으로 등가인 변이체
본 발명의 범주 내의 DNA 변이체의 또 다른 클래스가 이들이 코딩하는 생성물과 관련하여 설명될 수 있다. 상기 기능적으로 등가인 유전자들은 이들이 유전자 코드의 축퇴성 때문에 서열 34-45에서 발견되는 동일한 펩티드 서열을 코딩한다는 사실을 특징으로 한다.
본원에서 제시되는 DNA 분자의 변이체는 몇몇의 상이한 방식으로 구축될 수 있는 것으로 인지된다. 예를 들어, 이들은 완전한 합성 DNA로서 구축될 수 있다. 20 내지 약 150개 뉴클레오티드 범위의 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 합성하는 방법이 널리 이용가능하다 ([Ausubel et al., section 2.11, Supplement 21 (1993)] 참조). 중첩되는 올리고뉴클레오티드는 문헌 [Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971)]에 처음 보고된 방식으로 합성되고 조립될 수 있다 (또한, [Ausubel et al., 상기 문헌, Section 8.2] 참조). 합성 DNA는 바람직하게는 적절한 벡터 내로의 클로닝을 용이하게 하기 위해 유전자의 5' 및 3' 말단부에서 조작된 편리한 제한 부위를 갖도록 설계된다.
나타낸 바와 같이, 변이체 생성 방법은 본원에서 개시된 DNA의 하나로 출발하고 부위 지정 돌연변이 유발을 수행하는 것이다 ([Ausubel et al., 상기 문헌, chapter 8, Supplement 37 (1997)] 참조). 전형적인 방법에서, 표적 DNA를 단일가닥 DNA 박테리오파지 비히클 내로 클로닝한다. 단일가닥 DNA를 단리하고, 요구되는 뉴클레오티드 변경(들)을 함유하는 올리고뉴클레오티드와 혼성화시킨다. 상보성 가닥이 합성되고, 이중 가닥 파지를 숙주 내로 도입한다. 몇몇의 생성되는 자손체는 DNA 서열분석을 사용하여 확인될 수 있는 요구되는 돌연변이체를 함유할 것이다. 또한, 자손체 파지가 요구되는 돌연변이체일 가능성을 증가시키는 다양한 방법이 이용가능하다. 상기 방법은 당업계에 주지되어 있고, 상기 돌연변이체를 생성하기 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다.
재조합 DNA 구축물 및 발현
본 발명은 추가로 본 발명의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 제공한다. 본 발명의 재조합 구축물은 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 분자가 그 내부에 삽입되는 벡터, 예컨대 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 함께 사용된다.
코딩되는 유전자는 문헌 [Sambrook et al., 1989], 및 [Ausubel et al., 1989]에 기재된 기법에 의해 생산될 수 있다. 별법으로, DNA 서열은 예를 들어 합성기를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (1984, Gait, ed., IRL Press, Oxford)]에 기재된 기법을 참조한다. 당업자는 가변 도메인을 코딩하는 DNA를 돌연변이된 또는 비-돌연변이된 다양한 인간 IgG 이소형 또는 그의 유도체의 불변 영역을 코딩하는 유전자 단편과 융합할 수 있다. 당업자는 링커, 예컨대 글리신-글리신-글리신-글리신-세린의 3개조를 함유하는 15개 아미노산의 스트레치 (stretch)를 사용하여 단일쇄 포맷으로 두 가변 도메인을 융합하기 위해 재조합 DNA 기술을 적용할 수 있다. 본 발명의 재조합 구축물은 코딩되는 DNA(들)의 RNA 및/또는 단백질 생성물을 발현할 수 있는 발현 벡터에 포함된다. 벡터는 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 벡터는 추가로 선택 마커 서열을 포함할 수 있다. 또한, 특이적인 개시 및 박테리아 분비 신호는 삽입된 표적 유전자 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 필요할 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 적어도 하나의 DNA를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 발현 벡터가 이용가능한 실질적으로 임의의 세포일 수 있다. 숙주 세포는 예를 들어 고등 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포, 하등 진핵 숙주 세포, 예컨대 효모 세포일 수 있고, 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포일 수 있다. 재조합 구축물의 숙주 세포 내로의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE, 덱스트란 매개 형질감염, 전기천공 또는 파지 감염에 의해 실시될 수 있다.
박테리아 발현
박테리아 용도에 유용한 발현 벡터는 기능적 프로모터와 작동가능한 판독상 (reading phase)에서 적합한 번역 개시 및 종결 신호와 함께 요구되는 단백질을 코딩하는 구조적 DNA 서열을 삽입함으로써 구축된다. 벡터는 벡터의 유지를 보장하고, 바람직한 경우 숙주 내에서의 증폭을 제공하기 위해 하나 이상의 표현형 선택 마커 및 복제 기점을 포함할 것이다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주는 이. 콜라이 (E. coli), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토미세스 (Streptomyces), 및 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 속 내의 다양한 종을 포함한다.
박테리아 벡터는 예를 들어 박테리오파지-, 플라스미드- 또는 파지미드-기반 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 선택 마커 및 공지된 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 요소를 일반적으로 함유하는 상업적으로 입수가능한 플라스미드로부터 유래된 박테리아 복제 기점을 함유할 수 있다. 적합한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 균주의 적절한 세포 밀도로의 성장 후에, 선택된 프로모터는 적절한 수단 (예를 들어, 온도 변화 또는 화학적 유도)에 의해 탈억제/유도되고, 세포는 추가의 기간 동안 배양된다. 세포를 일반적으로 원심분리에 의해 수거하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴하고, 생성되는 조 추출물을 추가의 정제를 위해 유지한다.
박테리아 시스템에서, 발현될 단백질에 대해 의도되는 용도에 따라 다수의 발현 벡터를 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 항체를 생성하거나 또는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 다량의 상기 단백질이 생산되어야 할 때, 쉽게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 본 발명의 신규한 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터이다.
포유동물 발현 및 정제
포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV) (예를 들어, CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예를 들어, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 바이러스 조절 요소, 및 그의 서열에 대한 추가의 설명에 대해서는, 예를 들어 U.S. 5,168,062 (Stinski), U.S. 4,510,245 (Bell et al.) 및 U.S. 4,968,615 (Schaffner et al.)을 참조한다. 또한, 재조합 발현 벡터는 복제 기점 및 선택 마커를 포함할 수 있다 (예를 들어, U.S. 4,399,216, 4,634,665 및 U.S. 5,179,017 (Axel et al.) 참조). 적합한 선택 마커로는 벡터가 그 내부로 도입된 숙주 세포에 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 유전자가 포함된다. 예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하고, neo 유전자는 G418에 대한 저항성을 부여한다.
숙주 세포 내로의 발현 벡터의 형질감염은 표준 기법, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전, 및 DEAE-덱스트란 형질감염을 사용하여 수행할 수 있다.
본원에서 제시되는 항체, 그의 항원 결합 부분, 또는 유도체를 발현하기 위한 적합한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 [예를 들어 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 DHFR 선택가능 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포], NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 몇몇의 실시양태에서, 발현 벡터는 발현된 단백질이 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로 분비되도록 설계된다. 항체, 그의 항원 결합 부분, 또는 유도체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 암모늄 술페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포-셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하고 이로 제한되지 않는 공지의 방법에 의해 재조합 세포 배양액으로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")도 정제를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology], 또는 [Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 예를 들어, 챕터 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조한다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 천연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생산 절차에 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 항체는 글리코실화되거나 또는 비-글리코실화될 수 있다. 상기 방법은 많은 표준 실험 매뉴얼, 예컨대 문헌 [Sambrook, 상기 문헌, 섹션 17.37-17.42]; [Ausubel, 상기 문헌, 챕터 10, 12, 13, 16, 18 및 20]에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 또한 벡터 또는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포이고, 여기서 숙주 세포는 고등 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포, 하등 진핵 숙주 세포, 예컨대 효모 세포일 수 있고, 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하고 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항체 및 항원-결합 단편을 생산하기 위해 숙주 세포를 사용하는 방법이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 생산되고 적어도 95 중량%의 균질성으로 정제된 본 발명에서 기재되는 항체이다.
자궁내막증 및 자궁선근증 ( 내자궁내막증 )
자궁내막증은 자궁강 외부의 자궁내막 조직 (선 및 간질)의 존재를 특징으로 하는 양성, 에스트로겐-의존성 부인과 장애이다. 자궁내막증 병변은 골반 복막, 난소 및 직장질 중격에서 주로 발견된다 (Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. 24:235-238, 1997). 자궁내막증은 종종 불임 및 통증 증상, 예컨대 월경통과 연관된다. 또한, 많은 환자는 자가면역 질환으로 고통받는다 (Hum. Reprod. 17(19):2715-2724, 2002). 또한, 내자궁내막증으로도 알려진 자궁선근증은 자궁으로 제한된 자궁내막증의 파생 형태이다. 자궁선근증의 경우에, 자궁내막선은 자궁근층 및 자궁벽을 침습한다. 이식 이론에 따르면, 자궁내막 단편은 환자 및 건강한 여성 모두에서 역류성 월경에 의해 복강 내로 보내진다 (Obstet. Gynecol. 64:151-154, 1984). 4개의 주요 인자가 환자의 골반강에서 자궁내막증 병변의 성공적인 확립에 중요하게 관련되는 것으로 보인다:
a) 월경 주기의 후기 분비기에서, 건강한 여성의 자궁내막 세포는 아폽토시스성이 된다. 환자에서, 자궁내막 세포에서 아폽토시스의 정도는 분명하게 감소한다 (Fertil. Steril. 69:1042-1047,1998). 따라서, 역류성 월경에 의해 복강 내로 보내진 자궁내막 단편이 죽지 않고 성공적으로 이식될 확률이 건강한 여성보다 환자에서 더 높다.
b) 이소성 자궁내막 단편의 복막에서의 성공적인 이식 및 장기간 생존을 위해서는, 새로운 혈관이 형성되어야 한다 (British Journal of Pharmacology, 149:133-135, 2006).
c) 많은 환자는 자가면역 질환으로 고통받고, 따라서 손상된 면역 시스템을 갖는다 (Hum. Reprod. 17(19): 2002, 2715-2724, 2002). 이로 인해, 무손상 면역 반응이 - 건강한 여성에 존재하는 바와 같이 - 자궁내막증 병변의 확립 방지를 위해 일정 역할을 할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
d) 병변은 성장해야 하고, 따라서, 분열촉진 자극 및 성장 인자의 존재에 의존한다.
자궁내막증의 치료를 위해, 현재 다음과 같은 접근법이 존재한다:
a) 성선 자극 호르몬-방출 호르몬 (GnRH) 유사체: 난소 에스트라디올 합성의 억제를 유발하고, 성장을 위해 에스트라디올의 존재에 크게 의존하는 이소성 자궁내막증 이식물의 위축을 유도한다.
b) 아로마타제 억제제: 자궁내막증 이식물에 의한 에스트라디올의 국소 생산을 억제하고, 아폽토시스를 유도하고, 이소성 자궁내막증 단편의 증식을 억제한다.
c) 선택적 에스트로겐 수용체 조절자: 정상 자궁내막 및 이소성 이식물에서 에스트로겐 수용체 길항 활성을 갖고, 따라서 이식된 이소성 자궁내막증 조직의 위축을 유발한다.
d) 프로게스테론 수용체 효능제: 정상 및 이소성 자궁내막 세포의 증식을 억제하고, 분화 및 아폽토시스를 유도한다.
e) 조합 경구 피임제: 현재 상태를 유지하고, 질환 진행을 방지하고, 이소성 및 정상 자궁내막의 위축을 유도한다.
f) 병변의 외과적 절제.
GnRH 유사체, SERM, 및 아로마타제 억제제는 심각한 부작용을 가지며, 자궁내막증으로 고통받는 젊은 여성에서 안면 홍조 및 골 소실을 유발한다. 프로게스테론 수용체 효능제를 사용한 치료는 배란 억제, 불규칙적인 월경 후의 무월경, 체중 증가 및 우울증을 유발한다. 정맥 혈전증의 증가된 위험 때문에, 조합 경구 피임제는 35세 초과의 여성, 흡연자 및 과체중으로 고통받는 개체에 권고되지 않는다. 병변의 외과적 절제는 높은 재발율을 보이기 쉽다.
본 발명의 항체는 뇌하수체- 및 국소-생산된 프로락틴에 의해 또는 활성화 PRLR 돌연변이 때문에 자극된 PRLR-매개 신호전달을 저해하고, 따라서 뇌하수체 프로락틴 분비만을 저해하는 도파민-2-수용체 효능제보다 더 효과적이다.
따라서, 본 발명의 목적은 의약으로서의 항체 006-H08 또는 항원-결합 단편이다.
PRL 및 PRLR은 자궁에서 발현되고, 정상 자궁 생리에서 기능을 수행한다; PRL은 효능있는 미토겐으로서 작용하고, 면역조정 역할을 수행한다. 본 발명에서, PRL/PRLR 시스템의 변경이 인간 자궁내막증에서 일정 역할을 수행함이 밝혀졌다. 정량적 택맨(Taqman) PCR에 의한, 건강한 여성의 자궁내막 및 환자의 자궁내막 및 병변에서 PRL 및 PRLR의 발현의 분석 (실시예 2 참조)은 도 1 및 2에 제시된다.
도 1 (PRL 발현) 및 도 2 (PRLR 발현)에서 입증된 바와 같이, PRL과 그의 수용체는 모두 자궁내막증 병변에서 크게 상향조절된다. 이 발견은 자가분비성 PRL 신호전달이 자궁내막증 병변의 확립, 성장, 및 유지에서 근본적인 역할을 수행할 수 있다는 실험상 증거를 처음으로 제시한다.
PRLR 항체는 내자궁내막증의 동물 모델, 즉 자궁선근증 마우스에서 성공적으로 시험되었다 (실시예 20 참조). 자궁선근증은 자궁내막의 자궁근층 내의 자궁내막선의 침윤 성장을 특징으로 한다. 이것은 자궁에 제한된 자궁내막증 형태와 유사하고 - 자궁내막증 비-월경 종의 유일한 형태가 발생할 수 있다. 자궁내막증으로 고통받는 환자의 임상 치료에 효과적인 다나졸이 또한 자궁선근증의 치료에 효과적이다 (Life Sciences 51:1119-1125, 1992). 그러나, 다나졸은 안드로겐성 프로게스틴이고, 젊은 여성에서 심각한 안드로겐성 부작용을 유발하고, 그에 따라 사용이 제한된다.
본 발명의 항체는 자궁내막증의 새로운 치료 또는 예방법의 제공이라는 문제를 해결하고, 현재의 표준 요법보다 작은 부작용을 보인다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은 자궁내막증 및 자궁선근증 (내자궁내막증)의 치료 또는 예방을 위한 중화 PRLR 항체 및 항원-결합 단편을 사용하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 자궁내막증 및 자궁선근증 (내자궁내막증)의 치료 또는 예방을 위한, 본 발명에서 기재되는 항체 및 항원-결합 단편의 용도이다.
비- 호르몬성 여성 피임제
현재의 여성 피임 접근법은 다음과 같다:
a) 에스트로겐 및 프로게스틴을 함유하는 조합 경구 피임제.
프로게스토겐 성분은 시상하부-뇌하수체-성선축에 대한 음성 피드백을 통해 피임 효과를 매개한다. 에스트로겐 성분은 양호한 출혈 제어를 보장하고, 표적 세포에서 프로게스테론 수용체의 유도를 통한 게스타겐 작용을 증강시킨다.
b) 프로게스틴만을 함유하는 자궁내 장치.
국소 방출 프로게스틴은 자궁내막을 착상 저항 상태로 만든다. 또한, 경관 점막은 정자 세포에 대해 거의 불투과성으로 된다.
c) 프로게스틴만을 함유하는 환제 및 이식물.
프로게스틴은 시상하부-뇌하수체-성선축에 대한 음성 피드백을 통해 배란을 억제한다. 또한, 정자 세포에 대한 경관 점막의 투과성이 감소한다.
d) 에티닐에스트라디올 + 프로게스틴을 함유하는 질내 고리.
조합 경구 피임제의 주요 부작용은 정맥 혈전증 (VTE)에 대한 위험 증가이다. 또한, 과체중 또는 흡연 여성, 및 자가면역 질환, 예컨대 루푸스로 고통받는 여성 및 35세 초과의 여성은 경구 조합 피임제를 사용할 수 없다.
프로게스틴만을 함유하는 자궁내 장치 및 이식물은 기능장애 자궁 출혈을 유발할 수 있다.
프로게스틴만을 함유하는 환제는 불규칙적인 출혈 패턴, 점상 출혈, 무월경을 야기할 수 있다. 자궁외 임신 위험이 증가한다. 체중 증가 및 골 질량 밀도의 감소가 추가의 부작용이다.
질내 고리는 질염, 백대하 또는 만출 (expulsion)을 야기할 수 있다.
PRLR-결핍 마우스는 수년 전에 생성되었다 (Genes Dev 11:167-178, 1997). 흥미롭게도, PRLR-결핍 암컷은 완전히 불임이지만, 수컷 마우스는 그렇지 않다. PRLR-/- 암컷은 수정 직후 난자 발생의 정지를 보였는데, 즉, 이 암컷은 착상전 발생의 정지를 보였다. 극히 일부의 난모세포만이 포배기에 도달하였고, 돌연변이체 암컷에서 착상될 수 없었지만, 이식 후에 야생형 대리모 암컷에서 정상 배아로 발달하였다. PRLR-결핍 마우스의 불임 표현형은 임신 중기까지 프로게스테론 보충에 의해 회복될 수 있다. 분명하게, PRLR-매개 신호전달은 임신 허용 및 유지에 필요한 프로게스테론을 생산하는 황체의 유지 및 기능에서 중요한 역할을 수행한다. 또한, PRLR-결핍 암컷은 복부 지방 질량 및 렙틴 수준의 감소와 연관된 체중 감소를 보였지만, 수컷은 그렇지 않았다.
지금까지, 어떠한 불활성화 인간 PRLR 돌연변이도 알려져 있지 않고, 따라서, 인간 생식력에서 PRLR-매개 신호전달의 정확한 역할은 여전히 미지의 상태이다. 그러나, 또한 인간에서, 최소의 프로락틴 수준이 성공적인 임신을 허용하기 위해 필요하다는 증거가 증가하고 있다. 고프로락틴혈증성 황체 부족에 의해 원발성 불임으로 고통받는 환자는 브로모크립틴으로 치료되었다. 몇몇의 경우에, 프로락틴 수준은 과다억제되고, 다시 재발생한 황체기를 단축하였다 (Bohnet HG et al., in Lisuride and other dopamine agonists edited by D.B. Calne et al., Raven Press, New York, 1983). 상기 데이터로부터, 고- 및 저프로락틴혈증성 상태가 여성 생식력을 부정적으로 저해한다고 결론지었다. 이것은 PRL과 그의 수용체의 상호작용에 의해 설명될 수 있다. 낮은 프로락틴 수준의 경우에, 충분한 수용체 활성화가 존재하지 않지만, 고프로락틴혈증의 경우에도 충분한 수용체 활성화가 존재하지 않고, 그 이유는 모든 수용체가 하나의 프로락틴 분자에 의해 차단되고, 더이상 이량체화될 수 없기 때문이다. 즉, 프로락틴에 대한 용량 반응은 종형 (bell-shaped)이고, 최적 수용체 활성화는 특정 농도 범위에서만 달성된다. 환자에 자궁내막 프로락틴 발현의 결여가 조기 이식 실패를 야기한다는 제2 연구로부터의 증거가 존재한다 (Human Reprod. 19:1911-1916, 2004). 또한, 생체 외에서, 프로락틴은 배양된 인간 과립층 세포의 아폽토시스를 억제할 수 있고, 따라서 PRLR-결핍 마우스에서 입증된 바와 같이 초기 황체 기능을 유지하는 것으로 밝혀졌다 (Human Reprod. 18:2672-2677, 2003).
중화 PRLR 항체의 피임 효능을 시험하기 위해, 마우스에게 특이적 및 비특이적 PRLR 항체를 주사하고, 실시예 11에서 설명되는 바와 같이 수컷과 교배시켰다. 판독은 처리군당 한배새끼수 및 동물당 한배새끼 수이었다. 도 11에 제시된 실험은 본 발명의 중화 항체 처리에 의해, 30 mg/kg (체중)으로 시험할 때 마우스에서 임신이 완전히 방지됨을 보여준다.
상기 언급된 표준 접근법에 비해, 중화 PRLR 항체를 사용한 여성 피임은 몇 가지의 이점을 갖는다:
- 항체는 흡연, 과체중, 및 나이든 여성 및 홍반성 루푸스로 고통받는 여성에서 사용될 수 있다 (PRLR 항체는 심지어 루푸스 치료 및 복부 지방의 감소를 위해 유익할 수 있는데, 즉, PRLR-결핍 마우스는 보다 적은 복부 지방을 가졌다).
- PRLR 항체는 VTE (정맥 혈전증) 위험을 증가시키지 않는다
- 조합 경구 피임에 사용되는 에스트로겐 및 프로게스틴과 대조적으로, PRLR-매개 신호전달의 중화는 유방 상피 증식의 억제를 유도하고, 생식력 제어를 위한 호르몬 접근법과 대조적으로 심지어 사용자를 유방암으로부터 보호할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 표준 치료에 비해 부작용이 감소된 여성 피임을 위한, PRLR-중화 PRLR 항체 및 항원-결합 단편의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 표준 치료에 비해 부작용이 감소된 여성 피임을 위한, 본 발명에서 기재되는 항체 및 항원-결합 단편의 용도이다.
양성 유방 질환 및 유방통
양성 유방 질환은 다양한 증상, 예컨대 섬유낭성 유방 질환, 섬유선종, 유방통, 및 대포낭을 포함한다. 30 - 50%의 폐경전 여성은 섬유낭성 유방 질환으로 고통받는다 (Epidemiol Rev 19:310-327, 1997). 여성의 연령에 따라, 양성 유방 질환은 별개의 표현형을 나타낼 수 있고 (J Mammary Gland Biol Neoplasia 10:325-335, 2005): 초기 생식기 (15 - 25세) 동안 정상 유방에서 소엽성 발달이 일어날 때, 양성 유방 질환은 섬유선종을 야기한다. 단일 거대 섬유선종 및 다수의 선종이 관찰된다. 이러한 섬유선종은 간질 및 상피 세포로 이루어지고, 소엽으로부터 발생한다. 성숙 생식기 (25 - 40세)에, 유방은 각각의 월경 주기 동안 주기적인 변화를 겪는다. 이환된 여성은 주기적인 유방통 및 그의 유방 내의 몇몇의 소괴를 보인다. 보다 후기에 (35 - 55세), 정상 유방은 정상 상태로 회복되지만, 이환된 유방에서는 이형성을 보이거나 보이지 않으면서 대포낭 및 상피 비후가 관찰될 수 있다. 증강된 상피 세포 증식이 수반되는 상기 형태의 양성 유방 질환은 보다 높은 유선 암종 발생 위험을 갖는다. 상기 위험은 세포 이형성이 증식 세포 부분에 존재할 경우 11%까지일 수 있다 (Zentralbl Gynaekol 119:54-58, 1997). 또한, 60 - 80세의 여성의 25%는 양성 유방 질환으로 고통받고, 종종 에스트로겐 대체 요법 또는 지방축적이 폐경 후에 양성 유방 질환이 지속되는 이유이다 (Am J Obstet Gynecol 154:161-179, 1986).
섬유낭성 유방 질환의 병리생리학은 선택적인 (facultative) 상피 세포 증식이 뒤따르는 연결 조직의 과다증식 (섬유증)을 야기하는 에스트로겐 우세 및 프로게스테론 결핍에 의해 결정된다. 이미 언급한 바와 같이, 유방암의 위험은 섬유낭성 병소 내의 증강된 상피 세포 증식을 보이는 환자에서 상승한다. 임상적으로 섬유낭성 유방 질환은 유방 통증 및 유방 압통을 보인다. 섬유낭성 유방 질환 환자의 70%는 황체 부족 또는 무배란으로 고통받는다 (Am J Obstet 154:161-179, 1986). 황체 부족은 감소된 프로게스테론 수준 및 에스트로겐 우세를 야기한다.
유방통 (유방 통증)은 약 70%의 여성에서 그의 생식 수명 내 언젠가에 발생한다. 유방 통증은 월경전 증후군의 다른 기준과 연관되거나 되지 않을 수 있다. 유방통으로 고통받는 여성은 시상하부 뇌하수체축의 자극 후에 과량의 프로락틴 방출로 반응함이 입증되었다 (Clin Endocrinol 23:699-704, 1985).
양성 유방 질환 및 유방통의 표준 요법은 다음과 같다:
1) 브로모크립틴
도파민 효능제로서 브로모크립틴은 뇌하수체 프로락틴 합성만을 차단하고, 유선 상피 세포에서 프로락틴의 국소 합성은 차단하지 않는다. 따라서, 이것은 상승된 전신 프로락틴 수준에 의존하는 유방통 및 양성 유방 질환의 형태에서만 효과적이다. 브로모크립틴의 주요 부작용은 다음과 같다: 메스꺼움, 구토, 부종, 저혈압, 현기증, 탈모, 두통, 및 환상.
2) 다나졸
다나졸은 그의 항성선 자극 활성을 통해 양성 유방 질환에서 관찰되는 에스트로겐 우세를 상쇄하는 안드로겐성 프로게스틴이다. 주요 부작용은 다음과 같다: 불규칙적인 월경, 우울증, 여드름, 다모증, 낮고 굵은 목소리 (voice deepening), 및 안면 홍조 및 체중 증가.
3) 타목시펜
타목시펜은 유방에서 항에스트로겐 활성 및 자궁에서 에스트로겐 활성을 갖는 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자이다. 주요 부작용은 다음과 같다: 폐경후 증상, 예컨대 골 소실 및 안면 홍조, 난소낭, 및 자궁내막 암종.
4) 프로게스틴
프로게스틴은 뇌하수체 성선축의 억제, 배란 억제 및 에스트로겐 고갈을 통해 양성 유방 질환을 억제한다. 에스트로겐 고갈은 폐경 증상, 예컨대 골 소실 및 안면 홍조를 야기한다.
5) 저용량 조합 경구 피임제.
상기 치료제는 35세 초과의 여성, 흡연 및 당뇨병 및 과체중 환자에서 권고되지 않는다.
일반적으로, 프로락틴 수준은 양성 유방 질환이 있는 여성의 1/3에서 증가하는 것으로 밝혀졌다. 에스트로겐은 뇌하수체 프로락틴 분비를 증가시키기 때문에, 혈청 프로락틴 수준의 증가는 상기 질환에서 에스트로겐 우세의 결과로 생각되었다. 활성화 PRLR 돌연변이가 섬유낭성 유방 질환의 아형과 유사한 다발성 유방 선종으로 고통받는 여성에 종종 존재하는 것으로 보고되었다 ([Paul Kelly, Breast Congress Turin, 2007] 및 [Proc Natl Acad Sci 105: 14533-14538; 2008]).
양성 유방 질환, 유방통 및 월경전 유방 긴장은 하나의 공통의 병리생리학적 메카니즘, 즉 증강된 프로락틴 신호전달에 기인한다. 프로락틴 신호전달의 상승은 다음의 결과일 수 있다:
- 전신성 고프로락틴혈증 (뇌하수체 선종에 의한)
- 국소 고프로락틴혈증 (증식 유선 상피 세포에서 프로락틴 합성에 의한). 국소 고프로락틴혈증은 혈액 내의 상승된 프로락틴 수준으로 이어지지 않는다.
- 정상 프로락틴 수준의 존재 하에 구성적으로 활성인 PRLR 신호전달 (활성화 PRLR 돌연변이에 의한).
특정 형태의 양성 유방 질환이 유방암을 야기할 수 있음을 고려할 때, 상기 질환의 치료를 위한 의학적 필요성이 존재한다.
양성 유방 질환의 전임상 모델에서 중화 PRLR 항체의 효능을 입증하기 위해, 전신성 고프로락틴혈증을 기초로 한 마우스 모델을 사용하였다. 성체 Balb/c 마우스에게 실시예 16에서 설명되는 바와 같이 신장 피막 아래에 뇌하수체 동종이식편을 이식하였다 (In: Methods in Mammary gland Biology and Breast Cancer Research, 101-107, 2000). 전신성 고프로락틴혈증은 비처리 처녀 대조군 마우스에 비해 유선에서 증강된 상피 세포 증식을 유발하였고, 측지 형성 (sidebranching) 및 소엽 폐포 발생을 자극하였다. 암 발생의 증강된 위험을 갖는 인간 섬유낭성 유방 질환의 가장 심각한 형태는 증가된 상피 세포 증식을 특징으로 한다. 실시예 16에서 설명되는 바와 같이, 상기 Balb/c 마우스 모델에서 중화 PRLR 항체를 다음과 같은 그의 능력에 대해 비특이적 항체와 비교하여 시험하였다:
- 측지 형성 및 소엽폐포 발생의 차단
- 유선 상피 세포 증식의 억제
- PRLR 활성화 후에 정상적으로 활성화되고 인산화되는 전사 인자인 STAT5의 인산화 억제.
도 15a-c에 도시된 바와 같이, 중화 PRLR 항체는 상기 언급된 모든 판독 패러다임을 용량-의존성 방식으로 차단한다.
본 발명의 또 다른 목적은 폐경전 및 폐경후 여성에서 양성 유방 질환 및 유방통의 치료를 위한 중화 PRLR 항체 또는 항원-결합 단편의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 폐경전 및 폐경후 여성에서 양성 유방 질환 및 유방통의 치료를 위한, 본 발명에서 기재되는 항체 또는 항원-결합 단편의 용도이다.
젖분비 억제
프로락틴은 출산 후 젖분비에 관여하는 주요 호르몬이다. 이것은 PRLR-결핍 마우스의 표현형에 의해 증명된다. 심지어 이형접합성 마우스도 심각한 젖분비 문제를 갖고, 그의 새끼에게 젖을 완전히 먹일 수 없다 (Frontiers in Neuroendocrinology 22:140-145, 2001).
많은 이유, 즉 모체의 잠재적으로 유아에게 위험한 약물 복용, 심각한 감염 (유선염, 신염), 다량의 분만후 출혈, 및 심각한 모체 질환, 예컨대 당뇨병, 암종, 및 쇠약 또는 신생아의 질환 때문에, 여성은 수유를 중지하여야 한다. 현재, 도파민 수용체 효능제, 예컨대 브로모크립틴 및 리수라이드가 출산후 젖분비 억제를 위해 사용된다. 그러나, 상기 화합물은 심각한 부작용, 예컨대 메스꺼움, 구토, 부종, 저혈압, 현기증, 탈모, 두통, 및 환상을 유발할 수 있다. 또한, 도파민 수용체 효능제는 심혈관 질환 및 고혈압으로 고통받는 여성에서 권고되지 않는다. 브로모크립틴의 추가의 단점은 그의 짧은 반감기로서, 이는 14일에 걸쳐 매일 4-6회의 약물 복용을 필요로 한다.
마우스에서 중화 프로락틴 수용체 항체의 효능을 시험하기 위해, NMRI 마우스를 수컷과 교배시켰다. 출산 후에, 한배새끼 수를 8마리의 동물로 조정하고, 암컷을 실시예 15에서 설명되는 바와 같이 PRLR에 대해 작용하는 특이적 및 비특이적 항체로 처리하였다. 모체의 젖분비 능력의 척도로서, 새끼의 체중을 매일 모니터링하였다. 판독은 실시예 15에서 상세히 기술되어 있고, 결과는 도 14a-d에 제시되어 있다. 중화 PRLR 항체는 젖분비의 용량-의존성 억제를 보이고, 유선 퇴화 및 감소된 유단백질 생산을 유도한다.
본 발명의 또 다른 목적은 젖분비의 억제를 위한, 중화 PRLR 항체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 목적은 젖분비의 억제를 위한, 본 발명에서 기재되는 항체 006-H08 및 항원-결합 단편의 용도이다.
양성 전립선 비대증
양성 전립선 비대증 (BPH)은 나이 많은 남성에서 네번째로 가장 많이 발생하는 병태이다. 전립선 비대증은 50세 이상의 남성의 50% 초과에서 이환되는 연령-의존성의 진행성 병태이다. BPH는 전립선 간질 및 상피 세포의 비후를 특징으로 하고, 이것은 요도관을 압박하는 전립선의 요도 주위 영역에 큰 별개의 소괴 형성을 야기한다. 따라서, 요류 (urine flow)의 손상은 BPH의 주요 결과의 하나이다.
BPH에 대한 표준 요법은 다음을 포함한다:
a) α1-아드레날린성 수용체 길항제 (예를 들어, 탐술로신, 알푸조신, 테라조신, 독사조신)는 하부 요로에서 BPH 증상을 경감한다. 이들은 전립선 평활근의 알파-수용체-매개 자극을 차단함으로써 방광 배출로 폐색을 감소시킨다. 주요 부작용은 혈관확장성 유해 사례, 현기증 및 사정 장애이다.
b) 5α-리덕타제 억제제 (예를 들어, 피나스테리드)
5α-리덕타제 억제제는 전립선의 확대를 책임지는, 전립선 내의 테스토스테론의 활성 형태인 디히드로테스토스테론의 형성을 방지한다. 주요 부작용은 성기능장애, 예컨대 발기 장애 및 성욕 감퇴이다.
c) 전립선의 요도경유 절제술 (TURP)
이 수술 치료법은 높은 이환율과 연관된다. 부작용은 출혈, 실금, 협착 형성, 사정 상실, 및 방광 천공이다.
d) 전립선 스텐트 유치법
스텐트는 적절한 요류를 보장하기 위해 요도의 전립선 부분 내로 삽입된다. 주요 부작용은 증피, 요로 감염, 및 스텐트의 이동이다. 또한, 스텐트는 임의의 요도 경유 조작 전에 제거되어야 한다.
유선에 대해 설명한 바와 같이, PRL 및 PRLR은 전립선 내에서 자가분비/측분비 방식으로 작용한다 (J. Clin. Invest. 99:618 pp, 1997).
임상 연구는 고프로락틴혈증 (및 말단비대증)은 전립선 비대증 및 염증 세포의 간질 축적과 연관됨을 보여준다. 인간 성장 호르몬은 아연의 존재 하에 인간 PRLR에 결합할 수 있고, 이것은 말단비대증이 양성 전립선 비대증을 야기할 수 있는 이유를 설명할 수 있다. PRL 혈청 수준은 종종 BPH 환자에서 상승된다.
PRL 유전자를 도처에서 발현하는 트랜스제닉 동물은 심각한 간질 전립선 비대증을 발달시키고, 이것은 PRL이 전립선 비대증의 발생을 위한 중요한 병리생리학적 요인임을 나타낸다 (Endocrinology 138:4410 pp,1997). 또한, 전립선 특이적 프로바신 프로모터 하에 트랜스제닉 마우스에서 PRL의 국소 과다발현은 인간 BPH의 기본적인 특징인 간질 확대, 염증 세포의 축적 및 국소 상피 이형성을 야기한다 (Endocrinology 144:2269 pp,2003).
PRLR은 전립선에서 고도로 발현된다 (실시예 3, 도 3). PRLR 단백질 발현의 변이는 호르몬 고갈 및 치료 후에 래트 전립선 조직에서 관찰되었다 (실시예 4, 도 4). PRLR 이외에, 전립선 세포는 프로락틴도 발현한다.
실시예 17에서 설명되는 바와 같이, 수컷 Balb/c 마우스에게 신장 피막 아래에 뇌하수체 동종이식편을 이식하고, 양성 전립선 비대증을 발생시켰다. 중화 프로락틴 수용체 항체 및 비특이적 항체의 양성 전립선 비대증에 대한 효과를 상기 모델에서 시험하였다. 판독 패러다임은 실시예 17에서 설명된다. 도 16에 도시되는 바와 같이, 중화 PRLR 항체는 양성 전립선 성장을 억제하고, 따라서 양성 전립선 비대증의 치료에 적합하다.
본 발명의 또 다른 목적은 양성 전립선 비대증의 치료를 위한, 중화 PRLR 항체 또는 항원-결합 단편의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 양성 전립선 비대증의 치료를 위한, 본 발명에서 기재되는 항체 또는 항원-결합 단편의 용도이다.
고프로락틴혈증성 탈모
탈모는 여전히 그 치료 필요성이 충족되지 않고 있다. 두발 성장 주기: 성장기는 활발한 모발 성장을 특징으로 하고, 퇴행기는 퇴화를 보이고, 이어서 휴지기 (휴지)가 온다. 탈락기 (죽은 모발의 방출)는 휴지기의 종료와 동시에 발생한다. 탈모는 임의의 기에서 모발 성장의 방해의 결과일 수 있다.
휴지기 탈모는 많은 촉발 요인 (생리학적 및 정서적 스트레스, 의학적 병태, 철 및 아연 결핍)을 가질 수 있고, 중요한 사실은 안드로겐성 탈모증은 그의 초기 시기에서 휴지기 모발 빠짐 (hair shedding)을 보인다는 점이다 (Cleveland clinic journal of medicine 2009; 76:361-367). 성장기 탈모는 종종 방사선 또는 화학요법의 결과이다.
미녹시딜 및 피나스테리드는 남성형 탈모의 치료를 위해 사용되고, 글루코코르티코이드는 원형 탈모증에 사용된다. 일반적으로, 모든 상기 치료는 부작용 (피나스테리드: 남성의 성욕 상실 및 발기부전, 글루코코르티코이드: 당뇨병, 체중 증가, 골다공증)을 보이고, 탈모 치료 문제가 완전히 해결되지는 않았다.
설치류에서, 성체 동물에서 면도 실험을 사용하여, 판독 패러다임으로서 면도된 영역에서 털 재성장을 사용함으로써 탈모에 대한 화합물의 효과를 분석하였다 (British Journal of dermatology 2008; 159:300-305). 성체 동물의 면도 (대부분 휴지기의 털)는 털 성장을 특징으로 하는 성장기를 유도한다.
실시예 17에서 설명되는 실험 (양성 전립선 비대증)에서, 뇌하수체 동종이식편을 이식한 동물을 면도하였다. 상기 실험 과정에서, 예기치 않게 뇌하수체 동종이식편을 이식한 동물은 면도된 영역에서 털 재성장의 심각한 손상을 보임이 발견되었다. 중화 PRLR 항체는 털 성장을 자극하였지만, 비특이적 항체는 그렇지 않았다 (도 17). 이 관찰은 프로락틴 수용체-매개 신호전달의 상승이 탈모에 관련됨을 입증한다. 이를 보다 상세하게 분석하기 위해서, 이전에 설명한 실험과 매우 유사한 추가의 면도 실험을 수행하였다 (British Journal of dermatology 2008; 159:300-305). 상기 추가의 면도 실험은 실시예 18에 기재되어 있다. 실험은 중화 PRLR 항체가 고- 및 정상 프로락틴혈증 수컷 및 암컷 마우스에서 털 성장을 자극함을 보여준다.
본 발명의 항체는 여성 및 남성에서 고- 및 정상 프로락틴혈증성 탈모에 대한 새로운 치료제의 제공이라는 문제를 해결한다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은 고- 및 정상 프로락틴혈증성 탈모의 치료 또는 예방을 위해 중화 PRLR 항체 또는 항원-결합 단편을 사용하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 고프로락틴혈증성 탈모의 치료 또는 예방을 위한, 본 발명에서 기재되는 항체 또는 항원-결합 단편의 용도이다.
조합 호르몬 요법
자궁을 계속 갖는 폐경후 여성의 안면 홍조를 치료하기 위해, 에스트로겐 (에스트라디올, 또는 접합된 말 에스트로겐 = CEE) 및 프로게스틴 (예를 들어 메드록시프로게스테론 아세테이트 (MPA), 프로게스테론, 드로스피레논, 레보노르게스트렐)의 조합물이 사용되었다. 프로게스틴은 에스트라디올-활성화된 자궁 상피 세포 증식을 억제하기 위해 첨가되어야 한다. 그러나, 프로게스틴의 첨가는 유선 상피 세포 증식을 증가시킨다. 정상 및 암성 유선 상피 세포 둘 모두가 에스트로겐 + 프로게스틴 조합 치료에 대해 증식으로 반응하기 때문에, 상대적인 유방암 위험은 CEE + MPA 치료 후에 증가되는 것으로 밝혀졌다 (JAMA 233:321-333; 2002).
중화 PRLR 항체는 조합 호르몬 요법 하에 여성에게 매달 또는 격월로 투여될 때 증강된 유방 상피 세포 증식을 억제할 것이다.
실시예 19에서 설명되는 바와 같이, 자궁 및 유방에서 프로게스틴 효과의 정량적 분석을 위한 이전에 개발된 마우스 모델이 사용되었다 (Endocrinology 149:3952-3959, 2008). 마우스를 난소절제하고, 난소절제 14일 후에 3주 동안 비히클 또는 호르몬 대체 요법을 모방하는, 100 ng 에스트라디올 + 100 mg/kg 프로게스테론을 처리하였다. 동물을 특이적 PRLR (10 mg/kg 또는 30 mg/kg) 또는 비특이적 항체 (30 mg/kg)로 매주 1회 처리하였다. 조합 호르몬 요법 하에 유방에서 증식 활성에 대한 중화 PRLR 항체의 효과를 분석하였다.
본 발명의 항체는 조합 호르몬 요법 하에 관찰된 증강된 유방 상피 세포 증식의 치료라는 문제를 해결한다.
본 발명의 또 다른 목적은 유선 상피 세포 증식을 억제하기 위한, 조합 호르몬 요법 (즉, 에스트로겐 + 프로게스틴 요법)에서 중화 PRLR 항체 또는 항원-결합 단편의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 유선 상피 세포 증식을 억제하기 위한, 조합 호르몬 요법 (즉, 에스트로겐 + 프로게스틴 요법)에서 본 발명에서 기재되는 항체 또는 항원-결합 단편의 용도이다.
정의
표적 항원 인간 "PRLR"은 본원에서 사용되는 바 서열 70의 아미노산 위치 1 내지 210과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 그의 세포외 도메인에 갖는 인간 폴리펩티드 및 그의 천연 생성 대립유전자 및/또는 스플라이스 변이체를 의미한다. "PRLR의 ECD"는 본원에서 사용되는 바와 같이 상기 언급된 아미노산에 의해 제시되는 PRLR의 세포외 부분을 의미한다. 또한, 표적 인간 PRLR은 수용체의 돌연변이된 버전, 예컨대 폴 켈리(Paul Kelly) (문헌 [Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38): 14533-14538, 2008]; 및 튜린(Turin)에서의 구두 발표 (2007))에 의해 설명된 활성화 돌연변이 I146L을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 구문 "치료 유효량"은 요구되는 치료법에 따라 투여될 때 질환의 몇몇 또는 모든 상기 증상의 완화 또는 질환에 대한 소인의 감소를 비롯하여 요구되는 치료 또는 예방 효과 또는 반응을 유도하기에 적절한 치료 또는 예방 항체의 양을 나타내도록 의도한 것이다.
본원에서 사용되는 바, 결합 특이성은 절대적인 것이 아니라 상대적인 특성이기 때문에, 항체가 항원 (여기서, PRLR) 및 하나 이상의 참조 항원(들)을 식별할 수 있다면, 상기 항체는 상기 항원에 "특이적으로 결합"하거나, "특이적"이거나 또는 이를 "특이적으로 인식"한다. 그의 가장 일반적인 형태에서 (및 규정된 문헌이 언급되지 않을 때), "특이적 결합"은 예를 들어 다음 방법 중의 하나에 따라 결정되는, 관심있는 항원과 비관련 항원을 식별하는 항체의 능력을 나타낸다. 그 방법은 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-시험 및 펩티드 스캔을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 표준 ELISA 검정을 수행할 수 있다. 평가는 표준 발색에 의해 수행될 수 있다 (예를 들어, 2차 항체와 양고추냉이 과산화물 및 테트라메틸 벤지딘과 과산화수소). 특정 웰 내의 반응은 예를 들어 450 nm에서의 광학 밀도에 의해 평가된다. 전형적인 배경 (=음성 반응)은 0.1 OD일 수 있고; 전형적인 양성 반응은 1 OD일 수 있다. 이것은 양성/음성 차이가 10배 초과일 수 있음을 의미한다. 일반적으로, 결합 특이성의 결정은 단일 참조 항원이 아니라, 약 3 내지 5개의 비관련된 항원, 예컨대 우유 분말, BSA, 트랜스페린 등의 조합을 사용하여 수행된다. 그러나, "특이적 결합"은 또한 표적 항원과 참조 포인트로서 사용되는 하나 이상의 밀접하게 관련된 항원(들)을 식별하는 항체의 능력을 나타낼 수 있다. 추가로, "특이적 결합"은 그의 표적 항원의 상이한 부분, 예를 들어, PRLR의 상이한 도메인, 하위도메인 또는 영역, 예컨대 PRLR의 ECD의 N-말단 또는 C-말단 영역 내의 에피토프, 또는 PRLR의 ECD의 하나 이상의 핵심 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 스트레치를 식별하는 항체의 능력에 관련될 수 있다.
"친화도" 또는 "결합 친화도" KD는 종종 평형 회합 상수 (ka) 및 평형 해리 상수 (kd)의 측정 및 ka에 대한 kd의 몫을 계산함으로써 결정된다 (KD = kd/ka). 용어 "면역특이적" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체가 10-6 M 미만 또는 이와 동일한 친화도 KD (1가 친화도)로 PRLR 또는 그의 ECD에 결합함을 의미한다. 용어 "고 친화도"는 항체가 10-7 M 미만 또는 이와 동일한 친화도 KD (1가 친화도)로 PRLR 또는 그의 ECD에 결합함을 의미한다. 항체는 다른 비관련된 분자에 비해 표적 항원에 대한 실질적으로 보다 큰 친화도를 가질 수 있다. 또한, 항체는 상동체에 비해 표적 항원에 대한 실질적으로 보다 큰 친화도, 예를 들어, 적어도 1.5배, 2배, 5배, 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 106배 또는 이보다 더 큰 상대적인 친화도를 가질 수 있다. 상기 친화도는 통상적인 기법을 사용하여, 예컨대 평형 투석에 의해; 제조자에 의해 제시된 일반적인 절차를 사용하여 비아코어 2000 기기의 사용에 의해; 방사성 표지된 표적 항원을 사용한 방사성면역검정에 의해; 또는 당업자에게 공지된 또 다른 방법에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 친화도 데이터는 예를 들어 문헌 [Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949)]의 방법에 의해 분석될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 구문 "항체가 프로락틴 매개 신호전달에 대해 길항작용을 한다"는 프로락틴 수용체 매개 신호전달의 완전한 억제를 야기하는, 본 발명의 항체에 의한 프로락틴 수용체 활성화의 차단을 나타내도록 의도된 것이다.
본원에서 사용되는 바, 구문 "항체가 결합을 위해 경쟁한다"는 프로락틴 수용체에 대한 결합에 있어, 하나의 항체와 제2 항체 또는 보다 많은 항체 사이의 경쟁을 나타내도록 의도된 것이다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 완전히 조립된 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 항원에 결합할 수 있는 항체 단편 (예를 들어, Fab', F'(ab)2, Fv, 단일쇄 항체, 디아바디 (diabody)), 캐멀 바디 (camel body) 및 요구되는 생물학적 활성을 보이는, 전술한 것을 포함하는 재조합 펩티드를 포함한다. 항체는 바람직하게는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 이소형으로부터 유래되는 그의 중쇄 상에 상이한 불변 도메인 (Fc 도메인)을 보유할 수 있다 (아래 참조). 효과기 기능의 변형을 위한 돌연변이가 도입될 수 있다. 보체 단백질 C1q 및 Fc 수용체와의 상호작용에서 우세한 역할을 수행하는 Fc-도메인 내의 아미노산 잔기가 확인되었고, 효과기 기능에 영향을 주는 돌연변이가 설명되어 있다 (개관을 위해 문헌 [Labrijn et al., Current opinion in Immunology 20:479-485, 2008]을 참조). 특히, IgG1의 비글리코실화는 아미노산 위치 297에서 아스파라긴을 알라닌으로 또는 아스파라긴을 글루타민으로 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있는데, 이는 항체-유래 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 폐지하는 것으로 보고된 바 있다 ([Sazinsky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 105 (51): 20169, 2008]; [Simmons et al., J. of Immunological Methods 263: 133-147, 2002]). 위치 322에서 리신을 알라닌으로 교체하면, ADCC가 감소하고 보체-유래 세포독성 (CDC)이 제거되고, 위치 234 및 235에서 2개의 류신을 알라닌으로 동시에 교체하면 ADCC 및 CDC가 방지된다 [Hezareh et al., J. of Virology, 75 (24):12161-12168, 2001]. IgG4 이소형을 결합력을 보유하는 2가 치료제로서 생체내에서 적용하기 위해서, '코어 힌지 영역' 내의 변형, 예컨대 세린-대-프롤린 교환 (Schuurman, J. et al., Immunology 97: 693-698, 1999)을 도입할 수 있다. 인간 IgG2 분자가 불균일 공유 이량체를 형성하는 경향은 위치 127, 232 및 233에서 시스테인 중의 하나를 세린으로 교체함으로써 방지될 수 있다 (Allen et al., Biochemistry, 2009, 48 (17), pp 3755-3766). 효과기 기능이 감소된 다른 포맷은 4개의 IgG4-특이적 아미노산 잔기 변화를 보유하는 IgG2로부터 유래된 IgG2m4 포맷일 수 있다 (An et al., mAbs 1(6), 2009). 항체 단편은 재조합 DNA 기법 또는 무손상 항체의 효소에 의한 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있고, 이는 아래에서 추가로 설명된다. 모노클로날 항체의 비제한적인 예는 각각 아래에서 추가로 설명되는 뮤린, 키메라, 인간화, 인간, 및 휴먼 엔지니어드 (Human Engineered)™ 이뮤노글로불린, 항체, 이뮤노글로불린으로부터 유래된 서열을 갖는 키메라 융합 단백질, 또는 뮤테인 (mutein) 또는 그의 유도체를 포함한다. 화학적으로 유도체화된 항체를 비롯하여 무손상 분자 및/또는 단편의 다량체 또는 응집체가 고려된다.
용어 "모노클로날 항체"는 본원에서 사용되는 바 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미하는데, 즉, 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는, 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대해 작용한다. 또한, 이와 대조적으로, 통상의 (폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 포함하고, 여기서 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 작용한다. 그의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 균일한 배양액에 의해 합성되고, 상이한 특이성 및 특성을 갖는 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
변경 표현 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 것이라는 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 해석하지 않아야 한다. 예를 들어, 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495, 1975]에 처음 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 재조합, 키메라, 인간화, 인간, 휴먼 엔지니어드™, 또는 항체 단편일 수 있다.
"이뮤노글로불린" 또는 "천연 항체"는 사량체 당단백질이다. 천연 생성 이뮤노글로불린에서, 각각의 사량체는 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 사슬의 아미노-말단부는 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 "가변" 영역을 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시-말단부는 효과기 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 규정한다. 이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 중쇄는 뮤 (μ), 델타 (Δ), 감마 (γ), 알파 (α), 및 엡실론 (ε)으로 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 규정한다. 이들 중 몇몇은 서브클래스 또는 이소형, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 이소형은 상이한 효과기 기능을 갖고; 예를 들어, IgG1 및 IgG3 이소형은 종종 ADCC 활성을 갖는다. 인간 경쇄는 카파 (K) 및 람다 (λ) 경쇄로 분류된다. 경쇄 및 중쇄 내에, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조한다.
항체/이뮤노글로불린의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 항원-결합 영역을 보유하는 항체/이뮤노글로불린의 단편 (예를 들어, IgG의 가변 영역)으로서 본원에서 규정된다. 항체의 "항원-결합 영역"은 일반적으로 항체의 하나 이상의 초가변 영역(들), 즉, CDR-1, -2, 및/또는 -3 영역에서 발견되지만; 가변 "프레임워크" 영역도 예컨대 스캐폴드 (scaffold)를 CDR에 제공함으로써 항원-결합에서 중요한 역할을 할 수 있다. 바람직하게는, "항원-결합 영역"은 적어도 가변 경쇄 (VL)의 아미노산 잔기 4 내지 103 및 가변 중쇄 (VH)의 5 내지 109, 보다 바람직하게는 VL의 아미노산 잔기 3 내지 107 및 VH의 4 내지 111을 포함하고, 완전한 VL 및 VH 사슬이 특히 바람직하다 [VL의 아미노산 위치 1 내지 109 및 VH의 1 내지 113; 아미노산 위치의 넘버링은 카바트 (Kabat) 데이터베이스에 따른다 (Johnson and Wu, Nucleic Acids Res., 2000, 28, 214-218)]. 본 발명에서 사용하기 위한 이뮤노글로불린의 바람직한 클래스는 IgG이다.
용어 "초가변" 영역은 항원-결합을 담당하는 항체 또는 기능적 단편의 가변 도메인 VH 및 VL의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 CDR로부터의 아미노산 잔기 [즉, 도 12에 도시된 바와 같이 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) 및 88-97 (LCDR3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 29-36 (HCDR1), 48-66 (HCDR2) 및 93-102 (HCDR3)] 및/또는 초가변 루프로부터의 잔기 [즉, 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)]에 기재된 바와 같이 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (LCDR1 내), 50-52 (LCDR2 내) 및 91-96 (LCDR3 내) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (HCDR1 내), 53-55 (HCDR2 내) 및 96-101 (HCDR3 내)]를 포함한다.
항체 단편의 비제한적인 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 (dAb), 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일-사슬 항체 (scFv), 단일쇄 항체 단편, 디아바디, 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody), 미니바디 (minibody), 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)); 킬레이팅 재조합 항체, 트리바디 (tribody) 또는 비바디 (bibody), 인트라바디 (intrabody), 나노바디 (nanobody), 소형 모듈형 면역약제 (SMIP), 항원-결합-도메인 이뮤노글로불린 융합 단백질, 카멜화 (camelized) 항체, VHH 함유 항체, 또는 뮤테인 또는 그의 유도체, 및 항체가 요구되는 생물학적 활성을 보유하는 한, 특이적 항원-결합을 폴리펩티드에 부여하기에 충분한 이뮤노글로불린의 적어도 일부, 예컨대 CDR 서열을 함유하는 폴리펩티드; 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체 ([C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press]; [R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag])를 포함한다. "이중특이적" 또는 "이중기능적" 항체 이외의 다른 항체는 각각의 그의 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1과 CL 도메인 사이에 발생하는 분자간 디술피드 상호작용을 최소화하거나 또는 완전히 제거하도록 조작될 수 있다. 항체를 파파인으로 소화하면, "Fab" 단편으로 언급되는, 각각 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 잔여 "Fc" 단편 (이 명칭은 쉽게 결정화하는 그의 능력을 반영한다)이 생성된다. 펩신 처리에 의해, 2개의 "Fv" 단편을 갖는 F(ab')2 단편이 생성된다. "Fv" 단편은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 상기 입체형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 규정한다. 종합적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하여 결합할 능력을 갖는다.
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다.
바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 Fv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성하게 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 대해서는, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
Fab 단편도 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기의 부가에 의해 Fab' 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 적어도 하나의 유리 티올기를 포함하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이의 힌지 시스테인을 갖는 Fab'단편의 쌍으로서 생성되었다.
"프레임워크" 또는 FR 잔기는 초가변 영역 잔기가 아닌 가변 도메인 잔기이다.
구문 "불변 영역"은 효과기 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 의미한다.
용어 "뮤테인" 또는 "변이체"는 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 뮤테인 또는 변이체가 목적하는 결합 친화도 또는 생물학적 활성을 보유한다면, 가변 영역 또는 가변 영역에 동등한 부분에 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 함유하는 항체의 폴리펩티드 서열을 의미한다. 뮤테인은 모 항체에 대해 실질적으로 상동성이거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다.
용어 "유도체"는 유비퀴틴화, 치료제 또는 진단제에의 접합, 표지 (예를 들어, 방사성 핵종 또는 다양한 효소를 사용한 표지), 공유적 중합체 부착, 예컨대 페길화 (폴리에틸렌 글리콜을 사용한 유도체화) 및 비-천연 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환과 같은 기법에 의해 공유 변형된 항체를 의미한다.
"인간" 항체 또는 기능적 인간 항체 단편은 본원에서 키메라 또는 "인간화"가 아니고 비-인간 종으로부터 (전체적으로 또는 부분적으로) 유래되지 않은 것으로서 규정된다. 인간 항체 또는 기능적 항체 단편은 인간으로부터 유래될 수 있거나 또는 합성 인간 항체일 수 있다. "합성 인간 항체"는 알려진 인간 항체 서열의 분석을 기초로 한 합성 서열로부터 인 실리코 (in silico)로 전체적으로 또는 부분적으로 유도된 서열을 갖는 항체로서 본원에서 규정된다. 인간 항체 서열 또는 그의 단편의 인 실리코 설계는 예를 들어 인간 항체 또는 항체 단편 서열의 데이터베이스를 분석하고 그로부터 얻은 데이터를 이용하여 폴리펩티드 서열을 고안함으로써 달성될 수 있다. 인간 항체 또는 기능적 항체 단편의 또 다른 예는 인간 기원의 항체 서열의 라이브러리 (즉, 상기 라이브러리는 인간 천연 공급원으로부터 얻은 항체를 기초로 함)로부터 단리된 핵산에 의해 코딩되는 것이다. 인간 항체의 예는 문헌 [Carlsson and Soederlind Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1), 102-108 (2001)], [Soederlin et al., Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000)] 및 미국 특허 번호 6,989,250에 기재된 바와 같은 n-CoDeR-기반 항체를 포함한다.
"인간화 항체" 또는 기능적 인간화 항체 단편은 본원에서 (i) 비-인간 공급원 (예를 들어, 이종성 면역계를 보유하는 트랜스제닉 마우스)으로부터 유래되고, 인간 배선 서열을 기초로 하는 항체; 또는 (ii) 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크가 인간 기원이고 불변 도메인 (존재할 경우)이 인간 기원이면서 가변 도메인의 CDR이 비-인간 기원인 CDR-그라프팅된 항체로 규정된다.
구문 "키메라 항체"는 본원에서 사용되는 바, 일반적으로 상이한 종으로부터 유래하는 2개의 상이한 항체로부터 유래되는 서열을 함유하는 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)를 의미한다. 가장 일반적으로는, 키메라 항체는 인간 및 뮤린 항체 단편, 일반적으로 인간 불변 영역 및 마우스 가변 영역을 포함한다.
"휴먼 엔지니어드™" 항체는 미국 특허 번호 5,766,886 (Studnicka et al.)에 제시된 방법에 따라 모 서열을 변경함으로써 생성되고, 예컨대 서열 58, 61, 64, 67에 제시되고 특허 출원 WO08/022295에 기재된 항체이다.
본 발명의 항체는 재조합 항체 유전자 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 재조합 인간 항체 유전자의 레퍼토리 제조 및 섬유상 박테리오파지의 표면 상에 코딩되는 항체 단편의 디스플레이를 위한 기술의 개발은 직접 인간 항체를 제조하고 선택하기 위한 재조합 수단을 제공하였고, 이것은 인간화, 키메라, 뮤린 또는 뮤테인 항체에도 적용될 수 있다. 파지 기술에 의해 생산된 항체는 박테리아에서 항원 결합 단편 - 대체로 Fv 또는 Fab 단편 -으로서 생산되고, 따라서 효과기 기능이 결여된다. 효과기 기능은 이하의 두 전략 중의 하나에 의해 도입될 수 있다: 단편은 포유동물 세포에서 발현을 위한 완전한 항체로, 또는 효과기 기능을 촉발할 수 있는 제2 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체 단편으로 조작될 수 있다. 일반적으로, 항체의 Fd 단편 (VH-CH1) 및 경쇄 (VL-CL)를 PCR에 의해 별개로 클로닝하고, 조합 파지 디스플레이 라이브러리에서 무작위로 재조합한 후, 특정 항원에 대한 결합에 대해 선택할 수 있다. Fab 단편은 파지 표면 상에 발현된다. 즉, 이 단편은 이들을 코딩하는 유전자에 물리적으로 연결된다. 따라서, 항원 결합에 의한 Fab의 선택은 Fab 코딩 서열을 동시에 선택하고, 이 서열은 후속적으로 증폭될 수 있다. 수 회차의 항원 결합 및 재-증폭, 즉 패닝으로 불리는 절차에 의해, 항원에 특이적인 Fab를 농축하고, 최종적으로 단리한다.
파지-디스플레이 라이브러리로부터 인간 항체를 유도하기 위한 다양한 절차가 문헌에 기재되어 있다. 상기 라이브러리는 그 내에서 다양한 생체내 형성된 (즉, 인간-유래) CDR이 문헌 [Carlsson and Soederlind Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1), 102-108 (2001)], [Soederlin et al., Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000)] 및 미국 특허 번호 6,989,250에 기재된 바와 같이 재조합될 수 있는 단일 마스터 프레임워크 상에 형성될 수 있다. 별법으로, 상기 항체 라이브러리는 인 실리코로 설계되고 합성에 의해 생성된 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 기초로 할 수 있다. 항체 서열의 인 실리코 설계는 예를 들어 인간 서열의 데이터베이스를 분석하고 그로부터 얻은 데이터를 이용하여 폴리펩티드 서열을 고안함으로써 달성된다. 인 실리코로 생성되는 서열을 설계하고 얻는 방법은 예를 들어 문헌 [Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57]; [Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67]; 및 미국 특허 6,300,064에 기재되어 있다. 파지 디스플레이 기술의 검토를 위해서는, WO08/022295 (노파르티스)를 참조한다.
별법으로, 본 발명의 항체는 동물로부터 유래할 수 있다. 그러한 항체는 WO08/022295 (노파르티스)에 요약된 인간화 또는 휴먼 엔지니어드 항체일 수 있고; 상기 항체는 트랜스제닉 동물로부터 유래할 수 있다 [또한, WO08/022295 (노파르티스) 참조].
본원에서 사용되는 바, 상이한 '형태'의 항원, 예를 들어 PRLR은 본원에서 상이한 번역 및 번역후 변형, 예컨대 1차 프로락틴 수용체 전사체의 스플라이싱 (splicing)의 차이, 글리코실화의 차이, 및 번역후 단백질분해 절단의 차이 (이로 제한되지 않음)로 인해 발생하는 상이한 단백질 분자로서 정의된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 '에피토프'는 이뮤노글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 대체로 분자의 화학적 활성 표면기, 에피토프 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되고, 대체로 특이적 3차원 구조 특징 및 특이적 전하 특징을 갖는다. 2개의 항체는 한 항체가 당업자에게 주지된 임의의 방법에 의해 경쟁 결합 검정에서 제2 항체와 경쟁하는 것으로 밝혀지고, 바람직하게는 에피토프의 모든 아미노산이 2개의 항체에 의해 결합될 경우 '동일한 에피토프에 결합하는' 것으로 언급된다.
용어 '성숙 항체' 또는 '성숙 항원-결합 단편', 예컨대 성숙 Fab 변이체는 제시된 항원, 예컨대 PRLR의 세포외 도메인에 대한 보다 강한 결합 - 즉, 증가된 친화도로의 결합 -을 보이는 항체 또는 항체 단편의 유도체를 포함한다. 성숙은 상기 친화도 증가를 유발하는, 항체 또는 항체 단편의 6개의 CDR 내의 소수의 돌연변이를 확인하는 과정이다. 성숙 과정은 돌연변이를 항체 내로 도입하고 개선된 결합제를 확인하기 위해 스크리닝하는 분자생물학적 방법의 조합이다.
치료 방법
치료 방법은 본 발명에 의해 고려되는 치료 유효량의 항체를 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 수반한다. "치료 유효"량은 본원에서 대상체의 치료 영역에서 단일 용량으로서 또는 다중 용량 요법에 따라, 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 PRLR-양성 세포의 증식을 차단하기에 충분한 양이고 유해한 병태의 완화를 유도하고 독성학적으로 허용되는 항체의 양으로서 정의된다. 대상체는 인간 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 원숭이 또는 다른 하등 영장류)일 수 있다.
본 발명의 항체는 알려진 의약과 동시에 투여될 수 있고, 몇몇의 경우에 항체 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 항체는 잠재적으로 효능을 추가로 증가시키기 위해 면역독소 또는 방사성 동위원소에 접합될 수 있다.
본 발명의 항체는 PRLR이 바람직하지 않게 고도로 발현되는 다양한 상황에서 치료 또는 진단 도구로서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체를 사용한 치료에 특히 적합한 장애 및 병태는 자궁내막증, 자궁선근증, 비-호르몬성 여성 수정능력 피임, 양성 유방 질환 및 유방통, 젖분비 억제, 양성 전립선 비대증, 유섬유종, 고- 및 정상 프로락틴혈증성 탈모, 및 유선 상피 세포 증식을 억제하기 위한 조합 호르몬 요법에서의 공동 치료이다.
임의의 상기 장애를 치료하기 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 하나 이상의 생리학상 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 항체는 치료되는 장애의 종류에 따라 상이할 수 있는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 가능한 투여 경로는 비경구 (예를 들어, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하), 폐내 및 비내, 및 국소 면역억제 치료가 요구될 경우 병변내 투여를 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 예를 들어 항체의 감소하는 용량으로 펄스 주입에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여는 부분적으로는 투여가 단기적인지 또는 장기적인지의 여부에 좌우되어 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다. 투여되는 양은 다양한 인자, 예컨대 임상 증상, 개체의 체중, 다른 약물의 투여 여부에 따라 결정될 것이다. 당업자는 투여 경로가 치료되는 장애 또는 병태에 따라 상이할 것임을 알 것이다.
본 발명에 따른 신규한 폴리펩티드의 치료 유효량은 주로 특정 환자의 특성, 투여 경로, 및 치료되는 장애의 특성에 따라 결정될 것이다. 일반적인 지침은 예를 들어 국제 조화 회의 (International Conference on Harmonisation)의 간행물 및 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, chapters 27 and 28, pp. 484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990)]에서 확인할 수 있다. 보다 구체적으로, 치료 유효량의 결정은 의약의 독성 및 효능과 같은 요인에 따라 결정될 것이다. 독성은 당업계에 공지되고 상기 문헌에 제시된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 효능은 하기 실시예에서 설명되는 방법과 함께 동일한 지침을 사용하여 결정될 수 있다.
제약 조성물 및 투여
또한, 본 발명은 PRLR 항체를 단독으로, 또는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 및 물을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 멸균, 생체적합성 제약 담체 내에서 투여될 수 있는 적어도 하나의 다른 작용제, 예컨대 안정화 화합물과 조합되어 포함할 수 있는 제약 조성물에 관한 것이다. 임의의 상기 분자는 환자에게 단독으로, 또는 부형제(들) 또는 제약상 허용되는 담체와 혼합된 제약 조성물 내에서 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합되어 투여될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 제약상 불활성이다.
또한, 본 발명은 제약 조성물의 투여에 관한 것이다. 상기 투여는 비경구로 시행된다. 비경구 전달 방법은 국소, 동맥내 (종양에 직접 투여), 근육내, 피하, 골수강내, 경막내, 심실내, 정맥내, 복강내, 자궁내 또는 비내 투여를 포함한다. 활성 성분 이외에, 상기 제약 조성물은 활성 화합물의 제약상 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 제형화 기법 및 투여에 대한 추가의 상세한 설명은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.)]의 최신판에서 볼 수 있다.
비경구 투여를 위한 제약 제형은 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 주사를 위해, 본 발명의 제약 조성물은 수용액, 바람직하게는 생리학상 적합성 완충제, 예컨대 행크 (Hank) 용액, 링거액, 또는 생리학상 완충 염수 내에서 제형화될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 오일상 주사 현탁액으로서 제조할 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예컨대 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다. 임의로, 현탁액은 또한 고농축 용액의 제조를 허용하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다.
국소 또는 비내 투여를 위해, 투과되는 특정 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 상기 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
또한, 비경구 투여는 정맥내, 근육내, 피하, 골수강내, 경막내, 및 심실내, 정맥내, 복강내, 자궁내, 질내, 또는 비내 투여를 또한 포함하는 비경구 전달 방법을 포함한다.
키트
본 발명은 추가로 본 발명의 상기 언급된 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 및 키트에 관한 것이다. 상기 용기(들)에는 인간 투여를 위한 제품의 제조, 사용 또는 판매에 대한 규제 당국에 의한 승인을 반영하는, 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 규정된 형태의 통지서가 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체를 코딩하는 DNA 서열은 숙주 세포 내로의 형질감염 및 숙주 세포에 의한 발현을 위해 적합한 플라스미드 내에 제공된다. 플라스미드는 숙주 세포 내에서 DNA의 발현을 조절하기 위해 프로모터 (종종 유도성 프로모터)를 함유할 수 있다. 또한, 플라스미드는 다양한 항체를 생산하기 위해 다른 DNA 서열의 플라스미드 내로의 삽입을 용이하게 하기 위해 적절한 제한 부위를 함유할 수 있다. 또한, 플라스미드는 코딩되는 단백질의 클로닝 및 발현을 용이하게 하기 위한 많은 다른 요소를 함유할 수 있다. 상기 요소는 당업자에게 주지되어 있고, 예를 들어 선택 마커, 개시 코돈, 종결 코돈 등을 포함한다.
제조 및 저장
본 발명의 제약 조성물은 당업계에 공지된 방식으로, 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 연화 (levigating), 유화, 캡슐화, 포획 (entrapping) 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다.
제약 조성물은 사용 전에 완충제와 조합되는, 4.5 내지 5.5의 pH 범위에서 1 mM-50 mM 히스티딘, 0.1%-2% 수크로스, 2%-7% 만니톨 내의 동결건조된 분말로서 제공될 수 있다.
허용되는 담체 내에서 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제조한 후, 제약 조성물은 적절한 용기에 담고, 표시된 병태의 치료를 위해 라벨을 붙인다. PRLR 항체의 투여를 위해, 상기 라벨은 양, 빈도 및 투여 방법을 포함한다.
치료 유효 용량
본 발명에서 사용하기에 적합한 제약 조성물은 활성 성분이 의도된 목적, 즉, PRLR 발현을 특징으로 하는 특정 질환 상태의 치료를 달성하기 위해 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. 효과적인 용량의 결정은 당업자의 능력 내에 속한다.
임의의 화합물에 대해, 치료 유효 용량은 세포 배양 검정, 예를 들어, 림프종 세포에서, 또는 동물 모델, 대체로 마우스, 래트, 토끼, 개, 돼지 또는 원숭이에서 초기에 추정될 수 있다. 또한, 동물 모델은 바람직한 농도 범위 및 투여 경로를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 정보는 이어서 인간에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
치료 유효 용량은 증상 또는 병태를 개선하는 단백질 또는 그의 항체, 길항제, 또는 억제제의 양을 의미한다. 그러한 화합물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차, 예를 들어, ED50 (집단의 50%에서 치료상 효과적인 용량) 및 LD50 (집단의 50%에서 치사적인 용량)에 의해 결정될 수 있다. 치료 효과와 독성 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, 비율 ED50/LD50으로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 제약 조성물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에 사용하기 위한 투여량의 범위를 공식화하기 위해 사용된다. 상기 화합물의 투여량은 독성을 거의 또는 전혀 보이지 않는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 이내인 것이 바람직하다. 투여량은 사용 투여 형태, 환자의 감수성, 및 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 상이하다.
정확한 투여량은 치료되는 환자에 비추어 개별적인 의사에 의해 선택된다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성 모이어티를 제공하거나 또는 요구되는 효과를 유지하도록 조정된다. 고려될 수 있는 추가의 요인은 질환 상태의 중증도, 예를 들어 자궁내막증 병변의 크기 및 위치; 환자의 연령, 체중 및 성별; 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 감수성 및 요법에 대한 관용/반응을 포함한다. 장기 작용성 제약 조성물은 특정 제형의 반감기 및 클리어런스율에 따라 3 내지 4일마다, 매주, 또는 2주마다 1회, 또는 1개월에 1회 투여될 수 있다.
정상 투여량은 투여 경로에 따라 약 2 g의 총 용량까지 0.1 내지 100,000 ㎍으로 상이할 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌에 제시되어 있다. US 4,657,760; US 5,206,344; 또는 US 5,225,212를 참조한다. 당업자는 폴리뉴클레오티드에 대해 단백질 또는 그의 억제제에 대한 것과 상이한 제형을 사용할 수 있다. 이와 유사하게, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전달은 특정 세포, 병태, 위치 등에 특이적일 것이다. 방사성 표지된 항체에 대한 바람직한 비활성은 단백질 1 mg 당 0.1 내지 10 mCi 범위일 수 있다 ([Riva et al., Clin. Cancer Res. 5:3275s-3280s, 1999]; [Wong et al., Clin. Cancer Res. 6:3855-3863, 2000]; [Wagner et al., J. Nuclear Med. 43:267-272, 2002]).
본 발명은 다음 실시예에 의해 추가로 설명된다. 실시예는 구체적 실시양태를 참고로 단지 본 발명을 예시하기 위해 제시된다. 본 발명의 구체적인 특정 측면을 예시하는 이들 실시예는 본 발명에 대한 제한을 나타내거나 또는 개시된 발명의 범위를 제한하지 않는다.
모든 실시예는 다른 방식으로 상세하게 설명된 것을 제외하고는 당업자에게 공지되고 통상적인 표준 기법을 사용하여 수행하였다. 다음 실시예의 통상적인 분자 생물학 기법은 표준 실험 매뉴얼, 예컨대 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
도 1: 건강한 여성 및 자궁내막증으로 고통받는 여성으로부터 인간 자궁내막 및 병변 (이소성 조직)에서의 프로락틴-mRNA (PRL-mRNA)의 발현 (실시간 택맨 PCR 분석에 의해 분석됨).
도 2: 건강한 여성 및 자궁내막증으로 고통받는 여성으로부터 인간 자궁내막 및 병변 (이소성 조직)에서의 프로락틴 수용체-mRNA (PRLR-mRNA)의 발현 (실시간 택맨 PCR 분석에 의해 분석됨).
도 3: 래트 조직에서 PRLR 유전자 발현의 노던 블롯 분석. PRLR의 유전자 발현은 태반 및 전립선에서 높은 발현을 보였다.
도 4: 상이한 호르몬으로 처리된 래트 전립선에서 PRLR 발현의 웨스턴 블롯 분석. 무손상 래트에 대한 에스트라디올 처리 및 거세는 무손상 동물의 비히클 처리에 비해 래트 전립선에서 PRLR 단백질의 상향조절을 유도하고, 무손상 래트의 디히드로테스토스테론 처리는 전립선에서 PRLR 발현에 대해 영향을 주지 않았다.
도 5: 중화 PRLR 항체 및 비특이적 대조군 항체에 의한 프로락틴-활성화된 Ba/F (=Baf) 세포 증식 (인간 PRLR을 안정적으로 발현)의 억제. IC50 값은 IgG1 포맷의 다음 항체에 대해 결정되었다: 005-C04 (검정 원): 1.29 ㎍/ml = 8.6 nM; 006-H08 (흰색 원): 0.15 ㎍/ml = 1 nM; HE06.642 (검정 삼각형): 0.34 ㎍/ml = 2.2 nM; 002-H06 (흰색 삼각형): 0.54 ㎍/ml = 3.6 nM; 002-H08 (검정 정사각형): 0.72 ㎍/ml = 4.8 nM; 비특이적 대조군 항체 (흰색 정사각형): 세포 증식의 억제 보이지 않음.
도 6: 중화 PRLR 항체 및 비특이적 대조군 항체에 의한 프로락틴-유도 래트 림프종 세포 증식 (NB2 세포)의 억제. 다음 IC50 값을 결정하였다: XHA06.642 (검정 원): 10 ㎍/ml = 67 nM; XHA06.983 (흰색 원): 래트 림프종 세포 증식에 대한 효과 없음; 비특이적 대조군 항체 (검정 삼각형): 10 ㎍/ml에서 효과 없음.
도 7: 중화 PRLR 항체 및 비특이적 대조군 항체에 의한 T47D 세포에서 프로락틴-자극 STAT5 인산화의 억제. 비특이적 대조군 항체 (FITC)는 T47D 세포에서 STAT5 인산화를 억제하지 않는다. 이와 달리, 항체 XHA06.642, 005-C04 (= IgG1 005-C04), 및 006-H08 (= IgG1 006-H08)은 T47D 세포에서 STAT5의 인산화를 용량-의존성 방식으로 억제한다.
도 8: 인간 프로락틴 수용체 (hPRLR)로 안정적으로 형질감염되고 젖분비자극 호르몬 반응 요소 (LHRE)의 제어 하에 루시퍼라제 유전자를 일시적으로 발현하는 HEK293 세포에서, 프로락틴-활성화된 루시퍼라제 리포터 유전자 활성에 대한 중화 PRLR 항체 및 비특이적 대조군의 효과. IC50 값은 IgG1 포맷의 다음 항체에 대해 결정되었다: 006-H08 (검정 원): 0.83 ㎍/ml = 5.5 nM; HE06.642 (흰색 원): 0.63 ㎍/ml = 4.2 nM; 비특이적 대조군 항체 (검정 삼각형): 루시퍼라제 활성의 억제를 보이지 않음.
도 9: 뮤린 프로락틴 수용체 (mPRLR)로 안정적으로 형질감염되고 젖분비자극 호르몬 반응 요소 (LHRE)의 제어 하에 루시퍼라제 유전자를 일시적으로 발현하는 HEK293 세포에서, 프로락틴-활성화된 루시퍼라제 리포터 유전자 활성에 대한 중화 PRLR 항체 및 비특이적 대조군의 효과. IC50 값은 IgG1 포맷의 다음 항체에 대해 결정되었다: 005-C04 (검정 삼각형): 0.45 ㎍/ml = 3 nM; XHA06.642 (검정 원): >> 50 ㎍/ml >> 333 nM, 비특이적 대조군 항체 (흰색 원): 루시퍼라제 활성의 억제를 보이지 않음.
도 10: 중화 프로락틴 수용체 항체 및 비특이적 대조군 항체에 의한 프로락틴-활성화된 Ba/F (= Baf) 세포 증식 (뮤린 프로락틴 수용체를 안정적으로 발현)의 억제. IC50 값은 IgG1 포맷의 다음 항체에 대해 결정되었다: 비특이적 FITC 항체 (검정 정사각형): 세포 증식의 억제를 보이지 않음; HE06.642 (검정 원): >>> 30 ㎍/ml >>> 200 nM; 001-E06 (흰색 원): 43.7 ㎍/ml = 291 nM; 001-D07 (검정 삼각형): 16.5 ㎍/ml = 110 nM; 005-C04 (흰색 삼각형): 0.74 ㎍/ml = 4.9 nM.
도 11: 포스페이트-완충 염수 (= 비히클), 비특이적 대조군 항체 (FITC IgG1) 또는 중화 항체 IgG1 005-C04 (=005-C04)로 처리된 암컷 마우스에서 임신율 및 평균 한배새끼 수. 임신율은 87.5% (비히클 처리 암컷), 75% (10 mg/kg 비특이적 항체로 처리한 암컷), 100% (10 mg/kg IgG1 005-C04로 처리한 암컷), 및 0% (30 mg/kg IgG1 005-C04로 처리한 암컷)이었다. 평균 한배새끼 수는 10.9마리 동물 (비히클 처리 암컷), 12.3마리 동물 (10 mg/kg 비특이적 항체로 처리한 암컷), 13마리 동물 (10 mg/kg IgG1 005-C04로 처리한 암컷) 및 0마리 동물 (30 mg/kg IgG1 005-C04로 처리한 암컷)이었다.
도 12: 문헌 [Johnson and Wu (Nucleic Acids Res. 2000, 28, 214-218)]에 따른 프레임워크 아미노산 위치의 카바트 넘버링.
도 13: 선택된 항-PRLR 항체 (005-C04, 001-E06, HE06642)를 사용한 FACS 분석 결과. 항체의 결합은 PRLR을 발현하지 않는 모 세포주에 비해 인간 및 마우스 PRLR을 발현하는 HEK293 세포에 대해 고정된 농도에서 결정되었다.
도 14a: 출산후 제1일에 얻은 한배새끼 체중의 비율로서 표현된, 각각의 출산후 일수에 대한 한배새끼 체중 증가. 비처리된 모체 (검정 원), 10 mg/kg 비특이적 뮤린 IgG2a 항체로 처리된 모체 (흰색 원), 및 뮤린 IgG2a 불변 도메인을 함유하는 중화 항체 005-C04 (= IgG2a 005-C04) 10 mg/kg (검정 삼각형) 및 30 mg/kg (흰색 삼각형)으로 처리된 모체로부터의 한배새끼의 체중 증가를 제시한다. 화살표는 항체 주사가 수행된 일을 나타낸다. 출산후 제8일부터 계속 30 mg/kg IgG2a 005-C04로 처리된 모체의 한배새끼로부터의 체중 증가가 유의하게 감소한다.
도 14b: 출산후 제1일의 한배새끼 체중의 비율로서 표현된, 매일의 증분의 한배새끼 체중 증가. 비처리된 모체 (검정 원), 10 mg/kg 비특이적 뮤린 IgG2a 항체로 처리된 모체 (흰색 원), 뮤린 IgG2a 불변 도메인을 함유하는 중화 항체 005-C04 (= IgG2a 005-C04) 10 mg/kg (검정 삼각형) 및 30 mg/kg (흰색 삼각형)으로 처리된 모체의 한배새끼로부터의 결과가 제시된다. 기본적으로, 도 14b는 도 14a에 제시된 그래프의 기울기를 나타낸다. 비처리된 모체 및 10 mg/kg 비특이적 항체로 처리된 모체로부터의 한배새끼에서의 1일 체중 증가는 출산후 제1일의 한배새끼 체중의 약 30%에서 오르내린다. 이와 대조적으로, 30 mg/kg IgG2a 005-C04로 모체를 처리하면, 체중 증가가 제7일부터 계속 유의하게 감소하는 반면 (비특이적 항체로 처리된 모체로부터의 한배새끼에 비해 *p<0.05; ***p<0.005), 10 mg/kg IgG2a 005-C04 처리는 1일 체중 증가가 제11일부터 계속 유의하게 감소한다 (비특이적 항체로 처리된 모체로부터의 한배새끼에 비해 p<0.05). 화살표는 항체 적용일을 나타낸다.
도 14c: 수유 모체의 유선으로부터의 조직학적 절편. 비처리된 모체 또는 비특이적 항체로 처리된 모체로부터의 유선은 젖 생산 관으로 채워진다. 이와 대조적으로, 지방 섬 (fatty island) (검정 화살표)의 출현에 의해 입증되는 유선 퇴화는 중화 IgG2a 005-C04 항체에 의해 용량-의존적으로 유도된다.
도 14d: 수유 모체로부터의 유선에서 젖 단백질 발현. 젖 단백질 베타 카제인 (Csn-2), 유장 산성 단백질 (WAP), 및 IGF-1의 발현은 중화 PRLR 항체 IgG2a 005-C04로 처리된 모체에서 용량-의존성 방식으로 감소하지만, 비특이적 항체 처리시에는 감소하지 않는다. 유전자 발현을 TATA 박스 결합 단백질 (TBP)의 발현에 대해 표준화하였다.
도 15a: 양성 유방 질환의 고프로락틴혈증성 마우스 모델에서 측지 및 폐포 유사 구조의 형성. 중화 PRLR 항체 IgG1 005-C04 (= 005-C04)는 뇌하수체 동종이식편이 이식된 마우스에서 10 및 30 mg/kg에서 측지 형성 및 폐포 유사 구조의 형성을 억제한다.
도 15b: 양성 유방 질환의 고프로락틴혈증성 마우스 모델에서 상피 비후 및 상피 세포 증식의 정도. 몇몇의 BrdU-양성 세포는 흰색 화살표로 표시된다. 중화 PRLR 항체 IgG1 005-C04 (= 005-C04)는 유선에서 상피 비후 및 상피 세포 증식을 차단한다.
도 15c: 양성 유방 질환의 고프로락틴혈증성 마우스 모델에서 STAT5 인산화의 정도. 몇몇의 포스포-STAT5-양성 세포는 흰색 화살표에 의해 표시된다. 중화 PRLR 항체 IgG1 005-C04 (= 005-C04)는 30 mg/kg의 투여량으로 적용될 때 STAT5 인산화를 완전히 차단한다.
도 16: 뮤린 IgG2a 불변 도메인을 함유하는 중화 PRLR 항체 005-C04 (= IgG2a 005-C04)에 의한 전립선 성장의 억제. 뇌하수체 동종이식편은 비처리된 샴 (sham)-수술 마우스에 비해 전립선 성장을 자극한다. 10 mg/kg의 용량 및 30 mg/kg의 용량에서 중화 PRLR 항체의 처리는 전립선 성장을 억제한다 (비처리된, 샴-수술된 마우스에 비해 ***p<0.005).
도 17: 중화 PRLR 항체는 고프로락틴혈증의 존재 하에 모발 성장을 자극한다. 실시예 17 및 도 16에 기재된 실험에 사용된 수컷 마우스로부터 뇌하수체 동종이식 (및 면도) 3주 후에 사진을 찍었다. 고프로락틴혈증은 면도 영역에서 모발 재성장을 억제한다. 중화 PRLR 항체는 005-C04 (= IgG2a 005-C04)의 10 및 30 mg/kg의 용량에서 고프로락틴혈증성 병태 하에 모발 재성장을 자극하지만, 비특이적 항체는 자극하지 않는다.
도 18: 중화 PRLR 항체는 고- 및 정상 프로락틴혈증 수컷 및 암컷 마우스에서 면도 영역에서 모발 재성장을 자극하지만 비특이적 항체는 자극하지 않는다 (실시예 18). 중화 PRLR 항체는 따라서 남성 (도 18b) 및 여성 (도 18a)에서 정상- 및 고프로락틴혈증성 병태 하에 탈모의 치료에 적합하다.
도 19: 중화 PRLR 항체는 조합 호르몬 요법, 즉 조합 에스트로겐 + 프로게스틴 요법 후에 유선에서 증강된 상피 세포 증식을 억제하지만, 비특이적 대조군 항체는 억제하지 않는다.
유선의 4개의 단면 내의 증식 도관 상피 세포의 절대적인 수를 평가하고, 중간값을 도면 내에 수평 막대로 도시한다. 난소절제된, 비히클 처리 마우스에서의 상피 세포 증식은 상당히 낮다 (중간값 = 0). 에스트라디올 처리는 상피 세포 증식의 몇몇의 자극 (중간값 = 9)을 야기하고, 최대 유선 상피 세포 증식은 에스트로겐 + 프로게스테론 치료 하에 관찰된다 (중간값 = 144). 중화 프로락틴 수용체 항체 005-C04를 사용한 처리 (10 mg/kg 005-C04 처리 후 중간값 = 84; 30 mg/kg 005-C04 처리 후 중간값 = 27)는 유선 상피 세포 증식을 거의 에스트라디올-단독 수준으로 다시 용량-의존적으로 감소시키지만, 비특이적 대조군 항체는 감소시키지 않는다 (중간값 = 154). 중화 PRLR 항체는 따라서 조합 호르몬 요법, 즉 에스트라디올 + 프로게스테론 치료 하에 증강된 유선 상피 세포 증식의 치료에 적합하다.
도 20: 중화 PRLR 항체는 마우스에서 내자궁내막증을 억제하지만, 비특이적 대조군 항체는 억제하지 않는다. 결과를 실시예 20에 기재된 바와 같이 질환 스코어로서 제시한다. 각각의 실험군에 대한 중간값 질환 스코어는 수평 막대로서 표시된다. 정상 프로락틴혈증성 마우스에서 어느 정도로 내자궁내막증이 발생한다 (중간값 질환 스코어 = 0.25). 뇌하수체 동종이식에 의한 고프로락틴혈증은 질환 스코어를 증가시키고, 보다 많은 동물이 질환에 걸린다 (중간값 질환 스코어 = 2.5). 30 mg/kg의 비특이적 항체로 매주 1회 (중간값 스코어 = 2.5) 또는 2회 (중간값 스코어 = 2) 처리하면 질환에 대한 영향이 없는 반면, 특이적 중화 항체 처리는 병에 걸린 동물의 수를 용량-의존적으로 감소시키고; 특이적 항체가 사용되는 모든 경우에 중간값 질환 스코어는 0이었다. 특히, 10 또는 30 mg/kg의 특이적 항체를 매주 2회 투여한 모든 동물은 완전히 치유되었고, 이들의 질환 스코어는 정상 프로락틴혈증성 마우스의 질환 스코어보다 유의하게 더 낮았다. 중화 PRLR 항체는 따라서 여성에서 내자궁내막증 (= 자궁선근증) 및 외자궁내막증 치료에 적합하다.
도 21: 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정을 사용한 성숙 006-H08 Fab 변이체의 결합 시험:
Fab-함유 이. 콜라이 상청액을 006-H08의 IgG1 분자에 대한 경쟁을 통해 인간 PRLR의 세포외 도메인에 대한 결합에 대해 시험하였다. 도면은 Fab 변이체의 결합을 막대 그래프로 제시한다. 5개의 상이한 인큐베이션 시간에서 신호 강도 (665 nM에서)를 y축에 제시하고, Fab 변이체의 명칭을 x축에 제시한다. 주어진 시점에서 대조군 Fab 006-H08에 비해 보다 낮은 신호는 PRLR에 대한 개선된 결합을 나타낸다. 파트 1에 나열된 모든 Fab는 개선된 결합제를 나타내고, 파트 2에는 개선된 및 몇몇의 비-개선된 결합제가 제시된다.
서열 1은 HCDR1, 006-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 2는 HCDR1, 002-H06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 3은 HCDR1, 002-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 4는 HCDR1, 006-H07의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 5는 HCDR1, 001-E06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 6은 HCDR1, 005-C04의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 7은 HCDR2, 006-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 8은 HCDR2, 002-H06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 9는 HCDR2, 002-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 10은 HCDR2, 006-H07의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 11은 HCDR2, 001-E06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 12는 HCDR2, 005-C04의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 13은 HCDR3, 006-H08, 002-H06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 14는 HCDR3, 002-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 15는 HCDR3, 006-H07의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 16은 HCDR3, 001-E06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 17은 HCDR3, 005-C04의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 18은 LCDR1, 006-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 19는 LCDR1, 002-H06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 20은 LCDR1, 002-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 21은 LCDR1, 006-H07의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 22는 LCDR1, 001-E06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 23은 LCDR1, 005-C04의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 24는 LCDR2, 006-H08, 002-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 25는 LCDR2, 002-H06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 26은 LCDR2, 006-H07의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 27은 LCDR2, 001-E06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 28은 LCDR2, 005-C04의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 29는 LCDR3, 006-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 30은 LCDR3, 002-H06, 001-E06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 31은 LCDR3, 002-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 32는 LCDR3, 006-H07의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 33은 LCDR3, 005-C04의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 34는 VH, 006-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 35는 VH, 002-H06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 36은 VH, 002-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 37은 VH, 006-H07의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 38은 VH, 001-E06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 39는 VH, 005-C04의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 40은 VL, 006-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 41은 VL, 002-H06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 42는 VL, 002-H08의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 43은 VL, 006-H07의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 44는 VL, 001-E06의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 45는 VL, 005-C04의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 46은 VH, 006-H08의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 47은 VH, 002-H06의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 48은 VH, 002-H08의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 49는 VH, 006-H07의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 50은 VH, 001-E06의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 51은 VH, 005-C04의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 52는 VL, 006-H08의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 53은 VL, 002-H06의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 54는 VL, 002-H08의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 55는 VL, 006-H07의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 56은 VL, 001-E06의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 57은 VL, 005-C04의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 58은 VH, HE06642, 노파르티스 (WO2008/22295)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 59는 VH, XHA06642, 노파르티스 (WO2008/22295)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 60은 VH, XHA06983, 노파르티스 (WO2008/22295)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 61은 VL, HE06642의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 62는 VL, XHA06642 노파르티스 (WO2008/22295)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 63은 VL, XHA06983 노파르티스 (WO2008/22295)의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 64는 VH, HE06642의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 65는 VH, XHA06642 노파르티스 (WO2008/22295)의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 66은 VH, XHA06983 노파르티스 (WO2008/22295)의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 67은 VL, HE06642의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 68은 VL, XHA06642, 노파르티스 (WO2008/22295)의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 69는 VL, XHA06983, 노파르티스 (WO2008/22295)의 핵산 서열을 나타낸다.
서열 70은 인간 ECD_PRLR, 아미노산 위치 1 - 210, S1 도메인 1-100 (S1 도메인 구축물 1-102), S2 도메인 101-210을 나타낸다.
서열 71은 CDS 인간 ECD_PRLR, 뉴클레오티드 위치 1-630을 나타낸다.
서열 72는 뮤린 ECD_PRLR, 아미노산 위치 1-210을 나타낸다.
서열 73은 CDS 뮤린 ECD_PRLR, 뉴클레오티드 위치 1-630을 나타낸다.
서열 74는 HCDR2, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 75는 HCDR2, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 76은 HCDR2, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 77은 HCDR2, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 78은 LCDR1, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 79는 LCDR1, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 80은 LCDR1, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 81은 LCDR1, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 82은 LCDR1, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 83은 LCDR1, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 84는 LCDR1, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 85는 LCDR1, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 86은 LCDR1, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 87은 LCDR1, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 88은 LCDR1, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 89는 LCDR1, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 90은 LCDR3, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 91은 LCDR3, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 92는 LCDR3, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 93은 LCDR3, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 94는 LCDR3, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 95는 LCDR3, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 96은 LCDR3, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 97은 LCDR3, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 98은 LCDR3, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 99는 LCDR3, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 100은 LCDR3, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 101은 LCDR3, 성숙 006-H08 변이체, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 143은 VH, 006-H08-12-2, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 144는 VH, 006-H08-13-2, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 145는 VH, 006-H08-13-6-1, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 146은 VH, 006-H08-14-6-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 147은 VH, 006-H08-15-5, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 148은 VH, 006-H08-19-1, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 149는 VH, 006-H08-29-1, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 150은 VH, 006-H08-32-2, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 151은 VH, 006-H08-33-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 152는 VH, 006-H08-33-16-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 153은 VH, 006-H08-35-17-1, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 154는 VH, 006-H08-35-17-4, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 155는 VH, 006-H08-35-1, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 156은 VH, 006-H08-36-17-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 157은 VH, 006-H08-37-19-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 158은 VH, 006-H08-39-7, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 159는 VH, 006-H08-48-5, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 160은 VH, 006-H08-53-27-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 161은 VH, 006-H08-59-30-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 162는 VH, 006-H08-63-32-4, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 163은 VH, 006-H08-65-33-2, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 164는 VH, 006-H08-68-35-2, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 165는 VL, 006-H08-12-2, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 166은 VL, 006-H08-13-2, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 167은 VL, 006-H08-13-6-1, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 168은 VL, 006-H08-14-6-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 169는 VL, 006-H08-15-5, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 170은 VL, 006-H08-19-1, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 171은 VL, 006-H08-29-1, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 172는 VL, 006-H08-32-2, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 173은 VL, 006-H08-33-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 174는 VL, 006-H08-33-16-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 175는 VL, 006-H08-35-17-1, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 176은 VL, 006-H08-35-17-4, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 177은 VL, 006-H08-35-1, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 178은 VL, 006-H08-36-17-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 179는 VL, 006-H08-37-19-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 180은 VL, 006-H08-39-7, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 181은 VL, 006-H08-48-5, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 182는 VL, 006-H08-53-27-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 183은 VL, 006-H08-59-30-0, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 184는 VL, 006-H08-63-32-4, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 185는 VL, 006-H08-65-33-2, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 186은 VL, 006-H08-68-35-2, 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 331은 VH, 006-H08-12-2, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 332는 VH, 006-H08-13-2, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 333은 VH, 006-H08-13-6-1, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 334는 VH, 006-H08-14-6-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 335는 VH, 006-H08-15-5, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 336은 VH, 006-H08-19-1, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 337은 VH, 006-H08-29-1, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 338은 VH, 006-H08-32-2, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 339는 VH, 006-H08-33-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 340은 VH, 006-H08-33-16-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 341은 VH, 006-H08-35-17-1, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 342는 VH, 006-H08-35-17-4, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 343은 VH, 006-H08-35-1, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 344는 VH, 006-H08-36-17-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 345는 VH, 006-H08-37-19-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 346은 VH, 006-H08-39-7, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 347은 VH, 006-H08-48-5, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 348은 VH, 006-H08-53-27-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 349는 VH, 006-H08-59-30-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 350은 VH, 006-H08-63-32-4, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 351은 VH, 006-H08-65-33-2, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 352는 VH, 006-H08-68-35-2, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 353은 VL, 006-H08-12-2, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 354는 VL, 006-H08-13-2, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 355는 VL, 006-H08-13-6-1, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 356은 VL, 006-H08-14-6-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 357은 VL, 006-H08-15-5, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 358은 VL, 006-H08-19-1, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 359는 VL, 006-H08-29-1, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 360은 VL, 006-H08-32-2, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 361은 VL, 006-H08-33-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 362는 VL, 006-H08-33-16-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 363은 VL, 006-H08-35-17-1, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 364는 VL, 006-H08-35-17-4, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 365는 VL, 006-H08-35-1, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 366은 VL, 006-H08-36-17-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 367은 VL, 006-H08-37-19-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 368은 VL, 006-H08-39-7, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 369는 VL, 006-H08-48-5, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 370은 VL, 006-H08-53-27-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 371은 VL, 006-H08-59-30-0, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 372는 VL, 006-H08-63-32-4, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 373은 VL, 006-H08-65-33-2, 핵산 서열을 나타낸다.
서열 374는 VL, 006-H08-68-35-2, 핵산 서열을 나타낸다.
실시예 1
인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 표적-특이적 항체의 단리
인간 PRLR의 활성을 중화시킬 수 있는 일군의 항체를 단리하기 위해, Fab 및 scFv 단편을 발현하는 3개의 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 동시에 조사하였다. 라이브러리 패닝을 위해 사용된 표적은 WO08/022295 (노파르티스)에 기재된 바와 같이 제조된, 인간 프로락틴 수용체 아미노산 25-234를 나타내는 프로락틴 수용체의 가용성 세포외 도메인 (ECD)이었다. 다른 표적은 아미노산 서열 "이소류신-글루타메이트-글리신-아르기닌-메티오닌-아스파르테이트"를 갖는 링커를 통해 6개의 히스티딘에 또는 인간 IgG1-Fc 도메인에 C-말단 연결된 PRLR의 ECD이었다.
파지 디스플레이로부터 표적-특이적 항체의 선택은 문헌 [Marks et al., Methods Mol Biol. 248:161-76, 2004]에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 파지 디스플레이 라이브러리를 50 pmol의 비오티닐화된 ECD와 함께 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하고, 형성된 복합체를 이어서 100 ㎕의 스트렙타비딘 비드 현탁액 (다이나비즈 (Dynabeads)® M-280 스트렙타비딘, 인비트로젠 (Invitrogen))을 사용하여 포획하였다. 비특이적 파지는 세척 완충제 (PBS + 5% 우유)로 비드를 세척함으로써 제거하였다. 결합된 파지를 0.5 ml의 100 nM 트리에틸아민 (TEA)으로 용리시키고, 등부피의 1 M 트리스(TRIS)-Cl pH 7.4를 첨가하여 즉시 중화시켰다. 용리된 파지 풀 (pool)을 사용하여 대수증식기로 성장중인 TG1 이. 콜라이 세포를 감염시키고, 파지미드를 문헌에 기재된 바와 같이 회복시켰다 (Methods Mol Biol. 248:161-76, 2004). 선택을 총 3 라운드 반복하였다. 제3 라운드의 패닝으로부터 용출된 파지로 감염된 TG1 세포로부터 얻은 단일 콜로니를 ELISA 검정에서 결합 활성에 대해 스크리닝하였다. 간단히 설명하면, 용리된 파지로 감염된 TG1 세포로부터 얻어진 단일 콜로니를 사용하여 96-웰 플레이트 내의 배지에 접종하였다.
미세배양액을 OD60O=0.6으로 성장시키고, 여기서 진탕기 인큐베이터 내에서 30℃에서 밤새 배양한 후 1 mM IPTG의 첨가에 의해 가용성 항체 단편의 포인트 발현을 유도하였다. 박테리아를 스핀다운하고, 주변세포질 추출물을 제조하고, 이를 사용하여, 마이크로플레이트 제조자에 의해 제공되는 표준 ELISA 프로토콜에 따라 96-웰 마이크로플레이트 (96-웰 편평 바닥 면역흡착 플레이트, 눈크 (Nunc)) 상에 고정된 ECD에 대한 항체 결합 활성을 검출하였다.
재조합 세포외 도메인 (ECD)에 대한 결합을 위한 항-프로락틴 수용체 (PRLR) 항체의 친화도는 비아코어® 2000을 사용하여 추정하고, 항체의 친화도 순위매김을 위해 사용하였다.
실시예 2
환자 및 건강한 대조군으로부터의 정상부위 및 이소성 자궁내막 및 자궁내막증 병변에서 실시간 택맨 PCR 분석에 의한 프로락틴 및 프로락틴 수용체 유전자 발현의 정량적 분석
실시간 택맨 PCR 분석은 ABI 프리즘(Prism) 7700 서열 검출기 시스템을 제조자의 지시에 따라 (피이 어플라이드 바이오시스템즈 (PE Applied Biosystems)), 문헌 [Endocrinolgy 2008, 149(8): 3952-3959)]에 기재되고 당업자에게 알려진 바와 같이 사용하여 수행하였다. PRL 및 PRLR의 상대적 발현 수준은 시클로필린의 발현에 대해 표준화되었다. 본 발명자들은 정량적 실시간 택맨 PCR 분석을 사용하여 건강한 여성의 자궁내막에서 및 환자로부터의 자궁내막 및 자궁내막증 병변에서 PRL 및 PRLR의 발현을 분석하였다. 프로락틴 및 그의 수용체의 발현은 건강한 자궁내막 또는 환자로부터 유래된 자궁내막에 비해 자궁내막증 병변에서 분명하게 상향조절되었다. 결과를 도 1 및 2에 제시한다.
이러한 발견은 자가분비 프로락틴 신호전달이 자궁내막증 및 자궁선근증 (내자궁내막증, 자궁으로 제한된 자궁내막증의 한 형태)의 발생 및 유지에서 일정 역할을 함을 시사한다.
실시예 3
노던 블롯에 의한, 인간 조직에서 프로락틴 수용체 발현의 분석
상이한 래트 조직으로부터 RNA를 단리하고, 겔 전기영동 후에 나일론막으로 옮겼다. 막을 래트 프로락틴 수용체 또는 β-액틴 (로딩 대조군으로서)의 방사성 표지된 cDNA와 연속적으로 혼성화시켰고, 이를 세척하고, 필름에 노출시켰다. 밴드는 래트 프로락틴 수용체 및 β-액틴의 mRNA에 상응하였다. 도 3에 제시된 결과는 태반, 전립선, 난소 및 부신에서 프로락틴 수용체의 강한 발현을 나타낸다.
실시예 4
래트 전립선에서 프로락틴 수용체 단백질 발현의 조절 - 거세 및 호르몬 처리의 영향
래트를 거세하거나 무손상 상태로 유지하였다. 무손상 동물을 14일 동안 매일 비히클 (무손상), DHT (3 mg/kg) 또는 E2 (0.4 mg/kg)로 처리하였다. 이어서, 전립선을 모든 처리군의 동물로부터 단리하고, 단백질 추출물을 제조하였다. 단백질 추출물을 겔 전기영동에 의해 분리하고, 막으로 옮겼다. 프로락틴 수용체는 상업적으로 입수가능한 항체 MA610 (산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology))을 사용하여 검출하였다. 결과는 도 4에 제시되어 있고, 이것은 래트 전립선에서 프로락틴 수용체의 호르몬 조절을 나타낸다.
실시예 5
중화 프로락틴 수용체 항체 및 비특이적 대조군 항체에 의한 BaF3 세포 (인간 프로락틴 수용체로 안정적으로 형질감염됨)의 프로락틴-유도된 증식의 억제
중화 PRLR 항체의 시험관내 효능을 분석하기 위해, BaF3 세포의 프로락틴-활성화된 세포 증식의 억제를 사용하였다. 세포를 인간 PRLR로 안정적으로 형질감염시키고, 10% FCS 및 10 ng/ml의 인간 프로락틴의 존재 하에 2 mM 글루타민을 함유하는 RPMI 내에 통상적인 방식으로 배양하였다. 1% FCS를 함유하는 프로락틴-비함유 배지 내에서 6시간 단식시킨 후에, 세포를 10000개 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 20 ng/ml 프로락틴으로 자극하고, 2일 동안 증가하는 용량의 중화 PRLR 항체와 함께 동시에 인큐베이션하였다. 세포 증식을 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 발광 세포 생존력 검정 (Luminescent Cell Viability Assay) (프로메가 (Promega))을 사용하여 분석하였다. 프로락틴-자극 세포 성장의 억제에 대한 용량-반응 곡선을 작성하고, IC50 값을 계산하였다. 음성 대조군으로서, 비특이적 대조군 항체를 사용한 자극을 사용하였다.
용량-반응 곡선 및 IC50 값을 도 5에 도시한다. 비특이적 항체는 인간 PRLR을 안정적으로 발현하는 BaF 세포의 증식을 억제하지 않은 반면, 특이적 항체는 세포 증식을 차단하고, 상이한 효력을 보였다. 중화 항체 006-H08은 상기 판독 패러다임에서 최고 효력을 보였다.
실시예 6
특이적 및 비특이적 항체의 프로락틴-유도 래트 림프종 세포 증식의 억제
또한, 중화 PRLR 항체의 시험관내 효능을 프로락틴-의존성 래트 림프종 세포 (Nb2-11 세포) 증식의 억제를 사용하여 시험하였다. Nb2-11 세포를 10% FCS 및 10% 말 혈청을 함유하는 RPMI 내에서 통상적인 방식으로 성장시켰다. 세포 성장 검정 개시 전에, 세포를 10% FCS 대신에 1% FCS를 함유하는 동일한 배지 내에서 24시간 동안 성장시켰다. 이어서, 세포를 10000개 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트 내의 FCS-비함유 배지에 시딩하였다. 2일 동안 증가하는 용량의 중화 PRLR 항체 또는 대조군 항체의 존재 또는 부재 하에 세포를 10 ng/ml 인간 프로락틴으로 자극하였다. 이어서, 세포 증식을 셀타이터-글로 발광 세포 생존력 검정 (프로메가)을 사용하여 평가하였다. 용량-반응 곡선 및 IC50 값을 도 6에 도시한다. 래트 PRLR에 결합하지 않는 비특이적 항체 및 항체 XHA06.983은 Nb2-11 세포 증식을 차단하지 않았다. 래트 PRLR에 결합하는 XHA06.642는 Nb2-11 세포 증식을 차단하였다.
실시예 7
중화 프로락틴 수용체 항체에 의한, T47D 세포에서 프로락틴-유도 STAT5 인산화의 억제
추가의 판독에서 중화 PRLR 항체의 시험관내 효능을 분석하기 위해서, 프로락틴으로 처리된 인간 T47D 세포에서 STAT5 인산화의 억제를 사용하였다. T47D 세포를 10% FCS 및 2 mM 글루타민을 함유하는 RPMI 내에서 성장시켰다. 세포를 0.5 x 105개 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 다음날, 세포를 무혈청 RPMI에서 1 h 동안 단식시켰다. 이어서, 세포를 20 ng/ml 인간 프로락틴의 부재 또는 존재 하에 30 min 동안 상이한 용량의 중화 PRLR 항체 또는 비특이적 대조군 항체를 첨가하거나 첨가하지 않은 상태로 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세정하고, 70 ㎕의 용해 완충제에서 용해시켰다. 용해물을 원심분리하고, 상청액을 -80℃에서 동결하였다. 추출물을 웨스턴 블롯 (업스테이트 (Upstate) 07-586으로부터의 항-pSTAT5A/B 항체, 1:1000 희석)을 사용하여 분석하였다. 로딩 대조군으로서, 스트리핑된 (stripped) 블롯을 항-베타 튜불린 항체 (ab7287, 1:500 희석)와 함께 인큐베이션하였다. 결과를 도 7에 제시한다. 비특이적 FITC 항체를 제외하고, 모든 중화 PRLR 항체는 인간 T47D 세포에서 STAT5 인산화를 용량-의존적으로 차단하였다. 모든 시험된 항체는 인간 PRLR에 고 친화도로 결합하였다.
실시예 8
인간 PRLR 로 안정적으로 형질감염된 Hek293 세포에서 루시퍼라제 리포터 유전자 활성의 억제 - 중화 프로락틴 수용체 항체 및 비특이적 대조군 항체의 분석
중화 PRLR 항체의 시험관내 효능을 추가로 분석하기 위해서, 리포터 유전자 검정을 사용하였다. 인간 PRLR로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포를 LHRE (젖분비자극 호르몬 반응 요소)의 제어 하에 루시퍼라제 리포터 유전자로 일시적으로 7시간 동안 형질감염시켰다. 이어서, 세포를 96-웰 플레이트 (0.5% 목탄 스트리핑된 혈청, DMEM) 상에 20000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 다음날, 300 ng/ml의 인간 프로락틴을 증가하는 용량의 중화 PRLR 항체 또는 대조군 항체와 함께 또는 이들 항체없이 첨가하였다. 24시간 후에, 루시퍼라제 활성을 결정하였다. 결과를 도 8에 제시한다. 비특이적 항체와 달리, 006-H08 및 HE06.642는 인간 PRLR로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포에서 루시퍼라제 활성을 억제하였다.
실시예 9
뮤린 PRLR로 안정적으로 형질감염된 Hek293 세포에서 루시퍼라제 리포터 유전자 활성의 억제 - 중화 프로락틴 수용체 항체 및 비특이적 대조군 항체의 분석
뮤린 프로락틴 수용체에 대한 중화 PRLR 항체의 시험관내 효능을 추가로 분석하기 위해서, 리포터 유전자 검정을 사용하였다. 뮤린 PRLR로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포를 LHRE (젖분비자극 호르몬 반응 요소)의 제어 하에 루시퍼라제 리포터 유전자로 일시적으로 7시간 동안 형질감염시켰다. 이어서, 세포를 96-웰 플레이트 (0.5% 목탄 스트리핑된 혈청, DMEM) 상에 20000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 다음날, 200 ng/ml의 인간 프로락틴을 증가하는 용량의 중화 PRLR 항체 또는 대조군 항체와 함께 또는 이들 항체없이 첨가하였다. 24시간 후에, 루시퍼라제 활성을 결정하였다. 결과를 도 9에 제시한다. 항체 005-C04 (검정 삼각형)는 높은 활성 (IC50 값 = 3 nM)을 보이는 반면, 항체 HE06.642 (검정 원)는 330 nM까지 활성을 보이지 않는다. 비특이적 대조군 항체 (흰색 원)는 완전히 비활성이다. 노파르티스 항체 HE06.642와 달리, 항체 005-C04는 뮤린 PRLR-매개 신호전달을 차단할 수 있다.
실시예 10
중화 프로락틴 수용체 항체 및 비특이적 대조군 항체에 의한 BaF3 세포 (뮤린 프로락틴 수용체로 안정적으로 형질감염됨)의 프로락틴-유도된 증식의 억제
중화 PRLR 항체의 시험관내 효능을 분석하기 위해, Ba/F3 세포의 프로락틴-활성화된 세포 증식의 억제를 사용하였다. 세포를 뮤린 PRLR로 안정적으로 형질감염시키고, 10% FCS 및 10 ng/ml의 인간 프로락틴의 존재 하에 2 mM 글루타민을 함유하는 RPMI 내에서 통상적인 방식으로 배양하였다. 1% FCS를 함유하는 프로락틴-비함유 배지 내에서 6시간 단식시킨 후에, 세포를 10000개 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 40 ng/ml 프로락틴으로 자극하고, 2일 동안 증가하는 용량의 중화 PRLR 항체와 함께 동시에 인큐베이션하였다. 세포 증식을 셀타이터-글로 발광 세포 생존력 검정 (프로메가)을 사용하여 분석하였다. 프로락틴-자극된 세포 성장의 억제에 대한 용량-반응 곡선을 작성하고, IC50 값을 계산하였다. 음성 대조군으로서, 비특이적 대조군 항체를 사용한 자극을 사용하였다.
용량-반응 곡선 및 IC50 값을 도 10에 도시한다. 비특이적 대조군 항체 (검정 정사각형)는 뮤린 PRLR에서 비활성이었다. 항체 HE06.642, 001-E06, 및 001-D07에 의한 뮤린 PRLR 활성화의 제한된 억제만이 존재하였다. 항체 005-C04만이 뮤린 PRLR 활성화를 완전히 차단하였다.
실시예 11
마우스에서 중화 프로락틴 수용체 항체 IgG1 005- C04 의 피임 효과
마우스에서 생식력에 대한 중화 프로락틴 수용체 항체의 영향을 시험하기 위해, 12주령 암컷 및 수컷 NMRI 마우스를 7일 동안 (제0일 - 제7일) 교배시켰다. 암컷 마우스를 제-3일, 제0일, 제3일 및 제6일에 포스페이트-완충 염수, 비특이적 IgG1 대조군 항체 (항-FITC, 10 mg/kg), 또는 포스페이트 완충 염수에 용해된, 10 또는 30 mg/kg (체중)의 농도의 중화 IgG1 항체 005-C04 (= IgG1 005-C04)를 복강내 주사하여 처리하였다. 각각의 실험군에 10마리의 암컷을 사용하였다. 각각의 수컷을 2마리 암컷과 교배시켰고, 암컷 중의 한 마리는 포스페이트-완충 염수 또는 비특이적 항체로 처리된 음성 대조군이고, 다른 암컷은 특이적 중화 항체로 처리된 것이었다. 수컷이 적어도 하나의 임신 암컷을 생성하지 않은 교배는 데이터 평가로부터 제외하였다. 판독 파라미터는 평균 한배새끼 수, 및 실험군 당 한배새끼 수를 실험군 내의 이론적으로 가능한 한배새끼의 수로 나눔으로써 계산된 임신율 (%로 측정)이었다. 결과를 도 11에 제시한다.
도 11A는 얻어진 임신율을 보여준다. 임신율은 다음과 같았다:
- 포스페이트 완충 염수로 처리된 마우스의 군에서 87.5%,
- 비특이적 대조군 항체 (10 mg/kg)로 처리된 마우스의 군에서 75%,
- 중화 PRLR 항체 IgG1 005-C04 (10 mg/kg)로 처리된 마우스의 군에서 100% 및
- 중화 PRLR 항체 IgG1 005-C04 (30 mg/kg)로 처리된 마우스의 군에서 0%.
도 11B는 상이한 실험군에 대해 관찰된 한배새끼 수를 보여준다. 한배새끼 수는 다음과 같았다:
- 포스페이트 완충 염수로 처리된 마우스의 군에서 10.9마리 마우스/한배새끼,
- 비특이적 대조군 항체 (10 mg/kg)로 처리된 마우스의 군에서 12.3마리 마우스/한배새끼,
- 중화 PRLR 항체 IgG1 005-C04 (10 mg/kg)로 처리된 마우스의 군에서 13마리 마우스/한배새끼 및
- 중화 PRLR 항체 IgG1 005-C04 (30 mg/kg)로 처리된 마우스의 군에서 0마리 마우스/한배새끼.
상기 교배 연구로부터의 결과는 중화 프로락틴 수용체 항체 IgG1-005-C04가 30 mg/kg (체중)에서 시험될 때 마우스의 임신을 완전히 억제함을 보여준다.
실시예 12
에피토프 분류
에피토프 분류 실험은 비아코어를 사용하여 항-PRLR 항체쌍의 ECD-PRLR (서열 70)에 대한 동시 결합을 모니터링함으로써 수행하였다. 간단히 설명하면, 제1 항체를 n-히드록시숙신아미드 (NHC) 및 N-에틸-N'-디메틸아미노프로필 카르보디이미드 (EDC)를 사용하여 1차 아민 커플링을 통해 센서 칩에 공유 고정하였다. 표면 상의 비점유된 결합 부위를 이어서 에탄올아미드로 차단하였다. 가용성 ECD-PRLR (서열 70)은 고정된 항체를 통해 표면 상에 포획되었고, 따라서, 포획 항체의 에피토프는 모든 결합된 ECD-PRLR 분자에 대해 차단되었다. 고정된 ECD-PRLR에 결합하도록 제2 항체를 즉시 표면 상에 통과시켰다. 동일하거나 중복되는 에피토프를 인식하는 2개의 항체는 ECD-PRLR에 결합할 수 없는 반면, 별개의 에피토프를 갖는 항체는 결합할 수 있다. 결합된 단백질을 제거하기 위해 항체 표면을 글리신 (pH 2.8)으로 재생하고, 이 과정을 다른 항체를 사용하여 반복하였다. 모든 항체 조합을 시험하였다. 대표적인 결과를 표 7에 제시한다. 항체 006-H08, 002-H06, 002-H08, 006-H07 및 XHA06983은 ECD-PRLR에 대해 서로 경쟁적으로 결합하였고, 이것은 이들이 중복되는 에피토프 (에피토프 군 1, 표 6)를 표적으로 함을 나타낸다. 또한, 항체들은 경쟁적으로 PRL에 결합하였고, 001-E06 (에피토프 군 2, 표 6)도 역시 그러했다. 이 항체는 상기 언급된 것과 상이한 ECD-PRLR 부위를 표적으로 한다. 마지막으로, 항체 005-C04는 PRL에는 경쟁적이지 않으면서 HE06.642 및 XHA06.642에 경쟁적으로 결합하였다 (에피토프 군 3, 표 6).
Figure pct00008
실시예 13
세포 표면에 발현된 마우스 및 인간 PRLR 에 대한 항체의 교차-반응성
세포 상에 발현된 마우스 및 인간 PRLR에 대한 항-PRLR 항체의 결합 특징을 결정하기 위해, 결합을 각각 인간 및 뮤린 PRLR을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포 상에서 유동 세포 분석으로 시험하였다. 상기 세포 및 PRLR이 없는 모 HEK293 세포주를 수거하고, 원심분리하고, 2% FBS 및 0.1% 아지드화나트륨 (FACS 완충제)를 함유하는 1xPBS 내에 약 5x106개 세포/ml로 재현탁하였다. 항체 005-C04, 001-E06 및 HE06.642를 FACS 완충제에 2배의 최종 농도로 희석하고, 적절한 샘플 웰 (50 ㎕/웰)에 첨가하였다. 2차 항체 및 자가형광 대조군에 대해, 50 ㎕ FACS 완충제를 적절한 웰에 첨가하고. 50 ㎕의 세포 현탁액을 각각의 샘플 웰에 첨가하였다. 샘플을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 저온의 FACS 완충제로 2회 세척하고, PE-접합 염소 항-인간 IgG를 함유하는 FACS 완충제 내에 1:100 희석으로 재현탁하였다. 4℃에서 30 min 인큐베이션 후에, 세포를 저온의 FACS 완충제로 2회 세척하고, 1 mg/ml 아이오딘화프로피듐을 함유하는 FACS 완충제 (인비트로젠 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고))에 재현탁하고, 유동 세포 분석에 의해 분석하였다. 도 13에 제시된 바와 같이, 항체 005-C04 및 001-E06은 상기 세포 상의 인간 및 뮤린 PRLR에 결합하였고, HE06.642는 인간 PRLR에만 결합하였다. 이러한 관찰은 뮤린 PRLR-의존성 루시퍼라제 리포터 유전자 검정에서 HE06.642의 효능 결핍에 대해 실시예 9에서 보고된 발견과 일치한다. 005-C04 및 HE06.642는 인간 PRLR에 경쟁적으로 결합하였지만, 뮤린 PRLR에 대한 두 항체의 상이한 결합 특성은 이들의 에피토프 특이성의 차이를 나타낸다.
실시예 14
세포 신호전달 캐스케이드에 대한 Fab 및 scFv 항체의 억제 활성
PRLR-촉발 신호전달 캐스케이드에 대한 Fab 및 scFv 스크리닝 히트 (hit)의 활성을 기능적으로 특성화하기 위해, 프로락틴으로 처리된 인간 T47D 세포에서 PRLR 자체에 대한 및 전사 조절자 ERK1/2 및 STAT5에 대한 인산화의 억제를 측정하였다. T47D 세포를 2 mM L-글루타민, 10% 목탄 스트리핑된 FBS 및 인슐린-트랜스페린-셀레늄-A (깁코 (Gibco))를 함유하는 RPMI 내에서 성장시켰다. 세포를 1.5 x 106개 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트 또는 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 다음날, 성장 배지를 새로 교체하였다. 제3일에, 세포를 무혈청 RPMI에서 1시간 동안 단식시켰다. 이어서, 세포를 500 ng/ml의 인간 프로락틴의 존재 하에 5 min 동안 상이한 용량의 중화 PRLR 항체 또는 비특이적 대조군 항체와 함께 또는 이들 항체없이 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세정하고, 용해 완충제에서 용해시켰다. 용해물을 원심분리하고, 상청액을 -80℃에서 동결시켰다. 샘플을 PRLR 인산화의 측정의 경우 듀오세트(DuoSet) IC "휴먼 포스포-프로락틴(Human Phospho-Prolactin) R" 키트 (알&디 시스템즈)에 따라, STAT5 인산화의 측정의 경우 패스스캔 포스포(PathScan Phospho)-STAT5 (Tyr694) 샌드위치(Sandwich) ELISA 키트 (셀 시그널링 테크놀로지 (Cell Signaling Technology); #7113)에 따라 및 ERK1/2 인산화의 측정의 경우 포스포(Phospho)-ERK1/ERK2 키트 (알&디 시스템즈)에 따라 ELISA에 의해 시험하였다. 표 8은 7.5 ㎍/ml의 고정된 용량에서 Fab 또는 scFv 포맷의 선정된 스크리닝 히트의 길항 활성에 대한 개요를 제공한다.
Figure pct00009
실시예 15
중화 PRLR 항체는 마우스에서 젖분비를 억제한다
성체 NMRI 암컷을 NMRI 수컷과 교배시켰다. 출산후 제1일에, 한배새끼 수를 수유 모체당 8마리 마우스로 조정하였다. 새끼의 체중을 출산후 제1일부터 아침에 매일 결정하였다. 수유 모체는 비처리 상태로 유지하거나 (도 14a,b의 검정 원) 또는 비특이적 항체 (10 mg/kg (체중); 도 14a,b의 흰색 원), 또는 뮤린 IgG2a 불변 도메인을 함유하는 중화 PRLR 항체 005-C04 (= IgG2a 005-C04; 10 mg/kg, 도 14a, b의 검정 삼각형) 또는 중화 PRLR 항체 IgG2a 005-C04 (30 mg/kg, 도 14a, b의 흰색 삼각형)로 복강내로 처리하였다. 군 크기는 실험군당 5-6마리의 수유 모체이었다. 모체를 출산후 제1, 3, 6, 9, 10, 및 12일에 특이적 또는 비특이적 대조군 항체로 처리하였다 (도 14a, b에 화살표로 표시됨). 결과를 도 14에 제시한다. 도 14a는 제1일의 각각의 한배새끼 체중의 비율로서 표현된, 각각의 출산후 일수에 대한 1일당 한배새끼 체중 증가를 보여준다. 중화 PRLR 항체로 처리된 모체로부터의 새끼와 비처리된 또는 비특이적 대조군 항체로 처리된 모체로부터의 새끼 사이에 한배새끼 체중 증가의 유의한 차이가 출산후 제8일부터 계속 존재한다. 윤리적인 이유 때문에, 최고 용량의 중화 PRLR 항체를 투여한 모체의 실험군에서 몇 마리의 한배새끼를 출산후 제10일에 희생시켰다. 도 14b에서, 결과를 상이한 방식으로 도시한다. 매일의 상이한 한배새끼 체중 증가가 제시되는데, 이는 출산후 제1일의 한배새끼 체중의 비율로서 표현된다. 기본적으로, 도 14b는 도 14a에 제시된 그래프의 기울기를 나타낸다. 비처리된 모체 및 비특이적 항체로 처리된 모체로부터의 한배새끼에서의 상이한 1일 한배새끼 체중 증가는 출산후 제1일의 처음 한배새끼 체중의 약 30%에서 오르내린다. 제7일부터 계속 30 mg/kg (체중)의 중화 PRLR 항체로 처리한 모체로부터의 한배새끼에서 1일 한배새끼 체중 증가의 유의한 심한 감소가 존재한다 (비특이적 항체로 처리된 모체로부터의 한배새끼에 비해 *p<0.05; ***p<0.005). 출산후 제11일부터 계속 비특이적 대조군 항체로 처리된 모체로부터의 한배새끼에 비해 10 mg/kg의 중화 PRLR 항체로 처리된 모체로부터의 한배새끼에서도 1일 한배새끼 체중 증가가 유의하게 감소한다 (비특이적 항체로 처리된 모체로부터의 한배새끼에 비해 p<0.05). 결론적으로, 젖분비 억제에 대한 중화 PRLR 항체 IgG2a 005-C04의 용량-의존적 효과가 존재한다. 도 14c는 상이한 실험군의 수유 모체의 유선으로부터의 조직학적 절편을 보여준다. 비처리된 모체 및 비특이적 대조군 항체로 처리된 모체로부터의 유선은 젖 생산 관으로 채워져 있다. 이와 대조적으로, 중화 PRLR 항체 IgG2a 005-C04로 처리된 모체에서는 유선 퇴화의 징후가 존재한다. 도 14c에서 검정 화살표는 유선 조직 내의 지방 섬을 나타낸다 (유선 퇴화의 정도에 대한 특이적 항체 IgG2a 005-C04의 용량-의존적 효과 참조 (도 14c)). 또한, 상이한 실험군으로부터의 모체의 유선에서 주요 젖 단백질인 베타-카제인 (Csn-2), 유장 산성 단백질 (WAP), 및 IGF-1의 발현을 분석하였다 (도 14d). 유전자 발현을 TATA-박스 결합 단백질 (TBP)의 발현에 대해 표준화하였다. 중화 PRLR 항체 IgG2a 005-C04는 젖 단백질 발현을 용량-의존적으로 감소시켰지만, 비특이적 항체 (10 mg/kg)는 어떠한 유의한 효과도 보이지 않았다.
중화 PRLR 항체 IgG2a 005-C04는 젖분비를 용량-의존적으로 차단하여, 수유 마우스에서 유선 퇴화를 유발하였고, 이는 젖분비 억제를 위한 그의 유용성을 입증하는 것이다.
실시예 16
중화 PRLR 항체는 양성 유방 질환의 치료에 적합하다
활성화 PRLR 돌연변이 또는 국소 또는 전신성 고프로락틴혈증은 양성 유방 질환을 유발할 수 있다. 따라서, 유선에서 향상된 증식을 유발하는 고프로락틴혈증성 마우스 모델 (양성 유방 질환의 가장 심각한 형태의 특징)을 사용하였다. 제0일에, 12주령 암컷 Balb/c 마우스에게 신장 피막 하에 뇌하수체 동종이식편을 이식하거나 또는 수술을 하지 않은 상태로 유지하였다. 뇌하수체 동종이식된 마우스를 비처리하거나 또는 제0, 3, 7, 11, 및 15일에 비특이적 항체 (10 mg/kg), IgG1 포맷의 중화 PRLR 항체 005-C04 (= IgG1 005-C04; 10 mg/kg), 또는 중화 PRLR 항체 IgG1 005-C04 (30 mg/kg)를 복강내로 처리하였다. 실험군 크기는 8-10마리의 동물이었다. 제17일에 뇌하수체 이식 후 마우스를 희생시켰다. 희생 2시간 전에, 상피 세포 증식을 모니터링하기 위해 동물에게 BrdU를 복강내 주사하였다. 좌측 서혜부 유선을 카노이 (Carnoy) 용액에 고정하고, 유선 전체 마운트 (mount)를 제조하고, 카르민 알라운 (Carmine alaune)으로 염색하였다 (도 15a). 우측 서혜부 유선을 4% 포스페이트-완충 포르말린에 밤새 고정하였다. 이어서 유선을 파라핀에 포매하고, BrdU 면역염색을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (Endocrinology 149(8):3952-3959; 2009). 또한, 중화 PRLR 항체 처리에 반응하여 나타나는 PRLR-매개 신호전달의 억제를 모니터링하기 위해 pSTAT5 면역염색을 수행하였다 (아브캄 (abcam)의 항 pSTAT5 항체, ab32364, 1:60으로 희석). 도 15a는 상이한 실험군으로부터의 유선 전체 마운트의 확대 사진을 보여준다. 뇌하수체를 이식하지 않은 성체 마우스의 유선은 유관 및 신경종말구를 보인 반면에, 뇌하수체 동종이식편을 이식한 마우스에서 과도한 측지 형성 및 폐포 구조의 형성이 존재한다. 비특이적 항체 (10 mg/kg) 처리는 측지 형성 및 폐포 구조의 형성을 억제하지 않았다. 이와 대조적으로, 10 mg/kg (체중)의 중화 항체 IgG1 005-C04 처리는 뇌하수체 동종이식편을 이식한 10마리의 동물 중 8마리에서 측지 형성을 완전히 억제하고, 30 mg/kg의 IgG1 005-C04 처리는 뇌하수체 동종이식편을 이식한 9마리의 동물 중 9마리에서 측지 형성을 완전히 억제한다. 조직학적 분석 및 BrdU 면역염색을 도 15b에 도시한다. 뇌하수체 동종이식은 비특이적 항체 처리에 의해 억제되지 않는 상피 비후를 야기하는 반면, 뇌하수체 동종이식편을 보유하고 중화 PRLR 항체로 10 또는 30 mg/kg (체중)의 용량으로 처리된 마우스에서는 상피 비후가 존재하지 않는다. 분열할 예정인 세포 주기의 S-기의 세포를 반영하는 몇몇의 BrdU-양성 세포는 도 15b에 흰색 화살표로 표시되어 있다. 중화 항체 IgG1 005-C04 (30 mg/kg (체중))로 처리된 마우스는 유선에서 상피 세포 증식의 거의 완전한 억제를 보였다. 포스포-STAT5에 양성인 몇몇의 세포는 도 15c에 흰색 화살표로 표시되어 있다. 30 mg/kg IgG1 005-C04 처리는 STAT5 인산화의 완전한 억제를 유발하고, 이것은 PRLR-매개 신호전달의 완전한 차단을 나타낸다.
도 15a, b, 및 c로부터의 결과는 중화 PRLR 항체가 유선의 양성 증식 질환인 유선증의 치료에 적합함을 입증한다. 중화 PRLR 항체는 포스포-STAT5의 유선 상피 세포 증식 및 활성화를 억제한다.
실시예 17
중화 PRLR 항체를 사용한 양성 전립선 비대증의 치료
수컷 Balb/c 마우스에서 8주령에 신장 피막 아래에 2개의 뇌하수체를 이식함으로써 양성 전립선 비대증을 확립하였다. 대조군은 수술을 하지 않은 상태로 유지하였다. 뇌하수체 동종이식편을 이식한 마우스는 비처리하거나 또는 비특이적 항체 (10 mg/kg), 또는 10 및 30 mg/kg (체중)의 용량의 뮤린 IgG2a 불변 도메인을 함유하는 중화 PRLR 항체 005-C04 (= IgG2a 005-C04)를 복강내로 주사하였다. 항체 주사는 뇌하수체 이식일 (=제0일)에 시작하여, 뇌하수체 이식 후 제3일, 제7일, 제11일, 제15일, 제18일, 제22일, 및 제25일에 수행하였다. 마우스를 제28일에 희생시켰다. 복측 전립선의 상대적인 중량을 결정하였다. 결과를 도 16에 제시한다. 뇌하수체 동종이식은 상대적인 전립선 중량의 증가를 유발하였다. 10 mg/kg 및 30 mg/kg 중화 PRLR 항체 IgG2a 005-C04 처리는 전립선 중량을 감소시킨 반면에, 비특이적 대조군 항체 처리는 어떠한 효과도 없었다. 중화 PRLR 항체는 따라서 양성 전립선 비대증의 치료에 적합하다.
뇌하수체 동종이식 후 제18일에 모발 성장이 뇌하수체 동종이식편이 이식된 동물에서 감소함이 분명해졌다. 중화 PRLR 항체는 고프로락틴혈증성 병태 하에 모발 성장을 자극하였다. 대표적인 사진을 도 17에 제시한다. 따라서, 중화 PRLR 항체는 고프로락틴혈증성 탈모의 치료를 위해 사용될 수 있다.
실시예 18
모발 성장에 대한 중화 PRLR 항체의 효과
8주령 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스의 등쪽 모발을 문헌에 기재된 바와 같이 전기 쇼워 (electric shawer)로 제거하였다 (British Journal of Dermatology 2008; 159:300-305). 몇몇의 군에서 신장 피막 아래의 뇌하수체 동종이식에 의해 고프로락틴혈증을 유도하였고, 나머지 군의 동물은 정상 프로락틴혈증 상태이었다. 동물을 특이적 PRLR 항체 (IgG2a 005-C04) 또는 비특이적 대조군 항체 (30 mg/kg, 복강내)으로 매주 1회 처리하였다 (뇌하수체 동종이식일인 제0일에 시작). 후속 항체 주사는 제7 및 14일에 수행하였다. 3주 후에, 재성장한 모발이 분홍빛 흰색의 면도된 피부 상에 어둡게 가시화되었고, 어두워진 면도된 영역의 비율을 측정하였다. 암컷 마우스를 면도 15일 후에 희생시키고, 수컷 마우스는 면도 18일 후에 희생시켰다.
다음 실험군을 사용하였다 (군 크기는 6마리의 마우스였다):
1. 면도된 암컷
2. 뇌하수체 동종이식편을 갖는 면도된 암컷
3. 뇌하수체 동종이식편을 갖는 면도된 암컷 + 30 mg/kg 비특이적 항체 IgG2a 005-C04 매주 1회
4. 뇌하수체 동종이식편을 갖는 면도된 암컷 + 30 mg/kg 특이적 항체 매주 1회
5. 면도된 암컷 + 30 mg/kg 비특이적 항체 매주 1회
6. 면도된 암컷 + 30 mg/kg 특이적 항체 매주 1회
7. 면도된 수컷
8. 뇌하수체 동종이식편을 갖는 면도된 수컷
9. 뇌하수체 동종이식편을 갖는 면도된 수컷 + 30 mg/kg 비특이적 항체 매주 1회
10. 뇌하수체 동종이식편을 갖는 면도된 수컷 + 30 mg/kg 특이적 항체 IgG2a 005-C04 매주 1회
11. 면도된 수컷 + 30 mg/kg 비특이적 항체 매주 1회
12. 면도된 수컷 + 30 mg/kg 특이적 항체 매주 1회
상이한 군의 동물로부터의 대표적인 사진을 도 18에 제시하고, 모발이 재성장한 영역의 비율을 도 18에 나타낸다.
중화 PRLR 항체는 수컷 및 암컷 마우스에서 고- 및 정상 프로락틴혈증 상태 하에 모발 재성장을 자극하지만, 비특이적 항체는 그렇지 않다. 중화 PRLR 항체는 따라서 고- 및 정상 프로락틴혈증 상태 하의 여성 및 남성의 탈모 치료에 적합하다.
실시예 19
중화 PRLR 항체에 의한 향상된 유선 상피 세포 증식의 억제
조합 호르몬 요법 (즉, 에스트로겐 + 프로게스틴 요법)에 의해 활성화된 증강된 유선 상피 세포 증식에 대한 중화 PRLR 항체의 효과를 시험하기 위해, 자궁 및 유선에서 증식 효과의 정량이 가능한 이전에 문헌에 기재된 마우스 모델을 사용하였다 (Endocrinology 149:3952-3959, 2008). 6주령 C57BL/6 암컷 마우스를 난소절제하였다. 난소절제 2주 후에, 동물을 2주 동안 비히클 (에탄올/아라키소일 10%/90%) 또는 100 ng 에스트라디올 + 100 mg/kg 프로게스테론을 피하 주사로 매일 처리하였다. 동물을 3주 동안 뮤린 IgG2a 포맷의 중화 PRLR 항체 (10 mg/kg 및 30 mg/kg) 또는 비특이적 항체 (30 mg/kg)의 복강내 주사로 매주 1회 처리하였다. 난소절제 후 제36일에 부검을 수행하였다. 희생 2시간 전에, 동물에게 포스페이트 완충 염수에 용해된 브로모데옥시우리딘 (BrdU) (70 mg/kg (체중))을 복강내 주사하였다. 우측 서혜부 유선의 몸쪽 2/3을 문헌에 기재된 바와 같이 유선 상피 세포 증식 (BrdU 면역염색)에 대해 분석하였다 (Endocrinology 149:3952-3959, 2008).
실험은 다음 군을 포함하였다:
군 1: 비히클로 처리된 난소절제된 동물
군 2: 100 ng 에스트라디올로 처리된 난소절제된 동물
군 3: 100 ng 에스트라디올 (E) 및 100 mg/kg 프로게스테론 (P)로 처리된 난소절제된 동물
군 4: E + P 및 10 mg/kg 특이적 항체 005-C04로 처리된 난소절제된 동물
군 5: E + P 및 30 mg/kg 특이적 항체 005-C04로 처리된 난소절제된 동물
군 6: E2 + P 및 30 mg/kg 비특이적 대조군 항체로 처리된 난소절제된 동물.
결과를 도 19에 제시한다. 유선의 4개의 단면 내의 증식 도관 상피 세포의 절대적인 수를 평가하였다. 중간값을 수평 막대로 도시한다. 난소절제된, 비히클 처리 마우스에서의 상피 세포 증식은 상당히 낮다. 에스트라디올 처리는 상피 세포 증식의 몇몇의 자극을 야기하며, 최대 유선 상피 세포 증식은 에스트로겐 + 프로게스테론 처리 하에 관찰된다 (도 19). 중화 프로락틴 수용체 항체 005-C04를 사용한 처리는 유선 상피 세포 증식을 용량-의존적으로 거의 에스트라디올-단독 수준으로 다시 감소시키지만, 비특이적 대조군 항체는 감소시키지 않는다.
중화 PRLR 항체는 따라서 조합 호르몬 요법, 즉 에스트라디올 + 프로게스테론 치료 하에 증강된 유선 상피 세포 증식의 치료에 적합하다.
실시예 20
중화 PRLR 항체를 사용한 SHN 마우스에서 자궁선근증 (= 내자궁내막증 )의 치료
자궁내막증에서 중화 PRLR 항체의 효능을 시험하기 위해, 전신성 고프로락틴혈증에 의존하는 SHN 마우스에서의 자궁선근증 모델을 사용하였다 (Acta anat. 116:46-54, 1983). SHN 마우스에서 고프로락틴혈증은 7주령 암컷 마우스의 신장 피막 아래에 뇌하수체 동종이식을 수행함으로써 유도하였다 (Acta anat. 116:46-54, 1983). 중화 PRLR 항체 (10 mg/kg 또는 30 mg/kg) 또는 비특이적 항체 (30 mg/kg)를 뇌하수체 동종이식 1주 후부터 복강내 투여하였다. 선 조직에 의한 자궁 근육층의 침윤을 문헌에 기재된 바와 같이 평가하였다 (Laboratory Animal Science 1998, 48:64-68). 항체 처리는 9주 동안 매주 1회 및 2회 복강내 주사에 의해 수행하였다. 부검시에 (뇌하수체 이식 후 제70일), 자궁을 완충된 4% 포르말린 내에 밤새 고정시키고, 파라핀 내에 포매하였다. 자궁선근증 (=내자궁내막증)의 정도를 다음과 같이 평가하였다:
등급 0 = 자궁선근증 없음
등급 0.5 = 자궁근층의 내층이 그의 동심 배향을 느슨하게 한다.
등급 1 = 자궁내막선이 자궁근층의 내층을 침습한다.
등급 2 = 자궁 자궁근층의 내층과 외층 사이의 자궁내막선
등급 3 = 자궁내막선이 자궁 자궁근층의 외층을 침습한다.
등급 4 = 자궁 자궁근층의 외층 외부의 자궁내막선
실험은 다음 실험군을 포함하였다:
1. 뇌하수체 비이식 동물, 즉 정상 프로락틴혈증성 마우스
2. 뇌하수체 이식 동물, 즉 고프로락틴혈증성 마우스
3. 30 mg/kg의 용량의 비특이적 대조군 항체로 매주 1회 처리한 뇌하수체 이식 동물
4. 30 mg/kg의 용량의 비특이적 대조군 항체로 매주 2회 처리한 뇌하수체 이식 동물
5. 10 mg/kg의 용량의 뮤린 IgG2a 포맷의 중화 프로락틴 수용체 항체 005-C04로 매주 1회 처리한 뇌하수체 이식 동물
6. 10 mg/kg의 용량의 뮤린 IgG2a 포맷의 중화 프로락틴 수용체 항체 005-C04로 매주 2회 처리한 뇌하수체 이식 동물
7. 30 mg/kg의 용량의 뮤린 IgG2a 포맷의 중화 프로락틴 수용체 항체 005-C04로 매주 1회 처리한 뇌하수체 이식 동물
8. 30 mg/kg의 용량의 뮤린 IgG2a 포맷의 중화 프로락틴 수용체 항체 005-C04로 매주 2회 처리한 뇌하수체 이식 동물
결과를 도 20에 제시한다. 각각의 처리군에서 각각의 동물에 대한 스코어가 개별적으로 제시되고, 각각의 치료군에 대한 중간값이 수평 막대로서 제시된다. 정상 프로락틴혈증성 마우스에서 어느 정도로 내자궁내막증이 발생한다 (중간값 질환 스코어 = 0.25). 뇌하수체 동종이식에 의한 고프로락틴혈증은 질환 스코어를 증가시키고, 보다 많은 동물이 질환에 걸린다 (중간값 질환 스코어 = 2.5). 30 mg/kg의 비특이적 항체로 매주 1회 또는 2회 처리하면 질환에 대한 영향이 없는 반면, 특이적 중화 항체 처리는 질환 스코어를 용량 의존성으로 감소시킨다. 특히, 10 또는 30 mg/kg의 특이적 항체를 매주 2회 투여한 모든 동물은 완전히 치유되었고, 이들의 질환 스코어는 정상 프로락틴혈증성 마우스의 질환 스코어보다 유의하게 더 낮았다 (도 20). 중화 PRLR 항체는 따라서 여성에서 내자궁내막증 (= 자궁선근증) 및 외자궁내막증 치료에 적합하다.
실시예 21
항체 변이체의 성숙:
항체 친화도 성숙은 친화도 증가를 야기하는 소수의 돌연변이를 확인하기 위해 포화 돌연변이 유발 및 웰-기반 고효율 (high throughput) 스크리닝이 조합된 2단계 과정이다. 친화도 성숙의 제1 라운드에서, 문헌 [BMC Biotechnology 7: 65, 2007]에 따라 NNK-트리뉴클레오티드 카세트 (여기서, N은 아데닌, 티민, 구아닌, 및 시토신 뉴클레오티드 각각의 25% 혼합물을 나타내고, K는 티민 및 구아닌 뉴클레오티드 각각의 50% 혼합물을 나타낸다)를 사용한 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 야생형 항체의 위치 다양화가 도입된다. 상기 방식으로, 모든 20개의 아미노산이 개개의 아미노산 위치에 도입된다. 상기 위치 무작위화는 6개의 상보성 결정 영역 (CDR)으로 제한된다. 친화도 성숙의 제2 라운드에서, 유익한 치환이 재조합되고, 추가의 개선에 대해 스크리닝되었다.
균질 시간 분해 형광 검정 ( HTRF )에 의한 성숙 006- H08 Fab 변이체의 스크리닝:
표준화된 이. 콜라이-유래 상청액 및 8 nM PRLR의 비오티닐화된 세포외 도메인을 1 nM 스트렙타비딘-유로퓸과 함께 30 min 동안 96 웰-마이크로타이터 플레이트에서 인큐베이션하였다. 이어서, 200 mM KF 및 50 nM 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 647-표지된 006-H08의 IgG1을 첨가하였다. 상기 혼합물을 각각 5, 20, 35, 50, 및 65분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 나타낸 시점에서, 665 nm (및 620 nm)에서의 흡광도를 엔비젼 멀티레이블리더 (EnVision MultilabelReader) (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer))를 사용하여 측정하였다. 얻어진 결과를 도 21에 제시한다.
SEQUENCE LISTING <110> Bayer Schering Pharma AG <120> Neutralizing Prolactin Receptor Antibodies <130> 53788 <150> EP09075546.3 <151> 2009-12-10 <160> 518 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Ala Asn Tyr Gly Leu Thr Trp 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Phe Glu Asp His Gly Met Ser Trp 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Ser Ser Tyr Trp Met His Trp 1 5 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly Arg <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Val Ile Ser Phe Asn Gly Asp Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly Arg 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ggctggagtg ggtctcaagt gttagcgata ctggtactga tactcattac 180 gcagactccg tgaagggccg cttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc aaaaacccct 300 ctcgcatata gcagtggctg gtactacttt gactactggg gccaaggtac cctggtcacc 360 gtgagctca 369 <210> 51 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctactgga tgcactgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcagac attagcagtg ctagtagtta cacaaactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc gaggggtttg 300 gatgcgcgac ggatggacta ctggggccaa ggtaccctgg tcaccgtgag ctca 354 <210> 52 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 gatatcgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ctgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcaactc caacatcgga agtaatcctg taaactggta tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gacaataata 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tgttaccatt 60 agctgtaccg gtagcagcag caatattggt gcaggttatg ttgttcattg gtatcagcag 120 ctgcctggta cagcaccgaa actgctgatt tatcgtaata attggcgtca gagcggtgtt 180 ccggatcgtt ttagcggtag caaaagcggc accagcgcaa gcctggcaat tagcggtctg 240 cgtagcgaag atgaagcaga ttattattgt gcagcatggg atgatagcct gaatggttgg 300 ctgtttggtg gtggcaccaa actgaccgtt ctgggtcag 339 <210> 509 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maturated PRLR antibody <400> 509 cagagcgttc tgacccagcc tccgagcgca agcggtacac cgggtcagcg tgttaccatt 60 agctgtaccg gtagcagcag caatattggt gcaggttatg ttgttcattg gtatcagcag 120 ctgcctggta cagcaccgaa actgctgatt tatcgtaata attggcgtca gagcggtgtt 180 ccggatcgtt ttagcggtag caaaagcggc accagcgcaa gcctggcaat tagcggtctg 240 cgtagcgaag atgaagcaga ttattattgt gcagcatggg atgatagcct gaatggttgg 300 ctgtttggtg gtggcaccaa actgaccgtt ctgggtcag 339 <210> 510 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maturated PRLR antibody <400> 510 cagagcgttc tgacccagcc tccgagcgca agcggtacac cgggtcagcg tgttaccatt 60 agctgtaccg gtagcagcag caatattggt gcaggttatg ttgttcattg gtatcagcag 120 ctgcctggta cagcaccgaa actgctgatt tatcgtaata atgtgcgtca gagcggtgtt 180 ccggatcgtt ttagcggtag caaaagcggc accagcgcaa gcctggcaat tagcggtctg 240 cgtagcgaag atgaagcaga ttattattgt gcagcatggg atgatagcct gaatggttgg 300 ctgtttggtg gtggcaccaa actgaccgtt ctgggtcag 339 <210> 511 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maturated PRLR antibody <400> 511 cagagcgttc tgacccagcc tccgagcgca agcggtacac cgggtcagcg tgttaccatt 60 agctgtaccg gtagcagcag caatattggt gcaggttatg ttgttcattg gtatcagcag 120 ctgcctggta cagcaccgaa actgctgatt tatcgtaata attggcgtca gagcggtgtt 180 ccggatcgtt ttagcggtag caaaagcggc accagcgcaa gcctggcaat tagcggtctg 240 cgtagcgaag atgaagcaga ttattattgt gcagcatggg atgatagcct gaatggttgg 300 ctgtttggtg gtggcaccaa actgaccgtt ctgggtcag 339 <210> 512 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maturated PRLR antibody <400> 512 cagagcgttc tgacccagcc tccgagcgca agcggtacac cgggtcagcg tgttaccatt 60 agctgtaccg gtagcagcag caatattggt tatggttatg ttgttcattg gtatcagcag 120 ctgcctggta cagcaccgaa actgctgatt tatcgtaata attggcgtcc gagcggtgtt 180 ccggatcgtt ttagcggtag caaaagcggc accagcgcaa gcctggcaat tagcggtctg 240 cgtagcgaag atgaagcaga ttattattgt gcagcatggg atgatagcct gaatggttgg 300 ctgtttggtg gtggcaccaa actgaccgtt ctgggtcag 339 <210> 513 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maturated PRLR antibody <400> 513 cagagcgttc tgacccagcc tccgagcgca agcggtacac cgggtcagcg tgttaccatt 60 agctgtaccg gtagcagcag caatattggt tatggttatg ttgttcattg gtatcagcag 120 ctgcctggta cagcaccgaa actgctgatt tatcgtaata attggcgtcc gagcggtgtt 180 ccggatcgtt ttagcggtag caaaagcggc accagcgcaa gcctggcaat tagcggtctg 240 cgtagcgaag atgaagcaga ttattattgt gcagcatggg atgatagcct gaatggttgg 300 ctgtttggtg gtggcaccaa actgaccgtt ctgggtcag 339 <210> 514 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maturated PRLR antibody <400> 514 cagagcgttc tgacccagcc tccgagcgca agcggtacac cgggtcagcg tgttaccatt 60 agctgtaccg gtagcagcag caatattggt gcaggttatg ttgttcattg gtatcagcag 120 ctgcctggta cagcaccgaa actgctgatt tatcgtaata atcagcgtca gagcggtgtt 180 ccggatcgtt ttagcggtag caaaagcggc accagcgcaa gcctggcaat tagcggtctg 240 cgtagcgaag atgaagcaga ttattattgt gcagcatggg atgatagcct gaatggttgg 300 ctgtttggtg gtggcaccaa actgaccgtt ctgggtcag 339 <210> 515 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maturated PRLR antibody <400> 515 cagagcgttc tgacccagcc tccgagcgca agcggtacac cgggtcagcg tgttaccatt 60 agctgtaccg gtagcagcag caatattggt gcaggttatg ttgttcattg gtatcagcag 120 ctgcctggta cagcaccgaa actgctgatt tatcgtaata attggcgtca gagcggtgtt 180 ccggatcgtt ttagcggtag caaaagcggc accagcgcaa gcctggcaat tagcggtctg 240 cgtagcgaag atgaagcaga ttattattgt gcagcatggg atgatagcct gaatggttgg 300 ctgtttggtg gtggcaccaa actgaccgtt ctgggtcag 339 <210> 516 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maturated PRLR antibody <400> 516 cagagcgttc tgacccagcc tccgagcgca agcggtacac cgggtcagcg tgttaccatt 60 agctgtaccg gtagcagcag caatattggt gcaggttatg ttgttcattg gtatcagcag 120 ctgcctggta cagcaccgaa actgctgatt tatcgtaata attggcgtca gagcggtgtt 180 ccggatcgtt ttagcggtag caaaagcggc accagcgcaa gcctggcaat tagcggtctg 240 cgtagcgaag atgaagcaga ttattattgt gcagcatggg atgatagcct gaatggttgg 300 ctgtttggtg gtggcaccaa actgaccgtt ctgggtcag 339 <210> 517 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maturated PRLR antibody <400> 517 cagagcgttc tgacccagcc tccgagcgca agcggtacac cgggtcagcg tgttaccatt 60 agctgtaccg gtagcagcag caatattggt gcaggttatg ttgttcattg gtatcagcag 120 ctgcctggta cagcaccgaa actgctgatt tatcgtaata attggcgtcc gagcggtgtt 180 ccggatcgtt ttagcggtag caaaagcggc accagcgcaa gcctggcaat tagcggtctg 240 cgtagcgaag atgaagcaga ttattattgt gcagcatggg atgatagcct gaatggttgg 300 ctgtttggtg gtggcaccaa actgaccgtt ctgggtcag 339 <210> 518 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maturated PRLR antibody <400> 518 cagagcgttc tgacccagcc tccgagcgca agcggtacac cgggtcagcg tgttaccatt 60 agctgtaccg gtagcagcag caatattggt gcaggttatg ttgttcattg gtatcagcag 120 ctgcctggta cagcaccgaa actgctgatt tatcgtaata atcagcgtca gagcggtgtt 180 ccggatcgtt ttagcggtag caaaagcggc accagcgcaa gcctggcaat tagcggtctg 240 cgtagcgaag atgaagcaga ttattattgt gcagcatggg atgatagcct gaatggttgg 300 ctgtttggtg gtggcaccaa actgaccgtt ctgggtcag 339

Claims (25)

  1. 프로락틴 수용체-매개 신호전달에 대해 길항작용을 하는, 표 5에 따른 항체 006-H08 또는 규정된 그의 성숙 변이체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    a. 가변 중쇄가 서열 1, 7 및 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 및 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나, 또는
    b. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 78, 24, 90에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    c. 가변 중쇄가 서열 1, 75, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 82, 24, 91에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    d. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 82, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    e. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 86, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    f. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 87, 24, 100에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    g. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 87, 24, 92에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    h. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 89, 24, 93에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    i. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 79, 24, 101에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    j. 가변 중쇄가 서열 1, 76, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 89, 24, 90에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    k. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 100에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    l. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 97에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    m. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 98에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    n. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 83, 24, 99에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    o. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 96에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    p. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 94에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    q. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 88, 24, 90에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    r. 가변 중쇄가 서열 1, 74, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 81, 24, 95에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    s. 가변 중쇄가 서열 1, 75, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    t. 가변 중쇄가 서열 1, 77, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 18, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    u. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 80, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    v. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 85, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하거나; 또는
    w. 가변 중쇄가 서열 1, 7, 13에 상응하는 CDR 서열을 함유하고, 가변 경쇄가 서열 84, 24, 29에 상응하는 CDR 서열을 함유하는 것인,
    제1항의 항체의 CDR을 포함하는 항체 006-H08 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a. 항체 006-H08은 서열 46에 따른 핵산 서열, 및 서열 34에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 52에 따른 핵산 서열, 및 서열 40에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    b. 항체 006-H08-12-2는 서열 331에 따른 핵산 서열, 및 서열 353에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 165에 따른 핵산 서열, 및 서열 143에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    c. 항체 006-H08-13-2는 서열 332에 따른 핵산 서열, 및 서열 354에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 166에 따른 핵산 서열, 및 서열 144에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    d. 항체 006-H08-13-6-1은 서열 333에 따른 핵산 서열, 및 서열 355에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 167에 따른 핵산 서열, 및 서열 145에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    e. 항체 006-H08-14-6-0은 서열 334에 따른 핵산 서열, 및 서열 356에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 168에 따른 핵산 서열, 및 서열 146에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    f. 항체 006-H08-15-5는 서열 335에 따른 핵산 서열, 및 서열 357에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 169에 따른 핵산 서열, 및 서열 147에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    g. 항체 006-H08-19-1은 서열 336에 따른 핵산 서열, 및 서열 358에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 170에 따른 핵산 서열, 및 서열 148에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    h. 항체 006-H08-29-1은 서열 337에 따른 핵산 서열, 및 서열 359에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 171에 따른 핵산 서열, 및 서열 149에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    i. 항체 006-H08-32-2는 서열 338에 따른 핵산 서열, 및 서열 360에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 172에 따른 핵산 서열, 및 서열 150에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    j. 항체 006-H08-33-0은 서열 339에 따른 핵산 서열, 및 서열 361에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 173에 따른 핵산 서열, 및 서열 151에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    k. 항체 006-H08-33-16-0은 서열 340에 따른 핵산 서열, 및 서열 362에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 174에 따른 핵산 서열, 및 서열 152에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    l. 항체 006-H08-35-17-1은 서열 341에 따른 핵산 서열, 및 서열 363에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 175에 따른 핵산 서열, 및 서열 153에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    m. 항체 006-H08-35-17-4는 서열 342에 따른 핵산 서열, 및 서열 364에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 176에 따른 핵산 서열, 및 서열 154에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    n. 항체 006-H08-35-1은 서열 343에 따른 핵산 서열, 및 서열 365에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 177에 따른 핵산 서열, 및 서열 155에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    o. 항체 006-H08-36-17-0은 서열 344에 따른 핵산 서열, 및 서열 366에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 178에 따른 핵산 서열, 및 서열 156에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    p. 항체 006-H08-37-19-0은 서열 345에 따른 핵산 서열, 및 서열 367에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 179에 따른 핵산 서열, 및 서열 157에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    q. 항체 006-H08-39-7은 서열 346에 따른 핵산 서열, 및 서열 368에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 180에 따른 핵산 서열, 및 서열 158에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    r. 항체 006-H08-48-5는 서열 347에 따른 핵산 서열, 및 서열 369에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 181에 따른 핵산 서열, 및 서열 159에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    s. 항체 006-H08-53-27-0은 서열 348에 따른 핵산 서열, 및 서열 370에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 182에 따른 핵산 서열, 및 서열 160에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    t. 항체 006-H08-59-30-0은 서열 349에 따른 핵산 서열, 및 서열 371에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 183에 따른 핵산 서열, 및 서열 161에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    u. 항체 006-H08-63-32-4는 서열 350에 따른 핵산 서열, 및 서열 372에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 184에 따른 핵산 서열, 및 서열 162에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    v. 항체 006-H08-65-33-2는 서열 351에 따른 핵산 서열, 및 서열 373에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 185에 따른 핵산 서열, 및 서열 163에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하고,
    w. 항체 006-H08-68-35-2는 서열 352에 따른 핵산 서열, 및 서열 374에 따른 아미노산 서열에 상응하는 가변 중쇄 도메인, 및 서열 186에 따른 핵산 서열, 및 서열 164에 따른 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 것인,
    항체 또는 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가, 서열 70 및 서열 70의 인간 다형성 변이체, 아미노산 위치 1 내지 210에 제시된 아미노산 서열을 갖는 PRLR의 하나 이상의 영역에 특이적으로 결합하거나 고 친화도를 갖는 항원-결합 영역으로 이루어지고, 여기서 친화도가 적어도 100 nM, 바람직하게는 약 100 nM 미만, 보다 바람직하게는 약 30 nM 미만, 훨씬 더 바람직하게는 친화도가 약 10 nM 미만 또는 훨씬 더 바람직하게는 친화도가 1 nM 미만인 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 변형된 또는 비변형된 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열.
  7. 제6항에 있어서, 표 5에 따른 단리된 핵산 서열.
  8. 제6항 또는 제7항에 따른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  9. 제8항에 따른 벡터 또는 제6항 또는 제7항에 따른 핵산 분자를 포함하고, 고등 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포, 하등 진핵 숙주 세포, 예컨대 효모 세포일 수 있고, 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포일 수 있는 숙주 세포.
  10. 적합한 조건 하에 제9항에 따른 숙주 세포를 배양하고 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하기 위해 제9항의 숙주 세포를 사용하는 방법.
  11. 제10항의 방법에 의해 생산된 항체 또는 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 95 중량%의 균질성으로 정제된 항체 또는 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서의 항체 또는 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 및 부형제 및 보조제를 포함하는 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  15. 용기에 포장된 치료 유효량의 항체 006-H08 또는 그의 성숙 변이체를 포함하고, 임의로 제2 치료제를 함유하고, 용기에 부착되거나 포장된 라벨을 추가로 포함하고, 여기서 라벨은 용기의 내용물을 기재하고, 자궁내막증, 자궁선근증, 양성 유방 질환 및 유방통, 젖분비 억제, 고- 및 정상 프로락틴혈증성 탈모, 양성 전립선 비대증, 유섬유종을 치료하거나 또는 비-호르몬성 여성 피임에 사용하기 위해 또는 유선 상피 세포 증식을 억제하기 위한 조합 호르몬 요법 (즉, 에스트로겐 + 프로게스틴 요법) 하에 여성을 치료하기 위한 용기 내용물의 사용에 대한 지시서 및/또는 적응증을 제공하는 것인, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 키트.
  16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 자궁내막증 및 자궁선근증 (내자궁내막증)의 치료 및/또는 예방을 위한 항체 또는 항원-결합 단편.
  17. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 여성 피임을 위한 항체 또는 항원-결합 단편.
  18. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 양성 유방 질환 및 유방통의 치료를 위한 항체 또는 항원-결합 단편.
  19. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 젖분비의 억제를 위한 항체 또는 항원-결합 단편.
  20. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 양성 전립선 비대증의 치료를 위한 항체 또는 항원-결합 단편.
  21. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 고- 및 정상 프로락틴혈증성 탈모의 치료를 위한 항체 또는 항원-결합 단편.
  22. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조합 호르몬 요법을 받고 있는 여성의 치료를 위한 항체 또는 항원-결합 단편.
  23. 조합 호르몬 요법이 에스트로겐 + 프로게스틴 요법인, 제22항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편의 용도.
  24. 비경구 전달 방법이 국소, 동맥내, 근육내, 피하, 골수강내, 경막내, 심실내, 정맥내, 복강내, 자궁내, 질내, 또는 비내 투여를 포함하는 것인 비경구 투여를 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 PRLR 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 제14항에 따른 제약 조성물 형태의 항체의 용도.
  25. 제14항에 있어서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 PRLR 항체 또는 항원-결합 단편을 적어도 하나의 다른 작용제와 조합하여 포함하는 제약 조성물.
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