MX2012006621A

MX2012006621A - Anticuerpos neutralizadores contra el receptor de prolactancia y su uso terapeutico.

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Publication number: MX2012006621A
Application number: MX2012006621A
Authority: MX
Inventors: Christiane Otto; Siegmund Wolf; Christoph Freiberg; Axel Harrenga; Simone Greven; Mark Trautwein; Sandra Bruder; Andrea Eicker; Andreas Wilmen
Original assignee: Bayer Ip Gmbh
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2012-10-05
Also published as: CA2783513C; EP2510002A1; IN2012DN05078A; US20130272968A1; ZA201204214B; HUE031631T2; NZ600512A; DOP2012000160A; US20120321632A1; CU23973B1; PE20121561A1; EP2570436A1; AR079352A1; BR112012015852B1; MX339343B; TWI508744B; US9649374B2; JP2013513362A; PT2510002T; ES2603352T3

Abstract

El anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina 006-H08, formas maduras de éste y fragmentos de unión al antígeno de éste. Composiciones farmacéuticas que los contienen. Su uso en el tratamiento o la prevención de trastornos e indicaciones benignos mediados por el receptor de prolactina, tales como la endometriosis, la adenomiosis, la anticoncepción femenina no hormonal, la enfermedad mamaria benigna y la mastalgia, la inhibición de la lactancia, la hiperplasia prostática benigna, los fibroides, la pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica, y como tratamiento concurrente en una terapia hormonal combinada, con el fin de inhibir la proliferación de las células del epitelio mamario. Los anticuerpos de la invención bloquean la señalización mediada por el receptor de prolactina.

Description

ANTICUERPOS NEUTRALIZADORES CONTRA EL RECEPTOR DE PRO LACTINA Y SU USO TERAPÉUTICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el anticuerpo contra el receptor de prolactina 006-H08. Se proveen regiones de unión al antígeno y anticuerpos recombinantes y fragmentos funcionales que contienen dichas regiones de unión al antígeno, que se unen específicamente al receptor de prolactina y lo neutralizan. La presente invención también se relaciona con secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos precedentes, con vectores que los contienen, con composiciones farmacéuticas que los contienen y con su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades e indicaciones benignas que se benefician con la inhibición de la señalización mediada por el receptor de prolactina, tales como la endometriosis, la adenomiosis, la anticoncepción femenina no hormonal, la enfermedad mamaria benigna y la mastalgia, la inhibición de la lactancia, la hiperplasia prostética benigna, los fibroides, así como la pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica, y como tratamiento concurrente en una terapia hormonal combinada, con el objeto de inhibir la proliferación de las células del epitelio mamario.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Hay una necesidad médica insatisfecha relacionada con el tratamiento de diversas enfermedades e indicaciones benignas como la endometriosis, la adenomiosis, la anticoncepción femenina no hormonal, la enfermedad mamaria benigna y la mastalgia, la inhibición de la lactancia, la hiperplasia prostética benigna, los fibroides, la pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica, así como con la prevención de la proliferación de las células del epitelio mamario en las terapias hormonales combinadas (es decir, las terapias con estrógeno y progestina) La prolactina (PRL) es una hormona polipeptídica compuesta por 199 aminoácidos. La PRL pertenece a la familia de hormonas polipeptídicas de la hormona del crecimiento (GH) y el lactógeno placentario (PL), y es sintetizada en las células lactotróficas de la pituitaria y en diversos tejidos extrapituitarios, tales como los linfocitos, las células del epitelio mamario, el miometrio y la próstata. Dos promotores diferentes regulan la síntesis de PRL en la pituitaria y fuera de ella (BioEssays 28:1051-1055, 2006).

La PRL se une al receptor de PRL (PRLR), un receptor transmembrana individual que pertenece a la superfamilia de los receptores de citoquina de la clase 1 (Endocrine Reviews 19:225-268, 1998). El PRLR existe en tres isoformas diferentes, las formas corta, larga e intermedia, que pueden distinguirse en función de la longitud de sus colas citoplasmáticas. Al unirse al ligando, un proceso en cadena da como resultado la activación del PRLR. La PRL ¡nteractúa a través de su sitio de unión 1 con una molécula del PRLR, y luego atrae una segunda molécula receptora a través de su sitio de unión 2, con lo que se obtiene un dímero activo del PRLR. La dimerización del PRLR da como resultado la activación predominante de la vía JAK/STAT (la quinasa Janus/los transductores de señales y los activadores de la transcripción). Al dimerizarse el receptor, las JAK asociadas al receptor (predominantemente JAK2) se transfosforilan y se activan mutuamente. Además, el PRLR también se fosforila y puede unirse a las proteínas que contienen dominios con SH2, tales como las proteínas STAT. Posteriormente, las proteínas STAT unidas al receptor se fosforilan, se disocian del receptor y se translocan al núcleo, donde estimulan la transcripción de los genes blanco. Además, se ha descripto la activación de la vía de Ras-Raf-MAPK y la activación de la quinasa citoplasmática src por los PRLR (para hallar una revisión, véase Endocrine Reviews 19:225-268, 1998).

La señalización mediada por el PRLR participa en una variedad de procesos, tales como el desarrollo de las glándulas mamarias, la lactancia, la reproducción, el crecimiento de los tumores mamarios y prostáticos, las enfermedades autoinmunes, el crecimiento y el metabolismo general y la inmunomodulación (Endocrine Reviews 19:225-268, 1998; Annu. Rev. Physiol. 64:47-67,2002).

En la actualidad, no es posible una interferencia completa con la señalización mediada por el PRLR. La única manera de interferir con la señalización mediada por el PRLR es mediante la inhibición de la secreción de PRL en la pituitaria, per medio del uso de bromocriptina y otros agonistas del receptor de dopamina 2 (Nature Clinical Practice Endocrinology and etabolism 2(10): 571-581 , 2006). Sin embargo, estos agentes no suprimen la síntesis de PRL fuera de la pituitaria, que puede compensar exitosamente la síntesis de PRL en la pituitaria, lo que puede resultar en una interrupción prácticamente completa de la señalización mediada por el PRLR (Endocrine Reviews 19:225-268,1998). Entonces, no es sorprendente que los agonistas del receptor de dopamina del tipo 2 no fueran beneficiosos en los pacientes que sufrían cáncer de mama o enfermedades autoinmunes, tales como el lupus sistémico o la artritis reumática (Breast Cáncer Res. Treat. 14:289-29, 1989; Lupus 7:414-419, 1998), aunque la prolactina hubiera sido implicada en estas enfermedades. La síntesis local de prolactina en las células del cáncer de mama o en los linfocitos, que cumple una función fundamental en el carcinoma mamario o en las enfermedades autoinmunes, respectivamente, no fue bloqueada por los agonistas del receptor de dopamina.

A pesar de los intentos mencionados con anterioridad para proveer medios para el tratamiento o la prevención de enfermedades e indicaciones benignas como la endometriosis, la adenomiosis, la anticoncepción femenina no hormonal, la enfermedad mamaria benigna y la mastalgia,' la inhibición de la lactancia, la hiperplasia prostética benigna, los fibroides, la pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica, y como tratamiento concurrente en terapias hormonales combinadas, con el propósito de prevenir la proliferación de las células del epitelio mamario, aún no hay compuestos disponibles para satisfacer estas necesidades. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es solucionar estos pro-blemas mediante la provisión de compuestos que son agentes terapéuticos para estas enfermedades e indicaciones benignas.

Recientemente, se identificaron anticuerpos novedosos que presentan especificidad y una afinidad elevada por el PRLR, por lo que neutralizan la señalización mediada por el PRLR y pueden proveerle un beneficio terapéutico al sujeto.

El bloqueo de la activación del PRLR por los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR da como resultado una inhibición completa de la señalización mediada por el PRLR. En contraste, los agonistas receptor de dopamina solamente pueden interferir con la señalización mediada por el PRLR incrementada en respuesta a una secreción elevada de prolactina en la pituitaria, pero no con la señalización mediada por el PRLR incrementada debida a una mutación de activación del PRLR o a una producción localmente elevada de prolactina.

Entonces, el problema se soluciona al proveerse el anticuerpo 006-H08 y fragmentos de unión al antígeno de éste o variantes de éste, que son de utilidad en el tratamiento de las enfermedades y las indicaciones benignas mencionadas con anterioridad, que se unen al PRLR con una afinidad elevada, que neutralizan de manera eficiente la señalización mediada por el PRLR y que preferiblemente también reaccionan con el PRLR de otras especies, tales como Macacoa mulatta, Macacoa fascicularis, Mus musculus o Rattus norvegicus.

Se han descripto algunos anticuerpos contra el PRLR en la solicitud WO2008/022295 (Novartis) y en la Patente de los EEUU N° 7422899 (Biogen). La presente invención se basa en el descubrimiento de anticuerpos novedosos que presentan especificidad y una afinidad elevada por el PRLR, por lo que neutralizan la señalización mediada por el PRLR y pueden proveerle un beneficio terapéutico al sujeto (las secuencias de los nuevos anticuerpos son como las que se detallan en SEQ ID N° 34, 40, 46 y 52). Los anticuerpos de la invención, que pueden ser anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o humanos modificados, pueden usarse en muchos contextos que serán descriptos con mayor detalle en la presente.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Entonces, un objeto de la presente invención es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, donde dicho anticuerpo antagoniza la señalización mediada por el receptor de prolactina.

Los anticuerpos novedosos "002-H06", "002-H08", "0?6-?07", "001-E06" y "005-C04" son los sujetos de las solicitudes correspondientes.

La caracterización in vivo de estos anticuerpos en modelos de enfermedades en ratones solamente es posible con un anticuerpo que también es capaz de reaccionar con el receptor de prolactina murino. Solamente el anticuerpo 005-C04, que se describe en la solicitud correspondiente, presenta una capacidad de reacción transversal suficiente con el receptor de prolactina murino, por lo que es el único anticuerpo que puede usarse en modelos murinos in vivo. Por ende, los resultados obtenidos con este anticuerpo han de servir como una generalización para la eficacia de los otros anticuerpos neutralizadores contra el receptor de prolactina, que se describen en los modelos de las enfermedades analizadas en las solicitudes correspondientes.

Los anticuerpos se caracterizaron en diversos sistemas celulares para determinar su especificidad por las especies y su potencia, así como su eficacia en distintos paradigmas de análisis, relacionados con la inactivación de la señalización mediada por el PRLR (véanse los ejemplos 5-10). Se llevaron a cabo ensayos de proliferación con células Nb2-1 1 de rata (ejemplo 6, figura 6) o en células Ba/F transfectadas de manera estable con el PRLR humano (ejemplo 5, figura 5) o con el PRLR murino (ejemplo 10, figura 10). Mientras que el anticuerpo XHA 06.983 de Novartis no presentó actividad sobre los PRLR de rata o de ratón, el anticuerpo XHA 06.642 de Novartis presentó actividad sobre el PRLR de rata, pero no sobre el PRLR murino. XHA 06.642 inhibió la señalización mediada por el PRLR humano (ejemplos 5, 7, 8). El anticuerpo novedoso de la presente invención 006-H08 presentó la potencia más alta con relación a la inhibición de la proliferación de las células Ba/F transfectadas de manera estable con el PRLR humano (ejemplo 5, figura 5). El anticuerpo novedoso 005-C04, de la solicitud correspondiente, fue el único anticuerpo que también reaccionó con el PRLR murino (ejemplo 10, 9) y humano (ejemplos 5, 7, 8). En contraste con el anticuerpo XHA 06.642 de Novartis, el nuevo anticuerpo 005-C04 es apropiado para evaluar la inhibición de la señalización mediada por el PRLR en modelos murinos. Los otros anticuerpos que se describen en esta solicitud o en las solicitudes correspondientes presentan especificidad por el PRLR humano. Además de los ensayos de proliferación con células (ejemplos 5, 6, 10), se llevaron a cabo ensayos con luciferasa como indicador, usando células HEK293 transfectadas de manera estable con el PRLR humano (ejemplo 8) o murino (ejemplo 9) y transfectadas de manera transitoria con un gen indicador de luciferasa bajo el control de LHRE (elementos de respuesta hormonal lactogénicos). Usando estos sistemas, nuevamente resultó evidente la incapacidad del anticuerpo XHA 06.642 de Novartis de bloquear de manera eficiente la señalización mediada por el PRLR murino (ejemplo 9). En contraste, el anticuerpo novedoso 005-C04 (que se describe en la solicitud correspondiente) bloqueó la activación del gen indicador de la luciferasa por el PRLR murino (ejemplo 9). La fosforilación de STAT5 en células T47D humanas ha sido usada como parámetro adicional para analizar la actividad de inhibición de los anticuerpos sobre el PRLR humano (ejemplo 7, figura 7). Como era de esperarse, los anticuerpos no específicos no presentaron actividad en ninguno de los paradigmas experimentales analizados.

La presente invención se relaciona con métodos para inhibir el crecimiento de las células positivas para el PRLR y el progreso de las enfermedades y las indicaciones benignas mencionadas con anterioridad. En estos métodos se emplean anticuerpos anti-PRLR. Se proveen anticuerpos monoclonales humanos, fragmentos de unión al antigeno de éstos y variantes de los anticuerpos y de los fragmentos, que se unen específicamente al dominio extracelular (ECD) del PRLR (SEQ ID N° 70) o de variantes polimórficas humanas de SEQ ID N° 70, tales como las variantes I146L y I76V, que se describen en PNAS 105 (38), 14533, 2008, y en J. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (1 ), 271 , 2010.

Otro objeto de la presente invención es un anticuerpo que se une a los epitopes del dominio extracelular del receptor de prolactina y de las variantes polimórficas humanas de éste, donde la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del receptor de prolactina corresponde a SEQ ID N° 70 y la secuencia del ácido nucleico corresponde a SEQ ID N° 71.

Los anticuerpos, los fragmentos de unión al antigeno y las variantes de los anticuerpos y los fragmentos de la invención están compuestos por una región variable de la cadena liviana y una región variable de la cadena pesada. Las variantes de los anticuerpos o los fragmentos de unión al antigeno que se contemplan en la invención son moléculas en las que se conserva la actividad de unión al PRLR del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno del anticuerpo (las secuencias se detallan en la tabla 5).

Entonces, un objeto de la presente invención es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno compiten con el anticuerpo 006-H08 o con variantes maduras definidas de éste. Las secuencias de los anticuerpos y sus variantes maduras se detallan en la tabla 5.· En otra forma de realización, se describe un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, donde a. las secuencias de aminoácidos de las regiones variables pesada y liviana son al menos 60%, más preferiblemente 70%, más preferiblemente 80% o 90%, o aun más preferiblemente 95% idénticas a SEQ ID N° 34 para el dominio variable de la cadena pesada y a SEQ ID N° 40 para el dominio variable de la cadena liviana, o b. para las formas maduras de anticuerpo 006-H08, las secuencias de aminoácidos de los dominios de las cadenas pesada y liviana variables son al menos 60%, más preferiblemente 70%, más preferiblemente 80% o 90%, o aun más preferiblemente 95% idénticas, o c. las secuencias de aminoácidos de las CDR son al menos 60%, más preferiblemente 70%, más preferiblemente 80%, más preferiblemente 90% o aun más preferiblemente 95% idénticas a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 para el dominio de la cadena pesada y a SEQ ID N° 18, 24 y 29 para el dominio variable de la cadena liviana.

En otra forma de realización, se describe un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno que comprenden las CDR del anticuerpo 006-H08, donde a. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 29. b. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 78, 24 y 90, o c. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 75 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 82, 24 y 91 , o d. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 82, 24 y 29, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 86, 24 y 29, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 87, 24 y 100, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 87, 24 y 92, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 89, 24 y 93, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 79, 24 y 101 , o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 76 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 89, 24 y 90, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 100, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 97, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 la cadena pesada vanable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 83, 24 y 99, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 96, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 94, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 88, 24 y 90, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 81 , 24 y 95, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 75 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 29, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 77 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 29, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 80, 24 y 29, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 85, 24 y 29, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 84, 24 En una forma de realización, se describe el anticuerpo humano 006-H08 o una forma madura de éste, donde el anticuerpo a. 006-H08 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 46 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 34, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 52 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 40, b. 006-H08-12-2 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 331 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 353, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 165 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 143, c. 006-H08-13-2 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 332 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 354, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 166 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 144, d. 006-H08-13-6-1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 333 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 355, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 167 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 145, e. 006-H08-14-6-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 334 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 356, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 168 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 146, f. 006-H08-15-5 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 335 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 357, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 169 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 147, g. 006-H08-19-1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 336 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 358, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 170 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 148, h. 006-H08-29-1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 337 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 359, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 171 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 149, i. 006-H08-32-2 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 338 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 360, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 172 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 150, j. 006-H08-33-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 339 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 361 , así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 173 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 151 , k. 006-H08-33-16-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 340 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 362, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 174 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 152, I. 006-H08-35-17-1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 341 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 363, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 175 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 153, m. 006-H08-35-17-4 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 342 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 364, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 176 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 154, 006-H08-35-1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 343 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 365, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 177 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 155, 006-H08-36-17-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 344 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 366, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 178 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 156, 006-H08-37-19-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 345 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 367, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 179 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 157, 006-H08-39-7 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 346 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 368, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 180 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 158, 006-H08-48-5 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 347 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 369, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 181 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 159, 006-H08-53-27-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 348 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 370, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 182 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 160, 006-H08-59-30-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 349 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 371 , así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 183 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 161 , u. 006-H08-63-32-4 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 350 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 372, asi como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 184 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 162, v. 006-H08-65-33-2 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 351 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 373, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 185 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 163, w. 006-H08-68-35-2 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 352 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 374, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 186 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 164.

En aun otra forma de realización, se describen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos mencionados, donde a. el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7, 13, 18, 24 y 29, o b. el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74, 13, 78, 24 y 90, o c. el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 75, 13, 82, 24 y 91 , o d. el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7, 13, 82, 24 y 29, o e. el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 7, 13, 86, 24 y 29, o anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 74, 13, 87, 24 y 100, o anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 74, 13, 87, 24 y 92, o h. anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 74, 13, 89, 24 y 93, o anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 74, 13, 79, 24 y 101 , o j. anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 76, 13, 89, 24 y 90, o k. anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 7, 13, 18, 24 y 100, o anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 7, 13, 18, 24 y 97, o m. anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 7, 13, 18, 24 y 98, o n. anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 74, 13, 83, 24 y 99, o o. anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 7, 13, 18, 24 y 96, o anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 7, 13, 18, 24 y 94, o anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 74, 13, 88, 24 y 90, o anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 74, 13, 81 , 24 y 95, o s. anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 75, 13, 18, 24 y 29, o t. el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 77, 13, 18, 24 y 29, o u. el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7, 13, 80, 24 y 29, o v. el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7, 13, 85, 24 y 29, o w. el anticuerpo contiene una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7, 13, 84, 24 y 29.

En otra forma de realización de la presente invención, el anticuerpo 006-H08 consiste en una región de unión al antígeno que se une específicamente a una o más regiones del PRLR o que presenta una afinidad elevada por ellas, cuya secuencia de aminoácidos se ilustra en SEQ ID N° 70 y en las variantes polimórficas humanas de SEQ ID N° 70, en los aminoácidos entre las posiciones 1 y 210, donde la afinidad es de al menos 100 nM, preferiblemente menor que aproximadamente 100 nM, más preferiblemente menor que aproximadamente 30 nM, aun más preferiblemente menor que aproximadamente 10 nM, aun más preferiblemente menor que 1 nM o aun más preferiblemente menor que 30 pM.

Otro objeto de la presente invención es el anticuerpo 006-H08 mencionado con anterioridad, donde la región pesada constante es una lgG1 , una lgG2, una lgG3 o una lgG4 modificada o no modificada.

En la tabla 1 se provee un resumen de las constantes de disociación y las velocidades de disociación de anticuerpos representativos de la invención, que pueden determinarse por medio de una resonancia de plasmón superficial (Biacore) con dominios extracelulares monoméricos del PRLR (SEQ ID N° 70) en anticuerpos inmovilizados directamente.

Tabla 1. Constantes de disociación y velocidades de disociación monovalentes del dominio extracelular del PRLR humano expresado en células HEK293, determinadas para moléculas de lgG1 humana anti-PRLR por resonancia de plasmón superficial Para la determinación de la afinidad basada en células, se usó el formato de lgG1. La determinación se efectuó por medio de una clasificación de las células activadas por fluorescencia (FACS) en combinación con un análisis de Scatchard.

En la tabla 2 se detalla la fuerza de la unión de anticuerpos de IgG representativos sobre la línea de células de cáncer de mama humano T47D y sobre la línea de células de linfoma de rata Nb2.

Tabla 2. Potencia de la unión basada en células de los anticuerpos anti-PRLR, determinada por medio de una FACS en la línea de células de cáncer de mama humano T47D y la línea de células de linfoma de rata Nb2 Generación de los anticuerpos Para aislar un panel de anticuerpos capaces de bloquear de manera funcional el PRLR humano y murino, se investigaron en paralelo dos formatos de la biblioteca de presentación de anticuerpos humanos sintéticos en fagos denominada n-CoDeR®, de Bioinvent (Sóderlind et al. 2000, Nature BioTechnology. 18, 852-856), donde se expresaban fragmentos scFv y Fab, respectivamente. Los blancos usados para la selección de los fragmentos scFv o Fab fueron el ECD soluble del PRLR humano (los aminoácidos entre las posiciones 1 y 210 de SEQ ID N° 70) y del PRLR de ratón (los aminoácidos entre las posiciones 1 y 210 de SEQ ID N° 72), que se aplicaron como variantes biotiniladas (con biotina NHS-LC, Pierce) y no biotiniladas, así como la línea de células de cáncer de mama humano T47D, donde se expresaba el PRLR.

Se usó una combinación de diversos abordajes con una tecnología de presentación en fagos (PDT) para aislar anticuerpos monoclonales monoclonales con especificidad y una gran afinidad por el PRLR. Se trató de una combinación de análisis de proteínas y ensayos en células completas que comprendió el desarrollo de herramientas específicas. Las herramientas y los métodos usados para el análisis incluyen el ECD del PRLR humano y de ratón expresados de manera recombinante en una fusión con un dominio Fe (R&D Systems, catálogo N° 1167-PR y 1309-PR, respectivamente, posiciones 1-216 de SEQ ID N° 70 y 72, respectivamente, cada uno fusionado al dominio Fe de la lgG1 humana, posiciones 100-330 de la lgG1 humana), el dominio extracelular del PRLR humano expresado de manera recombinante en una fusión con una marca de seis histidinas (SEQ ID N° 70), la línea de células HEK293 y la línea de células de linfoma murino Ba/F, cada una transfectada de manera estable con el PRLR humano y murino, respectivamente, así como la línea de células de cáncer de mama T47D y la línea de células de linfoma de rata Nb2, en cada una de las cuales se expresaba de manera natural el PRLR. También abarcaron el desarrollo de procedimientos y ensayos de búsqueda con los que pudieran identificarse los anticuerpos neutralizadores capaces de unirse de manera preferencial al PRLR en la superficie de las células, y que también pudieran reaccionar con los PRLR de ratón y de rata (véanse los ejemplos 6 y 10).

El análisis comprendió primero identificar los componentes que se unieran al PRLR humano y eventualmente al PRLR de ratón en pruebas de ELISA, mediante el uso de antígenos expresados de manera recombinante. Luego se examinó la unión de los fragmentos Fab y scFv en células T47D por medio de análisis de FACS, a lo que siguió el análisis de la actividad de neutralización de estos agentes sobre la señalización intracelular. Con este propósito, se determinó la inhibición de la fosforilación del PRLR, de STAT5 y de ERK1/2 en células T47D (véase el ejemplo 14). Los mejores fragmentos scFv y Fab que bloquearon la función fueron convertidos en moléculas de lgG1 completas, después de lo cual se evaluó su afinidad monovalente por el ECD del PRLR y su actividad de inhibición en ensayos con genes indicadores de luciferasa, así como en ensayos de proliferación con células que se desarrollaban de una manera dependiente de la prolactina. La combinación de estos métodos específicos permitió aislar el anticuerpo novedoso "006-H08", que es el sujeto de la presente invención, así como los anticuerpos "002-H06", "002-H08", "006-H07", "001-E06" y "005-C04", que son los sujetos de las solicitudes correspondientes.

Variantes de los péptidos Los anticuerpos de la invención no se limitan a las secuencias peptídicas específicas que se proveen en la presente. Por el contrario, la invención también abarca variantes de estos polipéptidos. Con relación a la presente invención y a la tecnología y las referencias disponibles en la actualidad, aquellos versados en la técnica han de poder preparar, evaluar y utilizar variantes funcionales de los anticuerpos que se describen en la presente, pero también han de apreciar que las variantes que puedan unirse al PRLR y lo bloqueen de manera funcional quedarán dentro del alcance de la presente invención.

Una variante puede incluir, p.ej., un anticuerpo que tiene al menos una región de determinación de la complementariedad (CDR) (hipervariable) y/o un dominio/una posición del marco (FR) (variable) alterados respecto de la secuencia peptídica que se describe en la presente. Para ilustran con mayor detalle este concepto, a continuación se proveerá una descripción breve de la estructura de los anticuerpos.

Un anticuerpo está compuesto por dos cadenas peptídicas, cada una de las cuales contiene un dominio constante de la cadena liviana o tres dominios constantes de la cadena pesada y una región variable (VL, VH). En cada caso, esta última está compuesta por cuatro regiones FR (VH: HFR1 , HFR2, HFR3, HFR4; VL: LFR1 , LFR2, LFR3, LFR4) y tres CDR separadas (VL: LCDR1, LCDR2, LCDR3; VH: HCDR1 , HCDR2, HCDR3). El sitio de unión al antígeno está formado por una o más CDR, pero son las regiones FR las que proveen el marco estructural para las CDR, por lo que tienen una función importante en la unión al antígeno. Por medio de la alteración de uno o más residuos de aminoácidos en una región CDR o FR, aquellos versados en la técnica han de poder generar o diversificar de manera convencional las secuencias de los anticuerpos. Estas secuencias pueden analizarse contra el antígeno, por ejemplo, para establecer si presentan propiedades novedosas o mejoradas.

En la figura 12 se proveen esquemas de la numeración de la posición de cada aminoácido en los dominios variables VL y VH. En las tablas 3 (VH) y 4 (VL) se detallan las regiones de las CDR de determinados anticuerpos de la invención y se comparan los aminoácidos en una posición dada. También se los compara con una secuencia de consenso correspondiente o con un "gen maestro", en cuyo caso las regiones de las CDR están marcadas con una "X". En las tablas 5 y 6 se detallan las asignaciones de los números de los identificadores de secuencias para los anticuerpos, los fragmentos de anti-cuerpos y las variantes del PRLR que se proveen en esta invención.

Tabla 3. Secuencias VH HCD l— | 001-E06 VH QVELLESGGG LVQPGGSL L 5CAASGFTFS S. YWM5WVRQ APGKGLEWVS 002-H06 VH QVELLESGGG LVQPGG5L L 5CAASGFTFA N. YGLTWVRQ APGKGLEWVA 002-H08 VH QVELLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS S. YGMHWVRQ APGKGLEWVS 005 - C04 VH EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS S. YWMHWVRQ APGKGLEWVS 006-H07 VH QVELLESGGG LVQPGGSL L 5CAA5GFTFE D. HGM5WVRQ APGKGLEWVS 006-H08 VH QVELLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFD D. YGMS VRQ APGKGLEWVA consenso EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTXX XXXXXXXVRQ APGKGLEWVX 001-E06 VH 002 - H06 VH 002 -H08 VH 005-C04 VH 006-H07 VH 006-H08 VH consenso —HCDR3 001- E06 VH TPLAYSSGWY YFDYWGQGTL VTVSS 002 -H06 VH PLES PV AFDIWGQGTL VTVSS 002-H08 VH G G DFDYWGQGTL VTVSS 005-C04 VH GLDA R RMDYWGQGTL VTVSS 006- H07 VH SLR AT AFDTWGQGTL VTVSS 006-H08 VH PLES PV AFDIWGQGTM VIVSS consenso XXXXXXXXXX XXXXM.QGTL VTVSS Tabla 4. Secuencias VL | LCDR1 001 -E06 VL DIVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG S . NTVNWYQQ LPGTAPKLLI 002 -H06 VL QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSYSNIG G . NPVNWYQQ LPGTAPKLLI 002 -H08 VL QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG S. NDVYWYQQ LPGTAPKLLI 005 -C04 VL QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCTGSSSNIG AGYWHWYQQ LPGTAPKLLI 006 -H07 VL QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSSSNIG N . NAVNWYQQ LPGTAPKLLI 006 -H08 VL DIVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCSGSNSNIG S. NPVNWYQQ LPGTAPKLLI consGnso QSVLTQPPSA SGTPGQRVTI SCXXXXXXXX XXXXXXWYQQ LPGTAPKLLI |LCDR2| 1- LCDR3— 001 -E06 VL YRNYQRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC QSYDSSLSG. 002 -H06 VL YGNSNRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC QSYD5SLSG. 002 -H08 VL YDNNKRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC QSYD5SLSGS 005 -C04 VL YRNNQRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC AAWDDSLNG. 006 -H07 VL YSNNQRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC AAWDDSLSG. 006 -H08 VL YDNNKRPSGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYC QSY TGLSG. consenso YXXXXXXXGV PDRFSGSKSG TSASLAISGL RSEDEADYYX xxxxxxxxx 1 1 001 -E06 VL SVFGGGTKLT VLGQ 002 -H06 VL SVFGGGTKLT VLGQ 002 -H08 VL VFGGGTKLT VLGQ 005 -C04 VL WLFGGGTKLT VLGQ 006--H07 VL WVFGGGTKLT VLGQ 006· -H08 VL WVFGGGTKLT VLGQ consenso XXFGGGTKLT VLGQ Tabla 5. Secuencias de los anticuerpos Tabla 6. Secuencias de las variantes del PRLR Aquellos versados en la técnica han de poder usar los datos en las tablas 3, 4 y 5 para diseñar variantes de los péptidos que se hallen dentro del alcance de la presente invención. Es preferible que las variantes se construyan cambiando los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR. Una variante también puede presentar una o más regiones del marco (FR) alteradas. Por ejemplo, puede alterarse un péptido en el dominio de la FR para obtener una desviación respecto de la secuencia de la línea germinal.

Con relación a la comparación de los anticuerpos novedosos con la secuencia de consenso o el "gen maestro" correspondiente, que se ilustra en la figura 12, los residuos candidatos que pueden cambiarse incluyen, por ejemplo, los siguientes: - el cambio del residuo de lisina (K) en la posición 75 de la VH de 006-H08 (SEQ ID N° 34) por glutamina (Q), - el cambio del residuo de leucina (L) en la posición 108 de la VH de 006-H08 (SEQ ID N° 34) por metionina ( ), - el cambio del residuo de treonina (T) en la posición 110 de la VH de 006-H08 (SEQ ID N° 34) por isoleucina (I), - el cambio del residuo de fenilalanina (F) en la posición 67 de la VH de 002-H08 (SEQ ID N° 36) por leucina (L).

Además, las variantes pueden obtenerse por maduración, es decir, usando un anticuerpo como punto de partida para la optimización, mediante la diversificación de uno o más residuos de aminoácidos en el anticuerpo, preferiblemente los residuos de aminoácidos en una o más CDR, a lo que sigue el análisis la colección resultante de variantes del anticuerpo, con el objeto de hallar variantes con propiedades mejoradas. En particular, se prefiere la diversificación de uno o más residuos de aminoácidos en la LCDR3 de la VL, en la HCDR3 de la VH, en la LCDR1 de la VL y/o en la HCDR2 de la VH. La d ¡versificación puede efectuarse sintetizando una colección de moléculas de ADN con la tecnología de mutagénesis de trinucleótidos (TRIM) [Virnekás, B., Ge, L, Plückthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G., y Moroney S.E. (1994) Trinucleotide phosphoramidites: ideal reacants for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucí. Acids Res. 22, 5600].

Variantes de aminoácidos conservativas Pueden prepararse variantes de los polipéptidos que conservan la estructura molecular general de un anticuerpo con una secuencia peptídica como las que se describen en la presente. Cuando se analizan las propiedades de los aminoácidos individuales, es posible reconocer algunas sustituciones racionales. Las sustituciones de aminoácidos, es decir, las "susti-tuciones conservativas", pueden realizarse, p.ej., sobre la base de la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza antipática de los residuos en cuestión.

Por ejemplo, (a) los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen la alanina, la leucina, la isoleucina, la valina, la prolina, la fenilalanina, el triptofano y la metionina; (b) los aminoácidos polares neutros incluyen la glicina, la serina, la treonina, la cisteína, la tirosina, la asparragina y la glutamina; (c) los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen la arginina, la lisina y la histidina; y (d) los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico. Las sustituciones típicamente pueden efectuarse dentro de los grupos (a)-(d). Además, es posible reemplazar glicina por prolina, o viceversa, sobre la base de su capacidad de interrumpir las hélices a. De manera similar, determinados aminoácidos, tales como la alanina, la cisteína, la leucina, la metionina, el ácido glutámico, la glutamina, la histidina y la lisina, pueden hallarse con mayor frecuencia en las hélices a, mientras que la valina, la isoleucina, la fenilalanina, la tirosina, el triptofano y la treonina pueden hallarse con mayor frecuencia en las láminas plegadas ß. La glicina, la serina, el ácido aspártico, la asparragina y la prolina pueden hallarse con frecuencia en los giros. A continuación se detallan grupos de sustitución preferidos: (i) S y T; (ii) P y G; y (iii) A, V, L y I. Al tomar en consideración el código genético conocido y las técnicas de ADN recombinante y sintético, aquellos versados en la técnica han de poder construir con facilidad ADN que codifican las variantes de aminoácidos conservativas.

Como se la usa en la presente, la "identidad de secuencia" entre dos secuencias de polipéptidos hace referencia al porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias. La "homología de secuencia" hace referencia al porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones de aminoácidos conservativas. Las secuencias de los polipéptidos preferidos de la invención tienen una identidad de secuencia en las regiones de las CDR que es de al menos 60%, más preferiblemente de al menos 70% u 80%, aun más preferiblemente de al menos 90%, y más preferiblemente de al menos 95%. Los anticuerpos preferidos también tienen una homología de secuencia en las regiones de las CDR que es de al menos 80%, más preferiblemente de 90% y más preferiblemente de 95%. Sin embargo, todas las moléculas descriptas bloquean la señalización mediada por el receptor de prolactina.

Moléculas de ADN de la invención La presente invención también se relaciona con moléculas de ADN que codifican los anticuerpos de la invención. Estas secuencias incluyen, sin limitaciones, las moléculas de ADN que se detallan en SEQ ID N° 46, 52 y 331 a 374.

Las moléculas de ADN de la invención no se limitan a las secuencias que se describen en la presente, sino que también incluyen variantes de éstas. Las variantes de ADN en el contexto de la invención pueden describirse en referencia a sus propiedades físicas en la hibridación. Aquellos versados en la técnica han de reconocer que el ADN puede usarse para identificar su complemento, y como el ADN tiene dos cadenas, sus equivalentes u homólogos, por medio de procedimientos de hibridación de ácidos nucleicos. También ha de reconocerse que la hibridación puede ocurrir con una complementariedad menor que 100%. Sin embargo, si se seleccionan las condiciones apropiadas, los procedimientos de hibridación pueden usarse para distinguir las secuencias de ADN sobre la base de sus relaciones estructurales con una sonda particular. Para hallar lineamientos sobre estas condiciones, véanse Sambrook et al., 1989 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EEUU)] y Ausubel et al., 1995 [Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., y Struhl, K., editores (1995). Current Protocols in Molecular Biology. Nueva York: John Wiley and Sons].

La similitud estructural entre las secuencias de los dos polinucleótidos puede expresarse en función de la "severidad" de las condiciones bajo las que las dos secuencias hibridan una con otra. Como se lo usa en la presente, el término "severidad" hace referencia a la medida en que las condiciones desfavorecen la hibridación. Las condiciones severas desfavorecen fuertemente la hibridación, de modo que, bajo estas condiciones, solamente podrán hibridar las moléculas muy relacionadas desde el punto de vista estructural. Por otro lado, las condiciones no severas favorecen la hibridación de aquellas moléculas que presentan un menor grado de relación estructural. Por consiguiente, la severidad de la hibridación está correlacionada directamente con las relaciones estructurales entre las dos secuencias de ácidos nucleicos. Las siguientes ecuaciones son útiles para correlacionar la hibridación y las relaciones entre las secuencias (donde Tm es la temperatura de fusión de una dupla de ácidos nucleicos): a. Tm = 69,3 + 0,41 (G+C)% b. La Tm de una dupla de ADN disminuye 1°C al incrementarse 1 % la cantidad de pares de bases no coincidentes. c (Tm)p2 - (Tm) Mi = 18,5 log10M2/ 1 , donde µ1 y µ2 son las fuerzas iónicas de las dos soluciones.

La severidad de la hibridación es una función de diversos factores, incluyendo la concentración general del ADN, la fuerza iónica, la temperatura, el tamaño de la sonda y la presencia de agentes que alteran los enlaces de hidrógeno. Los factores que promueven la hibridación incluyen las concentraciones elevadas de ADN, las fuerzas iónicas elevadas, las temperaturas reducidas, las sondas de gran tamaño y la ausencia de agentes que destruyen los enlaces de hidrógeno. La hibridación típicamente se lleva a cabo en dos fases: la fase de "unión" y la fase de "lavado".

Primero, en la fase de unión, la sonda se une al blanco bajo condiciones que favorecen la hibridación. En esta etapa, la severidad usualmente se controla alterando la temperatura. Para obtener una severidad elevada, la temperatura usualmente se fija entre 65°C y 70°C, a menos que se usen oligonucleótidos cortos (de menos de 20 nucleótidos). Una solución de hibridación representativa comprende SSC 6x, 0,5% de SDS, solución de Denhardt 5x y 100 g de ADN de transporte no específico [véase Ausubel er al., sección 2.9, suplemento 27 (1994)]. Evidentemente, se conocen condiciones de amortiguación muy diferentes que pueden ser equivalentes desde el punto de vista funcional. Cuando el grado de relación es menor, puede seleccionarse una menor temperatura. Las temperaturas de unión propias de las severidades menores son de aproximadamente entre 25°C y 40°C. La severidad media tiene lugar entre al menos aproximadamente 40°C y menos de aproximadamente 65°C. La severidad elevada ocurre a al menos aproximadamente 65°C.

En segundo lugar, se retira la sonda en exceso por lavado. En esta fase, usualmente se aplican condiciones más severas. Por lo tanto, la etapa de lavado" es la más importante para determinar la relación por hibridación. Las soluciones de lavado típicamente contienen menores concentraciones de sal. Un ejemplo de una solución de lavado de severidad mediana contiene SSC 2x y 0, 1 % de SDS. Una solución de lavado de severidad alta contiene el equivalente (en términos de la fuerza iónica) de SSC menos de aproximadamente 0,2x, y una solución de lavado severa preferida contiene SSC aproximadamente 0,1x. Las temperaturas asociadas a los diversos grados de severidad en el lavado son idénticas a las que se describieron con anterioridad para la "unión". La solución de lavado típicamente también es reemplazada una cantidad de veces durante el lavado. Por ejemplo, las condiciones de lavado de gran severidad típicas comprenden dos lavados de 30 minutos a 55°C y tres lavados de 15 minutos a 60°C.

Por consiguiente, un sujeto de la presente invención es una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo y los fragmentos de unión al antígeno de la presente invención.

Otra forma de realización de la presente invención es la secuencia de ácido nucleico aislada mencionada con anterioridad, que codifica los anticuerpos de la presente invención, donde las secuencias de ácidos nucleicos son como las que se detallan en la tabla 5.

Por consiguiente, la presente invención abarca aquellas moléculas de ácidos nucleicos que hibridan con las moléculas que se detallan en la tabla 5 bajo condiciones de unión y lavado de gran severidad, donde estas moléculas de ácidos nucleicos codifican un anticuerpo o un fragmento funcional de éste, que tienen propiedades como las que se describen en la presente Las moléculas preferidas (desde la perspectiva del ARNm) son aquellas que tienen al menos 75% u 80% (preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90% y más preferiblemente al menos 95%) de identidad de secuencia con una de las moléculas de ADN que se describen en la presente. Las moléculas bloquean la señalización mediada por el receptor de prolactina.

Variantes equivalentes desde el punto de vista funcional Aun otra clase de variantes de ADN que se hallan dentro del alcance de la invención puede describirse en referencia al producto que codifican. Estos genes equivalentes desde el punto de vista funcional se caracterizan porque codifican las mismas secuencias peptídicas que se proveen en SEQ ID N° 34-45, debido a la degeneración del código genético.

Se reconoce que las variantes de las moléculas de ADN que se proveen en la presente pueden construirse de diversas maneras. Por ejemplo, es posible construirlas como ADN completamente sintético. Los métodos para sintetizar de manera eficiente oligonucleótidos con tamaños en el rango de entre 20 y aproximadamente 150 nucleótidos están ampliamente disponibles. Véase Ausubel ef al., sección 2.11 , suplemento 21 (1993). Los oligonucleótidos superpuestos pueden sintetizarse y ensamblarse de una manera que fue descripta por primera vez por Khorana eí al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971 ); véase también Ausubel ef al., supra, sección 8.2. El ADN sintético preferiblemente se sintetiza con la inserción de sitios de restricción convenientes en los extremos 5' y 3' del gen, con el propósito de facilitar la clonación en un vector apropiado.

Como se indicó, un método para generar las variantes comprende comenzar con los ADN que se describen en la presente y luego llevar a cabo una mutagénesis dirigida a un sitio. Véase Ausubel et al., supra, capítulo 8, suplemento 37 (1997). En un método típico, se clona un ADN blanco en un vehículo basado en un bacteriófago con ADN de cadena simple. El ADN de cadena simple se aisla y se hace hibridar con un oligonucleótido que contiene una o más alteraciones deseadas a nivel de los nucleótidos. Se sintetiza la cadena complementaria y se introduce el fago de cadena doble en un huésped. Parte de la progenie resultante contendrá la mutación deseada, lo cual podrá confirmarse por medio de una secuenciación del ADN. Además, hay diversos métodos disponibles que permiten incrementar la probabilidad de que la mutación deseada se halle en los fagos de la progenie. Estos métodos son bien conocidos por aquellos versados en la técnica, y hay conjuntos de elementos disponibles comercialmente para generar estas mutaciones.

Construcciones de ADN recombinante y su expresión En la presente invención también se proveen construcciones de ADN recombinantes que comprenden una o más de las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Las construcciones recombinantes de la presente invención se usan en conexión con un vector, tal como un plásmido, un fago o un vector viral, en el cual se inserta una molécula de ADN que codifica un anticuerpo de la invención.

El gen codificado puede producirse con las técnicas que se describen en Sambrook et al., 1989, y Ausubel ef al., 1989. Como alternativa, las secuencias de ADN pueden sintetizarse por medios químicos, usando, p.ej., sintetizadores. Véanse, p.ej., las técnicas que se describen en Oligonucleotide Synthesis (1984, Gait, editor, IRL Press, Oxford), que se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad. Aquellos versados en la técnica han de ser capaces de fusionar el ADN que codifica los dominios variables con fragmentos de genes que codifican regiones constantes de diversos isotipos humanos de IgG o derivados de éstos, tanto en formas mutadas como en formas no mutadas. La tecnología de ADN recombinante puede aplicarse para fusionar ambos dominios variables en un formato de una sola cadena, mediante el uso de conectores, p.ej., extensiones de quince aminoácidos que contienen tres motivos de glicina-glicina-glicina-glicina-serina. Las construcciones recombinantes de la invención están compuestas por vectores de expresión a partir de los cuales puede expresarse el ARN y/o los productos proteicos codificados por el ADN. El vector también puede comprender secuencias de regulación, incluyendo un promotor unido operativamente al marco abierto de lectura (ORF). El vector también puede comprender una secuencia marcadora de selección. También pueden ser necesarias señales de inicio y secreción específicas para bacterias para que tenga lugar una traducción eficiente de las secuencias insertadas que codifican los genes deseados.

En la presente invención también se proveen células huésped que contienen al menos un ADN de la presente invención. La célula huésped podrá ser virtualmente cualquier célula para la que haya disponibles vectores de expresión. Por ejemplo, podrá tratarse de una célula huésped eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula huésped eucariota inferior, tal como una célula de levadura, y también puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La construcción recombinante podrá introducirse en la célula huésped por medio de una transfección mediada por fosfato de calcio o DEAE, a través de una transfección mediada por dextrano, por electroporación o por medio de una infección con un fago.

Expresión en bacterias Los vectores de expresión útiles para usar en bacterias se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica la proteína deseada, en combinación con señales apropiadas para el inicio y la terminación de la traducción, en un marco de lectura operativo con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores de selección fenotípicos, un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector, y de resultar deseable, para proveer la amplificación en el huésped. Los huéspedes procariotas apropiados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.

Los vectores bacterianos pueden estar basados, por ejemplo, en bacteriófagos, en plásmidos o en fagémidos. Estos vectores pueden contener un marcador de selección y un origen de replicación para bacterias derivado de plásmidos disponibles comercialmente, que típicamente contienen elementos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Una vez realizada la transformación de la cepa huésped apropiada y de cultivarla hasta alcanzar la densidad celular apropiada, se desreprime/induce el promotor seleccionado por medios apropiados (p.ej., variaciones en la temperatura o inducción química) y se cultivan las células durante un período adicional. Las células típicamente se cosechan por centrifugación y se destruyen por medios físicos o químicos, y el extracto en bruto resultante se retiene para continuar con la purificación.

En los sistemas bacterianos, pueden seleccionarse numerosos vectores de expresión en función del uso que se desee darle a la proteína expresada. Por ejemplo, cuando se desee producir una gran cantidad de esta proteína para generar anticuerpos o analizar bibliotecas de péptidos, por ejemplo, resultarán deseables aquellos vectores que dirijan la expresión de productos de fusión de proteínas que puedan ser purificados con facilidad en niveles elevados.

Entonces, un objeto de la presente invención es un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica los anticuerpos novedosos de la presente invención.

Expresión en mamíferos y purificación Las secuencias de regulación preferidas para la expresión en células huésped de mamíferos incluyen los elementos virales que dirigen la expresión de proteínas en niveles elevados en las células de mamíferos, tales como los promotores y/o los potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador del CMV), del virus del simio 40 (SV40) (tales como el promotor/potenciador de SV40), de adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío mayor del adenovirus (AdMLP)) y de poliomas. Para hallar una descripción más detallada de los elementos de regulación virales y de las secuencias que los codifican, véanse, p.ej., U.S. 5168062, de Stinski, U.S. 4510245, de Bell et al., y U.S. 4968615, de Schaffner et al. Los vectores de expresión recombinantes también pueden incluir orígenes de replicación y marcadores de selección (véanse, p.ej., U.S. 4399216, 4634665 y U.S. 5179017, de Axel et al.). Los marcadores de selección apropiados incluyen genes que le confieren resistencia a drogas, tales como el G418, la higromicina o el metotrexato, a la célula huésped en la que se introduce el vector. Por ejemplo, el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) confiere resistencia al metotrexato y el gen neo confiere resistencia al G418.

La transfección del vector de expresión a una célula huésped puede realizarse de acuerdo con procedimientos convencionales, tales como la electroporación, la precipitación con fosfato de calcio y la transfección mediada por DEAE-dextrano.

Las células huésped de mamíferos apropiadas para expresar los anticuerpos, las porciones de unión al antígeno o los derivados de éstos que se proveen en la presente incluyen las células de ovario de hámster chino (células CHO) [incluyendo las células CHO dhfr-, descriptas por Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 77:4216-4220, que se usan con un marcador de selección DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]], las células de mieloma NSO, las células COS y las células SP2. En algunas formas de realización, el vector de expresión está diseñado de manera tal que la proteína expresada es secretada hacia el medio de cultivo en el que se desarrollan las células huésped. Los anticuerpos, las porciones de unión al antígeno o los derivados de éstos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales.

Los anticuerpos de la invención o los fragmentos de unión al antígeno de éstos pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos recombinantes de acuerdo con métodos bien conocidos, incluyendo, sin limitaciones, la precipitación con sulfato de amonio o con etanol, la extracción con ácido, la cromatografía con la proteína A, la cromatografía con la proteína G, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía con fosfo-celulosa, la cromatografía de interacción hidrofóbica, la cromatografía por afinidad, la cromatografía con hidroxilapatita y la cromatografía con lectina. Para la purificación, también puede emplearse una cromatografía líquida de alto desempeño ("HPLC"). Véanse, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols ¡n Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001 ), p.ej., los capítulos 1 , 4, 6, 8, 9, 10, cada uno de los cuales se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad.

Los anticuerpos de la presente invención o los fragmentos de unión al antígeno de éstos incluyen los productos purificados por medios naturales, los productos de procedimientos de síntesis química y los productos que se obtienen mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped embrionario, in-cluyendo, p.ej., una levadura, una planta superior, un insecto o una célula de mamífero. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, el anticuerpo de la presente invención puede estar glicosilado o no glicosilado. Estos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio, tales como Sambrook, supra, en las secciones 17,37-17,42, o Ausubel, supra, en los capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20.

Entonces, un objeto de la presente invención también son las células huésped que comprenden un vector o una molécula de ácido nucleico, donde la célula huésped puede ser una célula huésped eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula huésped eucariota inferior, tal como una célula de levadura, y también puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana.

Otro objeto de la presente invención es un método para usar la célula huésped para producir un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, que comprende cultivar la célula huésped bajo condiciones apropiadas y recuperar dicho anticuerpo.

Entonces, otro objeto de la presente invención es el anticuerpo que se describe en la presente invención, que es producido por las células huésped de la presente invención y es purificado hasta alcanzar una homogeneidad de al menos 95% en peso.

Endometriosis y adenomiosis (endometriosis interna) La endometriosis es un trastorno ginecológico benigno dependiente del estrógeno que se caracteriza por la presencia de tejido endometrial (glándulas y estroma) fuera de la cavidad uterina. Las lesiones en el endometrio se hallan principalmente en el peritoneo pélvico, en los ovarios y en el septo rectovaginal (Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. 24:235-238, 1997). La endometriosis frecuentemente está asociada a la infertilidad y a síntomas dolorosos como la dismenorrea. Además, muchos pacientes sufren enfermedades autoinmunes (Hum. Reprod. 17(19):2715-2724, 2002). La adenomiosis uteri, también conocida como endometriosis interna, es una subforma de la endometriosis que está restringida al útero. En el caso de la adenomiosis uteri, las glándulas endometriales invaden el miometrio y la pared del útero.

De acuerdo con la teoría del transplante, los fragmentos del endometrio son transportados por la menstruación retrógrada hacia la cavidad peritoneal en los pa-cientes y en las mujeres saludables (Obstet. Gynecol. 64:151-154, 1984). A continuación se detallan los cuatro factores principales que parecen tener una participación crítica en el establecimiento exitoso de las lesiones endometriales en la cavidad pélvica de los pacientes. a) En el caso de la fase de secreción del ciclo menstrual, las células endometriales en las mujeres saludables se tornan apoptóticas. En los pacientes, la extensión de la apoptosis en las células endometriales se reduce claramente (Fértil. Steril. 69:1042-1047,1998). Entonces, en los pacientes hay una mayor probabilidad que en las mujeres saludables de que los fragmentos del endometrio que hayan sido transportados a la cavidad peritoneal por medio de la menstruación retrógrada no mueran y se implanten con éxito. b) Para que tenga lugar un implante exitoso en el peritoneo y para que los fragmentos del endometrio ectópicos presenten una supervivencia a largo plazo, es necesario que se formen nuevos vasos sanguíneos (British Journal of Pharmacology, 149:133-135, 2006). c) Muchos pacientes sufren enfermedades autoinmunes, por lo que presentan un sistema inmune comprometido (Hum. Reprod. 17(19): 2002, 2715-2724, 2002). A partir de esto, puede concluirse que una respuesta inmune intacta, como la que ocurre en las mujeres saludables, puede ser fundamental para la prevención del establecimiento de las lesiones endometriales. d) Es necesario que las lesiones se desarrollen, para lo cual dependen de la presencia de estímulos mitogénicos y factores de crecimiento.

A continuación se detallan los abordajes disponibles actualmente para el tratamiento de la endometriosis. a) Los análogos de la hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH) dan como resultado la supresión de la síntesis de estradiol en el ovario e inducen la atrofia de los implantes endometriales ectópicos que dependen de manera crítica de la presencia de estradiol para su crecimiento. b) Los inhibidores de la aromatasa inhiben la producción local de estradiol por los implantes endometriales, inducen la apoptosis e inhiben la proliferación de los fragmentos ectópicos del endometrío. c) Los moduladores selectivos del receptor de estrógeno presentan una actividad antagónica sobre el receptor de estrógeno en los implantes endometriales normales y ectópicos, lo que resulta en la atrofia del tejido endometrial ectópico implantado. d) Los agonistas del receptor de progesterona inhiben la proliferación de las células endometriales normales y ectópicas e inducen la diferenciación y la apoptosis. e) Los anticonceptivos orales combinados mantienen el status quo, previenen el progreso de la enfermedad e inducen la atrofia del endometrío ectópico y eutópico. f) La extracción quirúrgica de las lesiones.

Los análogos de la GnRH, los SERM y los inhibidores de la aromatasa tienen efectos colaterales severos y dan como resultado calores y pérdida de hueso en las mujeres jóvenes que sufren endometriosis. El tratamiento con agonistas del receptor de progesterona da como resultado la inhibición de la ovulación, una hemorragia menstrual irregular seguida por amenorrea, ganancia de peso corporal y depresión. Debido al riesgo in-crementado de tromboembolia venosa, los anticonceptivos orales combinados no están indicados para mujeres con edades mayores que 35 años, para las personas que fuman y para los individuos que sufren exceso de peso. La extracción quirúrgica de las lesiones es susceptible a tasas de recurrencia ele-vadas.

Los anticuerpos de la presente invención interfieren con la señalización mediada por el PRLR, que es estimulada por la prolactina producida en la pituitaria y de manera local, o que también puede deberse a mutaciones de activación del PRLR, por lo que son más efectivos que los agonistas del receptor de dopamina 2, que solamente interfieren con la secreción de prolactina en la pituitaria.

Entonces, un objeto de la presente invención es el anticuerpo 006-H08 o sus fragmentos de unión al antígeno, que pueden usarse como medicamentos.

La PRL y el PRLR se expresan en el útero y participan en la fisiología normal del útero. La PRL puede actuar como un mitógeno potente y cumple una función de inmunomodulación. En la presente invención, se demuestra que las alteraciones en el sistema de la PRL/el PRLR es importante en la endometriosis humana. En las figuras 1 y 2 se ilustra un análisis de PCR cuantitativa Taqman de la expresión de la PRL y el PRLR en endometrio de mujeres saludables y en endometrio y lesiones de pacientes (véase el ejemplo 2).

Como se demuestra en la figura 1 (expresión de la PRL) y en la figura 2 (expresión del PRLR), tanto la PRL y como su receptor están regulados de una manera notablemente positiva en las lesiones del endometrio. Este descubrimiento genera por primera vez evidencias experimentales de que la señalización autocrina de la PRL puede cumplir una función fundamental en el establecimiento, el crecimiento y el mantenimiento de las lesiones del endometrio.

Los anticuerpos contra el PRLR fueron evaluados con éxito en un modelo de endometriosis interna en animales, es decir, la adenomiosis uteri en ratones (véase el ejemplo 20). La adenomiosis se caracteriza por el crecimiento infiltrativo de las glándulas endometriales en la capa del miometrio del endometrio. Se asemeja a una forma de la endometriosis restringida al útero, la única forma de endometriosis que puede desarrollarse en los individuos sin menstruación. El danazol, que es efectivo en el tratamiento clínico de los pacientes que sufren endometriosis, también es efectivo en el tratamiento de la adenomiosis uteri (Life Sciences 51 :1119-1125, 1992). Sin embargo, el danazol es una progestina androgénica y da como resultado efectos colaterales androgénicos severos en las mujeres jóvenes, lo que limita su uso.

Los anticuerpos de la presente invención solucionan este problema, ya que constituyen nuevos agentes para el tratamiento o la prevención de la endometriosis y presentan menos efectos colaterales que las terapias convencionales que se usan en la actualidad.

Entonces, otro aspecto de la presente invención es el uso de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR y de sus fragmentos de unión al antígeno para el tratamiento o la prevención de la endometriosis y la adenomiosis (endometriosis interna).

Otro aspecto de la presente invención es el uso del anticuerpo y los fragmentos de unión al antígeno que se describen en la presente invención para el tratamiento o la prevención de la endometriosis y la adenomiosis (endometriosis interna).

Anticoncepción femenina no hormonal A continuación se detallan los abordajes actuales disponibles para la anticoncepción femenina. a) Anticonceptivos orales combinados que contienen estrógenos y progestinas. b) El componente progestogénico media en el efecto anticon-ceptivo a través de la retroalimentación negativa sobre el eje del hipotálamo, la pituitaria y las gónadas. El componente estrogénico garantiza un buen control de las hemorragias y potencia la acción gestagénica a través de la inducción del receptor de progesterona en las células blanco. c) Dispositivos intrauterinos que solamente contienen progestinas. La progestina liberada en el ambiente local coloca el endometrio en un estado resistente a la implantación. Además, la mucosa cervical se torna prácticamente impermeable a las células del esperma. d) Pildoras e implantes que solamente contienen progestina. La progestina inhibe la ovulación a través de la retroalimentación negativa sobre el eje del hipotálamo, la pituitaria y las gónadas. Además, se reduce la permeabilidad de la mucosa cervical a las células del esperma. e) Anillos vaginales que contienen etinilestradiol y progestinas. El efecto colateral principal de los anticonceptivos orales combinados es el riesgo elevado de tromboembolia venosa (VTE). Más aun, las mujeres con sobrepeso o fumadoras, las mujeres que sufren enfermedades autoinmunes como el lupus y las mujeres con edades mayores que 35 años no pueden usar los anticonceptivos orales combinados.

Los dispositivos intrauterinos y los implantes que solamente contienen progestinas pueden resultar en una hemorragia uterina disfuncional.

Las pildoras que solamente contienen progestina pueden provocar patrones de hemorragia irregular, manchas o amenorrea. También aumenta el riesgo de desarrollar embarazos ectópicos. La ganancia de peso y las reducciones en la densidad de la masa ósea son otros efectos colaterales.

Los anillos vaginales pueden provocar vaginitis, leucorrea o expulsión.

Hace algunos años, se generaron ratones con deficiencias en el PRLR (Genes Dev. 11 :167-178, 1997). Vale destacar que los ratones hembra con deficiencias en el PRLR son completamente estériles, pero no así los machos. Los ratones hembra PRLR"'" presentaron una interrupción en el desarrollo de los oocitos inmediatamente después de la fertilización, es decir, se interrumpió el desarrollo previo a la implantación. Tan solo unos pocos oocitos alcanzaron la etapa del blastocisto. Fueron incapaces de implantarse en los ratones hembra mutantes, pero se desarrollaron hasta producir embriones normales en las madres adoptivas salvajes después de transplantarlos. Fue posible rescatar el fenotipo de infertilidad de los ratones con deficiencias en el PRLR hasta la etapa media de la preñez por medio de un tratamiento suplementario con progesterona. Evidentemente, la señalización mediada por el PRLR tiene una función importante en el mantenimiento y la función del cuerpo lúteo, que produce la progesterona que es necesaria para permitir y mantener la preñez. Además, los ratones hembra con deficiencias en el PRLR presentaron una reducción en el peso corporal asociada a una reducción en la masa de grasa abdominal y en los niveles de leptina, lo cual no se observó en los machos.

Hasta el momento, se desconoce una mutación de inactivación del PRLR humano, por lo que se desconoce la función precisa de la señalización mediada por el PRLR en la fertilidad del ser humano. Sin embargo, hay evidencias crecientes de que, también en los seres humanos, es necesario un nivel mínimo de prolactina para que haya un embarazo exitoso. Se trataron pacientes que sufrían una infertilidad primaria debida a una insuficiencia hiperprolactinémica en el cuerpo lúteo con bromocriptina. En algunos casos, los niveles de prolactina fueron excesivos, por lo que reaparecieron las fases lúteas acortadas (Bohnet HG et al. en Lisuride and other dopamine agonists, editado por D.B. Calne et al., Raven Press, Nueva York, 1983). A partir de estos datos, se concluyó que los estados hiperprolactinémicos e hipoprolactinémicos interfieren de manera negativa con la fertilidad masculina. Esto puede explicarse a través de la interacción entre la PRL y su receptor. En el caso de los niveles bajos de prolactina, no hay una activación suficiente del receptor, mientras que en el caso de la hiperprolactinemia, tampoco hay una activación suficiente del receptor, ya que todos los receptores están bloqueados por una molécula de prolactina y ya no pueden dimerizarse. En otras palabras, la respuesta a la dosis para la prolactina tiene forma de campana, y solamente se alcanza una activación óptima del receptor con un rango determinado de concentraciones. Un segundo estudio generó evidencias de que la ausencia de expresión de prolactina en el endometho en los pacientes da como resultado la imposibilidad de que haya una implantación temprana (Human Reprod. 19:1911-1916, 2004). Más aun, se ha demostrado que, ex vivo, la prolactina puede prevenir la apoptosis de células de la granulosa humana en cultivo, por lo que mantiene la función temprana del cuerpo lúteo, lo cual se demostró en ratones con deficiencias en el PRLR (Human Reprod. 18:2672-2677,2003).

Para evaluar la eficacia anticonceptiva de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR, a los ratones se les aplicaron anticuerpos específicos contra el PRLR y no específicos. Posteriormente, se cruzaron las hembras con los machos como se describe en el ejemplo 11. Los parámetros analizados fueron el tamaño de las carnadas por grupo de tratamiento y por animal. El experimento se ilustra en la figura 11. Se demuestra que el tratamiento con el anticuerpo neutralizador de la presente invención permitió prevenir por completo la preñez en los ratones en una concentración de 30 mg/kg de peso corporal.

En comparación con los abordajes convencionales mencionados con anterioridad, la anticoncepción femenina con anticuerpos neutralizadores contra el PRLR tiene diversas ventajas: • los anticuerpos pueden usarse en las mujeres fumadoras, con sobrepeso y de mayor edad, así como en las mujeres que sufren lupus eritematoso (los anticuerpos contra el PRLR también podrían ser beneficiosos para el tratamiento del lupus y para reducir la grasa abdominal, ya que los ratones con deficiencias en el PRLR presentan menos grasa abdominal); • los anticuerpos contra el PRLR no elevan el riesgo de VTE (tromboembolia venosa); • en contraste con los estrógenos y las progestinas que se usan en la anticoncepción oral combinada, la neutralización de la señalización mediada por el PRLR da como resultado la inhibición de la proliferación de las células del epitelio mamario, y en contraste con los abordajes hormonales para controlar la fertilidad, incluso puede proveerles protección a los usuarios con cáncer de mama.

Otro objeto de la presente invención es el uso de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR y de sus fragmentos de unión al antígeno para proveer una anticoncepción femenina con menos efectos colaterales que los tratamientos convencionales.

Otro aspecto de la presente invención es el uso del anticuerpo y de los fragmentos de unión al antígeno que se describen en la presente invención para proveer una anticoncepción femenina con menos efectos colaterales que los tratamientos convencionales.

Enfermedad mamaria benigna y mastalgia La enfermedad mamaria benigna abarca una variedad de síntomas, tales como la enfermedad fiboquística mamaria, el fibroadenoma, la mastalgia y los macroquistes. 30-50% de las mujeres premenopáusicas sufren la enfermedad fiboquística mamaria (Epidemiol. Rev. 19:310-327, 1997).

Dependiendo de la edad de la mujer, la enfermedad mamaria benigna puede presentar fenotipos diferentes (J. Mammal Gland Biol. Neoplasia 10:325-335, 2005): durante las primeras fases de la reproducción (entre los 15 años y los 25 años), cuando ocurre el desarrollo lobular en la mama normal, la enfermedad mamaria benigna da como resultado fibroadenomas. Se observan fibroadenomas gigantes individuales y también adenomas múltiples. Estos fibroadenomas están compuestos por células del estroma y del epitelio y surgen de los lóbulos. En la fase reproductiva madura (entre los 25 años y los 40 años), la mama pasa por cambios cíclicos durante cada ciclo menstrual. Las mujeres enfermas se caracterizan por una mastalgia cíclica y por diversos nodulos en sus mamas. Más tarde (entre los 35 años y los 55 años de edad), la mama normal ¡nvoluciona, pero en la mama enferma se observan macroquistes e hiperplasia epitelial, con atipia o sin ella. Las formas de la enfermedad mamaria benigna que están acompañadas por una proliferación incrementada de las células epiteliales se caractenzan por un mayor riesgo de desarrollar carcinomas mamarios. Este riesgo puede ser de hasta 11 % si hay atipias celulares presentes en la fracción de las células en proliferación (Zentralbl Gynákol 119:54-58,1997). 25% de las mujeres con edades de 60-80 años también sufren la enfermedad mamaria benigna. Frecuentemente, la terapia de reemplazo del estrógeno o la adiposidad son las razones de la persistencia de la enfermedad mamaria benigna después de la menopausia (Am. J. Obstet. Gynecol. 154:161-179, 1986).

La patofisiología de la enfermedad fibroquística mamaria está determinada por la predominancia del estrógeno y la deficiencia de progesterona, lo que da como resultado una hiperproliferación en los tejidos conectivos (una fibrosis), a lo que sigue una proliferación facultativa de las células epiteliales. Como ya se mencionó, el riesgo de desarrollar un cáncer de mama es elevado en los pacientes que presentan una proliferación incrementada de las células epiteliales en los focos fibroquístícos. La enfermedad fibroquística mamaria se caracteriza por dolor y sensibilidad en las mamas. 70% de los pacientes que sufren la enfermedad fibroquística mamaria también sufren insuficiencias en el cuerpo lúteo o anovulación (Am. J. Obstet. 154:161 -179,1986). Las insuficiencias en el cuerpo lúteo dan como resultado los niveles reducidos de progesterona y la predominancia del estrógeno.

La mastalgia (el dolor en las mamas) afecta a aproximadamente 70% de las mujeres en algún momento de su vida reproductiva. El dolor en las mamas puede estar asociado o no a otros criterios del síndrome premenstrual. Se ha demostrado que las mujeres que sufren mastalgia responden con una liberación excesiva de prolactina después de la estimulación del eje del hipotálamo y la pituitaria (Clin.

Endocrinol. 23:699-704,1985).

A continuación se detallan las terapias conven-cionales para la enfermedad mamaria benigna y la mastalgia. 1 ) Bromocriptina Como agonista de la dopamina, la bromocriptina solamente bloquea la síntesis de prolactina en la pituitaria, pero no la síntesis local de prolactina en las células del epitelio mamario. Por lo tanto, solamente es efectiva en aquellas formas de la mastalgia y la enfermedad mamaria benigna que se deben a niveles elevados de prolactina a nivel sistémico. Los efectos colaterales más importantes de la bromocriptina son las náuseas, los vómitos, el edema, la hipotensión, los mareos, la pérdida de cabello, las cefaleas y las alucinaciones. 2) Danazol El danazol es una progestina androgénica que, a través de su actividad antigonadotrófica, contrarresta la predominancia del estrógeno que se observa en la enfermedad mamaria benigna. Sus efectos colaterales más importantes son las irregularidades menstruales, la depresión, el acné, el hirsutismo, la adquisición de un tono grave en la voz y los calores, así como la ganancia de peso. 3) Tamoxifeno El tamoxifeno es un modulador selectivo del receptor de estrógeno que presenta actividad antiestrogénica en las mamas y actividad estrogénica en el útero. Sus efectos colaterales más importantes incluyen síntomas posmenopáusicos como la pérdida de hueso y los calores, los quistes ovárícos y el carcinoma endometrial. 4) Progestinas Las progestinas inhiben la enfermedad mamaria benigna a través de la supresión del eje de la pituitaria y las gónadas, la inhibición de la ovulación y la eliminación del estrógeno. La eliminación del estrógeno da como resultado síntomas menopáusicos como la pérdida de hueso y los calores. 5) Dosis reducidas de anticonceptivos orales combinados Este tratamiento no está indicado para las mujeres con edades superiores a 35 años, para las mujeres fumadoras o para los pacientes diabéticos y con sobrepeso.

En general, se ha descubierto que los niveles de prolactina están incrementados en un tercio de las mujeres que sufren la enfermedad mamaria benigna. Como los estrógenos incrementan la secreción de prolactina en la pituitaria, se cree que el incremento en los niveles de prolactina en el suero es una consecuencia de la predominancia de los estrógenos en esta enfermedad. Se ha informado que frecuentemente hay una mutación de activación del PRLR en las mujeres que sufren múltiples adenomas de mama, lo que es similar a un subtipo de la enfermedad fibroquística mamaria (Paul Kelly, Breast Congress, Turín, 2007, y Proc. Nati. Acad. Sci. 105:14533-14538;2008).

La enfermedad mamaria benigna, la mastalgia y la tensión mamaria premenstrual tienen un mecanismo patofisiológico en común: la señalización incrementada de la prolactina. La señalización incrementada de la prolactina puede ser una consecuencia de los siguientes factores: ¦ una hiperprolactinemia sistémica (debida a un adenoma en la pituitaria), · una hiperprolactinemia local (debida a la síntesis de prolactina en las células en proliferación en el epitelio de la glándula mamaria), que no se traduce en niveles elevados de prolactina en la sangre, una señalización constitutivamente activa del PRLR en presencia de niveles normales de prolactina (debida a una mutación de activación del PRLR).

Como determinadas formas de la enfermedad mamaria benigna pueden dar lugar a un cáncer de mama, hay una necesidad médica relacionada con el tratamiento de esta enfermedad.

Para demostrar la eficacia de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR en un modelo preclínico de la enfermedad mamaria benigna, se empleó un modelo de la hiperprolactinemia sistémica basado en ratones. Se sometieron ratones Balb/c adultos a isoinjertos de pituitaria bajo la cápsula del riñón como se describe en el ejemplo 16 (véase Methods in Mammal Gland Biology and Breast Cáncer Research, 101-107,2000). La hiperprolactinemia sistémica provocó una proliferación incrementada de las células epiteliales en la glándula mamaria y estimuló las ramificaciones laterales y el desarrollo de lóbulos alveolares, en comparación con los ratones control vírgenes sin tratar. En las formas más severas de las enfermedades fibroquísticas mamarias humanas caracterizadas por un riesgo incrementado de un desarrollo canceroso, se observa una proliferación incrementada de las células epiteliales. Como se describe en el ejemplo 16, los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR se evaluaron en este modelo en ratones Balb/c y se los comparó con los anticuerpos no específicos en los siguientes aspectos: ¦ su capacidad de bloquear las ramificaciones laterales y el desarrollo de lóbulos alveolares, • su capacidad de inhibir la proliferación de las células del epitelio mamario, ¦ su capacidad de inhibir la fosforilación de STAT5, un factor de transcripción que normalmente es activado y fosforilado después de la activación del PRLR.

Como se ilustra en las figuras 15A-C, los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR bloquean todos los paradigmas de análisis mencionados con anterioridad de una manera dependiente de la dosis.

Otro objeto de la presente invención es el uso de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR o de sus fragmentos de unión al antígeno en el tratamiento de la enfermedad mamaria benigna y la mastalgia en mujeres premenopáusicas y posmenopáusicas.

Otro aspecto de la presente invención es el uso de los anticuerpos o de los fragmentos de unión al antígeno que se describen en la presente invención en el tratamiento de la enfermedad mamaria benigna y la mastalgia en mujeres premenopáusicas y posmenopáusicas.

Inhibición de la lactancia La prolactina es la hormona principal relacionada con la lactancia después del nacimiento del niño. Esto se ve reflejado en el fenotipo de los ratones con deficiencias en el PRLR. Incluso los ratones heterocigotas presentan problemas severos en la lactancia, por lo que son completamente incapaces de amamantar su descendencia (Frontiers in Neuroendocrinology 22:140-145, 2001 ).

Las mujeres pueden verse obligadas a interrumpir la lactancia debido a muchas razones. Algunas de ellas incluyen los regímenes don drogas que podrían ser potencialmente peligrosas para el lactante, las infecciones serias (la mastitis, la nefritis), las hemorragias posparto profusas y las enfermedades maternas severas, p.ej., la diabetes, los carcinomas y la debilidad, o las enfermedades de los neonatos. En la actualidad, se usan agonistas del receptor de dopamina como la bromocriptina y el lisuride para inhibir la lactancia después del nacimiento. Sin embargo, estos compuestos pueden provocar efectos colaterales severos, tales 'como náuseas, vómitos, edema, hipotensión, mareos, pérdida de cabello, cefaleas y alucinaciones. Además, los agonistas del receptor de dopamina no están indicados para las mujeres que sufren enfermedades cardio-vasculares o hipertensión. Otra desventaja de la bromocriptina es su vida media breve, por lo cual es necesario ingerirla 4-6 veces al día durante un período de 14 días.

Para evaluar la eficacia de los anticuerpos neutralizadores contra el receptor de prolactina en ratones, se cruzaron ratones NMRI hembra con otros ratones macho. Después del nacimiento, se ajustó el tamaño de la carnada en 8 animales y se trataron las hembras con anticuerpos específicos contra el PRLR y con anticuerpos no específicos, tal como se describe en el ejemplo 15. Como medida de la capacidad de lactancia materna, se monitoreó diariamente el peso de la descendencia. Los parámetros analizados se describen en detalle en el ejemplo 15, y los resultados se ilustran en las figuras 14A-D. Los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR provocan una inhibición de la lactancia dependiente de la dosis y resultan en una involución de la glándula mamaria y en una producción reducida de proteínas de la leche.

Otro objeto de la presente invención es el uso de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR en la inhibición de la lactancia.

Otro objeto de la presente invención es el uso del anticuerpo 006-H08 y de los fragmentos de unión al antígeno que se describen en la presente invención en la inhibición de la lactancia.

Hiperplasia prostética benigna La hiperplasia prostética benigna (BPH) es la cuarta afección de la salud más prevalente en los hombres de edad. El agrandamiento de la próstata es una afección progresiva que afecta a más de 50% de los hombres con edades superiores a 50 años. La BPH se caracteriza por la hiperplasia del estroma y las células epiteliales de la próstata, lo que resulta en la formación de grandes nódulos discretos en la región periuretral de la próstata, que comprime el canal ueretral. Por consiguiente, la interrupción del flujo de orina es una consecuencia importante de la BPH.

A continuación se detallan las terapias convencionales para la BPH. a) Los antagonistas del receptor adrenérgico a1 (p.ej. la tamsulosina, la alfuzosina, la terazosina, la doxazosina) alivian los síntomas de la BPH en el tracto urinario inferior. Disminuyen las obstrucciones a la salida de la vejiga al bloquear la estimulación del músculo liso de la próstata mediada por los receptores alfa. Los efectos colaterales más importantes incluyen efectos adversos relacionados con la vasodilatación, mareos e insuficiencias en la eyaculación. b) Los inhibidores de la 5a-reductasa (por ejemplo, el finasteride) previenen la formación de dihidrotestosterona,. la forma activa de la testosterona en la próstata, que es responsable del agrandamiento de la próstata. Los efectos colaterales más importantes incluyen las disfunciones sexuales, tales como los trastornos eréctiles y la libido disminuida. c) La resección transuretral de la próstata (TURP) es un tratamiento quirúrgico que está asociado a una morbilidad elevada. Los efectos colaterales incluyen las hemorragias, la incontinencia, la formación de obstrucciones, la pérdida de eyaculación y las perforaciones en la vejiga. d) La colocación de stents en la próstata. Se inserta un stent en la parte prostética de la uretra para garantizar un flujo apropiado de orina. Los efectos colaterales más importantes incluyen las incrustaciones, las infecciones en el tracto urinario y la migración del stent. Más aun, es necesario retirar los stents antes de realizar cualquier manipulación transuretral.

Como se describió para la glándula mamaria, la PRL y el PRLR actúan en una vía autocrina/paracrina (J. Clin. Invest. 99:618 pp. 1997) en la próstata.

En estudios clínicos, se ha demostrado que la hiperprolactinemia (y la agromegalia) está asociada al agrandamiento de la próstata y a la acumulación de células inflamadas en el estroma. La hormona de crecimiento humana puede unirse al PRLR humano en presencia de cinc, con lo que podría explicarse por qué la acromegalia puede dar como resultado una hiperplasia prostática benigna. Los niveles de PRL en el suero frecuentemente son elevados en los pacientes con BPH.

Los animales transgénicos donde se sobreexpresa el gen de la PRL de manera ubicua desarrollan una hiperplasia severa en el estroma de la próstata, lo que refleja que la PRL es un factor patofisiológico importante para el desarrollo de la hiperplasia prostática (Endocrinology 138:4410 pp. 1997). Además, la sobreexpresión local de la prolactina en los ratones transgénicos bajo el control del promotor de la probasina específico de la próstata da como resultado una expansión del estroma, una acumulación de células inflamatorias y una displasia epitelial focal, que son las características básicas de la BPH en los seres humanos (Endocrinology 144:2269 pp. 2003).

El PRLR se expresa en niveles elevados en la glándula prostática (ejemplo 3, figura 3). Se observaron variaciones en la expresión de las proteínas del PRLR en tejido de próstata de rata después de eliminar las hormonas y aplicar un tratamiento hormonal (ejemplo 4, figura 4). Además del PRLR, en las células de la próstata también se expresa la prolactina.

Como se describe en el ejemplo 17, a ratones Balb/c macho se les aplicaron isoinjertos de pituitaria bajo la cápsula del riñón. En estos ratones, se desarrolló una hiperplasia prostática benigna. En este modelo, se evaluó el efecto de los anticuerpos neutralizadores contra el receptor de prolactina y de los anticuerpos no específicos sobre la hiperplasia prostática benigna. Los paradigmas analizados se describen en el ejemplo 17. Como se ilustra en la figura 16, los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR inhiben el crecimiento benigno de la próstata, por lo que son apropiados para el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna.

Otro objeto de la presente invención es el uso de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR o de sus fragmentos de unión al antígeno en el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna.

Otro aspecto de la presente invención es el uso del anticuerpo o de los fragmentos de unión al antígeno que se describen en la presente invención en el tratamiento de hiperplasia prostática benigna.

Pérdida de cabello hiperprolactinémica El tratamiento de la pérdida de cabello aún es una necesidad insatisfecha. El crecimiento del cabello en el cuero cabelludo ocurre en ciclos: la fase anagénica se caracteriza por un crecimiento activo del cabello, la fase catagénica se caracteriza por una involución y es seguida por la fase telogénica (de reposo). La fase exogénica (la liberación del cabello muerto) coincide con el final de la fase telogénica. La pérdida de cabello puede ser la consecuencia del crecimiento alterado del cabello en cualquier fase.

La pérdida de cabello telogénica puede tener diversos desencadenantes (el estrés fisiológico y emocional, las afecciones médicas, las deficiencias de hierro y de cinc). Vale destacar que, en sus primeras etapas, la alopecia androgénica se caracteriza por una pérdida de cabello telogénica (Cleveland clinic journal of medicine 2009; 76:361-367). La pérdida de cabello anagénica frecuentemente es la consecuencia de la radiación o de la quimioterapia.

Para el tratamiento de la pérdida de cabello androgénica, suele usarse minoxidil y finasteride. Para la alopecia areata, suelen usarse glucocorticoides. En general, todos estos tratamientos tienen efectos colaterales (finasteride: pérdida de libido e impotencia en los hombres, glucocorticoides: diabetes, ganancia de peso, osteoporosis), por lo que todavía no ha sido posible solucionar completamente el problema de la pérdida de cabello.

Se han realizado experimentos de afeitado en roedores adultos para analizar el efecto de los compuestos sobre la pérdida de cabello, mediante el uso del crecimiento de nuevo cabello en el área afeitada como paradigma de lectura (Bntish Journal of dermatology 2008; 159:300-305). El afeitado de los animales adultos (cuyo cabello suele hallarse en la fase telogénica) induce la fase anagénica, que se caracteriza por el crecimiento del cabello.

En los experimentos que se describen en el ejemplo 17 (hiperplasia prostática benigna), se afeitaron animales que habían recibido isoinjertos de pituitaria. Durante estos experimentos, inesperadamente se descubrió que los animales que habían recibido isoinjertos de pituitaria presentaban una interrupción severa en el crecimiento de nuevo cabello en el área afeitada. El tratamiento con los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR estimuló el crecimiento del cabello, lo cual no ocurrió con los anticuerpos no específicos (figura 17).

Esta observación permite demostrar que en la pérdida de cabello hay una señalización elevada mediada por el receptor de prolactina. Para analizar esto con mayor detalle, se realizaron experimentos de afeitado adicionales, análogos a experimentos que habían sido descriptos con anterioridad (British Journal of dermatology 2008; 159:300-305). Estos experimentos de afeitado adicionales se describen en el ejemplo 18. Con los experimentos, se demostró que los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR estimulan el crecimiento del cabello en los ratones macho y hembra hiper y normoprolactinémicos.

Los anticuerpos de la presente invención solucionan este problema, ya que constituyen nuevos tratamientos para la pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica en las mujeres y en los hombres.

Entonces, otro aspecto de la presente invención es el uso de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR o de sus fragmentos de unión al antígeno para el tratamiento o la prevención de pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica.

Otro aspecto de la presente invención es el uso del anticuerpo o de los fragmentos de unión al antígeno que se describen en la presente invención para el tratamiento o la prevención de la pérdida de cabello hiperprolactinémica.

Terapia hormonal combinada Para el tratamiento de los calores en las mujeres posmenopáusicas que aún tienen útero, se usaron combinaciones de estrógeno (estradiol o estógenos equinos conjugados = CEE) y progestinas (p.ej. acetato de medroxiprogesterona ( PA), progesterona, drospirenona, levonorgestrel). Es necesario agregar progestinas para inhibir la proliferación de las células del epitelio del útero activada por el estradiol. Sin embargo, la adición de las progestinas incrementa la proliferación de las células del epitelio mamario. Debido a que tanto las células del epitelio mamario normal como las células del epitelio mamario canceroso responden con proliferación ante un tratamiento con estrógeno y progestina, se estableció que el riesgo relativo de desarrollar un cáncer de mama aumentaba después de un tratamiento con CEE más MPA (JAMA 233:321-333;2002).

Cuando se los administra mensualmente o bimestralmente a mujeres que están siendo sometidas a una terapia hormonal combinada, los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR inhiben la proliferación de las células del epitelio mamario.

Como se describe en el ejemplo 19, se empleó un modelo en ratón que había sido desarrollado con anterioridad para realizar el análisis cuantitativo de los efectos de la progestina en el útero y en las mamas (Endocrinology 149:3952-3959,2008). Los ratones fueron ovariectomizados y tratados 14 días después con el vehículo o con 100 ng de estradiol más 100 mg/kg de progesterona durante tres semanas, con el objeto de imitar la terapia de reemplazo de hormonas. Los anímales fueron tratados una vez por semana con anticuerpos específicos contra el PRLR (10 mg/kg o 30 mg/kg) o con anticuerpos no específicos (30 mg/kg). Se analizaron los efectos de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR sobre la actividad de proliferación en las mamas de los ratones sometidos a la terapia hormonal combinada.

Los anticuerpos de la presente invención son una solución al problema del tratamiento de la proliferación incrementada de las células del epitelio mamario que se observa al aplicar una terapia hormonal combinada.

Otro objeto de la presente invención es el uso de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR o de sus fragmentos de unión al antígeno en una terapia hormonal combinada (es decir, una terapia de estrógeno + progestina) para inhibir la proliferación de las células del epitelio mamario.

Otro aspecto de la presente invención es el uso del anticuerpo o de los fragmentos de unión al antígeno que se describen en la presente invención en una terapia hormonal combinada (es decir, una terapia de estrógeno + progestina) para inhibir la proliferación de las células del epitelio mamario.

Definiciones El antígeno blanco, el "PRLR" humano, como se lo usa en la presente, hace referencia a un polipéptido humano que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos en su dominio extracelular que los aminoácidos entre las posiciones 1 y 210 de SEQ ID N° 70 y las variantes alélicas y/o de separación naturales de ésta. El "ECD del PRLR", como se lo usa en la presente, hace referencia a la porción extracelular del de PRLR que está representada por los aminoácidos mencionados con anterioridad. Además, el PRLR humano blanco también abarca las versiones mutadas del receptor, tales como la mutación de activación I146L, descripta por Paul Kelly (Proc Nati Acad Sci USA, 105 (38): 14533-14538,2008; y una comunicación oral, Turín, 2007).

Como se la usa en la presente, la frase "cantidad eficaz para el uso terapéutico" hace referencia a una cantidad de un anticuerpo terapéutico o profiláctico que sería apropiada para provocar el efecto o la respuesta terapéutica o profiláctica deseada, lo que incluye el alivio de algunos o la totalidad de los síntomas de la enfermedad o la reducción de la predisposición a la enfermedad, cuando se la administra de acuerdo con el régimen de tratamiento deseado.

Como se lo usa en la presente, se dice que un anticuerpo "se une específicamente" a un antígeno (en este caso, el PRLR), que "presenta especificidad" por él o que lo "reconoce específicamente" cuando dicho anticuerpo es capaz de discriminar entre dicho antígeno y uno o más antígenos de referencia, ya que la especificidad de la unión no es una propiedad absoluta, sino relativa. En su forma más general (y cuando no se menciona una referencia definida), la "unión específica" hace referencia a la capacidad del anticuerpo de discriminar entre el antígeno de interés y un antígeno no relacionado, lo cual puede determinarse, p.ej., de acuerdo con uno de los métodos que se describen a continuación. Los métodos comprenden, sin limitaciones, las transferencias Western, las pruebas de ELISA, RIA, ECL e IRMA y los análisis de péptidos. Por ejemplo, puede realizarse un ensayo de ELISA convencional. La calificación puede llevarse a cabo mediante el desarrollo de color (p.ej., con un anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano con picante y tetrametil benzidina con peróxido de hidrógeno). La reacción en determinadas cavidades se califica en función de la densidad óptica, p.ej., a 450 nm. El valor de fondo típico (que equivale a la reacción negativa) puede ser de 0,1 OD. Una reacción positiva típica puede ser de 1 OD. Esto implica que la diferencia entre el positivo y el negativo puede ser de más de 10 veces. Típicamente, la determinación de la especificidad de la unión se efectúa usando no solamente un antígeno de referencia, sino más bien un conjunto de aproximadamente tres a cinco antígenos no relacionados, tales como la leche en polvo, la BSA, la transferrina o semejantes.

Sin embargo, la "unión específica" también puede hacer referencia a la capacidad de un anticuerpo de discriminar entre el antígeno blanco y uno o más antígenos relacionados estrechamente, los cuales se usan como puntos de referencia. Adicionalmente, la "unión específica" puede estar relacionada con la capacidad de un anticuerpo de discriminar entre distintas partes de su antígeno blanco, p.ej., distintos dominios, subdominios o regiones del PRLR, tales como los epitopes en la región del extremo N o el extremo C del ECD del PRLR, o entre uno o más residuos de aminoácidos o extensiones de residuos de aminoácidos fundamentales del ECD del PRLR.

La KD de la "afinidad" o de la "afinidad de unión" frecuentemente se determina midiendo la constante de asociación en equilibrio (ka) y la constante de disociación en equilibrio (kd) y calculando el cociente entre la kd y la ka (KD = kd/ka). Los términos "inmunoespecífico" y "caracterizado por una unión específica" denotan que el anticuerpo se une al PRLR o a su ECD con una KD de afinidad menor o igual que 10'6 M (una afinidad monovalente). El término "afinidad elevada" denota que la KD de afinidad con la que se une el anticuerpo al PRLR o a su ECD con es menor o igual que 10"7 M (una afinidad monovalente). El anticuerpo puede presentar una afinidad sustancialmente mayor por el antígeno blanco que por otras moléculas no relacionadas. El anticuerpo también puede presentar una afinidad sustancialmente mayor por el antígeno blanco que por sus homólogos, p.ej., una afinidad relativa al menos 1 ,5 veces, 2 veces, 5 veces 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces mayor por el antígeno blanco, o incluso mayor. Estas afinidades pueden ser determinadas con facilidad usando técnicas convencionales, tales como la diálisis en equilibrio, con el instrumento BIAcore 2000, de acuerdo con los procedimientos generales provistos por el fabricante, con un radioinmunoensayo, usando un antígeno blanco radiomarcado, o con otro método conocido por aquellos versados en la técnica. Los datos de la afinidad pueden analizarse, por ejemplo, con el método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51 :660 (1949).

Como se la usa en la presente, la frase "los anticuerpos antagonizan la señalización mediada por la pro-lactina" hace referencia a un bloqueo de la activación del receptor de prolactina por los anticuerpos de la presente invención, lo que da como resultado una inhibición completa de la señalización mediada por el receptor de prolactina.

Como se la usa en la presente, la frase "los anti-cuerpos compiten por la unión" hace referencia a una competición de un anticuerpo con un segundo anticuerpo, o con más anticuerpos, por la unión al receptor de prolactina.

El término "anticuerpo" se usa en su sentido más amplio e incluye los anticuerpos completamente ensamblados, los anti-cuerpos monoclonales, los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecificos (p.ej., los anticuerpos biespecíficos), los fragmentos de anticuerpos que pueden unirse al antígeno (p.ej., los fragmentos Fab', F'(ab)2 o Fv, los anticuerpos de cadena simple, los diacuerpos), los cuerpos de camello y los péptidos recombinantes que abarcan los anteriores, con la condición de que presenten la actividad biológica deseada. Los anticuerpos pueden presentan distintos dominios constantes (dominios Fe) en su cadena pesada, que preferiblemente derivan de los isotipos lgG1 , lgG2 o lgG4 (véase la descripción más adelante). Pueden introducirse mutaciones para modificar las funciones efectoras. Se han identificado residuos de aminoácidos en el dominio Fe que cumplen una función dominante en las interacciones entre la proteína complementaria C1q y los receptores Fe, y se han desc pto mutaciones que influyen en las funciones efectoras (para hallar una revisión, véase Labrijn et al., Current opinión in Immunology 20:479-485, 2008). En particular, es posible realizar la aglicosilación de lgG1 por medio de una mutación de asparragina en alanina o de asparragina en glutamina en el aminoácido en la posición 297. Se ha informado que esta mutación anula la citotoxicidad mediada por células (ADCC) derivada del anticuerpo (Sazinsky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 105 (51 ): 20169, 2008; Simmons et al., J. of Immunological Methods 263:133-147, 2002). El reemplazo de lisina por alanina en la posición 322 da como resultado una reducción en la ADCC y la remoción de la citotoxicidad derivada del complemento (CDC), mientras que el reemplazo simultáneo de dos leucinas en las posiciones 234 y 235 por alaninas permite evitar la ADCC y la CDC [Hezareh et al., J. of Virology, 75 (24):12161-12168, 2001]. Con el objeto de aplicar isotipos lgG4 como agentes terapéuticos bivalentes in vivo que retengan la avidez, podrá introducirse una modificación en forma de un intercambio de serina por prolina en la "región de la bisagra principal" (Schuurman, J. et al. Immunology 97:693-698, 1999). La tendencia de las moléculas de lgG2 humanas a formar dímeros covalentes heterogéneos puede evitarse cambiando una de las cisternas en las posiciones 127, 232 y 233 por serina (Alien et al., Biochemistry, 2009, 48 (17), pp. 3755-3766). Un formato alternativo con una función efectora reducida puede ser el formato lgG2m4, que deriva de una lgG2 que contiene cuatro cambios por residuos de aminoácidos específicos de la lgG4 (An et al., mAbs 1(6), 2009). Es posible producir fragmentos de anticuerpos con técnicas de ADN recombinante o mediante la escisión enzimática o química de los anticuerpos intactos, lo cual se describirá con mayor detalle más adelante. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos monoclonales incluyen los anticuerpos murinos, quiméricos, humanizados y humanos, así como las inmunoglobulinas humanas modificadas, las proteínas de fusión quiméricas que tienen secuencias derivadas de inmunoglobulinas, las muteínas o los derivados de éstas, cada uno de los cuales se describirá con mayor detalle más adelante. También se contemplan los multímeros o los agregados de moléculas intactas y de fragmentos de éstas, incluyendo los anticuerpos modificados por medios químicos.

El término "anticuerpo monoclonal", como se lo usa en la presente, hace referencia a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, una población de anticuerpos individuales que son idénticos, excepto por las posibles mutaciones naturales que pudiera haber presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y están dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que típicamente incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra determinantes (epitopes) diferentes, cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque son sintetizados en un cultivo homogéneo, es decir, no están contaminados con otras inmunoglobulinas, que podrían tener especificidades y características diferentes.

El adjetivo "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo: se lo ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos. No restringe la producción del anticuerpo a un método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que pueden usarse pueden elaborarse con el método de los hibridomas, que fue descripto por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495, 1975, o pueden elaborarse con métodos de ADN recombinante (véase, p.ej., la Patente de los EEUU N° 4816567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden ser, p.ej., anticuerpos recombinantes, quiméricos, humanizados o humanos modificados, así como fragmentos de anticuerpos.

Una "inmunoglobulina" o un "anticuerpo nativo" hacen referencia a una glicoproteína tetramérica. En una inmunoglobulina natural, cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, donde cada par tiene una cadena "liviana" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La porción del extremo amino de cada cadena incluye una región "variable" de aproximadamente entre 100 y 110 aminoácidos, o más, que es la responsable primaria del reconocimiento del antígeno. La porción del extremo carboxilo de cada cadena define una región constante que es la responsable primaria de la función efectora. Las inmunoglobulinas pueden separarse en distintas clases en función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas. Las cadenas pesadas se clasifican como mu (µ), delta (?), gamma (?), alfa (a) y épsilon (e) y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Además, varias de éstas pueden ser divididas en subclases o isotipos, p.ej., lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgAl e lgA2. Los distintos isotipos pueden tener funciones efectoras diferentes; p.ej., los isotipos lgG1 e lgG3 frecuentemente presentan actividad de ADCC. Las cadenas livianas humanas se clasifican como cadenas livianas kappa (K) y lambda (?). Dentro de las cadenas livianas y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J", de aproximadamente 12 aminoácidos o más, donde la cadena pesada también incluye una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos o más. Véase en general Fundamental Immunology, capítulo 7 (Paul, W., editor, 2a edición, Raven Press, N.Y. (1989)).

Un "fragmento funcional" o un "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo/una inmunoglobulina se definen en la presente como un fragmento de anticuerpo/inmunoglobulina (p.ej., una región variable de una IgG) que retiene la región de unión al antígeno. La "región de unión al antígeno" de un anticuerpo típicamente se halla en una o más de las regiones hipervariables del anticuerpo, es decir, las regiones CDR 1, 2 y/o 3. Sin embargo, las regiones variables "del marco" también pueden cumplir una función importante en la unión al antígeno, por ejemplo, al proveer un andamiaje para las CDR. Preferiblemente, la "región de unión al antígeno" comprende al menos los residuos de aminoácidos 4 a 103 de la cadena liviana variable (VL) y los residuos de aminoácidos 5 a 109 de la cadena pesada variable (VH), más preferiblemente los residuos de aminoácidos 3 a 107 de la VL y los residuos de aminoácidos 4 a 111 de la VH, y en particular, particularmente las cadenas VL y VH completas [los aminoácidos en las posiciones 1-109 de la VL y en las posiciones 1-113 de la VH; la numeración de las posiciones de los aminoácidos se realiza de acuerdo con la base de datos de Kabat (Johnson y Wu, Nucleic Acids Res., 2000, 28, 214-218)]. Una clase preferida de inmunoglobulinas que pueden usarse en la presente invención es la de la IgG.

El término "región hipervariable" hace referencia a los residuos de aminoácidos de los dominios variables VH y VL de un anticuerpo o de un fragmento funcional de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácidos de la "región de determinación de la complementariedad" o CDR [es decir, los residuos 24-34 (LCDR1 ), 50- 56 (LCDR2) y 88-97 (LCDR3) en el dominio variable de la cadena liviana y los residuos 29-36 (HCDR1 ), 48-66 (HCDR2) y 93-102 (HCDR3) en el dominio variable de la cadena pesada, como se ¡lustra en la figura 12] y/o los residuos de un rizo hipervariable [es decir, los residuos 26-32 (dentro de LCDR1), 50-52 (dentro de LCDR2) y 91-96 (dentro de LCDR3) en el dominio variable de la cadena liviana y los residuos 26-32 (dentro de HCDR1), 53- 55 (dentro de HCDR2) y 96-101 (dentro de HCDR3) en el dominio variable de la cadena pesada, como se describe en Chotia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)].

Los ejemplos no limitativos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, los dominios de anticuerpos (dAb), los fragmentos de las regiones de determinación de la complementariedad (CDR), los anticuerpos de cadena simple (scFv), los fragmentos de anticuerpos de cadena simple, los diacuerpos, los triacuerpos, los tetracuerpos, los minicuerpos, los anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng.,8(10):1057-1062 (1995)), los anticuerpos recombinantes quelantes, los tricuerpos, los bicuerpos, los intracuerpos, los nanocuerpos, los inmunofármacos modulares pequeños (SMIP), las proteínas de fusión de dominios de unión al antígeno con inmunoglobulinas, los anticuerpos camelizados, los anticuerpos que contienen VHH, las muteínas o los derivados de éstas y los polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferirle al polipéptido la capacidad de unirse de manera específica al antígeno, tal como una secuencia de la CDR, con la condición de que el anticuerpo retenga la actividad biológica deseada, así como los anticuerpos multiespecíficos que pueden formarse a partir de fragmentos de anticuerpos (C. A. K Borrebaeck, editor (1995), Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editores (2001 ), Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Ha de interpretarse que un anticuerpo que no es un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene todos los sitios de unión idénticos. Podrían diseñarse fragmentos F(ab')2 o Fab para minimizar o eliminar por completo las interacciones intermoleculares mediadas por los enlaces disulfuro que pudieran aparecer entre los dominios C y CL. Mediante la digestión de los anticuerpos con papaína, se producen dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, que se denominan fragmentos "Fab", cada uno de los cuales tiene un solo sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual "Fe", cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizarse con facilidad. El tratamiento con pepsina da como resultado un fragmento F(ab')2 que tiene dos fragmentos "Fv". Un fragmento "Fv" es el fragmento mínimo de un anticuerpo que contiene un sitio completo para reconocer al antígeno y unirse a él. Esta región consiste en un dimero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena liviana, asociados estrechamente a través de enlaces no covalentes. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dimero VH-VL. En conjunto, las seis CDR le confieren especi-ficidad a la unión al antígeno del anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un fragmento Fv que comprenda tan solo tres CDR específicas para un antígeno) tendrá la capacidad de reconocer el antígeno y unirse a él.

Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena simple", "sFv" o "scFv" comprenden los dominios de la VH y la VL del anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica.

Preferiblemente, el polipéptido Fv también comprende un conector polipeptídico entre los dominios de la VH y la VL, que permite que el fragmento Fv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para hallar una revisión de los fragmentos sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, editores, Springer- Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (CH1 ) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región de la bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación que se le da en la presente a aquellos fragmentos Fab' donde uno o más residuos de cisteína de los dominios constantes contienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de los anticuerpos F(ab')2 fueron producidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que tenían cisteínas entre ellos.

Los residuos "del marco" o FR son aquellos residuos del dominio variable que no son los residuos de la región hipervariable.

La frase "región constante" hace referencia a la porción de la molécula del anticuerpo que confiere las funciones efectoras.

Los términos "muteína" y "variante" pueden usarse indistintamente y hacen referencia a la secuencia polipeptídica un anticuerpo que contiene al menos una sustitución, supresión o inserción de aminoácidos en la región variable o en una porción equivalente a la región variable, con la condición de que la muteína o la variante retengan la afinidad de unió o la actividad biológica deseada.

Las muteína pueden ser sustancialmente homologas o sustancialmente idénticas al anticuerpo progenitor.

El término "derivados" hace referencia a aquellos anticuerpos que han sido modificados por medios covalentes, por ejemplo, con procedimientos como la ubiquitinación, la conjugación con agentes terapéuticos o de diagnóstico, el marcado (p.ej., con radionucleidos o con diversas enzimas), la unión covalente de polímeros, tal como la pegilación (la derivatización con polietilenglicol), y la inserción o la sustitución de aminoácidos nativos por aminoácidos no naturales por medio de una síntesis química.

Un anticuerpo "humano" o un fragmento funcional de un anticuerpo humano se definen en la presente como un anticuerpo que no es quimérico o "humanizado" y que no proviene (por completo o en parte) de una especie no humana. Un anticuerpo humano o un fragmento funcional de un anticuerpo humano pueden derivar de un anticuerpo humano o pueden ser anticuerpos humanos sintéticos. Un "anticuerpo humano sintético" se define en la presente como un anticuerpo que tiene una secuencia que deriva por completo o en parte de secuencias sintéticas a través de procedimientos in silico, que se basan en el análisis de secuencias de anticuerpos humanos conocidos. El diseño in silico de la secuencia de un anticuerpo humano o de un fragmento de éste puede efectuarse, p.ej., analizando una base de datos de secuencias de anticuerpos humanos o de fragmentos de éstos y concibiendo una secuencia polipeptídica mediante el uso de los datos obtenidos. Otro ejemplo de un anticuerpo humano o de un fragmento funcional de un anticuerpo humano es uno que es codificado por un ácido nucleico que ha sido aislado de una biblioteca de secuencias de anticuerpos de origen humano (es decir, una biblioteca basada en anticuerpos tomados de una fuente humana natural). Los ejemplos de anticuerpos humanos incluyen los anticuerpos basados en n-CoDeR, que fueron descriptos por Carlsson y Sóderlind, Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1 ), 102-108 (2001 ), y por Sóderlin et al. Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000), así como en la Patente de los EEUU N° 6989250.

Un "anticuerpo humanizado" o un fragmento funcional de un anticuerpo humanizado se definen en la presente como un anticuerpo (i) que deriva de una fuente no humana (p.ej., un ratón transgénico que tiene un sistema inmune heterólogo), donde el anticuerpo está basado en la línea germinal humana, o (ii) que tiene CDR injertadas, donde las CDR del dominio variable son de origen no humano, mientras que uno o más de los marcos del dominio variable son de origen humano, así como el dominio constante (de haberlo).

La frase "anticuerpo quimérico", como se la usa en la presente, hace referencia a un anticuerpo que contiene una secuencia que deriva de dos anticuerpos diferentes (véase, p.ej., la Patente de los EEUU N° 4816567), que típicamente se origina en distintas especies. Más típicamente, los anticuerpos quiméricos comprenden fragmentos de anticuerpos humanos y murinos, generalmente regiones constantes humanas y regiones variables de ratón.

Los anticuerpos "humanos modificados" se generan alterando la secuencia progenitora de acuerdo con los métodos que se detallan en Studnicka et al., Patente de los EEUU N° 5766886, por ejemplo, como en los anticuerpos que se representan en SEQ ID N° 58, 61, 64 y 67 y los que se describen en la solicitud de patente WO08/022295.

Un anticuerpo de la invención puede derivar de una biblioteca de genes de anticuerpos recombinantes. El desarrollo de tecnologías para preparar repertorios de genes de anticuerpos humanos recombinantes y para presentar los fragmentos de anticuerpos codificados en la superficie de bacteriófagos filamentosos ha permitido elaborar y seleccionar directamente anticuerpos humanos, lo cual también puede aplicarse a los anticuerpos humanizados, quiméricos o murinos o a las muteínas. Los anticuerpos que se elaboran con esta tecnología basada en fagos se producen como fragmentos de unión al antígeno, usualmente fragmentos Fv o Fab, en bacterias, por lo que carecen de funciones efectoras. Las funciones efectoras pueden introducirse con una de dos estrategias. Los fragmentos pueden modificarse para obtener anticuerpos completos, que pueden expresarse en células de mamíferos, o para obtener fragmentos de anticuerpos biespecíficos, que contienen un segundo sitio de unión para desencadenar una función efectora.

Típicamente, el fragmento Fd (VH-CH1 ) y la cadena liviana (VL-CL) de los anticuerpos son clonados por separado por PCR y son recombinados de manera aleatoria en bibliotecas de combinación presentadas en fagos, en las que posteriormente puede realizarse la selección en función de la unión a un antí-geno particular. Los fragmentos Fab se expresan en la su-perficie del fago, es decir, se unen físicamente a los genes que los codifican. Por consiguiente, la selección de los fragmentos Fab a través de la unión a los antígenos también permite seleccionar las secuencias que codifican los fragmentos Fab, que luego pueden amplificarse. Al realizarse diversos procedimientos de unión al antígeno y amplificación recurrente, un procedimiento que se conoce como análisis, se incrementa el nivel de los fragmentos Fab con especificidad por el antígeno, y finalmente se los aisla.

Se ha desarrollado una variedad de procedimientos para obtener anticuerpos humanos de bibliotecas de presentación en fagos. Estas bibliotecas pueden construirse en un solo marco maestro, en el cual pueden recombinarse diversas CDR formadas in vivo (es decir, no derivadas del ser humano), como se describe en Carlsson y Soderlind, Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1 ), 102-108 (2001 ), Sóderlin et al. Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000), y la Patente de los EEUU N° 6989250. Como alternativa, esta biblioteca de anticuerpos podrá basarse en secuencias de aminoácidos que hayan sido diseñadas in silico y que estén codificadas por ácidos nucleicos creados por medios sintéticos. El diseño in silico de la secuencia de un anticuerpo se efectúa, por ejemplo, analizando una base de datos de secuencias humanas y concibiendo una secuencia polipeptídica mediante el uso de los datos obtenidos. Se describen métodos para diseñar u obtener secuencias creadas in silico, por ejemplo, en Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57, rebs et al., J. Immunol. Methods (2001 ) 254:67, y la Patente de los EEUU N° 6300064. Para hallar una revisión de las técnicas de presentación en fagos, véase WO08/022295 (Novartis).

Como alternativa, un anticuerpo de esta invención puede provenir de animales. Este anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado o un anticuerpo human modificado, como se resume en WO08/022295 (Novartis). El anticuerpo puede provenir de animales transgénicos [véase también WO08/022295 (Novartis)].

Como se las usa en la presente, las distintas "formas" de un antígeno, p.ej., el PRLR, se definen en la presente como las distintas moléculas proteicas que son el resultado de distintas modificaciones que ocurren durante la traducción y después de la traducción, tales como, sin limitaciones, las diferencias en la separación del transcripto primario del receptor de prolactina, las diferencias en la glicosilación y las diferencias en la escisión proteolítica posterior a la traducción.

Como se lo usa en la presente, el término "epitope" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse de manera específica a una inmunoglobulina o a un receptor en una célula T. Los determinantes epitópicos usualmente consisten en agrupamientos que presentan actividad química superficial, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares, y frecuentemente tienen características específicas en su estructura tridimensional, así como características de carga específicas. Se dice que dos anticuerpos "se unen al mismo epitope" cuando se demuestra que un anticuerpo compite con el segundo anticuerpo en un ensayo de unión competitiva, que puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquiera de los métodos que son bien conocidos en la técnica, y cuando preferiblemente los dos anticuerpos se unen a la totalidad de los aminoácidos del epitope.

Los términos "anticuerpos maduros" y "fragmentos de unión al antígeno maduros", por ejemplo, las variantes de los fragmentos Fab maduros, incluyen los derivados de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo que presentan una unión más fuerte a un antígeno dado, tal como el dominio extracelular del PRLR, es decir, que se unen a él con una mayor afinidad. La maduración es el proceso en el que se identifica una pequeña cantidad de mutaciones dentro de las seis CDR de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo que dan como resultado este incremento en la afinidad. El proceso de maduración es la combinación de métodos de biología molecular que permiten introducir mutaciones en el anticuerpo y analizar e identificar los miembros de unión mejorados.

Métodos terapéuticos Los métodos terapéuticos comprenden administrarle al sujeto que necesita el tratamiento una cantidad eficaz para el uso terapéutico de un anticuerpo contemplado en la invención. En la presente, una "cantidad eficaz para el uso terapéutico" se define como una cantidad de un anticuerpo que es suficiente para bloquear la proliferación de las células positivas para el PRLR en el área tratada del sujeto, que puede administrarse como una sola dosis o de acuerdo con un régimen de múltiples dosis, por sí sola o en combinación con otros agentes. Esto puede dar como resultado el alivio de una condición adversa, pero la cantidad debe ser tolerable desde el punto de vista toxicológico. El sujeto puede ser un ser humano o un animal no humano (p. ej., un conejo, una rata, un ratón, un mono u otro primate de un orden inferior).

Es posible administrar un anticuerpo de la invención de manera concurrente con medicamentos conocidos, y en algunas instancias, es posible modificar el propio anticuerpo. Por ejemplo, sería posible conjugar el anticuerpo con una inmunotoxina o un radioisótopo para potencialmente incrementar aun más la eficacia.

Los anticuerpos de la invención pueden usarse como herramienta terapéutica o de diagnóstico en una variedad de situaciones donde el PRLR se exprese en un nivel indeseablemente elevado. Los trastornos y las afecciones que son particularmente susceptibles al tratamiento con los anticuerpos de la invención son la endometriosis, la adenomiosis, la anticoncepción de la fertilidad femenina no hormonal, la enfermedad mamaria benigna y la mastalgia, la inhibición de la lactancia, la hiperplasia pros-tática benigna, los fibroides, la pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica. También se incluye el tratamiento concurrente en una terapia hormonal combinada, con el fin de inhibir la proliferación de las células del epitelio mamario.

Para tratar cualquiera de los trastornos precedentes, las composiciones farmacéuticas que han de usarse de acuerdo con la presente invención pueden formularse de manera convencional, mediante el uso de uno o más vehículos o excipientes aceptables para aplicaciones fisiológicas. Un anticuerpo de la invención puede administrarse por cualquier medio apropiado, que puede variar en función del tipo de trastorno que se desea tratar. Las rutas de administración posibles incluyen las vías parenteral (p.ej., intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea), intrapulmonar e intranasal, y si resulta deseable para un tratamiento de inmunosupresión local, la administración intralesional. Además, un anticuerpo de la invención puede administrarse a través de una infusión en pulsos, p.ej., con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferiblemente, la dosis se administra por inyección, más preferiblemente por inyección intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte del carácter breve o crónico de la administración. La cantidad que ha de administrarse depende de una variedad de factores, tales como los síntomas clínicos, el peso del individuo y la administración concurrente de otras drogas. Aquellos versados en la técnica han de reco-nocer que la ruta de administración variará en función del trastorno o la afección que se desee tratar.

La determinación de una cantidad eficaz para el uso terapéutico del polipéptido novedoso de acuerdo con esta invención dependerá en gran medida de las características del paciente particular, de la ruta de administración y de la naturaleza del trastorno que se desee tratar. Pueden hallarse lineamientos generales, p.ej., en las publicaciones de la Conferencia Internacional para la Armonización y en Remington's Pharmaceutical Sciences, capítulos 27 y 28, pp. 484-528 (18a edición, Alfonso R. Gennaro, editor, Easton, Pa.: ack Pub. Co., 1990). Más específicamente, la determinación de la cantidad eficaz para el uso terapéutico dependerá de factores como la toxicidad y la eficacia del medicamento. La toxicidad puede determinarse con métodos bien conocidos en la técnica, que pueden hallarse en las referencias precedentes. La eficacia puede determinarse empleando los mismos lineamientos, en conexión con los métodos que se describirán en los ejemplos más adelante.

Composiciones farmacéuticas y administración La presente invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas que pueden comprender anticuerpos contra el PRLR, solos o en combinación con al menos un agente adicional, tal como un compuesto estabilizador, que pueden administrarse en cualquier vehículo farmacéutico estéril biocompatible, incluyendo, sin limitaciones, la solución salina, la dextrosa y el agua. Cualquiera de estas moléculas podrá administrársele a un paciente por sí sola o en combinación con otros agentes, drogas u hormonas, en composiciones farmacéuticas donde se la mezcle con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. En una forma de realización de la presente invención, el vehículo farmacéuticamente aceptable es inerte desde el punto de vista farmacéutico.

La presente invención también se relaciona con la administración de las composiciones farmacéuticas. Esta administración se efectúa por vía parenteral. Los métodos para efectuar la administración parenteral incluyen la administración tópica, intraarterial (directamente en el tumor), intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina o intranasal. Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas podrán contener vehículos farmacéuticamente aceptables que comprendan excipientes y auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos, con el fin de obtener preparaciones que puedan usarse en aplicaciones farmacéuticas. Pueden hallarse detalles adicionales sobre la formulación y la administración en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (editado por Maack Publishing Co., Easton, Pa.).

Las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen las soluciones acuosas de los compuestos activos. Para la inyección, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en amortiguadores compatibles con aplicaciones fisiológicas, tales como la solución de Hank, la solución de Ringer o la solución salina amortiguada de uso fisiológico. Las suspensiones acuosas inyectables podrán contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, tales como la carboximetil celulosa de sodio, el sorbitol o el dex-trano. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones oleosas inyectables apropiadas. Los solventes o los vehículos lipofílicos apropiados incluyen los aceites grasos, tales como el aceite de sésamo, los ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como el oleato de etilo o los triglicéridos, o los liposomas. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes apropiados para incrementar la solubilidad de los compuestos, con el objeto de facilitar la preparación de soluciones altamente concentradas.

Para la administración tópica o nasal, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera particular que se desea atravesar. Estos penetrantes generalmente son conocidos en la técnica.

La administración parenteral también comprende métodos de administración parenteral que también incluyen la administración intraarterial, intramuscular, subcu-tánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina, vaginal o ¡ntranasal.

Conjuntos de elementos La invención también se relaciona con lotes farmacéuticos y conjuntos de elementos comprenden uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención que se mencionaron con anterioridad. En estos recipientes podrá haber una indicación donde se señale la aprobación de la manufactura, el uso y la comercialización del producto para la administración a los seres humanos por la agencia gubernamental correspondiente, responsable de la regulación de la manufactura, el uso y la comercialización de fármacos o productos biológicos.

En otra forma de realización, los conjuntos de elementos pueden contener secuencias de ADN que codifican los anticuerpos de la invención. Preferiblemente, las secuencias de ADN que codifican estos anticuerpos se proveen en un plásmido apropiado para transfectar y expresar en una célula huésped. El plásmido puede contener un promotor (frecuentemente un promotor inducible) para regular la expresión del ADN en la célula huésped. El plásmido también puede contener sitios de restricción para facilitar la inserción de otras secuencias de ADN. en el plásmido, con el propósito de producir diversos anticuerpos. Los plásmidos también pueden contener otros elementos para facilitar la clonación y la expresión de las proteínas codificadas. Estos elementos son bien conocidos por aquellos versados en la técnica e incluyen, p.ej., marcadores de selección, codones de terminación y semejantes.

Manufactura y almacenamiento Las composiciones farmacéuticas de la presente invención podrán manufacturarse de una manera que sea conocida en la técnica, por ejemplo, con procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, captura o liofilización.

La composición farmacéutica puede proveerse como un polvo liofilizado en histidina 1 mM-50 m , con 0,1%-2% de sacarosa y 2%-7% de manitol, con un pH en el rango de entre 4,5 y 5,5, que puede combinarse con un amortiguador antes de usarlo.

Una vez completa la elaboración de las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la invención formulado en un vehículo aceptable, es posible colocarlas en un recipiente apropiado, con instrucciones para el tratamiento de una afección indicada. Para administrar los anticuerpos contra el PRLR, en estas instrucciones puede detallarse la cantidad, la frecuencia y el método de administración.

Dosis con eficacia terapéutica Las composiciones farmacéuticas que son apropiadas para usar en la presente invención incluyen aquellas composiciones donde los ingredientes activos están presentes en una cantidad eficaz para el propósito deseado, es decir, el tratamiento de un estado de enfermedad particular caracterizado por la expresión del PRLR. La determinación de una dosis eficaz está dentro del alcance de aquellos versados en la técnica.

Para cualquier compuesto, la dosis con eficacia terapéutica puede estimarse inicialmente en ensayos en cultivos celulares, por ejemplo, en células de linfoma, o en modelos en animales, usualmente ratones, ratas, conejos, perros, cerdos o simios. También puede usarse un modelo en un animal para determinar el rango de concentración y la ruta de administración deseados. Posteriormente, esta información puede usarse para determinar las dosis y las rutas útiles para la administración en seres humanos.

La dosis con eficacia terapéutica hace referencia a la cantidad de una proteína, de un anticuerpo contra ella o de un antagonista o un inhibidor de dicha proteína que permite mejorar los síntomas o la afección. La eficacia terapéutica y la toxicidad de estos compuestos pueden determinarse de acuerdo con procedimientos farmacéuticos convencionales, en cultivos celulares o en animales experimentales, p.ej., a través de la ED50 (la dosis con eficacia terapéutica en 50% de la población) y la LD50 (la dosis letal para 50% de la población). La proporción entre las dosis correspondientes a los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, que puede expresarse como la proporción ED5o/LD5o. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que presentan índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos en los ensayos en cultivos celulares y en los estudios en animales se usan para formular un rango de dosificación para el uso en los seres humanos. La dosis de estos compuestos preferiblemente se halla en un rango de concentraciones en la circulación que incluyen la ED50, y se caracteriza por una toxicidad escasa o nula. Dentro de este rango, la dosis puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada, de la sensibilidad del paciente y de la ruta de administración.

La dosis exacta es seleccionada por el médico individual, en función del paciente que desea tratar. La dosis y la administración se ajustan para proveer niveles de la unidad activa que son suficientes para mantener el efecto deseado. Otros factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la severidad del estado de enfermedad, por ejemplo, el tamaño y la localización de las lesiones en el endometrio, la edad, el peso y el género del paciente, la dieta, la duración y la frecuencia de la administración, las combinaciones de drogas, la sensibilidad a la reacción y la y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrarse con una frecuencia de 3 ó 4 días, una vez por semana, una vez por quincena o una vez por mes, dependiendo de la vida media y la tasa de eliminación de la formulación particular.

Las dosis normales pueden variar entre 0,1 y 100000 microgramos, hasta la dosis total, de aproximadamente 2 g, dependiendo de la ruta de administración. En la literatura pueden hallarse lineamientos relacionados con las dosis y los métodos de administración particulares. Véanse US. 4657760, US 5206344 o US 5225212. Aquellos versados en la técnica han de poder emplear distintas formulaciones para los polinucleótidos y para las proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la administración de los polinucleótídos o los polipéptidos será específica para las células, las afecciones, las localizaciones u otros factores particulares. Las actividades preferidas para un anticuerpo radiomarcado pueden variar entre 0,1 y 10 mCi/mg de proteínas (Riva et al., Clin. Cáncer Res. 5:3275s-3280s, 1999; Wong et al., Clin. Cáncer Res. 6:3855-3863, 2000; Wagner et al., J. Nuclear Med. 43:267-272, 2002).

La presente invención se describirá con mayor detalle en los ejemplos más adelante. Los ejemplos se proveen exclusivamente para ilustrar la invención en refe-rencia a formas de realización específicas. Si bien en estos ejemplos se ilustran determinados aspectos específicos de la invención, los ejemplos no han de constituir limitaciones para el alcance de la presente invención.

Todos los ejemplos fueron puestos en práctica de acuerdo con procedimientos convencionales, que han de ser bien conocidos y de uso convencional para aquellos versados en la técnica, excepto donde se indique lo contrario y se provea una descripción detallada. Los pro-cedimientos convencionales de biología molecular que se describirán en los ejemplos más adelante pueden ponerse en práctica como se describe en los manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Expresión del ARNm de la prolactina (PRL-ARNm) (determinada con un análisis de PCR en tiempo real de TaqMan) en endometrio humano y en lesiones (tejido ectópi-co) de mujeres saludables y de mujeres que sufren endometriosis.

Figura 2. Expresión del ARNm del receptor de prolactina (PRLR-ARNm) (determinada con un análisis de PCR en tiempo real de TaqMan) en endometrio humano y en lesiones (tejido ectópico) de mujeres saludables y de mujeres que sufren endometriosis.

Figura 3. Análisis de transferencia Northern de la expresión del gen de la PRLR en tejidos de rata. La expresión del gen de la PRLR fue elevada en la placenta y en la próstata.

Figura 4. Análisis de transferencia Northern de la expresión del PRLR en próstatas de rata tratadas con distintas hormonas. El tratamiento con estradiol de las ratas intactas y la castración dieron como resultado una regulación positiva de la proteína del PRLR en las próstatas de las ratas, mientras que el tratamiento con dihidrotestosterona de las ratas intactas no afectó la expresión del PRLR en la próstata, en comparación con el tratamiento de los animales intactos con el vehículo.

Figura 5. Inhibición de la proliferación de las células Ba/F (= Baf, donde se expresaba de manera estable el PRLR humano) activada con prolactina por los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR y por los anticuerpos no específicos control. Se determinaron los siguientes valores de la IC50 para los anticuerpos en el formato de lgG1 : 005-C04 (círculos cerrados): 1 ,29 pg/ml = 8,6 nM; 006-H08 (círculos abiertos): 0,15 pg/ml = 1 nM; HE06.642 (triángulos cerrados): 0,34 pg/ml = 2,2 nM; 002-H06 (triángulos abiertos): 0,54 pg/ml = 3,6 nM; 002-H08 (cuadrados cerrados): 0,72 pg/ml = 4,8 nM. El anticuerpo no específico control (cuadrados abiertos) no inhibió la proliferación de las células.

Figura 6. Inhibición de la proliferación de las células de linfoma de rata (células NB2) inducida con prolactina por los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR y por los anticuerpos no específicos control. Se determinaron los siguientes valores de la IC50: XHA 06.642 (círculos cerrados): 10 pg/ml = 67 nM; XHA 06.983 (círculos abiertos). No se observaron efectos sobre la proliferación de las células de linfoma de rata. El anticuerpo no específico control (triángulos cerrados) no presentó efectos en una dosis de 10 pg/ml.

Figura 7. Inhibición de fosforilación de STAT5 estimulada con prolactina en las células T47D por los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR y por el anticuerpo no específico control. El anticuerpo no específico control (FITC) no inhibe la fosforilación de STAT5 en las células T47D. En contraste, los anticuerpos XHA 06.642, 005-C04 (= lgG1 005-C04) y 006-H08 (= lgG1 006-H08) inhiben la fosforilación de STAT5 en las células T47D de una manera dependiente de la dosis.

Figura 8. Efectos de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR y de anticuerpos no específicos control sobre la actividad del gen indicador de luciferasa activado con prolactina, en células HEK293 transfectadas de manera estable con el receptor de prolactina humano (hPRLR) donde se expresaba de manera transitoria el gen de la luciferasa bajo el control de elementos de respuesta hormonal lactogénicos (LHRE). Se deter-minaron los siguientes valores de la IC50 para los anticuerpos en el formato de lgG1: 006-H08 (círculos cerrados): 0,83 pg/ml = 5,5 nM; HE06.642 (círculos abiertos): 0,63 pg/ml = 4,2 nM. El anticuerpo no específico control (triángulos cerrados) no inhibió la actividad de la luciferasa.

Figura 9. Efectos de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR y de anticuerpos no específicos control sobre la actividad del gen indicador de luciferasa activada con prolactina, en células HEK293 transfectadas de manera estable con el receptor de prolactina murino (mPRLR) donde se expresaba de manera transitoria el gen de la luciferasa bajo el control de elementos de respuesta hormonal lactogénicos (LHRE). Se determinaron los siguientes valores de la IC50 para los anticuerpos en el formato de lgG1: 005-C04 (triángulos cerrados): 0,45 pg/ml = 3 nM; XHA 06.642 (círculos cerrados): »50 pg/ml » 333 nM. El anticuerpo no específico control (círculos abiertos) no inhibió la actividad de la luciferasa.

Figura 10. Inhibición de la proliferación de las células Ba/F (= Baf, donde se expresaba de manera estable el PRLR humano) activada con prolactina por los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR y por los anticuerpos no específicos control. Se determinaron los siguientes valores de la ICS0 para los anticuerpos en el formato de lgG1 : el anticuerpo no específico FITC (cuadrados cerrados) no inhibió la proliferación de las células; HE06.642 (círculos cerrados): »> 30 g/ml »> 200 n ; 001-E06 (círculos abiertos): 43,7 pg/ml = 291 nM; 001 -D07 (triángulos cerrados): 16,5 pg/ml = 110 nM; 005-C04 (triángulos abiertos): 0,74 pg/ml = 4,9 nM.

Figura 11. Tasas de preñez y tamaño medio de la camada en ratones hembra tratados con solución salina amortiguada con fosfato (= vehículo), con un anticuerpo no específico control (FITC lgG1) o con un anticuerpo neutralizador lgG1 005-C04 (= 005-C04). Las tasas de preñez fueron de 87,5% (para las hembras tratadas con el vehículo), 75% (para las hembras tratadas con 10 mg/kg del anticuerpo no específico), 100% (para las hembras tratadas con 10 mg/kg de lgG1 005-C04) y 0% (para las hembras tratadas con 30 mg/kg de lgG1 005-C04). El tamaño medio de la camada fue de 10,9 animales (para las hembras tratadas con el vehículo), 12,3 animales (para las hembras tratadas con 10 mg/kg del anticuerpo no especifico), 13 animales (para las hembras tratadas con 10 mg/kg de lgG1 005-C04) y 0 animales (para las hembras tratadas con 30 mg/kg de lgG1 005-C04).

Figura 12. Numeración de Kabat de las posiciones de los aminoácidos del marco, de acuerdo con Johnson y Wu (Nucleic Acids Res. 2000, 28, 214-218.

Figura 13. Resultados de un análisis de FACS con anticuerpos anti-PRLR seleccionados (005-C04, 001-E06, HE06642). La unión de los anticuerpos se determinó con una concentración fija en células HEK293 donde se expresaba el PRLR humano y de ratón, en comparación con una línea celular progenitora donde no se expresaba el PRLR.

Figura 14A. Ganancia de peso de la camada en cada día posterior al parto, expresada como un porcentaje del peso de la camada determinado el primer día posterior al parto. Se detalla la ganancia de peso de las camadas de las madres sin tratar (círculos cerrados), de las madres tratadas con 10 mg/kg de un anticuerpo no específico murino basado en lgG2a (círculos abiertos) y de las madres tratadas con el anticuerpo neutralizador 005-C04, que contenía dominios constantes de la lgG2a murina (= lgG2a 005-C04), en dosis de 10 mg/kg (triángulos cerrados) y de 30 mg/kg (triángulos abiertos). Con flechas se indican los días en que se aplicó la inyección del anticuerpo. Hay una reducción significativa en la ganancia de peso de las camadas de las madres tratadas con 30 mg/kg de lgG2a 005-C04 desde el octavo día posterior al parto en adelante.

Figura 14B. Ganancia de peso diaria creciente de las camadas, expresada como un porcentaje del peso de la carnada determinado el primer día posterior al parto. Se detallan los resultados de las carnadas de las madres sin tratar (círculos cerrados), de las madres tratadas con 10 mg/kg de un anticuerpo no específico murino basado en lgG2a (círculos abiertos) y de las madres tratadas con el anticuerpo neutralizador 005-C04, que contenía dominios constantes de la lgG2a murina (= lgG2a 005-C04), en dosis de 10 mg/kg (triángulos cerrados) y de 30 mg/kg (triángulos abiertos). Básicamente, en la figura 14A se representa la pendiente de los gráficos de la figura 14A. La ganancia de peso diaria en las carnadas de las madres sin tratar y de las madres tratadas con 10 mg/kg del anticuerpo no específico es de aproximadamente 30% del peso de la carnada el primer día posterior al parto. En contraste, el tratamiento de las madres con 30 mg/kg de lgG2a 005-C04 da como resultado una reducción significativa en la ganancia de peso desde el día 7 en adelante (*p<0,05; ***p<0,005 en comparación con las carnadas de las madres tratadas con el anticuerpo no específico), mientras que el tratamiento con 10 mg/kg de lgG2a 005-C04 da como resultado una reducción significativa en la ganancia de peso diaria desde el día 1 1 en adelante (p<0,05 en comparación con las carnadas de las madres tratadas con el anticuerpo no específico). Con flechas se indican los días en que se aplicó la inyección del anticuerpo.

Figura 14C. Secciones histológicas de las glándulas mamarias de madres en lactancia. Las glándulas mamarias de las madres sin tratar o de las ma-dres tratadas con el anticuerpo no específico están llenas de conductos que producen leche. En contraste, se observa una involución dependiente de la dosis de las glándulas mamarias, que se ve reflejada en la aparición de islotes grasos (flechas negras), como resultado de un tratamiento con el anticuerpo neutralizador lgG2a 005-C04.

Figura 14D. Expresión de las proteínas de la leche en las glándulas mamarias de madres en lactancia. La expresión de las proteínas de la leche beta caseína (Csn-2), la proteína acida del suero (WAP) e IGF-1 se reduce de una manera dependiente de la dosis en las madres tratadas con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG2a 005-C04, pero no en las madres tratadas con anticuerpos no específicos. La expresión genética se normalizó en función de la expresión de la proteína capaz de unirse a la caja TATA (TBP).

Figura 15A. Formación de ramas laterales y de estructuras similares a alvéolos en un modelo de una enfermedad mamaria benigna hiperprolactinémica en ratones. El anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG1 005-C04 (= 005-C04) inhibió las ramificaciones laterales y la formación de estructuras similares a alvéolos en dosis de 10 y 30 mg/kg en los ratones que habían recibido isoinjertos de pituitaria.

Figura 15B. Extensión de la hiperplasia epitelial y de la proliferación de las células epiteliales en un modelo de una enfermedad mamaria benigna hiperprolactinémica en ratones. Algunas células positivas para BrdU están marcadas con flechas blancas. El anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG1 005-C04 (= 005-C04) bloquea la hiperplasia epitelial y la proliferación de las células epiteliales en la glándula mamaria.

Figura 15C. Extensión de la fosforilación de STAT5 en un modelo de una enfermedad mamaria benigna hiperprolactinémica en ratones. Algunas células positivas para fosfo-STAT5 están marcadas con flechas blancas. El anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG1 005-C04 (= 005-C04) bloquea completamente la fosforilación de STAT5 cuando se lo aplica en una dosis de 30 mg/kg.

Figura 16. Inhibición del crecimiento de la próstata por el anticuerpo neutralizador contra el PRLR 005-C04, que contiene dominios constantes de la lgG2a murina (= lgG2a 005-C04). El isoinjerto de pituitaria estimula el crecimiento de la próstata, en comparación con los ratones sometidos a una operación simulada. El tratamiento con los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR, en dosis de 10 mg/kg y en dosis de 30 mg/kg, inhibe el crecimiento de la próstata (***p<0,005 en comparación con los ratones sin tratar, sometidos a una operación simulada).

Figura 17. Los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR estimulan el crecimiento del cabello en presencia de hiperprolactinemia. Se tomaron fotografías tres semanas después de realizar isoinjertos de pituitaria en los ratones macho que se usaron en los experimentos que se describen en el ejemplo 17 y en la figura 16 (que también fueron afeitados). La hiperprolactinemia inhibe el crecimiento de nuevo cabello en las áreas afeitadas. Los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR, pero no los anticuerpos no específicos, estimulan el crecimiento de nuevo cabello bajo condiciones de hiperprolactinémica en dosis de 10 y 30 mg/kg de 005-C04 (= lgG2a 005-C04).

Figura 18. Los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR, pero no los anticuerpos no específicos, estimulan el crecimiento de nuevo cabello en las áreas afeitadas de ratones macho y hembra hiperprolactinémicos y normoprolactinémicos (ejemplo 18). Puede concluirse que los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR son apropiados para tratar la pérdida de cabello bajo condiciones normoprolactinémicas e hiperprolactinémicas en los hombres (figura 18B) y en las mujeres (figura 18A).

Figura 19. Los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR, pero no los anticuerpos no específicos control, inhiben la proliferación celular incrementada en la glándula mamaria después de una terapia hormonal combinada, es decir, una terapia con una combinación de estrógeno y progestina. Se evaluó la cantidad absoluta de células epiteliales de los conductos en proliferación en 4 secciones transversales de la glándula mamaria. En la figura, se ilustran las medianas como barras horizontales. La proliferación de las células epiteliales en los ratones ovariectomizados tratados con el vehículo es bastante baja (con una mediana de 0). El tratamiento con estradiol da como resultado una cierta estimulación de la proliferación de las células epiteliales (con una mediana de 9). Se observa una proliferación máxima de las células del epitelio mamario al aplicarse un tratamiento con estrógeno y progesterona (con una mediana de 144). El tratamiento con el anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina 005-C04 (con una mediana de 84 después de un tratamiento con 10 mg/kg de 005-C04 y una mediana de 27 después de un tratamiento con 30 mg/kg de 005-C04), pero no con el anticuerpo no específico control (con una mediana de 154), da como resultado una disminución dependiente de la dosis en la proliferación de las células del epitelio mamario, prácticamente hasta alcanzar los niveles obtenidos al aplicar estradiol solo. Por consiguiente, los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR son apropiados para tratar la proliferación incrementada de las células del epitelio mamario al aplicar una terapia hormonal combinada, es decir, un tratamiento con estradiol y progesterona.

Figura 20. Los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR, pero no los anticuerpos no específicos control, inhiben la endometriosís interna en ratones. Los resultados se representan como las calificaciones de la enfermedad que se describen en el ejemplo 20. La mediana de la calificación de la enfermedad para cada grupo experimental se indica como una barra horizontal. Los ratones normoprolactinémicos desarrollan una endometriosís interna en un cierto grado (con una mediana de la calificación de la en-fermedad de 0,25). La hiperprolactinemia debida al isoinjerto de pituitaria incrementa la calificación de la enfermedad, y más animales su-fren la enfermedad (con una mediana de la calificación de la enfermedad de 2,5). Por otro lado, el tratamiento con una aplicación sola de 30 mg/kg de un anticuerpo no específico (con una mediana de la calificación de 2,5) o con dos aplicaciones del mismo anticuerpo (con una mediana de la calificación de 2) por semana no influyó en la enfermedad. El tratamiento con los anticuerpos neutralizadores específicos dio como resultado una disminución dependiente de la dosis en la cantidad de animales enfermos: la mediana de la calificación de la enfermedad en todos los casos en que se usó el anticuerpo específico fue de cero. Vale destacar que todos los animales que habían recibido dos aplicaciones semanales de 10 ó 30 mg/kg del anti-cuerpo específico se curaron por completo, por lo que la calificación de la enfermedad en ellos fue significativamente menor que la calificación de la enfermedad de los ratones normoprolactinémicos. Por lo tanto, los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR son apropiados para tratar la endometriosis interna (= adenomiosis uteri) y la endometriosis externa en las mujeres.

Figura 21. Pruebas de la unión de variantes maduras del fragmento Fab de 006-H08 en las que se usó un ensayo de fluorescencia homogénea con resolución temporal (HTRF). Se evaluó la unión de los sobrenadantes de E. coli que contenían los fragmentos Fab al dominio extracelular del PRLR humano a través de la competición con las moléculas de lgG1 de 006-H08. En la figura se ilustra la unión de las variantes de los fragmentos Fab como un diagrama de barras. En el eje Y se proveen las intensidades de las señales (a 665 n ) que se obtuvieron con incubaciones con cinco duraciones diferentes. En el eje X se detallan los nombres de las variantes de los fragmentos Fab. Las señales menores que las del control, el fragmento Fab de 006-H08, que se observan en determinados puntos de tiempo, reflejan una unión mejorada al PRLR. Todos los fragmentos Fab que se observan en la parte 1 representan miembros de unión mejorados, mientras que en la parte 2 se observan algunos miembros de unión mejorados y algunos miembros de unión no mejorados.

En SEQ ID N° 1 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de 006-H08.

En SEQ ID N° 2 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de 002-H06.

En SEQ ID N° 3 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de 002-H08.

En SEQ ID N° 4 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de 006-H07.

En SEQ ID N° 5 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de 001-E06.

En SEQ ID N° 6 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR1 de 005-C04.

En SEQ ID N° 7 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de 006-H08.

En SEQ ID N° 8 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de 002-H06.

En SEQ ID N° 9 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de 002-H08.

En SEQ ID N° 10 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de 006-H07.

En SEQ ID N° 11 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de 001-E06.

En SEQ ID N° 12 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de 005-C04.

En SEQ ID N° 13 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de 006-H08 y de 002- H06.

En SEQ ID N° 14 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de 002-H08.

En SEQ ID N° 15 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de 006-H07.

En SEQ ID N° 16 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de 001-E06.

En SEQ ID N° 17 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR3 de 005-C04.

En SEQ ID N° 18 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de 006-H08.

En SEQ ID N° 19 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de 002-H06.

En SEQ ID N° 20 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de 002-H08.

En SEQ ID N° 21 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de 006-H07.

En SEQ ID N° 22 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de 001-E06.

En SEQ ID N° 23 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de 005-C04.

En SEQ ID N° 24 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de 006-H08 y de 002- H08.

En SEQ ID N° 25 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de 002-H06.

En SEQ ID N° 26 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de 006-H07.

En SEQ ID N° 27 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de 001 -E06.

En SEQ ID N° 28 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR2 de 005-C04.

En SEQ ID N° 29 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de 006-H08.

En SEQ ID N° 30 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de 002-H06 y de 001- E06.

En SEQ ID N° 31 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de 002-H08.

En SEQ ID N° 32 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de 006-H07.

En SEQ ID N° 33 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de 005-C04.

En SEQ ID N° 34 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08.

En SEQ ID N° 35 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 002-H06.

En SEQ ID N° 36 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 002-H08.

En SEQ ID N° 37 se representa l secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H07.

En SEQ ID N° 38 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 001-E06.

En SEQ ID N° 39 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 005-C04.

En SEQ ID N° 40 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08.

En SEQ ID N° 41 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 002-H06.

En SEQ ID N° 42 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 002-H08.

En SEQ ID N° 43 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H07.

En SEQ ID N° 44 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 001-E06.

En SEQ ID N° 45 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 005-C04.

En SEQ ID N° 46 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08.

En SEQ ID N° 47 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 002-H06.

En SEQ ID N° 48 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 002-H08.

En SEQ ID N° 49 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H07.

En SEQ ID N° 50 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 001-E06.

En SEQ ID N° 51 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 005-C04.

En SEQ ID N° 52 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VL de 006-H08.

En SEQ ID N° 53 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VL de 002-H06.

En SEQ ID N° 54 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VL de 002-H08.

En SEQ ID N° 55 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VL de 006-H07.

En SEQ ID N° 56 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VL de 001-E06.

En SEQ ID N° 57 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VL de 005-C04.

En SEQ ID N° 58 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de HE06642, de Novartis (WO2008/22295).

En SEQ ID N° 59 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de XHA06642, de Novartis (WO2008/22295).

En SEQ ID N° 60 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de XHA06983, de Novartis (WO2008/22295).

En SEQ ID N° 61 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de HE06642.

En SEQ ID N° 62 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de XHA06642, de Novartis (WO2008/22295).

En SEQ ID N° 63 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de XHA06983, de Novartis (WO2008/22295).

En SEQ ID N° 64 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de HE06642.

En SEQ ID N° 65 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de XHA06642, de Novartis (WO2008/22295).

En SEQ ID N° 66 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de XHA06983, de Novartis (WO2008/22295).

En SEQ ID N° 67 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VL de HE06642.

En SEQ ID N° 68 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VL de XHA06642, de Novartis (WO2008/22295).

En SEQ ID N° 69 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VL de XHA06983, de Novartis (WO2008/22295).

En SEQ ID N° 70 se representa el ECD del PRLR humano, los aminoácidos entre las posiciones 1 y 210, el dominio S1 , entre las posiciones 1 y 100 (la construcción del dominio S1 1 -102), y el dominio S2, entre las posiciones 101 -210.

En SEQ ID N° 71 se representa la CDS del ECD del PRLR humano, los nucleótidos en las posiciones 1 -630.

En SEQ ID N° 72 se representa el ECD del PRLR murino, los aminoácidos entre las posiciones 1 y 210.

En SEQ ID N° 73 se representa la CDS el ECD del PRLR murino, los nucleótidos en las posiciones 1 -630.

En SEQ ID N° 74 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 75 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 76 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 77 se representa la secuencia de aminoácidos de la HCDR2 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 78 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 79 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 80 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 81 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 82 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 83 se representa la secuencia de amino-ácidos de la LCDR1 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 84 se representa la secuencia de amino-ácidos de la LCDR1 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 85 se representa la secuencia de amino-ácidos de la LCDR1 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 86 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 87 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 88 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 89 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR1 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 90 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 91 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 92 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 93 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 94 se representa la secuencia de amino-ácidos de la LCDR3 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 95 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 96 se representa la secuencia de amino-ácidos de la LCDR3 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 97 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 98 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 99 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 100 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 101 se representa la secuencia de aminoácidos de la LCDR3 de las variantes maduras de 006-H08.

En SEQ ID N° 143 se representa la secuencia de amino-ácidos de la VH de 006-H08-12-2.

En SEQ ID N° 144 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-13-2.

En SEQ ID N° 145 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-13-6-1.

En SEQ ID N° 146 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-14-6-0.

En SEQ ID N° 147 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-15-5.

En SEQ ID N° 148 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-19-1.

En SEQ ID N° 149 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-29-1.

En SEQ ID N° 150 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-32-2.

En SEQ ID N° 151 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-33-0.

En SEQ ID N° 152 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-33-16-0.

En SEQ ID N° 153 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-35-17-1.

En SEQ ID N° 154 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-35-17-4.

En SEQ ID N° 155 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-35-1.

En SEQ ID N° 156 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-36-17-0.

En SEQ ID N° 157 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-37-19-0.

En SEQ ID N° 158 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-39-7.

En SEQ ID N° 159 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-48-5.

En SEQ ID N° 160 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-53-27-0.

En SEQ ID N° 161 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-59-30-0.

En SEQ ID N° 162 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-63-32-4.

En SEQ ID N° 163 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-65-33-2.

En SEQ ID N° 164 se representa la secuencia de aminoácidos de la VH de 006-H08-68-35-2.

En SEQ ID N° 165 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-12-2.

En SEQ ID N° 166 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-13-2.

En SEQ ID N° 167 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-13-6-1.

En SEQ ID N° 168 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-14-6-0.

En SEQ ID N° 169 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-15-5.

En SEQ ID N° 170 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-19-1.

En SEQ ID N° 171 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-29-1.

En SEQ ID N° 172 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-32-2.

En SEQ ID N° 173 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-33-0.

En SEQ ID N° 174 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-33-16-0.

En SEQ ID N° 175 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-35-17-1.

En SEQ ID N° 176 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-35-17-4.

En SEQ ID N° 177 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-35-1.

En SEQ ID N° 178 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-36-17-0.

En SEQ ID N° 179 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-37-19-0.

En SEQ ID N° 180 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-39-7.

En SEQ ID N° 181 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-48-5.

En SEQ ID N° 182 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-53-27-0.

En SEQ ID N° 183 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-59-30-0.

En SEQ ID N° 184 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-63-32-4.

En SEQ ID N° 185 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-65-33-2.

En SEQ ID N° 186 se representa la secuencia de aminoácidos de la VL de 006-H08-68-35-2.

En SEQ ID N° 331 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-12-2.

En SEQ ID N° 332 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-13-2.

En SEQ ID N° 333 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-13-6-1.

En SEQ ID N° 334 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-14-6-0.

En SEQ ID N° 335 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-15-5.

En SEQ ID N° 336 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-19-1.

En SEQ ID N° 337 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-29-1.

En SEQ ID N° 338 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-32-2.

En SEQ ID N° 339 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-33-0.

En SEQ ID N° 340 se representa la secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-33-16-0.

En SEQ ID N° 341 se representa a secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-35-17-1.

En SEQ ID N° 342 se representa a secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-35-17-4.

En SEQ ID N° 343 se representa a secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-35-1.

En SEQ ID N° 344 se representa a secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-36-17-0.

En SEQ ID N° 345 se representa a secuencia del ácido nucleico de la VH de 006-H08-37-19-0.

En SEQ ID N° 346 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VH de 006-H08-39-7.

En SEQ ID N° 347 se representa la secuencia del ácido nucleico de a VH de 006-H08-48-5.

En SEQ ID N° 348 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VH de 006-H08-53-27-0.

En SEQ ID N° 349 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VH de 006-H08-59-30-0.

En SEQ ID N° 350 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VH de 006-H08-63-32-4.

En SEQ ID N° 351 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VH de 006-H08-65-33-2.

En SEQ ID N° 352 se representa la secuencia del ácido nucleico de a VH de 006-H08-68-35-2.

En SEQ ID N° 353 se representa la secuencia del ácido nucleico de a VL de 006-H08-12-2.

En SEQ ID N° 354 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VL de 006-H08-13-2.

En SEQ ID N° 355 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VL de 006-H08-13-6-1.

En SEQ ID N° 356 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VL de 006-H08-14-6-0.

En SEQ ID N° 357 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VL de 006-H08-15-5.

En SEQ ID N° 358 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VL de 006-H08-19-1.

En SEQ ID N° 359 se representa la secuencia del ácido nucleico de a VL de 006-H08-29-1.

En SEQ ID N° 360 se representa la secuencia del ácido nucleico de a VL de 006-H08-32-2.

En SEQ ID N° 361 se representa la secuencia del ácido nucleico de a VL de 006-H08-33-0.

En SEQ ID N° 362 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VL de 006-H08-33-16-0.

En SEQ ID N° 363 se representa la secuencia del ácido nucleico de a VL de 006-H08-35-17-1.

En SEQ ID N° 364 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VL de 006-H08-35-17-4.

En SEQ ID N° 365 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VL de 006-H08-35-1.

En SEQ ID N° 366 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VL de 006-H08-36-17-0.

En SEQ ID N° 367 se representa la secuencia del ácido nucleico de a VL de 006-H08-37-19-0.

En SEQ ID N° 368 se representa la secuencia del ácido nucleico de a VL de 006-H08-39-7.

En SEQ ID N° 369 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VL de 006-H08-48-5.

En SEQ ID N° 370 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VL de 006-H08-53-27-0.

En SEQ ID N° 371 se representa la secuencia de ácido nucleico de a VL de 006-H08-59-30-0.

En SEQ ID N° 372 se representa la secuencia del ácido nucleico de a VL de 006-H08-63-32-4.

En SEQ ID N° 373 se representa la secuencia del ácido nucleico de a VL de 006-H08-65-33-2.

En SEQ ID N° 374 se representa la secuencia del ácido nucleico de a VL de 006-H08-68-35-2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN EJEMPLOS Ejemplo 1 Aislamiento de anticuerpos específicos de blanco a partir de bibliotecas de expresión en fago de anticuerpos humanos Para aislar un panel de anticuerpos con capacidad de neutralizar la actividad del PRLR humano, se investigaron en paralelo tres bibliotecas de expresión en fago de anticuerpos humanos, que expresan fragmentos Fab y scFv. El blanco usado para el análisis en la biblioteca fue el dominio extracelular soluble (ECD) del receptor de prolactina representado por los aminoácidos entre 25 y 234 del receptor de prolactina humana, preparado como se describió anteriormente en WO08/022295 (Novartis). Blancos alternativos fueron el ECD del PRLR unido por el extremo C terminal a seis histidinas o a un dominio lgG1-Fc humano a través del conector con la secuencia de aminoácidos "isoleucina-glutamato-glicina-arginina-metionina-aspartato".

La selección de anticuerpos específicos de blanco a partir de expresión en fagos se realizó de acuerdo a los métodos descritos por Marks et al. ( ethods Mol. Biol. 248:161-76, 2004). Brevemente, la biblioteca de expresión en fagos se incubó con 50 pmol del ECD biotinilado a temperatura ambiente durante 1 hora y el complejo formado luego se capturó usando 100 µ? de suspensión de perlas de estreptavidina (Dynabeads® M-280 con estreptavidina, Invitrogen). Los fagos no específicos se eliminaron por lavado de las perlas con solución amortiguadora de lavado (PBS + 5% leche). Los fagos unidos se eluyeron con 0,5 mi de trietilamina (TEA) 100 nM, e inmediatamente se los neutralizó agregando un volumen igual de TRIS-HCI 1 M, pH 7,4. El conjunto de fagos eluidos se usó para infectar células de E. coli TG1 creciendo en fase logarítmica, y los fagémidos se rescataron como se describió con anterioridad (Methods Mol. Biol. 248:161-76, 2004). La selección se repitió durante un total de tres ciclos. Se estudió la actividad de unión por ensayo de ELISA de colonias únicas obtenidas de células TG1 infectadas con fagos eluidos del tercer ciclo de análisis. Brevemente, se usaron colonias únicas obtenidas de células TG1 infectadas con fagos eluidos para inocular placas de 96 cavidades.

Los microcultivos se hicieron crecer hasta una OD60O=0,6, punto en el cual se indujo la expresión del fragmento de anticuerpo soluble por agregado de IPTG 1 mM seguido de cultivo durante la noche en un incubador con agitación a 30°C. Las bacterias se centrifugaron y se preparó extracto periplásmico y se usó para detectar actividad de unión del anticuerpo a ECD inmovilizado en microplacas de 96 cavidades (placas Immunosorb de 96 cavidades de fondo plano, Nunc) seguido por protocolo estándar de ELISA provisto por el fabricante de las microplacas.

Las afinidades de unión de los anticuerpos anti-receptor de prolactina (PRLR) al dominio extracelular (ECD) recombinante se estimaron usando Biacore® 2000 y se usaron para clasificar por afinidad los anticuerpos.

Ejemplo 2 Análisis cuantitativo de expresión del gen de prolactina y del receptor de prolactina por análisis de PCR en tiempo real TaqMan en endometrio eu- y ectópico y lesiones endométricas de pacientes y controles sanos Se realizó análisis de PCR en tiempo real Taqman usando el Sistema Detector de Secuencia ABI PMsm 7700 de acuerdo a las instrucciones del fabricante (PE Applied Biosystems) y como se describe en Endocrinolgy 2008, 149(8): 3952-3959) y como es conocido por los expertos en el campo. Los niveles de expresión relativos de la PRL y del PRLR se normalizaron a la expresión de ciclofilina. Los inventores analizaron la expresión de la PRL y del PRLR en el endometrio de mujeres sanas y en endometrio y lesiones de endometrio de pacientes por uso de análisis de PCR en tiempo real cuantitativa Taqman. La expresión de prolactina y su receptor claramente aumentó en lesiones de endometrio en comparación a endometrios sanos o derivados de pacientes.

Los resultados se ilustran en las figuras 1 y 2.

Estos hallazgos implican que la señalización de prolactina autocrina tiene una participación en el desarrollo y mante-nimiento de endometriosis y adenomiosis uterina (endometriosis interna, una forma de endometriosis restringida al útero).

Ejemplo 3 Análisis de expresión de receptor de prolactina en tejidos humanos por transferencia Northern Se aisló ARN de distintos tejidos de rata y se transfirió a una membrana de nylon luego de electroforesis en gel. Las membranas se hibridizaron exitosamente con ADNc marcados radiactivamente para el receptor de prolactina de rata o ß-actina (como control de carga), se lavaron y se expusieron a una película fotográfica. Las bandas corresponden a los ARNm del receptor de prolactina y ß-actina de rata. Los resultados mostrados en la figura 3 indican una fuerte expresión del receptor de prolactina en la placenta, la próstata, el ovario y la glándula adrenal.

Ejemplo 4 Regulación de la expresión de la proteína receptor de prolactina en próstata de rata - influencia del castrado y tratamientos hormonales Las ratas se castraron o se mantuvieron intactas. Los animales intactos se trataron diariamente durante 14 días con vehículo (intacto), DHT (3 mg/kg) o E2 (0,4 mg/kg). Luego se aislaron las próstatas de animales de todos los grupos de tratamiento y se prepararon extractos de proteína. Los extractos de proteína se separaron por electroforesis en gel y se transfirieron a una membrana. El receptor de prolactina se detectó usando el anticuerpo disponible comercialmente MA610 (Santa Cruz Biotechnology). Los resultados se ilustran en la figura 4 e indican la regulación hormonal del receptor de prolactina en la próstata de rata.

Ejemplo 5 Inhibición de la proliferación inducida con prolactina de células BaF3 (transfectadas de manera estable con receptor de prolactina humano), por anticuerpos neutralizadores contra el receptor de prolactina y anticuerpos control no no específicos Para analizar la eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR, se usó la inhibición de la proliferación celular activada por prolactina de células BaF3. Las células se transfectaron de manera estable con PRLR humano y se cultivaron de rutina en RP I que contenía glutamina 2 m en presencia de FCS 10% y 10 ng/ml de prolactina humana. Luego de seis horas de inanición en medio libre de prolactina que contenía FCS 1%, las células se sembraron en placas de 96 cavidades a una densidad de 10000 células por cavidad. Las células se estimularon con prolactina 20 ng/ml y se coincubaron con dosis crecientes de anticuerpos neutralizadores contra el PRLR durante dos días. La proliferación celular se analizó usando un Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CelITiter-Glo (Promega). Se generaron curvas dosis-respuesta para la inhibición del crecimiento celular estimulado por prolactina y se calcularon los valores de IC50. Como control negativo, se usó la estimulación con un anticuerpo control no especifico.

Las curvas dosis-respuesta y valores de IC50 se describen en la figura 5. El anticuerpo no específico no inhibió la proliferación de células BaF que expresaban de manera estable el PRLR humano, mientras que los anticuerpos específicos bloquearon la proliferación celular y exhibieron potencias diferentes. El anticuerpo neutralizador 006-H08 presentó la mayor potencia en este paradigma leído.

Ejemplo 6 Inhibición de la proliferación inducida con prolactina de células de linfoma de rata por anticuerpos específicos e no específicos La eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR también se ensayó usando inhibición de la proliferación de células de linfoma de rata dependiente de prolactina (células Nb2-11 ). Se hicieron crecer de rutina células Nb2-11 en RPMI que contenía FCS 10% y suero de caballo 10%. Antes de comenzar los ensayos de crecimiento celular, las células se hicieron crecer durante 24 horas en el mismo medio que contenía FCS 1% en lugar de FCS 10%. Luego, las células se sembraron en placas de 96 cavidades en medio libre de FCS a una densidad de 10000 células por cavidad. Las células se estimularon con prolactina humana 10 ng/ml en presencia o ausencia de dosis crecientes de anticuerpos neutralizadores contra el PRLR o anticuerpos control durante 2 días. Luego se evaluó la proliferación celular usando un Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CelITiter-Glo (Promega). Las curvas dosis-respuesta y valores de IC50 se describen en la figura 6. El anticuerpo no específico y anticuerpo XHA06.983, no se unieron al PRLR de rata, no bloquearon la proliferación de células Nb2-11. XHA06.642 que se une a PRLR de rata bloqueó la proliferación de células Nb2-11.

Ejemplo 7 Inhibición de la fosforilación de STAT5 inducida con prolactina en células T47D por anticuerpos neutralizadores contra el receptor de prolactina Para analizar la eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR en una lectura adicional, se usó la inhibición de la fosforilación de STAT5 en células T47D humanas tratadas con prolactina. Las células T47D se hicieron crecer en RPMI que contenía FCS 10% y glutamina 2 mM. Las células se sembraron en placas de 24 cavidades a una densidad de 0,5 x 105 células por cavidad. El día siguiente, las células se ayunaron durante 1 hora en RPMI libre de suero. Luego se incubaron las células con o sin dosis diversas de anticuerpos neutralizadores contra el PRLR o anticuerpo control no específico en ausencia o presencia de prolactina humana 20 ng/ml durante 30 minutos. Luego se lavaron las células y se lisaron en 70 µ? de solución amortiguadora de lisis. Los lisados se centrifugaron y el sobrenadante se congeló a -80°C. Los extractos se analizaron usando transferencia Western (anticuerpo anti-pSTAT5A/B de Upstate 07-586, diluido 1 :1000). Como control de carga, las membranas libradas de anticuerpos se incubaron con anticuerpos anti-beta tubulina (ab7287, diluido 1 :500).

Los resultados se ¡lustran en la figura 7. Con excepción del anticuerpo no específico FITC, todos los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR bloquearon la fosforilación de STAT5 en células T47D de humano de forma dependiente de la dosis. Todos los anticuerpos ensayados se unieron al PRLR humano con alta afinidad.

Ejemplo 8 Inhibición de la actividad del gen reportero luciferasa en células HEK293 transfectadas de manera estable con el PRLR humano - análisis de anticuerpos neutralizadores contra el receptor de prolactina y anticuerpos no específicos control Para analizar adicionalmente la eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR, se usó un ensayo de gen reportero. Las células HEK293 transfectadas de manera estable con el PRLR humano se transfectaron transitoriamente con el gen reportero luciferasa bajo el control de LHRE (elementos de respuesta a hormona lactogénica), durante 7 horas. Luego, las células se sembraron a una densidad de 20000 células por cavidad en una placa de 96 cavidades (suero tratado con carbón 0,5%, D EM). El día siguiente se agregaron 300 ng/ml de prolactina humana con y sin dosis crecientes de anticuerpos neutralizadores contra el PRLR o anticuerpos control. 24 horas más tarde, se determinó luciferasa. Los resultados se describen en la fi-gura 8. En contraste con el anticuerpo no específico, 006-H08 y HE06.642 inhibieron la actividad luciferasa en células HEK293 transfectadas de manera estable con el PRLR humano. Ejemplo 9 Inhibición de la actividad del gen reportero luciferasa en células HEK293 transfectadas de manera estable con el PRLR murino - análisis de anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina y anticuerpos no específicos control Para analizar adicionalmente la eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR en el receptor de prolactina murino, se usó un ensayo de gen reportero. Las células HEK293 transfectadas de manera estable con el PRLR murino se transfectaron transitoriamente con un gen reportero luciferasa bajo el control de LHRE (elementos de respuesta a hormona lactogénica) durante 7 horas. Luego, las células se sembraron a una densidad de 20000 células por cavidad en una placa de 96 cavidades (suero tratado con carbón 0,5%, DMEM). El día siguiente se agregaron 200 ng/ml de prolactina humana con y sin dosis crecientes de anticuerpos neutralizadores contra el PRLR o anticuerpos control. 24 horas más tarde, se determinó la actividad luciferasa. Los resultados se describen en la figura 9. Mientras el anticuerpo 005-CÓ4 (triángulos cerrados) exhiben alta actividad (valor IC50 = 3 nM), el anticuerpo HE06.642 (círculos cerrados) no mostraron actividad hasta 330 nM. El anticuerpo control no específico (círculos abiertos) es completamente inactivo. En contraste al anticuerpo HE06.642 de Novartis, el anticuerpo 005-C04 tiene la capacidad de bloquear la señalización mediada por PRLR murino.

Ejemplo 10 Inhibición de la proliferación inducida con prolactina de células BaF3 (transfectadas de manera estable con el receptor de prolactina murino) por anticuerpos neutralizadores contra el receptor de prolactina v anticuerpos no específicos control Para analizar la eficacia in vitro de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR, se usó la inhibición de la proliferación celular actividad por prolactina de células Ba/F3. Las células se transfectaron de manera estable con el PRLR murino y se cultivaron de rutina en RPMI que contenía glutamina 2 mM en presencia de FCS 10% y 10 ng/ml de prolactina humana. Luego de seis horas de ayuno en medio libre de prolactina que contenía FCS 1%, las células se sembraron en placas de 96 cavidades a una densidad de 10000 células por cavidad. Las células se estimularon con prolactina 40 ng/ml y se coincubaron con dosis crecientes de anticuerpos neutralizadores contra el PRLR durante dos días. Se analizó la proliferación celular usando un Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega). Se generaron curvas dosis-respuesta para la inhibición del crecimiento celular estimulado por prolactina y se calcularon los valores de IC50. Como control negativo, se usó estimulación con un anticuerpo control no específico.

Las curvas dosis respuesta y valores de IC50 se describen en la figura 10. El anticuerpo control no específico (círculos cerrados) fue inactivo con el PRLR murino. Solamente hubo una inhibición limitada de la activación del PRLR murino por los anticuerpos HE06.642, 001-E06 y 001-D07. Solamente el anticuerpo 005-C04 bloqueó completamente la activación del PRLR murino.

Ejemplo 11 Efecto anticonceptivo de anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina lqG1 005-C04 en ratones Para ensayar la influencia de anticuerpos neutralizadores contra el receptor de prolactina en la fertilidad de ratones, se aparearon ratones hembra de 12 semanas de y ratones NMRI machos durante 7 días (entre día 0 y día 7). Los ratones hembra se trataron los días -3, 0, 3 y 6 con una inyección intraperitoneal de solución salina amortiguada con fosfato, del anticuerpo control no específico lgG1 (an-ti-FITC, 10 mg/kg) o del anticuerpo neutralizador lgG1 005-C04 (= lgG1 005-C04), en concentraciones de 10 ó 30 mg por kilo de peso corporal, disueltos en solución salina amortiguada con fosfato. Se usaron 10 hembras en cada grupo experimental. Cada macho se apareó con dos hembras, una de las hembras fue de un grupo control negativo tratado con solución salina amortiguada con fosfato o anticuerpo no específico, la otra hembra se trató con anticuerpo neutralizador específico. Los apareamientos, donde el macho no produjo al menos una hembra preñada, se excluyeron de la evaluación de los datos. Los parámetros leídos fueron tamaño promedio de carnada y tasa de preñez (medido en %) calculado como número de carnadas por grupo experimental dividido el número de carnadas posibles teóricas en ese grupo. Los resultados se describen en la figura 11.

En la figura 11A se ilustran las tasas de preñez obtenidas. A continuación se detallan las tasas de preñez. • 87,5% en el grupo de ratones tratados con solución salina amortiguada con fosfato, • 75% en el grupo de ratones tratados con el anticuerpo control no específico (10 mg/kg), • 100% en el grupo de ratones tratados con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG1 005-C04 (10 mg/kg), y • 0% en el grupo de ratones tratados con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG1 005-C04 (30 mg/kg).

En la figura 11 B se ilustran los tamaños de carnada observados para los distintos grupos experimentales. A continuación se detallan los tamaños de carnada. • 10,9 ratones por carnada en el grupo de ratones tratados con solución salina amortiguada con fosfato, • 12.3 ratones por carnada en el grupo de ratones tratados con el anticuerpo control no específico (10 mg/kg), • 13 ratones por carnada en el grupo de ratones tratados con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG1 005-C04 (10 mg/kg), y • 0 ratones por carnada en el grupo de ratones tratados con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG1 005-C04 (30 mg/kg).

Los resultados de este estudio de apareamiento permiten demostrar que el anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina lgG1-005-C04 previno completamente la preñez en ratones cuando se ensayó con 30 mg/kg de peso corporal.

Ejemplo 12 Aqrupamiento de epitopes Se realizaron experimentos de agrupamiento de epitopes usando Biacore por monitoreo simultáneo de unión de pares de anticuerpos anti-PRLR a ECD-PRLR (SEQ ID N° 70). Brevemente, el primer anticuerpo se inmovilizó covalentemente al chip sensor por medio de acoplamiento con amina primaria usando n-hidroxisucinamida (NHC) y N-etil-N'-dimetilaminopropilcarbo-diimida (EDC). Los sitios de unión no ocupados en la superficie luego se bloquearon con etanolamida. El ECD-PRLR soluble (SEQ ID N° 70) se capturó en la superficie por medio del anticuerpo inmovilizado, por lo tanto, el epitope del anticuerpo capturado se bloqueó para todas las moléculas de ECD-PRLR unidas. In-mediatamente se pasó un segundo anticuerpo sobre la superficie para unirse al ECD-PRLR inmovilizado. Dos anticuerpos que reconocen el mismo epitope o superpuesto no puede unirse al ECD-PRLR, mientras que anticuerpos con distintos epitopes tiene la capacidad de unirse. La superficie del anticuerpo se regeneró con glicina, pH 2,8, para eliminar proteínas unidas y luego se repitió el proceso con otros anticuerpos. Se ensayaron todas las combinaciones de anticuerpos. Los resultados representativos se detallan en la Tabla 7. Los anticuerpos 006-H08, 002-H06, 002-H08, 006-H07 y XHA06983 se unieron compe-titivamente uno con el otro en ECD-PRLR, indicando que tienen como blanco epitopes superpuestos (epitope grupo 1 , tabla 6). Además, los anticuerpos se unieron competitivamente a PRL, que también es el caso para 001-E06 (epitope grupo 2, ta-bla 6). Este anticuerpo tiene como blanco un sitio del ECD del PRLR diferente de los mencionados anteriormente. Finalmente, el anticuerpo 005-C04 se unió competitivamente a HE06.642 y XHA06.642 sin ser competitivo con PRL (epitope grupo 3, tabla 6).

Tabla 7. Grupos de anticuerpos que tienen como blanco epitopes superpuestos en el dominio extracelular (ECD) del receptor de prolactina humano (PRLR) Ejemplo 13 Reactividad transversal de anticuerpos en PRLR de ratón y de humano expresado en superficies celulares Con el objetivo de determinar las características de unión de los anticuerpos anti-PRLR en PRLR de ratón y de humano expresado en superficies celulares, se ensayó la unión por citometría de flujo en células HEK293 que expresaban de manera estable PRLR humano y murino, respectivamente. Las células así como la línea progenitora de células HEK293 sin PRLR se colectaron, se centrifugaron y se resuspendieron a aproximadamente 5x106 células/ml en 1xPBS que contenía FBS 2% y azida sódica 0, 1% (solución amortiguadora FACS). Los anticuerpos 005-C04, 001-E06 y HE06.642 se diluyeron a 2-veces la concentración final en solución amortiguadora FACS y se agregaron a las cavidades con las muestras apropiadas (50 µ?/cavidad). Para los controles de anticuerpo secundario y autofluorescencia, se agregaron 50 µ? de solución amortiguadora FACS a las cavidades apropiadas. Se agregaron 50 µ? de suspensión celular a cada cavidad con la muestra. Las muestras se incubaron a 4°C durante una hora, se lavaron dos veces con solución amortiguadora FACS y se resuspendieron en solución amortiguadora FACS que contenía IgG anti-humano de cabra conjugado con PE en una dilución 1 :100. Luego de 30 minutos de incubación a 4°C, las células se lavaron dos veces con solución amortiguadora FACS fría, se resuspendieron en solución amortiguadora FACS que contenía yoduro de propidio 1 mg/ml (Invitrogen, San Diego, CA) y se analizó por citometría de flujo. Como se ilustra en la figura 13, los anticuerpos 005-C04 y 001-E06 se unieron a PRLR humano y murino en estas células, mientras que HE06.642 solamente se unió al PRLR humano. Esta observación es consistente con el hallazgo informado en el ejemplo 9 sobre la eficacia perdida de HE06.642 en el ensayo de gen reportero luciferasa dependiente del PRLR murino. A pesar de que 005-C04 y HE06.642 se unieron competitivamente a PRLR humano, las distintas propiedades de unión de ambos anticuerpos con respecto al PRLR murino indica diferencias en sus especificidades por epitope.

Ejemplo 14 Actividad inhibitoria de anticuerpos Fab y scFv en cascadas de señalización celular Para caracterizar funcionalmente la actividad de Fab y scFv, se analizaron los resultados obtenidos con la cascada de señalización activada por el PRLR, la inhibición de la fosforilación del PRLR propiamente dicho y de los reguladores de la transcripción ERK1/2 y STAT5 en células T47D humanas tratadas con prolactina. Las células T47D se hicieron crecer en RPMI que contenía L-glutamina 2 mM, FBS 10% tratado con carbón e insulina-transferrina-selenio-A (Gibco). Las células se sembraron en placas de 6 cavidades o placas de 96 cavidades, en una densidad de 1 ,5 x 106 células por cavidad. El siguiente día, se renovó el medio de crecimiento. En el tercer día, las células se ayunaron durante 1 hora en RPMI libre de suero. Luego, las células se incubaron con y sin diversas dosis de anticuerpos neutralizadores contra el PRLR o anticuerpo control no específico en presencia de prolactina humana 500 ng/ml durante 5 min. Luego, las células se lavaron y se lisaron en solución amortiguadora de lisis. Los lisados se centrifugaron y los sobrenadantes se congelaron a -80°C. Se ensayaron las muestras mediante ELISA de acuerdo al conjunto de componentes DuoSet IC "Human Phospho-Prolactin R" (R&D Systems) para medida de fosforilación del PRLR, de acuerdo al conjunto de componentes PathScan Phospho-STAT5 (Tyr694) Sandwich ELISA (Cell Signaling Technology; #7113) para medida de fosforilación de STAT5 y de acuerdo al conjunto de componentes Phospho-ERK1/ERK2 (R&D Systems) para medida de fosforilación de ERK1/2. La Tabla 8 provee un resumen acerca de la actividad antagonista de una selección de los descubrimientos realizados mediante el análisis en el formato Fab o scFv, con una dosis fija de 7,5 pg por mi.

Tabla 8. Actividad antagonista de una selección de los descubrimientos realizados en el análisis de la fosforilación del PRLR, de ERK1/2 y de STAT5, según lo determinado por ELISA, sobre Usados celulares de la línea celular de cáncer de mama humano T47D * formato scFv, 0 formato Fab Ejemplo 15 La neutralización de los anticuerpos PRLR inhibe la lactancia en ratones Se aparearon hembras NMRI adultas con machos NMRI. En el día posparto 1 , se ajustó el tamaño de la cría a 8 ratones por madre en lactancia. Se determinó en forma diaria el peso de la descendencia en la mañana comenzando en el día posparto 1. Las madres en lactancia permanecieron ya sea sin tratamiento (círculos cerrados en la figura 14A.B) o bien se trataron por vía intraperitoneal con anticuerpo no específico (10 mg/kg de peso corporal; círculos abiertos en la figura 14A.B), o bien con anticuerpo neutralizador contra el PRLR 005-C04 conteniendo dominios constantes lgG2a murinos (= lgG2a 005-C04; 10 mg/kg, triángulos cerrados en la figura 14A, B) o con anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG2a 005-C04 (30 mg/kg, triángulos abiertos en la figura 14A, B). El tamaño de grupo fue de entre 5 y 6 madres en lactancia por grupo experimental. Se trataron las madres con anticuerpos control específicos o no específicos en el día posparto 1 , 3, 6, 9, 10 y 12 (indicado con flechas en la figura 14A, B). Los resultados se exhiben en la figura 14. En la figura 14A se ilustra, para cada día posparto, la ganancia de peso de cría por día expresada como porcentaje del respectivo peso de cría en el día 1. Desde el día posparto 8 hacia adelante, existe una diferencia significativa en la ganancia de peso de cría entre la descendencia de madres tratados con anticuerpos neutralizadores contra el PRLR y la descendencia de las madres que permanecieron sin tratar o que recibieron anticuerpos no específicos control. Debido a razones de etnia, tuvieron que matarse varias crías en el día posparto 10 en el grupo experimental de las madres que recibieron la dosis más alta del anticuerpo neutralizador contra el PRLR. En la figura 14B, se exhiben los resultados de una forma diferente. Se ilustra la ganancia de peso diferencial de cría día a día y se expresa como porcentaje del peso de la cría del día posparto 1. Básicamente, en la figura 14B se ¡lustra la pendiente de los gráficos que se proveen en la figura 14A. El incremento diario diferencial del peso de la cría oscila alrededor de 30% del peso de cría inicial en el día posparto 1 , para las crías de madres sin tratar o madres tratadas con el anticuerpo no específico. Existe una reducción severa significativa en el incremento de peso de cría diario en las crías de las madres tratadas con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR a 30 mg/kg de peso corporal a partir de día 7 hacia adelante (*p<0,05; ***p<0,005 vs. crías de madres tratadas con anticuerpo no específico). Comenzando el día posparto 1 1 hacia adelante, el incremento de peso de cría diario disminuye también significativamente en las crías de madres tratadas con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR a 10 mg/kg en comparación con las crías de madres tratadas con anticuerpos no específicos control (p<0,05 vs. crías de madres tratadas con anticuerpo no específico). En conclusión, existen efectos dependientes de la dosis del anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG2a 005-C04 sobre la inhibición de la lactancia. En la figura 14C se ilustran secciones histológicas de las glándulas mamarias de madres en lactancia de los distintos grupos experimentales. Las glándulas mamarías de madres no tratadas y madres tratadas con anticuerpos no específicos control están llenas de conductos que producen leche. En contraste, existen signos de involución de las glándulas mamarias en las madres tratadas con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG2a 005-C04. Las flechas negras en la figura 14C apuntan a islas grasas en el tejido de las glándulas mamarias (véase efecto dependiente de la dosis del anticuerpo especifico lgG2a 005-C04 sobre la extensión de la involución de glándulas mamarias (figura 14C)). Además, se analizó la expresión de las siguientes proteínas mayoritarias de la leche: la beta-caseína (Csn-2), la proteína ácida del suero (WAP) e IGF-1 , en las glándulas mamarias de madres de los distintos grupos experimentales (figura 14D). Se normalizó la expresión génica a la de la proteína de unión a TATA-box (TBP). El anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG2a 005-C04 disminuyó, en forma dependiente de la dosis, la expresión de las proteínas de leche mientras que el anticuerpo no específico (10 mg/kg) estuvo sin ningún efecto significativo.

El anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG2a 005-C04 bloqueó en forma dependiente de la dosis la lactancia y condujo a involución de glándulas mamarias en ratones en lactancia, con lo que se demuestra su utilidad para la inhibición de la lactancia.

Ejemplo 16 Los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR son apropiados para el tratamiento de enfermedad de mama benigna Una mutación de activación del PRLR o hiperprolactinemia local o sistémica puede provocar enfermedad benigna de mama. Por lo tanto, se empleó un modelo de ratón hiperprolactinémico para inducir proliferación incrementada de la gandula mamaria (marca distintiva de las formas más severas de enfermedad benigna de mama). En el día 0, ratones hembra Balb/c de 12 semanas de edad recibieron un isoinjerto de pituitaria bajo la cápsula renal o permanecieron sin operar. Los ratones con isoinjerto de pituitaria permanecieron sin tratar o se trataron por vía intraperitoneal con el anticuerpo no específico (10 mg/kg), con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR 005-C04 en el formato de la lgG1 (= lgG1 005-C04; 10 mg/kg) o con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG1 005-C04 (30 mg/kg) en los días 0, 3, 7, 11 y 15. El tamaño del grupo experimental fue de entre 8 y 10 animales. En el día 17 después del trasplante de pituitaria se sacrificaron los ratones. Dos horas antes de la muerte, los animales recibieron una inyección intraperitoneal de BrdU para monitorear la proliferación de células epiteliales. Se fijó la glándula mamaria inguinal izquierda en solución de Carnoy y se prepararon montajes de completos de glándula mamaria y se tiñeron con Carmine alaune (figura 15A). Se fijó la glándula mamaria inguinal derecha en formalina amortiguada con fosfato al 4% durante una noche. Las glándulas mamarias se embebieron subsiguientemente en parafina y se llevaron a cabo inmunotinciones con BrdU como se describió previamente (Endocrinology 149(8):3952-3959;2009). Además, se llevó a cabo una inmunocoloración para pSTAT5 (anticuerpo anti-pSTAT5 de abcam, ab32364, diluido 1 :60) para monitorear la inhibición de la señalización mediada por PRLR en respuesta al tratamiento con anticuerpos neutralizadores contra el PRLR. En la figura 15A se proveen fotografías ampliadas de montajes completos de las glándulas mamarias de los distintos grupos experimentales. La glándulas mamarias de animales adultos que no recibieron una pituitaria presentan conductos y brotes terminales, mientras que existe ramificación lateral extrema y formación de estructuras alveolares en los ratones que recibieron un isoinjerto de pituitaria. El tratamiento con el anticuerpo no específico (10 mg/kg) no inhibió la ramificación lateral y la formación de estructuras alveolares. Por el contrario, el tratamiento con el anticuerpo neutralizador lgG1 005-C04 a 10 mg/kg de peso corporal conduce a una inhibición completa de la ramificación lateral en 8 de los 10 animales que recibieron un isoinjerto de pituitaria y el tratamiento con lgG1 005-C04 a 30 mg/kg inhibe completamente la ramificación lateral en 9 de los 9 animales que recibieron un isoinjerto de pituitaria. En la figura 15B se ilustra un análisis histológico y una inmunocoloración con BrdU. El isoinjerto de pituitaria conduce a hiperplasia epitelial que no se inhibe mediante tratamiento con el anticuerpo no específico, mientras que no hay hiperplasia epitelial en los ratones que portan un isoinjerto de pituitaria y que se trataron con el anticuerpo neutralizador contra el PRLR con una dosis de 10 ó 30 mg/kg de peso corporal. Algunas de las células positivas a BrdU, que reflejan células en fase S del ciclo celular que se están por dividir, están indicadas mediante flechas blancas en la figura 15B. Los ratones tratados con el anticuerpo neutralizador lgG1 005-C04 (30 mg/kg de peso corporal) mostraron inhibición casi completa de la proliferación celular epitelial en las glándulas mamarias. Algunas de las células positivas para fosfo-STAT5 se Indican mediante flechas blancas en la figura 15C. El tratamiento con 30 mg/kg de lgG1 005-C04 conduce a una inhibición completa de la fosforilación de STAT5, lo que indica un bloqueo completo de la señalización mediada por PRLR.

Los resultados de la figura 15A, B y C demostraron que los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR son apropiados para el tratamiento de mastopatía, una enfermedad proliferativa benigna de la glándula mamaria. Los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR inhiben la proliferación de células epiteliales mamarias y la activación de fosfo-STAT5.

Ejemplo 17 Tratamiento de hiperplasia prostética benigna con anticuerpos neutralizadores contra el PRLR Se estableció una hiperplasia prostética benigna en ratones Balb/c macho mediante injerto de dos pituitarias debajo de la cápsula renal a la edad de 8 semanas. Un grupo control permaneció sin operar. Los ratones que recibieron isoinjerto de pituitarias permanecieron sin tratar o recibieron inyecciones intraperitoneales de ya sea un anticuerpo no específico (10 mg/kg), o bien del anticuerpo neutralizador contra el PRLR 005-C04 con dominios constantes de lgG2a murina (= lgG2a 005-C04) a dosis de 10 y 30 mg/kg de peso corporal. Las inyecciones del anticuerpo se llevaron a cabo a partir del día del trasplante de pituitaria (= día 0), así como el día 3, el día 7, el día 11 , el día 15, el día 18, el día 22 y el día 25 después del trasplante de pituitaria. Se sacrificaron los ratones en el día 28. Se determinó el peso relativo de la próstata ventral. Los resultados se ilustran en la figura 16. El isoinjerto de pituitaria resultó en un incremento del peso de próstata relativo. El tratamiento con 10 mg/kg y 30 mg/kg de anticuerpo neutralizador contra el PRLR lgG2a 005-C04 redujo el peso de la próstata mientras que el tratamiento con anticuerpo control no específico no tuvo ningún efecto. Los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR son por lo tanto apropiados para el tratamiento de hiperplasia prostética benigna.

En el día 18 después del isoinjerto de pituitaria se hizo evidente que disminuyó el crecimiento de cabello en los animales que recibieron el isoinjerto de pituitarias. Los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR estimularon el crecimiento de cabello bajo las condiciones de hiperprolactinemia. En la figura 17 se proveen fotografías representativas. Por lo tanto los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR pueden usarse para el tratamiento de pérdida de cabello por hiperprolactinemia.

Ejemplo 18 Efecto de anticuerpos neutralizadores contra el PRLR sobre el crecimiento del cabello Se sacó cabello dorsal de ratones C57BL/6 machos y hembras de 8 semanas de edad usando afeitadoras eléctricas como se describió previamente (British Journal of Dermatology 2008; 159:300-305). Se indujo hiperprolactinemia en algunos grupos mediante isoinjerto de pituitaria bajo la cápsula renal, los animales de los grupos restantes fueron normoprolactinémicos. Se trataron los animales con anticuerpos PRLR específicos (lgG2a 005-C04) o anticuerpos no específicos control (30 mg/kg, por vía ¡ntraperitoneal) una vez por semana (comenzando en el día 0 que es el día del isoinjerto de pituitaria). Se llevaron a cabo subsiguientes inyecciones de anticuerpo en los días 7 y 14. Después de tres semanas, se observó el recrecimiento de cabello como manchas oscuras sobre la piel afeitada, de color rosa blanquecino, y se midió el porcentaje de área afeitada que se volvió oscura. Los rato-nes hembra se sacrificaron 15 días después de afeitar y los ratones macho se sacrificaron 18 días después de afeitar.

Se usaron los siguientes grupos experimentales (el tamaño de grupo fue de 6 ratones): 1. hembras afeitadas; 2. hembras afeitadas con isoinjerto de pituitaria; 3. hembras afeitadas con isoinjerto de pituitaria + 30 mg/kg del anticuerpo no específico lgG2a 005-C04 una vez por semana; 4. hembras afeitadas con isoinjerto de pituitaria + 30 mg/kg de anticuerpo específico una vez por semana; 5. hembras afeitadas + 30 mg/kg del anticuerpo no específico una vez por semana; 6. hembras afeitadas + 30 mg/kg de anticuerpo específico una vez por semana; 7. machos afeitados; 8. machos afeitados con isoinjerto de pituitaria; 9. machos afeitados con isoinjerto de pituitaria + 30 mg/kg del anticuerpo no específico una vez por semana; 10. machos afeitados con isoinjerto de pituitaria + 30 mg/kg de anticuerpo específico lgG2a 005-C04 una vez por semana; 11. machos afeitados + 30 mg/kg del anticuerpo no específico una vez por semana; 12. machos afeitados + 30 mg/kg de anticuerpo específico una vez por semana.

En la figura 18 se proveen fotografías representativas de animales de los distintos grupos, se indica el porcentaje de área de recrecimiento con cabello en la figura 18.

Los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR, pero no los anticuerpos no específicos, estimulan el recrecimiento del cabello bajo condiciones de hiper y normoprolactinemia en ratones macho y hembra. Los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR son por lo tanto apropiados para tratar la caída de cabello en mujeres y hombres bajo condiciones de hiper y normoprolactinemia.

Ejemplo 19 Inhibición de la proliferación incrementada de las células epiteliales mamarias mediante anticuerpos neutralizadores contra el PRLR Para ensayar el efecto de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR sobre la proliferación incrementada de las células epiteliales mamarias activadas por terapia hormonal combinada (o sea terapia de estrógeno más progestina) se empleó un modelo de ratón descrito previamente que permitió la cuantificación de efectos proliferativos en el útero y en la glándula mamarla (Endocrinology 149:3952-3959,2008). Se sacaron los ovarios de ratones C57BL 6 de 6 semanas de edad. 2 semanas después de la ovariectomía, se trató a los animales por vía subcutánea con inyecciones diarias ya sea de vehículo (etanol/araquisoil 10%/90%) o 100 ng de estradiol más 100 mg/kg de progesterona durante dos semanas. Se trataron los animales una vez por semana con inyecciones intraperitoneales de anticuerpos neutralizadores contra el PRLR (10 mg/kg y 30 mg/kg) en formato de lgG2a murino o anticuerpo no específico (30 mg/kg) durante tres semanas. Se llevó a cabo una autopsia en el día 36 después de la ovariectomía. Dos horas antes de la muerte los animales recibieron una inyección intraperitoneal de bromodeoxiuridina (BrdU) disuelta en solución salina amortiguada con fosfato (70 mg/kg de peso corporal). Se analizaron los 2/3 proximales de la glándula mamaria inguinal derecha para proliferación de células epiteliales mamarias (inmunocoloración para BrdU) como se describió previamente (Endocrinology 149:3952-3959,2008).

El experimento comprendió los siguientes grupos: 1. animales ovariectomizados tratados con vehículo; 2. animales ovariectomizados tratados con 100 ng de estradiol; 3. animales ovariectomizados tratados con 100 ng de estradiol (E) y 100 mg/kg de progesterona (P); 4. animales ovariectomizados tratados con E + P y 10 mg/kg de anticuerpo específico 005-C04; 5. animales ovariectomizados tratados con E + P y 30 mg/kg de anticuerpo específico 005-C04; 6. animales ovariectomizados tratados con E2 + P y 30 mg/kg de anticuerpo control no específico.

Los resultados se ilustran en la figura 19. Se evaluó el número absoluto de células epiteliales de los conductos en proliferación dentro de 4 secciones transversales de la glándula mamaria. Las medianas se presentan como barras horizontales. La proliferación de células epiteliales en ratones ovariectomizados, tratados con vehículo es más bien baja. El tratamiento con conduce a alguna estimulación de la proliferación celular epitelial, la proliferación máxima de células epiteliales mamarias se observa bajo tratamiento con estrógeno y progesterona (figura 19). El tratamiento con anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina 005-C04, pero no con anticuerpo control no específico, conduce a una disminución dependiente de la dosis de la proliferación de células epiteliales mamarias casi de regreso a los niveles conseguidos con estradiol solo.

Por consiguiente, los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR son apropiados para tratar la proliferación incrementada de las células epiteliales mamarias bajo una terapia hormonal combinada, es decir, con un tratamiento con estradiol y progesterona.

Ejemplo 20 Tratamiento de la adenomiosis uteri (= endometriosis interna) en ratones SHN con anticuerpos neutralizadores contra el PRLR Para ensayar la eficacia de los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR en la endometriosis, se empleó el modelo de adenomiosis uteri en ratones SHN que depende de hiperprolactinemia sistémica (Acta anat. 116:46-54,1983). Se indujo hiperprolactinemia en ratones SHN me-diante isoinjerto de pituitaria bajo la cápsula renal de ratones hembra de 7 semanas de edad (Acta anat. 116:46-54,1983). Se administraron anticuerpos neutralizadores contra el PRLR (10 mg/kg o 30 mg/kg) o anticuerpos no específicos (30 mg/kg) por vía intraperitoneal co-menzando una semana después del isoinjerto de pituitaria. Se evaluó el infiltrado de la capa muscular uterina con tejido glandular como se describió previamente (Labo-ratory Animal Science 1998,48:64-68). El tratamiento con los anticuerpos se llevó a cabo durante 9 semanas una vez y dos veces por semana mediante inyecciones intraperitoneales. En la autopsia (día 70 después del trasplante de pituitaria), se fijó el útero durante una noche en formalina al 4% amortiguada y se embebió en parafina. El grado de adenomiosis (=endometriosis interna) se evaluó como sigue: Grado 0 = sin adenomiosis; Grado 0,5 la capa interna del miometrio pierde su orientación concéntrica; Grado 1 = glándulas endometriales invaden la capa interna del miometrio; Grado 2 = glándulas endometriales entre la capa interna y externa del miometrio uterino; Grado 3 = glándulas endometriales invaden la capa externa del miometrio uterino; Grado 4 = glándulas endometriales fuera de la capa externa del miometrio uterino.

El experimento comprendió los siguientes grupos experimentales: 1. animales sin trasplante de pituitaria, es decir, ratones normoprolactinémicos; 2. animales con trasplante de pituitaria, es decir, ratones hiperprolactinémicos; 3. animales con trasplante de pituitaria, tratados con el anticuerpo control no específico una vez por semana en una dosis de 30 mg/kg; 4. animales con trasplante de pituitaria, tratados con el anticuerpo control no específico dos veces por semana en una dosis de 30 mg/kg; 5. animales con trasplante de pituitaria, tratados con el anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina 005-C04 en formato lgG2a murino una vez por semana en una dosis de 10 mg/kg; 6. animales con trasplante de pituitaria, tratados con el anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina 005-C04 en formato lgG2a murino dos veces por semana en una dosis de 10 mg/kg; 7. animales con trasplante de pituitaria, tratados con el anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina 005-C04 en formato lgG2a murino una vez por semana en una dosis de 30 mg/kg; 8. animales con trasplante de pituitaria, tratados con el anticuerpo neutralizador contra el receptor de prolactina 005-C04 en formato lgG2a murino dos veces por semana en una dosis de 30 mg/kg.

Los resultados se ilustran en la figura 20. Las puntuaciones para cada animal en cada grupo de tratamiento se dan en forma individual y las medianas para cada grupo de tratamiento se presentan como barras horizontales. Los ratones normoprolactinémicos desa-rrollan endometriosis interna en algún grado (puntuación de enfermedad media = 0,25). La hiperprolactinemia debida a isoinjerto de pituitaria aumenta la puntuación de enfermedad y más animales sufren de la enfermedad (puntuación de enfermedad media = 2,5). Mientras que el tratamiento con 30 mg/kg del anticuerpo no específico una vez o dos veces por semana no tuvo influencia sobre la enfermedad, el tratamiento con anticuerpos neutralizadores específicos da como resultado una disminución dependiente de la dosis en la puntuación de enfermedad. Notablemente, todos los animales que recibieron ya sea 10 o bien 30 mg/kg de anticuerpo específico dos veces por semana se curaron completamente y su puntuación de enfermedad fue significativamente menor que la puntuación de enfermedad de los ratones normoprolactinémicos (figura 20). Por lo tanto, los anticuerpos neutralizadores contra el PRLR son apropiados para tratar endometriosis interna (= adenomiosis uteri) y endometriosis externa en la mujer.

Ejemplo 21 Maduración de variantes de los anticuerpos La maduración de la afinidad de los anticuerpos en un proceso de dos pasos donde se combina una mutagénesis por saturación y un análisis de alto rendimiento a base de cavidades para identificar un pequeño número de mutaciones que resultan en incrementos de afinidad. En la primera ronda de maduración de afinidad se introduce una diversificación posicional del anticuerpo de tipo salvaje mediante mutagénesis dirigida a sitio usando casetes NNK-trinucleótido (en donde N representa una mezcla al 25% de cada uno de los nucleótidos adenina, timina, guanina y citosina y K representa una mezcla al 50% de cada uno de los nucleótidos timina y guanina) de acuerdo a BMC Biotechnology 7:65, 2007. De esta forma, se introducen todos los 20 aminoácidos en una posición aminoacídica individual. Esta aleatorización posicional se restringe a las seis regiones determinantes de complementaridad (CDRs). En una segunda ronda de maduración de afinidad, se recombinaron las sustituciones beneficiosas y se cribaron para mejoras adicionales.

Análisis de variantes de 006-H08 Fab maduras mediante ensayo de fluorescencia de resolución temporal homogéneo (HTRF) Se incubaron sobrenadantes derivados de E. coli normalizados y dominio extracelular biotinilado del PRLR 8 nM, junto con estreptavidina-europio 1 nM, en una placa de microtitulación de 96 cavidades durante 30 minutos. Luego, se agregaron KF a 200 niM e lgG1 de 006-H08 marcado con Alexa Fluor 647 a 50 nM. Esta mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5, 20, 35, 50 y 65 minutos, respectivamente. En los puntos de tiempo indicados, se midió la absorción a 665 nm (y 620 nm) usando un EnVision MultilabeIReader (Perkin Elmer). Los resultados obtenidos se ilustran en la figura 21.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo 006-H08 o variantes maduras definidas del mismo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que antagoniza la señalización mediada por el receptor de prolactina y que se une a los epitopes del dominio extracelular del receptor de prolactina y de las variantes polimórficas humanas de éste, donde la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del receptor de prolactina corresponde a SEQ ID N° 70 y la secuencia del ácido nucleico corresponde a SEQ ID N° 71.

2. El anticuerpo 006-H08 o el fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 , que comprende las CDR del anticuerpo de las reivindicaciones 1 , en donde a. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 29, o b. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 78, 24 y 90, o c. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 75 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 82, 24 y 91 , o d. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 82, 24 y 29, o e. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 86, 24 y 29, o f. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 87, 24 y 100, o g. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 87, 24 y 92, o h. la cadena pesada vanable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 89, 24 y 93, o i. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 79, 24 y 101 , 0 j. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 76 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 89, 24 y 90, o k. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 100, o I. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 97, o m. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 98, o n. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 83, 24 y 99, o o. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 96, o p. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 94, o q. la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 88, 24 y 90, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 74 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 81 , 24 y 95, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 75 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 29, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 77 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 18, 24 y 29, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 80, 24 y 29, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 85, 24 y 29, o la cadena pesada variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 1 , 7 y 13 y la cadena liviana variable contiene las secuencias de las CDR que corresponden a SEQ ID N° 84, 24 y 29.

3. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 , en donde el anticuerpo 006-H08 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 46 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 34, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 52 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 40, 006-H08-12-2 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 331 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 353, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 165 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 143, 006-H08-13-2 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 332 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 354, asi como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 166 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 144, 006-H08-13-6-1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 333 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 355, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 167 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 145, 006-H08-14-6-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 334 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 356, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 168 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 146, 006-H08-15-5 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 335 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 357, asi como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 169 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 147, 006-H08-19-1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 336 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 358, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 170 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 148, 006-H08-29-1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 337 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 359, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 171 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 149, 006-H08-32-2 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 338 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 360, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 172 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 150, j. 006-H08-33-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 339 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 361 , así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 173 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 151 , k. 0?6-?08-33-16-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 340 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 362, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 174 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 152, I. 006-H08-35-17-1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 341 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 363, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 175 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 153, m. 006-H08-35-17-4 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 342 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 364, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 176 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 154, n. 006-H08-35-1 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 343 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 365, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 177 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 155, o. 006-H08-36-17-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 344 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 366, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 178 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 156, p. 006-H08-37-19-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 345 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 367, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 179 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 157, 006-H08-39-7 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 346 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 368, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 180 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 158, 006-H08-48-5 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 347 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 369, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 181 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 159, 0?6-?08-53-27-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 348 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 370, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 182 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 160, 006-H08-59-30-0 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 349 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 371 , así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 183 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 161 , 006-H08-63-32-4 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 350 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 372, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 184 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 162, 006-H08-65-33-2 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 351 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 373, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 185 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 163, w. 006-H08-68-35-2 comprende un dominio variable de la cadena pesada que corresponde a una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 352 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 374, así como un dominio variable de la cadena liviana con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 186 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 164.

4. Un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo consiste en una región de unión al antígeno que se une específicamente a una o más regiones del PRLR o que presenta una afinidad elevada por ellas, cuya secuencia de aminoácidos se ilustra en SEQ ID N° 70 y en las variantes polimórficas humanas de SEQ ID N° 70, en los aminoácidos entre las posiciones 1 y 210, donde la afinidad es de al menos 100 nM, preferiblemente menor que aproximadamente 100 nM, más preferiblemente menor que aproximadamente 30 nM, aun más preferiblemente menor que aproximadamente 10 nM o aun más preferiblemente menor que 1 nM.

5. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la región pesada constante es una lgG1 , una lgG2, una lgG3 o una lgG4 modificada o no modificada.

6. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Una secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 6, en donde las secuencias de ácidos nucleicos son acordes con las de la tabla 5.

8. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de las reivindicaciones 6 y 7.

9. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 8 o una molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 6 y 7, donde la célula huésped puede ser una célula huésped eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula huésped eucariota inferior, tal como una célula de levadura, y también puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana.

10. Un método para usar la célula huésped de la reivindicación 9 en la producción de un anticuerpo o de un fragmento de unión al antígeno, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación bajo condiciones apropiadas y recuperar dicho anticuerpo.

11. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno que han sido producidos con el método de la reivindicación 10.

12. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que han sido purificados hasta alcanzar una homogeneidad de al menos 95% en peso.

13. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, que tienen utilidad como medicamentos.

14. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, que comprende excipientes y auxiliares.

15. Conjuntos de elementos que comprenden un anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 5, que comprenden una cantidad eficaz para el uso terapéutico del anticuerpo 006-H08 o de variantes maduras de éste envasada en un recipiente, donde dichos conjuntos de elementos opcionalmente contienen un segundo agente terapéutico y también comprenden un instructivo adjunto o envasado en el recipiente, en el cual se describen los contenidos del recipiente y se proveen indicaciones y/o instrucciones relacionadas con el uso de los contenidos del recipiente para tratar la endometriosis, la adenomiosis, la enfermedad mamaria benigna y la mastalgia, la inhibición de la lactancia, la pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica, la hiperplasia prostática benigna y los fibroides, o para usarlos en la antinconcepción femenina no hormonal o en el tratamiento de mujeres que están siendo sometidas a terapias hormonales combinadas (es decir, terapias con estrógeno y progestina), con el fin de inhibir la proliferación de las células del epitelio mamario.

16. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 a 5, para el tratamiento y/o la prevención de la endometriosis y de la adenomiosis (endometriosis interna).

17. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, para la anticoncepción femenina.

18. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, para el tratamiento de la enfermedad mamaria benigna y de la mastalgia.

19. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, para la inhibición de la lactancia.

20. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, para el tratamiento de la hiperplasia prostética benigna.

21. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, para el tratamiento de la pérdida de cabello hiper y normoprolactinémica.

22. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antí-geno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, para el tratamiento de mujeres que reciben una terapia hormonal combinada.

23. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, que tienen utilidad en el tratamiento de mujeres que reciben una terapia hormonal combinada, en donde la terapia hormonal combinada es una terapia con estrógeno y progestina.

24. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende anticuerpos contra el PRLR o fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en una administración parenteral, donde los métodos para efectuar la administración parenteral incluyen la administración tópica, intraarterial, intramuscular, subcutánea, ¡ntramedular, intratecal, ¡ntraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina, vaginal o intranasal.

25. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende anticuerpos contra el PRLR o fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con las reivin-dicaciones 1 a 5, en combinación con al menos un agente adicional.