BR112012015852B1

BR112012015852B1 - anticorpo do receptor da prolactina, sequência de ácido nucleico isolada, vetor de expressão,microrganismo transgênico, método de produzir,composição farmacêutica e kit

Info

Publication number: BR112012015852B1
Application number: BR112012015852-0A
Authority: BR
Inventors: Christiane Otto; Siegmund Wolf; Christoph Freiberg; Axel Harrenga; Simone Greven; Mark Trautwein; Sandra Bruder; Andrea Eicker; Andreas Wilmen
Original assignee: Bayer Intellectual Property Gmbh
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2020-12-29
Also published as: JP6199930B2; SI2510002T1; MX2012006621A; TW201130507A; SG181511A1; TW201138817A; MA33888B1; SG181513A1; AR079350A1; AR079349A1; US20130022606A1; US9649374B2; WO2011069795A4; TN2012000294A1; AU2010330161A1; PE20121561A1; WO2011069794A1; ZA201204213B; EP2510002A1; HUE031631T2

Abstract

ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DO RECEPTOR DA PROLACTINA E SEU USO TERAPÊUTICO. A presente invenção refere-se ao anticorpo neutralizante do receptor da prolactina 006-H08, como também formas amadurecidas dos mesmos, e fragmentos de ligação de antígeno, composições farmacêuticas contendo os mesmos e seu uso no tratamento ou prevenção de distúrbios benignos e indicações mediadas pelo receptor da prolactina tais como endometriose, adenomiose, contracepção feminina não-hormonal, doença de mama benigna e mastalgia, inibição de lactação, hiperplasia de próstata benigna, fibroides, perda de cabelo hiper e normoprolactinêmica, e cotratamento em terapia hormonal combinada para inibir a proliferação de células epiteliais mamarias. Os anticorpos da invenção bloqueiam a sinalização mediada pelo receptor da prolactina.

Description

[001] A presente invenção é direcionada ao anticorpo do receptor da prolactina 006-H08 e fornece regiões recombinantes de ligação de antígeno e anticorpos e fragmentos funcionais contendo tais regiões de ligação de antígeno que especificamente ligam e neutralizam o receptor da prolactina, sequências de ácido nucleico que codificam os anticorpos anteriores, vetores contendo os mesmos, composições farmacêuticas contendo os mesmos e seu uso no tratamento ou prevenção de doenças benignas e indicações que se beneficiam da inibição da sinalização mediada por receptor da prolactina tais como endometriose, adenomiose, contracepção feminina não-hormonal, doença de mama benigna, mastalgia, inibição de lactação, hiperplasia de próstata benigna, fibroides como também queda de cabelo hiper e normoprolactinêmica, e cotratamento em terapia hormonal combinada para inibir proliferação de células epiteliais mamárias.

[002] Há uma necessidade médica não satisfeita pelo tratamento de várias doenças benignas e indicações tais como endometriose, adenomiose, contracepção feminina não-hormonal, doença de mama benigna, mastalgia, inibição de lactação, hiperplasia de próstata benigna, fibroides, queda de cabelo hiper e normoprolactinêmica, e prevenção de proliferação de células epiteliais mamárias em terapia hormonal combinada (isto é, estrogênio mais progestina).

[003] Prolactina (PRL) é um hormônio polipeptídico composto de 199 aminoácidos. PRL pertence à família dos hormônios polipeptídicos - hormônio de crescimento (GH), lactogênio placentário (PL) - e é sintetizada nas células lactotróficas da pituitária e em vários tecidos extrapituitários tais como linfócitos, células epiteliais mamárias, o miométrio, e a próstata. Dois promotores diferentes regulam a síntese de PRL pituitária e extrapituitária (BioEssays 28:1051-1055, 2006).

[004] PRL liga ao receptor de PRL (PRLR), um receptor de transmembrana simples que pertence à superfamília do receptor da citocina da classe 1 (Endocrine Reviews 19:225-268, 1998). O PRLR existe em três isoformas diferentes, a forma curta, a longa, e a intermediária, que podem ser distinguidas pelo comprimento de suas caudas citoplásmicas. Sob ligação do ligante, um processo sequencial leva à ativação do PRLR. PRL interage por meio de seu sítio de ligação 1 com uma molécula do PRLR e depois atrai por meio de seu sítio de ligação 2 uma segunda molécula de receptor levando a um dímero ativo dos PRLRs. Dimerização de PRLR leva à ativação predominante da via de JAK/STAT (Janus Kinase/Signal Transducers e Activators of Transcription) via. Sob dimerização do receptor, JAKs (predominantemente JAK2) associados com o receptor, transfosforilam e ativam um com o outro. Além disso, o PRLR é também fosforilado e pode ligar ao domínio de SH2 contendo proteínas tais como STATs. STATs ligadas ao receptor são subsequentemente fosforiladas, dissociam-se do receptor e deslocam-se para o núcleo onde elas estimulam a transcrição dos genes alvos. Além disso, a ativação da via de Ras-Raf-MAPK e ativação da src cinase citoplásmica por PRLRs foram descritas (para revisão Endocrine Reviews 19:225-268, 1998).

[005] Sinalização mediada por PRLR representa um papel em uma variedade de processos tais como desenvolvimento da glândula mamária, lactação, reprodução, crescimento de tumor mamário e prostático, doenças autoimunes, crescimento e metabolismo gerais, e imunomodulação (Endocrine Reviews 19:225-268, 1998; Annu. Rev. Physiol. 64:47-67, 2002).

[006] Correntemente, a interferência completa com sinalização mediada por PRLR não é possível. O único modo para interferir com a sinalização mediada por PRLR é a inibição da secreção de PRL pituitária mediante o uso de bromocriptina e outros agonistas do receptor de dopamina 2 (Nature Clinical Practice Endocrinology e Metabolism 2(10): 571-581, 2006). Estes agentes, porém, não suprem a síntese de PRL extrapituitária que pode compensar de forma bem sucedida a inibição da síntese de PRL pituitária levando à sinalização mediada por PRLR quase incólume (Endocrine Reviews 19:225- 268,1998). Portanto, não é surpreendente que os agonistas do receptor de dopamina do tipo 2 não foram benéficos em pacientes que sofrem de câncer de mama ou doenças autoimunes, tais como lúpus sistêmico ou artrite reumatóide (Breast Cancer Res. 14:289-29, 1989; Lupus 7:414-419, 1998) embora prolactina tenha estado implicada nestas doenças. Síntese de prolactina local em células ou linfócitos de câncer de mama, que representa um papel pivotante em carcinoma mamário ou doenças autoimunes, respectivamente, não foi bloqueada pelos agonistas do receptor de dopamina.

[007] Apesar das tentativas supracitadas para prover meios para o tratamento ou prevenção de doenças benignas e indicações tais como endometriose, adenomiose, contracepção feminina não-hormonal, doença de mama benigna e mastalgia, inibição de lactação, hiperplasia de próstata benigna, fibroides, queda de cabelo hiper e normoprolactinêmica, e cotratamento em terapia hormonal combinada para a prevenção de proliferação de células epiteliais mamárias nenhum composto está ainda disponível para satisfazer aquela necessidade. É, portanto, um objetivo da presente invenção, solucionar aquele problema fornecendo compostos que sejam terapêuticos para estas doenças benignas e indicações.

[008] Agora, novos anticorpos foram identificados que são específicos e têm uma afinidade alta para PRLR e, deste modo, neutralizam a sinalização mediada por PRLR e que podem liberar um benefício terapêutico ao sujeito.

[009] Bloqueio da ativação de PRLR mediante neutralização dos anticorpos de PRLR leva a uma inibição completa da sinalização mediada por PRLR. Em contraste, os agonistas do receptor da dopamina podem apenas interferir com a sinalização mediada por PRLR intensificada em resposta à secreção elevada da prolactina pituitária, mas não com a sinalização mediada por PRLR intensificada devido a uma mutação de PRLR ativadora ou devido à produção localmente elevada da prolactina.

[0010] Portanto, o problema é solucionado pela provisão do anticorpo 006-H08, e fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, ou suas variantes para o tratamento das doenças benignas e indicações acima mencionadas, que ligam ao PRLR com afinidade alta, eficientemente neutralizam a sinalização mediada por PRLR, e que são preferivelmente reativos cruzados com PRLR de outras espécies tais como Macacca mulatta e Macacca fascicularis, Mus musculus ou Rattus norvegicus.

[0011] Alguns anticorpos de PRLR já foram descritos no pedido de patente WO2008/022295 (Novartis) e na patente US 7.422.899 (Biogen). A presente invenção baseia-se na descoberta de novos anticorpos que são específicos e têm uma afinidade alta para PRLR e deste modo neutralizam a sinalização mediada por PRLR e que podem liberar um benefício terapêutico ao sujeito (sequências de anticorpos novos são como na SEQ ID NO: 34, 40, 46, e 52). Os anticorpos da invenção, que podem ser humanos ou humanizados ou quiméricos ou humanos engenheirados, podem ser usados em muitos contextos que são descritos mais completamente aqui.

[0012] Portanto um objetivo da presente invenção é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, por meio do qual o dito anticorpo antagoniza a sinalização mediada por receptor da prolactina.

[0013] Os novos anticorpos "002-H06", "002-H08", "006-H07", "001- E06", "005-C04" são objeto dos pedidos de patente correspondentes.

[0014] A caracterização in vivo destes anticorpos em modelos murinos de doença é apenas possível com um anticorpo exibindo reatividade para o receptor de prolactina murino. Apenas o anticorpo 005-C04, que é revelado em um pedido de patente correspondente mostra reatividade cruzada suficiente para o receptor de prolactina murino e é, portanto, o único anticorpo que pode ser usado em modelos in vivo murinos. Os resultados obtidos com este anticorpo provam, portanto, como um substituto para eficácia geral para todos os outros anticorpos neutralizantes do receptor da prolactina que são revelados nos pedidos de patente correspondentes nos modelos de doença analisados.

[0015] Os anticorpos foram caracterizados em vários sistemas celulares para determinar sua especificidade para as espécies e sua potência como também eficácia nos paradigmas de leitura diferentes que tratam da inativação da sinalização mediada por PRLR (vide Exemplos 5 - 10). Ensaios de proliferação foram executados com células Nb2-11 de rato (Exemplo 6, Figura 6) ou células Ba/F ou estavelmente transfeccionadas com o PRLR humano (Exemplo 5, Figura 5) ou o PRLR murino (Exemplo 10, Figura 10). Enquanto que o anticorpo de Novartis XHA 06.983 não mostrou atividade no PRLR de rato e murino, o anticorpo de Novartis XHA06.642 mostrou atividade no PRLR de rato mas não no PRLR murino. XHA 06.642 inibiu a sinalização mediada por PRLR humano (Exemplo 5, 7, 8). O novo anticorpo da presente invenção 006-H08 mostrou a potência mais alta com respeito à inibição de proliferação das células Ba/F estavelmente transfeccionadas com o PRLR humano (Exemplo 5, Figura 5). O novo anticorpo 005-C04 de um pedido de patente correspondente foi o único anticorpo que mostrou reatividade cruzada no PRLR murino (Exemplo 10, 9) e humano (Exemplos 5, 7, 8). Em contraste com o anticorpo de Novartis XHA06.642, o novo anticorpo 005-C04 é, portanto, adequado para testar a inibição de sinalização mediada por PRLR em modelos murinos. Todos os outros anticorpos descritos neste pedido de patente ou nos pedidos de patente correspondentes são específicos para o PRLR humano. Além dos ensaios de proliferação celular (Exemplos 5, 6, 10), ensaios de repórter de luciferase foram executados usando células HEK293 estavelmente transfeccionadas com ou o PRLR humano (Exemplo 8) ou murino (Exemplo 9) e transientemente transfeccionadas com um gene repórter de luciferase sob o controle de LHRE’s (elementos lactogênicos de resposta hormonal). Usando estes sistemas a inabilidade do anticorpo de Novartis XHA06.642 para eficientemente bloquear sinalização mediada por PRLR murina ficou evidente novamente (Exemplo 9). Em contraste, o novo anticorpo 005- C04 (pedido de patente correspondente) bloqueou a ativação do gene repórter de luciferase pelo PRLR murino (Exemplo 9). Fosforilação de STAT5 em células T47D humanas foi usada como leitura adicional para analisar a atividade inibidora dos anticorpos no PRLR humano (Exemplo 7, Figura 7). Como esperado, os anticorpos não específicos foram inativos em todos os paradigmas experimentais analisados.

[0016] A presente invenção diz respeito a métodos para inibir crescimento de células PRLR-positivas e a progressão das doenças benignas e indicações acima mencionadas fornecendo anticorpos de anti-PRLR. Fornecidos são anticorpos monoclonais humanos, fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, e variantes dos anticorpos e fragmentos que especificamente ligam ao domínio extracelular (ECD) de PRLR (SEQ ID NO: 70) ou variantes polimórficas humanas da SEQ ID NO: 70 tais como as variantes de I146L e I76V sendo descritas em PNAS 105 (38), 14533, 2008, e J. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (1), 271, 2010.

[0017] Outro objetivo da presente invenção é um anticorpo que liga a epítopos do domínio extracelular do receptor da prolactina e variantes polimórficas humanas dos mesmos, por meio do qual a sequência de aminoácido do domínio extracelular do receptor da prolactina corresponde à SEQ ID NO: 70, e a sequência de ácido nucleico corresponde à SEQ ID NO: 71.

[0018] Os anticorpos, fragmentos de ligação de antígeno, e variantes dos anticorpos e fragmentos da invenção são compreendidos de uma região da cadeia variável leve e uma região da cadeia variável pesada. Variantes dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno contemplados na invenção são moléculas em que a atividade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de anticorpo para PRLR é mantida (para as sequências vide tabela 5).

[0019] Portanto, um objetivo da presente invenção é um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, por meio do qual o anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno compete com o anticorpo 006-H08 ou variantes maduras definidas dos mesmos. As sequências dos anticorpos e suas variantes maduras são descritas na tabela 5.

[0020] Em uma outra modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno são revelados, a. por meio do qual as sequências de aminoácido das regiões variáveis pesada e leve são pelo menos 60%, mais preferido 70%, mais preferido 80%, ou 90%, ou até mesmo mais preferido 95% idênticas à SEQ ID NO: 34 para o domínio da cadeia variável pesada e, idênticas à SEQ ID NO: 40 para o domínio da cadeia variável leve, ou b. por meio do qual as formas maduras do anticorpo 006-H08 são as sequências de aminoácido do domínio da cadeia variável pesada e cadeia leve pelo menos 60%, mais preferido 70%, mais preferido 80%, ou 90%, ou até mesmo mais preferido 95% idêntica a esta, ou c. por meio do qual as sequências de aminoácido das CDRs são pelo menos 60%, mais preferido 70%, mais preferido 80%, mais preferido 90%, ou até mesmo mais preferido 95% idênticas à SEQ ID NO: 1, 7, e 13 para o domínio da cadeia pesada, e à SEQ ID NO: 18, 24, e 29 para o domínio da cadeia variável leve.

[0021] Em uma outra modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreendendo as CDRs do anticorpo 006-H08 são revelados, por meio do qual a. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7 e 13 e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 18, 24, e 29. b. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 78, 24, 90; ou c. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 75, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 82, 24, 91; ou d. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 82, 24, 29; ou e. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 86, 24, 29; ou f. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 87, 24, 100; ou g. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 87, 24, 92; ou h. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 89, 24, 93; ou i. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 79, 24, 101; ou j. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 76, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 89, 24, 90; ou k. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 18, 24, 100; ou l. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 18, 24, 97; ou m. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 18, 24, 98; ou h. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 83, 24, 99; ou o. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 18, 24, 96; ou p. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 18, 24, 94; ou q. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 88, 24, 90; ou r. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 81, 24, 95; ou s. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 75, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 18, 24, 29; ou t. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 77, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 18, 24, 29; ou u. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 80, 24, 29; ou v. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 85, 24, 29; ou w. a cadeia variável pesada contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, e a cadeia variável leve contém as sequências de CDR que correspondem às SEQ ID NO: 84, 24, 29.

[0022] Em uma modalidade, o anticorpo 006-H08 humano, ou forma madura do mesmo são revelados, por meio do qual o anticorpo a. 006-H08 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 46, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 34, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 52, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 40. b. 006-H08-12-2 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 331, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 353, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 165, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 143, c. 006-H08-13-2 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 332, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 354, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 166, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 144, d. 006-H08-13-6-1 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 333, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 355, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 167, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 145, e. 006-H08-14-6-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 334, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 356, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 168, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 146, f. 006-H08-15-5 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 335, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 357, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 169, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 147, g. 006-H08-19-1 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 336, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 358, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 170, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 148, h. 006-H08-29-1 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 337, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 359, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 171, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 149, i. 006-H08-32-2 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 338, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 360, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 172, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 150, j. 006-H08-33-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 339, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 361, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 173, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 151, k. 006-H08-33-16-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 340, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 362, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 174, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 152, l. 006-H08-35-17-1 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 341, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 363, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 175, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 153, m. 006-H08-35-17-4 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 342, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 364, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 176, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 154, h. 006-H08-35-1 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 343, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 365, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 177, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 155, o. 006-H08-36-17-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 344, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 366, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 178, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 156, p. 006-H08-37-19-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 345, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 367, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 179, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 157, q. 006-H08-39-7 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 346, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 368, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 180, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 158, r. 006-H08-48-5 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 347, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 369, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 181, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 159, s. 006-H08-53-27-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 348, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 370, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 182, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 160, t. 006-H08-59-30-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 349, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 371, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 183, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 161, u. 006-H08-63-32-4 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 350, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 372, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 184, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 162, v. 006-H08-65-33-2 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 351, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 373, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 185, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 163, w. 006-H08-68-35-2 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 352, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 374, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 186, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 164.

[0023] Em ainda outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno dos anticorpos acima mencionados são revelados por meio do qual a. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, 18, 24, 29, ou b. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, 78, 24, 90, ou c. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 75, 13, 82, 24, 91, ou d. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, 82, 24, 29, ou e. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, 86, 24, 29, ou f. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, 87, 24, 100, ou g. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, 87, 24, 92 ou h. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, 89, 24, 93 ou i. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, 79, 24, 101 ou j. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 76, 13, 89, 24, 90 ou k. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, 18, 24, 100 ou l. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, 18, 24, 97 ou m. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, 18, 24, 98 ou n. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, 83, 24, 99 ou o. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, 18, 24, 96 ou p. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, 18, 24, 94 ou q. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, 88, 24, 90 ou r. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 74, 13, 81, 24, 95 ou s. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 75, 13, 18, 24, 29 ou t. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 77, 13, 18, 24, 29 ou u. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, 80, 24, 29 ou v. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, 85, 24, 29 ou w. o anticorpo contém uma, duas, três, quatro, cinco ou seis das CDRs que correspondem às SEQ ID NO: 1, 7, 13, 84, 24, 29.

[0024] Em outra modalidade da presente invenção, o anticorpo 006- H08 consiste em uma região de ligação de antígeno que especificamente liga ou tem uma afinidade alta para uma ou mais regiões de PRLR, cuja sequência de aminoácido é descrita pela SEQ ID NO: 70, posição de aminoácido 1 a 210, por meio do qual a afinidade é pelo menos 100 nM, preferivelmente menos que cerca de 100 nM, mais preferivelmente menos que cerca de 30 nM, até mesmo mais preferido com uma afinidade de menos que cerca de 10 nM ou até mesmo mais preferido com uma afinidade menos que 1 nM, ou até mesmo mais preferido com uma afinidade de menos de 30 pM.

[0025] Também objeto da presente invenção é o anticorpo 006-H08 acima mencionado, em que a constante pesada é uma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 modificada ou não-modificada.

[0026] Tabela 1 fornece um sumário das constantes de dissociação e taxas de dissociação dos anticorpos representativos da invenção, como determinado por ressonância de plasmon de superfície (Biacore) com domínios extracelulares monoméricos de PRLR (SEQ ID NO: 70) em anticorpos diretamente imobilizados. TABELA 1: CONSTANTES DE DISSOCIAÇÃO MONOVALENTES E TAXAS DE DISSOCIAÇÃO DO DOMÍNIO EXTRACELULAR DE PRLR HUMANO EXPRESSO EM CÉLULAS HEK293 DETERMINADAS PARA MOLÉCULAS DE IgG1 HUMANA DE ANTI-PRLR ATRAVÉS DE RESSONÂNCIA DE PLASMON DE SUPERFÍCIE

[0027] O formato de IgG1 foi usado para a determinação de afinidade com base em célula, determinada por classificação de célula ativada por fluorescência (FACS) combinada com análise de Scatchard.

[0028] Tabela 2 denota a resistência da ligação dos anticorpos de IgG representativos na linhagem celular de câncer de mama humano T47D e linhagem celular de linfoma de rato Nb2. TABELA 2: POTÊNCIA DE LIGAÇÃO COM BASE EM CÉLULA DOS ANTICORPOS DE ANTI-PRLR COMO DETERMINADO POR FACS NA LINHAGEM CELULAR DE CÂNCER DE MAMA HUMANO T47D E LINHAGEM CELULAR DE LINFOMA DE RATO Nb2

GERAÇÃO DE ANTICORPO

[0029] Para isolar um painel de anticorpos capazes de funcionalmente bloquear o PRLR humano e murino, dois formatos da biblioteca de exibição de fago de anticorpo humano sintético chamada n-CoDeR® de Bioinvent (Soderlind et al. 2000, Nature Bio Technology. 18, 852-856.), expressando fragmentos scFv e Fab, respectivamente, foram investigados em paralelo. Os alvos usados para seleção de scFv ou Fab eram o ECD solúvel de PRLR humano (posições de aminoácido 1 a 210 da SEQ ID NO. 70) e PRLR de camundongo (posições de aminoácido 1 a 210 da SEQ ID NO: 72), aplicados como variante biotinilada (biotina de NHS-LC, Pierce) e não-biotinilada como também a linhagem celular de câncer de mama humano T47D expressando PRLR.

[0030] Uma combinação de várias abordagens em tecnologia de exibição de fago (PDT) foi usada para isolar anticorpos monoclonais PRLR-específicos, humanos, de afinidade alta, por uma combinação de proteína e técnicas de aderência celular à superfície sólida (pannings) de célula inteira e através do desenvolvimento de ferramentas específicas. As ferramentas de panning e métodos de triagem incluem o ECD do PRLR humano e de camundongo recombinantemente expresso em fusão com um domínio de Fc (R&D Systems, catálogo no. 1167-PR e 1309-PR, respectivamente; pos. 1-216 das SEQ ID NO: 70 e 72, respectivamente, cada fundida ao domínio de Fc de IgG1 humana, pos. 100 a 330 da IgG1 humana), o domínio extracelular do PRLR humano recombinantemente expresso em fusão com um marcador de seis histidinas (SEQ ID NO: 70), a HEK293 e a linhagem celular de linfoma murino Ba/F cada estavelmente transfeccionadas com o PRLR humano e murino, respectivamente, e a linhagem celular de câncer de mama T47D e a célula de linfoma de rato Nb2 cada naturalmente expressando PRLR como também o desenvolvimento de procedimentos de panning e ensaios de triagem capazes de identificar anticorpos neutralizantes que preferencialmente ligam a PRLR exibido na superfície celular e que são reativos cruzado com PRLR de camundongo e rato (vide exemplo 6 e 10).

[0031] Triagem foi executada primeiro identificando os aglutinantes para PRLR humano e eventualmente PRLR de camundongo em testes de ELISA usando antígenos recombinantemente expressos. Depois, a ligação celular dos fragmentos Fab e scFv em células T47D foi examinada por análises de FACS seguidas testando a atividade neutralizante destes agentes em sinalização intracelular. Para este propósito, inibição da fosforilação de PRLR, de STAT5 e de ERK1/2 em células T47D foi determinada (vide exemplo 14). A melhor função que bloqueia scFvs e Fabs foi convertida nas moléculas de IgG1 total e testadas para afinidades monovalentes ao ECD de PRLR e para atividade inibidora em ensaios de gene repórter de luciferase como também em ensaios de proliferação com células que crescem na dependência de prolactina. A combinação destes métodos específicos permitiu o isolamento do novo anticorpo "006-H08", objeto da presente invenção, como também dos anticorpos "002-H06", "002-H08", "006- H07", "001-E06", "005-C04", objetos dos pedidos de patente correspondentes.

VARIANTES DE PEPTÍDEO

[0032] Os anticorpos da invenção não são limitados às sequências de peptídeo específicas fornecidas aqui. De preferência, a invenção também incorpora variantes destes polipeptídeos. Com referência à revelação imediata e tecnologias convencionalmente disponíveis e referências, o operário versado poderá preparar, testar e utilizar variantes funcionais dos anticorpos revelados aqui, enquanto apreciando que as variantes tendo a habilidade para funcionalmente ligar e bloquear PRLR caem dentro do escopo da presente invenção.

[0033] Uma variante pode incluir, por exemplo, um anticorpo que tem pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) alterada (hiper-variável) e/ou domínio/posição de estrutura (FR) (variável), vis-à-vis uma sequência de peptídeo revelada aqui. Para melhor ilustrar este conceito, uma breve descrição da estrutura de anticorpo segue.

[0034] Um anticorpo é composto de duas cadeias de peptídeo, cada contendo um (cadeia leve) ou três (cadeia pesada) domínios constantes e uma região variável (VL, VH), a última desta é em cada caso composta de quatro regiões de FR (VH: HFR1, HFR2, HFR3, HFR4; VL: LFR1, LFR2, LFR3, LFR4) e três CDRs interespaçadas (VL: LCDR1, LCDR2, LCDR3; VH: HCDR1, HCDR2, HCDR3). O sítio de ligação de antígeno é formado por uma ou mais CDRs, ainda as regiões de FR fornecem a estrutura estrutural para os CDRs e, consequentemente, representam um papel importante na ligação do antígeno. Alterando um ou mais resíduos de aminoácido em uma CDR ou região de FR, o operário versado pode habitualmente gerar sequências de anticorpo mutadas ou diversificadas que podem ser triadas contra o antígeno para propriedades novas ou melhoradas, por exemplo.

[0035] Figura 12 fornece os esquemas para numeração de cada posição de aminoácido nos domínios variáveis VL e VH. Tabelas 3 (VH) e 4 (VL) esboçam as regiões de CDR para certos anticorpos da invenção e comparam os aminoácidos em uma posição dada uns com os outros e com uma sequência de consenso correspondente ou de "gene mestre", em que as regiões de CDR estão marcadas com "X". Tabela 5 e 6 ajudam a atribuir os Números de SEQ ID aos anticorpos, fragmentos de anticorpo e variantes de PRLR fornecidas nesta invenção. TABELA 3: SEQUÊNCIAS DE VH

TABELA 4: SEQUÊNCIAS DE VL

TABELA 5: SEQUÊNCIAS DOS ANTICORPOS

TABELA 6: SEQUÊNCIAS DE VARIANTES DE PRLR

[0036] O operário versado pode usar os dados nas Tabelas 3, 4 e 5 para projetar as variantes de peptídeo que estão dentro do escopo da presente invenção. Prefere-se que as variantes sejam construídas alterando os aminoácidos dentro uma ou mais regiões de CDR; uma variante pode também ter uma ou mais regiões de estrutura (FR) alteradas. Por exemplo, um domínio de FR de peptídeo poderia ser alterado onde houver um desvio em um resíduo comparado a uma sequência de linhagem germinal.

[0037] Com referência a uma comparação dos anticorpos novos com a sequência de consenso ou de "gene mestre" correspondente, que são listadas na Fig. 12, os resíduos candidatos que podem ser alterados incluem, por exemplo, os seguintes: - resíduo lisina (K) na posição 75 para glutamina (Q) em VH 006-H08 (SEQ ID 34) - resíduo leucina (L) na posição 108 para metionina (M) em VH 006-H08 (SEQ ID 34) - resíduo treonina (T) na posição 110 para isoleucina (I) em VH 006-H08 (SEQ ID 34) - resíduo fenilalanina (F) na posição 67 para leucina (L) em VH 002-H08 (SEQ ID 36).

[0038] Além disso, variantes podem ser obtidas por maturação, isto é, usando um anticorpo como ponto de partida para otimização diversificando um ou mais resíduos de aminoácido no anticorpo, preferivelmente resíduos de aminoácido em uma ou mais CDRs, e triando a coletânea resultante de variantes de anticorpo para variantes com propriedades melhoradas. Particularmente preferido é diversificação de um ou mais resíduos de aminoácido em LCDR3 de VL, HCDR3 de VH, LCDR1 de VL e/ou HCDR2 de VH. Diversificação pode ser feita sintetizando uma coletânea de moléculas de DNA usando tecnologia de mutagênese de trinucleotídeo (TRIM) [Virnekas, B., Ge, L., Pluckthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G., e Moroney S.E. (1994) Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucletoides for random mutagenesis. Nucl. Acids Res. 22, 5600].

VARIANTES DE AMINOÁCIDO CONSERVADORAS

[0039] Variantes de polipeptídeo podem ser feitas que conservam a estrutura molecular geral de uma sequência de peptídeo de anticorpo descrita aqui. Dadas as propriedades dos aminoácidos individuais, algumas substituições racionais serão reconhecidas pelo operário versado. Substituições de aminoácido, isto é, "substituições conservadoras", podem ser feitas, por exemplo, com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou a natureza anfipática dos resíduos envolvidos.

[0040] Por exemplo, (a) aminoácidos não-polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, e metionina; (b) aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, e glutamina; (c) aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina, e histidina; e (d) aminoácidos negativamente carregados (acídicos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Substituições tipicamente podem ser feitas dentro dos grupos (a)-(d). Além disso, glicina e prolina podem ser substituídas uma pela outra com base em sua habilidade para romper as a-hélices. Similarmente, certos aminoácidos, tais como alanina, cisteína, leucina, metionina, ácido glutâmico, glutamina, histidina e lisina, são mais comumente encontrados em a-hélices, enquanto valina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano e treonina são encontrados mais comumente em folhas β-pregueadas. Glicina, serina, ácido aspártico, asparagina, e prolina são comumente encontradas nas voltas. Algumas substituições preferidas podem ser feitas entre os seguintes grupos: (i) S e T; (ii) P e G; e (iii) A, V, L e I. Dado o código genético conhecido, e as técnicas de DNA recombinante e sintéticas, o cientista versado pode facilmente construir DNAs que codificam as variantes de aminoácido conservadoras.

[0041] Como aqui usado, "identidade de sequência" entre duas sequências de polipeptídeo, indica a porcentagem de aminoácidos que são idênticos entre as sequências. "Homologia de sequência" indica a porcentagem de aminoácidos que são idênticos ou que representam substituições de aminoácido conservadoras. Sequências de polipeptídeo preferidas da invenção têm uma identidade de sequência nas regiões de CDR de pelo menos 60%, mais preferivelmente, pelo menos 70% ou 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% e o mais preferivelmente pelo menos 95%. Anticorpos preferidos também têm uma homologia de sequência nas regiões de CDR de pelo menos 80%, mais preferivelmente 90% e o mais preferivelmente 95%. Porém, todas estas moléculas reveladas bloqueiam a sinalização mediada por receptor da prolactina.

MOLÉCULAS DE DNA DA INVENÇÃO

[0042] A presente invenção também diz respeito às moléculas de DNA que codificam um anticorpo da invenção. Estas sequências incluem, mas não são limitadas àquelas moléculas de DNA expostas nas SEQ ID NOs 46 e 52, e 331 a 374.

[0043] As moléculas de DNA da invenção não são limitadas às sequências reveladas aqui, mas também incluem suas variantes. Variantes de DNA podem ser descritas dentro da invenção em referência às suas propriedades físicas sob hibridação. O operário versado reconhecerá que o DNA pode ser usado para identificar seu complemento e, uma vez que o DNA é bifilamentar, seu equivalente ou homólogo, usando técnicas de hibridação de ácido nucleico. Será também reconhecido que a hibridação pode ocorrer com menos de 100% de complementaridade. Porém, dada a escolha apropriada das condições, técnicas de hibridação podem ser usadas para diferenciar entre as sequências de DNA com base em sua relação estrutural com uma sonda particular. Para orientação com relação a tais condições vide, Sambrook et al., 1989 [Sambrook, J. Fritsch, E. F. e Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EUA] e Ausubel et al., 1995 [Ausubel, F. M. Brent, R. Kingston, R. E. Moore, D. D. Sedman, J. G. Smith, J. A. & Struhl, K., eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. Nova Iorque: John Wiley e Sons].

[0044] Similaridade estrutural entre duas sequências de polinucleotídeo podem ser expressadas como uma função de "severidade" das condições sob as quais as duas sequências hibridarão uma com a outra. Como aqui usado, o termo "severidade" refere-se à extensão que as condições desfavorecem hibridação. Condições rigorosas desfavorecem fortemente hibridação, e apenas as moléculas mais estruturalmente relacionadas hibridarão entre si sob tais condições. Inversamente, condições não-rigorosas favorecem hibridação das moléculas exibindo um grau de relação estrutural menor. Portanto, a severidade da hibridação correlata diretamente com as relações estruturais de duas sequências de ácido nucleico. As relações a seguir são úteis em correlatar hibridação e relação (onde Tm é a temperatura de fundição de um dupleto de ácido nucleico): a. Tm = 69,3 + 0,41(G+C)% b. A Tm de um dupleto de DNA diminui em 1°C com cada aumento de 1% no número de pares de base não-pareados. c. (Tm)μ2 - (Tm)μ1 = 18,5 log10μ2/μ1

[0045] onde μ1 e μ2 são as resistências iônicas das duas soluções.

[0046] Severidade da hibridação é uma função de muitos fatores, incluindo concentração de DNA geral, resistência iônica, temperatura, tamanho da sonda e a presença de agentes que rompem a ligação de hidrogênio. Fatores que promovem hibridação incluem concentrações de DNA altas, resistências iônicas altas, baixas temperaturas, tamanho mais longo da sonda e a ausência de agentes que rompem a ligação de hidrogênio. Hibridação é tipicamente executada em duas fases: a fase de "ligação" e a fase de "lavagem".

[0047] Primeiro, na fase de ligação, a sonda é ligada ao alvo sob condições que favorecem a hibridação. Severidade é usualmente controlada neste estágio alterando a temperatura. Para severidade alta, a temperatura é usualmente entre 65°C e 70°C, a menos que sondas curtas (< 20 nt) de oligonucleotídeo sejam usadas. Uma solução de hibridação representativa compreende 6x SSC, 0,5% SDS, solução de 5x Denhardt e 100 μg de DNA de veículo não-específico [vide Ausubel et al., seção 2.9, suplemento 27 (1994)]. Claro que, muitas condições de tampão diferentes, embora funcionalmente equivalentes, são conhecidas. Onde o grau de relação for menor, uma temperatura mais baixa pode ser selecionada. Temperaturas de ligação de severidade baixa são entre cerca de 25°C e 40°C. Severidade média é entre pelo menos cerca de 40°C a menos que cerca de 65°C. Severidade alta é pelo menos cerca de 65°C.

[0048] Segundo, a sonda em excesso é removida lavando. É nesta fase que condições mais rigorosas são usualmente aplicadas. Consequentemente, é este estágio de "lavagem" que é muito importante na determinação da relação por meio de hibridação. Soluções de lavagem tipicamente contêm concentrações de sal mais baixas. Uma solução de severidade média exemplar contém 2X SSC e 0,1% SDS. Uma solução de lavagem de severidade alta contém o equivalente (em resistência iônica) de menos que cerca de 0,2X SSC, com uma solução rigorosa preferida contendo cerca de 0,1X SSC. As temperaturas associadas com as várias severidades são iguais como debatido acima para "ligação". A solução de lavagem é também tipicamente substituída várias vezes durante a lavagem. Por exemplo, condições típicas de lavagem de severidade alta compreendem lavar duas vezes durante 30 minutos a 55°C e três vezes por 15 minutos a 60°C.

[0049] Consequentemente, objeto da presente invenção é uma sequência de ácido nucleico isolada que codifica o anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção.

[0050] Outra modalidade da presente invenção é a sequência de ácido nucleico isolada acima mencionada que codifica os anticorpos da presente invenção por meio do qual as sequências de ácido nucleico são como dadas na tabela 5.

[0051] Consequentemente, a presente invenção inclui moléculas de ácido nucleico que hibridam com as moléculas como expostas na Tabela 5 sob condições de ligação e lavagem de severidade alta onde tais moléculas nucléicas codificam um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo tendo propriedades como descritas aqui.

[0052] Moléculas preferidas (de uma perspectiva de mRNA) são aquelas que têm pelo menos 75% ou 80% (preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90% e o mais preferivelmente pelo menos 95%) de identidade de sequência com uma das moléculas de DNA descritas aqui. As moléculas bloqueiam a sinalização mediada por receptor da prolactina.

VARIANTES FUNCIONALMENTE EQUIVALENTES

[0053] Ainda outra classe de variantes de DNA dentro do escopo da invenção pode ser descrita com referência ao produto que elas codificam. Estes genes funcionalmente equivalentes são caracterizados pelo fato que eles codificam as mesmas sequências de peptídeo encontradas em SEQ ID NO: 34-45 devido à degeneração do código genético.

[0054] É reconhecido que as variantes de moléculas de DNA fornecidas aqui podem ser construídas de vários modos diferentes. Por exemplo, elas podem ser construídas como DNAs completamente sintéticos. Métodos de eficientemente sintetizar oligonucleotídeos na faixa de 20 a cerca de 150 nucleotídeos estão extensamente disponíveis. Vide Ausubel et al., seção 2.11, Suplemento 21 (1993). Oligonucleotídeos sobrepostos podem ser sintetizados e montados em uma maneira primeiro relatada por Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209- 217 (1971); vide também Ausubel et al., supra, Seção 8.2. DNAs sintéticos são preferivelmente projetados com sítios de restrição convenientes engenheirados nas terminações 5’ e 3’ do gene para facilitar a clonagem em um vetor apropriado.

[0055] Como indicado, um método de gerar variantes é iniciar com um dos DNAs revelados aqui e depois conduzir a mutagênese dirigida. Vide Ausubel et al., supra, capítulo 8, Suplemento 37 (1997). Em um método típico, um DNA alvo é clonado em um veículo de bacteriófago de DNA unifilamentar. O DNA unifilamentar é isolado e hibrida com um oligonucleotídeo contendo a(s) alteração(ões) de nucleotídeo desejada(s). O filamento complementar é sintetizado e o fago bifilamentar é introduzido em um hospedeiro. Alguma da progênie resultante conterá o mutante desejado, que pode ser confirmado usando sequenciação de DNA. Além disso, vários métodos estão disponíveis que aumenta a probabilidade que o fago da progênie será o mutante desejado. Estes métodos são bem conhecidos àqueles no campo e kits estão comercialmente disponíveis para gerar tais mutantes.

CONSTRUÇÕES DE DNA RECOMBINANTE E EXPRESSÃO

[0056] A presente invenção ainda fornece construções de DNA recombinantes que compreendem uma ou mais das sequências de nucleotídeo da presente invenção. As construções recombinantes da presente invenção são usadas com relação a um vetor, tal como um plasmídeo, fagemídeo, fago ou vetor viral aos quais uma molécula de DNA que codifica um anticorpo da invenção é inserida.

[0057] O gene codificado pode ser produzido por técnicas descritas em Sambrook et al., 1989, e Ausubel et al., 1989. Alternativamente, as sequências de DNA podem ser quimicamente sintetizadas usando, por exemplo, sintetizadores. Vide, por exemplo, as técnicas descritas em Oligonucleotide Synthesis (1984, Gait, ed., IRL Press, Oxford), que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. O perito no campo é capaz de fundir o DNA que codifica os domínios variáveis com fragmentos de gene que codificam as regiões constantes de vários isótipos de IgG humana ou derivados dos mesmos, mutados ou não- mutados. Ele é capaz de aplicar tecnologia de DNA recombinante a fim de fundir ambos os domínios variáveis em um formato de cadeia simples usando ligadores tais como uma extensão de quinze aminoácidos contendo três vezes de glicina-glicina-glicina-glicina-serina. As construções recombinantes da invenção são compreendidas com vetores de expressão que são capazes de expressar o RNA e/ou os produtos de proteína do(s) DNA(s) codificado(s). O vetor pode ainda compreender sequências reguladoras, incluindo um promotor operavelmente ligado à fase de leitura aberta (ORF). O vetor pode ainda compreender uma sequência de marcador selecionável. Iniciação específica e sinais secretórios bacterianos também podem ser requeridos para a tradução eficiente das sequências de codificação de gene alvo inseridas.

[0058] A presente invenção ainda fornece células hospedeiras contendo pelo menos um dos DNAs da presente invenção. A célula hospedeira pode ser virtualmente qualquer célula para as quais vetores de expressão estão disponíveis. Pode ser, por exemplo, uma célula hospedeira eucariótica superior, tal como uma célula mamífera, uma célula hospedeira eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura, e pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. Introdução da construção recombinante na célula hospedeira pode ser realizada por transfecção de fosfato de cálcio, DEAE, transfecção mediada por dextrana, eletroporação ou infecção de fago.

EXPRESSÃO BACTERIANA

[0059] Vetores de expressão úteis para o uso bacteriano são construídos inserindo uma sequência de DNA estrutural que codifica uma proteína desejada junto com sinais de iniciação e terminação de tradução adequados e em fase de leitura operável com um promotor funcional. O vetor compreenderá um ou mais marcadores selecionáveis fenotípicos e uma origem de replicação para assegurar a manutenção do vetor e, se desejável, fornecer amplificação dentro do hospedeiro. Hospedeiros procarióticos adequados para transformação incluem E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias espécies dentro dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces, e Staphylococcus.

[0060] Vetores bacterianos podem ser, por exemplo, com base em bacteriófago, plasmídeo ou fagemídeo. Estes vetores podem conter um marcador selecionável e origem de replicação bacteriana derivada de plasmídeos comercialmente disponíveis tipicamente contendo elementos de vetor de clonagem bem conhecidos pBR322 (ATCC 37017). Seguindo a transformação de uma cepa hospedeira adequada e crescimento da cepa hospedeira para uma densidade de célula apropriada, o promotor selecionado é descomprimido/induzido através de meios apropriados (por exemplo, deslocamento de temperatura ou indução química) e as células são cultivadas durante um período adicional. As células são tipicamente colhidas por centrifugação, rota por meios físicos ou químicos, e o extrato bruto resultante retido para outra purificação.

[0061] Em sistemas bacterianos, vários vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo do uso intencionado para a proteína sendo expressada. Por exemplo, quando uma quantidade grande de uma tal proteína for para ser produzida, para a geração de anticorpos ou para triar bibliotecas de peptídeo, por exemplo, vetores que direcionam a expressão de níveis altos de produtos de proteína de fusão que são facilmente purificados podem ser desejáveis.

[0062] Portanto, um objetivo da presente invenção é um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para novos anticorpos da presente invenção.

EXPRESSÃO & PURIFICAÇÃO MAMÍFERAS

[0063] Sequências reguladoras preferidas para a expressão da célula hospedeira mamífera incluem elementos virais que direcionam níveis altos de expressão de proteína nas células mamíferas, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV) (tal como o promotor/intensificador de CMV), Símio Vírus 40 (SV40) (tal como o promotor/intensificador de SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Para mais descrição dos elementos reguladores virais, e sequências dos mesmos, vide, por exemplo, U. S. 5.168.062 por Stinski, U. S. 4.510.245 por Bell et al. e U. S. 4.968.615 por Schaffner et al. Os vetores de expressão recombinantes podem também incluir origens de replicação e marcadores selecionáveis (vide por exemplo, U. S. 4.399.216, 4.634.665 e U. S. 5.179.017, por Axel et al.). Marcadores selecionáveis adequados incluem genes que conferem resistência aos fármacos tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira ao qual o vetor foi introduzido. Por exemplo, o gene da diidrofolato reductase (DHFR) confere resistência ao metotrexato e o gene não confere resistência a G418.

[0064] Transfecção do vetor de expressão em uma célula hospedeira pode ser realizada usando técnicas padrões tais como eletroporação, precipitação de cálcio-fosfato, e transfecção de DEAE- dextrana.

[0065] Células hospedeiras mamíferas adequadas para expressar os anticorpos, porções de ligação de antígeno, ou derivados dos mesmos fornecidos aqui incluem Ovário de Hamster Chinês (células CHO) [incluindo células CHO-dhfr, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]], células de mieloma de NSO, células COS e células SP2. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é projetado de modo que a proteína expressa é segregada no meio de cultura no qual as células hospedeiras são crescidas. Os anticorpos, porções de ligação de antígeno, ou derivados dos mesmos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrões.

[0066] Anticorpos da invenção ou um fragmento de ligação de antígeno dos mesmos podem ser recuperados e purificados das culturas de células recombinantes através de métodos bem conhecidos incluindo, mas não limitados a precipitação de sulfato de amônio ou de etanol, extração de ácido, cromatografia de Proteína A, cromatografia de Proteína G, cromatografia de permuta de ânions ou cátions, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. Cromatografia líquida de desempenho alto ("HPLC") pode também ser empregada para purificação. Vide, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, ou Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), por exemplo, Capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada um completamente incorporado aqui por referência.

[0067] Anticorpos da presente invenção ou fragmento de ligação de antígeno dos mesmos incluem produtos naturalmente purificados, produtos de procedimentos sintéticos químicos, e produtos produzidos por técnicas recombinantes de um hospedeiro eucariótico, incluindo, por exemplo, levedura, planta mais alta, inseto e células mamíferas. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, o anticorpo da presente invenção pode ser glicosilado ou não-glicosilado. Tais métodos são descritos em muitos manuais de laboratório padrões, tais como Sambrook, supra, Seções 17.37-17.42; Ausubel, supra, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 e 20.

[0068] Portanto, um objetivo da presente invenção são também células hospedeiras compreendendo o vetor ou uma molécula de ácido nucleico, por meio do qual a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira eucariótica superior, tal como uma célula mamífera, uma célula hospedeira eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura, e pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana.

[0069] Outro objetivo da presente invenção é um método de usar a célula hospedeira para produzir um anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno, compreendendo cultivar a célula hospedeira sob condições adequadas e recuperar o dito anticorpo.

[0070] Portanto, outro objetivo da presente invenção é o anticorpo como descrito na presente invenção produzida com as células hospedeiras da presente invenção e purificada para pelo menos 95% de homogeneidade em peso.

ENDOMETRIOSE E ADENOMIOSE (ENDOMETRIOSE INTERNA)

[0071]Endometriose é um distúrbio benigno, dependente de estrogênio, ginecológico que é caracterizado pela presença de tecido endometrial (glândulas e estroma) fora da cavidade uterina. Lesões endometrióticas são principalmente encontradas no peritôneo pélvico, nos ovários e no septo retovaginal (Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. 24:235-238, 1997). Endometriose é frequentemente associada com infertilidade e sintomas de dor tais como dismenorréia. Além disso, muitos pacientes sofrem de doenças autoimunes (Hum. Reprod. 17(19):2715-2724, 2002). Úteros de adenomiose também conhecido como endometriose interna descreve uma subforma de endometriose que é restringida ao útero. No caso de úteros de adenomiose, as glândulas endometriais invadem o miométrio e a parede uterina.

[0072] De acordo com a teoria de transplantação, fragmentos endometriais são fluxados através de menstruação retrógrada na cavidade peritonial tanto em pacientes como mulheres saudáveis (Obstet. Gynecol. 64:151-154, 1984). Quatro fatores principais parecem estar criticamente envolvidos no estabelecimento com sucesso das lesões endometrióticas na cavidade pélvica de pacientes: (a) Na fase secretória tardia do ciclo menstrual, as células endometriais em mulheres saudáveis tornam-se apoptóticas. Em pacientes, a extensão de apoptose em células endometriais é claramente reduzida (Fertil. Steril. 69:1042-1047,1998). Portanto, em pacientes há uma probabilidade mais alta que em mulheres saudáveis, aqueles fragmentos endometriais que foram fluxados para dentro da cavidade peritonial através da menstruação retrógrada não morrem e implantam-se de forma bem sucedida. (b) Para implantação com sucesso no peritôneo e sobrevivência a longo prazo dos fragmentos endometriais ectópicos, novos vasos sanguíneos têm que se formar (British Journal of Pharmacology, 149:133-135, 2006). (c) Muitos pacientes sofrem de doença autoimune e desse modo têm um sistema imune comprometido (Hum. Reprod. 17(19): 2002, 2715-2724, 2002). Isto pode levar à conclusão que uma resposta imune intacta - como está presente em mulheres saudáveis - pode representar um papel para a prevenção do estabelecimento de lesões endometrióticas. (d) As lesões têm que crescer e desse modo dependem da presença de estímulos mitogênicos e fatores de crescimento.

[0073] Para o tratamento de endometriose, correntemente existem as seguintes abordagens: (a) Análogos de hormônio de liberação de gonadotropina (GnRH): levam à supressão da síntese de estradiol ovariana e induzem atrofia dos implantes endometrióticos ectópicos que dependem criticamente da presença de estradiol para o crescimento. (b) Inibidores de aromatase: inibem a produção local de estradiol por meio dos implantes endometrióticos, induzem apoptose e inibem a proliferação dos fragmentos endometrióticos ectópicos. (c) Moduladores de receptor de estrogênio seletivos: têm atividade antagonística do receptor de estrogênio em implantes endometriais normais e ectópicos e desse modo levam à atrofia do tecido endometrióticos ectópico implantado. (d) Agonistas do receptor de progesterona: inibem a proliferação das células normais e endometriais ectópicas, induzem diferenciação e apoptose. (e) Preservativos orais combinados: mantêm o estado quo, impedem a progressão da doença, e induzem atrofia do endométrio ectópico e eutópico. (f) Excisão cirúrgica das lesões.

[0074] Análogos de GnRH, SERMs, e inibidores de aromatase têm efeitos colaterais severos e levam a rubores quentes e perda óssea em mulheres jovens que sofrem de endometriose. Tratamento com agonistas do receptor de progesterona leva à inibição da ovulação, hemorragia menstrual irregular seguida por amenorréia, ganho de peso corporal e depressão. Devido ao risco aumentado para trombembolismo venoso, preservativos orais combinados não são indicados em mulheres acima da idade de 35 anos, fumantes e indivíduos que sofrem de sobrepeso. Excisão cirúrgica das lesões é propensa a taxas de recorrência altas.

[0075] Os anticorpos da presente invenção interferem com a sinalização mediada por PRLR estimulada pela prolactina pituitária e localmente produzida ou devido à ativação das mutações de PRLR e são, portanto, mais efetivas que os agonistas do receptor de dopamina- 2 que interferem apenas com a secreção da prolactina pituitária.

[0076] Portanto, um objetivo da presente invenção é o anticorpo 006-H08 ou fragmentos de ligação de antígeno como um medicamento.

[0077] PRL e o PRLR são expressados no útero e representam um papel em fisiologia uterina normal; PRL pode agir como um mitógeno potente e pode ter um papel imunomodulador. Na presente invenção é mostrado que alterações no sistema de PRL/PRLR representa um papel em endometriose humana. Uma análise da expressão de PRL e PRLR em endométrio de mulheres saudáveis e em endométrio e lesões de pacientes (vide Exemplo 2) por PCR quantitativa de Taqman é mostrada nas Figuras 1 e 2.

[0078] Como demonstrado na Figura 1 (expressão de PRL) e Figura 2 (expressão de PRLR), tanto PRL como seu receptor são fortemente suprarregulados em lesões endometrióticas. Este achado gera evidência experimental pela primeira vez que sinalização de PRL autócrina pode representar um papel fundamental no estabelecimento, crescimento, e manutenção das lesões endometrióticas.

[0079] Os anticorpos de PRLR foram de forma bem sucedida testados em um modelo animal para endometriose interna, isto é, úteros de adenomiose em camundongos (vide Exemplo 20). Adenomiose é caracterizada por crescimento infiltrativo das glândulas endometriais na camada miometrial do endométrio. Se assemelha a uma forma de endometriose restringida ao útero - a única forma de endometriose que as espécies que não menstruam podem desenvolver. Danazol, que é efetivo no tratamento clínico de pacientes que sofrem de endometriose, é também efetivo no tratamento de úteros de adenomiose (Life Science 51:1119-1125, 1992). Porém danazol é um progestina androgênica e leva a efeitos colaterais androgênicos severos em mulheres jovens, o que limita seu uso.

[0080] Os anticorpos da presente invenção solucionam o problema provendo novos tratamentos ou prevenção para endometriose e apresentam menos efeitos colaterais que as terapias padrões atuais.

[0081] Portanto, um outro aspecto da presente invenção é empregar anticorpos neutralizantes de PRLR e fragmentos de ligação de antígeno para o tratamento ou prevenção de endometriose e adenomiose (endometriose interna).

[0082] Outro aspecto da presente invenção é o uso do anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno como descritos na presente invenção para o tratamento ou prevenção de endometriose e adenomiose (endometriose interna).

CONTRACEPÇÃO FEMININA NÃO-HORMONAL

[0083] Abordagens atuais para contracepção feminina são as seguintes: (a) Preservativos orais combinados contendo estrogênios e progestinas. O componente progestogênico medeia o efeito anticoncepcional por meio de realimentação negativa no eixo hipotalâmico-pituitário-gonádico. O componente estrogênico garante um bom controle da hemorragia e potencializa a ação gestagênica por meio de indução do receptor de progesterona em células alvo. (b) Dispositivos intrauterinos contendo progestinas apenas. A progestina localmente liberada dá ao endométrio um estado resistente à implantação. Além disso, o muco cervical fica quase impermeável para as células espermáticas. (c) Progestina apenas pílulas e implantes. A progestina inibe a ovulação por meio de realimentação negativa no eixo hipotalâmco- pituitário-gonádico. Além disso, a permeabilidade dos mucos cervicais para células espermáticas é reduzida. (d) Anéis vaginais contendo etinilestradiol mais progestinas.

[0084] O efeito colateral principal dos preservativos orais combinados é o risco elevado para tromboembolismo venoso (VTE). Além disso, mulheres com sobrepeso ou fumantes, como também mulheres que sofrem de doenças autoimunes tais como lúpus e mulheres acima da idade de 35 anos não podem usar preservativos combinados orais.

[0085] Dispositivos intrauterinos e implantes contendo progestinas apenas podem levar à hemorragia uterina disfuncional.

[0086] Pílulas apenas de progestina podem causar padrões de hemorragia irregulares, mancha, amenorréia. O risco para gravidezes ectópicas aumenta. Ganho de peso e reduções na densidade de massa óssea são outros efeitos colaterais.

[0087] Anéis vaginais podem levar à vaginite, leucorréia ou expulsão.

[0088] Camundongos deficientes de PRLR foram gerados alguns anos atrás (Genes Dev 11:167-178, 1997). De forma interessante, fêmeas deficientes de PRLR, mas não camundongos machos, são completamente estéreis. Fêmeas de PRLR-/- apresentaram uma apreensão de desenvolvimento de óvulo imediatamente após fertilização, isto é, elas mostraram uma apreensão de desenvolvimento de pré-implantação. Apenas muito poucos oócitos alcançaram o estágio de blastocisto e foram incapazes de se implantar em fêmeas mutantes mas desenvolveram em embriões normais em mães de criação do tipo selvagem após transplantação. O fenótipo de infertilidade dos camundongos deficientes de PRLR poderia ser salvado até à metade da gravidez através de suplementação de progesterona. Obviamente, a sinalização mediada por PRLR representa um papel importante na manutenção e função do corpo lúteo produzindo progesterona que é necessária para permitir e manter a gravidez. Além disso, fêmeas deficientes de PRLR, mas não machos, apresentaram uma redução no peso do corpo associada com uma redução na massa de gordura abdominal e nos níveis de leptina.

[0089] Até agora, nenhuma mutação de PRLR humana inativadora é conhecida, portanto o papel preciso da sinalização mediada por PRLR em fertilidade humana ainda é desconhecido. Porém, há evidência crescente que também em seres humanos, um nível de prolactina mínimo é requerido para permitir gravidez com sucesso. Pacientes que sofrem de infertilidade primária devido à insuficiência de corpo lúteo hiperprolactinêmico foram tratados com bromocriptina. Em alguns casos, os níveis de prolactina foram sobressuprimidos e as fases lúteas encurtadas reaparecidas novamente (Bohnet HG et al. em Lisuride e the other dopamine agonists editado por D. B. Calne et al, Raven Press, Nova Iorque, 1983). Destes dados, concluiu-se que os estados hiper e hipoprolactinêmicos interferem negativamente com a fertilidade feminina. Isto pode ser explicado pela interação de PRL com seu receptor. No caso de níveis baixos de prolactina, não há nenhuma ativação de receptor suficiente, enquanto que no caso de hiperprolactinemia, não há também nenhuma ativação de receptor suficiente, uma vez que todos os receptores são bloqueados através de uma molécula de prolactina e não podem se dimerizar mais. Em outras palavras, a resposta de dose para prolactina é campaniforme e ativação ótima do receptor é alcançada apenas em uma certa faixa de concentração. Há evidência de um segundo estudo que falta da expressão de prolactina endometrial em pacientes leva à insuficiência de implantação prematura (Human Reprod. 19:1911-1916, 2004). Além disso, foi mostrado que ex vivo, a prolactina pode impedir apoptose de células granulosas humanas cultivadas e desse modo manter a função de corpo lúteo prematura como foi demonstrado em camundongos deficientes de PRLR (Human Reprod. 18:2672-2677,2003).

[0090] Para testar a eficácia anticoncepcional dos anticorpos neutralizantes de PRLR, os camundongos foram injetados com anticorpos de PRLR específicos e não específicos e acasalados com machos como descrito no exemplo 11. Leituras foram o número da ninhada por grupo de tratamento e tamanho da ninhada por animal. O experimento apresentado na figura 11 demonstra que o tratamento com o anticorpo neutralizante da presente invenção impediu completamente gravidez em camundongos quando testado em 30 mg/kg do peso do corpo.

[0091] Comparado às abordagens padrões acima mencionadas, contracepção feminina com anticorpos neutralizantes de PRLR tem várias vantagens: ■ os anticorpos podem ser usados em mulheres fumantes, com sobrepeso, e mais velhas como também em mulheres que sofrem de lúpus eritematoso (anticorpos de PRLR poderiam ser até mesmo benéficos para o tratamento de lúpus e a redução da gordura abdominal, isto é, camundongos deficientes de PRLR tiveram menos gordura abdominal). ■ os anticorpos de PRLR não elevam o risco de VTE (tromboembólico venoso). ■ em contraste com os estrogênios e as progestinas usados em contracepção oral combinada, neutralização da sinalização mediada por PRLR leva à inibição de proliferação epitelial da mama e em contraste com as abordagens hormonais para o controle de fertilidade poderia até mesmo proteger os usuário de câncer de mama.

[0092] Outro objetivo da presente invenção é o uso de anticorpos de PRLR de neutralização de PRLR e fragmentos de ligação de antígeno para contracepção feminina com efeitos colaterais reduzidos comparados aos tratamentos padrões.

[0093] Outro aspecto da presente invenção é o uso do anticorpo e fragmentos de ligação de antígeno como descritos na presente invenção para contracepção feminina com efeitos colaterais reduzidos comparados aos tratamentos padrões.

DOENÇA DE MAMA BENIGNA E MASTALGIA

[0094] Doença de mama benigna abrange uma variedade de sintomas, tais como doença de mama fibrocística, fibroadenoma, mastalgia, e macrocistos. 30 - 50% de mulheres em pré-menopausa sofrem de doença de mama fibrocística (Epidemiol Rev 19:310-327, 1997). Dependendo da idade das mulheres, a doença de mama benigna pode apresentar com fenótipos distintos (J Mammary Gland Biol Neoplasia 10:325-335, 2005): durante as fases reprodutivas prematuras (15 - 25 anos) quando o desenvolvimento lobular na mama normal acontece, a doença de mama benigna resulta em fibroadenomas. Fibroadenomas gigantes simples como também adenomas múltiplos são observados. Estes fibroadenomas são compostos de células estromais como também epiteliais e surgem dos lóbulos. Na fase reprodutiva madura (25 - 40 anos), a mama está sujeita a alterações cíclicas durante cada ciclo menstrual. Mulheres doentes apresentam mastalgia cíclica e vários nódulos em seu seio. Depois (35-55 anos de idade), a mama normal involuta enquanto que na mama doente macrocistos e hiperplasia epitelial com e sem atipia podem ser observados. Aquelas formas de doença de mama benigna que são acompanhadas por proliferação intensificada de células epiteliais têm um risco mais alto para desenvolver carcinomas mamários. Este risco pode ser até 11% se as atipias celulares estiverem presentes na fração celular proliferativa (Zentralbl Gynakol 119:54-58,1997). 25% das mulheres com idade entre 60 - 80 anos também sofrem de doença de mama benigna, frequentemente terapia de substituição de estrogênio ou adiposidade são as razões para persistir a doença de mama benigna após a menopausa (Am J Obstet Gynecol 154:161-179, 1986).

[0095] A fisiopatologia da doença de mama fibrocística é determinada por predominância de estrogênio e deficiência de progesterona resultando em hiperproliferação dos tecidos conjuntivos (fibrose) que é seguido pela proliferação de célula epitelial facultativa. Como já mencionado, o risco de câncer de mama é elevado em pacientes que exibem proliferação intensificada de células epiteliais dentro dos focos fibrocísticos. Clinicamente, a doença de mama fibrocística apresenta-se com dor na mama e ternura na mama. 70% de pacientes com doença de mama fibrocística sofrem de qualquer insuficiência de corpo lúteo ou anovulação (Am J Obstet 154:161- 179,1986). Insuficiência de corpo lúteo resulta em níveis de progesterona reduzidos e predominância de estrogênio.

[0096] Mastalgia (dor na mama) afeta cerca de 70% de mulheres em algum momento em seu período de vida reprodutivo. Dor de mama pode ou não estar associada com outros critérios da síndrome pré- menstrual. Foi demonstrado que mulheres que sofrem de mastalgia respondem com uma liberação de prolactina em excesso após estimulação do eixo hipotalâmico-pituitário (Clin Endocrinol 23:699- 704,1985).

[0097] As terapias padrões de doença de mama benigna e mastalgia são: 1) Bromocriptina

[0098] Bromocriptina como um agonista de dopamina bloqueia apenas a síntese de prolactina pituitária, mas não a síntese local de prolactina nas células epiteliais mamárias. É, portanto, apenas efetiva naquelas formas de mastalgia e doença de mama benigna que contam com níveis elevados de prolactina sistêmica. Efeitos colaterais principais de bromocriptina são:

[0099] Náusea, vômito, edema, hipotensão, vertigem, queda de cabelo, dor de cabeça, e alucinações. 2) Danazol

[00100] Danazol é uma progestina androgênica que, por meio de sua atividade antigonadotrófica//, combate a predominância de estrogênio observada em doença de mama benigna. Efeitos colaterais principais são:

[00101] Irregularidades menstruais, depressão, acne, hirsutismo, voz grave, e rubores quentes como também ganho de peso. 3) Tamoxifeno

[00102] Tamoxifeno é um modulador seletivo do receptor de estrogênio com atividade antiestrogênica no mama e atividade estrogênica no útero. Efeitos colaterais principais são:

[00103] sintomas de pós-menopausa tais como perda óssea e rubores quentes, cistos ovarianos, e carcinoma endometrial. 4) Progestinas

[00104] Progestinas inibem doença de mama benigna por meio da supressão do eixo gonádico-pituitário, inibição da ovulação e depleção de estrogênio. Depleção de estrogênio leva a sintomas de menopausa tais como perda óssea e rubores quentes. 5) Preservativos orais combinados de dose baixa

[00105] Este tratamento não é indicado em mulheres acima de 35 anos de idade, pacientes fumantes como também diabéticos e com sobrepeso.

[00106] Em geral, os níveis de prolactina foram constatados ser aumentados em um terço das mulheres com doença de mama benigna. Considerando que os estrogênios intensificam a secreção de prolactina pituitária, acredita-se que o aumento nos níveis de prolactina de soro seja uma consequência da predominância de estrogênios nesta doença. Foi relatado que uma mutação de PRLR de ativação está frequentemente presente em mulheres que sofrem de adenomas de mama múltiplos - se assemelhando a um subtipo da doença de mama fibrocística (Paul Kelly, Breast Congress Turin, 2007 e Proc Natl Acad Sci 105: 14533-14538;2008).

[00107] Doença de mama benigna, mastalgia e tensão de mama pré- menstrual contam com um mecanismo patofisiológico comum: sinalização intensificada da prolactina. Sinalização elevada da prolactina pode ser a consequência de: ■ hiperprolactinemia sistêmica (devido ao adenoma pituitário) ■ hiperprolactinemia local (devido à síntese de prolactina proliferando células epiteliais da glândula mamária). Hiperprolactinemia local não traduz em níveis elevados de prolactina no sangue. ■ constitutivamente ativar a sinalização de PRLR na presença de níveis normais de prolactina (devido a uma mutação de PRLR ativador).

[00108] Dado que certas formas da doença de mama benigna podem dar origem a câncer de mama, há uma necessidade médica pelo tratamento desta doença.

[00109] Para demonstrar a eficácia dos anticorpos neutralizantes de PRLR em um modelo pré-clínico de doença de mama benigna, empregou-se um modelo de camundongo com base em hiperprolactinemia sistêmica. Camundongos Balb/c adultos foram transplantados com isoenxertos pituitários sob a cápsula do rim como descrito no Exemplo 16 (Em: Methods in Mammary gland Biology e Breast Cancer Research, 101-107,2000). Hiperprolactinemia sistêmica causou proliferação intensificada de células epiteliais na glândula mamária, e estimulou bifurcação e desenvolvimento lobuloalveolar em comparação aos camundongos de controle virgens sem tratar. As formas mais severas das doenças de mama fibrocísticas humanas que carregam um risco intensificado de desenvolvimento canceroso são caracterizadas por proliferação aumentada de células epiteliais. Como descrito no Exemplo 16, os anticorpos de PRLR neutralizantes foram testados neste modelo de camundongo Balb/c em comparação aos anticorpos não específicos com respeito à sua habilidade para: ■ bloquear a bifurcação e o desenvolvimento lobuloalveolar ■ inibir a proliferação de células epiteliais mamárias ■ inibir a fosforilação de STAT5, um fator de transcrição que é normalmente ativado e fosforilado após ativação de PRLR.

[00110] Como demonstrado na Figura 15A-C anticorpos de PRLR neutralizantes bloqueiam todos os paradigmas de leitura supracitados de uma maneira dose-dependente.

[00111] Outro objetivo da presente invenção é o uso de anticorpos neutralizantes de PRLR ou fragmentos de ligação de antígeno para o tratamento de doença de mama benigna e mastalgia em mulheres em pré ou pós-menopausa.

[00112] Outro aspecto da presente invenção é o uso dos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno como descritos na presente invenção para o tratamento de doença de mama benigna e mastalgia em mulheres em pré ou pós-menopausa.

INIBIÇÃO DE LACTAÇÃO

[00113] Prolactina é o hormônio principal envolvido na lactação após o nascimento da criança. Este é comprovado pelo fenótipo de camundongos deficientes de PRLR. Até mesmo camundongos heterozigotos têm problemas lactacionais severos e não podem completamente alimentar sua descendência (Frontiers in Neuroendocrinology 22:140-145, 2001).

[00114] Por muitas razões, as mulheres têm que parar a alimentação de peito, isto é, aporte materno de fármacos potencialmente perigosos ao lactente, infecções sérias (mastite, nefrite), hemorragia pós-parto profusa, e doenças maternas severas tais como diabetes, carcinoma, e debilidade ou doenças do recém-nascido. Correntemente, agonistas do receptor da dopamina tais como bromocriptina e lisurida são usados para inibir a lactação após o nascimento da criança. Porém, estes compostos podem provocar efeitos colaterais severos tais como náusea, vômito, edema, hipotensão, vertigem, queda de cabelo, dor de cabeça, e alucinações. Além disso, os agonistas do receptor da dopamina não são indicados em mulheres que sofrem de doença cardiovascular e hipertensão. Uma outra desvantagem da bromocriptina é seu tempo meia-vida curto requerendo diariamente aporte de fármaco 4-6 vezes em um período de 14 dias.

[00115] Para testar a eficácia dos anticorpos neutralizantes do receptor da prolactina em camundongos, camundongos NMRI foram acasalados com machos. Após o nascimento, tamanho da ninhada foi determinado em 8 animais, e as fêmeas foram tratadas com anticorpos específicos e não específicos direcionados contra o PRLR como descrito no exemplo 15. Como uma medida para capacidade de lactação materna, o peso da prole foi monitorado diariamente. Leituras são descritas em detalhes no exemplo 15 e os resultados são descritos na figura 14A-D. Anticorpos de PRLR neutralizantes mostram uma inibição dose-dependente da lactação e levam à involução da glândula mamária e produção reduzida de proteína de leite.

[00116] Outro objetivo da presente invenção é o uso de anticorpos neutralizantes de PRLR para inibição da lactação.

[00117] Outro objetivo da presente invenção é o uso do anticorpo 006-H08 e fragmentos de ligação de antígeno como descritos na presente invenção para inibição da lactação.

HIPERPLASIA DE PRÓSTATA BENIGNA

[00118] Hiperplasia de próstata benigna (BPH) é a quarta condição de cuidado médico mais prevalecente em homens mais velhos. Alargamento da próstata é uma condição progressiva dependente da idade que afeta mais de 50% de homens com > 50 anos de idade. BPH é caracterizada por hiperplasia das células estromais e epiteliais prostáticas, resultando na formação de nódulos distintos grandes na região periuretral da próstata que comprime o canal uretral. Desse modo, prejuízo do fluxo de urina é uma consequência principal de BPH.

[00119] Terapias padrões para BPH abrangem: (a) antagonistas de receptor a1-adrenérgicos (por exemplo, tansulosina, alfuzosina, terazosina, doxazosina) aliviam os sintomas de BPH no trato urinário inferior. Eles diminuem a obstrução de saída da bexiga bloqueando a estimulação mediada pelo alfa-receptor do músculo liso da próstata. Efeitos colaterais principais são eventos adversos vasodilatadores, vertigem e falha de ejaculação. (b) inibidores de 5α-reductase (por exemplo finasterida)

[00120] inibidores de 5α-reductase impedem a formação de diidrotestosterona, a forma ativa da testosterona na próstata que é responsável pelo alargamento da próstata. Efeitos colaterais principais são disfunção sexual, tais como distúrbios eréteis e libido diminuída. (c) Resseção transuretral da próstata (TURP)

[00121] Este tratamento cirúrgico é associado com morbidez alta. Efeitos colaterais são hemorragia, incontinência, formação de restrição, perda de ejaculação, e perfuração da bexiga. (d) Colocação de stent de próstata

[00122] Um stent é inserido na parte prostática da uretra para garantir fluxo apropriado de urina. Efeitos colaterais principais são incrustação, infecção do trato urinário, e migração do stent. Além disso, os stents têm que ser removidos antes de qualquer manipulação transuretral.

[00123] Como descrito para a glândula mamária, PRL e o PRLR atuam de um modo autócrino/parácrino (J. Clin. Invest. 99:618 págs. 1997) dentro da próstata.

[00124] Estudos clínicos indicam que hiperprolactinemia (e agromegalia) está associada com alargamento prostático e acumulação estromal de células inflamatórias. Hormônio de crescimento humano pode ligar ao PRLR humano na presença de zinco que poderia explicar por que a acromegalia pode levar à hiperplasia de próstata benigna. Níveis séricos de PRL são frequentemente elevados em pacientes com BPH.

[00125] Animais transgênicos que supraexpressam o gene de PRL de forma ubíqua, desenvolvem hiperplasia de próstata estromal severa, indicando PRL como um fator patofisiológico importante para o desenvolvimento de hiperplasia de próstata (Endocrinology 138:4410 págs., 1997). Além disso, a supraexpressão local de PRL em camundongos transgênicos sob o promotor de probasina específico para próstata resulta em expansão estromal, acumulação de células inflamatórias e displasia epitelial focal, que são características básicas de BPH humana (Endocrinology 144:2269 págs., 2003).

[00126] O PRLR é altamente expresso na glândula prostática (Exemplo 3, Figura 3). Variação de expressão de proteína de PRLR foi observada em tecido de próstata de rato após depleção e tratamento hormonais (Exemplo 4, Figura 4). Além do PRLR, as células de próstata também expressam prolactina.

[00127] Como descrito no Exemplo 17, camundongos de Balb/c machos receberam isoenxertos pituitários sob a cápsula renal e hiperplasia de próstata benigna desenvolveu-se. O efeito dos anticorpos neutralizantes do receptor da prolactina e anticorpos não específicos em hiperplasia de próstata benigna foi testado neste modelo. Os paradigmas de leitura são descritos no Exemplo 17. Como descrito na Figura 16, os anticorpos neutralizantes de PRLR inibem crescimento de próstata benigna e são, portanto, adequados para o tratamento de hiperplasia de próstata benigna.

[00128] Outro objetivo da presente invenção é o uso de anticorpos neutralizantes de PRLR ou fragmentos de ligação de antígeno para o tratamento de hiperplasia de próstata benigna.

[00129] Outro aspecto da presente invenção é o uso do anticorpo ou fragmentos de ligação de antígeno como descritos na presente invenção para o tratamento de hiperplasia de próstata benigna.

QUEDA DE CABELO HIPERPROLACTINÊMICA

[00130] Tratamento de queda de cabelo ainda é uma necessidade não satisfeita. Crescimento de cabelo do couro cabeludo em ciclos: a fase anágena é caracterizada por crescimento de cabelo ativo, a fase catágena mostra involução e é seguida pela fase telógena (queda). A fase exógena (a liberação do cabelo morto) coincide com o término da fase telógena. Queda de cabelo pode ser a consequência de crescimento de cabelo alterado em qualquer fase.

[00131] Queda de cabelo telógena pode ter muitos desencadeadores (tensão fisiológica e emocional, condições médicas, deficiência de ferro e zinco), importantemente alopecia androgênica em seus estágios prematuros mostra encurtamento de pêlo da fase telógena (Cleveland clinic journal of medicine 2009;76:361-367). Queda de cabelo anágena é frequentemente a consequência de radiação ou quimioterapia.

[00132] Minoxidil e Finasterida são usados para o tratamento de queda de cabelo androgenética, enquanto que glicocorticóides são usados para alopecia areata. Em geral, todos estes tratamentos têm efeitos colaterais (finasterida: perda de libido e impotência em homens, glicocorticóides: diabetes, ganho de peso, osteoporose), e o problema de tratar queda de cabelo não foi completamente solucionado.

[00133] Em roedores, experimentos de raspagem em animais adultos foram usados para analisar o efeito dos compostos em queda de pêlo usando recrescimento de pêlo na área raspada como paradigma de leitura (British Journal of Dermatology 2008;159:300-305). Raspagem dos animais adultos (cabelo principalmente na fase telógena) induz à fase anágena que é caracterizada por crescimento de pêlo.

[00134] Nos experimentos como descritos no Exemplo 17 (hiperplasia de próstata benigna), os animais que recebem isoenxertos pituitários, foram raspados. No curso destes experimentos, foi descoberto inesperadamente que os animais que receberam isoenxertos pituitários mostraram um prejuízo severo de recrescimento de pêlo na área raspada. Tratamento com anticorpos neutralizantes de PRLR, mas não com anticorpos não específicos, estimulou crescimento de pêlo (Figura 17).

[00135] Esta observação demonstra que a sinalização elevada mediada por receptor da prolactina está envolvida em queda de pêlo. Para analisar isso em mais detalhes, outros experimentos de raspagem em analogia íntima aos experimentos previamente descritos foram executados (British Journal of Dermatology 2008;159:300-305). Estes experimentos de raspagem adicionais são descritos no Exemplo 18. Os experimentos demonstram que anticorpos neutralizantes de PRLR estimulam o crescimento de pêlo em camundongos machos e fêmeas hiper e normoprolactinêmicos.

[00136] Os anticorpos da presente invenção solucionam o problema para fornecer novos tratamentos para queda de cabelo hiper e normoprolactinêmica nas mulheres e nos homens.

[00137] Portanto, um outro aspecto da presente invenção é empregar anticorpos neutralizantes de PRLR ou fragmentos de ligação de antígeno para o tratamento ou prevenção de queda de cabelo hiper e normoprolactinêmica.

[00138] Outro aspecto da presente invenção é o uso do anticorpo ou fragmentos de ligação de antígeno como descritos na presente invenção para o tratamento ou prevenção de queda de cabelo hiperprolactinêmica.

TERAPIA HORMONAL COMBINADA

[00139] Para o tratamento de rubores quentes em mulheres de pós- menopausa que ainda têm útero, combinações de estrogênio (estradiol, ou estrogênios equinos conjugados = CEE) e progestinas (por exemplo, acetato de medroxiprogesterona (MPA), progesterona, drospirenona, levonorgestrel) foram usadas. Progestinas têm que ser adicionados para inibir proliferação de célula epitelial uterina ativada por estradiol. Porém, a adição de progestinas aumenta a proliferação de células epiteliais mamárias. Uma vez que ambos, células epiteliais mamárias normais como também cancerosas respondem com proliferação para estrogênio combinado mais tratamento de progestina, o risco relativo de câncer de mama foi observado ser aumentado após CEE mais tratamento de MPA (JAMA 233:321-333;2002).

[00140] Anticorpos de PRLR neutralizantes quando administrados todos os meses ou a cada segundo mês a mulheres sob terapia hormonal combinada inibirá proliferação intensificada de células epiteliais mamárias.

[00141] Como descrito no Exemplo 19, um modelo de camundongo previamente desenvolvido para a análise quantitativa dos efeitos de progestina no útero e na mama foi empregado (Endocrinology 149:3952-3959,2008). Camundongos foram ovariectomizados e foram tratados 14 dias após ovariectomia durante três semanas com veículo ou 100 ng de estradiol mais 100 mg/kg de progesterona para mimetizar a terapia de substituição hormonal. Os animais foram tratados uma vez semanalmente com PRLR específico (10 mg/kg ou 30 mg/kg) ou anticorpos não específicos (30 mg/kg). Os efeitos dos anticorpos neutralizantes de PRLR em atividade proliferativa na mama sob terapia hormonal combinada foram analisados.

[00142] Os anticorpos da presente invenção solucionam o problema para tratar proliferação intensificada de células epiteliais mamárias observada sob terapia hormonal combinada.

[00143] Outro objetivo da presente invenção é o uso de anticorpos neutralizantes de PRLR ou fragmentos de ligação de antígeno em terapia hormonal combinada (isto é, terapia de estrogênio + progestina) para inibir proliferação de células epiteliais mamárias.

[00144] Outro aspecto da presente invenção é o uso do anticorpo ou fragmentos de ligação de antígeno como descritos na presente invenção em terapia hormonal combinada (isto é, terapia de estrogênio + progestina) para inibir proliferação de células epiteliais mamárias.

DEFINIÇÕES

[00145] O "PRLR" humano de antígeno alvo como aqui usado refere- se a um polipeptídeo humano tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácido em seu domínio extracelular como as posições de aminoácido 1 a 210 da SEQ ID NO. 70 e variantes alélicas de ocorrência natural e/ou de splice das mesmas. "ECD de PRLR" como aqui usado refere-se à porção extracelular de PRLR representada pelos aminoácidos acima mencionados. Além disso, o PRLR humano alvo também abrange versões mutadas do receptor, tais como a mutação ativadora I146L descrita por Paul Kelly (Proc Natl Acad Sci U S A.105(38):14533-14538,2008; e Oral Communication Turin, 2007).

[00146] Como aqui usado, a frase "quantidade terapeuticamente eficaz" é significado referir-se a uma quantidade de anticorpo terapêutico ou profiláctico que seria apropriada para suscitar o efeito ou resposta terapêutica ou profiláctica desejada, incluindo aliviar alguns ou todos de tais sintomas de doença ou reduzindo a predisposição à doença, quando administrados de acordo com o regime de tratamento desejado.

[00147] Como aqui usado, um anticorpo "especificamente liga a," é "para/de específico" ou "especificamente reconhece" um antígeno (aqui, PRLR) se um tal anticorpo for capaz de discriminar entre tal antígeno e um ou mais antígeno(s) de referência, uma vez que a especificidade de ligação não é uma propriedade absoluta, mas uma relativa. Em sua forma mais geral (e quando nenhuma referência definida for mencionada), "ligação específica" está referindo-se à habilidade do anticorpo para discriminar entre o antígeno de interesse e um antígeno não relacionado, como determinado, por exemplo, de acordo com um dos métodos seguintes. Tais métodos compreendem, mas não são limitados a western blot, ELISA, RIA, ECL, testes de IRMA e varreduras de peptídeo. Por exemplo, um ensaio de ELISA padrão pode ser realizado. A contagem pode ser realizada por desenvolvimento de cor padrão (por exemplo anticorpo secundário com peróxido de raiz-forte e tetrametil benzidina com peróxido de hidrogênio). A reação em certos poços é registrada pela densidade óptica, por exemplo, a 450 nm. Antecedentes típicos (= reação negativa) podem ser 0,1 OD; reação positiva típica pode ser 1 OD. Isto significa que a diferença positiva/negativa pode ser mais que 10 vezes. Tipicamente, a determinação da especificidade de ligação é executada não usando um antígeno de referência simples, mas um conjunto de cerca de três a cinco antígenos não relacionados, tais como pó de leite, BSA, transferrina ou outros.

[00148] Porém, "ligação específica" também pode referir-se à habilidade de um anticorpo para discriminar entre o antígeno alvo e um ou mais antígeno(s) estritamente relacionado(s) que são usados como pontos de referência. Adicionalmente, "ligação específica" pode referir- se à habilidade de um anticorpo para discriminar entre partes diferentes de seu antígeno alvo, por exemplo domínios diferentes, subdomínios ou regiões de PRLR, tais como epítopos na região N-terminal ou C-terminal do ECD de PRLR, ou entre um ou mais resíduos de aminoácido fundamentais ou extensões de resíduos de aminoácido do ECD de PRLR.

[00149] "Afinidade" ou "afinidade de ligação" KD é frequentemente determinada por medição da constante de associação de equilíbrio (ka) e a constante de dissociação de equilíbrio (kd) e calculando o quociente de kd a ka (KD = kd/ka). O termo "imunoespecífico" ou "especificamente ligando" significa que o anticorpo liga-se ao PRLR ou seu ECD com uma afinidade KD de menor ou igual a 10-6M (afinidade monovalente). O termo "afinidade alta" significa que a KD que o anticorpo se liga a PRLR ou seu ECD com uma afinidade KD de menor ou igual a 10-7M (afinidade monovalente). O anticorpo pode ter afinidade substancialmente maior pelo antígeno alvo comparado a outras moléculas não relacionadas. O anticorpo pode também ter afinidade substancialmente maior pelo antígeno alvo comparado aos homólogos, por exemplo pelo menos 1,5 vez, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 10-3 vezes, 10-4 vezes, 10- 5 vezes, 10-6 vezes ou afinidade maior com relação ao antígeno alvo. Tais afinidades podem ser facilmente determinadas usando as técnicas convencionais, tais como através de diálise de equilíbrio; usando o instrumento BIAcore 2000, usando os procedimentos gerais esboçados pelo fabricante; através de radioimunoensaio usando o antígeno alvo radiomarcado; ou por outro método conhecido ao artesão versado. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949).

[00150] Como aqui usado a frase "anticorpos antagonizam sinalização mediada por prolactina" é significada referir-se a um bloqueio da ativação do receptor da prolactina pelos anticorpos da presente invenção que leva a uma inibição completa da sinalização mediada por receptor da prolactina.

[00151] Como aqui usado a frase "anticorpos competem para ligar" é significado referir-se a uma competição entre um anticorpo e um segundo anticorpo ou mais anticorpos por ligar-se ao receptor da prolactina.

[00152] O termo "anticorpo" é usado no sentido mais vasto e inclui anticorpos completamente montados, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), fragmentos de anticorpo que podem ligar-se ao antígeno (por exemplo, Fab’, F’(ab)2, Fv, anticorpos de cadeia simples, diacorpos), corpos de camelo e peptídeos recombinantes que compreendem os anteriores contanto que eles exibam a atividade biológica desejada. Os anticorpos podem carregar domínios constantes diferentes (domínios de Fc) em sua cadeia pesada preferivelmente derivada dos isótipos IgG1, IgG2, ou IgG4 (vide abaixo). Mutações para modificação das funções efetoras podem ser introduzidas. Resíduos de aminoácido no domínio Fc que representa um papel dominante nas interações com a proteína de complemento C1q e os receptores de Fc foram identificados e mutações que influenciam as funções efetoras foram descritas (para uma revisão vide Labrijn et al., Current Opinion in Immunology 20:479-485, 2008). Particularmente, aglicosilação de IgG1 pode ser alcançada mutando a asparagina para alanina ou asparagina para glutamina na posição de aminoácido 297 que foi relatada abolir a citotoxicidade mediada por célula derivada de anticorpo (ADCC) (Sazinsky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 105 (51): 20169, 2008; Simmons et al., J. de Immunological Methods 263: 133-147, 2002). Substituição de lisina por alanina na posição 322 leva à redução de ADCC e remoção da citotoxicidade derivada de complemento (CDC), enquanto a substituição simultânea das duas leucinas na posição 234 e 235 por alaninas leva à evitação de ADCC e CDC [Hezareh et al., J. of Virology, 75 (24):12161-12168, 2001]. A fim de aplicar isótipos de IgG4 como terapêuticas bivalentes in vivo tendo a avidez, uma modificação tal como a permuta de serina-para-prolina na "região de dobradiça de núcleo" (Schuurman, J., et al. Immunology 97: 693-698, 1999) podem ser introduzidas. A tendência das moléculas de IgG2 humana para formar dímeros covalentes heterogêneos pode ser evitada trocando um das cisteínas na posição 127, 232 e 233 para serina (Allen et al., Biochemistry, 2009, 48 (17), págs. 3755-3766). Um formato alternativo com função efetora reduzida pode ser o formato de IgG2m4, derivado de IgG2 que carrega quatro alterações de resíduos de aminoácido IgG4- específicos (An et al., mAbs 1(6), 2009). Fragmentos de anticorpo podem ser produzidos através de técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos e são descritas mais abaixo. Exemplos não-limitativos de anticorpos monoclonais incluem imunoglobulinas murinas, quiméricas, humanizadas, humanas, e Human Engineered™, anticorpos, proteínas de fusão quiméricas tendo sequências derivadas de imunoglobulinas, ou muteínas ou seus derivados, cada um descrito mais abaixo. Multímeros ou agregados de moléculas e/ou fragmentos intactos, incluindo anticorpos quimicamente derivatizados, são contemplados.

[00153] O termo "anticorpo monoclonal" como aqui usado refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos com exceção das possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades secundárias. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionado contra um sítio antigênico simples. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpo convencionais (policlonais) que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um determinante simples no antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos em que eles são sintetizados pela cultura homogênea, incontaminada por outras imunoglobulinas com especificidades diferentes e características.

[00154] O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não será interpretado como requerendo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados podem ser feitos primeiro pelo método de hibridoma descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 [1975, ou pode ser feito através de métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, Patente U.S. 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser recombinantes, quiméricos, humanizados, Human Engineered™, Humanos, ou fragmentos de anticorpo, por exemplo.

[00155] Um "imunoglobulina" ou "anticorpo nativo" é uma glicoproteína tetramérica. Em uma imunoglobulina de ocorrência natural, cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região "variável" de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função efetora. Imunoglobulinas podem ser atribuídas a classes diferentes dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas. Cadeias pesadas são classificadas como mu (μ), delta (Δ), gama (Y), alfa (a), e epsilo (ε), e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Vários destes podem ser ainda divididos em subclasses ou isótipos, por exemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Isótipos diferentes têm funções efetoras diferentes; por exemplo, isótipos IgG1 e IgG3 frequentemente têm atividade de ADCC. Cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves capa (K) e lambda (Y). Dentro de cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 10 mais aminoácidos. Vide em geral, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W. ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)).

[00156] Um "fragmento funcional" ou "fragmento de ligação de antígeno de anticorpo" de um anticorpo/imunoglobulina aqui é definido como um fragmento de um anticorpo/imunoglobulina (por exemplo, uma região variável de uma IgG) que retém a região de ligação de antígeno. Uma "região de ligação de antígeno" de um anticorpo é tipicamente encontrada em uma ou mais região(ões) hipervariável(éis) de um anticorpo, isto é, as regiões de CDR-1, 2, e/ou 3; porém, as regiões "estruturais" variáveis podem também representar um papel importante de ligação do antígeno, tal como provendo um andaime para as CDRs. Preferivelmente, a "região de ligação de antígeno" compreende pelo menos resíduos de aminoácido 4 a 103 da cadeia variável leve (VL) e 5 a 109 da cadeia variável pesada (VH), mais preferivelmente os resíduos de aminoácido 3 a 107 da VL e 4 a 111 da VH, e particularmente preferido são as cadeias VL e VH completas [posições de aminoácido 1 a 109 da VL e 1 a 113 da VH, enquanto a numeração das posições de aminoácido ocorre de acordo com a base de dados de Kabat (Johnson e Wu, Nucleic Acids Res., 2000, 28, 214-218]. Uma classe preferida de imunoglobulinas para o uso na presente invenção é IgG.

[00157] O termo região "hipervariável" refere-se aos resíduos de aminoácido dos domínios variáveis VH e VL de um anticorpo ou fragmento funcional que são responsáveis pela ligação do antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma "região de determinação de complementaridade" ou CDR [isto é, resíduos 24-34 (LCDR1), 50 - 56 (LCDR2) e 88-97 (LCDR3) no domínio variável da cadeia leve e 29-36 (HCDR1), 48-66 (HCDR2) e 93-102 (HCDR3) no domínio variável da cadeia pesada como descrito na Fig. 12] e/ou aqueles resíduos de uma alça hipervariável [isto é, resíduos 26-32 (dentro de LCDR1), 50-52 (dentro de LCDR2) e 91-96 (dentro de LCDR3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (dentro de HCDR1), 53 - 55 (dentro de HCDR2) e 96-101 (dentro de HCDR3) no domínio variável da cadeia pesada como descrito por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)].

[00158] Exemplos não-limitativos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, anticorpo de domínio (dAb), fragmentos da região de determinação de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia simples (scFv), fragmentos de anticorpo de cadeia simples, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, anticorpos lineares (Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)); anticorpos recombinantes quelantes, tricorpos ou bicorpos, intracorpos, nanocorpos, imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs), uma proteína de fusão da imunoglobulina do domínio de ligação de antígeno, um anticorpo camelizado, um anticorpo contendo VHH, ou muteínas ou seus derivados, e polipeptídeos contendo pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir ligação de antígeno específica ao polipeptídeo, tal como uma sequência de CDR, contanto que o anticorpo retenha a atividade biológica desejada; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editores (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Um anticorpo diferente de um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é entendido ter cada um de seus sítios de ligação idênticos. O F(ab’)2 ou Fab podem ser engenheirados para minimizar ou completamente remover as interações de dissulfeto intermolecular que ocorrem entre os domínios CH1 e CL. Digestão de papaína dos anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada com um sítio de ligação de antígeno simples, e um fragmento "Fc" residual cujo nome reflete sua habilidade para cristalizar-se facilmente. Tratamento de pepsina rende um fragmento de F(ab’)2 que tem dois fragmentos "Fv". Um fragmento "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo contendo um reconhecimento de antígeno completo e sítio de ligação. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e uma cadeia leve em associação apertada, não-covalente. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno na superfície do dímero de VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Porém, até mesmo um domínio variável simples (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a habilidade para reconhecer e ligar o antígeno.

[00159] Fragmentos de anticorpo de "Fv de cadeia simples" ou "sFv" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma cadeia de polipeptídeo simples.

[00160] Preferivelmente, o polipeptídeo de Fv ainda compreende um ligador de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite o Fv formar a estrutura desejada para ligação do antígeno. Para uma revisão de sFv vide Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994).

[00161] O fragmento de Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos de Fab diferem dos fragmentos de Fab’ pela adição de alguns resíduos ao término carbóxi do domínio de CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça de anticorpo. Fab’-SH é a designação aqui para Fab’ em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab’)2 foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab’ tendo cisteínas de dobradiça entre eles.

[00162] Resíduos de "estrutura" ou de FR são aqueles resíduos de domínios variáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável.

[00163] A frase "região constante" refere-se à porção da molécula de anticorpo que confere funções efetoras.

[00164] O termo "muteína" ou "variante" pode ser usado alternadamente e refere-se à sequência de polipeptídeo de um anticorpo contendo pelo menos uma substituição, deleção, ou inserção de aminoácido na região variável ou o equivalente de porção para a região variável, contanto que a muteína ou variante retenha a afinidade de ligação ou atividade biológica desejada.

[00165] Muteínas podem ser substancialmente homólogas ou substancialmente idênticas ao anticorpo de origem.

[00166] O termo "derivado" refere-se aos anticorpos covalentemente modificados por tais técnicas como ubiquitinação, conjugação com agentes terapêuticos ou de diagnósticos, marcação (por exemplo, com radionuclídeos ou várias enzimas), ligação de polímero covalente tal como pegilação (derivatização com polietileno glicol) e inserção ou substituição por síntese química de aminoácidos não-naturais.

[00167] Um anticorpo "humano" ou fragmento de anticorpo humano funcional é por este meio definido como um que não é quimérico ou "humanizado" e não de (ou ao todo ou em parte) uma espécie não- humana. Um anticorpo humano ou fragmento de anticorpo funcional podem ser derivados de um humano ou podem ser um anticorpo humano sintético. Um "anticorpo humano sintético" é definido aqui como um anticorpo tendo uma sequência derivada, ao todo ou em parte, in silico das sequências sintéticas que são com base na análise das sequências conhecidas de anticorpo humano. Projeto in silico de uma sequência de anticorpo humano ou seu fragmento pode ser alcançado, por exemplo, analisando uma base de dados das sequências de anticorpo humano ou de fragmento de anticorpo e inventando uma sequência de polipeptídeo que utiliza os dados obtidos dela. Outro exemplo de um anticorpo humano ou fragmento de anticorpo funcional é um que é codificado por um ácido nucleico isolado de uma biblioteca de sequências de anticorpo de origem humana (isto é, tal biblioteca sendo com base em anticorpos tirados de uma fonte natural humana). Exemplos de anticorpos humanos incluem anticorpos com base em n- CoDeR como descritos por Carlsson e Soderlind Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1), 102-108 (2001), Soderlin et al. Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000) e patente U. S. 6.989.250.

[00168] Um "anticorpo humanizado" ou fragmento de anticorpo humanizado funcional é definido aqui como um que é (i) derivado de uma fonte não-humana (por exemplo, um camundongo transgênico que carrega um sistema imune heterólogo), cujo anticorpo é com base em uma sequência de linhagem germinal humana; ou (ii) enxertado na CDR, em que as CDRs do domínio variável são de uma origem não- humana, enquanto uma ou mais estruturas do domínio variável são de origem humana e o domínio constante (se houver) é de origem humana.

[00169] A frase "anticorpo quimérico," como aqui usado, refere-se a um anticorpo contendo sequência derivada de dois anticorpos diferentes (vide, por exemplo, Patente U. S. 4.816.567) que tipicamente originam-se de espécies diferentes. Mais tipicamente, anticorpos quiméricos compreendem fragmentos de anticorpo humano e murino, em geral regiões constantes humanas e variáveis de camundongo.

[00170] Anticorpos "Human Engineered™" gerados alterando a sequência de origem de acordo com os métodos expostos em Studnicka et al., Patente U. S. 5.766.886 tal como o anticorpo representado pelas SEQ ID NOs 58, 61, 64, 67 e descritos no pedido de patente WO08/022295.

[00171] Um anticorpo da invenção pode ser derivado de uma biblioteca de genes de anticorpo recombinante. O desenvolvimento de tecnologias para fazer repertórios de genes de anticorpo humano recombinante, e a exibição dos fragmentos de anticorpo codificados na superfície de bacteriófago filamentoso, forneceu um meio recombinante para diretamente fazer e selecionar anticorpos humanos, que também podem ser aplicados a anticorpos humanizados, quiméricos, murinos ou de muteína. Os anticorpos produzidos por tecnologia de fago são produzidos como fragmentos de ligação de antígeno - usualmente fragmentos Fv ou Fab - em bactérias e desse modo são desprovidos das funções efetoras. Funções efetoras podem ser introduzidas por uma das duas estratégias: Os fragmentos ou podem ser engenheirados em anticorpos completos para expressão em células mamíferas, ou em fragmentos de anticorpos biespecíficos com um segundo sítio de ligação capaz de desencadear uma função efetora. Tipicamente, o fragmento Fd (VH-CH1) e cadeia leve (VL-CL) dos anticorpos é clonado separadamente de fortuito por PCR e recombinado em bibliotecas de exibição de fago combinatórias que podem ser depois selecionadas para ligar a um antígeno particular. Os fragmentos de Fab são expressados na superfície de fago, isto é, fisicamente ligados aos genes que os codificam. Desse modo, a seleção de Fab por ligação de antígeno cosseleciona para as sequências de codificação de Fab, que podem ser subsequentemente amplificadas. Por vários ciclos de ligação e reamplificação de antígeno, um procedimento denominado panning, Fab específico para o antígeno são enriquecidos e finalmente isolados.

[00172] Uma variedade de procedimentos foi descrita para derivar anticorpos humanos de bibliotecas de exibição de fago. Tais bibliotecas podem ser construídas em uma estrutura principal simples à qual diversas CDRs formadas in vivo (isto é, derivada de humano) são permitidas recombinar como descrito por Carlsson e Soderlind Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1), 102-108 (2001), Soderlin et al. Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000) e patente U. S. 6.989.250. Alternativamente, um tal biblioteca de anticorpo pode ser com base nas sequências de aminoácido que foram projetadas in silico e foram codificadas por ácidos nucleicos que são sinteticamente criados. Projeto in silico de uma sequência de anticorpo é alcançado, por exemplo, analisando uma base de dados de sequências humanas e projetando uma sequência de polipeptídeo que utiliza os dados obtidos dela. Métodos para projetar e obter sequências criadas in silico são descritos, por exemplo, em Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67; e patente U. S. 6.300.064. Para uma revisão das técnicas de exibição de fago, vide WO08/022295 (Novartis).

[00173] Alternativamente, um anticorpo desta invenção pode vir de animais. Um tal anticorpo pode ser humanizado ou Human Engenheired™ resumido em WO08/022295 (Novartis); um tal anticorpo pode vir de animais transgênicos [vide também WO08/022295 (Novartis)].

[00174] Como aqui usado, diferentes "formas" de antígeno, por exemplo PRLR, são por este meio definidas como moléculas de proteína diferentes que resultam de diferentes modificações translacionais e pós-translacionais, tais como, mas não limitadas a, diferenças em splicing da transcrição primária do receptor de prolactina, diferenças em glicosilação, e diferenças em clivagem proteolítica pós- translacional.

[00175] Como aqui usado, o termo "epítopo" inclui qualquer determinante de proteína capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Determinantes epitópicos usualmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou correntes laterais de açúcar e usualmente têm três características estruturais dimensionais específicas, como também características de carga específicas. Dois anticorpos são ditos "ligarem-se ao mesmo epítopo" se um anticorpo for mostrado competir com o segundo anticorpo em um ensaio de ligação competitiva, por qualquer um dos métodos bem conhecidos àqueles de habilidade na técnica, e se preferivelmente todos os aminoácidos do epítopo estiverem ligados pelos dois anticorpos.

[00176] O termo "anticorpos maduros" ou "fragmentos de ligação de antígeno maduros" tais como variantes de Fab maduras incluem derivados de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que exibem ligação mais forte - isto é, ligando com afinidade aumentada - a um antígeno dado tal como o domínio extracelular do PRLR. Maturação é o processo de identificar um número pequeno de mutações dentro das seis CDRs de um anticorpo ou fragmento de anticorpo levando a este aumento de afinidade. O processo de maturação é a combinação de métodos de biologia molecular para introdução de mutações no anticorpo e triagem para identificar os aglutinantes melhorados.

MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[00177] Métodos terapêuticos envolvem administrar a um sujeito em necessidade de uma quantidade terapeuticamente efetiva de tratamento de um anticorpo contemplado pela invenção. Uma quantidade "terapeuticamente efetiva" é por este meio definida como a quantidade de um anticorpo que é de quantidade suficiente para bloquear a proliferação de células PRLR-positivas em uma área tratada de um sujeito como uma dose simples ou de acordo com um regime de doses múltiplas, sozinho ou em combinação com ainda outros agentes, que leva ao alívio de uma condição adversa, ainda que a quantidade seja toxicologicamente tolerável. O sujeito pode ser um animal humano ou não-humano (por exemplo, coelho, rato, camundongo, macaco ou outro primata de ordem inferior).

[00178] Um anticorpo da invenção poderia ser coadministrado com medicamentos conhecidos, e em algumas circunstâncias o anticorpo pode ser modificado. Por exemplo, um anticorpo poderia ser conjugado com uma imunotoxina ou radioisótopo para potencialmente também aumentar a eficácia.

[00179] Os anticorpos inventivos podem ser usados como uma ferramenta terapêutica ou uma de diagnóstico em uma variedade de situações onde PRLR é de forma indesejável altamente expressado. Distúrbios e condições particularmente adequados para o tratamento com um anticorpo das invenções são endometriose, adenomiose, contracepção de fertilidade feminina não-hormonal, doença de mama benigna e mastalgia, inibição de lactação, hiperplasia de próstata benigna, fibroides, queda de cabelo hiper e normoprolactinêmica, e cotratamento em terapia hormonal combinada para inibir proliferação de células epiteliais mamárias.

[00180] Para tratar quaisquer dos distúrbios anteriores, as composições farmacêuticas para o uso de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de uma maneira convencional usando um ou mais veículos ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. Um anticorpo da invenção pode ser administrado por quaisquer meios adequados que pode variar dependendo do tipo de distúrbio sendo tratado. Possíveis rotas de administração incluem parenteral (por exemplo, intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, ou subcutânea), intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para tratamento imunossupressor local, administração intralesional. Além disso, um anticorpo da invenção poderia ser administrado através de infusão de pulso, com, por exemplo, diminuindo as doses do anticorpo. Preferivelmente, o doseamento é dado através de injeções, o mais preferivelmente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. A quantidade a ser administrada dependerá de uma variedade de fatores tais como os sintomas clínicos, peso do indivíduo, se outros fármacos são administrados. O artesão versado reconhecerá que a rota de administração variará, dependendo do distúrbio ou da condição a ser tratada.

[00181] Determinar uma quantidade terapeuticamente efetiva do novo polipeptídeo, de acordo com esta invenção, em grande parte dependerá das características de paciente particulares, da rota de administração, e da natureza do distúrbio sendo tratado. Orientação geral pode ser encontrada, por exemplo, nas publicações da International Conference on Harmonisation e em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, capítulos 27 e 28, págs. 484-528 (18a ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Mais especificamente, determinação de uma quantidade terapeuticamente efetiva dependerá de tais fatores como toxicidade e eficácia do medicamento. Toxicidade pode ser determinada usando métodos bem conhecidos na técnica e encontrados nas referências anteriores. Eficácia pode ser determinada utilizando a mesma orientação junto com os métodos descritos abaixo nos Exemplos.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E ADMINISTRAÇÃO

[00182] A presente invenção também diz respeito às composições farmacêuticas que podem compreender anticorpos de PRLR, sozinhos ou em combinação com pelo menos um outro agente, tal como composto estabilizante que pode ser administrado em qualquer veículo farmacêutico estéril, biocompatível incluindo, mas não limitado a, solução salina, solução salina tamponada, dextrose, e água. Qualquer uma destas moléculas pode ser administrada sozinha a um paciente, ou em combinação com outros agentes, fármacos ou hormônios, em composições farmacêuticas onde é misturada com excipiente(s) ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em uma modalidade da presente invenção, o veículo farmaceuticamente aceitável é farmaceuticamente inerte.

[00183] A presente invenção também diz respeito à administração de composições farmacêuticas. Tal administração é parenteralmente realizada. Métodos de liberação parenteral incluem administração tópica, intra-arterial (diretamente ao tumor), intramuscular, subcutânea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina ou intranasal. Além dos ingredientes ativos, estas composições farmacêuticas podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados que compreendem excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos ativos nas preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. Mais detalhes sobre as técnicas para formulação e administração podem ser encontrados na última edição de Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.).

[00184] Formulações farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas de compostos ativos. Para injeção, as composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou solução salina fisiologicamente tamponada. Suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetil celulose de sódio, sorbitol, ou dextrana. Adicionalmente, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[00185] Para administração tópica ou nasal, os penetrantes apropriados para a barreira particular a ser penetrada são usados na formulação. Tais penetrantes são em geral conhecidos na técnica.

[00186] A administração parenteral também compreende métodos de liberação parenteral que também incluem administração intra- arterial, intramuscular, subcutânea, intramedular, intratecal, e intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina, vaginal, ou intranasal.

KITS

[00187] A invenção ainda diz respeito aos pacotes farmacêuticos e kits que compreendem um ou mais recipientes enchidos com um ou mais dos ingredientes das composições da invenção acima mencionadas. Associado com tal(is) recipiente(s) pode ser uma nota na forma escrita por uma agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de farmacêuticos ou produtos biológicos, refletindo a aprovação pela agência da fabricação, uso ou venda do produto para administração humana.

[00188] Em outra modalidade, os kits podem conter sequências de DNA que codificam os anticorpos da invenção. Preferivelmente as sequências de DNA que codificam estes anticorpos são providas em um plasmídeo adequado para transfecção e expressão por uma célula hospedeira. O plasmídeo pode conter um promotor (frequentemente um promotor induzível) para regular a expressão do DNA na célula hospedeira. O plasmídeo pode também conter sítios de restrição apropriados para facilitar a inserção de outras sequências de DNA no plasmídeo para produzir vários anticorpos. Os plasmídeos podem também conter numerosos outros elementos para facilitar a clonagem e expressão das proteínas codificadas. Tais elementos são bem conhecidos àqueles de habilidade na técnica e incluem, por exemplo, marcadores selecionáveis, códons de iniciação, códons de terminação, e outros.

FABRICAÇÃO E ARMAZENAMENTO

[00189] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas de uma maneira que é conhecida na técnica, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, em drágeas, pulverização, emulsificação, encapsulação, captura ou liofilização.

[00190] A composição farmacêutica pode ser fornecida como um pó liofilizado em 1 mM-50 mM de histidina, 0,1%-2% de sacarose, 2%-7% de manitol a uma faixa de pH de 4,5 a 5,5 que é combinada com tampão antes do uso.

[00191] Após as composições farmacêuticas compreendendo um composto da invenção formulado em um veículo aceitável terem sido preparadas, elas podem ser colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento de uma condição indicada. Para administração dos anticorpos de PRLR, tal rótulo incluiria quantidade, frequência e método de administração.

DOSE TERAPEUTICAMENTE EFETIVA

[00192] As composições farmacêuticas adequadas para o uso na presente invenção incluem composições em que os ingredientes ativos são contidos em uma quantidade efetiva para alcançar o propósito intencionado, isto é, tratamento de um estado de doença particular caracterizado por expressão de PRLR. A determinação de uma dose efetiva está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica.

[00193] Para qualquer composto, a dose terapeuticamente efetiva pode ser inicialmente estimada em ensaios de cultura de célula, por exemplo, células de linfoma, ou em modelos animais, usualmente camundongos, ratos, coelhos, cachorros, porcos ou macacos. O modelo animal é também usado para alcançar uma faixa de concentração desejável e a rota de administração. Tal informação pode ser depois usada para determinar as doses úteis e rotas para administração em humanos.

[00194] Uma dose terapeuticamente efetiva refere-se àquela quantidade de proteína ou seus anticorpos, antagonistas, ou inibidores que melhoram os sintomas ou a condição. Eficácia terapêutica e toxicidade de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrões em culturas de célula ou animais experimentais, por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamente efetiva em 50% da população) e LD50 (a dose letal a 50% da população). A razão de dose entre os efeitos terapêuticos e tóxicos é o índice terapêutico, e pode ser expresso como a razão, ED50/LD50. Composições farmacêuticas que exibem índice terapêutico grande são preferidas. Os dados obtidos dos ensaios de cultura de célula e estudos em animais são usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso humano. A dosagem de tais compostos fica preferivelmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que inclui a ED50 com pequena ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada, sensibilidade do paciente, e da rota de administração.

[00195] A dosagem exata é escolhida pelo médico em vista do paciente a ser tratado. A dosagem e administração são ajustadas para fornecer níveis suficientes da metade ativa ou manter o efeito desejado. Fatores adicionais que podem ser levados em conta incluem a severidade do estado de doença, por exemplo, tamanho e localização das lesões endometrióticas; idade, peso e gênero do paciente; dieta, tempo e frequência de administração, combinação(ões) de fármaco, sensibilidades de reação, e tolerância/resposta à terapia. Composições farmacêuticas de ação longa poderiam ser administradas a cada 3 a 4 dias, toda semana, ou uma vez a cada duas semanas, ou uma vez dentro de um mês dependendo da meia-vida e da taxa de depuração da formulação particular.

[00196] Quantidades de dosagem normais podem variar de 0,1 a 100.000 microgramas, até uma dose total de cerca de 2 g, dependendo da rota de administração. Orientação sobre dosagens particulares e métodos de liberação é fornecida na literatura. Vide US 4.657.760; US 5.206.344; ou US 5.225.212. Aqueles versados na técnica empregarão formulações diferentes para polinucleotídeos que para proteínas ou seus inibidores. Similarmente, a liberação de polinucleotídeos ou polipeptídeos será específica às células, condições, localizações particulares, etc. Atividades específicas preferidas para um anticorpo radiomarcado pode variar de 0,1 a 10 mCi/mg de proteína (Riva et al., Clin. Cancer Res. 5:3275s-3280s, 1999; Wong et al., Clin. Cancer Res. 6:3855-3863, 2000; Wagner et al., J. Med Nuclear. 43:267-272, 2002).

[00197] A presente invenção é ainda descrita pelos exemplos a seguir. Os exemplos são fornecidos para unicamente ilustrar a invenção em referência às modalidades específicas. Estas exemplificações, ilustrando certos aspectos específicos da invenção, não retratam as limitações ou circunscrevem o escopo da invenção revelada.

[00198] Todos os exemplos foram realizados usando técnicas padrões que são bem conhecidas e rotina para aqueles de habilidade na técnica, exceto onde do contrário descrito em detalhes. Técnicas de biologia molecular rotineiras dos exemplos seguintes podem ser realizadas como descritas nos manuais de laboratório padrões, tais Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00199] Figura 1: Expressão de prolactina-mRNA (PRL-mRNA) (analisada através de análise de PCR de TaqMan em tempo real) em endométrio humano e lesões (tecido ectópico) das mulheres saudáveis e mulheres que sofrem de endometriose.

[00200] Figura 2: Expressão de receptor de prolactina-mRNA (PRLR- mRNA) (analisada por análise de PCR de TaqMan em tempo real) em endométrio humano e lesões (tecido ectópico) das mulheres saudáveis e mulheres que sofrem de endometriose.

[00201] Figura 3: Análise de Northern blot da expressão gênica de PRLR em tecidos de rato. Expressão gênica do PRLR revelou expressão alta na placenta e próstata.

[00202] Figura 4: Análise de western blot da expressão de PRLR em próstatas de rato tratadas com diferentes hormônios. Tratamento de estradiol de ratos intactos e castração levam a uma suprarregulação de proteína de PRLR em próstatas de rato enquanto que o tratamento de diidrotestosterona de ratos intactos não teve nenhum impacto na expressão de PRLR na próstata comparada ao tratamento de veículo de animais intactos.

[00203] Figura 5: Inibição da proliferação de células Ba/F (= Baf) ativada por prolactina (estavelmente expressando o PRLR humano) neutralizando os anticorpos de PRLR e anticorpos de controle não específicos. Os valores de IC50 foram determinados para os seguintes anticorpos em formato de IgG1: 005-C04 (círculos cheios): 1,29 μg/ml = 8,6 nM; 006-H08 (círculos vazios): 0,15 μg/ml =1 nM; HE06.642 (triângulos cheios): 0,34 μg/ml = 2,2 nM; 002-H06 (triângulos vazios): 0,54 μg/ml = 3,6 nM; 002-H08 (quadrados cheios): 0,72 μg/ml = 4,8 nM; anticorpo de controle não específico (quadrados vazios): nenhuma inibição de proliferação celular.

[00204] Figura 6: Inibição de proliferação de células de linfoma de rato induzida por prolactina (células NB2) por anticorpos neutralizantes de PRLR e anticorpos de controle não específicos. Os valores de IC50 seguintes foram determinados: XHA06.642 (círculos cheios): 10 μg/ml = 67 nM; XHA06.983 (círculos vazios): nenhum efeito na proliferação de células de linfoma de rato; anticorpo de controle não específico (triângulo cheio): nenhum efeito em 10 μg/ml.

[00205] Figura 7: Inibição da fosforilação de STAT5 estimulada por prolactina em células T47D por anticorpos neutralizantes de PRLR e anticorpo de controle não específico.

[00206] O anticorpo de controle não específico (FITC) não inibe a fosforilação de STAT5 em células T47D. Em contraste os anticorpos XHA06.642, 005-C04 (= IgG1 005-C04), e 006-H08 (= IgG1 006-H08) inibem a fosforilação de STAT5 de uma maneira dose-dependente em células T47D.

[00207] Figura 8: Efeitos dos anticorpos neutralizantes de PRLR e controles não específicos em atividade ativada por prolactina de gene repórter de luciferase usando células HEK293 estavelmente transfeccionadas com o receptor da prolactina humano (hPRLR) e transientemente expressando o gene de luciferase sob o controle de elementos de resposta de hormônio lactogênico (LHREs). Os valores de IC50 foram determinados para os seguintes anticorpos em formato de IgG1: 006-H08 (círculos cheios): 0,83 μg/ml = 5,5 nM; HE06.642 (círculos vazios): 0,63 μg/ml = 4,2 nM; anticorpo de controle não específico (triângulo cheio): nenhuma inibição de atividade de luciferase.

[00208] Figura 9: Efeitos dos anticorpos neutralizantes de PRLR e controles não específicos em atividade ativada por prolactina de gene repórter de luciferase usando células HEK293 estavelmente transfeccionadas com o receptor de prolactina murino (mPRLR) e transientemente expressando o gene de luciferase sob o controle de elementos de resposta de hormônio lactogênico (LHREs). Os valores de IC50 foram determinados para os seguintes anticorpos em formato de IgG1: 005-C04 (triângulos cheios): 0,45 μg/ml = 3 nM; XHA06.642 (círculos cheios): > 50 μg/ml > 333 nM, anticorpo de controle não específico (círculos vazios): nenhuma inibição da atividade de luciferase.

[00209] Figura 10: Inibição de proliferação de células Ba/F (= Baf) ativada por prolactina (estavelmente expressando o receptor de prolactina murino) por anticorpos neutralizantes do receptor da prolactina e anticorpos de controle não específicos. Os valores de IC50 foram determinados para os seguintes anticorpos em formato de IgG1: anticorpo de FITC não específico (quadrados cheios): nenhuma inibição de proliferação celular; HE06.642 (círculos cheios): > > 30 μg/ml > 200 nM; 001-E06 (círculos vazios): 43,7 μg/ml = 291 nM; 001-D07 (triângulos cheios): 16,5 μg/ml = 110 nM; 005-C04 (triângulos vazios): 0,74 μg/ml = 4,9 nM.

[00210] Figura 11: Taxas de gravidez e tamanho médio da ninhada em camundongos fêmeas tratados com solução salina tamponada de fosfato (= veículo), anticorpo de controle não específico (FITC IgG1) ou anticorpo neutralizante IgG1 005-C04 (=005-C04). Taxas de gravidez foram 87,5% (fêmeas tratadas com veículo), 75% (fêmeas tratadas com 10 mg/kg de anticorpo não específico), 100% (fêmeas tratadas com 10 mg/kg de IgG1 005-C04), e 0% (fêmeas tratadas com 30 mg/kg de IgG1 005-C04). Tamanho médio da ninhada foi 10,9 animais (fêmeas tratadas com veículo), 12,3 animais (fêmeas tratadas com 10 mg/kg de anticorpo não específico), 13 animais (fêmeas tratadas com 10 mg/kg de IgG1 005-C04) e 0 animais (fêmeas tratadas com 30 mg/kg de IgG1 005- C04).

[00211] Figura 12: Numeração de Kabat das posições de aminoácido da estrutura de acordo com Johnson e Wu (Nucleic Acids Res. 2000, 28, 214-218).

[00212] Figura 13: Resultados da análise de FACS com anticorpos de anti-PRLR selecionados (005-C04, 001-E06, HE06642). Ligação dos anticorpos foi determinada a uma concentração fixa em células HEK293 expressando para o PRLR humano e para camundongo em comparação à linhagem celular parental não expressando PRLR.

[00213] Figura 14A: Ganho de peso da ninhada durante cada dia pós-parto expresso como porcentagem de peso da ninhada obtida no dia pós-parto 1. Ganho de peso das ninhadas de mães sem tratar (círculos cheios), de mães tratadas com 10 mg/kg de anticorpo não específico de IgG2a murina (círculos vazios), e de mães tratadas com o anticorpo neutralizante 005-C04 contendo domínios constantes de IgG2a murina (= IgG2a 005-C04) a 10 mg/kg (triângulos cheios) e a 30 mg/kg (triângulos vazios) são mostrados. As setas indicam dias nos quais a injeção de anticorpo foi executada. Há uma redução significativa no ganho de peso das ninhadas de mães tratadas com 30 mg/kg de IgG2a 005-C04 a partir do dia pós-parto 8 em diante.

[00214] Figura 14B: Ganho de peso incremental da ninhada expresso a cada dia como porcentagem de peso da ninhada no dia pós- parto 1. Resultados das ninhadas de mães sem tratar (círculos cheios), das mães tratadas com 10 mg/kg de anticorpo não específico de IgG2a murina (círculos vazios), das mães tratadas com o anticorpo neutralizante 005-C04 contendo domínios constantes de IgG2a murina (= IgG2a 005-C04) a 10 mg/kg (triângulos cheios) e a 30 mg/kg (triângulos vazios) são mostrados. Basicamente, a Figura 14A apresenta o declive dos gráficos mostrados na Figura 14A. Diariamente ganho de peso nas ninhadas das mães sem tratar e mães tratadas com 10 mg/kg de anticorpo não específico oscila 30% do peso da ninhada por redor do dia pós-parto 1. Em contraste, o tratamento de mães com 30 mg/kg de IgG2a 005-C04 leva a uma redução significativa no ganho de peso a partir do dia 7 em diante (*p < 0,05; ***p < 0,005 vs. ninhadas de mães tratadas com anticorpo não específico) enquanto que o tratamento com 10 mg/kg de IgG2a 005-C04 leva a uma redução significativa no ganho de peso diário a partir do dia 11 em diante (p < 0,05 vs. ninhadas de mães tratadas com anticorpo não específico). As setas indicam dias de aplicação do anticorpo.

[00215] Figura 14C: Seções histológicas das glândulas mamárias de mães lactantes. Glândulas mamárias de mães sem tratar ou mães tratadas com anticorpo não específico estão cheias com dutos de produção de leite. Em contraste, involução da glândula mamária, comprovada pelo aparecimento de ilhas de gordura (setas pretas), é induzida de modo dose-dependente pelo anticorpo neutralizante de IgG2a 005-C04.

[00216] Figura 14D: Expressão da proteína de leite em glândulas mamárias de mães lactantes. Expressão das proteínas de leite caseína beta (Csn-2), proteína de soro acídica (WAP), e IGF-1 é reduzida de uma maneira dose-dependente em mães tratadas com anticorpo neutralizante de PRLR IgG2a 005-C04, mas não com anticorpos não específicos. Expressão gênica foi normalizada na expressão da proteína de ligação de caixa TATA (TBP).

[00217] Figura 15A: Formação de ramificações laterais e estruturas alveolares iguais em um modelo de camundongo hiperprolactinêmico de doença de mama benigna. O anticorpo de PRLR neutralizante IgG1 005-C04 (= 005-C04) inibe ramificação lateral e a formação de estruturas alveolares iguais a 10 e 30 mg/kg em camundongos que receberam um isoenxerto pituitário.

[00218] Figura 15B: Extensão de hiperplasia epitelial e proliferação de célula epitelial em um modelo de camundongo hiperprolactinêmico de doença de mama benigna. Algumas células BrdU-positivas são marcadas através de setas brancas. O anticorpo de PRLR neutralizante IgG1 005-C04 (= 005-C04) bloqueia hiperplasia epitelial e a proliferação de células epiteliais na glândula mamária.

[00219] Figura 15C: Extensão da fosforilação de STAT5 em um modelo de camundongo hiperprolactinêmico de doença de mama benigna. Algumas células fosfo-STAT5-positivas são indicadas através de setas brancas. O anticorpo de PRLR neutralizante IgG1 005-C04 (= 005-C04) bloqueia completamente a fosforilação de STAT5 quando aplicado a uma dosagem de 30 mg/kg.

[00220] Figura 16: Inibição de crescimento de próstata pelo anticorpo de PRLR neutralizante 005-C04 contendo domínios constantes de IgG2a murina (= IgG2a 005-C04). Isoenxerto pituitário estimula o crescimento da próstata em comparação aos camundongos pseudo- operados sem tratar. Tratamento com anticorpos neutralizantes de PRLR em doses de 10 mg/kg e em doses de 30 mg/kg inibe crescimento da próstata (*** p < 0,005 vs. camundongos sem tratar, pseudo- operados).

[00221] Figura 17: Anticorpos neutralizantes de PRLR estimulam crescimento de pêlo na presença de hiperprolactinemia. Fotografias foram tiradas três semanas após isoenxerto pituitário (e raspagem) de camundongos machos usados nos experimentos descritos no Exemplo 17 e na Figura 16. Hiperprolactinemia inibe recrescimento de pêlo nas áreas raspadas. Anticorpos de PRLR neutralizantes, mas não anticorpos não específicos estimulam recrescimento de pêlo sob condições hiperprolactinêmicas em doses de 10 e 30 mg/kg de 005-C04 (= IgG2a 005-C04).

[00222] Figura 18: Anticorpos neutralizantes de PRLR mas não anticorpos não específicos estimulam recrescimento de pêlo em áreas raspadas em camundongos machos e fêmeas hiper e normoprolactinêmicos (Exemplo 18). Anticorpos de PRLR neutralizantes são, portanto, adequados para o tratamento de queda de pêlo sob condições normo e hiperprolactinêmicas em homens (Figura 18 B) e mulheres (Figura 18A).

[00223] Figura 19: Anticorpos neutralizantes de PRLR mas não anticorpos de controle não específicos inibem a proliferação intensificada de células epiteliais na glândula mamária após terapia hormonal combinada, isto é, terapia combinada de estrogênio mais progestina.

[00224] O número absoluto de células epiteliais ductais proliferativas dentro de 4 cortes transversais da glândula mamária foi avaliado e as médias são descritas como barras horizontais dentro da figura. Proliferação das células epiteliais em camundongos ovariectomizados, tratados com veículo é bastante baixa (média = 0). Tratamento com estradiol leva a alguma estimulação da proliferação das células epiteliais (média = 9), proliferação de células epiteliais mamárias máxima é observada sob tratamento de estrogênio mais progesterona (média = 144). Tratamento com receptor da prolactina de anticorpo neutralizante 005-C04 (média = 84 após o tratamento com 10 mg/kg 005-C04; média = 27 após o tratamento com 30 mg/kg 005-C04) mas não com anticorpo de controle não específico (média = 154) leva a uma diminuição dose- dependente na proliferação de células epiteliais mamárias quase de volta aos níveis de estradiol apenas.

[00225] Anticorpos neutralizantes de PRLR são, portanto, adequados para tratar proliferação intensificada de células epiteliais mamárias sob terapia hormonal combinada, isto é, tratamento de estradiol mais progesterona.

[00226] Figura 20: Anticorpos neutralizantes de PRLR mas não anticorpos de controle não específicos inibem endometriose interna em camundongos. Os resultados são descritos como contagens de doença como descrito no Exemplo 20. A contagem de doença média para cada grupo experimental é indicada como uma barra horizontal. Camundongos normoprolactinêmicos desenvolvem endometriose interna até certo ponto (contagem de doença média = 0,25). Hiperprolactinemia devido ao isoenxerto pituitário intensifica a contagem de doença e mais animais sofrem da doença (contagem de doença média = 2,5). Enquanto o tratamento com 30 mg/kg de anticorpo não específico uma vez (contagem média = 2,5) ou duas vezes (contagem média = 2) por semana não teve nenhuma influência na doença, o tratamento com anticorpos neutralizantes específicos mostra uma diminuição dose-dependente da quantidade de animais doentes; a contagem de doença média em todos os casos em que o anticorpo específico foi usado foi zero. Notavelmente, todos os animais que recebem 10 ou 30 mg/kg de anticorpo específico duas vezes por semana ficam completamente curados e sua contagem de doença foi significativamente inferior à contagem de doença dos camundongos normoprolactinêmicos. Anticorpos neutralizantes de PRLR são, portanto, adequados para tratar endometriose interna (= úteros de adenomiose) e endometriose externa em mulheres.

[00227] FIGURA 21: Testes de ligação de variantes de Fab 006-H08 maduras usando ensaio homogêneo de fluorescência resolvida no tempo (HTRF):

[00228] Sobrenadantes de E. coli contendo Fab foram testados para ligação ao domínio extracelular do PRLR humano por meio de competição com as moléculas de IgG1 de 006-H08. A figura ilustra a ligação das variantes de Fab como um diagrama de barras. As intensidades de sinal (a 665 nM) em cinco tempos de incubação diferentes são dadas no eixo y, os nomes das variantes de Fab no eixo x. Sinais inferiores comparados ao Fab de controle 006-H08 em um ponto de tempo dado indicam ligação melhorada ao PRLR. Todo os Fabs listados na Parte 1 representam aglutinantes melhorados, enquanto na parte 2 são mostrados aglutinantes melhorados como também alguns não-melhoraram.

[00229] SEQ ID NO: 1 representa sequência de aminoácido de HCDR1, 006-H08

[00230] SEQ ID NO: 2 representa sequência de aminoácido de HCDR1, 002-H06

[00231] SEQ ID NO: 3 representa sequência de aminoácido de HCDR1, 002-H08

[00232] SEQ ID NO: 4 representa sequência de aminoácido de HCDR1, 006-H07

[00233] SEQ ID NO: 5 representa sequência de aminoácido de HCDR1, 001-E06

[00234] SEQ ID NO: 6 representa sequência de aminoácido de HCDR1, 005-C04

[00235] SEQ ID NO: 7 representa sequência de aminoácido de HCDR2, 006-H08

[00236] SEQ ID NO: 8 representa sequência de aminoácido de HCDR2, 002-H06

[00237] SEQ ID NO: 9 representa sequência de aminoácido de HCDR2, 002-H08

[00238] SEQ ID NO: 10 representa sequência de aminoácido de HCDR2, 006-H07

[00239] SEQ ID NO: 11 representa sequência de aminoácido de HCDR2, 001-E06

[00240] SEQ ID NO: 12 representa sequência de aminoácido de HCDR2, 005-C04

[00241] SEQ ID NO: 13 representa sequência de aminoácido de HCDR3, 006-H08, 002-H06

[00242] SEQ ID NO: 14 representa sequência de aminoácido de HCDR3, 002-H08

[00243] SEQ ID NO: 15 representa sequência de aminoácido de HCDR3, 006-H07

[00244] SEQ ID NO: 16 representa sequência de aminoácido de HCDR3, 001-E06

[00245] SEQ ID NO: 17 representa sequência de aminoácido de HCDR3, 005-C04

[00246] SEQ ID NO: 18 representa sequência de aminoácido de LCDR1, 006-H08

[00247] SEQ ID NO: 19 representa sequência de aminoácido de LCDR1, 002-H06

[00248] SEQ ID NO: 20 representa sequência de aminoácido de LCDR1, 002-H08

[00249] SEQ ID NO: 21 representa sequência de aminoácido de LCDR1, 006-H07

[00250] SEQ ID NO: 22 representa sequência de aminoácido de LCDR1, 001-E06

[00251] SEQ ID NO: 23 representa sequência de aminoácido de LCDR1, 005-C04

[00252] SEQ ID NO: 24 representa sequência de aminoácido de LCDR2, 006-H08, 002-H08

[00253] SEQ ID NO: 25 representa sequência de aminoácido de LCDR2, 002-H06

[00254] SEQ ID NO: 26 representa sequência de aminoácido de LCDR2, 006-H07

[00255] SEQ ID NO: 27 representa sequência de aminoácido de LCDR2, 001-E06

[00256] SEQ ID NO: 28 representa sequência de aminoácido de LCDR2, 005-C04

[00257] SEQ ID NO: 29 representa sequência de aminoácido de LCDR3, 006-H08

[00258] SEQ ID NO: 30 representa sequência de aminoácido de LCDR3, 002-H06, 001-E06

[00259] SEQ ID NO: 31 representa sequência de aminoácido de LCDR3, 002-H08

[00260] SEQ ID NO: 32 representa sequência de aminoácido de LCDR3, 006-H07

[00261] SEQ ID NO: 33 representa sequência de aminoácido de LCDR3, 005-C04

[00262] SEQ ID NO: 34 representa sequência de aminoácido de VH, 006-H08

[00263] SEQ ID NO: 35 representa sequência de aminoácido de VH, 002-H06

[00264] SEQ ID NO: 36 representa sequência de aminoácido de VH, 002-H08

[00265] SEQ ID NO: 37 representa sequência de aminoácido de VH, 006-H07

[00266] SEQ ID NO: 38 representa sequência de aminoácido de VH, 001-E06

[00267] SEQ ID NO: 39 representa sequência de aminoácido de VH, 005-C04

[00268] SEQ ID NO: 40 representa sequência de aminoácido de VL, 006-H08

[00269] SEQ ID NO: 41 representa sequência de aminoácido de VL, 002-H06

[00270] SEQ ID NO: 42 representa sequência de aminoácido de VL, 002-H08

[00271] SEQ ID NO: 43 representa sequência de aminoácido de VL, 006-H07

[00272] SEQ ID NO: 44 representa sequência de aminoácido de VL, 001-E06

[00273] SEQ ID NO: 45 representa sequência de aminoácido de VL, 005-C04

[00274] SEQ ID NO: 46 representa sequência de ácido nucleico VH, 006-H08

[00275] SEQ ID NO: 47 representa sequência de ácido nucleico VH, 002-H06

[00276] SEQ ID NO: 48 representa sequência de ácido nucleico VH, 002-H08

[00277] SEQ ID NO: 49 representa sequência de ácido nucleico VH, 006-H07

[00278] SEQ ID NO: 50 representa sequência de ácido nucleico VH, 001-E06

[00279] SEQ ID NO: 51 representa sequência de ácido nucleico VH, 005-C04

[00280] SEQ ID NO: 52 representa sequência de ácido nucleico VL, 006-H08

[00281] SEQ ID NO: 53 representa sequência de ácido nucleico VL, 002-H06

[00282] SEQ ID NO: 54 representa sequência de ácido nucleico VL, 002-H08

[00283] SEQ ID NO: 55 representa sequência de ácido nucleico VL, 006-H07

[00284] SEQ ID NO: 56 representa sequência de ácido nucleico VL, 001-E06

[00285] SEQ ID NO: 57 representa sequência de ácido nucleico VL, 005-C04

[00286] SEQ ID NO: 58 representa sequência de aminoácido de VH, HE06642, Novartis (WO2008/22295)

[00287] SEQ ID NO: 59 representa sequência de aminoácido de VH, XHA06642, Novartis (WO2008/22295)

[00288] SEQ ID NO: 60 representa sequência de aminoácido de VH, XHA06983, Novartis (WO2008/22295)

[00289] SEQ ID NO: 61 representa sequência de aminoácido de VL, HE06642

[00290] SEQ ID NO: 62 representa sequência de aminoácido de VL, XHA06642 Novartis (WO2008/22295)

[00291] SEQ ID NO: 63 representa sequência de aminoácido de VL, XHA06983 Novartis (WO2008/22295)

[00292] SEQ ID NO: 64 representa sequência de ácido nucleico VH, HE06642

[00293] SEQ ID NO: 65 representa sequência de ácido nucleico VH, XHA06642 Novartis (WO2008/22295)

[00294] SEQ ID NO: 66 representa sequência de ácido nucleico VH, XHA06983 Novartis (WO2008/22295)

[00295] SEQ ID NO: 67 representa sequência de ácido nucleico VL, HE06642

[00296] SEQ ID NO: 68 representa sequência de ácido nucleico VL, XHA06642, Novartis (WO2008/22295)

[00297] SEQ ID NO: 69 representa sequência de ácido nucleico VL, XHA06983, Novartis (WO2008/22295)

[00298] SEQ ID NO: 70 representa ECD_PRLR humano, posição de aminoácido 1 - 210, domínio de S1 1-100 (construção de domínio S1 1- 102), domínio de S2 101-210

[00299] SEQ ID NO: 71 representa o ECD_PRLR humano de CDS, posição de nucleotídeo 1-630

[00300] SEQ ID NO: 72 representa ECD_PRLR murino, posição de aminoácido 1 - 210

[00301] SEQ ID NO: 73 representa o ECD_PRLR murino de CDS, posição de nucleotídeo 1-630

[00302] SEQ ID NO: 74: representa HCDR2, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00303] SEQ ID NO: 75 representa HCDR2, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00304] SEQ ID NO: 76 representa HCDR2, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00305] SEQ ID NO: 77 representa HCDR2, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00306] SEQ ID NO: 78 representa LCDR1, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00307] SEQ ID NO: 79 representa LCDR1, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00308] SEQ ID NO: 80 representa LCDR1, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00309] SEQ ID NO: 81 representa LCDR1, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00310] SEQ ID NO: 82 representa LCDR1, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00311] SEQ ID NO: 83 representa LCDR1, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00312] SEQ ID NO: 84 representa LCDR1, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00313] SEQ ID NO: 85 representa LCDR1, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00314] SEQ ID NO: 86 representa LCDR1, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00315] SEQ ID NO: 87 representa LCDR1, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00316] SEQ ID NO: 88 representa LCDR1, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00317] SEQ ID NO: 89 representa LCDR1, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00318] SEQ ID NO: 90 representa LCDR3, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00319] SEQ ID NO: 91 representa LCDR3, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00320] SEQ ID NO: 92 representa LCDR3, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00321] SEQ ID NO: 93 representa LCDR3, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00322] SEQ ID NO: 94 representa LCDR3, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00323] SEQ ID NO: 95 representa LCDR3, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00324] SEQ ID NO: 96 representa LCDR3, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00325] SEQ ID NO: 97 representa LCDR3, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00326] SEQ ID NO: 98 representa LCDR3, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00327] SEQ ID NO: 99 representa LCDR3, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00328] SEQ ID NO: 100 representa LCDR3, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00329] SEQ ID NO: 101 representa LCDR3, variantes maduras de 006-H08, sequência de aminoácido

[00330] SEQ ID NO: 143 representa VH, 006-H08-12-2, sequência de aminoácido

[00331] SEQ ID NO: 144 representa VH, 006-H08-13-2, sequência de aminoácido

[00332] SEQ ID NO: 145 representa VH, 006-H08-13-6-1, sequência de aminoácido

[00333] SEQ ID NO: 146 representa VH, 006-H08-14-6-0, sequência de aminoácido

[00334] SEQ ID NO: 147 representa VH, 006-H08-15-5, sequência de aminoácido

[00335] SEQ ID NO: 148 representa VH, 006-H08-19-1, sequência de aminoácido

[00336] SEQ ID NO: 149 representa VH, 006-H08-29-1, sequência de aminoácido

[00337] SEQ ID NO: 150 representa VH, 006-H08-32-2, sequência de aminoácido

[00338] SEQ ID NO: 151 representa VH, 006-H08-33-0, sequência de aminoácido

[00339] SEQ ID NO: 152 representa VH, 006-H08-33-16-0, sequência de aminoácido

[00340] SEQ ID NO: 153 representa VH, 006-H08-35-17-1, sequência de aminoácido

[00341] SEQ ID NO: 154 representa VH, 006-H08-35-17-4, sequência de aminoácido

[00342] SEQ ID NO: 155 representa VH, 006-H08-35-1, sequência de aminoácido

[00343] SEQ ID NO: 156 representa VH, 006-H08-36-17-0, sequência de aminoácido

[00344] SEQ ID NO: 157 representa VH, 006-H08-37-19-0, sequência de aminoácido

[00345] SEQ ID NO: 158 representa VH, 006-H08-39-7, sequência de aminoácido

[00346] SEQ ID NO: 159 representa VH, 006-H08-48-5, sequência de aminoácido

[00347] SEQ ID NO: 160 representa VH, 006-H08-53-27-0, sequência de aminoácido

[00348] SEQ ID NO: 161 representa VH, 006-H08-59-30-0, sequência de aminoácido

[00349] SEQ ID NO: sequência de aminoácido 162 representa VH, 006-H08-63-32-4,

[00350] SEQ ID NO: sequência de aminoácido 163 representa VH, 006-H08-65-33-2,

[00351] SEQ ID NO: sequência de aminoácido 164 representa VH, 006-H08-68-35-2,

[00352] SEQ ID NO: 165 representa VL, 006-H08-12-2, sequência de aminoácido

[00353] SEQ ID NO: 166 representa VL, 006-H08-13-2, sequência de aminoácido

[00354] SEQ ID NO: 167 representa VL, 006-H08-13-6-1, sequência de aminoácido

[00355] SEQ ID NO: 168 representa VL, 006-H08-14-6-0, sequência de aminoácido

[00356] SEQ ID NO: 169 representa VL, 006-H08-15-5, sequência de aminoácido

[00357] SEQ ID NO: 170 representa VL, 006-H08-19-1, sequência de aminoácido

[00358] SEQ ID NO: 171 representa VL, 006-H08-29-1, sequência de aminoácido

[00359] SEQ ID NO: 172 representa VL, 006-H08-32-2, sequência de aminoácido

[00360] SEQ ID NO: 173 representa VL, 006-H08-33-0, sequência de aminoácido

[00361] SEQ ID NO: sequência de aminoácido 174 representa VL, 006-H08-33-16-0,

[00362] SEQ ID NO: 175 representa VL, 006-H08-35-17-1, sequência de aminoácido

[00363] SEQ ID NO: 176 representa VL, 006-H08-35-17-4, sequência de aminoácido

[00364] SEQ ID NO: 177 representa VL, 006-H08-35-1, sequência de aminoácido

[00365] SEQ ID NO: 178 representa VL, 006-H08-36-17-0, sequência de aminoácido

[00366] SEQ ID NO: 179 representa VL, 006-H08-37-19-0, sequência de aminoácido

[00367] SEQ ID NO: 180 representa VL, 006-H08-39-7, sequência de aminoácido

[00368] SEQ ID NO: 181 representa VL, 006-H08-48-5, sequência de aminoácido

[00369] SEQ ID NO: 182 representa VL, 006-H08-53-27-0, sequência de aminoácido

[00370] SEQ ID NO: sequência de aminoácido 183 representa VL, 006-H08-59-30-0,

[00371] SEQ ID NO: sequência de aminoácido 184 representa VL, 006-H08-63-32-4,

[00372] SEQ ID NO: sequência de aminoácido 185 representa VL, 006-H08-65-33-2,

[00373] SEQ ID NO: sequência de aminoácido 186 representa VL, 006-H08-68-35-2,

[00374] SEQ ID NO: 331 representa VH, 006-H08-12-2, sequência de ácido nucleico

[00375] SEQ ID NO: 332 representa VH, 006-H08-13-2, sequência de ácido nucleico

[00376] SEQ ID NO: 333 representa VH, 006-H08-13-6-1, sequência de ácido nucleico

[00377] SEQ ID NO: 334 representa VH, 006-H08-14-6-0, sequência de ácido nucleico

[00378] SEQ ID NO: 335 representa VH, 006-H08-15-5, sequência de ácido nucleico

[00379] SEQ ID NO: 336 representa VH, 006-H08-19-1, sequência de ácido nucleico

[00380] SEQ ID NO: 337 representa VH, 006-H08-29-1, sequência de ácido nucleico

[00381] SEQ ID NO: 338 representa VH, 006-H08-32-2, sequência de ácido nucleico

[00382] SEQ ID NO: 339 representa VH, 006-H08-33-0, sequência de ácido nucleico

[00383] SEQ ID NO: 340 representa VH, 006-H08-33-16-0, sequência de ácido nucleico

[00384] SEQ ID NO: 341 representa VH, 006-H08-35-17-1, sequência de ácido nucleico

[00385] SEQ ID NO: 342 representa VH, 006-H08-35-17-4, sequência de ácido nucleico

[00386] SEQ ID NO: 343 representa VH, 006-H08-35-1, sequência de ácido nucleico

[00387] SEQ ID NO: 344 representa VH, 006-H08-36-17-0, sequência de ácido nucleico

[00388] SEQ ID NO: 345 representa VH, 006-H08-37-19-0, sequência de ácido nucleico

[00389] SEQ ID NO: 346 representa VH, 006-H08-39-7, sequência de ácido nucleico

[00390] SEQ ID NO: 347 representa VH, 006-H08-48-5, sequência de ácido nucleico

[00391] SEQ ID NO: 348 representa VH, 006-H08-53-27-0, sequência de ácido nucleico

[00392] SEQ ID NO: 349 representa VH, 006-H08-59-30-0, sequência de ácido nucleico

[00393] SEQ ID NO: 350 representa VH, 006-H08-63-32-4, sequência de ácido nucleico

[00394] SEQ ID NO: 351 representa VH, 006-H08-65-33-2, sequência de ácido nucleico

[00395] SEQ ID NO: 352 representa VH, 006-H08-68-35-2, sequência de ácido nucleico

[00396] SEQ ID NO: 353 representa VL, 006-H08-12-2, sequência de ácido nucleico

[00397] SEQ ID NO: 354 representa VL, 006-H08-13-2, sequência de ácido nucleico

[00398] SEQ ID NO: 355 representa VL, 006-H08-13-6-1, sequência de ácido nucleico

[00399] SEQ ID NO: 356 representa VL, 006-H08-14-6-0, sequência de ácido nucleico

[00400] SEQ ID NO: 357 representa VL, 006-H08-15-5, sequência de ácido nucleico

[00401] SEQ ID NO: 358 representa VL, 006-H08-19-1, sequência de ácido nucleico

[00402] SEQ ID NO: 359 representa VL, 006-H08-29-1, sequência de ácido nucleico

[00403] SEQ ID NO: 360 representa VL, 006-H08-32-2, sequência de ácido nucleico

[00404] SEQ ID NO: 361 representa VL, 006-H08-33-0, sequência de ácido nucleico

[00405] SEQ ID NO: 362 representa VL, 006-H08-33-16-0, sequência de ácido nucleico

[00406] SEQ ID NO: 363 representa VL, 006-H08-35-17-1, sequência de ácido nucleico

[00407] SEQ ID NO: 364 representa VL, 006-H08-35-17-4, sequência de ácido nucleico

[00408] SEQ ID NO: 365 representa VL, 006-H08-35-1, sequência de ácido nucleico

[00409] SEQ ID NO: 366 representa VL, 006-H08-36-17-0, sequência de ácido nucleico

[00410] SEQ ID NO: 367 representa VL, 006-H08-37-19-0, sequência de ácido nucleico

[00411] SEQ ID NO: 368 representa VL, 006-H08-39-7, sequência de ácido nucleico

[00412] SEQ ID NO: 369 representa VL, 006-H08-48-5, sequência de ácido nucleico

[00413] SEQ ID NO: 370 representa VL, 006-H08-53-27-0, sequência de ácido nucleico

[00414] SEQ ID NO: 371 representa VL, 006-H08-59-30-0, sequência de ácido nucleico

[00415] SEQ ID NO: 372 representa VL, 006-H08-63-32-4, sequência de ácido nucleico

[00416] SEQ ID NO: 373 representa VL, 006-H08-65-33-2, sequência de ácido nucleico

[00417] SEQ ID NO: 374 representa VL, 006-H08-68-35-2, sequência de ácido nucléico EXEMPLOS EXEMPLO 1 ISOLAMENTO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS AO ALVO DE BIBLIOTECAS DE EXIBIÇÃO DE FAGO DE ANTICORPO HUMANO

[00418] Para isolar um painel de anticorpos capazes neutralizar a atividade de PRLR humano, três bibliotecas de exibição de fago de anticorpo humano, expressando fragmentos Fab e scFv, foram investigadas em paralelo. O alvo usado para o panning de biblioteca foi o domínio extracelular solúvel (ECD) do receptor da prolactina que representa os aminoácidos 25-234 do receptor de prolactina humana, preparado como descrito acima em WO08/022295 (Novartis). Alvos alternativos foram o ECD de PRLR C-terminalmente ligado a seis histidinas ou a um domínio de IgG1-Fc humano por meio do ligador com a sequência de aminoácido "isoleucina-glutamato-glicina-arginina- metionina-aspartato".

[00419] Seleção de anticorpos específicos ao alvo de exibição de fago foi realizada de acordo com os métodos descritos por Marks et al. (Methods Mol Bol. 248:161-76, 2004). Brevemente, a biblioteca de exibição de fago foi incubada com 50 pmols do ECD biotinilado em temperatura ambiente por 1 h e o complexo formado foi depois capturado usando 100 μl de suspensão de contas de Estreptavidina (Dynabeads® M-280 Streptavidin, Invitrogen). Fagos não específicos foram removidos lavando as contas com tampão de lavagem (PBS + 5% de Leite). Os fagos ligados foram eluídos com 0,5 ml de 100 nM Trietilamina (TEA) e imediatamente neutralizados por adição de um volume igual de 1M TRIS-Cl pH 7,4. Fundo geral dos fagos eluídos foi usado para infetar células de E. coli. de TG1 que crescem em fase logarítmica, e o fagemídeo foi salvo como descrito (Methods Mol Biol. 248:161-76, 2004). Seleção foi repetida para um total de três ciclos. As colônias simples foram triadas obtidas de células de TG1 infetadas com fago eluído do terceiro ciclo de panning para atividade de ligação em um ensaio de ELISA. Brevemente, as colônias simples obtidas da célula de TG1 infetada foram usadas com fago eluído para inocular os meios nas placas de 96 poços.

[00420] Microculturas foram crescidas a uma OD600=0,6 na qual a expressão de ponto de fragmento de anticorpo solúvel foi induzida por adição de 1 mM de IPTG seguindo cultura durante a noite em uma incubadora de agitador a 30°C. As bactérias foram giradas e o extrato periplásmico foi preparado e usado para detectar a atividade de ligação do anticorpo em ECD imobilizado na microplaca de 96 poços (placas de fundo chato de 96 poços Immunosorb, Nunc) seguindo o protocolo de ELISA padrão fornecido pelo fabricante da microplaca.

[00421] As afinidades dos anticorpos do receptor de anti-prolactina (PRLR) para ligar ao domínio extracelular recombinante (ECD) foram estimadas usando Biacore® 2000 e usadas para classificação de afinidade dos anticorpos. EXEMPLO 2 ANÁLISE QUANTITATIVA DA EXPRESSÃO DO GENE DE PROLACTINA E DO RECEPTOR DA PROLACTINA POR MEIO DE ANÁLISE DE PCR DE TAQMAN EM TEMPO REAL EM LESÕES ENDOMETRIÓTICAS EUCTÓPICAS E ECTÓPICAS DE PACIENTES E CONTROLES SAUDÁVEIS

[00422] Análise de PCR de Taqman em tempo real foi executada usando o Sistema de Detector de Sequência ABI Prism 7700 de acordo com as instruções do fabricante (PE Applied Biosystems) e como descrito em Endocrinolgy 2008, 149(8): 3952-3959) e conhecido pelo perito no campo. Os níveis de expressão relativos de PRL e PRLR foram normalizados para a expressão de ciclofilina. Nós analisamos a expressão de PRL e de PRLR no endométrio de mulheres saudáveis e em lesões do endométrio e endometrióticas de pacientes usando análise de PCR quantitativo Taqman em tempo real. A expressão de prolactina e seu receptor foi claramente suprarregulada em lesões endometrióticas comparadas ao endométrio saudável ou endométrio derivado de pacientes.

[00423] Os resultados estão mostrados na Figura 1 e 2.

[00424] Estes achados implicam que a sinalização de prolactina autócrina representa um papel no desenvolvimento e manutenção da endometriose e úteros de adenomiose (endometriose interna, uma forma de endometriose restringida ao útero. EXEMPLO 3 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE RECEPTOR DA PROLACTINA EM TECIDOS HUMANOS ATRAVÉS DE NORTHERN BLOT

[00425] RNA foi isolado de tecidos de rato diferentes e transferidos para uma membrana de náilon após eletroforese em gel. As membranas foram sucessivamente hibridadas com cDNAs marcados radioativos para o receptor da prolactina de rato ou β-actina (como controle de carga), lavadas, e expostas ao filme. As bandas correspondem aos mRNAs para o receptor da prolactina de rato e β-actina. Os resultados mostrados na Figura 3 indicam uma expressão forte do receptor da prolactina na placenta, na próstata, no ovário e na glândula ad-renal. EXEMPLO 4 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA DO RECEPTOR DA PROLACTINA EM PRÓSTATA DE RATO - INFLUÊNCIA DE CASTRAÇÃO E TRATAMENTOS HORMONAIS

[00426] Os ratos ou foram castrados ou permaneceram intactos. Os animais intactos foram tratados diariamente durante 14 dias com veículo (intacto), DHT (3 mg/kg), ou E2 (0,4 mg/kg). Depois, as próstatas foram isoladas dos animais de todos os grupos de tratamento e extratos de proteína foram preparados. Extratos de proteína foram separados através de eletroforese em gel e transferidos para uma membrana. O receptor da prolactina foi detectado usando o anticorpo comercialmente disponível MA610 (Santa Cruz Biotechnlogy). Os resultados estão mostrados na Figura 4 e indicam a regulação hormonal do receptor da prolactina na próstata de rato. EXEMPLO 5 INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO INDUZIDA POR PROLACTINA DE CÉLULAS BAF3 (ESTAVELMENTE TRANSFECCIONADAS COM O RECEPTOR HUMANO DA PROLACTINA), ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DO RECEPTOR DA PROLACTINA E ANTICORPOS DE CONTROLE NÃO ESPECÍFICOS

[00427] Para analisar a eficácia in vitro dos anticorpos de PRLR neutralizantes, a inibição da proliferação celular ativada por prolactina de células BaF3 foi usada. As células foram estavelmente transfeccionadas com PRLR humano e foram habitualmente cultivadas em RPMI contendo 2 mM de glutamina na presença de 10% de FCS e 10 ng/ml de prolactina humana. Após seis horas de privação, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 10.000 células por poço em meio livre de prolactina contendo 1% de FCS. As células foram estimuladas com 20 ng/ml de prolactina e coincubadas com doses crescentes de anticorpos neutralizantes de PRLR durante dois dias. Proliferação celular foi analisada usando um Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-Glo (Promega). As curvas de dose-resposta para a inibição do crescimento celular estimulado por prolactina foram geradas e os valores de IC50 calculados. Como controle negativo, estimulação com um anticorpo de controle não específico foi usada.

[00428] As curvas de dose-resposta e os valores de IC50 são descritos na Figura 5. O anticorpo não específico não inibiu a proliferação de células BaF estavelmente expressando o PRLR humano, enquanto que os anticorpos específicos bloquearam a proliferação de células e apresentaram potências diferentes. Anticorpo neutralizante 006-H08 mostrou a potência mais alta neste paradigma de leitura. EXEMPLO 6 INIBIÇÃO DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS DE LINFOMA DE RATO INDUZIDA POR PROLACTINA POR MEIO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS E NÃO ESPECÍFICOS

[00429] A eficácia in vitro dos anticorpos de PRLR neutralizantes foi também testada usando a inibição da proliferação de células de linfoma de rato dependente de prolactina (células Nb2-11). Células Nb2-11 foram habitualmente crescidas em RPMI contendo 10% de FCS e 10% de soro de cavalo. Antes de iniciar os ensaios de crescimento celular, as células foram crescidas por 24 horas no mesmo meio contendo 1% FCS em vez de 10% FCS. Depois, as células foram semeadas em placas de 96 poços em meio livre de FCS a uma densidade de 10.000 células por poço. As células foram estimuladas com 10 ng/ml de prolactina humana na presença ou ausência de doses crescentes de anticorpos neutralizantes de PRLR ou anticorpos de controle durante 2 dias. Depois a proliferação celular foi avaliada usando um Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-Glo (Promega). As curvas de dose-resposta e os valores de IC50 são descritos na Figura 6. O anticorpo não específico e anticorpo XHA06.983 que não liga ao PRLR de rato não bloquearam a proliferação de células de Nb2-11. XHA06.642 que liga ao PRLR de rato bloqueou a proliferação de células de Nb2-11. EXEMPLO 7 INIBIÇÃO DE FOSFORILAÇÃO DE STAT5 INDUZIDA POR PROLACTINA EM CÉLULAS T47D POR ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DO RECEPTOR DA PROLACTINA

[00430] Para analisar a eficácia in vitro dos anticorpos de PRLR neutralizantes em uma leitura adicional, a inibição de fosforilação de STAT5 em células T47D humanas tratadas com prolactina foi usada. Células T47D foram crescidas em RPMI contendo 10% FCS e 2 mM glutamina. As células foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 0,5 x 105 células por poço. No dia seguinte, as células foram privadas por 1 h em soro livre de RPMI. Depois as células foram incubadas com ou sem doses diferentes de anticorpos neutralizantes de PRLR ou anticorpo de controle não específico na ausência ou presença de 20 ng/ml prolactina humana por 30 min. Depois as células foram enxaguadas e lisadas em 70 μl de tampão de lise. Os lisados foram centrifugados e o sobrenadante foi congelado a -80°C. Os extratos foram analisados usando western blot (anticorpo de anti-pSTAT5A/B de Upstate 07-586, diluídos 1:1000). Como controle de carga, os borrões tirados foram incubados com anticorpo de tubulina de anti-beta (ab7287, diluídos 1:500).

[00431] Os resultados estão mostrados na Figura 7. Com a exceção do anticorpo de FITC não específico, todos anticorpos neutralizantes de PRLR bloquearam a fosforilação de STAT5 em células T47D humanas de forma dose-dependente. Todos os anticorpos testados ligaram-se ao PRLR humano com afinidade alta. EXEMPLO 8 INIBIÇÃO DE ATIVIDADE DO GENE REPÓRTER DE LUCIFERASE EM CÉLULAS HEK293 ESTAVELMENTE TRANSFECCIONADAS COM O PRLR HUMANO - ANÁLISE DOS ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DO RECEPTOR DA PROLACTINA E ANTICORPOS DE CONTROLE NÃO ESPECÍFICOS

[00432] Para também analisar a eficácia in vitro dos anticorpos de PRLR neutralizantes, um ensaio de gene repórter foi usado. Células HEK293HEK293 estavelmente transfeccionadas com o PRLR humano foram transientemente transfeccionadas com um gene repórter de luciferase sob o controle de LHREs (elementos de resposta de hormônio lactogênico), por 7 horas. Depois, as células foram semeadas a uma densidade de 20000 células por poço em uma placa de 96 poços (0,5% de soro tirado de carvão, DMEM). O próximo dia 300 ng/ml prolactina humana com e sem doses crescentes de anticorpos neutralizantes de PRLR ou anticorpos de controle foram adicionados. 24 horas depois, a atividade da luciferase foi determinada. Os resultados estão descritos na Figura 8. Em contraste com o anticorpo não específico, 006-H08 e HE06.642 inibiram a atividade de luciferase em células HEK293 estavelmente transfeccionadas com o PRLR humano. EXEMPLO 9 INIBIÇÃO DE ATIVIDADE DO GENE REPÓRTER DE LUCIFERASE EM CÉLULAS HEK293 ESTAVELMENTE TRANSFECCIONADAS COM O PRLR MURINO - ANÁLISE DE ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DO RECEPTOR DA PROLACTINA E ANTICORPOS DE CONTROLE NÃO ESPECÍFICOS

[00433] Para também analisar a eficácia in vitro dos anticorpos de PRLR neutralizantes no receptor de prolactina murino, um ensaio de gene repórter foi usado. Células HEK293 estavelmente transfeccionadas com o PRLR murino foram transientemente transfeccionadas com um gene repórter de luciferase sob o controle de LHREs (elementos de resposta de hormônio lactogênico) por 7 horas. Depois, as células foram semeadas a uma densidade de 20.000 células por poço em uma placa de 96 poços (0,5% de soro tirado de carvão, DMEM). No próximo dia, 200 ng/ml prolactina humana com e sem doses crescentes de anticorpos neutralizantes de PRLR ou anticorpos de controle foram adicionados. 24 horas depois, a atividade de luciferase foi determinada. Os resultados estão descritos na Figura 9. Enquanto que o anticorpo 005-C04 (triângulos cheios) exibiram atividade alta (valor de IC50 = 3 nM), o anticorpo HE06.642 (círculos cheios) não mostram atividade até 330 nM. O anticorpo de controle não específico (círculos vazios) é completamente inativo. Em contraste com o anticorpo de Novartis HE06.642, o anticorpo 005-C04 é capaz de bloquear a sinalização mediada por PRLR murina. EXEMPLO 10 INIBIÇÃO DE PROLIFERAÇÃO INDUZIDA POR PROLACTINA DE CÉLULAS BAF3 (ESTAVELMENTE TRANSFECCIONADAS COM O RECEPTOR DA PROLACTINA MURINO) POR ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DE RECEPTOR DA PROLACTINA E ANTICORPOS DE CONTROLE NÃO ESPECÍFICOS

[00434] Para analisar a eficácia in vitro dos anticorpos de PRLR neutralizantes, a inibição de proliferação celular ativada por prolactina de células Ba/F3 foi usada. As células foram estavelmente transfeccionadas com o PRLR murino e foram habitualmente cultivadas em RPMI contendo 2 mM glutamina na presença de 10% FCS e 10 ng/ml de prolactina humana. Após seis horas de privação, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 10.000 células por poço em meio livre de prolactina contendo 1% FCS. As células foram estimuladas com 40 ng/ml prolactina e coincubadas com doses crescentes de anticorpos neutralizantes de PRLR durante dois dias. Proliferação celular foi analisada usando um Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-Glo (Promega). Curvas de dose- resposta foram geradas para a inibição do crescimento celular estimulado por prolactina e os valores de IC50 calculados. Como controle negativo, a estimulação com um anticorpo de controle não específico foi usada.

[00435] As curvas de dose-resposta e os valores de IC50 são descritos na Figura 10. O anticorpo de controle não específico (quadrados cheios) foi inativo para o PRLR murino. Houve apenas inibição limitada da ativação de PRLR murina pelos anticorpos HE06.642, 001-E06, e 001-D07. Apenas o anticorpo 005-C04 bloqueou completamente a ativação de PRLR murina. EXEMPLO 11 EFEITO ANTICONCEPCIONAL DE ANTICORPOS NEUTRALIZANTES IGG1 005-C04 DE RECEPTOR DA PROLACTINA EM CAMUNDONGOS

[00436] Para testar a influência dos anticorpos neutralizantes do receptor da prolactina em fertilidade em camundongos, camundongos de NMRI fêmeas e machos de 12 semanas de idade foram acasalados durante 7 dias (dia 0 - dia 7). Os camundongos fêmeas foram tratados nos dias -3, 0, 3, e 6 com uma injeção intraperitoneal de uma solução salina tamponada com fosfato de IgG1, anticorpo de controle não específico (anti-FITC, 10 mg/kg), ou o anticorpo neutralizante IgG1 005- C04 (= IgG1 005-C04) em concentrações de 10 ou 30 mg por kg de peso do corpo dissolvidos em solução salina tamponada com fosfato. 10 fêmeas foram usadas em cada grupo experimental. Cada macho foi acasalado com duas fêmeas, uma das fêmeas era de um grupo de controle negativo ou tratada com solução salina tamponada com fosfato ou anticorpo não específico, a outra fêmea foi tratada com anticorpo neutralizante específico. Acasalamentos, em que o macho não engravidou a fêmea, foram excluídos da avaliação de dados. Parâmetros de leitura foram tamanho médio da ninhada e taxas de gravidez (medida em %) calculada como número de ninhada por grupo experimental dividido pelo número de possíveis ninhadas teóricas dentro deste grupo. Os resultados estão descritos na Figura 11.

[00437] Figura 11A mostra as taxas de gravidez obtidas. Taxas de gravidez foram como segue: - 87,5% no grupo de camundongos tratados com solução salina tamponada com fosfato, - 75% no grupo de camundongos tratados com o anticorpo de controle não específico (10 mg/kg), - 100% no grupo de camundongos tratados com o anticorpo de PRLR neutralizante IgG1 005-C04 (10 mg/kg), e - 0% no grupo de camundongos tratados com o anticorpo de PRLR neutralizante IgG1 005-C04 (30 mg/kg).

[00438] Figura 11B mostra os tamanhos da ninhada observados para os grupos experimentais diferentes. Tamanhos da ninhada foram como segue: - 10,9 camundongos por ninhada no grupo de camundongos tratados com solução salina tamponada com fosfato, - 12,3 camundongos por ninhada no grupo de camundongos tratados com o anticorpo de controle não específico (10 mg/kg), - 13 camundongos por ninhada no grupo de camundongos tratados com o anticorpo de PRLR neutralizante IgG1 005-C04 (10 mg/kg), e - 0 camundongo por ninhada no grupo de camundongos tratados com o anticorpo de PRLR neutralizante IgG1 005-C04 (30 mg/kg).

[00439] Os resultados deste do estudo de acasalamento demonstram que o anticorpo de receptor da prolactina neutralizante IgG1-005-C04 impediu completamente a gravidez em camundongos quando testados a 30 mg/kg peso do corpo. EXEMPLO 12 AGRUPAMENTO DE EPÍTOPO

[00440] Experimentos de agrupamento de epítopo foram executados usando Biacore monitorando a ligação simultânea de pares de anticorpos de anti-PRLR para ECD-PRLR (SEQ ID NO: 70). Brevemente, o primeiro anticorpo foi covalentemente imobilizado na fatia de sensor através de acoplamento da amina primária usando n- hidroxissuccinamida (NHC) e dimetilaminopropil N-etil-N"-carbodiimida (EDC). Sítios de ligação desocupados na superfície foram depois bloqueados com etanolamida. ECD-PRLR solúvel (SEQ ID NO: 70) foi capturado na superfície por meio do anticorpo imobilizado, portanto, o epítopo do anticorpo de captura é bloqueado para todas as moléculas de ECD-PRLR ligadas. Um segundo anticorpo foi passado imediatamente na superfície para ligar ao ECD-PRLR imobilizado. Dois anticorpos que reconhecem os mesmos epítopos ou sobrepostos não podem ligar ao ECD-PRLR, enquanto que os anticorpos com epítopos distintos podem ligar. A superfície de anticorpo foi regenerada com glicina, pH 2,8, para remover as proteínas ligadas e depois o processo foi repetido com outros anticorpos. Todas as combinações de anticorpos foram testadas. Os resultados representativos estão mostrados na Tabela 7. Os anticorpos 006-H08, 002-H06, 002-H08, 006-H07 e XHA06983 competitivamente ligaram-se entre si no ECD-PRLR, indicando que eles visam epítopos sobrepostos (grupo de epítopo 1, tabela 6). Além disso, os anticorpos competitivamente ligaram-se a PRL que é também o caso para 001-E06 (grupo de epítopo 2, tabela 6). Este anticorpo visa um sítio diferente de ECD-PRLR que os acima mencionados. Por fim, o anticorpo 005-C04 competitivamente ligou-se a HE06.642 e XHA06.642 sem ser competitivo com PRL (grupo de epítopo 3, tabela 6). TABELA 7: GRUPOS DE ANTICORPOS QUE VISAM EPÍTOPOS DE SOBREPOSIÇÃO NO DOMÍNIO EXTRACELULAR (ECD) DO RECEPTOR DA PROLACTINA HUMANO (PRLR)

EXEMPLO 13 REATIVIDADE CRUZADA DE ANTICORPOS EM PRLR DE CAMUNDONGO E HUMANO EXPRESSO NAS SUPERFÍCIES DAS CÉLULAS

[00441] Para determinar as características de ligação dos anticorpos de anti-PRLR em PRLR de camundongo e humano expresso nas células, ligação foi testada através de citometria de fluxo em células HEK293 estavelmente expressando o PRLR humano e murino, respectivamente. As células como também a linhagem celular de HEK293 parental sem PRLR foram colhidas, centrifugadas e ressuspensas a cerca de 5x106 células/ml em 1xPBS contendo 2% FBS e 0,1% azida de sódio (tampão de FACS). Os anticorpos 005-C04, 001- E06 e HE06.642 foram diluídos 2 vezes para concentração final em tampão de FACS e acrescentados aos poços de amostra apropriados (50 μl / poço). Para anticorpo secundário e controles de autofluorescência, 50 μl tampão de FACS foram acrescentados aos poços apropriados. 50 μl de suspensão de célula foram acrescentados a cada poço da amostra. As amostras foram incubadas a 4°C por uma hora, lavadas duas vezes com tampão de FACS frio e ressuspensas em tampão de FACS contendo a IgG anti-humana de cabra conjugada com PE a uma diluição de 1:100. Seguindo uma incubação de 30 min a 4°C, células foram lavadas duas vezes com tampão de FACS frio, ressuspensas em tampão de FACS contendo 1 mg/ml de iodeto de propídio (Invitrogen, San Diego, CA) e analisadas através de citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 13, os anticorpos 005-C04 e 001- E06 ligaram-se ao PRLR humano e murino nestas células, enquanto HE06.642 apenas ligou-se ao PRLR humano. Esta observação é consistente com o achado relatado no exemplo 9 acerca da eficácia perdida de HE06.642 no ensaio de gene repórter de luciferase dependente de PRLR murino. Embora 005-C04 e HE06.642 competitivamente ligaram-se ao PRLR humano, as propriedades de ligação diferentes de ambos os anticorpos com respeito ao PRLR murino indicam diferenças em suas especificidade de epítopo. EXEMPLO 14 ATIVIDADE INIBIDORA DE ANTICORPOS FAB E DE scFv EM CASCATAS DE SINALIZAÇÃO CELULARES

[00442] Para funcionalmente caracterizar a atividade das repetições de triagem de Fab e scFv na cascata de sinalização desencadeada por PRLR, a inibição de fosforilação no próprio PRLR, e nos reguladores transcricionais ERK1/2 e STAT5 em células T47D humanas tratadas com prolactina, foi medidas. Células T47D foram crescidas em RPMI contendo 2 mM L-glutamina, 10% FBS tirado de carvão e insulina- transferrina-selênio-A (Gibco). Células foram semeadas em placas de 6 poços ou placas de 96 poços a uma densidade de 1,5 x 106 células por poço. No próximo dia, o meio de crescimento foi renovado. No terceiro dia, as células foram privadas por 1 hora em RPMI livre de soro. Depois as células foram incubadas com ou sem doses diferentes de anticorpos neutralizantes de PRLR ou anticorpo de controle não específico na presença de 500 ng/ml de prolactina humana por 5 min. Depois as células foram enxaguadas e lisadas em tampão de lise. Os lisados foram centrifugados e os sobrenadantes foram congelados a -80°C. As amostras foram testadas por ELISA de acordo com o kit DuoSet IC "Phospho-prolactin Human R" (R&D Systems) para medição da fosforilação de PRLR, de acordo com o kit de ELISA em sanduíche PathScan Phospho-STAT5 (Tyr694) (Cell Signaling Technology; #7113) para medição da fosforilação de STAT5 e de acordo com o kit de Phospho-ERK1/ERK2 (R&D Systems) para medição de fosforilação de ERK1/2. Tabela 8 fornece uma visão geral acerca da atividade antagonística de uma seleção das repetições de triagem em formato Fab ou scFv a uma dose fixa de 7,5 μg por ml. TABELA 8: ATIVIDADE ANTAGONÍSTICA DE UMA SELEÇÃO DE REPETIÇÕES DE TRIAGEM NA FOSFORILAÇÃO DE PRLR, ERK1/2 E STAT5 COMO DETERMINADO POR ELISAS EM LISADOS DE CÉLULA DA LINHAGEM CELULAR DE CÂNCER DE MAMA HUMANO T47D * FORMATO DE sc Fv, ° FORMATO DE Fab, EXEMPLO 15 ANTICORPOS DE PRLR NEUTRALIZANTES INIBEM A LACTAÇÃO EM CAMUNDONGOS

[00443] Fêmeas de NMRI adultas foram acasaladas com machos de NMRI. No dia pós-parto 1, o tamanho da ninhada foi ajustado em 8 camundongos por mãe lactantes. O peso da prole foi determinado diariamente pela manhã começando no dia pós-parto 1. Mães lactantes permaneceram ou sem tratar (círculos cheios na Figura 14A,B) ou foram tratadas intraperitonealmente com qualquer anticorpo não específico (10 mg/kg peso do corpo; círculos vazios na Figura 14A,B), ou com anticorpo neutralizante de PRLR murino IgG2a 005-C04 contendo domínios constantes (= IgG2a 005-C04; 10 mg/kg, triângulos cheios na Figura 14A, B) ou com anticorpo neutralizante de PRLR IgG2a 005-C04 (30 mg/kg, triângulos vazios na Figura 14A, B). Tamanho do grupo foi 5-6 mães lactantes por grupo experimental. As mães foram tratadas com anticorpos de controle específicos ou não específicos no dia pós- parto 1, 3, 6, 9, 10, e 12 (indicados com as setas na Figura 14A, B). Os resultados estão descritos na Figura 14. Figura 14A mostra durante cada dia pós-parto o ganho de peso da ninhada diariamente expresso como porcentagem do respectivo peso da ninhada no dia 1. A partir do dia pós-parto 8 em diante, há uma diferença significativa no ganho de peso da ninhada entre a prole de mães tratadas com anticorpos neutralizantes de PRLR e a prole de mães que permaneceram sem tratar ou receberam anticorpos de controle não específicos. Devido a razões éticas, vários ninhadas tiveram que ser mortas no dia pós-parto 10 no grupo experimental de mães que recebem a dose mais alta do anticorpo de PRLR neutralizante. Na Figura 14B, os resultados são descritos de um modo diferente. O ganho de peso da ninhada diferencial é descrito em cada dia e expresso como porcentagem do peso de ninhada no dia pós-parto 1. Basicamente a Figura 14B mostra o declive dos gráficos descritos na Figura 14A. O aumento diário diferencial no peso da ninhada oscila 30% do peso da ninhada iniciando por volta do dia pós-parto 1 para ninhadas de mães sem tratar ou mães tratadas com o anticorpo não específico. Há uma redução severa significativa no aumento de peso diário da ninhada em ninhadas de mães tratadas com o anticorpo de PRLR neutralizante a 30 mg/kg peso do corpo a partir do dia 7 em diante (*p < 0,05; *** p < 0,005 vs. ninhadas de mães tratadas com anticorpo não específico). A partir do dia pós-parto 11 em diante, o aumento de peso diário da ninhada é diminuído significativamente também em ninhadas de mães tratadas com o anticorpo de PRLR neutralizante a 10 mg/kg se comparadas às ninhadas de mães tratadas com anticorpos de controle não específicos (p < 0,05 vs. ninhadas de mães tratadas com anticorpo não específico). Sob conclusão, há efeitos dose-dependentes do anticorpo de PRLR neutralizante IgG2a 005-C04 na inibição da lactação. Figura 14C mostra as seções histológicas das glândulas mamárias de mães lactantes dos grupos experimentais diferentes. As glândulas mamárias de mães sem tratar e mães tratadas com os anticorpos de controle não específicos estão cheias com dutos produtores de leite. Em contraste, há sinais de involução da glândula mamária em mães tratadas com o anticorpo de PRLR neutralizante IgG2a 005-C04. Setas pretas na Figura 14C apontam para ilhas de gordura no tecido da glândula mamária (vide efeito dose-dependente do anticorpo específico IgG2a 005-C04 na extensão da involução da glândula mamária (Figura 14C)). Além disso, a expressão da beta- caseína das proteínas de leite principais (Csn-2), proteína acídica de soro (WAP), e IGF-1 foi analisada nas glândulas mamárias de mães dos grupos experimentais diferentes (Figura 14D). Expressão gênica foi normalizada para a expressão de proteína ligadora da caixa TATA (TBP). O anticorpo de PRLR neutralizante IgG2a 005-C04 de modo dose-dependente diminuiu a expressão da proteína do leite enquanto que o anticorpo não específico (10 mg/kg) foi sem qualquer efeito significativo.

[00444] O anticorpo de PRLR neutralizante IgG2a 005-C04 de modo dose-dependente bloqueou a lactação e levou à involução da glândula mamária em camundongos lactantes, o que demonstrou sua utilidade para inibição da lactação. EXEMPLO 16 ANTICORPOS DE PRLR NEUTRALIZANTES SÃO ADEQUADOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇA DE MAMA BENIGNA

[00445] Uma mutação de PRLR ativador ou hiperprolactinemia local ou sistêmica pode provocar doença de mama benigna. Portanto, um modelo de camundongo hiperprolactinêmico para induzir proliferação intensificada na glândula mamária (conspícuo das formas mais severas de doença de mama benigna) foi empregado. No dia 0, os camundongos Balb/c fêmeas de 12 semanas de idade receberam um isoenxerto pituitário sob a cápsula renal ou permaneceram sem operar. Camundongos isoenxertados com pituitária permaneceram sem tratar ou foram tratados intraperitonealmente com anticorpo não específico (10 mg/kg), anticorpo neutralizante de PRLR 005-C04 em formato de IgG1 (= IgG1 005-C04; 10 mg/kg), ou anticorpo neutralizante de PRLR IgG1 005-C04 (30 mg/kg) nos dias 0, 3, 7, 11, e 15. Tamanho do grupo experimental foi 8-10 animais. No dia 17 após, os camundongos de transplantação da pituitária foram sacrificados. Duas horas antes da morte, os animais receberam uma injeção intraperitoneal de BrdU para monitorar a proliferação das células epiteliais. A glândula mamária inguinal esquerda foi fixada em solução de Carnoy e montes inteiros da glândula mamária foram preparados e tingidos com Carmim alaune (Figura 15A). A glândula mamária inguinal direita foi fixada em 4% formalina tamponada com fosfato durante a noite. Glândulas mamárias foram subsequentemente embebidas em parafina e imunotingimentos de BrdU foram executados como previamente descritos (Endocrinology 149(8):3952-3959;2009). Além disso, um imunotingimento de pSTAT5 foi executado (anticorpo de pSTAT5 de anti abcam, ab32364, diluído 1:60) para monitorar a inibição da sinalização mediada por PRLR em resposta ao tratamento com anticorpos neutralizantes de PRLR. Figura 15A mostra ampliações dos montes inteiros da glândula mamária dos grupos experimentais diferentes. Glândulas mamárias de camundongos adultos que não receberam uma pituitária mostram dutos e brotos terminais, enquanto que há bifurcação extrema e formação de estruturas alveolares em camundongos que recebem um isoenxerto pituitário. Tratamento com o anticorpo não específico (10 mg/kg) não inibe bifurcação e formação de estruturas alveolares. Em contraste, o tratamento com o anticorpo neutralizante IgG1 005-C04 a 10 mg/kg peso do corpo leva à inibição completa da bifurcação em 8 entre 10 animais que recebem um isoenxerto pituitário e tratamento com IgG1 005-C04 a 30 mg/kg completamente inibe a bifurcação em 9 entre 9 animais que recebem um isoenxerto pituitário. Análise histológica e imunotingimento de BrdU são descritos na Figura 15B. Isoenxerto pituitário leva à hiperplasia epitelial que não é inibida por tratamento com o anticorpo não específico, enquanto que não há nenhuma hiperplasia epitelial em camundongos abrigando um isoenxerto pituitário e tratados com o anticorpo de PRLR neutralizante a uma dose de 10 ou 30 mg/kg peso do corpo. Algumas das células BrdU-positivas, refletindo as células na fase S do ciclo celular que vão se dividir, são indicadas através de setas brancas na Figura 15B. Camundongos tratados com o anticorpo neutralizante IgG1 005-C04 (30 mg/kg peso do corpo) mostraram inibição quase completa da proliferação de célula epitelial em glândulas mamárias. Algumas das células positivas para fosfo-STAT5 estão indicadas através de setas brancas na Figura 15C. Tratamento com 30 mg/kg IgG1 005-C04 leva à inibição completa da fosforilação de STAT5, indicando bloqueio completo da sinalização mediada por PRLR.

[00446] Os resultados da Figura 15A, B, e C demonstraram que os anticorpos neutralizantes de PRLR são adequados para o tratamento de mastopatia, uma doença proliferativa benigna da glândula mamária. Anticorpos de PRLR neutralizantes inibem a proliferação de células epiteliais mamárias e a ativação de fosfo-STAT5. EXEMPLO 17 TRATAMENTO DE HIPERPLASIA DE PRÓSTATA BENIGNA COM ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DE PRLR

[00447] Hiperplasia de próstata benigna foi estabelecida em camundongos Balb/c machos enxertando duas pituitárias sob a cápsula renal na idade de 8 semanas. Um grupo de controle permaneceu sem operar. Camundongos que recebem isoenxertos pituitários permaneceram sem tratar ou receberam injeções intraperitoneais de ou um anticorpo não específico (10 mg/kg), ou o anticorpo de PRLR neutralizante 005-C04 IgG2a murino contendo domínios constantes (= IgG2a 005-C04) em doses de 10 e 30 mg/kg peso do corpo. As injeções de anticorpo foram executadas iniciando no dia de transplantação da pituitária (= dia 0), e no dia 3, dia 7, dia 11, dia 15, dia 18, dia 22, e dia 25 após transplantação da pituitária. Os camundongos foram sacrificados no dia 28. O peso relativo da próstata ventral foi determinado. Os resultados estão descritos na Figura 16. Isoenxerto pituitário resultou em um aumento no peso relativa da próstata. Tratamento com 10 mg/kg e 30 mg/kg de anticorpo neutralizante de PRLR IgG2a 005-C04 reduziu o peso da próstata enquanto que o tratamento com anticorpo de controle não específico foi sem qualquer efeito. Anticorpos de PRLR neutralizantes são portanto adequados para o tratamento de hiperplasia de próstata benigna.

[00448] No dia 18 após isoenxerto pituitário ficou evidente que o crescimento de pêlo foi diminuído em animais recebendo isoenxertos pituitários. Anticorpos neutralizantes de PRLR estimularam o crescimento de pêlo sob condições hiperprolactinêmicas. Fotografias representativas estão mostradas na Figura 17. Anticorpos neutralizantes de PRLR portanto podem ser usados para o tratamento de queda de pêlo hiperprolactinêmico. EXEMPLO 18 EFEITO DOS ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DE PRLR EM CRESCIMENTO DE PÊLO

[00449] O pêlo dorsal de camundongos C57BL/6 machos e fêmeas de 8 semanas de idade foi removido usando raspadores elétricos como descrito previamente (British Journal of Dermatology 2008;159:300- 305). Hiperprolactinemia foi induzida em alguns grupos através de isoenxerto pituitário sob a cápsula renal, os animais nos grupos restantes eram normoprolactinêmicos. Os animais foram tratados com anticorpos de PRLR específicos (IgG2a 005-C04) ou anticorpos de controle não específicos (30 mg/kg, intraperitonealmente) uma vez semanalmente (iniciando no dia 0, que é o dia do isoenxerto pituitário). As injeções de anticorpo subsequentes foram executadas nos dias 7 e 14. Após três semanas, o recrescimento do pêlo foi visível como partes escuras na pele branca-rosada raspada, e a porcentagem da área raspada que se tornou escura foi medida. Os camundongos fêmeas foram mortos 15 dias após raspagem e os camundongos machos foram sacrificados 18 dias após raspagem.

[00450] Os grupos experimentais seguintes foram usados (tamanho dos grupos foi 6 camundongos): 1. fêmeas raspadas 2. fêmeas raspadas com isoenxerto pituitário 3. fêmeas raspadas com isoenxerto pituitário + 30 mg/kg de anticorpo não específico IgG2a 005-C04 uma vez semanalmente 4. fêmeas raspadas com isoenxerto pituitário + 30 mg/kg de anticorpo específico uma vez semanalmente 5. fêmeas raspadas + 30 mg/kg de anticorpo não específico uma vez semanalmente 6. fêmeas raspadas + 30 mg/kg de anticorpo específico uma vez semanalmente 7. machos raspados 8. machos raspados com isoenxerto pituitário 9. machos raspados com isoenxerto pituitário + 30 mg/kg de anticorpo não específico uma vez semanalmente 10. machos raspados com isoenxerto pituitário + 30 mg/kg anticorpo específico IgG2a 005-C04 uma vez semanalmente 11. machos raspados + 30 mg/kg de anticorpo não específico uma vez semanalmente 12. machos raspados + 30 mg/kg de anticorpo específico uma vez semanalmente

[00451] Figuras representativas dos animais dos grupos diferentes são representadas na Figura 18, a porcentagem do recrescimento da área com pêlo é indicada na Figura 18.

[00452] Anticorpos neutralizantes de PRLR, mas não anticorpos não específicos, estimulam o recrescimento de pêlo sob condições hiper e normoprolactinêmicas em camundongos machos e fêmeas. Anticorpos neutralizantes de PRLR são portanto adequados para tratar queda de cabelo nas mulheres e homens sob condições hiper e normoprolactinêmicas. EXEMPLO 19 INIBIÇÃO DE PROLIFERAÇÃO INTENSIFICADA DE CÉLULAS EPITELIAIS MAMÁRIAS POR ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DE PRLR

[00453] Para testar o efeito dos anticorpos neutralizantes de PRLR em proliferação de células epiteliais mamárias intensificada ativada por terapia hormonal combinada (isto é, terapia de estrogênio mais progestina) um modelo de camundongo previamente descrito que permitiu a quantificação dos efeitos proliferativos no útero e na glândula mamária foi empregado (Endocrinology 149:3952-3959,2008). Camundongos C57BL/6 fêmeas de 6 semanas de idade foram ovariectomizados. 2 semanas após ovariectomia, os animais foram tratados subcutaneamente com injeções diárias de qualquer veículo (etanol/arachisoil 10%/90%) ou 100 ng estradiol mais 100 mg/kg progesterona durante duas semanas. Os animais foram tratados uma vez semanalmente com injeções intraperitoneais de anticorpos neutralizantes de PRLR (10 mg/kg e 30 mg/kg) no formato de IgG2a murino ou anticorpo não específico (30 mg/kg) durante três semanas. Autópsia foi executada no dia 36 após ovariectomia. Duas horas antes da morte, os animais receberam uma injeção intraperitoneal de bromodeoxiuridina (BrdU) dissolvida em solução salina tamponada com fosfato (70 mg/kg peso do corpo). Os 2/3 proximais da glândula mamária inguinal direita foram analisados para proliferação de células epiteliais mamárias (imunotingimento de BrdU) previamente descrito (Endocrinology 149:3952-3959,2008).

[00454] O experimento compreendeu os grupos seguintes: 1. animais ovariectomizados tratados com veículo 2. animais ovariectomizados tratados com 100 ng estradiol 3. animais ovariectomizados tratados com 100 ng estradiol (E) e 100 mg/kg progesterona (P) 4. animais ovariectomizados tratados com E + P e 10 mg/kg de anticorpo específico 005-C04 5. animais ovariectomizados tratados com E + P e 30 mg/kg de anticorpo específico 005-C04 6. animais ovariectomizados tratados com E2 + P e 30 mg/kg de anticorpo de controle não específico

[00455] Os resultados estão mostrados na Figura 19. O número absoluto de células epiteliais ductais proliferativas dentro de 4 cortes transversais da glândula mamária foi avaliado. As medias são descritas como barras horizontais. Proliferação de células epiteliais em camundongos ovariectomizados, tratados com veículo é bastante baixa. Tratamento com estradiol leva a alguma estimulação da proliferação de células epiteliais, proliferação de células epiteliais mamárias máxima é observada sob tratamento de estrogênio mais progesterona (Figura 19). Tratamento com receptor da prolactina de anticorpo neutralizante 005- C04 mas não com anticorpo de controle não específico leva a uma diminuição dose-dependente na proliferação de células epiteliais mamárias quase novamente para os níveis de estradiol apenas.

[00456] Anticorpos neutralizantes de PRLR são portanto adequados para tratar proliferação intensificada de células epiteliais mamárias sob terapia hormonal combinada, isto é, tratamento de estradiol mais progesterona. EXEMPLO 20 TRATAMENTO DE ÚTEROS DE ADENOMIOSE (= ENDOMETRIOSE INTERNA) EM CAMUNDONGOS DE SHN COM ANTICORPOS NEUTRALIZANTES DE PRLR

[00457] Para testar a eficácia dos anticorpos neutralizantes de PRLR em endometriose, foi empregado o modelo de úteros de adenomiose em camundongos de SHN que contam com hiperprolactinemia sistêmica (Acta anat. 116:46-54,1983). Hiperprolactinemia em camundongos de SHN foi induzida por isoenxerto pituitário sob a cápsula renal de camundongos fêmeas de 7 semanas de idade (Acta anat. 116:46-54,1983). Anticorpos de PRLR neutralizantes (10 mg/kg ou 30 mg/kg) ou anticorpos não específicos (30 mg/kg) foram administrados intraperitonealmente iniciando uma semana após isoenxerto pituitário. A infiltração da camada muscular uterina através de tecido glandular foi avaliada como previamente descrito (Laboratory Animal Science 1998,48:64-68). Tratamento com os anticorpos foi executado durante 9 semanas uma vez e duas vezes semanalmente através de injeções intraperitoneais. A autópsia (dia 70 após transplantação da pituitária), os úteros foram fixados durante a noite em formalina tamponada a 4% e embebidos em parafina. O grau de adenomiose (= endometriose interna) foi avaliado como segue: Grau 0 = nenhuma adenomiose Grau 0,5 = a camada interna do miométrio perde sua orientação concêntrica Grau 1 = glândulas endometriais invadindo a camada interna do miométrio Grau 2 = glândulas endometriais entre a camada interna e externa do miométrio uterino Grau 3 = glândulas endometriais invadindo a camada externa do miométrio uterino Grau 4 = glândulas endometriais fora da camada externa do miométrio uterino

[00458] O experimento compreendeu os grupos experimentais seguintes: 1. Animais sem transplantação da pituitária, isto é, camundongos normoprolactinêmicos 2. Animais com transplantação da pituitária, isto é, camundongos hiperprolactinêmicos 3. Animais com transplantação da pituitária, tratados com anticorpo de controle não específico uma vez semanalmente a uma dose de 30 mg/kg 4. Animais com transplantação da pituitária, tratados com anticorpo de controle não específico duas vezes semanalmente a uma dose de 30 mg/kg 5. Animais com transplantação da pituitária, tratados com o anticorpo neutralizante do receptor da prolactina 005-C04 no formato de IgG2a murina uma vez semanalmente a uma dose de 10 mg/kg 6. Animais com transplantação da pituitária, tratados com o anticorpo neutralizante do receptor da prolactina 005-C04 no formato de IgG2a murina duas vezes semanalmente a uma dose de 10 mg/kg 7. Animais com transplantação da pituitária, tratados com o anticorpo neutralizante do receptor da prolactina 005-C04 no formato de IgG2a murina uma vez semanalmente a uma dose de 30 mg/kg 8. Animais com transplantação da pituitária, tratados com o anticorpo neutralizante do receptor da prolactina 005-C04 no formato de IgG2a murina duas vezes semanalmente a uma dose de 30 mg/kg

[00459] Os resultados são descritos na Figura 20. As contagens para cada animal em cada grupo de tratamento são individualmente dadas e as medias mostradas para cada grupo de tratamento como barras horizontais. Camundongos normoprolactinêmicos desenvolvem endometriose interna até certo ponto (contagem de doença média = 0,25). Hiperprolactinemia devido ao isoenxerto pituitário intensifica a contagem de doença e mais animais sofrem da doença (contagem de doença média = 2,5). Enquanto que o tratamento com 30 mg/kg de anticorpo não específico um ou duas vezes por semana não teve nenhuma influência na doença, o tratamento com anticorpos neutralizantes específicos mostra uma diminuição dose-dependente na contagem da doença. Notavelmente, todos os animais que recebem 10 ou 30 mg/kg de anticorpo específico duas vezes por semana foram completamente curados e sua contagem de doença foi significativamente inferior que a contagem de doença de camundongos normoprolactinêmicos (Figura 20). Anticorpos neutralizantes de PRLR são portanto adequados para tratar endometriose interna (= úteros de adenomiose) e endometriose externa em mulheres. EXEMPLO 21 MATURAÇÃO DE VARIANTES DE ANTICORPO:

[00460] Maturação de afinidade de anticorpo é um processo de duas etapas onde mutagênese de saturação e triagem de rendimento alto são combinados para identificar um número pequeno de mutações que resultam em aumentos de afinidade. No primeiro ciclo de maturação por afinidade, diversificação posicional do anticorpo do tipo selvagem é introduzida através de mutagênese dirigida usando cassetes de NNK- trinucleotídeo (por meio do qual N representa uma mistura de 25% de cada um dos nucleotídeos de adenina, timina, guanina, e citosina e K representa uma mistura de 50% de cada um dos nucleotídeos de timina e guanina) de acordo com BMC Biotechnology 7: 65, 2007. Deste modo, todos os 20 aminoácidos são introduzidos em uma posição de aminoácido individual. Esta randomização posicional é restringida às seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs). No segundo ciclo de maturação de afinidade, as substituições benéficas foram recombinadas e triadas para mais melhorias. TRIAGEM DE VARIANTES DE Fab MADURAS DE 006-H08 POR MEIO DE ENSAIO HOMOGÊNEO DE FLUORESCÊNCIA RESOLVIDA NO TEMPO (HTRF):

[00461] Sobrenadantes derivados de E. coli normalizados e 8 nM de domínio extracelular biotinilado de PRLR juntamente com 1 nM de Estreptavidina-Európio foram incubados em placas de microtitulação de 96 poços durante 30 min. Depois 200 mM de KF e 50 nM de IgG1 marcada com Alexa Flúor 647 de 006-H08 foram adicionados. Esta mistura foi incubada em temperatura ambiente por 5, 20, 35, 50, e 65 minutos, respectivamente. Nos pontos de tempo indicados, a absorção a 665 nm (e 620 nm) foi medida usando EnVision MultilabelReader (Perkin Elmer). Os resultados obtidos estão mostrados na Figura 21.

Claims

1. Anticorpo 006-H08 que antagoniza a sinalização mediada pelo receptor da prolactina e que se liga a epítopos do domínio extracelular do receptor da prolactina e variantes polimórficas humanas do mesmo, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido do domínio extracelular do receptor da prolactina corresponde à SEQ ID NO: 70, e a sequência de ácido nucleico corresponde à SEQ ID NO: 71, em que SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 7 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3 e SEQ ID NO: 18 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 29 corresponde a LCDR3, e em que a. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 74 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 78 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 90 corresponde a LCDR3; ou b. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 75 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 82 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 91 corresponde a LCDR3; ou c. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 7 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 82 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 29 corresponde a LCDR3; ou d. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 7 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 86 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 29 corresponde a LCDR3; ou e. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 74 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 87 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 100 corresponde a LCDR3; ou f. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 74 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 87 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 92 corresponde a LCDR3; ou g. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 74 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 89 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 93 corresponde a LCDR3; ou h. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 74 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 79 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 101 corresponde a LCDR3, or i. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 76 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 89 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 90 corresponde a LCDR3; ou j. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 7 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 18 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 100 corresponde a LCDR3; ou k. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 7 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 18 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 97 corresponde a LCDR3; ou l. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 7 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 18 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 98 corresponde a LCDR3; ou m. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 74 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 83 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 99 corresponde a LCDR3; ou n. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 7 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 18 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 96 corresponde a LCDR3; ou o. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 7 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 18 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 94 corresponde a LCDR3; ou p. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 74 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 88 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 90 corresponde a LCDR3; ou q. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 74 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 81 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 95 corresponde a LCDR3; ou r. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 75 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 18 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 29 corresponde a LCDR3; ou s. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 77 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 18 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 29 corresponde a LCDR3; ou t. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 7 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 80 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 29 corresponde a LCDR3; ou u. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 7 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 85 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 29 corresponde a LCDR3 9; ou v. SEQ ID NO: 1 da cadeia variável pesada corresponde a HCDR1, SEQ ID NO: 7 corresponde a HCDR2, SEQ ID NO: 13 corresponde a HCDR3, e SEQ ID NO: 84 da cadeia variável leve corresponde a LCDR1, SEQ ID NO: 24 corresponde a LCDR2 e SEQ ID NO: 29 corresponde a LCDR3.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a. 006-H08 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 46, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 34, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 52, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 40, b. 006-H08-12-2 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 331, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 353, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 165, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 143, c. 006-H08-13-2 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 332, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 354, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 166, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 144, d. 006-H08-13-6-1 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 333, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 355, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 167, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 145, e. 006-H08-14-6-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 334, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 356, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 168, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 146, f. 006-H08-15-5 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 335, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 357, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 169, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 147, g. 006-H08-19-1 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 336, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 358, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 170, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 148, h. 006-H08-29-1 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 337, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 359, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 171, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 149, i. 006-H08-32-2 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 338, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 360, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 172, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 150, j. 006-H08-33-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 339, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 361, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 173, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 151, k. 006-H08-33-16-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 340, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 362, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 174, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 152, l. 006-H08-35-17-1 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 341, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 363, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 175, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 153, m. 006-H08-35-17-4 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 342, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 364, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 176, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 154, n. 006-H08-35-1 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 343, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 365, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 177, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 155, o. 006-H08-36-17-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 344, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 366, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 178, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 156, p. 006-H08-37-19-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 345, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 367, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 179, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 157, q. 006-H08-39-7 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 346, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 368, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 180, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 158, r. 006-H08-48-5 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 347, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 369, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 181, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 159, s. 006-H08-53-27-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 348, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 370, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 182, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 160, t. 006-H08-59-30-0 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 349, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 371, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 183, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 161, u. 006-H08-63-32-4 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 350, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 372, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 184, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 162, v. 006-H08-65-33-2 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 351, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 373, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 185, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 163, w. 006-H08-68-35-2 compreende um domínio da cadeia variável pesada que corresponde a uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 352, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 374, e um domínio da cadeia variável leve com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 186, e uma sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 164.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que consiste em uma região de ligação de antígeno que especificamente liga ou tem uma afinidade alta para uma ou mais regiões de PRLR, cuja sequência de aminoácido é descrita pela SEQ ID NO: 70 e variantes polimórficas humanas da SEQ ID NO: 70, posição de aminoácido 1 a 210, por meio do qual a afinidade é pelo menos 100 nM, preferivelmente menos que cerca de 100 nM, mais preferivelmente menos que cerca de 30 nM, até mesmo mais preferido com uma afinidade de menos que cerca de 10 nM, ou até mesmo mais preferido com uma afinidade de menos que 1 nM.

4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a constante pesada é uma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 modificada ou não-modificada.

5. Sequência de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 5.

7. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 6 ou uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 5, em que o microrganismo transgênico é uma célula de levedura ou uma célula bacteriana.

8. Método de usar o microrganismo transgênico como definido na reivindicação 7, para produzir um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cultivar o microrganismo transgênico sob condições adequadas e recuperar o dito anticorpo.

9. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser purificado a pelo menos 95% de homogeneidade em peso.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um veículo farmaceuticamente aceitável compreendendo excipientes e auxiliares.

11. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de anticorpo 006-H08 ou variantes amadurecidas do mesmo, empacotados em um recipiente, em que opcionalmente ainda contém um segundo agente terapêutico.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso como medicamento para tratamento e/ou prevenção de endometriose e adenomiose (endometriose interna).

13. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso como medicamento para tratamento de doença de mama benigna e mastalgia.

14. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso como medicamento para a inibição de lactação.

15. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso como medicamento para tratamento de hiperplasia de próstata benigna.

16. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso como medicamento para o tratamento de perda de cabelo hiper e normoprolactinêmica.

17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende anticorpos de PRLR ou fragmento de ligação de antígeno como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em combinação com pelo menos um outro agente.