TW201130504A - Neutralizing prolactin receptor antibodies and their therapeutic use - Google Patents

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TW201130504A
TW201130504A TW099143327A TW99143327A TW201130504A TW 201130504 A TW201130504 A TW 201130504A TW 099143327 A TW099143327 A TW 099143327A TW 99143327 A TW99143327 A TW 99143327A TW 201130504 A TW201130504 A TW 201130504A
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Siegmund Wolf
Christoph Freiberg
Axel Harrenga
Simone Greven
Mark Trautwein
Sandra Bruder
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Bayer Schering Pharma Ag
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Description

201130504 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關催乳激素受體抗體隊祕，且提供特異 性結合並中和催乳激素受體的重組抗原結合區及含有該等 抗原結合區之抗體及功能片段、編碼前述抗體之核酸序 列、含有該等核酸序列之載體、含有上述者之醫藥組合物 及其在以下方面之用途：治療或預防可受益於抑制催乳激 素受體介導之信號傳導的良性疾病及適應症，諸如子宮内 膜異位症、子宮腺肌症、雌性非激素性避孕、良性乳房疾 2、乳腺痛 '泌乳抑制、良性前列腺增[類纖維瘤以及 高催乳激素血症性及正常催乳激素血症性毛髮❹；及在 組合激素療法中用以抑制乳腺上皮細胞增殖之聯合治療。 【先前技術】 關於以下項，存在尚待滿足的醫學需要：對各種良性疾 病及適應症之治療，諸如治療子宮内膜異位症、子宮腺肌 症、雌性非激素性避孕、良性乳房疾病、乳腺痛、泌乳抑 制、良性前列腺增生、類纖維瘤、高催乳激素血症性及正 常催乳激素血症性毛髮減少；及在組合（亦即雌激素加助 孕素）激素療法中對乳腺上皮細胞增殖之預防。 催乳激素（PRL)為由199個胺基酸構成之多肽激素。prl 屬於多肽激素之生長激素（GH)、胎盤催乳素（pL)家族，且 在垂體催乳素細胞中及在若干垂體外組織中合成，該等垂 體外組織諸如有淋巴細胞、乳腺上皮細胞、子宮肌層及前 列腺。兩種不同啟動子調控垂體及垂體外pRL合成 152407.doc 201130504 (BioEssays 28:1051-1055， 2006)。 PRL結合於PRL受體（PRLR)，即一種單一跨膜受體，其 屬於1類細胞激素受體超家族（£11(1〇〇11丨116116丫丨6\¥5 19:225-268，1998)。PRLR呈三種不同同功異型物形式，即可按細 胞質尾長度區分之短型、長型及中型。在配位體結合之 後，連續的過程引起PRLR活化。PRL經由其結合位點1與 一個PRLR分子相互作用，隨後經由其結合位點2吸引第二 受體分子，從而產生PRLR之活性二聚體。PRLR二聚合使 得JAK/STAT(Janus激酶/信號轉導子與轉錄活化子）路徑被 顯著活化。在受體二聚合之後，與受體締合之JAK(主要為 JAK2)彼此間發生轉磷酸化及活化。另外，PRLR亦被磷酸 化且可結合於含SH2域之蛋白質，諸如STAT。結合受體之 STAT隨後被破酸化，自受體解離且易位至其刺激標把基因 之轉錄所在之核中。另外，已描述PRLR對Ras-Raf-MAPK 路徑之活化及對細胞質src激酶之活化（關於綜述，請參見 Endocrine Reviews 19:225-268，1998) 〇 PRLR介導之信號傳導在諸如以下之各種過程中起作 用：乳腺發育、泌乳、生殖、乳房腫瘤及前列腺腫瘤生 長、自體免疫疾病、全身生長及新陳代謝以及免疫調節 (Endocrine Reviews 19:225-268，1998 ; Annu. Rev. Physiol. 64:47-67, 2002) » 目前，不可能完全干擾PRLR介導之信號傳導。干擾 PRLR介導之信號傳導的唯一途徑為利用溴麥角環肽 (bromocriptine)及其他多巴胺（dopamine)受體2促效劑抑制 152407.doc 201130504 垂體 PRL 分泌（Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism 2(10): 571-581，2006)。然而，該等試劑不抑 制可成功補償垂體PRL合成之抑制的垂體外PRL合成，從 而產生幾乎未受損之PRLR介導之信號傳導（Endocrine Reviews 19:225-268，1998)。因此，多巴胺2型受體促效劑 不利於罹患乳癌或自體免疫疾病（諸如全身性狼瘡或類風 濕性關郎炎）之患者並不令人驚If (Breast Cancer Res.
Treat. 14:289-29，1989 ; Lupus 7:414-419，1998)，即使該 等疾病牵涉有催乳激素亦然。乳癌細胞或淋巴細胞中之局 部催乳激素合成分別在乳癌或自體免疫疾病中起關鍵作 用，且其不能被多巴胺受體促效劑阻斷。 儘管已為了提供用於以下之方法而作了上述努力：治療 或預防良性疾病及適應症（諸如子宮内膜異位症、子宮腺 肌症、雌性非激素性避孕、良性乳房疾病及乳腺痛、泌乳 抑制、良性前列腺增生、類纖維瘤、高催乳激素血症性及 正常催乳激素血症性毛髮減少）及在組合激素療法中用以 預防乳腺上皮細胞增殖之聯合治療，但尚無任何可滿足該 需要之化合物可利用°因此，本發明之一個目標在於藉由 it供作為„玄4良性疾病及適應症之治療劑之化合物來解決 該問題。 現在，已鑑別出新穎抗體，其對PRLR具有特異性及具 有尚親和力’因此中和pRLR介導之信號傳導，且可向個 體提供治療益處。 藉由中和PRLR抗體阻斷pRLR活化可完全抑制PRLR介導 152407.doc 201130504 之k號傳導。相比之下，多巴胺受體促效劑可能僅干擾回 應於增加之垂體催乳激素分泌而增強的pRLR介導之信號 傳導，而不干擾因活化PRLR突變或局部增加之催乳激素 產生而增強的PRLR介導之信號傳導。 因此’藉由提供以高親和力結合於PrLr、可有效中和 PRLR介導之信號傳導且較佳可與其他物種（諸如怪河獼猴 (Macacca mulatta)及食蟹獼猴（Macacca fascicularis)、小家 鼠（Mus musculus)或褐家鼠（Rattus norvegicus))之 PRLR 交 叉反應的抗體002-H06及其抗原結合片段或其變異體用於 治療先前提及之良性疾病及適應症來解決該問題。 一些PRLR抗體已描述於申請案w〇 2008/022295 (Novartis)及美國專利7,422,899(Biogen)中。本發明係基於 如下發現：新穎抗體對PRLR具有特異性及具有高親和 力，因此中和PRLR介導之信號傳導，且可向個體提供治 療益處（新穎抗體之序列如SEQ ID NO: 35、41、47及53中 所示）。本發明抗體可為人類抗體或人類化抗體或嵌合抗 體或經人類化工程改造’且可用於許多情況中，該等情況 更全面地描述於本文中。 【發明内容】 因此，本發明之一個目標在於一種抗體或抗原結合片 段，其中該抗體拮抗催乳激素受體介導之信號傳導。 新穎抗體『006-1108』、『〇〇2-則8』、『〇〇6-則7』、『001-E06』、『005-C04』為相應申請案之標的。 該等抗體於鼠類疾病模型中之活體内表徵僅對展現與鼠 152407.doc 201130504 類催乳激素受體之交又反應性之抗體有可能。僅如相應申 晴案中所揭示之抗體005-C04顯示與鼠類催乳激素受體有 充分的交叉反應性，且因此為可用於鼠類活體内模型之唯 一抗體。因此’由該抗體獲得之結果證明為相應申請案中 所揭示之所有其他催乳激素受體中和抗體在所分析之疾病 模型中的一般功效的代表。 在若干細胞系統中表徵該等抗體以在說明PRLR介導之 號傳導之滅活的不同讀數範例中確定其物種特異性及其 效力以及功效（參見實例5-10)。用大鼠Nb2-11細胞（實例 ό ’圖6)或經人類PRLR(實例5 ’圖5)或鼠類pRLR(實例 1 〇 ’圖10)穩定轉染之Ba/F細胞進行增殖檢定。然而， Novartis抗體XHA 06.983對大鼠及鼠類PRLR不顯示活性， Novartis抗體XHA 06.642對大鼠PRLR顯示活性，但對鼠類 PRLR不顯示。XHA 06.642抑制人類PRLR介導之信號傳導 (實例5、7、8)。相應申請案之新穎抗體006_h〇8關於經人 類PRLR穩定轉染之Ba/F細胞的增殖抑制顯示最高效力（實 例5，圖5)。相應申請案之新穎抗體〇〇5-C04為對鼠類（實例 10、9)及人類PRLR(實例5、7、8)顯示交又反應性之唯一 抗體。因此，與Nov^tis抗體XHA 06.642形成對比，新顆 抗體005-C04適用於在鼠類模型中測試對PRLR介導之信號 傳導的抑制。本申請案或相應申請案中描述之所有其他抗 體對人類PRLR具有特異性。除細胞增殖檢定（實例5、6、 10)之外，使用經人類（實例8)或鼠類（實例9)PRLR穩定轉染 且在LHRE(催乳激素反應元件）控制下經螢光素酶報導體基 152407.doc 201130504 因短暫轉染之HEK293細胞進行螢光素酶報導體檢定。使 用該等系統，Novartis抗體XHA06.642不能有效阻斷鼠類 PRXR介導之信號傳導再次變得顯而易見（實例9)。相比之 下，新穎抗體005-C04(相應申請案）阻斷鼠類PRLR對螢光 素酶報導體基因之活化（實例9)。使用人類T47D細胞中之 STAT5磷酸化作為額外讀數來分析抗體對人類PRLR之抑制 活性（實例7，圖7)。如所預期，非特異性抗體在所有所分 析之實驗範例中不具活性。 本發明係關於藉由提供抗PRLR抗體來抑制PRLR陽性細 胞之生長及先前提及之良性疾病及適應症之進展的方法。 本發明提供特異性結合於PRLR之細胞外域（ECD)(SEQ ID NO: 70)或SEQ ID NO: 70之人類多型變異體的人類單株抗 體、其抗原結合片段以及抗體及片段之變異體，諸如描述 於 PNAS 105 (38)，14533，2008 及 J. Clin. Endocrinol.
Metab. 95 (1), 271, 2010 中之 I146L及 I76V變異體。 本發明之另一目標在於一種結合於催乳激素受體之細胞 外域及其人類多型變異體之抗原決定基的抗體，其中該催 乳激素受體之細胞外域之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 70，且核酸序列對應於SEQ ID NO: 71。 本發明之抗體、抗原結合片段以及該等抗體及片段之變 異體包含輕鏈可變區及重鏈可變區。本發明中涵蓋之抗體 或抗原結合片段之變異體為維持抗體或抗原結合抗體片段 對PRLR之結合活性的分子（關於序列，參見表5)。 因此，本發明之一個目標在於一種抗體或抗原結合片 152407.doc 201130504 段，其中該抗體或抗原結合片段與抗體002-H06或其特定 之成熟變異體競爭。該等抗體及其成熟變異體之序列展示 於表5中。 本發明之一個目標亦在於一種抗體或抗原結合片段， a. 其中可變重鏈及輕鏈區之胺基酸序列在可變重鏈域中 與SEQ ID NO: 35之一致性及在可變輕鏈域中與SEQ ID NO: 41之一致性為至少60%，更佳為70%，更佳為 80%、或90%，或甚至更佳為95%，或 b. 其中CDR之胺基酸序列在重鏈域中與SEQ ID NO: 2、 8及13之一致性及在可變輕鏈域中與SEQ ID NO: 19、 25及30之一致性為至少60%，更佳為70%，更佳為 80%，更佳為90%，或甚至更佳為95%。 在一個實施例中，抗體或抗原結合片段包含如上所述之 抗體之CDR，其中 可變重鏈含有對應於SEQ ID NO: 2、8及13之CDR序 列，且可變輕鏈含有對應於SEQ ID NO: 19、25及3 0之 CDR序列。 在一個實施例中，揭示抗體002-H06及抗原結合分段， 其中 抗體002-H06包含對應於如SEQ ID NO: 47之核酸序列及 如SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的可變重鏈區， 以及具有如SEQ ID NO: 53之核酸序列及如SEQ ID NO: 4 1之胺基酸序列的可變輕鏈區。 在又一實施例中，所揭示之抗體或抗原結合片段含有 152407.doc -10- 201130504 1、2、3、4、5或6個對應於 SEQ ID N〇: 2、8、13、19、 25及 30之 CDR。 在本發明之另一實施例中，抗體〇〇2_H〇6由特異性結合 於胺基酸序列如SEQ ID NO: 70胺基酸位置1至21〇所示的 PRLR之一或多個區或對該一或多個區具有高親和力的抗 原結合區組成，其中該親和力為至少丨〇〇 nM，較佳為小於 約100 nM，更佳為小於約30 nM，甚至更佳為親和力小於 約10 nM，或甚至更佳為親和力小於1 nM，或甚至更佳為 親和力小於3 0 pM。 本發明之另一目標在於先前提及之抗體〇〇2_h〇6，其中 重鏈怪定區為經修飾或未經修飾之IgG1、Ig(J2、IgG3或 IgG4 〇 表1提供本發明代表性抗體之解離常數及解離速率之概 要’如藉由表面電漿子共振（Biac〇re)用PRLR之單體細胞 外域（SEQ ID NO: 70)對直接固定之抗體所測定。 表1 :藉由表面電漿子共振針對抗PrLR人類igGl分子所測 定的表現於HEK293細胞中之人類PRLR之細胞外域的單價 解離常數及解離速率 抗體 Kd[M] kd[l/s] 006-H08 0.7xl〇-y 2.4xl0'4 002-H06 2.7xl〇'y 5.4xl0*4 002-H08 1.8xl〇-y 2·〇χ10·4 006-H07 2.〇xl〇'y 1.3xl〇·3 001-E06 15.8xl〇'y 4.8X10'3 005-C04 12.2xl〇'9 9.3 xlO'3 HE06.642 0.3xl〇_y 3.2xl0'4 XHA06.642 1.2xl〇-y 1.3X10'4 XHA06.983 0.2xl〇'y 1.7xl0·4 152407.doc 201130504 使用IgGl格式進行基於細胞之親和力測定，藉由螢光活 化細胞分選（FACS)結合Scatchard分析來測定。 表2展示代表性IgG抗體對人類乳癌細胞株T47D及大鼠 淋巴瘤細胞株Nb2之結合強度》 表2 :如藉由FACS對人類乳癌細胞株T47D及大鼠淋巴瘤 細胞株Nb2所測定的抗PRLR抗體之基於細胞之結合效力 抗體 ECs〇[M] T47D Nb2 006-H08 1.3xlO'9 無結合 006-H07 0.4x10'9 無結合 001-E06 1.8χ10'9 1.2x10° 005-C04 1.9xl〇·9 0.5χ10·9 HE06.642 1.8χ10'9 0.9xl0*9 XHA06.642 1.5xl〇-9 l.lxlO'9 XHA06.983 0.3xl0'9 無結合 抗體產生 為了分離一組能夠在功能上阻斷人類及鼠類PRLR之抗 體，並行研究來自 Bioinvent(S6derlind 等人，2000, Nature BioTechnology. 18，852-856)且分別表現 scFv 及 Fab 片段之 稱為n-CoDeR®之合成人類抗體噬菌體呈現庫的兩種格 式。用於scFv或Fab選擇之標靶為以經生物素標記（NHS-LC 生物素，Pierce)及未經生物素標記之變異體形式採用的人 類PRLR之可溶性ECD(SEQ ID NO. 70之胺基酸位置1至 210)及小鼠PRLR之可溶性ECD(SEQ ID NO: 72之胺基酸位 置1至210)，以及表現PRLR之人類乳癌細胞株T47D。 使用噬菌體呈現技術（PDT)中各種方法之組合且藉由蛋 152407.doc •12· 201130504
白質及全細胞淘洗之組合及經由開發特定工具來分離高親 和力PRLR特異性人類單株抗體。淘洗工具及篩選方法包 括與Fc域融合重組表現之人類及小鼠PRLR之ECD(R&D Systems，目錄號分別為1167-PR及1309-PR ;分別為SEQ ID NO: 70及72之位置1-216，各融合於人類IgGl Fc域，即 . * ' 人類IgGl之位置1〇〇至330);與六組胺酸標記融合重組表 現之人類PRLR之細胞外域（SEQ ID NO: 70) ; HEK293及鼠 類淋巴瘤細胞株Ba/F ’各自分別經人類及鼠類PRLR穩定 轉染；及乳癌細胞株T47D及大鼠淋巴瘤細胞Nb2，各天然 表現PRLR ;以及開發能夠鑑別優先結合於呈現於細胞表 面上之PRLR且可與小鼠及大鼠之PRLR交叉反應之中和抗 體的淘洗程序及篩選檢定（參見實例6及10)。 藉由在ELISA測試中使用重組表現之抗原首先鑑別人類 PRLR之結合劑及最終鑑另ij小鼠PRLR之結合劑來進行篩 選。隨後，藉由FACS分析，接著測試該等試劑對細胞内 信號傳導之中和活性來檢驗Fab及scFv片段對T47D細胞之 細胞結合。出於該目的，測定對PRLR、STAT5及ERK1/2 在T47D細胞中之磷酸化的抑制（參見實例14)。使最佳的功 能阻斷性scFv及Fab轉化成完全IgGl分子，並在螢光素酶 報導體基因檢定中以及在增殖檢定中用依賴於催乳激素生 長之細胞來測試其對PRLR之ECD的單價親和力及抑制活 性。該等特定方法之組合允許分離作為本發明標的之新穎 抗體『002-H06』以及作為相應標的之抗體『006-H08』' 『002-H08』、『006-H07』、『001-E06』、『005-C04』。 152407.doc -13· 201130504 肽變異體 本發明抗體不限於本文提供之特定肽序列。更確切而 言，本發明亦包含該等多肽之變異體。參考本發明及習知 可利用的技術及參考文獻，習此相關技藝之人士將能夠製 備、測試及利用本文揭示之抗體的功能變異體，同時應瞭 解，能夠結合於及在功能上阻斷PRLR之變異體屬於本發 明之範疇。 變異體可包括例如與本文揭示之肽序列相比具有至少一 個改變之互補決定區（CDR)(高變）及/或構架（FR)(可變）域/ 位置的抗體。為更好地說明該概念，抗體結構簡述如下。 抗體由兩條肽鏈構成，各含有一個（輕鏈）或三個（重鏈） 恆定域及一個可變區（VL、VH)，後者在各情況下由四個 FR 區（VH : HFR1、HFR2、HFR3、HFR4 ; VL : LFR1、 LFR2、LFR3、LFR4)及三個分散之 CDR(VL : LCDR1、 LCDR2、LCDR3 ; VH : HCDR1、HCDR2、HCDR3)構成。 抗原結合位點由一或多個CDR形成，而FR區提供CDR之結 構構架，且因此，在抗原結合中起重要作用。藉由改變 CDR或FR區中之一或多個胺基酸殘基，習此相關技藝之人 士按常規可產生突變或多樣化抗體序列，該等序列可例如 就新或改良之性質針對抗原加以篩選。 圖12提供對可變域VL及VH中之各胺基酸位置編號的圖 解。表3(VH)及4(VL)描繪某些本發明抗體之CDR區且彼此 比較及與相應共同或「主控基因」序列比較既定位置之胺 基酸，其中CDR區以「X」標記。表5及6幫助給本發明中 152407.doc 201130504 提供之抗體、抗體片段及PRLR變異體分配SEQ ID號碼。 表3 : VH序列 001- E06 VH 002- H06 VH 002-H08 VH 005- C04 VH 006- H07 VH 006-H08 VH 共同
| -HCDR1—| | QVELLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS S.Y\<JMSWRQ APGKGLEWS QVELLESGGG LVQPGGSLRL 5CAASGFTFA N.YGLTWRQ APGKGLEWA QVELLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS S.YGMHWWQ APGKGLEWS EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS S.YWMHWRQ APGKGLEWS QVELLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFE D. HGMSWRQ APGKGLEWS QVELLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFD D.YGMSWRQ APGKGLEWA EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTXX X>00000<VRQ APGKGLEWX
--HCDR3-------1 TPLAYSSGWT YFDYWGQGTL VTV5S PLES____PV AFDIWGQGTL VTV5S G........G DFDYWGQGTL VTVSS 6LDA.....R RMDYWGQGTL VTVSS SLR.....AT AFDTWGQGTL VTVSS PLES____PV AFDIWGQGTM VIVSS XXXXXXXXXX XXXXWGQGTL VTVSS
LYLQMNSLRA LYLQMNSLRA LYLQMNSLRA LYLQMNSLRA LYLQMNSLRA LYLQMNSLRA LYLQMNSLRA 001- E06 VH 002- H06 VH 002-H08 VH 005- C04 VH 006- H07 VH 006-H08 VH 共同 001- E06 VH 002- H06 VH 002-H08 VH 005- C04 VH 006- H07 VH 006-H08 VH 共同
—---HCDR2— SVSDT.GTDT VISFN.GDKK GVSWN.GSRT DISSA.SSYT LISWDDG5NK VISYD.GSNK
HYADSVKGRF YYADSVKGRF HYAD5VKGRL NYADSVKGRF YYADSVKGRF YYADSVKGRF XXXXXXXXKF
TISRDNSKNT TISRDNSKNT TISRDNSKNT TISRDNSKNT TISRDNSKNT TISRDNSQNT TISRDNSKNT
EDTAVYYCAK EDTAVTYCAS EDTAVYYCAR EDTAVTYCAR EDTAVYYCAT EDTAVYYCAS EDTAVYYCXX 表4 : VL序列 I---LCDR1
001-E06 VL DIVLTQPPSA SGTPGQRVTI SC5GSSSNIG 5. NTVNWTQQ LPGTAPKLLI 002-H06 VL QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSY5NIG G. WPVNWYQQ LPGTAPKLLI 002-H08 VL QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSG5SSNIG S. WDVYWYQQ LPGTAPKLLI 005-C04 VL QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCTGSSSNIG AGYWHWQQ LPGTAPKLLI 006-H07 VL QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG N. WAVNWTQQ LPGTAPKLLI 006-H08 VL DIVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSNSNIG S. NPVNWYQQ LPGTAPKLLI 共同 QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI sooooooocx XXXXXXWYQQ LPGTAPKLLI |LCDR2| 1 · ----LCDR3— 001-E06 VL YRNYQRPSGV PDRF5GSK5G TSA5LAISGL RSEDEADYYC QSYDSSLSG. 002-H06 VL YGNSNRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC QSYDSSLSG- 002-H08 VL YDNNKRP5GV PDRF5G5K5G TSASLAISGL RSEDEADYYC QSYDSSLSGS 005-C04 VL YRNNQRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC AAWDDSLNG. 006-H07 VL YSNNQRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC AAWDDSLSG. 006-H08 VL YDNNKRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC QSYDTGLSG. 共同 YXXXXXXXGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYX XXXXXXXXXX 001-E06 VL SVFGGGTKLT VLGQ 002-H06 VL SVFGGGTKLT VLGQ 002-H08 VL WVFGGGTKLT VLGQ 005-C04 VL WLFGGGTKLT VLGQ 006-H07 VL WFGGGTKLT VLGQ 006-H08 VL WVFGGGTKLT VLGQ 共同 XXFGGGTKLT VLGQ -15- 152407.doc 201130504 VL核苷酸 SEQID ΙΛ ΙΛ ΙΛ 5) VO 00 OS VO VH核苷酸 SEQID 妄 QO ί?3 IT) VO VL蛋白質 SEQID o — VH蛋白質 SEQID 艺 ΙΛ Ρ； 00 Os 00 ΙΛ 〇\ ΙΛ s LCDR3 SEQID ON n 沄 ro ro 1 1 1 LCDR2 SEQID Ά ID <S η 00 <s 1 1 1 LCDR1 SEQID 90 s <s rs 1 1 1 HCDR3 SEQID rn jn 1 1 1 HCDR2 SEQID 卜 00 〇\ ο rj 1 1 1 HCDR1 SEQID fS tn VC 1 1 1 抗體 006-H08 002-H06 002-H08 006-H07 001-E06 005-C04 HE06.642 XHA06.642 XHA06.983 ί·ί^^_^οίΊΗ*Ι:9< SEQID Ο — JS 抗體 人類ECD PRLR(蛋白質） 人類ECD PRLR(核苷酸） 鼠類ECD PRLR(蛋白質） i鼠類ECD PRLR(核苷酸） 1 152407.doc -16- 201130504 習此相關技藝之人士可使用表3、4及5中之資料來設計 屬於本發明範疇内之肽變異體。較佳的是，藉由改變一或 多個CDR區内之胺基酸來構築變異體；變異體亦可能具有 一或多個改變之構架區（FR)。舉例而言，肽FR域可能經改 變，其中與生殖系序列相比，殘基有偏差。 參考新穎抗體與圖12中所列之相應共同或「主控基因」 序列之比較，可改變之候選殘基包括例如以下者： -VH 006-H08(SEQ ID 34)中位置75處可變為麩醯胺酸 (Q)之殘基離胺酸（K); -VH 006-H08(SEQ ID 34)中位置108處可變為甲硫胺酸 (M)之殘基白胺酸（L); -VH 006-H08(SEQ ID 34)中位置110處可變為異白胺酸 (I)之殘基蘇胺酸（T); -VH 002-H08(SEQ ID 36)中位置67處可變為白胺酸（L) 之殘基苯丙胺酸（F)。 此外，變異體可藉由成熟來獲得，亦即藉由使用一個抗 體作為最佳化起始點，使抗體中之一或多個胺基酸殘基、 較佳為一或多個CDR中之胺基酸殘基多樣化，及篩選所得 抗體變異體集合中的具有改良性質之變異體來獲得。尤其 較佳為使VL之LCDR3、VH之HCDR3、VL之LCDR1及/或 VH之HCDR2中的一或多個胺基酸殘基多樣化。可藉由使 用三核苷酸突變誘發（TRIM)技術合成DNA分子集合來進行 多樣化[VirnekSs，B.，Ge，L” PlUckthun，A” Schneider， K.C·，Wellnhofer, G·及 Moroney S.E. (1994) Trinucleotide 152407.doc -17- 201130504 phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucl. Acids Res. 22, 5600] 〇 保守性胺基酸變異體 可製備保留本文所述之抗體肽序列之整體分子結構的多 肽變異體。鑒於個別胺基酸之性質，一些合理的取代將為 習此相關技藝之人士所認可。胺基酸取代，亦即「保守性 取代」’可例如基於所涉及之殘基之極性、電荷、溶解 性、疏水性、親水性及/或兩性性質的類似性來進行。 舉例而言’（a)非極性（疏水性）胺基酸包括丙胺酸、白胺 酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲 硫胺酸；（b)極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺 酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩醢胺酸；帶正電 (驗性）胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；及（d)帶負電 (酸性）胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。取代通常可在組 (a)-(d)内進行。另外’甘胺酸及脯胺酸可基於其破壞^^螺 旋之能力經彼此取代。類似地，某些胺基酸，諸如丙胺 酸、半胱胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、 組胺酸及離胺酸更通常可在α螺旋中發現，而纈胺酸、異 白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及蘇胺酸更通常可在 β摺疊片中發現。甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺 及脯胺酸通常在轉折中發現。一些較佳取代可在以下組中 進行：（i) S與Τ ; (ii) Ρ與G ;及（iii) A、V、L及I。繁於已 知遺傳密碼及重組及合成DNA技術，有經驗的科學家可容 152407.doc 201130504 易地構築編碼保守性胺基酸變異體之DNA。 如本文所使用，兩個多肽序列之間的「序列一致性」指 示序列之間相同的胺基酸所佔之百分比。「序列同源性」 指示相同或表示保守性胺基酸取代之胺基酸所佔的百分 比。本發明之較佳多肽序列在CDR區中的序列一致性為至 少60%，更佳為至少70%或80%，又更佳為至少90%，且最 佳為至少95%。較佳抗體在CDR區中之序列同源性亦為至 少80%，更佳為90%且最佳為95%。 本發明之DNA分子 本發明亦係關於編碼本發明抗體之DNA分子。該等序列 包括（但不限於）如SEQ ID NO 47、53中所示之彼等DNA分 子。 本發明之DNA分子不限於本文所揭示之序列，而是亦包 括其變異體。本發明内之DNA變異體可參考其在雜交中之 物理性質來描述。習此相關技藝之人士應認識到，可使用 DNA，利用核酸雜交技術來鑑別其互補序列，且因為DNA 為雙股，所以可鑑別其等效物或同源物。亦應認識到，雜 交可在小於100%之互補性下發生。然而，倘若適當選擇 條件，則雜交技術可用於基於與特定探針之結構相關性區 分DNA序列。關於該等條件之指南，參見Sambrook等人， 1989[Sambrook，J·，Fritsch，E. F·及 Maniatis, T. (1989)
Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA)]及 Ausubel 等人，1995 [Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. 152407.doc -19- 201130504 E·，NWe，D. D.，Sedman，G.，Smhh，】A 及 w福 κ 編，（1995). Current Protocols in M〇lecular 則〇1，Μ
York: John Wiley and Sons]。 兩個聚核㈣序列之間的結構相似性可表示為兩個序列 將彼此雜交所處之條件之「嚴格度」的函數❶如本文所使 用’術語「嚴格度」係指條件不利於雜交之程度。嚴格條 件極不利於雜交，且僅結構最相關之分子方在該等條件下 彼此雜交。反之，非嚴格條件有利於展現較小結構相關度 之分子雜交。因此，雜交嚴格度與兩個核酸序列之結構關 係直接相關。以下關係適用於將雜交與相關性相關聯（其 中Tm為核酸雙鏈體之熔融溫度）： a. Tm = 69.3 + 0.41(G+C)°/〇 b. 錯配鹼基對之數目每增加1 % ’雙鏈體〇να之Tm降低rc c. (Tm)M2-(Tm)Mi = 18.5 1ο§,〇μ2/μ1 其中μΐ及μ2為兩個溶液之離子強度。 雜交嚴格度隨許多因素而變化，包括整體DNA濃度、離 子強度、溫度、探針尺寸及存在破壞氫鍵結合之試劑。促 進雜交之因素包括高DNA濃度、高離子強度、低溫、較長 探針尺寸及不存在破壞氫鍵結合之試劑。雜交通常分兩期 進行：「結合」期及「洗滌」期。 首先，在結合期中，探針在有利於雜交之條件下結合於 標靶。在該階段，通常藉由改變溫度來控制嚴格度。對於 高嚴格度，除非使用短（<20 nt)之寡核苷酸探針，否則溫 152407.doc •20· 201130504 度通常在65°C與70°C之間。代表性雜交溶液包含“SSC、 0.5% SDS、5χ 登哈特氏溶液（Denhardt，s 3〇11^011)及1〇〇 叫 非特異性載體DNA[參見Ausubel等人，2.9章節，增刊27 (1994)^當然’已知許多不同但功能等效之緩衝條件。當 相關度較低時’可選擇較低溫度。低嚴格度結合溫度在約 25 C與40°C之間。申嚴格度在至少約4〇°c與小於約65。匚之 間。高嚴格度為至少約65。(：。 其次，藉由洗滌來移除過量探針。在該洗滌期時，通常 應用更嚴格的條件《因此，該「洗滌」階段在經由雜交測 疋相關性時最為重要。洗滌溶液通常含有較低鹽濃度。一 種例示性中嚴格度溶液含有2xSSC及〇1% SDS。高嚴格度 洗滌溶液含有少於約0.2XSSC之等效物（離子強度），其中 較佳嚴格溶液含有約0.lxSSC。與各種嚴格度相關之溫度 與上文關於「結合」所論述相同。在洗滌期間，洗滌溶液 通常亦更換若干次。舉例而言’典型的高嚴格度洗務條件 包含在55。(：下洗滌兩次，持續3〇分鐘，及在6〇t>c下洗滌三 次，持續1 5分鐘。 因此，本發明之目標在於一種分離之核酸序列，其編碼 本發明之抗體及抗原結合片段。 本發明之另-實施例為先前提及之分離之核酸序列，其 編碼本發明之抗體，|中該等核酸序列如表5中所示。 因此，本發明包括在高嚴格度結合及洗滌條件下與卿 ID 47及53中所示之分子雜交的核酸分子其中該等核酸 分子編碼具有本文所述之性f的抗體或其功能片段。較佳 152407.doc -21· 201130504 分子（自mRNA觀點而言）為彼等與本文所述2DNA分子之 的同源性或序列一致性為至少75〇/。或8〇%(較佳為至少 85 /° ’更佳為至少90%且最佳為至少95%)之分子。該等分 子阻斷催乳激素受體介導之信號傳導。 功能等效變異體 本發明範疇内之另一類DNA變異體可參考其編碼之產物 進行描述。該等功能等效基因之特徵在於歸因於遺傳密碼 之簡併性’其編碼SEQ ID No: 34-45中所示之相同肽序列 的事實》 應認識到’本文提供之DNA分子之變異體可以若干不同 方式構築。舉例而言，其可構築成完全合成之DNA。可廣 泛利用能有效合成處於2〇至約15〇個核苷酸範圍内之寡核 苦酸之方法。參見Ausubel等人，2.11章節，增刊21 (1993)。重疊的寡核苷酸可以最初由Khorana等人，j. Μ〇ι. Biol. 72:209-217 (1971)所報導之方式合成及裝配；亦參見 Ausubel等人’同上，8.2章節。合成的DNA較佳經設計而 具有在基因之5,及3,端處經工程改造之適宜限制位點以有 利於選殖於適當載體中。 如所指示，產生變異體之方法在於以本文所揭示2DNA 之一起始，隨後進行定點突變誘發《參見Ausubel等人， 同上，第8章，增刊37 (1997)。在典型方法中，將標乾 DNA選殖於單股DNA噬菌體媒介中。分離出單股dNA且與 含有所需核苷酸變化之募核苷酸雜交。合成互補股，且將 雙股噬菌體引入宿主中。一些所得子代將含有所需突變 152407.doc •22· 201130504 體，其可使用DNA測序來證實。另外，可利用各種增加子 代噬菌體將為戶斤需突變體之幾㈣方法。1¾等方法為熟習 此項技術者所熟知，且用於產生該等突變體之套組可自市 面上購得。 重組DNA構築體及表現 本發明進一步提供包含本發明之一或多個核苷酸序列的 重組DNA構築體。本發明之重組構築體與載體相結合使 用，該載體諸如有質體、噬菌粒、噬菌體或病毒載體，在 該載體中插入編碼本發明抗體之Dn a分子。 編碼基因可藉由Sambrook等人，1989及Ausubel等人， 1989中所述之技術產生。或者，DNA序列可使用例如合成 儀化本合成。參見例如 Oligonucleotide Synthesis(1984, Gait編，IRL press，〇xf〇rd)中所述之技術，該文獻以全文 引用之方式併入本文中。此項技術之專家能夠融合編碼各 種人類IgG同型或其突變或未突變衍生物之可變域之〇να 與編碼其恆定區之基因片段。能夠應用重組DNA技術以使 用連接子使兩個可變域融合成單鏈格式，該等連接子諸如 有15個胺基酸的片段，其含有三個甘胺酸_甘胺酸_甘胺酸_ 甘胺酸-絲胺酸。本發明之重組構築體與能夠表現rNA及/ 或編碼DNA之蛋白質產物的表現載體包含在一起。載體可 進一步包含調控序列’包括可操作地連接於開放閱讀構架 (ORF)之啟動子。載體可進一步包含可選擇的標記物序 列。特異性起始及細菌分泌信號亦可為有效轉譯插入之標 靶基因編碼序列所需。 152407.doc -23· 201130504 本發明進一步提供含有至少一種本發明之DNA的宿主細 胞。宿主細胞可為幾乎任何可利用表現載體之細胞。其可 為例如較高等真核宿主細胞，諸如哺乳動物細胞；較低等 真核宿主細胞，諸如酵母細胞，且可為原核細胞，諸如細 菌細胞。引入重組構築體於宿主細胞中可利用磷酸鈣轉 染、DEAE、葡聚糖介導之轉染、電穿孔或噬菌體感染來 實現。 細菌表現 藉由插入編碼所需蛋白質之結構DNA序列連同與功能啟 動子處於可操作閱讀相中之適合轉譯起始及終止信號來構 築適用於細菌使用之表現載體。載體將包含一或多個表型 可選擇標記物及複製起點以確保維持載體且必要時在宿主 内提供擴增。適於轉型之原核宿主包括大腸桿菌（£ 、枯草桿菌（β⑽7/Mi 仏）、鼠傷寒沙門菌 及假單胞桿菌屬、鏈黴菌屬及葡 萄球菌屬内之各種物種。 細菌載體可例如基於噬菌體、基於質體或基於噬菌粒。 該等載體可含有源自通常含有熟知選殖載體pBR322(ATCC 37017)之兀件的可自市面上購得之質體的可選擇標記物及 細菌複製起點。在轉型適合之宿主菌株且使宿主薗株生長 至適當細胞密度後，利用適當方法（例如，溫度變動或化 學誘導）去阻遏/誘導所選擇的啟動子，且將細胞再培養一 段時間。通常利用離心收集細胞，利用物理或化學方法破 壞細胞’且保留所得粗提取物用於進一步純化。 152407.doc •24- 201130504 在細菌系統中，視所表現之蛋白質之預定用途而定，宜 選擇許多表現載體。舉例而言，#需產生大量該類蛋白質 例：^用於產生抗體或篩選肽庫時，可能需要能引導可容易 地純化之融合蛋白質產物之高量表現的載體。 因此，本發明之一目標在於一種表現載體，其包含編碼 新穎的本發明抗體之核酸序列。 哺乳動物表現及純化 用於哺乳動物宿主細胞表現之較佳調控序列包括在哺乳 動物細胞中引導高量蛋白質表現之病毒元件’諸如源自巨 細胞病毒（CMV)(諸如CMV啟動子/強化子）、猿猴病毒 4〇(SV40)(諸如SV40啟動子/強化子）、腺病毒（例如腺病毒 主要晚期啟動子（AdMLP))及多形瘤之啟動子及/或強化 子。關於病毒調控元件及其序列之進一步描述，參見例如 Stinski 之 U.S. 5，168,062、Bell 等人之 u s 4 51〇 245 及
Schaffner等人之u.S_ 4,968,61^重組表現載體亦可包括複 製起點及可選擇的標記物（參見例如Axel等人之U s 4,399,216、4,634,665 及 U.S. 5，179,017)。適合的可選擇標 記物包括賦予已引入有載體之宿主細胞耐藥（諸如G4i 8、 潮黴素或曱胺喋呤）性的基因。舉例而言，二氫葉酸還原 酶（DHFR)基因賦予耐曱胺喋呤性，且neo基因賦予耐G418 性。 將表現載體轉染於宿主細胞中可使用標準技術進行，諸 如電穿孔、磷酸鈣沈澱及DEAE-葡聚糖轉染。 適於表現本文提供之抗體、抗原結合部分或其衍生物之 152407.doc •25· 201130504 哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢（CHO細胞）[包括 dhfr-CHO細胞，描述於 Urlaub 及 Chasin，（1980) Proc· Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 中，與DHFR 可選擇標記物一 起使用，例如 R. J· Kaufman及 P. A· Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621中所述]、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細 胞。在一些實施例中，表現載體經設計以使表現之蛋白質 分泌於宿主細胞生長所在之培養基中。可使用標準蛋白質 純化方法自培養基中回收抗體、抗原結合部分或其衍生 物。 可利用熟知方法自重組細胞培養物中回收及純化本發明 之抗體或其抗原結合片段’該等方法包括（但不限於）硫酸 銨或乙醇沈澱、酸萃取、蛋白質A層析、蛋白質g層析、 陰離子或陽離子交換層析、磷酸基_纖維素層析、疏水性 相互作用層析、親和層析、經基破灰石層析及凝集素層 析。亦可採用高效液相層析（「HPLC」）進行純化。參見例 如 Colligan’ Current Pr〇t〇c〇ls in Imm_1〇gy 或⑸代加
Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)，例如第！、4、6、8、9、1〇章各以全文引 用之方式併入本文中。 本發明之抗體或其抗原結合片段包括天然純化之產物、 化學合成程序之產物、及藉由重組技術自真核宿主(包括 例如酵母、高等植物、昆蟲及哺乳動物細胞)產生之產 物。視重組產生程序中所採用之宿主而定，本發明之抗體 可經糖基化或可未經糖基化。該等方法描述於許多標準實 152407.doc •26- 201130504 驗手冊上’諸如Sambrook，同上，17 37 ΐ7 μ章節； Ausube卜同上，第1〇、12、13、16、^及⑼章。 因此，本發明之一個目標亦在於宿主細胞，其包含載體 或核酸分子，以該宿主細胞可為較高等真核宿主細胞， 諸如哺乳動物細胞；較低等真核宿主細胞，諸如酵母細 胞；且可為原核細胞，諸如細菌細胞。 本發明之另一目標在於一種使用宿主細胞來產生抗體或 ，原結合片段的方法，該方法包含在適合之條件下培養該 宿主細胞及回收該抗體。 因此本發明之另一目標在於用本發明之宿主細胞產生 且已純化至至少95重量〇/〇均質性的抗體〇〇2_H〇6 ^ 子宮内膜異位症及子宮腺肌症（子宮内子宮内臈異位） 子宮内膜異位症為良性的雌激素依賴性婦科病症，以子 宮腔外部存在子宮内膜組織（腺及基質）為特徵。子宮内膜 異位病灶主要在骨盆腹膜上、卵巢及直腸陰道隔中發現 (Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. 24:235-238，1997)。子 呂内膜異位症時常與不孕及疼痛症狀（諸如痛經）有關。另 外，許多患者罹患自體免疫疾病（Hum Repr〇d 17(19): 2715-2724, 2002) »亦稱為子宮内子宮内膜異位之子宮腺 肌症描述限於子宮中之子宮内膜異位症之一種衍生形式。 在子宮腺肌症之情況下，子宮内膜腺侵入子宮肌層及子宮 壁。 根據移植理論，在患者與健康女性中，子宮内膜片段因 逆行月經而沖入至腹膜腔中（0bstet. Gynec〇i. 64:151-154 152407.doc -27- 201130504 1984)。四個主要因素似乎與患者骨盆腔中子宮内膜異位 病灶的成功形成密切相關： a) 在月經週期分泌後期’健康女性之子宮内膜細胞调 亡。在患者中’子宮内膜細胞之凋亡程度明顯下降 (Fertil. Steril. 69:1042-1047，1998)。因此，在患者 中’已因逆行月經沖入腹膜腔中之子宮内膜片段不死 亡且成功植入的概率比健康女性高。 b) 為使異位子宮内膜片段成功植入腹膜中並長期存活， 不得不形成新血管（British Journal of Pharmacology， 149:133-135, 2006)。 c) 許多患者罹患自體免疫疾病’且具有缺乏抵抗力的免 疫系統（Hum. Rep rod. 17(19): 2002，2715-2724, 2002)。此可得出以下結論，健康女性中所存在之完 整免疫反應可在防止子宮内膜異位病灶之形成方面起 作用。 d) 病變不得不生長，且因此取決於促有絲分裂刺激及生 長因子之存在。 為了 /α療子呂内膜異位症，目前存在以下方法： a) 促性腺激素釋放激素（GnRH)模擬物：抑制印巢雌二 醇合成及誘導關鍵依賴於雌二醇之存在來生長之異位 子宮内膜異位植入物萎縮。 b) 方香酶抑制冑：由子宮内膜異位植入物抑制雕二醇之 局。P產S ’誘導〉周亡及抑制異位子宮内膜異位月段之 增殖。 152407.doc •28· 201130504 C)選擇性雌激素受體調 入仏士 劑在正常子宮内膜及異位植 入物中具有雌激素受體 L… 抗活性，且因此引起植入之 異位子S内膜異位組織萎縮。 d)助孕綱受體促效劑： @及異位子宮内膜細胞增 殖’誘導分化及凋亡。 阻止疾病進展，及誘導 e)組合口服避孕藥：維持現狀 異位及正位子宮内膜萎縮。 0外科手術切除病變。
GnRH類似物、SERM及芳香酶抑制劑具有嚴重副作用且 在患有子宮内膜異位症之年輕女性令引起熱潮紅及骨質流 失。用助孕_受體促效劑治療引起排卵抑制、不規律月經 出血而後相經、體重增加及抑鬱因於靜脈▲检检塞 之風險增加，故組合口服避孕藥不適用於大於35歲之女 性、吸煙者及體重超重之個體。外科手術切除病灶傾向於 復發率高。 本發明抗體干擾由錢產生及局部產线乳激素所刺激 或因活化PRLR突變所致的PRLR介導之信號冑導，且因此 比僅干擾垂體催乳激素分泌之多巴胺_2受體促效劑有效。
PRL及PRLR表現於子宮中且在正常子宮生理學中起作 用；PRL可充當有效的有絲分裂原且具有免疫調節作用。 在本發明中，已證實PRL/PRLR系統之變化在人類子宮内 膜異位症中起作用。利用定量Taqman PCR對PRL及PRLR 在健康女性之子宮内膜及患者之子宮内膜及病灶中之表現 的分析（參見實例2)展示於圖1及2中。 152407.doc •29- 201130504 如圖1(PRL表現）及圖2(PRLR表現）中所示，PRL與其受 體在子宮内膜異位病灶中被大幅上調。該發現初次產生以 下的實驗證據：自分泌PRL信號傳導可在子宮内膜異位病 灶之形成、生長及維持中起基本作用。 PRLR抗體已在子宮内子宮内膜異位動物模型（亦即小鼠 子宮腺肌症模型）中被成功測試（參見實例2〇)。子宮腺肌症 之特徵在於子宮内膜腺體在子宮内膜之子宮肌層中浸潤性 生長。此類似子侷限於子宮中之子宮内膜異位症形式，即 非行經物種可能患上之子宮内膜異位症之唯一形式。在患 有子s内膜異位症之患者之臨床治療中有效的達那〇坐 (Danazol)亦能有效治療子宮腺肌症（Life Sciences 5 1:1119_ 1125，1992)。然而，達那唑為雄激素助孕素且在年輕女性 中產生嚴重的雄激素副作用，此限制其使用。 本發明抗體可解決該問題，從而提供新的子宮内膜異位 症治療或預防法，且展現比現行標準療法少之副作用。 因此，本發明之另一態樣在於採用PRLR中和抗體及抗 原結合片段來治療或預防子宮内膜異位症及子宮腺肌症 (子宮内子宮内膜異位）。 本發明之另一態樣在於使用本發明所述之抗體及抗原結 合片段來治療或預防子宮内膜異位症及子宮腺肌症（子宮 内子宮内膜異位）。 雌性非激素性避孕 目前雌性避孕之方法如下： a)含有雌激素及助孕素之組合口服避孕藥p 152407.doc 201130504 助孕素組分經由向下丘腦_垂體_性腺軸提供負反饋介 導避孕作用。雌激素組分保證良好出血控制，且經由 在標乾細胞中誘導助孕酮受體增強促孕作用。 b) 僅含助孕素之子宮内裝置。 局部釋放之助孕素使子宮内膜呈抗植入狀態。另外， 子S頸黏膜變得對精細胞而言幾乎不滲透。 c) 僅助孕素之藥丸及植入物。 助孕素經由向下丘腦-垂體-性腺軸提供負反饋抑制排 卵。另外，子宮頸黏膜對精細胞之滲透性減小。 d) 含有炔雌醇加助孕素之陰道環。 組合口服避孕藥之主要副作用為靜脈血栓栓塞（vte) 風險升高。此外，超重或吸煙女性以及患有自體免疫 疾病（諸如狼瘡）之女性及大於35歲之女性不能使用口 服組合避孕藥。 僅含助孕素之子宮内裝置及植入物會導致異常子宮出 血0 僅助孕素之藥丸可導致不規律出血模式、血斑、閉經。 異位妊娠風險增加。體重增加及骨質密度減小為其他副作 用。 陰道環會導致陰道炎、白帶或排出。 幾年前已產生PRLR缺陷小鼠（Genes Dev 1ι:ΐ67 ΐ78 1997)。有趣的是，PRLR缺陷雌性小鼠完全不孕，作雄性 小鼠則不然。PRLR"·雌性展現受精”發育立即停滞，亦 即其展示植入前發育停滯。僅極少數卵母細胞達到囊胚 152407.doc -31 · 201130504 女且不犯植入突變雌性中，但在野生型養母中在移植後 月成正常胚胎。PRLR缺陷小鼠之不孕症表型可藉由補 充助孕酮來援救直至妊娠中期。顯然，PRLR介導之信號 專導在產生允+及維持姓娠所必需之助孕酮之黃體的維持 及力鲍中發揮重要作用。另夕卜’ pRLR缺陷雌性展現與腹 月曰肪質直減少及瘦素含量相關之體重減輕，但雄性則不 然。 冱7為止，尚未知失活人類PRLR突變，因此PRLR介導 之信號傳導在人類生育力中之精確作用仍未知。然而，越 來越多的證據表明’在人類中亦需要最低催乳激素含量來 達成成力姓it用，臭麥角環肽（br〇m〇criptin)治療患有由高 催乳激素血症性黃體功能不全所致之原發性不孕症的患 者在二清況下，催乳激素含量受過度抑制，且縮短之 黃體期再次重現（Bohnet HG等人，Lisuride and❶让打 dopamine agonists，D.B Calne 等人編，κ_η μ% New York，1983)。由該等資料推斷，高催乳激素狀態及低催乳 激素狀態負面干擾雌性生育力。此可由pRL與其受體之相 互作用得以說明。在低催乳激素含量之情況下，無充分的 受體活化 '而在高催乳激素血症之情況下，亦無充分的受 體活化，因為所有受體由催乳激素分子阻斷且不再能二聚 合。換έ之，催乳激素之劑量反應為鐘形，且最佳受體活 化僅在一定濃度範圍内達成。第二研究有證據表明，患者 中缺乏子宮内膜催乳激素表現導致早期植入失敗（Human Reprod. 19:1911-1916, 2004)。此外，已展示催乳激素可離 I52407.doc 32· 201130504 體預防培養之人類顆粒細胞凋亡，且因此維持早期黃體功 能’此已在PRLR缺陷小鼠中得以證明（Hunian Repr〇d 18:2672-2677, 2003)。 為測試PRLR中和抗體之避孕功效，用特異性及非特異 性PRLR抗體注射小鼠且如實例丨丨中所述與雄性交配。其 讀數為每處理組之离數及每動物之寫仔數。圖丨丨中所呈現 之實驗證明，用本發明之中和抗體處理當在每公斤體重3〇 mg下測試時完全預防小鼠妊娠。 與先前提及之標準方法相比，用pRLR中和抗體之雌性 避孕具有若干優點： -抗體可用於吸煙、超重及老年女性中以及患有紅斑狼瘡 之女性中（PRLR抗體甚1可有益於治療狼瘡及減少腹部脂 肪，亦即PRLR缺陷小鼠具有較少腹部脂肪）。 -PRLR抗體不使VTE(靜脈血栓栓塞）風險升高。 -與組合口服避孕藥中使用之雌激素及助孕素形成對比， PRLR介導之信號傳導引起乳房上皮細胞增殖受抑制，且 與生育控制之激素方法形成對比，甚至可預防使用者患乳 癌。 本發明之另-目標在於使用PRLR中和pRLR抗體及抗原 結合片段用於雌性避孕，且與標準療法相比，副作用減 少〇 本發明之另-態樣在於使用如本發明所述之抗體及抗原 結合片段用於雌性避孕’且與標準療法相比，副作用減 少0 152407.doc •33· 201130504 良性乳房疾病及乳腺痛 良性乳房疾病涵蓋多種症狀’諸如纖維囊性乳房疾病、 纖維腺瘤、乳腺痛及大包囊。30-50%絕經前女性患有纖維 囊性乳房疾病（Epidemiol Rev 19:310-327，1997)。視女性 年齡而定’良性乳房疾病可呈現有獨特的表型（J Mammary
Gland Biol Neoplasia 10:325-33 5, 2005):在生殖早期期間 (15-25歲）’當正常乳房發生小葉發育時，良性乳房疾病產 生纖維腺瘤。觀測到單一巨型纖維腺瘤以及多種腺瘤。該 等纖維腺瘤由基質以及上皮細胞構成且由小葉產生。在成 熟生殖期中（25-40歲），乳房在各月經週期期間，發生週期 性變化。患病女性呈現有週期性乳腺痛及在乳房中有若干 結節。後來（3 5-55歲）’正常乳房退化，而在患病者中，可 觀測到乳房大包囊及上皮增生，伴有及不伴有異形性。伴 隨上皮細胞增殖增強之良性乳房疾病之彼等形式患上乳癌 之風險較高。若增殖細胞部分中存在細胞異形性，則該風 險可高達 ll%(Zentralbl GynSkol 119:54_58，1997)。250/〇 60-80歲大之女性亦會患良性乳房疾病，雌激素替代療法 或肥胖通常為絕經後持續性良性乳房疾病之原因（Am 了 Obstet Gynecol 154:161-179, 1986) 〇 纖維囊性乳房疾病之病理生理學由雌激素優勢及導致結 締組織過度增殖（纖維化）繼而兼性上皮細胞增殖之助孕酮 缺乏決定。如早已提及，乳腺癌在展現纖維囊性病灶内上 皮細胞增殖增強之患者中風險升高。臨床纖維囊性乳房疾 病呈現有乳房疼痛及乳房觸痛。70%患有纖維囊性乳房疾 152407.doc -34- 201130504 病之患者患有貫體功能不全或排卵停止（Am J Obstet 154:161-179，1986) ^黃體功能不全導致助孕酮含量減少及 雌激素優勢。 乳腺痛（乳房疼痛）對約70%之女性在生殖生命期之某段 時間產生影響。乳房疼痛可能與或可能不與經前症候群之 其他標準相關。已證明，患有乳腺痛之女性作出刺激下丘 腦垂體軸後釋放過量催乳激素的反應（Clin End〇eHn〇1 23:699-704,1985)。 良性乳房疾病及乳腺痛之標準療法為： 1)溴麥角環肽 作為多巴胺促效劑之溴麥角環肽僅阻斷垂體催乳激素合 成，但不阻斷乳腺上皮細胞中催乳激素之局部合成。因 此’其僅在彼等依賴於升高之全身性催乳激素含量之乳腺 痛及良性⑽疾㈣式中有效。溴、麥角環肽之主要副作用 頭痛及幻覺。 心〜、嘔吐、水腫、低血壓、眩暈、毛髮減少 2)達那唑 良性I:房坐=素助孕素’經由其抗促性腺激素活性《 良Μ房疾病巾所觀測到之雌激素優勢。主要 月經不規律、抑鬱、痤瘡 用為. 及體重增加。◎夕毛症、聲音深沉及熱潮㈣ 3)他莫昔芬（tamoxifen) ’在乳房+具有抗 °主要副作用為： 他莫昔芬為選擇,j·生雌激素受體調節劑 雌激素活性且在子 你于呂中具有雌激素活性 152407.doc -35- 201130504 絕經後症狀，諸如骨質流失及熱潮紅、卵巢囊腫及子宮内 膜癌瘤。 4) 助孕素 助孕素經由抑制垂體性腺軸、抑制排卵及耗盡雌激素來 抑制良性乳房疾病。雌激素耗盡產生絕經症狀，諸如骨質 流失及熱潮紅。 5) 低劑量組合口服避孕藥 該治療不適用於大於35歲女性、吸煙女性以及糖尿病性 及超重患者。 一般而言，已發現在三分之一之患有良性乳房疾病之女 性中催乳激素含量增加◦因為雌激素增強垂體催乳激素分 泌’所以已認為在該疾病中’血清催乳激素含量增加為雌 激素佔優勢之結果》已報導，活化PRLR突變通常存在於 患有多種乳房腺瘤（類似纖維囊性乳房疾病亞型）之女性中 (Paul Kelly, Breast Congress Turin，2007，及 Proc Natl Acad Sci 105: 14533-14538; 2008)。 良性乳房疾病、乳腺痛及經前乳房緊張依賴於一種常見 生理疾病機制：催乳激素信號傳導增強。升高之催乳激素 信號傳導可為以下之結果： 全身性高催乳激素血症（歸因於垂體腺瘤）。 局部高催乳激素血症（歸因於增殖乳腺上皮細胞中之 催乳激素合成）。局部高催乳激素血症不轉化成血液 中升高之催乳激素含量。 在正常催乳激素含量存在下之組成性活性PRLR信號 152407.doc -36 - 201130504 傳導（歸因於活化PRLR突變）。 鑒於良性乳房疾病之某些形式會產生乳腺癌，故對治療 該疾病存在醫學需要。 為sf明PRLR中和抗體在良性乳房疾病之臨床前模型中 之功效’採用基於全身性高催乳激素血症之小鼠模型。如 貫例16中所述，在腎包膜下給成年Balb/c小鼠移植垂體同 源移植物（Methods in Mammary gland Biology and Breast
Cancer Research，101·107, 2〇〇〇)。與未處理原始對照小鼠 相比’全身性高催乳激素血症導致乳腺中之上皮細胞增殖 増強，且刺激側邊分枝及小葉腺泡發育。具有較高患癌風 險之人類纖維囊性乳房疾病之大多數嚴重形式的特徵在於 上皮細胞增殖增強》如在實例16中所述，與非特異性抗體 相比’就以下能力在Balb/c小鼠模型中測試prlR中和抗 體： 阻斷側邊分枝及小葉腺泡發育 抑制乳腺上皮細胞增殖 抑制STAT5之磷酸化，STAT5為通常在PRLR活化後活 化及磷酸化之轉錄因子。 如圖15A-C中所證明’ PRLR中和抗體以劑量依賴性方式 阻斷所有以上提及之讀數範例。 本發明之另一目標在於使用PRLR中和抗體及抗原結合 片段治療絕經前及絕經後女性之良性乳房疾病及乳腺痛。 本發明之另一態樣在於使用如本發明所述之抗體及抗原 結合片段治療絕經前及絕經後女性之良性乳房疾病及乳腺 152407.doc -37· 201130504 痛0 泌乳抑制 催礼激素為为挽後泌乳所涉及之主要激素。此由pRLR 缺陷小鼠之表型得到證明。即使雜合小鼠亦具有嚴重的哺 乳問題’且完全不能給其後代餵奶（Fr〇ntiers &
Neuroendocrinology 22:140-145, 2001) ο 出於許多原因，女性不得不停止母乳餵養，亦即母體攝 入藥物對幼兒有潛在危險、嚴重感染（乳房炎、腎炎）、產 後大出血及嚴重母體疾病（諸如糖尿病、癌）以及新生兒體 弱或疾病。目前’使用多巴胺受體促效劑（諸如溴麥角環 狀及麥角乙脲）抑制分娩後泌乳。然而，該等化合物可引 發嚴重的副作用’諸如噁心 '嘔吐、水腫、低血壓、眩 暈、毛髮減少、頭痛及幻覺《另外，多巴胺受體促效劑不 適用於患有心血官疾病及南血壓之女性。漠麥角環肽之另 一缺點為其半衣期短’從而需要在14天之時間裏，每曰攝 入藥物4 - 6次。 為測s式催乳激素受體中和抗體在小鼠中之功效，使 NMRI小鼠與雄性交配。出生後，調整窩仔數為8隻動物， 且如實例15中所述，用針對PRLR之特異性及非特異性抗 體處理雌性。作為母體泌乳能力之量度，每日監測後代之 重量。其讀數詳細描述於實例15中’且結果展示於圖14α·ι> 中。PRLR中和抗體展示泌乳之抑制係劑量依賴性，且引 起乳腺退化且乳汁蛋白質產生減少。 本發明之另一目標在於使用PRLR中和抗體抑制泌乳。 152407.doc 38 · 201130504 本發明之另一目標在於使用本發明所述之抗體及抗原結 合片段抑制泌乳。 良性前列腺增生 良性前列腺增生（BPH)為第四大老年男性流行衛生保健 病狀。前列腺腫大為影響大於5〇%之5〇歲及5〇歲以上之男 性的與年齡相關之進行性病狀。BpH之特徵在於前列腺基 質及上皮細胞增生，從而在前列腺尿道周區中形成壓縮尿 道之大離散結節。因此，尿流量減小為BpH之一個主要結 果。 BPH之標準療法涵蓋： a) cxl腎上膝素能受體拮抗劑（例如他蘇洛辛 (tamsulosin)、阿夫 π坐嗓（aifuz〇sin)、特拉唾嗪 (terazosin)夕沙°坐σ秦（doxazosin))減輕下尿路之βρη 症狀。其藉由阻斷α受體介導之前列腺平滑肌刺激降 低膀胱出口阻塞。主要副作用為血管擴張不良事件、 眩暈及射精失敗。 b) 5α_還原酶抑制劑（例如非那雄安（finasteride)) 5α-還原酶抑制劑阻止二氫睪固酮形成，二氫睪固酮 為睾酮在前列腺中之活性形式，其造成前列腺腫大。 主要副作用為性功能暗# ^ 力月t* Ρ早礙，诸如勃起病症及性慾降 低。 c) 經尿道前列腺切除（TlJRp) »亥外科手H療與高發病率相關聯ϋ作用為出血、 失禁、狹窄形成、射精損失及膀胱穿孔。 I52407.doc •39- 201130504 d)前列腺支架 在尿道前列腺部分插入支架以保證適當的尿流量。主 要副作用為結垢、尿路感染及支架遷移。此外，在任 何經尿道操作之前，必須移除支架。 如關於乳腺所述，PRL及PRLR在前列腺内以自分泌/旁 分泌方式起作用（J. Clin. Invest. 99 :第 618 頁，1997)。 臨床研究指示高催乳激素血症（及肢端肥大症）與前列腺 腫大及發炎性細胞之基質積聚相關聯。人類生長激素在鋅 存在下可結合人類PRLR，此可解釋為何肢端肥大症會導 致良性前列腺增生《在BPH患者中，PRL血清含量通常升 尚。 普遍過度表現PRL基因之轉殖基因動物顯現嚴重的基質 前列腺增生’表明PRL為患上前列腺增生之重要生理病原 性因素（Endocrinology 138 :第 4410 頁，1997)。此外，在 轉殖基因小鼠中，在前列腺特異性probasin啟動子下局部 過度表現PRL導致基質膨脹、發炎性細胞積聚及病灶上皮 細胞發育異常，此為人類BPH之基本特徵（Endocrinology 144 :第 2269頁，2003)。 PRLR高度表現於前列腺十（實例3，圖3)。在激素耗盡及 處理後’在大鼠前列腺組織中觀測到PRLR蛋白質表現之 變化（實例4，圖4)。除PRLR以外，前列腺細胞亦表現催乳 激素。 如實例1 7 t所述’雄性Balb/C小鼠在腎包膜下接受垂體 同源移植物且顯現良性前列腺增生。在該模型十測試催乳 152407.doc •40· 201130504 激素受體中和抗體及非特異性抗體對良性前列腺增生之作 用。其讀數範例描述於實例17中。如圖16中所示，咖汉 中和抗體抑制良性前列腺生長，且因此適用於治療 列腺增生。 y 本發明之另一目標在於使用prlrv|?和抗體及抗原結合 片段治療良性前列腺增生。 本發月之$痛、樣在於使用本發明所述之抗體及抗原結 合片段治療良性前列腺增生。 冋催乳激素灰症性毛髮減少 毛髮減少治療之需要仍未得到滿足。週期中之頭皮毛髮 生長.生長期之特徵在於活性毛髮生長，退化期顯示退 化，接著為休眠期（靜止）。外生期（死亡毛髮脫落）與休眠 期之末尾一致。毛髮減少可為任何期毛髮生長受擾亂之結 果。 休眠期毛髮減少可具有許多觸發原因（生理學及情緒壓 力、醫學病狀、缺鐵及缺鋅），重要的是，早期雄激素禿 頭展示休眠期毛髮排出（Cieveian£j ciinic journai medicine 2009; 76:361-367^生長期毛髮減少通常為放療 或化療之結果。 敏樂定（Minoxidil)及非那雄安（Finasteride)用於治療雄激 素毛髮減少’而糖皮質類固醇用於斑禿。一般而言，所有 該等治療均具有副作用（非那雄安：男性性慾降低及陰 萎’糖皮質類固醇：糖尿病、體重增加、骨質疏鬆），且 治療毛髮減少之問題尚未完全解決。 152407.doc -41 - 201130504 在齧齒動物中，使用成年動物之剃毛實驗藉由使用剃毛 區域中毛髮再生長作為讀數範例分析化合物對毛髮減少之 作用（British Journal 〇f dermatology 2008; 159:300-305)。 剃毛成年動物（毛髮通常處於休眠期）誘導以毛髮生長為特 徵之生長期》 _ 在實例17中所述之實驗（良性前列腺增生）中，為接受垂 體同源移植物之動物剃毛。在該等實驗過程中，出乎意料 地發現’接受垂體同源移植物之動物展示剃毛區域中之毛 髮再生長嚴重受損。用PRLR中和抗體治療刺激毛髮生 長，而非特異性抗體則不然（圖1 7)。 5玄觀測結果證明’毛髮減少中涉及催乳激素受體介導之 信號傳導升高。為對此進行更詳細的分析，進行極類似先 前描述之實驗的其他剃毛實驗（Bdtish dermatology 2008; 159:300-305)。該等其他剃毛實驗描述 於實例1 8中。該等實驗證明’在高催乳激素血症及正常催 礼激素血症雄性及雌性小鼠中，PRLR中和抗體刺激毛髮 生長。 本發明抗體解決該問題’從而提供新的用於女性及男性 高催乳激素血症性及正常催乳激素血症性毛髮減少之治 療。 因此’本發明之另一態樣在於採用PRLR中和抗體及抗 原結合片段來治療或預防高催乳激素企症性及正常催乳激 素血症性毛髮減少。 本發明之另一態樣在於使用本發明所述之抗體及抗原結 152407.doc •42· 201130504 合片段治療或預防高催乳激素血症性毛髮減少。 組合激素療法 關於仍具有子宮之絕經後女性之熱潮紅治療，使用雌激 素（雌二醇或結合馬雌激素=(：££)與助孕素（例如醋酸甲羥 助孕酮（ΜΡΑ)、助孕酮、屈螺酮、左炔諾孕酮）之組合。必 須添加助孕素來抑制雌二醇活化之子宮上皮細胞增殖。然 而，添加助孕素增加乳腺上皮細胞增殖。因為正常與癌乳 腺上皮細胞均對組合雌激素加助孕素治療作出增殖反應， 所以發現乳腺癌之相對風險在CEE加ΜΡΑ治療後增加 (JAMA 233:321-333; 2002) » PRLR中和抗體當每月或隔月投與接受組合激素療法之 女性時將抑制增加之乳房上皮細胞增殖。 如實例19中所述，採用先前開發用於定量分析助孕素在 子呂及乳房中之作用之小鼠模型（Endocrinology 149:3952-3959，2008)。切除小鼠之卵巢且在卵巢切除術後14天用媒 劑或100 ng雌二醇加1 〇〇 mg/kg助孕酮模擬激素替代療法治 療14天’持續3週。每週用特異性pRLR(1〇 mg/kg或3〇 mg/kg)或非特異性抗體（30 mg/kg)治療動物一次。分析 PRLR中和抗體對接受組合激素療法之乳房中之增殖活性 的作用。 本發明抗體解決該問題以治療在組合激素療下時所觀測 到的增強之乳房上皮細胞增殖。 本發明之另一目標在於在組合激素療法（亦即雌激素+助 孕素療法）中使用PRLR中和抗體及抗原結合片段來抑制乳 152407.doc • 43- 201130504 腺上皮細胞增殖。 本發明之另一態樣在於在組合激素療法（亦即雌激素+助 孕素療法）中使用如本發明所述之抗體及抗原結合片段來 抑制乳腺上皮細胞增殖。 定義 如本·文所使用之標靶抗原人類「PRLR」係指細胞外域 與SEQ ID NO. 70之胺基酸位置1至210具有實質上相同之 胺基酸序列的人類多肽及其天然存在之對偶基因及/或剪 接變異體。如本文所使用之「PRLR之ECD」係指由先前 提及之胺基酸表示之pRLR的細胞外部分。另外，標靶人 類PRLR亦涵蓋該受體之突變形式，諸如paul Kelly(pr〇e
Natl Acad Sci U S A.l〇5(38):14533-14538, 2008 ;及 oral communication Turin，2007)描述之活化突變 H46L。 如本文所使用，片s吾「治療有效量」意欲指當根據所需 治療療程投與時，將適於引發所需治療性或預防性作用或 反應，包括減輕一些或所有該疾病症狀或減小患該疾病之 傾向的治療性或預防性抗體的量。 如本文所使用，因為結合特異性不為絕對的，而具有相 對挫，所以若抗體能夠區分某一抗原（此處為與一或 多個參考抗原，則該抗體r特異性結合」係指「特異性針 對」或「特異性識別」該抗原。在其最一般形式中（且當 未提及指定參考物時），「特異性結合」係指抗體區分相關 抗原與無關抗原之能力，如例如根據一種以下方法所測 定。該等方法包含（但不限於）西方墨點法、eusa測試、 152407.doc •44· 201130504
Ria測試、ECL測試、IRMA測試及肽掃#。舉例而言，可 進行標準ELISA檢；^。可利用標準顯色（例如二次抗體與辣 根過氧化物，及四甲基聯苯胺與過氧化氫）進行評分。某 些孔中之反應由光密度（例如在45〇 nm下）評分。典型背景 (=陰性反應）可為(M 0D;典型陽性反應可為i 〇d。此意 謂陽性/陰性之差異可超過1〇倍。通常，不是使用單一參 考杬原，而是使用約3至5個的一組無關抗原（諸如奶粉、 B S A轉鐵蛋白或其類似物）來進行結合特異性之測定。 然而，「特異性結合」亦可指抗體區分標靶抗原與一或 多個用作參考點之密切相關抗原的能力。另外，「特異性 」可私抗體區分其標乾抗原之不同部分的能力，該等 不同部分例如有PRLR之不同域、子域或區，諸如pRLRi ECD之N末端或C末端區中的抗原決定基，或區分pRLR之 ECD之一或多個關鍵胺基酸殘基或數段胺基酸殘基的能 力。 「親和力」或「結合親和力」Kd通常藉由量測平衡締合 常數（ka)及平衡解離常數（kd)並計算kd比ka之商來確定 (KD=kd/ka)。術語「免疫特異性」或「特異性結合」意謂 抗體以低於或等於1 Ο·6 Μ(單價親和力）之親和 力Kd結合於 PRLR或其ECD。術語「高親和力」意謂抗體以低於或等 於ΙΟ7 Μ(單價親和力）之親和力Kd結合於pRLR或其ECD時 的KD。與其他無關分子相比，抗體對標靶抗原可具有實質 上較尚之親和力。與同源物相比，抗體對標靶抗原亦可具 有實質上較高之親和力，例如針對標靶抗原之相對親和力 152407.doc -45- 201130504 為至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、loo倍、ι〇3倍、ι〇4倍、 105倍、106倍或更高。該等親和力可使用習知技術容易地 測定，諸如藉由平衡透析；藉由使用BIAcore 2000儀器使 用由製造商概述之一般程序；藉由使用放射性標記之標靶 抗原之放射免疫檢定；或藉由熟習此項技術者已知之另一 方法。親和力資料可用例如Scatchard等人，Ann N.Y. Acad. ScL，51:660 (1949)之方法分析。 如本文所使用’片語「抗體拮抗催乳激素介導之信號傳 導」意欲指本發明抗體阻斷催乳激素受體活化，此使得催 乳激素受體介導之信號傳導完全受抑制。 如本文所使用，片語「抗體競爭結合」意欲指一抗體與 第二抗體或更多抗體之間的競爭結合催乳激素受體。 術語「抗體」以廣義使用’且包括完全裝配之抗體、單 株抗體、多株抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、 可結合抗原之抗體片段（Fab'、F，（ab)2、Fv、單鏈抗體、微 型雙功能抗體）、路敢體（camel body)及包含前述者之重組 肽’只要其展現所需生物活性即可^抗體在重鏈上可含有 不同恆定域（Fc域），較佳源自igGl、lgG2或IgG4同型（參見 下文）。可引入修飾效應功能之突變。已鑑別在補體蛋白 質Clq與Fc受體之相互作用中起主導作用之Fc域中的胺基 酸殘基，且已描述影響效應功能之突變（關於綜述，參見
Labrijn等人，Current opinion in Immunology 20:479-485, 2008)。特定言之’ igGi之去糖基化可藉由在胺基酸位置 297處使天冬醯胺突變成丙胺酸或使天冬醯胺突變成麩醯 152407.doc -46 - 201130504 胺酸達成，已報導引廢除抗體衍生之細胞介導之細胞毒性 (ADCC)(Sazinsky 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. 105 (51): 20169, 2008 ; Simmons 等人，J. of Immunological Methods 263: 133-147，2002)。用丙胺酸置換位置322處之離胺酸可 降低ADCC及移除補體衍生之細胞毒性（CDC)，而用丙胺 酸同時置換位置234與235處之兩個白胺酸可避免ADCC及 CDC[Hezareh等人，J. of Virology，75 (24):12161-12168, 2001]。為應用IgG4同型作為保留親合力之活體内二價治 療劑，可在「核心鉸鏈區」中引入諸如絲胺酸變成脯胺酸 之修飾（Schuurman, J.等人，Immunology 97: 693-698, 1999)。人類IgG2分子形成非均質共價二聚物之趨勢可藉 由將位置127、232及233處之一個半胱胺酸變成絲胺酸來 解決（Allen 等人，Biochemistry, 2009, 48 (17) 5 第 3755-3766頁）。效應功能減小之替代格式可為IgG2m4格式，源 自含有四個IgG4特異性胺基酸殘基變化之IgG2(An等人， mAbs 1(6)，2009)。抗體片段可由重組DNA技術產生或藉 由酶促或化學裂解完整抗體產生，且進一步描述於下文 中。單株抗體之非限制性實例包括鼠類、嵌合、人類化、 人類及Human Engineered™免疫球蛋白、抗體、具有源自 免疫球蛋白之序列之嵌合融合蛋白質或其突變蛋白或衍生 物，各進一步描述於下文中。涵蓋完整分子及/或片段（包 括化學衍生之抗體）之多聚體或聚集體。 術語「單株抗體」如本文所使用係指自實質上同質性之 抗體群體獲得之抗體，亦即構成群體之個別抗體除可能天 152407.doc -47- 201130504 然存在之可少量存在之突變外為相同的。單株抗體具有高 特異性’針對單個抗原位點。此外，與通常包括針對不同 決定子（抗原決定基）之不同抗體之習知（多株）抗體製劑形 成對比，各單株抗體係針對抗原上之單個決定子。除特異 性以外，單株抗體之優點亦在於，其由同源培養物合成， 未受具有不同特異性及特徵之其他免疫球蛋白污染。 修飾語「單株」指示抗體之特徵為自實質上同質性之抗 體群體獲得，且不應解釋為需要由任何特定方法產生該抗 體。舉例而言，欲使用之單株抗體可由首先由尺〇11以等 人，Nature，256:495, 1975描述之融合瘤方法製造，或可 由重組DNA方法（參見例如美國專利第4,816,567號）製造。 「單株抗體」亦可例如為重組、嵌合、人類化、人類、 Human Engineered™或抗體片段》 「免疫球蛋白」或「天然抗體」為四聚體醣蛋白。在天 然存在免疫球蛋白中，各四聚物由兩對相同多肽鍵構成， 各對具有一個「輕」鏈（約25 kDa)及一個「重」鏈（約 50-70 kDa)。各鍵之胺基末端部分包括具有約1〇〇至11〇個 或110個以上主要負責抗原識別之胺基酸的「可變」區。 各鍵之缓基末端部分界定主要負貴效應功能之恆定區。視 重鏈之恆定域之胺基酸序列而定，免疫球蛋白可歸為不同 類別。重鍵分類為μ、δ、γ、α及ε，且分別界定抗體同型 為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。若干該等類別可進一步分 為亞類或同型，例如IgGl、IgG2、IgG3 ' IgG4、IgAl及 IgA2。不同同型具有不同效應功能；例如“⑴與“⑺同型 I52407.doc -48· 201130504 通常具有ADCC活性。人類輕鏈分類為κ及λ輕鏈。在輕鍵 與重鏈内，可變區與恆定區經具有約12個或12個以上胺基 酸之「J」區連接，其中重鏈亦包括具有約10個以上胺基 酸之「D」區。一般參見Fundamental Immunology，第7章 (Paul, W.編，第 2版，Raven Press, N.Y. (1989))。 抗體/免疫球蛋白之「功能片段」或「抗原結合抗體片 段」因此定義為保留抗原結合區之抗體/免疫球蛋白之片 段（例如IgG之可變區）。抗體之「抗原結合區」通常可見 於抗體之一或多個高變區中，亦即CDR-1 ' CDR-2及/或 CDR-3區；然而，可變「構架」區亦可在抗原結合中發揮 重要作用，諸如藉由為CDR提供骨架。較佳地，「抗原結 合區」包含至少可變輕（VL)鏈之胺基酸殘基4至103及可變 重（VH)鏈之胺基酸殘基5至109，更佳VL之胺基酸殘基3至 107及VH之胺基酸殘基4至111，且尤其較佳為完全VL及 VH鏈[VL之胺基酸位置1至109及VH之1至113，同時胺基 酸位置編號根據Kabat資料庫進行（(Johnson及Wu，Nucleic Acids Res.，2000, 28, 214-218]。用於本發明之免疫球蛋白 之較佳類別為IgG。 術語「高變」區係指負責抗原結合之抗體或功能片段之 可變域VH及VL的胺基酸殘基。高變區包含來自「互補決 定區」或「CDR」之胺基酸殘基[亦即在輕鏈可變域中為 殘基 24-34(LCDRl)、50-56(LCDR2)及 88-97(LCDR3)，且 在重鏈可變域中為29-36(HCDRl)、48-66(HCDR2)及 93-102(HCDR3)，如圖12中所述]及/或彼等來自高變環之 152407.doc -49· 201130504 殘基[亦即在輕鏈可變域中為殘基26-32(LCDRl内）、 50-52(LCDR2内）及91-96(LCDR3内）且在重鏈可變域中為 26-32(HCDRl 内）、53-55(HCDR2 内）及 96-101(HCDR3 内）， 如 Chothia等人，J· Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)所述]。 抗體片段之非限制性實例包括Fab、Fab·、F(ab')2、 Fv、域抗體（dAb)、互補決定區（CDR)片段、單鏈抗體 (scFv)、單鏈抗雔片段、微型雙功能抗體、微型三功能抗 體、微型四功能抗體、微抗體、線性抗體（Zapata等人， Protein Eng.，8(10):1057-1062 (1995));螯合重組抗體、三 抗體或雙抗體、細胞内抗體、奈米抗體、小模組免疫藥劑 (small modular immunopharmaceutical，SMIP)、抗原結合 域免疫球蛋白融合蛋白質、駱駝化抗體、含VHH抗體或其 突變蛋白或衍生物、及含有免疫球蛋白之足以賦予多肽特 異性抗原結合至少一部分（諸如CDR序列）之多肽，只要抗 體保留所需生物活性；及由抗體片段形成之多特異性抗體 (C. A. K Borrebaeck 編，（1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press ; R. Kontermann 及 S. Duebel 編，(2001) Antibody
Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag)。除「雙特異性」或「雙官能」抗體以外的抗體應 理解為其各結合位點相同。F(ab')2或Fab可經工程改造以 使CH1與CL域之間存在之分子間二硫基相互作用降至最低 或完全移除。抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個稱為 「Fab」片段之相同抗原結合片段，各具有單個抗原結合 152407.doc -50· 201130504 位點；及一殘餘「Fc」片段，其名稱反映其能夠容易地結 晶。胃蛋白酶處理產生具有兩個「Fv」片段之F(ab')2片 段。「Fv」片段為含有完全抗原識別且結合位點之最小抗 體片段。該區由一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域緊密非 共價締合之二聚物構成。在該組態中，各可變域之三個 CDR相互作用以在VH-VL二聚物表面上界定抗原結合位 點。總體而言，六個CDR賦予該抗體抗原結合特異性。然 而，即使單個可變域（或僅包含三個對抗原具有特異性之 CDR之一半F v)亦能夠識別且結合抗原。 「單鏈Fv」或「sFv」或「scFv」抗體片段包含抗體之 VH及VL域，其中該等域存在於單多肽鏈中。
Fv多肽較佳另外包含VH域與VL域之間的能夠使Fv形成 所需抗原結合結構之多肽連接子。關於sFv之綜述，參見 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 5 第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York ，第 269-315頁（1994)。
Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域 (CH1)。Fab片段與Fab·片段之不同之處在於包括一或多個 來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸之重鏈CH1域的羧基末端處添 加有數個殘基。Fab’-SH在本文中指代恆定域之半胱胺酸 殘基帶有游離硫醇基之Fab'。F(ab')2抗體片段最初呈Fab' 片段對產生，在Fab1片段對之間具有鉸鏈半胱胺酸。 「構架」或FR殘基為彼等除高變區殘基以外的可變域殘 基。 152407.doc •51 - 201130504 片語「恆定區」係指抗體分子 卞之賦予效應功能之部分。 術語「突變蛋白」或「變異體」可互換使用且指在可變 區或與可變區等效之部分中含有至少—個胺基酸取代、缺 失或插入之抗體多肽序列，其限制條件為突變蛋白或變異 體保留所需結合親和力或生物活性。 突變蛋白可與親本抗體實質上同質性或實質上一致。 術語4生物」係指制某些技術共價修飾之抗體，該 等技術諸如泛素化、結合於治療劑或診斷劑、標記(例如 用放射性核素或各種酶)、共價聚合物連接(諸如聚乙二醇 化（用聚乙二醇衍生））及藉由化學合成非天然胺基酸之插入 或取代。 「人類」抗體或功能人類抗體片段因此定義為不嵌合或 「人類化」且不來自（全部或部分）非人類物種之抗體。人 類抗體或功能抗體片段可源自人類或可為合成人類抗體。 「合成人類抗體」在本文中定義為具有完全或部分自基於 已知人類抗體序列之分析之合成序列電子雜交衍生的序列 的抗體。人類抗體序列或其片段之電子雜交設計可例如藉 由分析人類抗體或抗體片段序列之資料庫並利用由其獲得 之資料設計多肽序列來達成。人類抗體或功能抗體片段之 另一貫例為自具有人類起源之抗體序列之庫（亦即該庫基 於取自人類天然來源之抗體）分離的核酸編媽的抗體。人 類抗體之實例包括基於n_CoDeR之抗體，如carisson及 Soderlind Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1), 102-108 (2001) » SSderlin等人，Nat. Biotech. 18，852-856 (2000)及美國專 152407.doc -52- 201130504 利第6,989,250號所述。 「人類化抗體j或功能人類化抗體在本文中定義為以下 者：（i)源自非人類來源（例如攜帶異源免疫系統之轉殖基 因小鼠），該抗體係基於人類生殖系序列；或（ii)CDR移 植，其中可變域之CDR來自非人類起源，而可變域之一或 多個構架具有人類起源且恆定域（若存在）具有人類起源。 片語「嵌合抗體」如本文所使用係指含有源自兩個通常 起源於不同物種之不同抗體（參見例如美國專利第 4,816,567號）之序列的抗體。最通常，嵌合抗體包含人類 及鼠類抗體片段，一般為人類恆定區及小鼠可變區》 「Human EngineeredTM」抗體藉由根據 Studnicka等人， 美國專利第5,766,886號中所述之方法改變親本序列產生， 諸如由SEQ ID NO 58、61、64、67表示之抗體，且描述於 專利申請案WO 08/022295中。 本發明抗體可源自重組抗體基因庫。製備重組人類抗體 基因譜系之技術之發展及編瑪抗體片段於絲狀嗟菌體表面 上之呈現提供直接製備及選擇人類抗體之重組方法，該方 法亦可應用於人類化、嵌合、鼠類或突變蛋白抗體。由嚷 菌體技術產生之抗體以抗原結合片段（通常F v或Fab片段） 形式在細菌中產生，且因此缺乏效應功能。效應功能可利 用以下兩種策略中之一種引入：可將該等片段工程改造成 完全抗體以於哺乳動物細胞中表現，或工程改造成含能夠 觸發效應功能之第二結合位點的雙特異性抗體片段。抗體 之Fd片段（VH-CH1)及輕鏈（VL-CL)通常由PCR分開選殖， 152407.doc •53- 201130504 且隨機重組於組合噬菌體呈現庫中，隨後可就與特定抗原 之結合加以選擇。Fab片段表現於噬菌體表面上，亦即物 理連接於編碼該等Fab片段之基因。因此，由抗原結合選 擇Fab共選擇接著可擴增之Fab編碼序列。經若干輪抗原結 合及再擴增，一種稱為淘選之程序，富集對抗原具有特異 性之Fab並最後分離。 關於自唆菌體呈現庫衍生人類抗體已描述多種程序。該 等庫可基於單一母體構架，在該構架中允許多樣性活體内 形成（亦即人類衍生）之CDR重組，如由Carlsson及S6derlind
Exp. Rev· Mol. Diagn. 1 (1)，102-108 (2001)，S6derlin等 人，Nat. Biotech. 18，852-856 (2000)及美國專利第 6,989,250號所述《或者，該抗體庫可基於經電子雜交設計 且由合成產生之核酸編碼的胺基酸序列。抗體序列之電子 雜交設計係例如藉由分析人類序列之資料庫並利用由其獲 得之資料設計多肽序列來達成。設計及獲得電子雜交產生 之序列的方法描述於例如Knappik等人，J. Mol. Biol. (2000) 296:57 ; Krebs等人，J. Immunol, Methods. (2001) 254:67 ;及美國專利第6,300,064號中。關於噬菌體呈現技 術之綜述，參見WO 08/022295(Novartis)。 或者，本發明抗體可來自動物《該抗體可經人類化或經 人類化工程改造，概述於WO 08/022295(Novartis)十；該 抗體可來自轉殖基因動物[亦參見WO 08/022295(Novartis)]。 如本文所使用，抗原（例如PRLR)之不同「形式」因此定 義為由不同轉譯及轉譯後修飾產生之不同蛋白質分子，諸 152407.doc -54· 201130504 之剪接差異、糖基 如（但不限於）一次催乳激素受體轉錄物 化差異及轉譯後蛋白水解裂解差異。 如本文所便用 J 〇何盹夠特異性結 合免疫球蛋白或τ細胞受體之任何蛋白 a 貝Ο 4/V JS ,Ά 定基決定子通常由分子之化學活性*而 ’、4、 表面組(諸如胺基酸或 糖側鏈）組成’且通常具有特異性三維姓 、、、°構特徵以及荷質 比特徵。若按照熟習此項技術者熟知之 、 〜饮Η方法，在競爭 性結合檢定中’一個抗體展示與第二抗體 几遐親肀’且較佳若 抗原決定基之所有胺基酸由兩個抗體結人， 抗體「結合相同抗原決定基」。 則遇為該兩個 術語「成熟抗體」或「成熟抗原結合片段」，諸如成熟 Fab變異體，包括展現更強地結合（亦即以增加之親和力結 合）既定抗原（諸如PRLR之細胞外域）的抗體或抗體片段之 竹生物。成熟為鑑別抗體或抗體片段之六個Cdr内少數引 起該親和力增加之突變的方法。成熟方法為在抗體中引入 突變之分子生物學方法與鑑別改良之結合劑之筛選的組 合0 治療方法 治療方法涉及投與需要治療之個體治療有效量之本發明 涵蓋之抗體。因此，「治療有效」量定義為抗體依單次劑 里或根據多次劑量方案單獨或與其他藥劑組合，足以阻斷 個體經處理區域之PRLR陽性細胞增殖，減輕不良病狀時 之用量’且該量為毒理學所容許。個體可為人類或非人類 動物（例如兔子、大鼠、小鼠、猴或其他較低等靈長類動 152407.doc -55· 201130504 物）0 本發明抗體可與已知藥劑共投盘， 仅/、且在一些情況下，括 體本身可經修飾。舉例而言，抗體可與免疫毒素或放射性 同位素結合以潛在地進一步增加功效。 本發明抗體可在PRLR有不當吝声矣 另个田回度表現之多種情形下用 作治療或診斷工具。尤苴田士 nQ , 尤具適於用本發明抗體處理之病症及 狀況為子宮内膜異位症、子宮腺肌症、雌性非激素性避 孕、良性乳房疾病及乳腺痛、泌乳抑制、良性前列腺增 生、類纖維瘤、高催乳激素血症性及正常催乳激素血症 毛髮減少；及在組合激素療法中用以抑制乳腺上皮細胞增 殖之聯合治療。 曰 為了治療任何上述病症，根據本發明使用之醫藥組合物 可依習知方式使用-或多種生理學上可接受之載劑或賦形 劑調配。本發明抗體可經任何適合的方式投與，該等方式 可視所治療之病症類型而變化。可能的投藥途徑包括非經 腸（例如肌肉内、靜脈内、動脈内、腹膜内或皮下广肺内 及鼻内，及必要時用於局部免疫抑制治療、器官内投藥。 另外，本發明抗體可經脈衝式輸注，例如投與遞減劑量之 抗體。部分視投藥為短暫還是長期而定，給藥較佳經注射 給予，最佳經靜脈内或皮下注射給予。投藥量將視多種因 素而定，諸如臨床症狀、個體體重、是否投與其他藥物。 熟習此項技術者應認識到，投藥途徑將視所治療之病症或 病狀而變化。 確疋本發明之新穎多肽之治療有效量基本上將視特定患 152407.doc -56- 201130504 者特徵、投藥途徑及所治療之病症性質而定。一般指南可 見於例如人用藥品註冊技術要求國際協調會（Internati〇nal
Conference 〇n Harmonisation)之出版物及、Remington，s
Pharmaceutical Sciences，第 27及 28章，第 484-528 頁（第 18 版，Alfonso R. Gennaro編，Easton，Pa.: Mack Pub. Co.， 1990)。更特定言之，確定治療有效量將視諸如藥劑之毒 性及功效之因素而定。毒性可使用此項技術熟知之方法測 定且可見於上述參考文獻中。功效可利用相同指南結合下 文實例中所述之方法測定。 醫藥組合物及投藥 /月邳係關於醫藥組合物’其可包含概尺抗體，且 :單獨或與至少—種其他藥劑(諸如穩定化合物）組合用作 樂劑’其可於任何無菌的生物相容醫藥載劑(包括但不限 =理鹽水、緩衝生理鹽水、右旋糖及水)中投與。任何 =子均可單獨或與其他藥劑、藥物或激素組合以該等 刀子與賦形劑或醫藥學上可接受之載劑混合之醫举植 投與患者。在本發明之一實施例中’醫藥學上可接 劑為醫藥學惰性的。 接又之裁 本亦係關於醫藥組合物之投藥 成。非經腸傳遞方法包括局”k腸達 瘤）、肌肉内、皮下 、（直接傳遞至腫 膜内、子宮…轉内、心室内、靜脈内、鳆 腰内子呂内或鼻内投藥。除 腹 合物亦可含有適合的醫藥 W外’該等醫藥組 及有利於活性化合物加 ：妾又之載劑’包含賦形劑 物加工成醫樂學上可用之製劑的助劑。 152407.doc S' -57· 201130504 關於調配及投藥技術之更多細節可見於Remingt。!^
Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co編，Easton
Pa.)之最新版本。 用於非經腸投藥之醫藥調配物包括活性化合物水性溶 液。對於注射，本發明醫藥組合物可在水性溶液、較佳諸 如漢克氏溶液（Hanks's solution)、林格氏溶液（Ringer,s solution)或生理學上緩衝生理鹽水等生理學相容的緩衝液 中調配。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質， 諸如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。另外，活性化合 物之懸浮液可酌情製備成油性注射懸浮液。適合的親脂性 溶劑或媒劑包括諸如芝麻油之脂肪油，或諸如油酸乙酯或 甘油三酯之合成脂肪酸酯，或脂質體。懸浮液亦可視情況 含有適合的穩定劑或增加化合物溶解性以允許製備高濃溶 液之試劑。 對於局部或鼻用投藥，調配物中使用適於滲透特定障壁 之滲透劑。該等滲透劑一般在此項技術中為已知的。 非經腸投藥亦包含非經腸傳遞方法，該等方法亦包括動 脈内、肌肉内、皮下、趙内、勒内及心室内、靜脈内、腹 膜内、子宮内、陰道或鼻内投藥。 套組 本發明進一步係 匕哀及套組’其包含一或多 填充有先前提及之本發明組合物之一或多個成分的容器 該（該等）容器可隨附呈由管理醫藥或生物產品之製造、 用或銷售之政府機構規定的形式的告示，該告示反映該 152407.doc -58- 201130504 構批准該產品之製造、使用或銷售可用於人類投藥。 在另一實施例中，該等套組可含有編碼本發明抗體之 DNA序列。編碼該等抗體之DNA序列較佳提供於適於轉染 至伯主細胞中及由宿主細胞表現之質體中。質體可含有啟 動子（通常為誘導性啟動子）以調控DNA於宿主細胞中之表 現。質體亦可含有適當的限制位點以有利於其他DNA序列 插入質體中，產生各種抗體。質體亦可含有眾多其他元件 以有利於所編碼之蛋白質之選殖及表現。該等元件為熟習 此項技術者所熟知，且包括例如可選擇標記物、起始密碼 子、終止密碼子及其類似物。 製造及儲存 本發明醫藥組合物可以此項技術中已知之方式製造，例 如藉助於常規混合、溶解、造粒、製糖衣藥丸、細磨、乳 化、囊封、包埋或凍乾方法。 醫藥組合物可以在使用之前與緩衝液組合的於1 mM組胺酸、〇·ι%_2%蔗糖、2%_7%甘露醇（？11值範圍為4.5 至5.5)中之凍乾粉末形式提供。 在製備包含本發明化合物調配於可接受之載劑中的醫藥 組合物之後，可將其置放於適當的容器中且貼上標籤以說 明用於治療某一適應病狀。對於PRLIU^體投藥，該標鐵 應包括投藥之量、頻率及方法。 治療有效劑量 適合用於本發明之醫藥組合物包括含有有效量之活性成 分而可達成預定目的（亦即治療特徵在於pRLR表現之特定 152407.doc 59- 201130504 疾病狀態）之組合物。有效劑量的確定係完全在熟習此項 技術者之能力範圍内。 對於任何化合物，治療有效劑量最初可在細胞培養檢定 (例如淋巴瘤細胞）或動物模型（通常為小鼠、大鼠、兔子、 狗、豬或狼）中評估。動物模型亦用於達成所需之濃度範 圍及投藥途徑。隨後可使用該等資訊來確定適用於人類之 劑量及投藥途徑。 治療有效劑量係指改善症狀或病狀之蛋白質或其抗體、 拮抗劑或抑制劑之量。該等化合物之治療功效及毒性可藉 由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定，例如 ED^(在50。/。群體中治療有效之劑量）及(使5〇%群體致 命之劑量）。治療效應與毒性效應之間的劑量比為治療沪 數，且可以比率LDm/EDw表示。展現高治療指數之醫藥 組合物較佳。使用自細胞培養檢定及動物研究獲得之資料 來確定可供人類使用之劑量範圍。該等化合物之劑量較佳 處於包括ED50的極小或不具有毒性之循環濃度範圍内。劑 量可視所採用之劑型、患者之敏感性及投藥途徑而定在該 範圍内變化β 5λ 確切劑量可由個別醫師考慮所治療之患者加以選擇。調 整劑量及投藥以提供足量活性部分或維持所需作用。可= 慮之其他因素包括疾病狀態之嚴重程度，例如子宮内膜異 位病灶之尺寸及位置；患者之年齡、體重及性別；膳食、 投藥時間及頻率、藥物組合、反應敏感性、及對療法之耐 受性/反應《視特定調配物之半衰期及清除率而定，長2 152407.doc -60- 201130504 醫藥組合物可每3至4天投與、每週投與、或每兩週投與一 次、或一個月内投與一次。 視投藥途徑而定，正常劑量可為〇丨至1〇〇,〇〇〇微克不 等’總劑量至多約2 g❶關於特定劑量及傳遞方法之指南 提供於文獻中。參見 US. 4,657,760; US 5,206,344;或 US 5，225,212 °對於聚核苷酸，熟習此項技術者應採用不同於 用於蛋白質或其抑制劑之調配物。類似地，聚核苷酸或多 肽之傳遞應對特定細胞、狀況、位置等具有特異性。放射 性標記之抗體之較佳比活性可在每毫克蛋白質〇丨至i 〇 mCi範圍内（Riva等人，ciin. Cancer Res. 5:3275s-3280s， 1999 ; Wong等人，Clin. Cancer Res. 6:3855-3863，2000 ; Wagner等人，J· Nuclear Med. 43:267-272，2002)。 進一步藉由以下實例來描述本發明。該等實例之提供僅 旨在參考具體實施例來說明本發明。雖然該等例證說明本 發明之某些具體態樣’但其不描寫侷限性或限定本發明之 範疇。 除非另有詳細描述，否則所有實例均使用對熟習此項技 術者而言為熟知且常規之標準技術進行。以下實例之常規 分子生物學技術可如標準實驗室手冊（諸如Sambrook,等 人 ’ Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2版；
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y·，1989)所述進行。
Seq ID NO:l表示HCDR1，006-H08之胺基酸序列 Seq ID NO:2表示HCDR1，002-H06之胺基酸序列 152407.doc 201130504
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Seq ID NO:69表示 VL，XHA06983, Novartis(WO 2008/22295) 之核酸序列
SeqIDNO:70表示人類ECD_PRLR，胺基酸位置l·210，Sl 域1-100(81域構築體1-1〇2)，32域101-210 Seq ID NO:71表示CDS人類ECD_PRLR，核苷酸位置1-63 0 SeqIDNO:72表示鼠類ECD_PRLR，胺基酸位置l-210 Seq ID NO:73表示CDS鼠類ECD_PRLR，核苷酸位置1-630 【實施方式】 實例 實例1 自人類抗體噬菌體呈現庫分離標靶特異性抗體 為了分離一組能夠中和人類PRLR活性之抗體，並行研 究三個表現Fab及scFv片段之人類抗體噬菌體呈現庫。用 於庫淘選之標靶為如上文在WO 08/022295(Novartis)中所 述製備之催乳激素受體之可溶性細胞外域（ECD)(人類催乳 激素受體胺基酸25-234)。替代性標靶為經由胺基酸序列為 「異白胺酸-麩胺酸-甘胺酸-精胺酸-甲硫胺酸-天冬胺酸 酯」之連接子在C末端上連接於6個組胺酸或人類IgGl-Fc 域的PRLR之ECD。 根據 Marks等人（Methods Mol Biol. 248:161-76，2004)描 述之方法自噬菌體呈現中選擇標靶特異性抗體。簡言之， 在室溫下與50 pmol經生物素標記之ECD—起培育噬菌體呈 I52407.doc -65- 201130504 現庫1小時，且隨後使用10〇 μ1抗生蛋白鏈菌素珠粒懸浮液 (Dynabeads® Μ-280抗生蛋白鍵菌素’ Invitrogen)捕捉所形 成之複合物。藉由用洗滌緩衝液（PBS + 5%乳汁）洗滌珠粒 來移除非特異性喔菌體。用〇 5 ml 100 nM三乙胺（TEA)溶 離結合之嗤菌體，且藉由添加等體積之…TRlS-Cl(pH 7.4)立即中和。使用溶離之噬菌體池感染對數期生長的 TG1大腸桿菌細胞，且如 Methods Mol Biol. 248:161-76, 2004所述救援噬菌粒。重複選擇，總計三輪。在ELISa檢 定中’就結合活性篩選自來自第三輪淘選之感染溶離之噬 菌體的TG1細胞獲得之單一菌落。簡言之，在96孔板中， 使用自感染溶離之噬菌體之TG1細胞獲得的單一菌落接種 培養基。 在振盪式恆溫箱中在30°C下培養隔夜後，使微量培養物 生長至OD6〇〇=0.6，此時藉由添加1 mM IPTG誘導可溶性抗 體片段之表現。短暫離心細菌，且製備周質提取物並根據 由微板製造商提供之標準ELISA方案用於偵測抗體與固定 於96孔微板（96孔平底免疫吸附板，Nunc)上之ECD的結合 活性。 使用Biacore® 2000估算抗催乳激素受體（prlR)抗體結 合於重組細胞外域（ECD)之親和力，且將其用於抗體之親 和力分等級。 實例2 藉由即時TaqMan PCR分析定量分析患者及健康對照組之 正常子宮内膜及異位子宮内膜及子宮内膜異位病灶中的催 152407.doc •66· 201130504 乳激素及催乳激素受體基因表現 使用ABI Prism 7700序列偵測器系統根據製造商之說明 書（PE Applied Biosystems) ’ 且如 End〇crin〇lgy 2〇〇8 149(8): 3952-3959中所述及如此項領域中之專家所知，進 行即時TaqmanPCR分析。相對於親環素（cycl〇phyUin)之表 現校正PRL及PRLR之相對表現量。吾人藉由使用定量即時 Taqman PCR分析PRL及PRLR在健康女性之子宮内膜中及 在患者之子宮内膜及子宮内膜異位病灶中之表現。與健康 子呂内膜或獲自患者之子宮内膜相比，催乳激素及其受體 之表現在子宮内膜異位病灶中明顯上調。 結果展不於圖1及2中。 該等研究結果暗示自分泌催乳激素信號傳導在子宮内膜 異位症及子宮腺肌症（子宮内子宮内膜異位，一種侷限於 子宮之内膜異位症的形式）之發展及維持中起作用。 實例3 藉由北方墨點法分析人類組織中之催乳激素受體表現 自不同大鼠組織分離RNA並在凝膠電泳後轉移至尼龍 膜。使膜與大鼠催乳激素受體或卜肌動蛋白（作為内參考 物）之放射性標記之cDNA連續雜交，洗滌且暴露於膜。該 等帶對應於大鼠催乳激素受體及3_肌動蛋白之mRNA。圖3 中所示之結果指示催乳激素受體在胎盤、前列腺、卵巢及 腎上腺中有強表現。 實例4 調控大鼠前列腺令之催乳激素受體蛋白質表現-閣割及激 152407.doc -67- 201130504 素治療之影饗 閹割大鼠或使其保持完整。用媒劑（完整）、 mg/kg)或E2(0.4 mg/kg)每日處理完整動物，持續“天。此 後，自所有處理組之動物分離前列腺，且製備蛋白質提取 物。藉由凝膠電泳分離蛋白質提取物並轉移至膜。使用市 售抗體MA6H)(Santa Cruz Biotechn〇1〇gy)偵測催乳激素受 體。結果展示於圖4中，且指示大鼠前列腺中催乳激素受 體之激素調控。 實例5 催乳激素受體中和抗體及非特異性對照抗體對催乳激素 誘導之BaF3細胞（經人類催乳激素受體穩定轉染）之增殖 的抑制 為了分析PRLR中和抗體之活體外功效，使用對催乳激 素活化之BaF3細胞之細胞增殖的抑制。用人類pRLR穩定 轉染細胞，且按常規在含有2 mM麩酿胺酸之rpmi令在 10% FCS及10 ng/ml人類催乳激素存在下培養。在含有ι〇/〇 FCS之無催乳激素培養基中挨餓6小時後，將細胞接種於96 孔板中’後度為母孔10000個細胞。用20 ng/ml催乳激素刺 激細胞，且與遞增劑量之PRLR中和抗體一起共培育兩 天。使用CellTiter-Glo發光細胞活力檢定（prornega)分析細 胞增殖。產生對催乳激素刺激之細胞生長之抑制的劑量反 應曲線，且計算IC5〇值《作為陰性對照組，使用以非特異 性對照抗體刺激。 劑量反應曲線及IC5〇值展示於圖5中。非特異性抗體不抑 152407.doc •68· 201130504 制穩定表現人類PRLR之BaF細胞增殖，而特異性抗體阻斷 細胞增殖且展現不同效能。中和抗體006-H08在該讀數範 例中顯示最高效能。 實例6 特異性及非特異性抗艎對催乳激素誘導之大鼠淋巴瘤細胞 增殖的抑制 亦使用對催乳激素依賴性大鼠淋巴瘤細胞（Nb2-11細胞） 增殖的抑制來測試PRLR中和抗體之活體外功效。按常規 使Nb2-ll細胞在含10% FCS及10%馬血清之RPMI中生長。 在開始細胞生長檢定之前，使細胞在以1% FCS代替10% FCS之相同培養基中生長24小時。以後，將細胞接種於96 孔板中之無FCS之培養基中，密度為每孔10000個細胞。在 有或無遞增劑量之PRLR中和抗體或對照抗體存在下，用 10 ng/ml人類催乳激素刺激細胞2天。以後，使用 CellTiter-Glo發光細胞活力檢定（Promega)評定細胞增殖。 劑量反應曲線及IC5〇值展示於圖6中。非特異性抗體及不結 合大鼠PRLR之抗體XHA06.983不阻斷Nb2-ll細胞增殖。 結合大鼠PRLR之XHA06.642阻斷Nb2-ll細胞增殖。 實例7 催乳激素受體中和抗體對T47D細胞中之催乳激素誘導之 STAT5磷酸化的抑制 為了分析PRLR中和抗體在另一讀數中之活體外功效， 使用對經催乳激素處理之人類T47D細胞中之STAT5磷酸化 的抑制。使T47D細胞在含有10% FCS及2 mM麩醯胺酸之 152407.doc -69- 201130504 RPMI中生長。將細胞接種於24孔板中，密度為每孔 0.5χ105個細胞。第二天，使細胞在無血清之RPMI中挨餓1 小時。此後，在無或有20 ng/ml人類催乳激素存在下，在 有或無不同劑量之PRLR中和抗體或非特異性對照抗體 下，培育細胞30分鐘。此後，清洗細胞並在70 μΐ溶解緩衝 液中溶解。離心溶解產物，且在-80°C下冷凍上清液。使 用西方墨點法分析提取物（抗pSTAT5A/B抗體，來自upstate 07-5 86，按1:1000稀釋）。作為内參考物，與抗β微管蛋白 抗體（ab7287，按1:500稀釋）一起培育剝離之墨點。 結果展示於圖7中。除非特異性FITC抗體外，所有PRLR 中和抗體均劑量依賴性地阻斷人類T47D細胞卡之STAT5磷 酸化。所有測試抗體均以高親和力結合於人類PRLR。 實例8 對經人類PRLR穩定轉染之Hek293細胞中之螢光素酶報導 體基因活性的抑制-分析催乳激素受體中和抗體及非特異 性對照抗體 為了進一步分析PRLR中和抗體之活體外功效，使用報 導體基因檢定。在LHRE(催乳激素反應元件）控制下，用螢 光素酶報導體基因短暫轉染經人類PRLR穩定轉染之 HEK293細胞7小時。此後，將細胞接種於96孔板中，密度 為每孔20000個細胞（0·5°/〇木炭剝離血清（charcoal stripped serum)，DMEM)。第二天，添加300 ng/ml人類催乳激素， 加上及不加上遞增劑量之PRLR中和抗體或對照抗體。24 小時後，測定螢光素酶活性。結果展示於圖8中。與非特 152407.doc -70- 201130504 異性抗體形成對比，006-H08及HE06.642在經人類PRLR穩 定轉染之HEK293細胞中抑制螢光素酶活性。 實例9 對經鼠類PRLR穩定轉染之Hek293細胞中之螢光素酶報導 醴基因活性的抑制-分析催乳激素受體中和抗體及非特異 性對照抗體 為了進一步分析PRLR中和抗體對鼠類催乳激素受體之 活體外功效，使用報導體基因檢定。在LHRE(催乳激素反 應元件）控制下，用螢光素酶報導體基因短暫轉染經鼠類 PRLR穩定轉染之HEK293細胞7小時。此後，將細胞接種 於96孔板中，密度為每孔20000個細胞（0.5%木炭剝離血 清，DMEM)。第二天，添加200 ng/ml人類催乳激素，加 上及不加上遞增劑量之PRLR中和抗體或對照抗體。24小 時後，測定螢光素酶活性。結果展示於圖9中。而抗體 005-C04(實心三角形）展現高活性（IC50值=3 nM)，抗體 HE06.642(實心圓形）不顯示高連330 nM之活性。非特異性 對照抗體（空心圓形）為完全非活性的。與Novartis抗體 HE06.642形成對比，抗體005-C04能夠阻斷鼠類PRLR介導 之信號傳導。 實例10 催乳激素受體中和抗體及非特異性對照抗體對催乳激素 誘導之BaF3細胞（經鼠類催乳激素受體穩定轉染）之增殖 的抑制 採用對催乳激素所活·化Ba/F3細胞之細胞增殖的抑制作 152407.doc -71 - 201130504 用为析PRLR中和抗體之活體外功效。用鼠類prlr穩定轉 染細胞，且按常規在含有2 mM麵醢胺酸之rpmi中在1 〇% FCS及10 ng/ml人類催乳激素存在下培養。在含有1% pcs 之無催乳激素培養基中挨餓6小時後，將細胞以每孔1 〇 〇 〇 〇 個細胞之密度接種於96孔板中。用40 ng/mi催乳激素刺激 細胞，且與遞增劑量之PRLR中和抗體一起共培育兩天。 使用CellTiter-Glo發光細胞活力檢定（Promega)分析細胞增 殖。產生對催乳激素刺激之細胞生長之抑制的劑量反應曲 線，且計算ICm值。作為陰性對照組，使用以非特異性對 照抗體刺激。 劑量反應曲線及ICw值展示於圖10中。非特異性對照抗 體（實心正方形）對鼠類PRLR為非活性的。抗體HE06.642、 001-E06及001—d07僅有限抑制鼠類PRLR活化。僅抗體005_ C04完全阻斷鼠類PRLR活化。 實例11 催乳激素受體中和抗體IgGl 005-C04在小鼠中之避孕作用 為了測試催乳激素受體中和抗體對小鼠生育力的影響， 使12週大的雌性與雄性NMRI小鼠交配7天（第〇天-第7天）。 在第-3天、第0天 '第3天及第6天藉由腹膜内注射磷酸鹽 緩衝生理食鹽水、溶解於磷酸鹽緩衝生理鹽水中之非特異 性IgGl對照抗體（抗FITC，10 mg/kg)或濃度為每公斤體重 10 mg 或 30 mg 之 IgGl 中和抗體 005-C04(=IgGl 005-C04)來 處理雌性小鼠。各實驗組使用1 〇隻雌性動物。使各隻雄性 與兩隻雌性交配，一隻雌性來自經填酸鹽緩衝生理食鹽水 152407.doc •72· 201130504 或非特異性抗體處理之陰性對照組，另一隻雌性經特異性 中和抗體處理。不會使至少一隻雌性受孕之雄性之交配數 據將會從分析中排除。讀數參數為平均窩仔數及受孕率 (以％計量），後者以每實驗組之窩數除以該組内理論上可 能的窩數而計算。結果展示於圖11中。 圖11A展示所獲得之受孕率。受孕率如下： 經磷酸鹽緩衝生理鹽水處理之小鼠組為87.5〇/〇， 經非特異性對照抗體（10 mg/kg)處理之小鼠組為75%， 經PRLR中和抗體igGl 005-C04(10 mg/kg)處理之小鼠組為 100%，及 經PRLR中和抗體“⑴0〇5_C〇4(3〇 mg/kg)處理之小鼠組為 0〇/〇。 圖11B展示對不同實驗組所觀察到之窩仔數。窩仔數如 下： *經鱗酸鹽緩衝生理鹽水處理之小鼠組每窩1〇9隻小 鼠， #經非特異性對照抗體（10 mg/kg)處理之小鼠組每窩 12.3隻小鼠， •經PRLR中和抗體igG1 005_C04(1〇 mg/kg)處理之小鼠 組每窩13隻小鼠，及 •經PRLR甲和抗體1§(31 005-C04(3〇 mg/kg)處理之小鼠 組每窩0隻小鼠。 該交配研究之結果證明，催乳激素受體中和抗體igGi 〇〇5_C〇4在每公斤體重mg下測試時完全阻止小鼠妊娠。 152407.doc •73· 201130504 實例12 抗原決定基分組 使用Biacore藉由監測數對抗PRLR抗體與ECD-PRLR (SEQ ID NO: 70)之同時結合進行抗原決定基分組實驗。簡 言之，使用正羥基丁二醯胺（NHC)與N-乙基-N·-二甲基胺 基丙基碳化二亞胺（EDC)經由一級胺偶合將第一抗體共價 固定於感測器晶片上。隨後用乙醇醯胺阻斷表面上未佔據 之結合位點。可溶性ECD-PRLR(SEQ ID NO: 70)經由固定 之抗體捕捉於表面上，因此，捕捉抗體之抗原決定基因所 有結合之ECD-PRLR分子而受阻斷。立即使第二抗體通過 該表面以結合於固定之ECD-PRLR。識別相同或重疊抗原 決定基之兩個抗體不能結合於ECD-PRLR，而具有獨特抗 原決定基之抗體則能夠結合。用甘胺酸（pH 2.8)使抗體表 面再生以移除結合之蛋白質，隨後用其他抗體重複該過 程。測試抗體之所有組合》代表性結果展示於表7中。抗 體 006-H08、002-H06、002-H08 ' 006-H07 及 XHA06983 彼 此競爭性結合於ECD-PRLR，表明其靶向重疊的抗原決定 基（抗原決定基組1，表6)。另外，該等抗體競爭性結合於 PRL，001-E06之情況亦如此（抗原決定基組2，表6)。該抗 體靶向ECD-PRLR之與先前提及之位點不同的位點。最 後，抗體005-C04競爭性結合於HE06.642及XHA06.642， 且不與PRL競爭（抗原決定基組3，表6)。 表7 :靶向人類催乳激素受體（PRLR)之細胞外域（ECD)上 之重疊抗原決定基的抗體組 152407.doc -74- 201130504 抗體 抗原決定基組 與催乳激素競爭 006-H08 1 是 002-H06 1 是 002-H08 1 是 006-H07 1 是 001-E06 2 是 005-C04 3 否 HE06.642 3 否 XHA06.642 3 否 XHA06.983 1 是 實例13 抗鱧對表現於細胞表面上之小鼠及人類PRLR之交叉反應性 為了測定抗PRLR抗體對表現於細胞上之小鼠及人類 PRLR之結合特徵，利用流式細胞術對分別穩定表現人類 及鼠類PRLR之HEK293細胞測試結合。收集該等細胞以及 無PRLR之親本HEK293細胞株，離心，且再懸浮於含有2% FBS及0.1%疊氮化鈉之lxPBS(FACS緩衝液）中，每毫升約 5χ106個細胞。以FACS緩衝液稀釋抗體005-C04、001-E06 及HE06.642至2倍最終濃度，且添加至適當樣品孔（每孔50 μΐ)中。對於二次抗體及自發螢光對照物，向適當孔中添加 50 μΐ FACS緩衝液。向各樣品孔中添加50 μΐ細胞懸浮液。 在4°C下培育樣品1小時，用冷FACS緩衝液洗滌兩次，且 再懸浮於按1:100稀釋之含有PE結合山羊抗人類IgG之 FACS缓衝液中。在4°C下培育30分鐘後，用冷FACS緩衝液 洗務細胞兩次，再懸浮於含有1 mg/ml蛾化丙錠 152407.doc -75- 201130504 (Invitrogen，San Diego，CA)之FACS緩衝液中並利用流式細 胞術分析。如圖13中所示’抗體005_C04及001_E06結合於 該等細胞上之人類及鼠類PRLR ’而HE06.642僅結合於人 類PRLR。該觀測結果與實例9中所報導之關於HE06.642在 鼠類PRLR依賴性螢光素酶報導體基因檢定中之功效缺失 的研究結果一致。雖然005-C04及HE06.642競爭性結合於 人類PRLR，但該兩種抗體相對於鼠類PRLR之不同結合性 質表明其抗原決定基特異性有差異。 實例14
Fab及scFv抗體對細胞信號傳導級聯之抑制活性
為了在功能上表徵Fab及scFv篩選命中項針對PRLR觸發 之信號傳導級聯的活性，量測對PRLR本身及經催乳激素 處理之人類T47D細胞中的轉錄調控物ERK1/2及STAT5上之 填酸化的抑制。使T47D細胞在含有2 mM L-麵醯胺酸、 10%木炭剝離之FBS及胰島素·轉鐵蛋白硒-A(Gibco)之 RPMI中生長。將細胞接種於6孔板或96孔板中，密度為每 孔1.5χ106個細胞。第二天’更換生長培養基。第三天，使 細胞在無血清RPMI中挨餓1小時。此後，在有或無不同劑 量之PRLR中和抗體或非特異性對照抗體下，在500 ng/mL 人類催乳激素存在下，培育細胞5分鐘。此後’清洗細胞 且在溶解缓衝液中溶解。離心溶解產物且在-8〇°C下冷凍 上清液。根據用於量測PRLR填酸化之Du〇Set 1C「人類填 酸基-催乳激素R」套組（R&D Systems)、根據用於量測 STAT5填酸化之 PathScan磷酸基 _STAT5(Tyr694)夾心 ELISA 152407.doc • 76- 201130504 套組（Cell Signaling Technology; #7113)及根據用於量測 ERK1/2 磷酸化之磷酸基-ERK1/ERK2 套組（R&D Systems)， 利用ELISA測試樣品。表8提供關於篩選命中選項在Fab或 scFv格式下、在每毫升7.5 pg固定劑量下的括抗活性之概 要。 表8:篩選命中選項對PRLR、ERK1/2及STAT5之磷酸化 之拮抗活性（如藉由ELISA對人類乳癌細胞株T47D之細胞 溶解產物所測定） 抗體 在固定抗體劑量(7.5 pg/m丨)下對磷酸化之抑制率(％) PRLR ERK1/2 STAT5 006-H081 100 100 100 002-H060 92 86 72 002-H080 100 100 98 006-H071 88 85 73 001-E060 63 45 36 陰性對照物 2 9 0 152407.doc -77- 1 scFv格式，。Fab格式 實例15 PRLR中和抗體抑制小鼠之泌乳 使成年NMRI雌性小鼠與NMRI雄性小鼠交配。在產後第 1天，調整窩仔數為每隻泌乳母體8隻小鼠。自產後第1天 開始，每天早晨測定後代之重量》泌乳母體保持未經處理 (圖14A、圖14B中之實心圓形）或用非特異性抗體（每公斤 體重10 mg ;圖14A、圖14B中之空心圓形）、或用含有鼠類 IgG2a恆定域之 PRLR 中和抗體 〇〇5-C04(=IgG2a 005-C04 ; 201130504 10 mg/kg，圖14A、圖14B中之實心三角形）、或用PRLR中 和抗體IgG2a 005-C04(30 mg/kg，圖 14A、圖 14B中之空心 三角形）經腹膜内處理。組規模為每實驗組5-6隻泌乳母 體。在產後第1天、第3天、第6天、第9天、第10天及第12 天用特異性或非特異性對照抗體處理母體（在圖14A、圖 14B中用箭頭指示）。結果展示於圖14中。圖14A展示產後 每一天之窩重增量，以佔第1天各別窩重之百分比表示。 自產後第8天起’經PRLR中和抗體處理之母體之後代與保 持未經處理或接受非特異性對照抗體之母體之後代之間的 窩重增量存在顯著差異。歸因於倫理原因，在接受最高劑 量PRLR中和抗體之母體之實驗組中，在產後第1〇天必須 處死若干窩。在圖14B中，以不同方式圖示結果。展示逐 曰有差異的窩重增量’且以佔產後第1天之窩重之百分比 表示。圖14B基本上展示圖14A中所示之圖的斜率。未處 理母體或經非特異性抗體處理之母體之窩的每日窩重增量 差異在產後第1天起始窩重之約30%上下波動。經每公斤 體重30 mg PRLR中和抗體處理之母體之窩自第7天起的每 曰窩重增量有明顯大幅減小（相對於經非特異性抗體處理 之母體之窩’ *ρ<0.05 ; *“ρ<〇·〇〇5)。若與經非特異性對 照抗體處理之母體之窩相比，則自產後第丨丨天起，經1〇 mg/kg PRLR中和抗體處理之母體之窩的每日窩重增量亦有 顯著減小（相對於經非特異性抗體處理之母體之寫， p<0.05)。總之’ PRLR中和抗體1§(}2& 〇〇5_C〇4對泌乳抑制 有劑量依賴性效應。圖14C展示不同實驗組之泌乳母體之 152407.doc •78· 201130504 乳腺的組織切片。給未處理母體及經非特異性對照抗體處 理之母體的乳腺充滿了產生乳汁之乳腺管。相比之下，經 PRLR中和抗體igG2a 005-C04處理之母體有乳腺退化跡 象。圖14C中之黑色箭頭指向乳腺組織中之脂肪島（參見特 異性抗體IgG2a 005-C04對乳腺退化程度之劑量依賴性效 應（圖14C))。另外’分析主要乳蛋白β_酪蛋白（Csn_2)、乳 清酸性蛋白質（WAP)及IGF-1於不同實驗組之母體之乳腺中 的表現（圖14D)。相對於TATA盒結合蛋白質（TBp)之表現校 正基因表現。PRLR中和抗體IgG2a 005-C04劑量依賴性地 降低乳蛋白表現，而非特異性抗體（10 mg/kg)不具有任何 顯著效應。 PRLR中和抗體ig〇2a 005-C04劑量依賴性地阻斷泌乳且 在泌乳小鼠中引起乳腺退化，表明其適用於泌乳抑制。 實例16 PRLR中和抗體適用於治療良性乳房疾病 活化PRLR突變或局部或全身性高催乳激素血症會引發 良性乳房疾病。因此，採用在乳腺中誘導增強之增殖（良 性乳房疾病之最嚴重的形式的特點）的高催乳激素血症小 鼠模型。第0天，12週大的雌性Balb/C小鼠在腎包膜下接受 垂體同源移植物或保持不接受手術。垂體同源移植小鼠保 持未經處理，或在第〇天、第3天、第7天、第u天及第15 天’用非特異性抗體（10 mg/kg)、呈1§(31格式之pRLR中和 抗體 005-C04(=IgG1 005_C04; 1〇 mg/kg)、或 pRLR 中和抗 體IgGl 005-C04(30 mg/kg)經腹膜内處理。實驗組規模為 152407.doc •79· 201130504
8_1〇隻動物。在垂體移植後第17天，處死小鼠。在死亡前 2小時’動物接受BrdU腹膜内注射，以監測上皮細胞增 殖。將左腹股溝乳腺固定於卡諾伊溶液（Carnoy's solution) 中’且製備乳腺整體封裝標本並用Carmine alaune染色（圖 15 A)。將右腹股溝乳腺固定於4%構酸鹽緩衝福馬林中隔 夜。接著，將乳腺包埋於石蠟中，且如先前所述進行BrdU 免疫染色（Endocrinology 149(8):3952-3959; 2009)。另外， 進行PSTAT5免疫染色（來自abcam之抗pSTAT5抗體 ab32364，按1:60稀釋）以監測因PRLR中和抗體處理而受抑 制之PRLR介導之信號傳導。圖丨5 A展示不同實驗組之乳腺 整體封裝標本之放大圖。不接受垂體之成年小鼠之乳腺顯 不乳腺管及末端芽，而接受垂體同源移植物之小鼠有極度 的側邊分枝及小泡結構形成。用非特異性抗體（1〇 mg/kg) 處理不抑制側邊分枝及小泡結構形成。相比之下，用每公 斤體重10 mg中和抗體igGl 〇〇5-C04處理在1〇隻接受垂體 同源移植物之動物的8隻中完全抑制側邊分枝，且用3〇 mg/kg IgGl 005-C04處理在9隻接受垂體同源移植物之動物 的9隻中完全抑制側邊分枝。組織學分析及8以1;免疫染色 展示於圖15B中。垂體同源移植引起不受非特異性抗體處 理抑制之上皮增生，而在具有垂體同源移植物且經每公斤 體重10 mg或30 mg劑量之PRLR中和抗體處理之小鼠中無 上皮增生。在圖15B中，一些反映處於將要分裂之細胞週 期S期之細胞的Brdu陽性細胞以白色箭頭指示。經中和抗 體IgGl 005-C04(每公斤體重30 mg)處理之小鼠顯示乳腺中 152407.doc -80- 201130504 之上皮細胞增殖幾乎完全被抑制。在圖丨5 c中，一些對填 酸基-STAT5呈陽性之細胞以白色箭頭指示。用3〇 mg/kg IgGl 005-C04處理可完全抑制STAT5磷酸化，此表明完全 阻斷PRLR介導之信號傳導。 圖15A、B及C之結果證明，pRLR中和抗體適用於治療 乳腺病，一種乳腺良性增殖疾病。PRLR中和抗體抑制乳 腺上皮細胞增殖及磷酸基STAT5-活化。 實例17 用PRLR中和抗體治療良性前列腺增生 在雄性Balb/c小鼠中藉由在8週大時，在腎包膜下移植兩 個垂體來形成良性前列腺增生。對照組則不接受手術。接 又垂體同源移植物之小鼠保持未經處理或接受非特異性抗 體（10 mg/kg)或每公斤體重10 mg及3〇 mg劑量之含有鼠類 IgG2a恆定域之 PRLR _ 和抗體 005-C04(=IgG2a 0〇5_c〇4)的 腹膜内注射。在垂體移植當天（=第〇天）開始且在垂體移植 後第3天、第7天、第11天、第15天、第18天、第22天及第 25天’進行抗體注射。第28天處死小鼠。測定腹側前列腺 之相對重量。結果展示於圖16中。垂體同源移植引起相對 前列腺重量增加。用1〇 mg/kg及30 mg/kg PRLR中和抗體 IgG2a 005-C04處理可減小前列腺重量，而用非特異性對 照抗體處理則無任何作用。因此，PRLR中和抗體適於治 療良性前列腺增生》 在垂體同源移植後第1 8天後，很明顯，接受垂體同源移 植物之動物的毛髮生長減弱。PRLR中和抗體在高催乳激 I52407.doc • 81 - 201130504 素血症病狀下刺激毛髮生長。代表性照片展示於圖以中。 因此，PRLR中和抗體可用於治療高催乳激素血症性毛髮 減少。 實例18 PRLR中和抗體對毛髮生長之影響 如先前所述（British Journal 〇f Dermat〇i〇gy 2〇〇8; 159 300-305)，使用電動剃毛刀去除8週大的雄性及雌性 C57BL/6小鼠之背毛。在—些組中藉由在腎包膜下作垂體 同源移植來誘發高催乳激素血症，其餘組之動物為正常催 礼激素血症。每週一次（在垂體同源移植當天，即第〇天開 始）用特異性PRLR抗體（IgG2a 005_C04)或非特異性對照抗 體（3〇 mg/kg，腹膜内）處理動物。在第7天及第14天，進行 後續抗體注射。在三週後，在帶粉紅色_白色的經剃毛之 皮膚上可見再生長之毛呈黑色，且量測變成黑色之經剃毛 區域所佔之百分比。在剃毛後15天殺死雌性小鼠，且在剃 毛後18天處死雄性小鼠。 使用以下實驗組（組規模為6隻小鼠）： 1. 經剃毛之雌性 2. 具有垂體同源移植物的經刹毛之雌性 3. 具有垂體同源移植物+每週一次用3〇 mg/kg非特異性 抗體IgG2a 0〇5-C04處理的經刹毛之雌性 4. 具有垂體同源移植物+每週一次用3〇 mg/kg特異性抗 體處理的經剃毛之雌性 5_每週一次用30 mg/kg非特異性抗體處理的經剃毛之 I52407.doc -82 - 201130504 雌性 6. 每週一次用30 mg/kg特異性抗體處理的經剃毛之雌 性 7. 經剃毛之雄性 8·具有垂體同源移植物的經剃毛之雄性 9.具有垂體同源移植物+每週一次用3〇 mg/kg#特異性 抗體處理的經刺毛之雄性 1〇_具有垂體同源移植物+每週一次用3〇 特異性抗 體IgG2a 005-C04處理的經剃毛之雄性 11.母週一次用3 0 mg/kg非特異性抗體處理的經剃毛之 雄性 12_每週一次用30 mg/kg特異性抗體處理的經剃毛之雄性 不同組之動物的代表性圖片展示於圖丨8中，圖丨8中指示 再生長有毛髮之區域所佔的百分比。 PRLR中和抗體在雄性及雌性小鼠中在高催乳激素血症 及正常催乳激素金症病狀下刺激毛髮再生長，而非特異性 抗體則不然。因此，PRLR中和抗體適用於治療女性及男 性在高催乳激素血症及正常催乳激素血症病狀下之毛髮減 少。 實例19 PRLR中和抗體對增強之乳腺上皮細胞增殖的抑制 為了測試PRLR中和抗體對由組合激素療法（亦即雌激素 加助孕素療法）活化之增強之乳腺上皮細胞增殖的影響， 採用允許定量子宮及乳腺中之增殖效應的先前描述之小鼠 152407.doc • 83 - 201130504 模型（Endocrinology 149:3952-3959，2008)。對 6 週大的 C5 7BL/6雌性小鼠切除卵巢。在卵巢切除術後2週，藉由每 曰注射媒劑（乙醇/花生油10%/90%)或100 ng雌二醇加100 mg/kg助孕酮經皮下處理動物，持續兩週。每週一次藉由 腹膜内注射呈鼠類IgG2a格式之PRLR中和抗體（10 mg/kg及 30 mg/kg)或非特異性抗體（30 mg/kg)來處理動物，持續三 週。在卵巢切除術後第3 6天，進行屍檢。在死亡之前兩小 時，動物接受溶解於磷酸鹽緩衝生理鹽水中之BrdU(每公 斤體重70 mg)的腹膜内注射。如先前所描述，分析右腹股 溝乳腺2/3處近端之乳腺上皮細胞增殖（BrdU免疫染 色）（Endocrinology 149:3952-3959，2008) 0 實驗包含以下組： 1. 經媒劑處理之卵巢切除動物 2. 經100 ng雌二醇處理之卵巢切除動物 3. 經100 ng雌二醇（E)及100 mg/kg助孕酮（P)處理之卵巢 切除動物 4. 經E+P及10 mg/kg特異性抗體005-C04處理之卵巢切除 動物 5. 經E+P及3 0 mg/kg特異性抗體005-C04處理之卵巢切除 動物 6. 經E2+P及30 mg/kg非特異性對照抗體處理之卵巢切除 動物 結果展示於圖19中。評估乳腺之4個橫截面内增殖的乳 腺管上皮細胞之絕對數目。中值展示成水平橫條。經媒劑 152407.doc •84- 201130504 處理之印巢㈣小鼠之上皮細胞增殖相當低。雌二醇處理 對上皮細胞增殖產生—定的刺激，在雌激素加助孕網處理 下觀測到最大乳腺上皮細胞增殖(圖19)。用催乳激素受體 中和抗體GG5-CG4處理引起乳腺上皮細胞增殖劑量依賴性 降低，幾乎回至單獨雌二醇之程度’而非特異性對照抗體 則不然。 因此，PRLR中和抗體適用於治療組合激素療法（亦㈣ 二醇加助孕酮治療）下增強之乳腺上皮細胞增殖。 實例20 用PRLR令和抗鱧治療SHN小鼠之子宮腺肌症卜子宮内子 宮内膜異位） 為了測試PRLR中和抗體在子宮内膜異位症中之功效， 採用依賴於全身性高催乳激素血症之Shn小鼠子宮腺肌症 模型（Acta anat. 1 16:46-54，1983)。藉由在腎包膜下給7週 大的雌性小鼠作垂體同源移植而在SHN小鼠中誘導高催乳 激素血症（Acta anat. 1 16:46-54，1983)。在垂體同源移植後 1週開始，經腹膜内投與PRLR中和抗體（1〇 mg/kg或3〇 mg/kg)或非特異性抗體（3〇 mg/kg)。如先前描述，評定腺 組織對子宮肌層之浸潤（Laboratory Animal Science 1998, 48:64-68)。每週一次及兩次藉由腹膜内注射來進行抗體處 理’持續9週❹在屍檢時（在垂體移植後第7〇天），將子宮於 緩衝之4%福馬林中固定隔夜並包埋於石蠟中。如下評定 子宮腺肌症（=子宮内子宮内膜異位）程度： 等級0= 無子宮腺肌症 152407.doc -85· 201130504 等級0.5=子宮肌層内層在同心方向上鬆驰 等級1= 子宮内膜腺體侵入子宮机層内層 等級2= 子宮内膜腺體在子宮肌層内層與外層之間 等級3= 子宮内膜腺體侵入子宮肌層外層 等級4= 子宮内膜腺體位於子宮肌層外層外部 實驗包含以下實驗組： 1. 未經垂體移植之動物，亦即正常催乳激素血症小鼠 2. 經垂體移植之動物’亦即高催乳激素血症小鼠 3. 經垂體移植之動物，每週用30 ^^/“劑量之非特異性 對照抗體處理一次 4. 經垂體移植之動物，每週用3〇瓜““劑量之非特異性 對照抗體處理兩次 5. 經垂體移植之動物，每週用1〇 mg/kg劑量之呈鼠類 IgG2a格式之催乳激素受體中和抗體^^[⑸處理一次 6. 經垂體移植之動物，每週用1〇 mg/kg劑量之呈鼠類 IgG2a格式之催乳激素受體中和抗體〇〇5〇：〇4處理兩次 7·經垂體移植之動物’每週用3〇 mg/kg劑量之呈鼠類 1§(}2&格式之催乳激素受體中和抗體005-C04處理一次 8.經垂體移植之動物，每週用3〇 mg/kg劑量之呈鼠類 IgG2a格式之催乳激素受體中和抗體〇〇5_c〇4處理兩次 結果展示於圖20中。個別地給予各處理組中之各動物的 評分，且各處理組之中值以水平橫條展示。正常催乳激素 血症小鼠在某種程度上患有子宮内子宮内膜異位（中值疾 病評分=0.25) °由垂體同源移植所致之高催乳激素血症增 J52407.doc • 86 - 201130504 加疾病5平分’且較多動物患有該疾病（中值疾病評分 -2.5)。而每週用3〇 mg/kg非特異性抗體處理一或兩次對疾 病無影f ’用肖異性中和&體處理顯示疾病評分有劑量依 賴性降低。值得注意的是，每週接受1〇 mg/kg43〇 特異性&體^欠之所有動物完全被治癒，且其#。病評分顯 著低於正常催乳激素血症小鼠之疾病評分（圖2〇)。因此， PRLR中和k體適用於治療女性之子宮内子宮内膜異位（= 子呂腺肌症）及子宮外子宮内膜異位症。 【圖式簡單說明】 圖1 ’催乳激素-mRNA(PRL-mRNA)於健康女性及罹患子 宮内膜異位症之女性的人類子宮内膜及病灶（異位組織）中 之表現（藉由即時TaqMan PCR分析來分析）。 圖2 :催乳激素受體_mRNA(PRLR_mRNA)於健康女性及 罹患子宮内膜異位症之女性的人類子宮内膜及病灶（異位 組織）中之表現（藉由即時TaqMan PCR分析來分析）。 ’ 圖3 :對PRLR基因在大鼠組織中之表現的北方墨點分析 結果。PRLR之基因表現顯示在胎盤及前列腺中有高度表 現。 圖4 .對PRLR在經不同激素處理之大鼠前列腺中的表現 之西方墨點分析結果。與完整動物之媒劑處理相比，完整 大鼠之雌二醇處理及閹割引起PRLR蛋白質在大鼠前列腺 t上調，而完整大鼠之二氫睪固酮處理對前列腺 中之表現無影響。 圖5 . PRLR中和抗體及非特異性對照抗體對催乳激素活 I52407.doc -87 · 201130504 化之Ba/F(=Baf)細胞增殖（穩定地表現人類PRLR)之抑制。 測定以下抗體在IgGl格式下之IC5Q值：005-C04(實心圓 形）：1.29 pg/ml = 8.6 nM ; 〇〇6-H08(空心圓形）：0.15 Hg/ml=l nM ; HE06.642(實心三角形）：0.34 pg/m卜2.2 nM ; 002-H06(空心三角形）：0.54 gg/m卜3.6 nM ; 002-H08 (實心正方形）：0.72 pg/ml=4.8 nM ;非特異性對照抗體（空 心正方形）：對細胞增殖無抑制。 圖6 : PRLR中和抗體及非特異性對照抗體對催乳激素誘 導之大鼠淋巴瘤細胞增殖（NB2細胞）之抑制。測定以下 IC50 值：ΧΗΑ06·642(實心圓形）：10 pg/ml=67 nM ; XHA06.983(空心圓形）：對大鼠淋巴瘤細胞增殖無影響； 非特異性對照抗體（實心三角形）：在10 pg/ml下無作用。 圖7 : PRLR中和抗體及非特異性對照抗體對T47D細胞中 催乳激素刺激之STAT5磷酸化的抑制。 非特異性對照抗體（FITC)不抑制T47D細胞中之STAT5磷 酸化。相比之下，抗體 XHA06.642、005-C04(=IgGl 005-C04)及006-H08(=IgGl 006-H08)以劑量依賴性方式抑 制T47D細胞中之STAT5磷酸化。 圖8 :使用經人類催乳激素受體（hPRLR)穩定轉染且在催 乳激素反應元件（LHRE)控制下短暫表現螢光素酶基因之 HEK293細胞所得知的PRLR中和抗體及非特異性對照組對 催乳激素活化之螢光素酶報導體基因活性的影響。測定以 下抗體在IgGl格式下之IC50值：006-H08(實心圓形）：0.83 pg/ml=5.5 ηΜ ; ΗΕ06·642(空心圓形）：0.63 pg/ml=4.2 152407.doc • 88 - 201130504 nM ;非特異性對照抗體（實心三角形）：對螢光素酶活性無 抑制。 圖9:使用經鼠類催乳激素受體（mPRLR)穩定轉染且在 催乳激素反應元件（LHRE)控制下短暫表現螢光素酶基因之 HEK293細胞所得知的PRLR中和抗體及非特異性對照組對 催乳激素活化之螢光素酶報導體基因活性的影響。測定以 下抗體在IgGl格式下之IC50值：005-C04(實心三角形）： 0.45 pg/ml=3 ηΜ; ΧΗΑ06·642(實心圓形）：>>50 pg/ml>> 333 nM ;非特異性對照抗體（空心圓形）：對螢光素酶活性 無抑制。 圖10 :催乳激素受體中和抗體及非特異性對照抗體對催 乳激素活化之Ba/F(=Baf)細胞增殖（穩定地表現鼠類催乳激 素受體）之抑制。測定以下抗體在IgGl格式下之IC5G值：非 特異性FITC抗體（實心正方形）：對細胞增殖無抑制； HE06.642(實心圓形）：>>>30 gg/ml>>>200 nM ； 001-E06 (空心圓形）：43.7 pg/ml=291 nM ; 001-D07(實心三角形）： 16.5 pg/ml=110 nM; 005-C04(空心三角形）：0.74 pg/ml = 4.9 nM。 圖11 :經磷酸鹽緩衝生理食鹽水（=媒劑）、非特異性對 照抗體（FITC IgGl)或中和抗體 IgGl 005-C04(=005-C04)處 理之雌性小鼠的受孕率（A)及平均窩仔數（B)。受孕率為 87.5%(經媒劑處理之雌性小鼠）、75%(經10 mg/kg非特異 性抗體處理之雌性小鼠）、1〇〇%(經1〇 mg/kg IgGl 005-C04 處理之雌性小鼠）及0%(經30 mg/kg IgGl 005-C04處理之雌 152407.doc • 89 - 201130504 性小鼠）。平均窩仔數為10.9隻動物（經媒劑處理之雌性小 鼠）、12.3隻動物（經1〇 mg/kg非特異性抗體處理之雌性小 鼠）、13隻動物（經1〇 mg/kg IgGl 005-C04處理之雌性小鼠） 及〇隻動物（經30 mg/kg IgGl 005-C04處理之雌性小鼠）。 圖 12 :根據 Johnson 及 Wu(Nucleic Acids Res. 2000，28, 214-218)之構架胺基酸位置之Kabat編號。
圖 13 :對所選抗 PRLR 抗體（005-C04、001-E06、 HE06642)之FACS分析結果》測定抗體在固定濃度下於表 現人類及小鼠PRLR之HEK293細胞上相較於不表現PRLR 之親本細胞株的結合情況。 圖14 A :產後各天之窩重增量（以佔產後第1天獲得之窩 重的百分比表示）。展示未處理母體（實心圓形）、經1〇 mg/kg非特異性鼠類ig〇2a抗體處理之母體（空心圓形）、及 經10 mg/kg(實心三角形）及30 mg/kg(空心三角形）含鼠類 IgG2a恆定域之中和抗體〇05_c〇4(=IgG2a 005-C04)處理之 母體的窩重增量。箭頭指示進行抗體注射之日。自產後第 8天起，經30 mg/kg IgG2a 005-C04處理之母體的寫重增量 明顯減小。 圖14B:逐曰增加之窩重增量（以佔產後第1天之窩重的 百分比表示）。展示未處理母體（實心圓形）、經1〇 mg/kg非 特異性鼠類IgG2a抗體處理之母體（空心圓形）、經i 〇 mg/kg(實心三角形）及3〇 mg/kg(空心三角形）含鼠類igG2a 恆定域之中和抗體〇〇5-C04(=IgG2a 005-C04)處理之母體的 窩的結果》基本上，圖14B呈現圖14A中所示之圖的斜 152407.doc -90- 201130504 率。未處理母體及經10 mg/kg非特異性抗體處理之母體的 每曰窩重增量在產後第1天窩重之約30%上下波動。相比 之下，用30 mg/kg IgG2a 005-C04處理母體引起增重自第7 天起明顯減小（相對於經非特異性抗體處理之母體的寫， *ρ<0·05，***ρ<〇·〇〇5)，而用 1〇 mg/kg igG2a 005-C04處理 引起每日體重增加自第11天起明顯減小（相對於經非特異 性抗體處理之母體的窩，p<〇. 〇5)。箭頭指示施用抗體之 曰° 圖14 C .泌乳母體之乳腺的組織切片。給未處理母體或 經非特異性抗體處理之母體的乳腺充滿了產生乳汁之乳腺 管。相比之下’由脂肪島（黑色箭頭）之出現所證明之乳腺 退化被IgG2a 005-C04中和抗體劑量依賴性地誘導。 圖14D :泌乳母體之乳腺中的乳蛋白質表現。在經pRLR 中和抗體IgG2a 005-C04處理之母體中乳蛋白質β赂蛋白 (Csn-2)、乳清酸性蛋白質（WAP)及Ι(}ΙΜ之表現以劑量依 賴性方式被降低’但在非特異性抗體下則不然。相對於 TATA盒結合蛋白質（ΤΒΡ)之表現校正基因表現。 圖15 A .良性乳房疾病之高摧乳激素金症小鼠模型中側 枝及小泡樣結構之形成。PRLR中和抗體IgG1 〇〇5 C〇4 (=005-C04)在10 mg/kg及30 mg/kg下抑制接受垂體同源移 植物之小鼠的側邊分枝及小泡樣結構形成。 圖1 5 B ·良性乳房疾病之高催乳激素也症小鼠模型中上 皮增生及上皮細胞增殖之程度。以白色箭頭標出一些Brdu 陽性細胞。PRLR中和抗體1§(}1 0〇5_c〇4(=〇〇5 c〇4)阻斷乳 152407.doc •91- 201130504 腺之上皮增生及上皮細胞增殖。 圖15 C .良性乳房疾病之南催乳激素灰症小鼠模型中 STAT5碳酸化之程度。以白色箭頭指示一些磷酸基_STAT5 陽性細胞。PRLR中和抗體igGl 005-C04(=005-C04)當以30 mg/kg之劑量施用時完全阻斷STAT5磷酸化。 圖16 :含有鼠類igG2a恆定域之PRLR中和抗體〇〇5_c〇4 (=IgG2a 005-C04)對前列腺生長之抑制。與未處理假手術 小鼠相比，垂體同源移植刺激前列腺生長。用1〇爪^“劑 量及30 mg/kg劑量之PRLR中和抗體處理抑制前列腺生長 (相對於未處理假手術小鼠，***p<〇.〇〇5)。 圖1 7 :在高催乳激素血症存在下，pRLR中和抗體刺激 毛髮生長。照片在對實例17及圖16中所述之實驗中所用之 雄性小鼠作垂體同源移植（及剃毛）後三週獲取。高催乳激 素血症抑制剃毛區域中毛髮再生長^ PRLR中和抗體在高 催乳激素血症病狀下在1〇 mg/kg及30 mg/kg 005.C04 (=IgG2a 005-C04)劑量下刺激毛髮再生長，但非特異性抗 體則不然。 圖1 8 :在高催乳激素血症及正常催乳激素血症雄性及雌 性小鼠中，PRLR中和抗體刺激剃毛區域之毛髮再生長， 但非特異性抗體則不然（實例18)。因此，PrLr中和抗體適 用於治療男性（圖1 8B)及女性（圖1 8A)在正常催乳激素血症 及高催乳激素血症病狀下之毛髮減少。 圖19 . PRLR中和抗體抑制繼組合激素療法（亦即組合之 雌激素加助孕素療法）後乳腺中增強之上皮細胞增殖但 152407.doc -92- 201130504 非特異性對照抗體則不然。 評估乳腺之4個橫截面内㉟殖的乳腺管上皮細胞之絕對 數目，且中值在圖争展示成水平橫條。經媒劑處理之印巢 切除小鼠之上皮細胞增殖相當低（中值=〇)。雌二醇产理對 上皮細胞增殖產生一定的刺激(中值=9)，在雌激素：助孕 酮處理下觀測到最大乳腺上皮細胞增殖（中值=144)。用催 乳激素受體中和抗體〇〇5_C()4處理（用1〇 mg/kg⑼5心4處 理後，中值=84 ;用30 mg/kg 005-C04處理後，中值=27)引 起乳腺上皮細胞增殖劑量依賴性降低，幾乎回至單獨雌二 醇之程度，而非特異性對照抗體則不然（中值=154)。 因此，PRLR中和抗體適於治療組合激素療法（亦即雄二 醇加助孕酮治療）下增強之乳腺上皮細胞增殖。 圖20 : PRLR中和抗體抑制小鼠之子宮内子宮内膜異 位仁非特異性對照抗體則不然❶結果以如實例2〇中所述 之疾病評分展示。各實驗組之中值疾病評分以水平橫條指 示。正㊉催乳激素血症小鼠在某種程度上患有子宮内子宮 内膜異位（中值疾病評分=〇 25)。由垂體同源移植所致之高 催乳激素血症增加疾病評分，且較多動物患有該疾病（十 值疾病β平为-2.5)。而每週用3〇 mg/kg非特異性抗體處理一 次（中值評分=2.5)或兩次（中值評分=2)對疾病無影響，用 特異性中和抗體處理顯示患病動物之數目有劑量依賴性減 少，在使用特異性抗體之所有情況下，中值疾病評分均為 、 值仔’主忍的疋’母週接受10 mg/kg或30 mg/kg特異性 抗體兩次之所有動物完全被治癒，且其疾病評分 顯著低於 152407.doc -93· 201130504 正常催乳激素血症小鼠之疾病評 體適用於治療女性之子宮内子宮 及子宮外子宮内膜異位症。 分。因此，PRLR中和抗 内膜異位（=子宮腺肌症） 152407.doc 94- 201130504 序列表 <110>德商拜耳先靈製藥公司 <120>催乳激素受體中和抗體及其治療用途 <130> 53788 <140> 099143327 <141> 2010-12-10 <150> 09075546.3 <151〉 2009-12-10 <160> 73 <170> Patentln version 3.3 <210〉 1 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 1
Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp 1 5 <210〉 2 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 2
Phe Ala Asn Tyr Gly Leu Thr Trp 1 <210> 3 <211> 8 <212〉 PRT <213〉 智人 <400〉 3 152407-序列表.doc 201130504 Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp 1 5 <210> 4 〈211〉 8 〈212〉 PRT <213〉 智人 <400〉 4 Phe Glu Asp His Gly Met Ser Trp 1 5 <210〉 5 〈211〉 8 <212〉 PRT 〈213〉 智人 <400> 5 Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp 1 5 <210> 6 <211〉 8 <212> PRT <213〉 智人 <400> 6 Phe Ser Ser Tyr Trp Met His Trp 1 5 <210〉 7 <211> 19 <212〉 PRT <213〉 智人 <400〉 7 152407·序列表.doc 201130504
Ala Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 15 10 15
Lys Gly Arg <210〉 8 <211> 19 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 8
Ala Val lie Ser Phe Asn Gly Asp Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 15 10 15
Lys Gly Arg 〈210〉 9 〈211〉 19 <212> PRT <213〉智人 <400〉 9
Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 15 10 15
Lys Gly Arg <210> 10 〈211〉 20 <212〉 PRT <213〉智人 152407-序列表.doc 201130504 <400〉 10
Ser Leu lie Ser Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15
Val Lys Gly Arg 20 <210〉 11 <211> 19 <212> PRT <213〉智人 〈400〉 11
Ser Ser Val Ser Asp Thr Gly Thr Asp Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 15 10 15
Lys Gly Arg <210〉 12 <211〉 19 <212> PRT 〈213〉智人 <400> 12
Ser Asp lie Ser Ser Ala Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 15 10 15
Lys Gly Arg <210〉 13 <211〉 12 <212> PRT <213〉智人 -4· 152407·序列表.doc 201130504 <400〉 13
Ala Ser Pro Leu Glu Ser Pro Val Ala Phe Asp He 1 5 10 <210〉 14 <211> 9 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 14
Cys Ala Arg Gly Gly Asp Phe Asp Tyr 1 5 <210> 15 <211〉 11 <212> PRT <213〉智人 〈400〉 15
Ala Thr Ser Leu Arg Ala Thr Ala Phe Asp Thr 1 5 10 〈210〉 16 <211〉 16 〈212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 16
Ala Lys Thr Pro Leu Ala Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr 15 10 15 <210> 17 <211> 11 <212> PRT 〈213〉智人 152407-序列表.doc 201130504 <400> 17
Ala Arg Gly Leu Asp Ala Arg Arg Met Asp Tyr 1 5 10 〈210〉 18 <211〉 13 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 18
Ser Gly Ser Asn Ser Asn lie Gly Ser Asn Pro Va.1 Asn 1 5 10 <210〉 19 <211〉 13 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 19
Ser Gly Ser Tyr Ser Asn lie Gly Gly Asn Pro Val Asn 1 5 10 <210〉 20 <211〉 13 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 20
Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn Asp Val Tyr 1 5 10 <210> 21 〈211〉 13 <212〉 PRT <213〉智人 -6- 152407·序列表.doc 201130504 <400> 21
Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn Ala Val Asn 1 5 10 <210〉 22 <211〉 13 <212> PRT 〈213>智人 <400〉 22
Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn Thr Val Asn 1 5 10 <210> 23 〈211〉 14 <212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 23
Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly Tyr Val Val His 1 5 10 <210〉 24 〈211〉 7 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 24
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 〈210〉 25 <211〉 7 <212> PRT <213〉智人 152407-序列表.doc 201130504 <400> 25
Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser 1 <210〉 26 <211> 7 〈212〉 PRT <213〉 智人 <400> 26
Ser Asn Asn Gin Arg Pro Ser 1 <210〉 27 〈211〉 7 <212> PRT <213〉 智人 〈400〉 27
Arg Asn Tyr Gin Arg Pro Ser 1 〈210〉 28 <211〉 7 <212〉 PRT <213〉 智人 <400〉 28
Arg Asn Asn Gin Arg Pro Ser 1 5 <210〉 29 <211〉 11 〈212〉 PRT <213〉智人 152407·序列表.doc 201130504 <400> 29
Cys Gin Ser Tyr Asp Thr Gly Leu Ser Gly Trp 1 5 10 <210〉 30 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 30
Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser 1 5 10 <210〉 31 <211〉 12 <212> PRT <213〉智人 <400> 31
Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Trp 1 5 10 <210〉 32 〈211〉 11 <212> PRT <213〉智人 <400〉 32
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp 1 5 10 <210〉 33 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉智人 -9- 152407-序列表.doc 201130504 <400> 33
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp 1 5 10 <210〉 34 <211〉 119 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 34
Gin Val Glu Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Gin Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ser Pro Leu Glu Ser Pro Val Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Met Val lie Val Ser Ser 115 10· 152407-序列表.doc 201130504 <210> 35 <211〉 119 <212〉 PRT 〈213>智人 <400〉 35
Gin Val Glu Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asn Tyr 20 25 30
Gly Leu Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val He Ser Phe Asn Gly Asp Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ser Pro Leu Glu Ser Pro Val Ala Phe Asp He Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 36 <211〉 115 <212〉 PRT 11· 152407·序列表.doc 201130504 〈213> 智人 <400> 36
Gin Val Glu Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser 115 <210〉 37 〈211〉 119 <212> PRT 〈213〉智人 〈400〉 37
Gin Val Glu Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly •12· 152407·序列表.doc 201130504 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp His 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Leu lie Ser Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Thr Ser Leu Arg Ala Thr Ala Phe Asp Thr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 38 <211〉 123 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 38
Gin Val Glu Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 •13- 152407-序列表.doc 201130504
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser Val Ser Asp Thr Gly Thr Asp Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Thr Pro Leu Ala Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 39 <211〉 118 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 39
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 14· 152407·序列表.doc 201130504
Ser Asp lie Ser Ser Ala Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Leu Asp Ala Arg Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 40 <211〉 112 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 40
Asp He Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 15 10 15
Arg Val Thr He Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn He Gly Ser Asn 20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45
He Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 15- 152407-序列表.doc 201130504
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Thr Gly Leu 85 90 95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin 100 105 110 <210> 41 <211〉 112 <212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 41
Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 15 10 15
Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn lie Gly Gly Asn 20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45
He Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala He Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95
Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin -16· 152407-序列表.doc 201130504 100 105 110 <210〉 42 <211> 113 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 42
Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 15 10 15
Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn 20 25 30
Asp Val Tyr Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95
Ser Gly Ser Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110
Gin <210〉 43 <211〉 112 17- 152407-序列表.doc 201130504 <212> PRT <213〉智人 <400> 43
Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 15 10 15
Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn 20 25 30
Ala Val Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Ser Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala He Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin 100 105 110 <210〉 44 <211> 112 <212> PRT 〈213> 智人 <400> 44
Asp He Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 1 5 10 15 • 18- 152407-序列表.doc 201130504
Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn 20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45
He Tyr Arg Asn Tyr Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95
Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin 100 105 110 <210〉 45 <211> 113 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 45
Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 15 10 15
Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly 20 25 30
Tyr Val Val His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Leu lie Tyr Arg Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe -19· 152407·序列表.doc 201130504 50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala He Ser Gly Leu 65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser 85 90 95
Leu Asn Gly Trp Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110
Gin •<210〉 46 <211〉 357 <212〉 DNA <213〉智人 〈400〉 46 caggtggaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct ccagggaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attcccagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc gagtcccctt gaaiagtcccg tcgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcatcgt gagctca <210〉 47 <211〉 357 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 47 • 20· 152407·序列表.doc 201130504 caggtggaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcgct aactacggcc tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcattta atggagacaa aaaatattac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc gagtcccctt 300 gaaagtcccg tcgcttttga tatctggggc caaggtaccc tggtcaccgt gagctca 357 <210> 48 <211〉 345 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 48 caggtggaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtatcgggt gttagttgga atggcagtag gacgcactat 180 gcagactctg tgaagggccg actcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc gagaggaggg 300 gactttgact actggggcca aggtaccctg gtcaccgtga gctca 345 <210〉 49 <211〉 357 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 49 caggtggaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgag gatcatggca tgagctgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctctctt attagttggg atgatggaag taataaatac 180 •21- 152407·序列表.doc 201130504 tacgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 240 tatctgcEiaa tgaacagcct gagagccgag gacactgccg tgtattactg tgcgacttcc 300 ctacgggcca cggcttttga tacgtggggc caaggtacac tggtcaccgt gagctca 357 〈210〉 50 <211〉 369 〈212〉 DNA <213〉智人 <400〉 50 caggtggaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaagt gttagcgata ctggtactga tactcattac 180 gcagactccg tgaagggccg cttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc aaaaacccct 300 ctcgcatata gcagtggctg gtactacttt gactactggg gccaaggtac cctggtcacc 360 gtgagctca 369 〈210〉 51 <211〉 354 <212> DNA <213〉智人 <400〉 51 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctactgga tgcactgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcagac attagcagtg ctagtagtta caceiaactac 180 gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac actgccgtgt attactgtgc gaggggtttg 300 -22- 152407-序列表.doc 201130504 gatgcgcgac ggatggacta ctggggccaa ggtaccctgg tcaccgtgag ctca 354 <210〉 52 〈211〉 336 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 52 gatatcgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ctgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcaactc caacatcgga agtaatcctg taaactggta tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gacaataata agcgaccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgccag tcctatgaca ccggcctgag tggttgggtg 300 ttcggcggag gaaccaagtt aaccgtccta ggtcag 336 <210〉 53 〈211〉 336 〈212〉 DNA <213〉智人 <400〉 53 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttccg gaagctactc caacatcggg ggtaatcctg taaactggta tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat ggtaacagca atcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgccag tcctatgaca gcagcctgag tggttcggta 300 ttcggcggag gaaccaagct gacggtccta ggtcag 336
<210〉 54 <211〉 339 <212〉 DNA •23- 152407-序列表.doc 201130504 <213〉智人 <400> 54 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caatatcgga agtaatgatg tatattggta tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gacaataata agcgaccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgccag tcctatgaca gcagcctgag tggttcttgg 300 gtgttcggcg gaggaaccaa gctgacggtc ctaggtcag 339 <210〉 55 <211〉 336 <212> DNA <213〉智人 <400〉 55 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcctgttctg gaagcagctc caacatcgga aataatgctg taaactggta tcagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgag tggttgggtg 300 ttcggcggag gaaccaagtt aaccgtccta ggtcag 336 <210> 56 <211〉 336 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 56 gatatcgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaatactg taaactggta tcagcagctc 120 • 24· 152407-序列表.doc 201130504 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agaaattatc agcgaccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgccag tcctatgaca gcagcctgag tggttcggtg 300 ttcggcggag gaaccaagtt aaccgtccta ggtcag 336 <210> 57 〈211〉 339 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 57 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacattggg gcgggttatg ttgtacattg gtatcagcag 120 ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc tataggaata atcagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 240 cggtccgagg atgaggctga ttattactgt gcagcatggg atgacagcct gaatggttgg 300 ctgttcggcg gaggaaccaa gttaaccgtc ctaggtcag 339 <210> 58 <211〉 124 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 58
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly 20 25 30 •25· 152407-序列表.doc 201130504
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg His Arg Gly Asn Tyr Tyr Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 59 <211> 124 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉成熟PRLR抗體 <400〉 59
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 26- 152407-序列表.doc 201130504
Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg His Arg Gly Asn Tyr Tyr Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 60 <211〉 114 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉成熟PRLR抗體 <400〉 60
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Phe 20 25 30
Gly Met Gin Trp Val Arg Gin Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 -27· 152407-序列表.doc 201130504
Ala Tyr lie Ser Ser Gly Ser Ser Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80
Leu Gin Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Arg Ser Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110
Ser Ser <210〉 61 <211〉 113 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 61
Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45
Lys Leu Leu lie Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser •28· 152407·序列表.doc 201130504 65 70 75 80
Pro Val Gin Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Gly 85 90 95
Glu Leu Pro Pro Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 110
Ala <210〉 62 <211〉 113 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉成熟PRLR抗體 <400〉 62
Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Gin Gly Ala Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45
Lys Leu Leu He Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His 65 70 75 80 29· 152407-序列表.d〇c 201130504
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Gly 85 90 95
Glu Leu Pro Pro Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 110
Ala <210> 63 <211〉 108 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 63
Ser lie Val Met Thr Gin Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Gly Val Ser Asn Asp 20 25 30
Val Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Leu Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Asn Thr Val Gin Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gin Gin Asp Tyr Thr Ser Pro Thr 85 90 95 30- 152407·序列表.doc 201130504
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Ala 100 105 <210〉 64 <211〉 372 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 64 gaggtgcagc tcgtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg agctgcgccg tgagcggctt caccttcagc agctacggca tgagctgggt gcgccaggct cctggcaagg gactggaatg ggtggccacc gtgtccagcg gcggcaccta cacctactac cccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagacaccgg ggcaactact acgccaccta ctactatgcc atggactact ggggccaggg caccctggtg accgtgagct ca <210> 65 <211〉 372 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉成熟PRLR抗體 <400〉 65 gaggtgcagc tcgtggagtc tggcggcgac ctggtgaagc ctggcggcag cctgaagctg tcctgcgccg tgagcggctt caccttcagc agctacggca tgagctgggt gcgccagacc cccgacaaga gactggaatg ggtggcaacc gtgtctagcg gcggcaccta cacctactac cccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acgccaagaa caccctgtac ctgcagatgt ccagcctgaa gtccgaggac agcgccatgt actattgcgc cagacatcgg 152407·序列表.doc •31 - 60 120 180 240 300 360 372 60 120 180 240 300 201130504 ggceiactact acgccaccta ctactatgcc atggactact ggggccaggg caccagcgtg 360 accgtgagct ca 372 〈210〉 66 <211> 342 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉成熟PRLR抗體 <400> 66 gacgtgcagc tcgtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag ccggaaactg 60 tcctgcgctg ccagcggctt cgccttcagc agcttcggca tgcagtgggt gcgccaggcc 120 cccgagaagg gcctggaatg ggtggcctac atcagcagcg gcagcagcac catctactac 180 gccgacaccg tgaagggccg gttcaccatc agcagagaca accccaagaa taccctgttc 240 ctgcagatga ccagcctgcg gagcgaggac accgccatgt actactgcgt gcggagcggc 300 agagactact ggggccaggg caccagcgtg accgtgagct ca 342 <210〉 67 <211〉 339 <212〉 DNA 〈213〉智人 <400〉 67 gatatcgtgc tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgggccacc 60 atcaactgca aggccagcaa gtccgtgagc accagcggct acacctacat gcactggtat 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacc tggccagcaa ccgggagagc 180 ggcgtgcccg accggtttag cggcagcggc tccggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240 cccgtgcagg ccgaggacgt ggccacctac tactgccagc acagcggcga gctgcccccc 300 agcttcggcc agggcaccaa gctggaaatc aagcgggcc 339 -32· 152407·序列表 _doc 201130504 <210〉 68 <211> 339 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 〈223>成熟PRLR抗體 <400〉 68 gatatcgtgc tgacccagag ccccgccagc ctggctgtgt ctctgggcca gggcgccacc 60 atcagctgcc gggccagcaa gtccgtgagc accagcggct acacctacat gcactggtat 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacc tggccagcaa cctggaaagc 180 ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc tccggcaccg acttcaccct gaacatccac 240 cccgtggagg aagaggacgc cgccacctac tactgccagc acagcggcga gctgccccct 300 agctttggcg gcggaacaaa gctggaaatc aagcgggcc 339 <210〉 69 <211〉 324 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉成熟PRLR抗體 <400〉 69 agcatcgtga tgacccagac ccccaagttc ctgctggtgt ctgccggcga cagagtgacc 60 atcacctgca aggccagcca gggcgtgagc aacgacgtgg cctggttcca gcagaagccc 120 ggccagagcc ccaagctgct gatctacagc gccagcaccc ggtacaccgg cgtgcccgac 180 agactgaccg gctccggcta cggcaccgat ttcaccttca ccatcaacac cgtgcaggcc 240 gaggacctgg ccgtgtactt ctgccagcag gactacacca gccccacctt tggcggcgga 300 acaaagctgg aaatcaagcg ggcc 324 •33· 152407·序列表.doc 201130504 <210> 70 〈211> 222 <212> PRT <213〉智人 <400> 70
Gin Leu Pro Pro Gly Lys Pro Glu lie Phe Lys Cys Arg Ser Pro Asn 15 10 15
Lys Glu Thr Phe Thr Cys Trp Trp Arg Pro Gly Thr Asp Gly Gly Leu 20 25 30
Pro Thr Asn Tyr Ser Leu Thr Tyr His Arg Glu Gly Glu Thr Leu Met 35 40 45
His Glu Cys Pro Asp Tyr He Thr Gly Gly Pro Asn Ser Cys His Phe 50 55 60
Gly Lys Gin Tyr Thr Ser Met Trp Arg Thr Tyr He Met Met Val Asn 65 70 75 80
Ala Thr Asn Gin Met Gly Ser Ser Phe Ser Asp Glu Leu Tyr Val Asp 85 90 95
Val Thr Tyr lie Val Gin Pro Asp Pro Pro Leu Glu Leu Ala Val Glu 100 105 110
Val Lys Gin Pro Glu Asp Arg Lys Pro Tyr Leu Trp lie Lys Trp Ser 115 120 125
Pro Pro Thr Leu He Asp Leu Lys Thr Gly Trp Phe Thr Leu Leu Tyr 130 135 140 •34- 152407·序列表doc 201130504
Glu lie Arg Leu Lys Pro Glu Lys Ala Ala Glu Trp Glu lie His Phe 145 150 155 160
Ala Gly Gin Gin Thr Glu Phe Lys lie Leu Ser Leu His Pro Gly Gin 165 170 175
Lys Tyr Leu Val Gin Val Arg Cys Lys Pro Asp His Gly Tyr Trp Ser 180 185 190
Ala Trp Ser Pro Ala Thr Phe lie Gin lie Pro Ser Asp Phe Thr Met 195 200 205
Asn Asp lie Glu Gly Arg Met Asp His His His His His His 210 215 220 <210〉 71 〈211〉 666 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 71 cagttacctc ctggaaaacc tgagatcttt aaatgtcgtt ctcccaataa ggaaacattc 60 acctgctggt ggaggcctgg gacagatgga ggacttccta ccaattattc actgacttac 120 cacagggaag gagagacact catgcatgaa tgtccagact acataaccgg tggccccaac 180 tcctgccact ttggcaagca gtacacctcc atgtggagga catacatcat gatggtcaat 240 gccactaacc agatgggaag cagtttctcg gatgaacttt atgtggacgt gacttacata 300 gttcagccag accctccttt ggagctggct gtggaagtaa aacagccaga agacagaaaa 360 ccctacctgt ggattaaatg gtctccacct accctgattg acttaaaaac tggttggttc 420 acgctcctgt atgaaattcg attaaaaccc gagaaagcag ctgagtggga gatccatttt 480 gctgggcagc aaacagagtt taagattctc agcctacatc caggacagaa ataccttgtc 540 -35- 152407-序列表.doc 600 201130504 caggttcgct gcaaaccaga ccatggatac tggagtgcat ggagtccagc gaccttcatt cagataccta gtgacttcac catgaatgat atcgagggcc gcatggacca ccaccaccac caccac 660 666 <210> 72 <211〉 222 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400〉 72
Gin Ser Pro Pro Gly Lys Pro Glu He His Lys Cys Arg Ser Pro Asp 15 10 15
Lys Glu Thr Phe Thr Cys Trp Trp Asn Pro Gly Ser Asp Gly Gly Leu 20 25 30
Pro Thr Asn Tyr Ser Leu Thr Tyr Ser Lys Glu Gly Glu Lys Asn Thr 35 40 45
Tyr Glu Cys Pro Asp Tyr Lys Thr Ser Gly Pro Asn Ser Cys Phe Phe 50 55 60
Ser Lys Gin Tyr Thr Ser lie Trp Lys lie Tyr lie lie Thr Val Asn 65 70 75 80
Ala Thr Asn Glu Met Gly Ser Ser Thr Ser Asp Pro Leu Tyr Val Asp 85 90 95
Val Thr Tyr lie Val Glu Pro Glu Pro Pro Arg Asn Leu Thr Leu Glu 100 105 110
Val Lys Gin Leu Lys Asp Lys Lys Thr Tyr Leu Trp Val Lys Trp Leu 36- 152407·序列表.doc 201130504 115 120 125
Pro Pro Thr He Thr Asp Val Lys Thr Gly Trp Phe Thr Met Glu Tyr 130 135 140
Glu He Arg Leu Lys Ser Glu Glu Ala Asp Glu Trp Glu He His Phe 145 150 155 160
Thr Gly His Gin Thr Gin Phe Lys Val Phe Asp Leu Tyr Pro Gly Gin 165 170 175
Lys Tyr Leu Val Gin Thr Arg Cys Lys Pro Asp His Gly Tyr Trp Ser 180 185 190
Arg Trp Gly Gin Glu Lys Ser He Glu He Pro Asn Asp Phe Thr Leu 195 200 205
Lys Asp He Glu Gly Arg Met Asp His His His His His His 210 215 220 <210〉 73 <211〉 666 <212〉 DNA <213〉小家鼠 〈400〉 73 cagtcaccac ctggaaaacc tgaaatccac aaatgtcgtt cccctgacaa ggaaacattc acctgctggt ggaatcctgg gtcagatgga ggactcccca ccaattattc attgacatac agcaaagaag gagagaaaaa cacctatgaa tgtccagact acaaaaccag tggccccaat tcctgtttct ttagcaagca gtacacttcc atatggaaaa tatacatcat cacagtaaat gccacgaacg aaatgggaag cagtacctcg gatccacttt atgtggatgt gacttacatt gttgaaccag agcctcctcg gaacctgact ttagaagtga aacaactaaa agacaaaaaa -37- 60 120 180 240 300 152407·序列表.doc 360 201130504 acatatctgt gggtaaaatg gttgccacct accataactg atgtaaaaac tggttggttt 420 acaatggaat atgaaattcg attaaagtct gaagaagcag atgagtggga gatccacttc 480 acaggtcatc aaacacaatt taaggttttt gacttatatc caggacaaaa gtatcttgtc 540 cagactcgct gcaagccaga ccatggatac tggagtagat ggggccagga gaaatctatt 600 gaaataccaa atgacttcac cttgaaagac atcgagggcc gcatggacca ccaccaccac 660 caccac 666 38· 152407-序列表 *doc

Claims (1)

  1. 201130504 七、申請專利範圍： 1.種抗體或抗原結合片段，其中該抗體枯抗催乳激素受 體介導之信號傳導。 2‘如請求項i之抗體，其結合於該催乳激素受體之細胞外 域及其人類多型變異體之抗原決定基，其中該催乳激素 又體之細胞外域之胺基酸序列對應於ID NO: ，且 其核酸序列對應於SEQ ID NO: 71。 3. 如明求項2之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或該抗 原結合片段與抗體002-H06競爭。 4. 如請求項3之抗體或抗原結合片段， a·其中可變重鏈及輕鏈區之胺基酸序列在可變重鏈域中 與SEQ ID NO. 35之一致性及在可變輕鏈域中與seq ID NO: 41之一致性為至少60% ,更佳為7〇%，更佳為 80%、或90%，或甚至更佳為95%，或 b.其中CDR之胺基酸序列在重鏈域中與SEQ ID N〇: 2、8 及13之一致性及在可變輕鏈域中與沾卩iD N〇 19、 25及30之一致性為至少60%，更佳為70%，更佳為 80%，更佳為90%，或甚至更佳為95%。 5 · —種抗體或抗原結合片段，其包含如請求項1至4中任一 項之抗體的CDR，其中其可變重鏈含有對應於SEQ ID NO: 2、8及13之CDR序列’且其可變輕鏈含有對應於 SEQ ID NO: 19、25及 30之 CDR序列。 6_如請求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該 抗體002-H06包含對應於如SEQ ID NO: 47之核酸序列及 152407.doc 201130504 如SEQ ID NO: 35之胺基酸序列的可變重鏈區，及具有如 SEQ ID NO: 53之核酸序列及*SEq ID no: 41之胺基酸 序列的可變輕鏈區。 7·如請求項3之抗體或抗原結合片段，其中該抗體含有i、 2、3、4、5或 6個對應於 SEQ ID NO·· 2、8、13、19、25 及30之CDR。 8. 如晴求項丨至4中任一項之抗體，其中該抗體由特異性結 合於胺基酸序列如SEQ ID NO: 70及SEQ ID NO: 70之人 類多型變異體胺基酸位置丨至之⑺所示的pRLR之一或多個 區或對該一或多個區具有高親和力的抗原結合區組成， 其中該親和力為至少1 〇〇 nM，較佳為小於約1 〇〇 nM，更 佳為小於約30 nM，甚至更佳為親和力小於約1〇 nM，或 甚至更佳為親和力小於1 nM。 9. 如請求項i至4中任一項之抗體’其中其重鏈恆定區為經 修飾或未經修飾之Ig(3i、igG2、IgG3或IgG4。 1 0. —種分離之核酸序列，其編碼如請求項1至9中任一項之 抗體或抗原結合片段。 11.如請求項1〇之分離之核酸序列，其中該核酸序列如表$ 所示》 12· —種表現載體，其包含如請求項⑺或丨丨之核酸序列。 13. —種宿主細胞’其包含如請求項12之載體或如請求項 或11之核酸分子，其中該宿主細胞可為較高等真核宿主 細胞’諸如哺乳動物細胞；較低等真核宿主細胞，諸如 酵母細胞，且可為原核細胞’諸如細菌細胞。 152407.doc 201130504 14. 一種使用如請求項13之宿主細胞來產生抗體或抗原結合 片段的方法，該方法包含在適合之條件下培養如請求項 13之宿主細胞及回收該抗體。 15. —種抗體或抗原結合片段，其係藉由如請求項14之方法 來產生。 16. 如請求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段，其被純 化至至少95重量。/。均質性。 17. 如請求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段，其係作 為藥劑。 18. —種醫藥組合物，其包含如請求項丨至9中任一項之抗體 或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑，該載劑包含 賦形劑及助劑。 19· 一種套組，其包含如請求項中任—項之抗體包裴於 一容器中，該抗體包含治療有效量之抗體〇〇2七〇6或其 成熟變異體，該套組視情況含有第二治療劑，且進一步 包含黏貼於該容器上或與該容器包襞在—起之標鐵，兮 標籤描述該容器之内含物且提供關於該容器之内含物於 . 以下用途的指示及/或說明：治療子宮内膜異位症、子宮 腺肌症、良性乳房疾病及乳腺痛、泌乳抑制、高催乳激 - 素血症性及正常催乳激素血症性毛髮減少、_ a 尺丨王刖列腺 增生、類纖維瘤，或用於雌性非激素性避孕， 〆 十 攻·治療接 文組合激素療法（亦即雌激素加助孕素療法）以抑制乳腺 上皮細胞增殖之女性。 - 2〇· —種PRLR中和抗體或抗原結合片段，其係 你用於治療及/ 152407.doc 201130504 或預防子宮内膜異位症及子宮腺肌症（子宮内子宮内膜異 位）〇 21·如請求項…中任一項之抗體或抗原結合片段，其係用 於治療及/或預防子宮内膜異位症及子宮腺肌症（子宮内 子宮内膜異位）。 22.^PRLRt和抗體或抗原結合片段，其制於雕性避 士"月长項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段其係用 於雌性避孕。 、’' 24. ，PRLR中和抗體或抗原結合片段，其係用於治療良性 乳房疾病及乳腺痛。 25. 如請求項1至4中任-項之抗體或抗原結合片段，其係用 於治療良性乳房疾病及乳腺痛。 種PRLR中和抗體或抗原結合片段，其係用於抑制泌 乳。 27. 如凊求項】至4辛任一項之抗體或抗原結合片段其係用 於抑制泌乳。 、、 28. -種PRLR中和抗體或抗原結合片段，其係用於治療良性 前列腺增生。 29. 如凊求項！至4中任—項之抗體或抗原結合片段，其係用 於治療良性前列腺增生。 3〇\一種PRLR中和抗體或抗原結合片段，其係用於治療高催 乳激素血症性及正常催乳激素血症性毛髮減少。 31.如凊求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段其係用 152407.doc 201130504 於治療高催乳激素血症性及正常催乳激素血症性毛髮減 少 〇 32_ —種PRLR中和抗體或抗原結合片段，其係用於治療接受 組合激素療法之女性。 33. 如請求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段，其係用 於治療接受組合激素療法之女性。 34. —種如請求項32或33之抗體或抗原結合片段的用途，其 係用於製造用以治療接受組合激素療法之女性的藥劑， 其中該組合激素療法為雌激素加助孕素療法。 3 5. —種如請求項1至9中任一項之抗體或如請求項18之包含 如請求項1至9中任一項之PRlr抗體或抗原結合片段的醫 藥組合物的用途，其係用於製造適於非經腸投與之藥 劑’其中非經腸傳遞之方法包括局部、動脈内、肌肉 内、皮下、髓内、鞘内、心室内、靜脈内、腹膜内、子 宮内、陰道或鼻内投與。 36. 如請求項18之醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一 項之PRLR抗體或抗原結合片段與至少一種其他藥劑組 合0 37. —種如請求項i至9中任一項之抗體或抗原結合片段的用 途’其係用於製造用於以下用途之藥劑：治療子宮内膜 異位症、子宮腺肌症、良性乳房疾病及乳腺痛、泌乳抑 制、高催乳激素企症性及正常催乳激素血症性毛髮減 ^ 良性刚列腺增生、類纖維瘤’或用於雖性非激素性 避孕’或治療接受組合激素療法（亦即雌激素加助孕素療 法）以抑制乳腺上皮細胞增殖之女性。 152407.doc
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