JP2015180690A - 中和プロラクチン受容体抗体およびそれらの治療的使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の目的は、プロラクチン受容体抗体006-H08に関し、プロラクチン受容体に特異的に結合してそれを中和する組換え抗原結合領域および抗体ならびにそのような抗原結合領域を含有する機能的フラグメントによって達成される。
【選択図】なし
Description
PRLR媒介シグナリングの完全な妨害は、現時点では、可能でない。PRLR媒介シグナリングを妨害する唯一の方法は、ブロモクリプチンや他のドーパミン受容体2アゴニストの使用による下垂体PRL分泌の阻害である(Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism 2(10): 571-581, 2006)。しかしこれらの薬剤は、下垂体PRL合成の阻害をうまく補償してほとんど損なわれていないPRLR媒介シグナリングをもたらすことができる下垂体外PRL合成を抑制しない(Endocrine Reviews 19:225-268,1998)。それゆえに、プロラクチンは乳がんまたは全身性狼蒼もしくは関節リウマチなどの自己免疫疾患と関連づけられているとはいえ、ドーパミン2型受容体アゴニストがこれらの疾患を患っている患者において有益でなかったことは、驚くにはあたらない(Breast Cancer Res. Treat. 14:289-29, 1989;Lupus 7:414-419, 1998)。乳癌または自己免疫疾患においてそれぞれ中枢的な役割を果たす乳がん細胞またはリンパ球における局所的プロラクチン合成は、ドーパミン受容体アゴニストによってはブロックされなかった。
ウトとして使用した(実施例7、図7)。予想どおり、非特異的抗体は、分析した全ての実験パラダイムにおいて不活性であった。
a.可変重鎖および軽鎖領域のアミノ酸配列が、可変重鎖ドメインについては配列番号34と、可変軽鎖ドメインについては配列番号40と、少なくとも60%、より好ましくは70%、より好ましくは80%、または90%、さらに好ましくは95%同一であるか、または、
b.抗体006-H08の成熟形態については、可変重鎖および軽鎖ドメインのアミノ酸配列は、それらと少なくとも60%、より好ましくは70%、より好ましくは80%、もしくは90%、または、さらに好ましくは95%同一であるか、または
c.CDRのアミノ酸配列は、重鎖ドメインについては配列番号1、7、および13と、および可変軽鎖ドメインについては配列番号18、24、および29と少なくとも60%、より好ましくは70%、より好ましくは80%、より好ましくは 90%、または、さらに好ましくは95%同一である。
a.可変重鎖は、配列番号1、7および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24、および29に対応するCDR配列を含有する、
b.可変重鎖は、配列番号1、74、13に対応する CDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号78、24、90に対応するCDR配列を含有するか、または、
c.可変重鎖は、配列番号1、75、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号82、24、91に対応するCDR配列を含有するか、または、
d.可変重鎖は、配列番号1、7、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号82、24、29に対応するCDR配列を含有するか、または、
e.可変重鎖は、配列番号1、7、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号86、24、29に対応するCDR配列を含有するか、または、
f.可変重鎖は、配列番号1、74、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号87、24、100に対応するCDR配列を含有するか、または、
g.可変重鎖は、配列番号1、74、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号87、24、92に対応するCDR配列を含有するか、または、
h.可変重鎖は、配列番号1、74、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号89、24、93に対応するCDR配列を含有するか、または、
i.可変重鎖は、配列番号1、74、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号79、24、101に対応するCDR配列を含有するか、または、
j.可変重鎖は、配列番号1、76、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号89、24、90に対応するCDR配列を含有するか、または、
k.可変重鎖は、配列番号1、7、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24、100に対応するCDR配列を含有するか、または、
l.可変重鎖は、配列番号1、7、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24、97に対応するCDR配列を含有するか、または、
m.可変重鎖は、配列番号1、7、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24、98に対応するCDR配列を含有するか、または、
n.可変重鎖は、配列番号1、74、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号83、24、99に対応するCDR配列を含有するか、または、
o.可変重鎖は、配列番号1、7、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24、96に対応するCDR配列を含有するか、または、
p.可変重鎖は、配列番号1、7、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24、94に対応するCDR配列を含有するか、または、
q.可変重鎖は、配列番号1、74、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号88、24、90に対応するCDR配列を含有するか、または、
r.可変重鎖は、配列番号1、74、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号81、24、95に対応するCDR配列を含有するか、または、
s.可変重鎖は、配列番号1、75、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24、29に対応するCDR配列を含有するか、または、
t.可変重鎖は、配列番号1、77、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24、29に対応するCDR配列を含有するか、または、
u.可変重鎖は、配列番号1、7、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号80、24、29に対応するCDR配列を含有するか、または、
v.可変重鎖は、配列番号1、7、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号85、24、29に対応するCDR配列を含有するか、または、
w.可変重鎖は、配列番号1、7、13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号84、24、29に対応するCDR配列を含有する。
a.006-H08は、配列番号46に記載の核酸配列、および配列番号34に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号52に記載の核酸配列、および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
b.006-H08-12-2は、配列番号 331に記載の核酸配列、および配列番号353に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号165に記載の核酸配列、および配列番号143に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
c.006-H08-13-2は、配列番号 332に記載の核酸配列、および配列番号354に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号166に記載の核酸配列、および配列番号144に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
d.006-H08-13-6-1は、配列番号 333に記載の核酸配列、および配列番号355に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号167に記載の核酸配列、および配列番号145に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
e.006-H08-14-6-0は、配列番号 334に記載の核酸配列、および配列番号356に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号168に記載の核酸配列、および配列番号146に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
f.006-H08-15-5は、配列番号 335に記載の核酸配列、および配列番号357に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号169に記載の核酸配列、および配列番号147に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
g.006-H08-19-1は、配列番号 336に記載の核酸配列、および配列番号358に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号170に記載の核酸配列、および配列番号148に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
h.006-H08-29-1は、配列番号 337に記載の核酸配列、および配列番号359に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号171に記載の核酸配列、および配列番号149に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
i.006-H08-32-2は、配列番号 338に記載の核酸配列、および配列番号360に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号172に記載の核酸配列、および配列番号150に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
j.006-H08-33-0は、配列番号 339に記載の核酸配列、および配列番号361に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号173に記載の核酸配列、および配列番号151に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
k.006-H08-33-16-0は、配列番号 340に記載の核酸配列、および配列番号362に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号174に記載の核酸配列、および配列番号152に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
l.006-H08-35-17-1は、配列番号 341に記載の核酸配列、および配列番号363に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号175に記載の核酸配列、および配列番号153に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
m.006-H08-35-17-4は、配列番号 342に記載の核酸配列、および配列番号364に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号176に記載の核酸配列、および配列番号154に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
n.006-H08-35-1は、配列番号 343に記載の核酸配列、および配列番号365に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号177に記載の核酸配列、および配列番号155に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
o.006-H08-36-17-0は、配列番号 344に記載の核酸配列、および配列番号366に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号178に記載の核酸配列、および配列番号156に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
p.006-H08-37-19-0は、配列番号 345に記載の核酸配列、および配列番号367に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号179に記載の核酸配列、および配列番号157に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
q.006-H08-39-7は、配列番号 346に記載の核酸配列、および配列番号368に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号180に記載の核酸配列、および配列番号158に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
r.006-H08-48-5は、配列番号 347に記載の核酸配列、および配列番号369に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号181に記載の核酸配列、および配列番号159に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
s.006-H08-53-27-0は、配列番号 348に記載の核酸配列、および配列番号370に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号182に記載の核酸配列、および配列番号160に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
t.006-H08-59-30-0は、配列番号 349に記載の核酸配列、および配列番号371に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号183に記載の核酸配列、および配列番号161に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
u.006-H08-63-32-4は、配列番号 350に記載の核酸配列、および配列番号372に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号184に記載の核酸配列、および配列番号162に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
v.006-H08-65-33-2は、配列番号 351に記載の核酸配列、および配列番号373に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドイン、ならびに配列番号185に記載の核酸配列、および配列番号163に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含み、
w.006-H08-68-35-2は、配列番号 352に記載の核酸配列、および配列番号374に記載のアミノ酸配列に対応する可変重鎖ドメイン、ならびに配列番号186に記載の核酸配列、および配列番号164に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む。
a.該抗体は、配列番号1、7、13、18、24、29に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
b.該抗体は、配列番号1、74、13、78、24、90に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
c.該抗体は、配列番号1、75、13、82、24、91に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
d.該抗体は、配列番号1、7、13、82、24、29に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
e.該抗体は、配列番号1、7、13、86、24、29に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
f.該抗体は、配列番号1、74、13、87、24、100に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
g.該抗体は、配列番号1、74、13、87、24、92に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
h.該抗体は、配列番号1、74、13、89、24、93に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
i.該抗体は、配列番号1、74、13、79、24、101に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
j.該抗体は、配列番号1、76、13、89、24、90に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
k.該抗体は、配列番号1、7、13、18、24、100に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
l.該抗体は、配列番号1、7、13、18、24、97に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
m.該抗体は、配列番号1、7、13、18、24、98に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
n.該抗体は、配列番号1、74、13、83、24、99に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
o.該抗体は、配列番号1、7、13、18、24、96に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
p.該抗体は、配列番号1、7、13、18、24、94に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
q.該抗体は、配列番号1、74、13、88、24、90に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
r.該抗体は、配列番号1、74、13、81、24、95に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
s.該抗体は、配列番号1、75、13、18、24、29に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
t.該抗体は、配列番号1、77、13、18、24、29に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
u.該抗体は、配列番号1、7、13、80、24、29に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
v.該抗体は、配列番号1、7、13、85、24、29に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有するか、または
w.該抗体は、配列番号1、7、13、84、24、29に対応するCDRの1、2、3、4、5、または6を含有する。
[表1]表面プラズモン共鳴により、抗PRLPヒトIgG1分子に関して決定された、HEK293細胞中で発現したヒトPRLRの細胞外ドメインの一価(monovalent)解離定数および解離速度
[表2]ヒト乳癌細胞株T47Dおよびラットリンパ腫細胞株Nb2上でFACSによって決定された抗PRLR抗体の細胞ベースの結合力価(binding potency)
ヒトおよびマウスPRLRを機能的にブロックすることができる一群の抗体を単離するために、scFvフラグメントとFabフラグメントをそれぞれ発現する2つのフォーマットの、Bioinvent製のn-CoDeR(登録商標)と呼ばれる合成ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー(Soederlindら, 2000, Nature BioTechnology. 18, 852-856)を、並行して調べた。scFv選択またはFab選択に使用したターゲットは、ビオチン化変異体(NHS-LCビオチン、Pierce)および非ビオチン化変異体として適用したヒトPRLRの可溶性ECD(配列番号70のアミノ酸位置1〜210)およびマウスPRLRの可溶性ECD(配列番号72のアミノ酸位置1〜210)、ならびにPRLRを発現するヒト乳がん細胞株T47Dであった。
本発明の抗体は、ここに提供する具体的ペプチド配列に限定されない。むしろ、本発明はこれらのポリペプチドの変異体も包含する。本開示ならびに従来から利用できる技術および参考文献を参照して、当業者は、本明細書に開示する抗体の機能的変異体を製造し、試験し、利用することができ、それと同時に、PRLRに結合し、PRLRを機能的にブロックする能力を有する変異体が、本発明の範囲に包含されることを理解するであろう。
・VH 006-H08(配列番号34)の位置75にある残基リジン(K)をグルタミン(Q)に
・VH 006-H08(配列番号34)の位置108にある残基ロイシン(L)をメチオニン(M)に
・VH 006-H08(配列番号34)の位置110にある残基スレオニン(T)をイソロイシン(I)に
・VH 002-H08(配列番号36)の位置67にある残基フェニルアラニン(F)をロイシン(L)に。
本明細書に記載する抗体ペプチド配列の全体的分子構造を保存しているポリペプチド変異体を作製することができる。個々のアミノ酸の性質を考えれば、いくつかの合理的な置換が、当業者にはわかるだろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
発明は本発明の抗体をコードするDNA分子にも関係する。これらの配列には、配列番号46および52、ならびに331〜374に示すDNA分子が含まれるが、これらに限るわけではない。
a.Tm=69.3+0.41(G+C)%
b.二重鎖DNAのTmは、ミスマッチ塩基対の数が1%増加するごとに1℃低下する。
c.(Tm)μ2 −(Tm)μ1=18.5log10μ2/μ1
式中、μ1およびμ2は2つの溶液のイオン強度である。
本発明の範囲に包含されるさらにもう一種類のDNA変異体は、それらがコードする産物を基準にして記述することができる。これらの機能的に等価な遺伝子は、遺伝暗号の縮重ゆえに、配列番号34〜45に見いだされるものと同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列の1つ以上を含む組換えDNAコンストラクトも提供する。本発明の組換えコンストラクトは、プラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターなどのベクターと一緒に使用され、そこに本発明の抗体をコードするDNA分子が挿入される。
細菌での使用に役立つ発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的プロモーターに対して作動可能な読み枠(reading phase)で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持が保証されるように、また所望であれば、宿主内での増幅がもたらされるように、1つ以上の表現型選択可能マーカーと複製起点とを含むであろう。形質転換に適した原核宿主には、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、およびシュードモナス(Pseudomonas)属、ストレプトミセス(Streptomyces)属、およびスタフィロコッカス(Staphylococcus)属のさまざまな種が含まれる。
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)(CMVプロモーター/エンハンサー)、シミアンウイルス40(SV40)(例えばSV40プロモーター/エンハンサー)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))およびポリオーマ由来のプロモーターおよび/またはエンハンサーが含まれる。ウイルス調節要素のさらなる説明およびその配列については、例えばStinskiによるU.S.5,168,062、BellらによるU.S.4,510,245、およびSchaffnerらによるU.S.4,968,615を参照されたい。組換え発現ベクターは複製起点および選択可能マーカーも含むことができる(例えばAxelらによるU.S.4,399,216、4,634,665およびU.S.5,179,017を参照されたい)。適切な選択可能マーカーには、そのベクターが導入されている宿主細胞にG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与し、neo遺伝子はG418に対する耐性を付与する。
子宮内膜症は、子宮内膜組織(腺および間質)が子宮腔外に存在することを特徴とする良性エストロゲン依存性婦人科障害である。子宮内膜症病変は主として骨盤腹膜上、卵巣内および直腸膣中隔内に見いだされる(Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. 24:235-238, 1997)。子宮内膜症はしばしば不妊および月経困難症などの疼痛症状を伴う。また、多くの患者は自己免疫疾患を患っている(Hum. Reprod. 17(19):2715-2724, 2002)。内性子宮内膜症とも呼ばれている子宮腺筋症は、子宮に制限された子宮内膜症の亜型(subform)をいう。子宮腺筋症の場合、子宮内膜腺は子宮筋層および子宮壁に浸潤する。
a)月経周期の分泌期後期において、健常女性の子宮内膜細胞はアポトーシス性になる。患者では、子宮内膜細胞のアポトーシスの程度が明確に低下している(Fertil. Steril. 69:1042-1047,1998)。それゆえに、患者では、逆行性月経によって腹膜腔中に流れ込んだ子宮内膜フラグメントが死なずにうまく移植性転移(implant)する確率が、健常女性より高い。
b)異所性子宮内膜フラグメントが腹膜内で移植性転移(implantation)に成功して、長期間にわたって生き残るには、新しい血管の形成が必要である(British Journal of Pharmacology, 149:133-135, 2006)。
c)患者は自己免疫疾患を患っており、したがって免疫系が損なわれている(Hum. Reprod. 17(19): 2002, 2715-2724, 2002)。このことから、無傷免疫応答−これは健常女性には存在するので−が、子宮内膜症病変の樹立の防止に役割を果たしているかもしれないという結論が導かれうる。
d)病変は成長する必要があり、したがって分裂促進刺激および成長因子の存在に依存する。
a)性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)類似体:卵巣エストラジオール合成の抑制をもたらし、その成長をエストラジオールの存在に決定的に依存している異所性子宮内膜移植性転移物(implant)の萎縮を誘発する。
b)アロマターゼ阻害剤:子宮内膜移植性転移物によるエストラジオールの局所的産生を阻害し、アポトーシスを誘発し、異所性子宮内膜フラグメントの増殖を阻害する。
c)選択的エストロゲン受容体モジュレーター:正常子宮内膜および異所性移植性転移物においてエストロゲン受容体アンタゴニスト活性を有するので、移植性転移した異所性子宮内膜組織の萎縮をもたらす。
d)プロゲステロン受容体アゴニスト:正常および異所性子宮内膜細胞の増殖を阻害し、分化およびアポトーシスを誘発する。
e)併用経口避妊薬:現状を維持し、疾患の進行を防止し、異所性および正所性子宮内膜の萎縮を誘発する。
f)病変の外科的切除。
雌性避妊のための現在のアプローチは、次のとおりである:
a)エストロゲンおよびプロゲスチンを含有する併用経口避妊薬。
プロゲストーゲン性コンポーネントは、視床下部-下垂体-性腺軸に対する負のフィードバックによって避妊効果を媒介する。エストロゲン性コンポーネントは、良好な出血制御を保証し、ターゲット細胞におけるプロゲステロン受容体の誘導によってゲスターゲン作用を増強する。
b)プロゲスチンだけを含有する子宮内器具(intrauterine device)。
局所的に放出されるプロゲスチンは、子宮内膜を着床抵抗性状態(implantation-resistant state)にする。また、頸管粘膜が精子細胞にとってほとんど不透過性になる。
c)プロゲスチン単独の丸剤およびインプラント。
プロゲスチンは、視床下部-下垂体-性腺軸に対する負のフィードバックによって排卵を阻害する。加えて、精子細胞に対する頸管粘膜の透過性が低下する。
d)エチニルエストラジオールおよびプロゲスチンを含有する腟内リング(vaginal ring)。
併用経口避妊薬の主な副作用は静脈血栓塞栓症(VTE)のリスクの上昇である。そのうえ、過体重の女性または喫煙女性は、狼蒼などの自己免疫疾患を患っている女性および35歳より高齢の女性と共に、経口併用避妊薬を使用することができない。
プロゲスチンのみを含有する子宮内器具およびインプラントは、機能障害性子宮出血をもたらしうる。
プロゲスチン単独の丸剤は、不規則な出血パターン、点状出血(spotting)、無月経を引き起こしうる。異所性妊娠のリスクが増加する。体重増加および骨密度の低下がさらなる副作用である。
腟内リングは、膣炎、白帯下または駆血(expulsion)をもたらしうる。
・この抗体は、喫煙女性、過体重の女性、および高齢女性に使用することができ、紅斑性狼瘡(lupus erythematodes)を患っている女性にも使用することができる(PRLR抗体は狼蒼の処置および腹部脂肪の減少にさえ有益であるかもしれない。すなわちPRLR欠損マウスは腹部脂肪が少なかった);
・このPRLR抗体はVTE(静脈血栓塞栓(venous thrombembolic)リスク)を上昇させない;
・併用経口避妊に使用されるエストロゲンおよびプロゲスチンとは対照的に、PRLR媒介シグナリングの中和は乳房上皮増殖の阻害につながり、妊性制御(fertility control)のためのホルモンアプローチとは対照的に、使用者を乳がんから防御することさえ考えられる。
良性乳房疾患は、線維嚢胞性乳房疾患、線維腺腫、乳房痛、および大嚢胞(macrocyst)など、さまざまな症状を包含する。閉経前女性の30〜50%は線維嚢胞性乳房疾患を患っている(Epidemiol Rev 19:310-327, 1997)。女性の年齢に依存して、良性乳房疾患は異なる表現型で現れうる(J Mammary Gland Biol Neoplasia 10:325-335, 2005)。すなわち、正常乳房において小葉発達が起こる早期生殖相(15〜25歳)中は、良性乳房疾患は線維腺腫をもたらす。単一の巨大線維腺腫ならびに複数の腺腫が観察される。これらの線維腺腫は間質細胞および上皮細胞で構成され、小葉から生じる。成熟生殖相(25〜40歳)においては、各月経周期中に乳房が周期的変化を起こす。罹患女性には、周期的乳房痛と、その乳房中にいくつかの小結節を認められる。その後(35〜55歳)、正常乳房は退縮するのに対して、罹患乳房では、大嚢胞ならびに異型性を伴うおよび異型性を伴わない上皮過形成を観察することができる。増進した上皮細胞増殖を伴うこれらの形態の良性乳房疾患では、乳癌を発生するリスクが高まっている。このリスクは、増殖細胞画分に細胞異型性が存在する場合には、11%にまで達しうる(Zentralbl Gynaekol 119:54-58,1997)。60〜80歳の女性の25%も良性乳房疾患を患っており、エストロゲン補充療法(replacement therapy)または脂肪症(adiposity)は、閉経後も良性乳房疾患が持続する理由である(Am J Obstet Gynecol 154:161-179, 1986)。
ドーパミンアゴニストとしてのブロモクリプチンは、下垂体プロラクチン合成だけをブロックし、乳腺上皮細胞におけるプロラクチンの局所的合成はブロックしない。それゆえに、これは、上昇した全身性プロラクチンレベルに依拠する形態の乳房痛および良性乳房疾患にしか有効でない。ブロモクリプチンの主な副作用は、悪心、嘔吐、浮腫、低血圧、めまい、脱毛、頭痛、および幻覚である。
ダナゾールは、その抗性腺刺激活性(antigonadotrophic activity)によって良性乳房疾患に観察されるエストロゲン優位に対抗するアンドロゲン性プロゲスチンである。主な副作用は、月経不順、うつ病、ざ瘡、多毛症、声の低音化(voice deepening)、および顔面紅潮、ならびに体重増加である。
タモキシフェンは、乳房では抗エストロゲン活性を、また子宮ではエストロゲン活性を有する、選択的エストロゲン受容体モジュレーターである。主な副作用は、骨量減少および顔面紅潮などの閉経後症状、卵巣嚢胞、および子宮内膜癌である。
プロゲスチンは、下垂体性腺軸の抑制、排卵阻害およびエストロゲン枯渇によって良性乳房疾患を阻害する。エストロゲン枯渇は骨量減少および顔面紅潮などの閉経症状につながる。
この処置は、35歳より高齢の女性、喫煙者ならびに糖尿病患者および過体重患者には適応がない。
・全身性高プロラクチン血症(下垂体腺腫によるもの)
・局所的高プロラクチン血症(増殖する乳腺上皮細胞におけるプロラクチン合成によるもの)。局所的高プロラクチン血症は、上昇した血中プロラクチンレベルには移行しない;
・正常プロラクチンレベルの存在下で構成的に活性なPRLRシグナリング(活性化PRLR変異によるもの)
の結果でありうる。
・側枝形成および小葉腺胞発生をブロックする能力
・乳腺上皮細胞増殖を阻害する能力
・STAT5(通常はPRLR活性化後に活性化されリン酸化される転写因子)のリン酸化を阻害する能力
について試験した。
プロラクチンは出産後の泌乳に関与する主要ホルモンである。これはPRLR欠損マウスの表現型によって立証される。ヘテロ接合マウスでさえ重度の泌乳障害を有し、その仔(offspring)に授乳することは全くできない(Frontiers in Neuroendocrinology 22:140-145, 2001)。
良性前立腺過形成(BPH)は、高齢男性において4番目によく見られる要医療状態(healthcare condition)である。前立腺の拡大は、≧50歳の男性の50%以上を冒す年齢依存的な進行性の状態である。BPHは、前立腺間質細胞および上皮細胞の過形成を特徴とし、それが、前立腺の尿道周囲領域における大きな離散的結節の形成をもたらして、尿道を圧迫する。したがって尿流障害はBPHの主要な結果の一つである。
a)α1-アドレナリン作動性受容体アンタゴニスト(例えばタムスロシン、アルフゾシン、テラゾシン、ドキサゾシン)は下部尿路におけるBPH症状を緩和する。これらは、アルファ受容体が媒介する前立腺平滑筋の刺激をブロックすることによって、膀胱下尿道閉塞を減少させる。主な副作用は、血管拡張性有害事象、めまいおよび射精不全(ejaculation failure)である。
b)5α−レダクターゼ阻害剤(例えばフィナステリド)
5α−レダクターゼ阻害剤は、前立腺におけるテストステロンの活性型であるジヒドロテストステロン(これは前立腺拡大の原因になる)の形成を防止する。主な副作用は勃起障害および性欲減退などの性機能障害である。
c)経尿道的前立腺切除術(TURP)
この外科的処置は高い手術合併症率(moribidity)を伴う。副作用は出血、失禁、狭窄形成、射精の消失、および膀胱穿孔である。
d)前立腺ステント留置術
適正な尿流量を保証するために、尿道の前立腺部分にステントが挿入される。主な副作用は、痂皮形成(encrustation)、尿路感染、およびステントの移動である。そのうえ、ステントは、何らかの経尿道的操作を行う前には除去する必要がある。
脱毛の処置は今なお未充足ニーズである。頭髪は周期的に成長する。すなわち、成長期(anagen phase)は活発な毛髪の成長を特徴とし、退行期(catagen phase)は退縮を示し、その後に休止期(telogen phase)(休眠期(resting))が続く。脱落期(exogen phase)(死んだ毛髪の遊離)は、休止期の最後と一致する。脱毛は、いずれかの時期における毛髪成長障害の結果でありうる。
まだ子宮を有する閉経後女性における顔面紅潮を処置するために、エストロゲン(エストラジオールまたは結合型ウマエストロゲン=CEE)とプロゲスチン(例えば酢酸メドロキシプロゲステロン(MPA)、プロゲステロン、ドロスピレノン、レボノルゲストレル)との組合せが使用された。プロゲスチンは、エストラジオールで活性化された子宮上皮細胞増殖を阻害するために添加する必要がある。しかし、プロゲスチンの添加は乳腺上皮細胞増殖を増加させる。正常乳腺上皮細胞とがん性乳腺上皮細胞はどちらも、併用エストロゲン+プロゲスチン処置に対して、増殖をもって応答するので、CEE+MPA処置後には、乳がんの相対的リスクが増加していることがわかった(JAMA 233:321-333;2002)。
本明細書にいうターゲット抗原ヒト「PRLR」は、配列番号70のアミノ酸位置1〜210と実質的に同じアミノ酸配列を、その細胞外ドメインに有するヒトポリペプチド、ならびにその天然の対立遺伝子(allelic)および/またはスプライス変異体を指す。本明細書にいう「PRLRのECD」は、上述のアミノ酸によって表されるPRLRの細胞外部分を指す。加えて、ターゲットヒトPRLRは、Paul Kellyが記載した活性化変異I146Lなどといった変異型の受容体も包含する(Proc Natl Acad Sci U S A.105(38):14533-14538,2008;および口頭発表(oral communication)、トリノ(Turin)、2007)。
治療法は、本発明によって考えられる抗体の治療有効量を、処置を必要とする対象に投与することを伴う。「治療有効」量とは、本明細書においては、単回投与として、または複数回投与レジメンに従って、単独で、または他の薬剤との組み合わせで、対象の処置区域におけるPRLR陽性細胞の増殖をブロックするのに十分な量であって、有害な状態の軽減につながるが、毒物学的には認容できるような、抗体の量と定義される。対象は、ヒトまたは非ヒト動物(例えばウサギ、ラット、マウス、サル、または他の下等霊長類)であることができる。
本発明は、PRLR抗体を含みうる医薬組成物であって、単独で、または安定化化合物などの少なくとも1つの他の薬剤と組み合わせて、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水などといった(ただしこれらに限るわけではない)滅菌生体適合性医薬担体に入れて投与することができる、医薬組成物にも関係する。これらの分子はいずれも、患者に単独で、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、医薬組成物として投与することができ、医薬組成物では、賦形剤または医薬上許容される担体と混合される。本発明のある実施形態では、医薬上許容される担体は医薬的に不活性である。
本発明はさらに、上述した本発明組成物の成分の1つ以上が充填された1つ以上の容器を含む医薬パック(pharmaceutical pack)およびキットに関する。そのような容器には、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局によって指示された形式で、当局によるヒト投与用製品の製造、使用または販売の認可を反映した告知書(notice)を、添付することができる。
本発明の医薬組成物は、当技術分野においてよく知られている方法で、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成(dragee-making)、研和(levigating)、乳化、カプセル化、捕捉(entrapping)または凍結乾燥プロセスなどによって、製造することができる。
本発明における使用に適した医薬組成物には、その活性成分が、意図する目的、すなわちPRLR発現を特徴とする特定の疾患状態の処置を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者の能力の範囲で十分に可能である。
配列番号2は、HCDR1、002-H06のアミノ酸配列を表す。
配列番号3は、HCDR1、002-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号4は、HCDR1、006-H07のアミノ酸配列を表す。
配列番号5は、HCDR1、001-E06のアミノ酸配列を表す。
配列番号6は、HCDR1、005-C04のアミノ酸配列を表す。
配列番号7は、HCDR2、006-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号8は、HCDR2、002-H06のアミノ酸配列を表す。
配列番号9は、HCDR2、002-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号10は、HCDR2、006-H07のアミノ酸配列を表す。
配列番号11は、HCDR2、001-E06のアミノ酸配列を表す。
配列番号12は、HCDR2、005-C04のアミノ酸配列を表す。
配列番号13は、HCDR3、006-H08、002-H06のアミノ酸配列を表す。
配列番号14は、HCDR3、002-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号15は、HCDR3、006-H07のアミノ酸配列を表す。
配列番号16は、HCDR3、001-E06のアミノ酸配列を表す。
配列番号17は、HCDR3、005-C04のアミノ酸配列を表す。
配列番号18は、LCDR1、006-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号19は、LCDR1、002-H06のアミノ酸配列を表す。
配列番号20は、LCDR1、002-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号21は、LCDR1、006-H07のアミノ酸配列を表す。
配列番号22は、LCDR1、001-E06のアミノ酸配列を表す。
配列番号23は、LCDR1、005-C04のアミノ酸配列を表す。
配列番号24は、LCDR2、006-H08、002-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号25は、LCDR2、002-H06のアミノ酸配列を表す。
配列番号26は、LCDR2、006-H07のアミノ酸配列を表す。
配列番号27は、LCDR2、001-E06のアミノ酸配列を表す。
配列番号28は、LCDR2、005-C04のアミノ酸配列を表す。
配列番号29は、LCDR3、006-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号30は、LCDR3、002-H06、001-E06のアミノ酸配列を表す。
配列番号31は、LCDR3、002-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号32は、LCDR3、006-H07のアミノ酸配列を表す。
配列番号33は、LCDR3、005-C04のアミノ酸配列を表す。
配列番号34は、VH、006-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号35は、VH、002-H06のアミノ酸配列を表す。
配列番号36は、VH、002-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号37は、VH、006-H07のアミノ酸配列を表す。
配列番号38は、VH、001-E06のアミノ酸配列を表す。
配列番号39は、VH、005-C04のアミノ酸配列を表す。
配列番号40は、VL、006-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号41は、VL、002-H06のアミノ酸配列を表す。
配列番号42は、VL、002-H08のアミノ酸配列を表す。
配列番号43は、VL、006-H07のアミノ酸配列を表す。
配列番号44は、VL、001-E06のアミノ酸配列を表す。
配列番号45は、VL、005-C04のアミノ酸配列を表す。
配列番号46は、核酸配列VH、006-H08を表す。
配列番号47は、核酸配列VH、002-H06を表す。
配列番号48は、核酸配列VH、002-H08を表す。
配列番号49は、核酸配列VH、006-H07を表す。
配列番号50は、核酸配列VH、001-E06を表す。
配列番号51は、核酸配列VH、005-C04を表す。
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配列番号53は、核酸配列VL、002-H06を表す。
配列番号54は、核酸配列VL、002-H08を表す。
配列番号55は、核酸配列VL、006-H07を表す。
配列番号56は、核酸配列VL、001-E06を表す。
配列番号57は、核酸配列VL、005-C04を表す。
配列番号58は、VH、HE06642、Novartis(WO2008/22295)のアミノ酸配列を表す。
配列番号59は、VH、XHA06642、Novartis(WO2008/22295)のアミノ酸配列を表す。
配列番号60は、VH、XHA06983、Novartis(WO2008/22295)のアミノ酸配列を表す。
配列番号61は、VL、HE06642のアミノ酸配列を表す。
配列番号62は、VL、XHA06642 Novartis(WO2008/22295)のアミノ酸配列を表す。
配列番号63は、VL、XHA06983 Novartis(WO2008/22295)のアミノ酸配列を表す。
配列番号64は、核酸配列VH、HE06642を表す。
配列番号65は、核酸配列VH、XHA06642 Novartis(WO2008/22295)を表す。
配列番号66は、核酸配列VH、XHA06983 Novartis(WO2008/22295)を表す。
配列番号67は、核酸配列VL、HE06642を表す。
配列番号68は、核酸配列VL、XHA06642、Novartis(WO2008/22295)を表す。
配列番号69は、核酸配列VL、XHA06983、Novartis(WO2008/22295)を表す。
配列番号70は、ヒトECD_PRLR、アミノ酸位置1〜210、S1ドメイン1〜100(S1ドメインコンストラクト1〜102)、S2ドメイン101〜210を表す。
配列番号71は、CDSヒトECD_PRLR、ヌクレオチド位置1〜630を表す。
配列番号72は、マウスECD_PRLR、アミノ酸位置1〜210を表す。
配列番号73は、CDSマウスECD_PRLR、ヌクレオチド位置1〜630を表す。
配列番号74は、HCDR2、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
配列番号75は、HCDR2、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
配列番号76は、HCDR2、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
配列番号77は、HCDR2、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
配列番号78は、LCDR1、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
配列番号79は、LCDR1、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
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配列番号81は、LCDR1、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
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配列番号87は、LCDR1、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
配列番号88は、LCDR1、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
配列番号89は、LCDR1、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
配列番号90は、LCDR3、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
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配列番号93は、LCDR3、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
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配列番号97は、LCDR3、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
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配列番号100は、LCDR3、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
配列番号101は、LCDR3、成熟006-H08変異体、アミノ酸配列を表す。
配列番号143は、VH、006-H08-12-2、アミノ酸配列を表す。
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ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーからのターゲット特異的抗体の単離
ヒトPRLRの活性を中和することができる一群の抗体を単離するために、FabおよびscFvフラグメントを発現する3つのヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを並行して調べた。ライブラリーパンニングに使用したターゲットは、WO08/022295(Novartis)に記載されているように製造されたヒトプロラクチン受容体アミノ酸25〜234を表すプロラクチン受容体の可溶性細胞外ドメイン(ECD)である。これに代わるターゲットは、C末端において、6個のヒスチジンに、またはヒトIgG1-Fcドメインにアミノ酸配列「イソロイシン-グルタミン酸-グリシン-アルギニン-メチオニン-アスパラギン酸」を有するリンカーを介して連結されたPRLRのECDであった。
患者および健常対照からの正所性および異所性子宮内膜および子宮内膜症病変におけるリアルタイムTaqMan PCR分析によるプロラクチンおよびプロラクチン受容体遺伝子発現の定量的分析
リアルタイムTaqman PCR分析は、ABI Prism 7700 Sequence Detector Systemを製造者の説明書(PE Applied Biosystems)に従って使用し、記述されているとおりに(Endocrinolgy 2008, 149(8): 3952-3959)、そしてまた当業者に知られているとおりに行った。PRLおよびPRLRの相対的発現レベルをシクロフィリン(cyclophillin)の発現に対して標準化した。本発明者らは、健常女性からの子宮内膜ならびに患者からの子宮内膜および子宮内膜症病変におけるPRLおよびPRLRの発現を、定量リアルタイムTaqman PCR分析を使って分析した。プロラクチンとその受容体の発現は、健常子宮内膜または患者に由来する子宮内膜と比較して、子宮内膜症病変では明確にアップレギュレートされていた。
ノーザンブロットによるヒト組織におけるプロラクチン受容体発現の分析
異なるラット組織からRNAを単離し、ゲル電気泳動後にナイロンメンブレンに転写した。メンブレンを、ラットプロラクチン受容体またはβ-アクチン(ローディング対照(loading control)として)の放射線標識cDNAと順次ハイブリダイズさせ、洗浄し、フィルムに露光した。バンドはラットプロラクチン受容体およびβ-アクチンのmRNAに対応する。図3に示す結果は、胎盤、前立腺、卵巣および副腎におけるプロラクチン受容体の強い発現を示す。
ラット前立腺におけるプロラクチン受容体タンパク質発現の調節−去勢およびホルモン処置の影響
ラットを去勢するか、無傷のままにしておいた。無傷動物を媒体(インタクト)、DHT(3mg/kg)、またはE2(0.4mg/kg)で14日間毎日処置した。その後、全ての処置群の動物から前立腺を単離し、タンパク質抽出物を調製した。タンパク質抽出物をゲル電気泳動によって分離し、メンブレンに転写した。市販の抗体MA610(Santa Cruz Biotechnology)を使ってプロラクチン受容体を検出した。結果を図4に示す。これらの結果は、ラット前立腺におけるプロラクチン受容体のホルモン調節を示している。
中和プロラクチン受容体抗体および非特異的対照抗体によるBaF3細胞(ヒトプロラクチン受容体を安定にトランスフェクトしたもの)のプロラクチン誘発性増殖の阻害
中和PRLR抗体のインビトロ効力を解析するために、BaF3細胞のプロラクチン活性化細胞増殖の阻害を使用した。細胞にヒトPRLRを安定にトランスフェクトし、2mMグルタミンを含有するRPMI中、10%FCSおよび10ng/mlのヒトプロラクチンの存在下で、通常培養した。1%FCSを含有するプロラクチン非含有培地中で6時間の飢餓処理(starvation)後に、細胞を96ウェルプレートに、1ウェルあたり10000細胞の密度で播種した。細胞を20ng/mlのプロラクチンで刺激し、一連の用量(increasing doses)の中和PRLR抗体と共に、2日間インキュベートした。CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)を使って細胞増殖を分析した。プロラクチン刺激細胞成長の阻害に関する用量応答曲線を作成し、IC50値を算出した。陰性対照として、非特異的対照抗体による刺激を使用した。
特異的および非特異的抗体によるプロラクチン誘発性ラットリンパ腫細胞増殖の阻害
中和PRLR抗体のインビトロ効力を、プロラクチン依存的ラットリンパ腫細胞(Nb2-11細胞)増殖の阻害を使って試験した。10%FCSおよび10%ウマ血清を含有するRPMI中で、Nb2-11細胞を通常どおり成長させた。細胞成長アッセイを開始する前に、10%FCSの代わりに1%FCSを含有する同じ培地中で、細胞を24時間成長させた。その後、96ウェルプレートに、FCS非含有培地中、1ウェルあたり10000細胞の密度で、細胞を播種した。一連の用量の中和PRLR抗体または対照抗体の存在下または非存在下、2日間にわたって、細胞を、10ng/mlのヒトプロラクチンで刺激した。その後、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)を使って、細胞増殖を評価した。用量応答曲線およびIC50値を図6に図示する。非特異的抗体およびラットPRLRに結合しない抗体XHA06.983は、Nb2-11細胞増殖をブロックしなかった。ラットPRLRに結合するXHA06.642はNb2-11細胞増殖をブロックした。
中和プロラクチン受容体抗体によるT47D細胞におけるプロラクチン誘発性STAT5リン酸化の阻害
さらにもう一つのリードアウトにおける中和PRLR抗体のインビトロ効力を解析するために、プロラクチンで処理したヒトT47D細胞におけるSTAT5リン酸化の阻害を使用した。T47D細胞を、10%FCSおよび2mMグルタミンを含有するRPMI中で成長させた。細胞を24ウェルプレート上に、1ウェルあたり0.5×105細胞の密度で播種した。翌日、細胞を無血清RPMI中で1時間飢餓処理した。その後、細胞を、さまざまな用量の中和PRLR抗体または非特異的対照抗体と共に、またはそれらの抗体を伴わずに、20ng/mlヒトプロラクチンの非存在下または存在下で、30分間インキュベートした。その後、細胞をすすぎ、70μlの溶解バッファー中で溶解した。溶解物を遠心分離し、上清を−80℃で凍結した。抽出物をウェスタンブロット(upstate製の抗pSTAT5A/B抗体07-586、1:1000希釈)で分析した。ローディング対照として、ストリッピングしたブロットを抗β-チューブリン抗体(ab7287、1:500希釈)と共にインキュベートした。
ヒトPRLRを安定にトランスフェクトしたHek293細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の阻害−中和プロラクチン受容体抗体および非特異的対照抗体の分析
中和PRLR抗体のインビトロ効力をさらに分析するために、レポーター遺伝子アッセイを使用した。ヒトPRLRを安定にトランスフェクトしたHEK293HEK293細胞に、LHRE(乳腺刺激ホルモン応答エレメント)の制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を、7時間、一過性にトランスフェクトした。その後、細胞を、1ウェルあたり20000細胞の密度で、96ウェルプレートに播種した(0.5%チャコールストリッピング済(charcoal stripped)血清、DMEM)。翌日、300ng/mlのヒトプロラクチンを、一連の用量の中和PRLR抗体または対照抗体と共に、およびこれらの抗体を伴わずに、加えた。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を決定した。結果を図8に図示する。非特異的抗体とは対照的に、006-H08およびHE06.642は、ヒトPRLRで安定にトランスフェクトされたHEK293細胞におけるルシフェラーゼ活性を阻害した。
マウスPRLRを安定にトランスフェクトしたHek293細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の阻害−中和プロラクチン受容体抗体および非特異的対照抗体の分析
マウスプロラクチン受容体に対する中和PRLR抗体のインビトロ効力をさらに解析するために、レポーター遺伝子アッセイを使用した。マウスPRLRを安定にトランスフェクトしたHEK293細胞に、LHRE(乳腺刺激ホルモン応答エレメント)の制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を、7時間、一過性にトランスフェクトした。その後、細胞を、1ウェルあたり20000細胞の密度で、96ウェルプレートに播種した(0.5%チャコールストリッピング済血清、DMEM)。翌日、200ng/mlのヒトプロラクチンを、一連の用量の中和PRLR抗体または対照抗体と共に、およびこれらの抗体を伴わずに、加えた。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を決定した。結果を図9に図示する。抗体005-C04(黒三角)が高い活性(IC50値=3nM)を呈するのに対し、抗体HE06.642(黒丸)は330nMまで活性を示さない。非特異的対照抗体(白丸)は完全に不活性である。Novartis抗体HE06.642とは対照的に、抗体005-C04はマウスPRLR媒介シグナリングをブロックすることができる。
中和プロラクチン受容体抗体および非特異的対照抗体による、BaF3細胞(マウスプロラクチン受容体を安定にトランスフェクトしたもの)のプロラクチン誘発性増殖の阻害
中和PRLR抗体のインビトロ効力を解析するために、Ba/F3細胞のプロラクチン活性化細胞増殖の阻害を使用した。細胞にマウスPRLRを安定にトランスフェクトし、2mMグルタミンを含有するRPMI中、10%FCSおよび10ng/mlのヒトプロラクチンの存在下で、通常培養した。1%FCSを含有するプロラクチン非含有培地中で6時間の飢餓処理後に、細胞を96ウェルプレートに、1ウェルあたり10000細胞の密度で播種した。細胞を40ng/mlのプロラクチンで刺激し、一連の用量の中和PRLR抗体と共に、2日間インキュベートした。CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)を使って細胞増殖を分析した。プロラクチン刺激細胞成長の阻害に関する用量応答曲線を作成し、IC50値を算出した。陰性対照として、非特異的対照抗体による刺激を使用した。
マウスにおける中和プロラクチン受容体抗体IgG1 005-C04の避妊効果
マウスにおける妊性に対する中和プロラクチン受容体抗体の影響を調べるために、12週齢雌および雄NMRIマウスを7日間(0日目〜7日目)交配した。雌マウスを、−3日目、0日目、3日目および6日目に、リン酸緩衝食塩水、非特異的IgG1対照抗体(抗FITC、10mg/kg)、または中和IgG1抗体005-C04(=IgG1 005-C04)のいずれかを、リン酸緩衝食塩水に溶解して、体重1kgあたり10または30mgの濃度で、腹腔内注射することによって処置した。各実験群に10匹の雌を使用した。各雄を2匹の雌と交配させた。雌の一方は、リン酸緩衝食塩水または非特異的抗体で処置した陰性対照群からの雌とし、他方の雌は、特異的中和抗体で処置した。雄が一匹の雌も妊娠させなかった交配をデータ評価から除外した。リードアウトパラメータは、平均一腹仔数、および実験群あたりの産仔数をその群内での理論上可能な産仔の数で割ったものとして算出される妊娠率(%単位で測定)とした。結果を図11に図示する。
・リン酸緩衝食塩水で処置したマウスの群では87.5%、
・非特異的対照抗体(10mg/kg)で処置したマウスの群では75%、
・中和PRLR抗体IgG1 005-C04(10mg/kg)で処置したマウスの群では100%、および
・中和PRLR抗体IgG1 005-C04(30mg/kg)で処置したマウスの群では0%。
・リン酸緩衝食塩水で処置したマウスの群では、一腹あたり10.9匹、
・非特異的対照抗体(10mg/kg)で処置したマウスの群では、一腹あたり12.3匹、
・中和PRLR抗体IgG1 005-C04(10mg/kg)で処置したマウスの群では、一腹あたり13匹、および
・中和PRLR抗体IgG1 005-C04(30mg/kg)で処置したマウスの群では、一腹あたり0匹。
エピトープ分類(epitope grouping)
エピトープ分類実験は、Biacoreを使用し、ECD-PRLR(配列番号70)への抗PRLR抗体のペアの同時結合をモニターすることによって行った。簡単に述べると、n-ヒドロキシスクシンアミド(NHC)およびN-エチル-N'-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(EDC)を使った1級アミンカップリングにより、第1抗体をセンサーチップに共有結合で固定化した。次に、表面上の、占有されていない結合部位を、エタノールアミドでブロッキングした。固定化された抗体により、可溶性ECD-PRLR(配列番号70)を、表面上に捕捉した。それゆえに、全ての結合されたECD-PRLR分子に関して、捕捉抗体のエピトープはブロックされている。第2の抗体を、固定化ECD-PRLRに結合させるために、直ちに表面上に流す。同じエピトープまたはオーバーラップするエピトープを認識する2つの抗体は、ECD-PRLRに結合できないが、異なるエピトープを伴う抗体は結合することができる。この抗体表面を、結合したタンパク質を除去するためにグリシン、pH2.8で再生し、次に他の抗体を使って、このプロセスを繰り返す。抗体の全ての組合せを試験した。代表的な結果を表7に示す。抗体006-H08、002-H06、002-H08、006-H07およびXHA06983は、ECD-PRLRに対して、互いに競合的に結合したことから、これらはオーバーラップするエピトープ(エピトープグループ1、表6)を標的にすることが示された。また、抗体はPRLとも競合して結合し、これは001-E06(エピトープグループ2、表6)の場合にも当てはまる。この抗体は、上述のものとは異なるECD-PRLRの部位を標的とする。最後に、抗体005-C04は、HE06.642およびXHA06.642とは、競合的に結合したが、PRLに対する競合はなかった(エピトープグループ3、表6)。
細胞表面上に発現したマウスおよびヒトPRLRに対する抗体の交差反応性
細胞上に発現したマウスおよびヒトPRLRに対する抗PRLR抗体の結合特徴を決定するために、ヒトおよびマウスPRLRをそれぞれ安定に発現するHEK293細胞上で、フローサイトメトリーによって結合を調べた。これらの細胞と、PRLRを伴わない親HEK293細胞株とを収穫し、遠心分離し、2%FBSおよび0.1%アジ化ナトリウムを含有する1×PBS(FACSバッファー)に、約5×106細胞/mlで再懸濁した。抗体005-C04、001-E06およびHE06.642をFACSバッファーに最終濃度の2倍まで希釈し、適当な試料ウェルに加えた(50μl/ウェル)。二次抗体および自己蛍光対照については、50μlのFACSバッファーを適当なウェルに加えた。50μlの細胞懸濁液を各試料ウェルに加えた。試料を4℃で1時間インキュベートし、冷FACSバッファーで2回洗浄し、1:100希釈のPEコンジュゲートヤギ抗ヒトIgGを含有するFACSバッファーに再懸濁した。4℃で30分間インキュベートした後、細胞を冷FACSバッファーで2回洗浄し、1mg/mlヨウ化プロピジウム(Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ)を含有するFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。図13に示すように、抗体005-C04および001-E06は、これらの細胞上のヒトおよびマウスPRLRに結合し、一方、HE06.642はヒトPRLRにしか結合しなかった。この観察結果は、マウスPRLR依存的ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいてHE06.642が効力を欠くことに関する実施例9に記載の知見と合致している。005-C04とHE06.642はヒトPRLRに競合的に結合したが、マウスPRLRに関する両抗体の異なる結合特性は、それらのエピトープ特異性の相違を示している。
細胞シグナリングカスケードに対するFabおよびscFv抗体の阻害活性
PRLRをトリガーとする(PRLR-triggered)シグナリングカスケードに対するFabおよびscFvスクリーニングヒット(screening hit)の活性を機能的に特徴づけるために、プロラクチンで処理したヒトT47D細胞におけるPRLR自体ならびに転写調節因子ERK1/2およびSTAT5のリン酸化の阻害を測定した。T47D細胞を、2mM L-グルタミン、10%チャコールストリッピング済FBSおよびインスリン-トランスフェリン-セレン-A(Gibco)を含有するRPMI中で成長させた。細胞を6ウェルプレートまたは96ウェルプレートに、1ウェルあたり1.5×106細胞の密度で播種した。翌日、成長培地を新しくした。3日目に、細胞を無血清RPMI中で1時間、飢餓処理した。その後、細胞を、異なる用量の中和PRLR抗体または非特異的対照抗体と共に、またはこれらの抗体を伴わずに、500ng/mlヒトプロラクチンの存在下で5分間インキュベートした。その後、細胞をすすぎ、溶解バッファー中で溶解した。溶解物を遠心分離し、上清を-80℃で凍結した。試料を、PRLRリン酸化の測定についてはDuoSet IC「Human Phospho-Prolactin R」キット(R&D Systems)、STAT5リン酸化の測定についてはPathScan Phospho-STAT5 (Tyr694) Sandwich ELISAキット(Cell Signaling Technology;#7113)、ERK1/2リン酸化の測定についてはPhospho-ERK1/ERK2キット(R&D Systems)によるELISAで、試験した。表8に、選ばれたスクリーニングヒットの、FabまたはscFvフォーマットにおける、1mlあたり7.5μgの固定用量での、アンタゴニスト活性に関する概要を記す。
中和PRLR抗体はマウスにおける泌乳を阻害する
成体NMRI雌をNMRI雄と交配した。分娩後1日目に、一腹仔数を泌乳中の母体1匹あたり8匹に調節した。仔の重量を分娩後1日目から開始して、毎日午前中に決定した。泌乳中の母体を無処置のままにしておくか(図14A、Bの黒丸)、あるいは非特異的抗体(10mg/kg体重;図14A、Bの白丸)またはマウスIgG2a定常ドメインを含有する中和PRLR抗体005-C04(=IgG2a 005-C04;10mg/kg、図14A、Bの黒三角)または中和PRLR抗体IgG2a 005-C04(30mg/kg、図14A、Bの白三角)のいずれかで腹腔内処置した。群サイズ(group size)は1実験群につき泌乳母体5〜6匹とした。母体を、分娩後1、3、6、9、10、および12日目(図14A、Bでは矢印で示す)に、特異的抗体または非特異的対照抗体で処置した。結果を図14に図示する。図14Aは、各分娩後日について、1日目の各産仔重量の百分率として表した毎日の産仔重量増加を示す。分娩後8日目以降、中和PRLR抗体で処置された母体からの仔と、無処置のままの母体または非特異的対照抗体を投与された母体からの仔との間には、産仔体重増加に有意差がある。倫理上の理由から、最高用量の中和PRLR抗体を与えた母体の実験群では、数匹の産仔を分娩後10日目に屠殺する必要があった。図14Bでは、結果を異なる方法で図示している。1日ごとの差分(differential)産仔重量増加を図示し、分娩後1日目での産仔重量の百分率として表している。基本的に、図14Bは図14Aに図示したグラフの傾きを示す。産仔重量の毎日の差分増加量は、無処置母体または非特異的抗体で処置された母体からの産仔については、分娩後1日目の出発産仔重量の30%付近を上下する。30mg/kg体重の中和PRLR抗体で処置された母体からの産仔では、7日目以降に、毎日の産仔重量増加の有意で著しい減少が起こる(*p<0.05;***p<0.005、非特異的抗体で処置された母体からの産仔との比較)。10mg/kgの中和PRLR抗体で処置された母体からの産仔も、非特異的対照抗体で処置された母体からの産仔と比較すると、分娩後11日目以降は、毎日の産仔重量増加が有意に減少した(p<0.05、非特異的抗体で処置された母体からの産仔との比較)。結論として、泌乳阻害に関して
、中和PRLR抗体IgG2a 005-C04の用量依存的効果がある。図14Cは、異なる実験群の泌乳中の母体からの乳腺の組織切片を示す。無処置母体および非特異的対照抗体で処置された母体の乳腺は、乳汁を産生する導管で満たされている。対照的に、中和PRLR抗体IgG2a 005-C04で処置された母体には乳腺退縮の徴候がある。図14C中の黒い矢印は、乳腺組織中の脂肪島を示している(乳腺退縮の程度に対する特異的抗体igG2a 005-C04の用量依存的効果(図14C)を参照のこと)。また、異なる実験群からの母体の乳腺における主要乳タンパク質β-カゼイン(Csn-2)、乳清酸性タンパク質(WAP)、およびIGF-1の発現を分析した(図14D)。遺伝子発現をTATAボックス結合タンパク質(TBP)の発現に対して標準化した。中和PRLR抗体IgG2a 005-C04が、乳タンパク質発現を用量依存的に減少させたのに対し、非特異的抗体(10mg/kg)には有意な効果がなかった。
中和PRLR抗体は良性乳房疾患の処置に適している
活性化PRLR変異または局所もしくは全身性高プロラクチン血症は良性乳房疾患を惹起しうる。それゆえに、乳腺における増進した増殖(大半の重症な形態の良性乳房疾患の特徴(hallmark))を誘導するための高プロラクチン血性マウスモデルを使用した。0日目に、12週齢雌Balb/cマウスに、腎被膜下に下垂体同系移植片を移植するか、または無手術のままにしておいた。下垂体同系移植したマウスを無処置のままにしておくか、0、3、7、11、および15日目に、非特異的抗体(10mg/kg)、IgG1フォーマットの中和PRLR抗体005-C04(=IgG1 005-C04;10mg/kg)、または中和PRLR抗体IgG1 005-C04(30mg/kg)のいずれかで腹腔内処置した。実験群サイズは8〜10匹とした。下垂体移植後17日目に、マウスを屠殺した。死亡の2時間前に、上皮細胞増殖をモニターするために動物にBrdUの腹腔内注射を行った。左鼠径部乳腺をカルノア(Carnoy)液で固定し、乳腺全載標本を調製し、アルムカーミン(Carmine alaune)で染色した(図15A)。右鼠径部乳腺は4%リン酸緩衝ホルマリン中で終夜固定した。次に、乳腺をパラフィンに包埋し、BrdU免疫染色を、既述のように行った(Endocrinology 149(8):3952-3959;2009)。また、中和PRLR抗体による処置に呼応して起こるPRLR媒介シグナリングの阻害をモニターするために、pSTAT5免疫染色も行った(abcam製の抗pSTAT5抗体、ab32364、1:60希釈)。図15Aに、異なる実験群からの乳腺全載標本の拡大図を示す。下垂体を移植されなかった成体マウスの乳腺が導管およびエンドバッド(endbud)を示すのに対し、下垂体同系移植を受けたマウスでは、並外れた側枝形成および腺房構造の形成が起こる。非特異的抗体(10mg/kg)による処置は側枝形成および腺房構造の形成を阻害しなかった。対照的に、10mg/kg体重の中和抗体IgG1 005-C04による処置は、下垂体同系移植を受けた動物10匹中8匹において側枝形成の完全な阻害をもたらし、30mg/kgのIgG1 005-C04による処置は、下垂体同系移植を受けた動物9匹中9匹において、側枝形成を完全に阻害した。組織学的分析およびBrdU免疫染色を図15Bに図示する。下垂体同系移植が、非特異的抗体による処置では阻害されない上皮過形成をもたらすのに対して、用量10または30mg/kg体重の中和PRLR抗体で処置された下垂体同系移植片を保有するマウスでは、上皮過形成が起こらない。細胞周期のS期にあって分裂しようとしている細胞を反映するBrdU陽性細胞の一部を、図15Bでは白矢印で示す。中和抗体IgG1 005-C04(30mg/kg体重)で処置したマウスは、乳腺における上皮細胞増殖のほとんど完全な阻害を示した。図15CではホスホSTAT5に関して陽性な細胞の一部を白矢印で示す。30mg/kg IgG1 005-C04による処置は、STAT5リン酸化の完全な阻害をもたらすことから、PRLR媒介シグナリングの完全な阻止が示される。
中和PRLR抗体による良性前立腺過形成の処置
8週齢時に2つの下垂体を腎被膜下に移植することによって、雄Balb/cマウスにおいて、良性前立腺過形成を樹立した。対照群は無手術のままにしておいた。下垂体同系移植を受けたマウスを無処置のままにしておくか、非特異的抗体(10mg/kg)または用量10および30mg/kg体重のマウスIgG2a定常ドメインを含有する中和PRLR抗体005-C04(=IgG2a 005-C04)のいずれかを腹腔内注射した。抗体注射は下垂体移植の日(=0日目)に開始して、下垂体移植後3日目、7日目、11日目、15日目、18日目、22日目、および25日目に行った。28日目にマウスを屠殺した。腹側前立腺の相対重量を決定した。結果を図16に図示する。下垂体同系移植は相対的前立腺重量の増加をもたらした。10mg/kgおよび30mg/kgの中和PRLR抗体IgG2a 005-C04による処置が前立腺重量を低下させたのに対し、非特異的対照抗体による処置には何の効果もなかった。それゆえに中和PRLR抗体は良性前立腺過形成の処置に適している。
毛髪成長に対する中和PRLR抗体の効果
8週齢雄および雌C57BL/6マウスの背部毛髪を、既述のように、電気シェーバー(electric shawer)を使って除去した(British Journal of Dermatology 2008;159:300-305)。いくつかの群では、腎被膜下に下垂体同系移植を行うことにより、高プロラクチン血症を誘発し、残りの群の動物は正常プロラクチン血性とした。動物を特異的PRLR抗体(IgG2a 005-C04)または 非特異的対照抗体(30mg/kg、腹腔内)で週に1回処置した(下垂体同系移植の日である0日目から開始)。その後の抗体注射は7日目および14日目に行った。3週間後には、再成長した毛髪が、ピンクがかった白色の剃毛済み皮膚上に黒く見え、黒くなった剃毛区域の百分率を測定した。雌マウスは剃毛の15日後に屠殺し、雄マウスは剃毛の18日後に屠殺した。
1.剃毛した雌
2.下垂体同系移植を受けた、剃毛した雌
3.下垂体同系移植を受けた、剃毛した雌+週1回の30mg/kg非特異的抗体IgG2a 005-C04
4.下垂体同系移植を受けた、剃毛した雌+週1回の30mg/kg特異的抗体
5.剃毛した雌+週1回の30mg/kg非特異的抗体
6.剃毛した雌+週1回の30mg/kg特異的抗体
7.剃毛した雄
8.下垂体同系移植を受けた、剃毛した雄
9.下垂体同系移植を受けた、剃毛した雄+週1回の30mg/kg非特異的抗体
10.下垂体同系移植を受けた、剃毛した雄+週1回の30mg/kg特異的抗体IgG2a 005-C04
11.剃毛した雄+週1回の30mg/kg非特異的抗体
12.剃毛した雄+週1回の30mg/kg特異的抗体。
中和PRLR抗体による増進した乳腺上皮細胞増殖の阻害
併用ホルモン療法(すなわちエストロゲン+プロゲスチン療法)によって活性化された増進した乳腺上皮細胞増殖に対する中和PRLR抗体の効果を調べるために、子宮および乳腺における増殖効果の定量を可能にする既述のマウスモデルを使用した(Endocrinology 149:3952-3959, 2008)。6週齢のC57BL/6雌マウスに卵巣切除を行った。卵巣切除の2週間後に、動物を、2週間にわたって、媒体(エタノール/ラッカセイ油10%/90%)または100ngエストラジオール+100mg/kgプロゲステロンを毎日注射することによって皮下処置した。動物を、3週間にわたって、マウスIgG2aフォーマットの中和PRLR抗体(10mg/kgおよび30mg/kg)または非特異的抗体(30mg/kg)の腹腔内注射で、週に1回処置した。卵巣切除後36日目に剖検を行った。死亡の2時間前に、動物に、リン酸緩衝食塩水に溶解したブロモデオキシウリジン(BrdU)(70mg/kg体重)の腹腔内注射を行った。右鼠径部乳腺の近位(proximal)2/3を、既述(Endocrinology 149:3952-3959,2008)の乳腺上皮細胞増殖について、分析した(BrdU免疫染色)。
1.媒体で処置した卵巣切除動物
2.100ngエストラジオールで処置した卵巣切除動物
3.100ngエストラジオール(E)および100mg/kgプロゲステロン(P)で処置した卵巣切除動物
4.E+Pおよび10mg/kg特異的抗体005-C04で処置した卵巣切除動物
5.E+Pおよび30mg/kg特異的抗体005-C04で処置した卵巣切除動物
6.E2+Pおよび30mg/kg非特異的対照抗体で処置した卵巣切除動物。
中和PRLR抗体によるSHNマウスにおける子宮腺筋症(=内性子宮内膜症)の処置
子宮内膜症における中和PRLR抗体の効力を調べるために、全身性高プロラクチン血症に依拠する、SHNマウスにおける子宮腺筋症モデルを使用した(Acta anat. 116:46-54, 1983)。7週齢雌マウスの腎被膜下に下垂体同系移植を行うことにより、SHNマウスにおける高プロラクチン血症を誘導した(Acta anat. 116:46-54, 1983)。中和PRLR抗体(10mg/kgまたは30mg/kg)または非特異的抗体(30mg/kg)の腹腔内投与を、下垂体同系移植の1週間後から開始した。腺組織による子宮筋層の浸潤を既述のように評価した(Laboratory Animal Science 1998, 48:64-68)。抗体による処置は、9週間にわたり、週に1回および2回、腹腔内注射によって行った。剖検時(下垂体移植後70日目)に、子宮を緩衝4%ホルマリン中で終夜固定し、パラフィンに包埋した。腺筋症(=内性子宮内膜症)の度合を次のように評価した:
グレード0=腺筋症なし
グレード0.5=子宮筋層の内層がその同心的配向(concentric orientation)を緩める
グレード1=子宮内膜腺が子宮筋層の内層に侵入
グレード2=子宮筋層の内層と外層の間に子宮内膜腺
グレード3=子宮内膜腺が子宮筋層の外層に侵入
グレード4=子宮筋層の外層の外側に子宮内膜腺。
1.下垂体移植なしの動物、すなわち正常プロラクチン血性マウス
2.下垂体移植を受けた動物、すなわち高プロラクチン血性マウス
3.30m/kgの用量で1週間に1回、非特異的対照抗体で処置された、下垂体移植を受けた動物
4.30m/kgの用量で1週間に2回、非特異的対照抗体で処置された、下垂体移植を受けた動物
5.10m/kgの用量で1週間に1回、マウスIgG2aフォーマットの中和プロラクチン受容体抗体005-C04で処置された、下垂体移植を受けた動物
6.10m/kgの用量で1週間に2回、マウスIgG2aフォーマットの中和プロラクチン受容体抗体005-C04で処置された、下垂体移植を受けた動物
7.30m/kgの用量で1週間に1回、マウスIgG2aフォーマットの中和プロラクチン受容体抗体005-C04で処置された、下垂体移植を受けた動物
8.30m/kgの用量で1週間に2回、マウスIgG2aフォーマットの中和プロラクチン受容体抗体005-C04で処置された、下垂体移植を受けた動物。
抗体変異体の成熟化:
抗体アフィニティ成熟化は、飽和突然変異誘発、およびウェルベースのハイスループットスクリーニングが、アフィニティ増加をもたらす少数の変異を同定するために組み合わされる2段階プロセスである。BMC Biotechnology 7: 65, 2007によれば、アフィニティ成熟化の第1段階において、野生型抗体の位置的多様性がNNK-トリヌクレオチドカセット(ここで、Nは、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドそれぞれ25%混合物を表し、Kは、チミンおよびグアニンヌクレオチドそれぞれ50%混合物を表す)を用いる部位特異的突然変異誘発によって導入される。このようにして、全ての20アミノ酸が個々のアミノ酸位置に導入される。この位置的ランダム化は、6つの相補性決定領域(CDR)に限定している。アフィニティ成熟化の第2段階において、有益な置換が、再結合され、さらなる改良についてスクリーニングされる。
均一時間分解蛍光アッセイ(HTRF)による成熟006-H08 Fab変異体のスクリーニング:
正規化したE.coli-由来上清、および8nMのPRLRのビオチン化細胞外ドメインを、1nM ストレプトアビジン−ユーロピウムとともに、96ウェルマイクロタイタープレート中で30分間インキュベートした。その後、200mM KFおよび 50nM 006-H08のAlexa Fluor 647-標識IgG1を加えた。混合物を、室温でそれぞれ5、20、35、50、および65分間インキュベートした。所定の時点で、665nm(および620nm)での吸光度をEnVision MultilabelReader (Perkin Elmer)を用いて測定した。得られた結果を、図21に示す。
Claims (20)
- プロラクチン受容体の細胞外ドメインのエピトープまたはそのヒト多型変異体に結合し、プロラクチン受容体媒介シグナリングを拮抗する、抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントであって、プロラクチン受容体の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号70に対応し、
a.可変重鎖は、配列番号1、7および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24および29に対応するCDR配列を含有する、または
b.可変重鎖は、配列番号1、74および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号78、24および90に対応するCDR配列を含有する、または
c.可変重鎖は、配列番号1、75および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号82、24および91に対応するCDR配列を含有する、または
d.可変重鎖は、配列番号1、7および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号82、24および29に対応するCDR配列を含有する、または
e.可変重鎖は、配列番号1、7および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号86、24および29に対応するCDR配列を含有する、または
f.可変重鎖は、配列番号1、74および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号87、24および100に対応するCDR配列を含有する、または
g.可変重鎖は、配列番号1、74および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号87、24および92に対応するCDR配列を含有する、または
h.可変重鎖は、配列番号1、74および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号89、24および93に対応するCDR配列を含有する、または
i.可変重鎖は、配列番号1、74および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号79、24および101に対応するCDR配列を含有する、または
j.可変重鎖は、配列番号1、76および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号89、24および90に対応するCDR配列を含有する、または
k.可変重鎖は、配列番号1、7および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24および100に対応するCDR配列を含有する、または
l.可変重鎖は、配列番号1、7および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24および97に対応するCDR配列を含有する、または
m.可変重鎖は、配列番号1、7および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24および98に対応するCDR配列を含有する、または
n.可変重鎖は、配列番号1、74および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号83、24および99に対応するCDR配列を含有する、または
o.可変重鎖は、配列番号1、7および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24および96に対応するCDR配列を含有する、または
p.可変重鎖は、配列番号1、7および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24および94に対応するCDR配列を含有する、または
q.可変重鎖は、配列番号1、74および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号88、24および90に対応するCDR配列を含有する、または
r.可変重鎖は、配列番号1、74および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号81、24および95に対応するCDR配列を含有する、または
s.可変重鎖は、配列番号1、75および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24および29に対応するCDR配列を含有する、または
t.可変重鎖は、配列番号1、77および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号18、24および29に対応するCDR配列を含有する、または
u.可変重鎖は、配列番号1、7および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号80、24および29に対応するCDR配列を含有する、または
v.可変重鎖は、配列番号1、7および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号85、24および29に対応するCDR配列を含有する、または
w.可変重鎖は、配列番号1、7および13に対応するCDR配列を含有し、可変軽鎖は、配列番号84、24および29に対応するCDR配列を含有する、
抗体または抗原結合性フラグメント。 - 以下の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを含む、請求項1に記載の抗体または抗原結合性フラグメントであって、ここで、
a.配列番号34に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号40に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
b.配列番号143に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号165に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
c.配列番号144に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号166に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
d.配列番号145に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号167に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
e.配列番号146に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号168に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
f.配列番号147に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号169に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
g.配列番号148に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号170に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
h.配列番号149に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号171に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
i.配列番号150に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号172に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
j.配列番号151に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号173に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
k.配列番号152に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号174に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
l.配列番号153に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号175に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
m.配列番号154に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号176に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
n.配列番号155に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号177に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
o.配列番号156に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号178に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
p.配列番号157に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号179に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
q.配列番号158に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号180に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
r.配列番号159に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号181に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
s.配列番号160に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号182に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
t.配列番号161に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号183に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
u.配列番号162に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号184に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
v.配列番号163に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号185に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、または
w.配列番号164に記載のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメイン、および配列番号186に記載のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインを含む、
抗体または抗原結合性フラグメント。 - 請求項1または2に記載の抗体または抗原結合性フラグメントであって、ここで、該抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号70、および配列番号70のヒト多型変異体、アミノ酸位置1〜210によって表されるアミノ酸配列を有するプロラクチン受容体の1つ以上の領域に特異的に結合するか、または前記1つ以上の領域に対して高いアフィニティを有する抗原結合性領域を含み、ここで、該アフィニティは、少なくとも100nMである、抗体または抗原結合性フラグメント。
- 重鎖定常部が、修飾された、または無修飾のIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントをコードする、単離された核酸分子。
- 配列番号46、配列番号52、および配列番号331から配列番号374からなる群から選択される配列を含む、請求項5に記載の単離された核酸分子。
- 請求項5または6に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項7に記載のベクター、または請求項5もしくは6に記載の核酸分子を含む宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞は、高等真核宿主細胞、下等真核宿主細胞または原核細胞である、宿主細胞。
- 抗体または抗原結合性フラグメントを生産するために請求項8に記載の宿主細胞を使用する方法であって、請求項8に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養すること、および該抗体または抗原結合性フラグメントを回収することを含む方法。
- 少なくとも95重量%均一にまで精製された、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントを含む医薬。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントと、賦形剤または助剤を含む医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
- 容器に詰められた、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントの治療有効量を含むキットであって、前記キットは、第二の治療剤を含有してもよく、およびさらに、該容器に添付された、または該容器と共に包装されたラベルを含み、該ラベルは、該容器の内容物を記載し、子宮内膜症、腺筋症、良性乳房疾患および乳房痛、泌乳阻害、高および正常プロラクチン血性脱毛、良性前立腺過形成、類線維腫を処置するための、または非ホルモン雌性避妊に使用するための、または乳腺上皮細胞増殖を阻害する目的で併用ホルモン療法を受けている女性を処置するための、該容器の内容物の使用に関する表示および/または指示を与える、キット。
- 子宮内膜症および腺筋症を処置および/または防止するための、請求項11に記載の医薬。
- 良性乳房疾患および乳房痛を処置するための、請求項11に記載の医薬。
- 泌乳を阻害するための、請求項11に記載の医薬。
- 良性前立腺過形成を処置するための、請求項11に記載の医薬。
- 高および正常プロラクチン血性脱毛を処置するための、請求項11に記載の医薬。
- 非経口投与用の、請求項11、14〜18のいずれか1項に記載の医薬。
- 少なくとも1つの他の薬剤と組み合わせて、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントを含む、請求項12に記載の医薬組成物。
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