JP2005526493A

JP2005526493A - 哺乳動物プロラクチンの変型体

Info

Publication number: JP2005526493A
Application number: JP2003558043A
Authority: JP
Inventors: ゴッフィン，ヴィンセント; ベルニクテイン，ソフィー; ケリー，ポール，エー．
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2002-01-08
Filing date: 2003-01-08
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2023-01-08
Also published as: JP4324477B2; EP1325930A1; CN100358919C; MXPA04006676A; CN1628128A; US20060277614A1; CA2472647A1; US7785838B2; EP1463758B1; EP1463758A2; ES2323233T3; AU2003215539B2; WO2003057729A2; DE60326430D1; CA2472647C; WO2003057729A3; AU2003215539A1; ATE424411T1

Abstract

本発明は、Ｎ末端の１４アミノ酸内の変異または変異のセットであって、Ｃｙｓ４とＣｙｓ１１との間のジスルフィドブリッジの形成を防止する変異または変異のセットと、ＰＲＬの結合部位２内に立体障害を起こす変異または変異のセットとを有する哺乳動物プロラクチン（ＰＲＬ）変型体に関する。これらの変型体は、哺乳動物プロラクチンレセプター（ＰＲＬＲ）の、特にヒトプロラクチンレセプター（ｈＰＲＬＲ）のアンタゴニストとして有用である。

Description

本発明は、哺乳動物プロラクチン（ＰＲＬ）の変型体に、そして哺乳動物プロラクチンレセプター（ＰＲＬＲ）の、より具体的にはヒトプロラクチンレセプター（ｈＰＲＬＲ）のアンタゴニストとしてのその使用に関する。

プロラクチンは、幅広いスペクトルの生物学的活性、とりわけ乳汁分泌および生殖に関する生物学的活性に関与する下垂体前葉ホルモンである（BOLE-FEYSOTら、Endocr. Rev.、19、225〜268、1998）。

標的組織に対するＰＲＬの作用は、サイトカインレセプタースーパーファミリーに属する（KELLYら、Endocr. Rev.、12、235-251、1991）特定の膜結合レセプターであるプロラクチンレセプター（ＰＲＬＲ）によって媒介される。

最近数年で、いくつかの研究により、ＰＲＬは、乳房上皮細胞（GINSBURGおよびVONDERHAAR、Cancer Res.、55、2591〜2595、1995）または前立腺（NEVALAINENら、J. Clin. Invest.、99、618〜627、1997）のような下垂体外の部位においても合成されることが証明された（総説として、BEN-JONATHANら、Endocr. Rev.、17、639〜669、1996を参照）。加えて、このホルモンが、オートクリン／パラクリンループを介して、（ＰＲＬＲを発現する）これらの細胞に対して増殖作用を発揮することが示された(GINSBURGおよびVONDERHAAR、Cancer Res.、55、2591〜2595、1995；MERSHONら、Endocrinology、136、3619〜3623、1995；CLEVENGERおよびPLANK、J. Mammary Gland. Biol. Neopl.、2、59〜68、1997)。さらに、正常条件下でいくつかの標的組織に対してＰＲＬにより発揮される増殖促進活性が、病的条件下での腫瘍増殖の促進にいくらか関与する可能性が示唆されている。ＰＲＬのこの腫瘍促進作用を支持する実験的証明は、ｉ）ＰＲＬトランスジェニックマウスにおける自然発症性胸部腫瘍の出現遅延の短縮（WENNBOら、J. Clin. Invest.、100、2744〜2751、1997）、ｉｉ）これとは対照的に、ＰＲＬノックアウトマウスにおける中型Ｔ抗原誘導胸部腫瘍の出現遅延（VOMACHKAら、Oncogene、19、1077〜1084、2000）、またはｉｉｉ）ＰＲＬトランスジェニックマウスにおいて観察される広範な前立腺過形成（WENNBOら、Endocrinology、138、4410〜4415、1997）である。

ドーパミンアゴニストを使用して胸部腫瘍の進行を減少させる臨床的処置の失敗（MANNIら、Breast Cancer Res. Treat.、14、289〜298、1989）のため、ＰＲＬは、長らく、ヒト胸部ガンにおいて軽微な役割を演じるものと考えられてきた。しかし、ドーパミンアゴニストは、（現在では、これらの腫瘍増殖現象において、下垂体により分泌された循環性ＰＲＬと、少なくとも同程度に重要とみられている）下垂体外ＰＲＬ合成を標的とすることができない。レセプター結合について野生型プロラクチン（ＷＴ−ＰＲＬ）と競合することはできるが、下流のシグナリング経路をトリガーすることはできないＰＲＬＲアンタゴニストを開発することが、胸部ガンおよび前立腺過形成のような病状に関与する可能性を有するＰＲＬ誘導腫瘍増殖を防止するかまたは少なくとも減少させるための代替戦略であるように思われる（GOFFINら、Mol. Cell. Endocrinol.、151、79〜87、1999）。Ｇ１２０Ｋ−ｈＧＨのような増殖ホルモン（ＧＨ）のアナログは、ＰＲＬＲに拮抗すると報告された（GOFFINら、Endocrino.、1999）が、これらのアナログはまた、ＧＨレセプター（ＧＨＲ）に拮抗する。この標的二重性は、治療上不適切であることもあるので、ＰＲＬＲを特異的に標的とする（しかしＧＨＲを標的としない）アンタゴニストの開発が始まった。

以前、本発明者らは、このホルモン上の２つの結合部位（結合部位１および２と呼ばれる）を同定し、位置決定し、そして特徴付けし、連続ホモ二量体化によるＰＲＬＲ活性化のモデルを提唱した（GOFFINら、Endocr. Rev.、17、385〜410、1996）。

これらのデータに基づき、本発明者らは、ヒトＰＲＬ（ｈＰＲＬ）の結合部位２内に立体障害を起こす変異を導入し、これによりこの領域がＰＲＬＲ分子と効率的にドッキングすることを防止することによって、第一世代のヒトプロラクチンレセプター（ｈＰＲＬＲ）アンタゴニストを設計した（GOFFINら、J. Biol. Chem.、271、16573〜16579、1996）。これらのアナログの１つ（Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬと呼ばれる）では、（部位２に属する）グリシン１２９がアルギニンに置換されており、このことによって期待された立体障害が生じる（GOFFINら、J. Biol. Chem.、271、16573〜16579、1996；GOFFINら、J. Biol. Chem.、269、32598〜32606、1994）。

本発明者らは、おそらくレセプターの二量体化が損なわれるので、このｈＰＲＬ変異体は、もはやＰＲＬＲを活性化することができず、したがって、アンタゴニストとして作用することを、いくつかのバイオアッセイにおいて示した。これらの特性は、まず、ヒトまたはラットのＰＲＬＲによるＰＲＬ応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を含むバイオアッセイにおいて（GOFFINら、J. Biol. Chem.、271、16573〜16579、1996）、次に、種々のヒト胸部ガン細胞株における増殖およびシグナリング経路の活性化に対して（LLOVERAら、Oncogene、19、4695〜4705、2000）証明された。

しかし、１０倍低い（１／１０の）アフィニティーのため、効率的なアンタゴニスト効果には、アナログをＷＴ−ｈＰＲＬに対して顕著なモル過剰（１０：１〜５０：１）で使用することが必要であった。加えて、古典的なラットＮｂ２細胞増殖バイオアッセイのようなより高感度のバイオアッセイでは、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬは、アンタゴニスト活性を示すことができず（GOFFINら、J. Biol. Chem.、269、32598〜32606、1994）、むしろ、ｈＰＲＬより高い濃度では完全な活性を示す、弱いアゴニストとして作用した。Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬのこの残存するアゴニスト活性は、本発明者らにより、別の増殖アッセイ（ｈＰＲＬＲをコードするプラスミドをトランスフェクトされたＢａ／Ｆ３細胞）を使用してインビトロで、そしてＧ１２９Ｒ−ｈＰＲＬアナログを発現するトランスジェニックマウスにおいてインビボで確認された。すなわち、ＰＲＬＲ欠損マウスは不妊であり正常な乳腺を発達させない（ORMANDYら、Genes Dev.、11、167〜178、1997）が、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬアナログを発現するマウスは、生殖欠損を示さず、そして問題なく乳汁を分泌する。このことにより、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬは、インビボで、ＰＲＬに媒介される作用を消失させないことが明確に示される。

これらのデータにより、ｉ）結合部位２内に立体障害を起こす変異（Ｇ１２９Ｒ変異）の導入は、ＰＲＬの生物学的特性を変化させ、いくつかの同種の（ヒトＰＲＬＲにより媒介される）バイオアッセイでは、アンタゴニスト特性を生じること、ｉｉ）しかし、より高感度のバイオアッセイでは、そしてトランスジェニックマウスにおいても同様に、アンタゴニスト特性よりＧ１２９Ｒ−ｈＰＲＬの残存する本来のアゴニスト活性が優勢になるので、この変異はレセプター二量体化を完全には防止しないことが明確に証明される。

このように、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬは、アンタゴニストから期待される効果とは反対の効果を発揮することがあるので、プロラクチンレセプターの純粋なアンタゴニストとして治療上使用することはできない。

本発明者らは、より効率的なｈＰＲＬＲアンタゴニストを開発することを企図してきた。本発明者らは、以前、ＰＲＬＲとの結合にｈＰＲＬのＮ末端テイルが関与する可能性を研究した。本発明者らは、ｈＰＲＬにおいて、最初の９残基を除去したものから最初の１４残基を除去したものまで、Ｎ末端を繰り返して欠失させる操作を行なった。野生型ｈＰＲＬおよびｈＧＨのＮ末端配列ならびにｈＰＲＬの欠失変異体のＮ末端配列を図１に示す。

図１の説明：上：ＰＲＬ（配列番号１）およびＧＨ（配列番号２）のＮ末端配列を整列させた。Ｎ末端は、ＰＲＬにおいて９残基ほど長く、Ｃｙｓ₄とＣｙｓ₁₁との間にジスルフィド結合を含む。矢印は、相同性モデリングにより推測される推定のヘリックス１を同定する。下：ｈＰＲＬのＮ末端の漸増欠失（incremental deletions）。最初の９残基の欠失（Δ１−９−ｈＰＲＬ）はｈＧＨのＮ末端を模倣する一方、最初の１４残基の欠失（Δ１−１４−ｈＰＲＬ）はＮ末端を全体的に除去している。

本発明者らは、ｈＰＲＬの最初の９残基の欠失（Δ１−９−ｈＰＲＬ）が、ＰＲＬＲに対するアフィニティーをわずかに上昇させ、ルシフェラーゼアッセイにおいて、野生型ｈＰＲＬ（ＷＴｈＰＲＬ）と比べて増大した最大活性を導いた一方で、最初の１４残基の欠失（Δ１−１４−ｈＰＲＬ）は、アフィニティーおよび最大活性の減少を生じることを観察した（Endocrine Society 82^nd Annual Meeting, Toronto, June 21-24 2000, Abstract 613）。

本発明者らは、そこで、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬアナログのアフィニティーおよびアンタゴニスト活性に対するＮ末端欠失の効果を試験することを企図した。したがって、本発明者らは、最初の９残基の除去（変異体Δ１−９−ｈＰＲＬ）および最初の１４残基の除去（変異体Δ１−１４−ｈＰＲＬ）により、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬに２つのＮ末端欠失を作製した。

本発明者らは、予期せずに、両方の変異が、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬの残存するアゴニスト活性を完全に消失させたことを見出した。

理論によって制限されないのではあるが、これらのＮ末端欠失は、Ｃｙｓ₄とＣｙｓ₁₁との間のジスルフィドブリッジの形成を害し、そしてこのジスルフィドブリッジの形成を防止する他の変異もまた、残存するアゴニスト活性に対する有利な効果を有すると考えられる。

したがって、本発明は、哺乳動物プロラクチンレセプターのアンタゴニストを提供する。ここで、このアンタゴニストは、以下の変異：
ａ）Ｎ末端の１４アミノ酸内の変異または変異のセットであって、Ｃｙｓ₄とＣｙｓ₁₁との間のジスルフィドブリッジの形成を防止する、変異または変異のセット、および
ｂ）プロラクチンの結合部位２内に立体障害を起こす変異または変異のセット
を有する、哺乳動物プロラクチンの変型体である。

Ｃｙｓ₄−Ｃｙｓ₁₁ジスルフィドブリッジの形成を害する変異ａ）は、例えば、Ｃｙｓ₄および／またはＣｙｓ₁₁を含む欠失、あるいはシステイン以外のアミノ酸によるＣｙｓ₄および／またはＣｙｓ₁₁の置換を含む。

変異ｂ）は、具体的には、立体障害を導入するために、大きなそして／または荷電したアミノ酸によって、ＰＲＬの結合部位２内の小さなアミノ酸を置換することを含む。このような変異の例は、例えば、Ｇｌｎ₁₂₂、Ｌｅｕ₁₂₅、Ｓｅｒ₂₆、Ａｌａ₂₂、またはＧｌｙ₁₂₉のうちの少なくとも１つの残基（好ましくはＡｌａ₂₂、より好ましくはＧｌｙ₁₂₉）を、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＴｒｐのような残基（好ましくは、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＴｒｐ）によって置換することである。

本発明の好適な実施形態によれば、変異ａ）は、ＰＲＬのＮ末端の少なくとも４残基の欠失、好ましくはＮ末端の少なくとも９残基の欠失を含む。

Ｎ末端欠失が１１アミノ酸より短い場合、変異ａ）は、システイン以外のアミノ酸によるＣｙｓ₁₁残基の置換をさらに含んでもよい。このことが、遊離ＳＨ基の存在から生じることがある凝集を回避することによって、変型体のより容易な精製を可能にする。

本発明の好適なＰＲＬ変型体は、以下の変異：
−Ｎ末端の少なくとも９残基の欠失であって、Ｎ末端の１４残基までの欠失、および
−Ｇ１２９Ｒ置換
を含む変型体である。

有利には、本発明の変型体は、ヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）の変型体である。

本発明はまた、本発明のＰＲＬ変型体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

本発明のポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術の周知の方法および／または化学ＤＮＡ合成の周知の方法によって取得してもよい。これらの方法はまた、天然のＤＮＡ配列に所望の変異を導入することを可能にする。

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物（例えば、ポリヌクレオチドが適切な制御配列に連結されて、宿主細胞における転写および翻訳の調節が可能である発現カセット、および本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含む組換えベクター）を提供する。

これらの組換えＤＮＡ構築物は、組換えＤＮＡおよび遺伝子操作の周知技術によって、宿主細胞において取得可能であり、そして宿主細胞に導入可能である。

本発明はまた、本発明のＰＲＬ変型体をコードするポリヌクレオチドによって形質転換された真核または原核の宿主細胞を含む。

本発明のＰＲＬ変型体は、そのＰＲＬ変型体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、その発現に適切な条件下で培養し、そしてその宿主細胞培養物から変型体を回収することによって取得することができる。

本発明はまた、本発明のＰＲＬ変型体をコードするポリヌクレオチドで形質転換されたトランスジェニック非ヒト動物、特に、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。トランスジェニック動物の調製に適切な方法は、例えば、Manipulating the Mouse Embryo、第2版、HOGANらによる、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1994；Transgenic Animal Technology、C. PINKERT編、Academic Press Inc.、1994；Gene Targeting: A Practical Approach、A.L. JOYNER編、Oxford University Press、1995；Strategies in Transgenic Animal Science、G.M. MONASTERSKYおよびJ.M. ROBL編、ASM Press、1995；Mouse Genetics: Concepts and Applications、Lee M. SILVERによる、Oxford University Press、1995に開示されている。

本発明はまた、本発明のＰＲＬ変型体またはＰＲＬ変型体をコードするポリヌクレオチドを含む治療組成物であって、必要に応じて適切なキャリアおよび／または賦形剤と混合された、治療組成物に関する。

例えば、本発明のＰＲＬ変型体はさらに、その分子量を増加させるために、１以上の化学基に共役させることができる。適切な化学基の例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリオール、または異種ポリペプチド、好ましくは水溶性ポリペプチド（例えば、血清アルブミンまたはそのフラグメント）が含まれる。

本発明の治療組成物は、特に、ＰＲＬＲにより媒介される効果を含む疾患、例えば、任意のＰＲＬ標的組織（胸、前立腺、肝臓、下垂体、リンパ球）における任意の形態の良性または悪性の腫瘍（過形成、異形成、新形成、アデノーマ、カルシノーマ）を含む腫瘍増殖、自己免疫疾患（エリテマトーデス、慢性関節リウマチ）、高プロラクチン血症、典型的には、ＰＲＬＲの過剰刺激から生じる任意の疾患（過剰乳房、生殖障害）（BOLE-FEYSOTら、Endocr. Rev.、1998）を処置または防止するためのＰＲＬＲアンタゴニストとして有用である。

本発明の治療組成物は種々の方法で投与することができる。

これらの治療組成物は、全身的または局所的に使用することができる。好適な投与経路は非経口経路であり、これには、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内、または局所腫瘍内注射が含まれる。

組成物が、経口投与に適切で、活性主剤を胃および腸の酵素から保護することが可能な剤型であれば、経口経路もまた使用することができる。

治療組成物が本発明のＰＲＬ変型体をコードするポリヌクレオチドを含む場合、そのヌクレオチドは、一般に、標的の器官または組織における発現を可能にする発現カセットに挿入される。

発現カセットは、裸のＤＮＡとして細胞に直接移入されるか、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス由来ベクター）のような適切なベクター中に配置されることができる。

遺伝子導入は、処置すべき患者から取り出した細胞においてエクスビボで行い、その後、患者に再移植することができ、あるいは患者に核酸を直接投与することによって行うこともできる。

導入方法および／またはベクターの選択は、標的の器官または組織に依存し、そして／または短時間の発現（一過性発現）とより安定な発現とのいずれが望ましいかに依存する。

本発明のＰＲＬ変型体は、ＰＲＬレセプターに対してネイティブのＰＲＬより低いアフィニティーを有するので、投与量は、血液および／または標的組織において内因性ＰＲＬより大過剰のＰＲＬ変型体を供給するために選択される。他方、本発明のＰＲＬ変型体は残存するアゴニスト活性がないため、望まないアゴニスト効果の危険を有することなく、高用量を投与することができる。ほとんどの場合、内因性ＰＲＬより１０〜１００倍過剰を結果的に生じるＰＲＬ変型体の量が適切である。必要であれば、内因性ＰＲＬより１０００倍以上の過剰を結果的に生じるＰＲＬ変型体の量を投与することもできる。

本発明を以下の追加記載によってさらに説明する。以下の記載は、本発明のｈＰＲＬアンタゴニスト特性を説明する実施例に言及する。しかし、これらの実施例は、本発明の例示のためにのみ提供され、いかなる方法でも本発明の限定を構成するものではないことを理解すべきである。

実施例１：ｈＰＲＬアナログの作製および精製
ホルモン
本研究に使用した以下のすべてのＰＲＬ（野生型形態および変異体形態）を、組換え技術により生産した：ＷＴｈＰＲＬ、結合部位２アナログＧ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ（Ｇｌｙ１２９をＡｒｇに置換）、単一Ｎ末端欠失変異（Δ１−９−ｈＰＲＬ、Δ１−１０−ｈＰＲＬ、Δ１−１１−ｈＰＲＬ、Δ１−１２−ｈＰＲＬ、Δ１−１３−ｈＰＲＬ、Δ１−１４−ｈＰＲＬ）、Δ１−９−ｈＰＲＬまたはΔ１−１４−ｈＰＲＬに変異Ｇ１２９Ｒを導入した二重変異体（Δ１−９−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬおよびΔ１−１４−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬアナログを生じる）。

変異ｈＰＲＬ発現ベクターの構築
Ｎ末端欠失
構築
Δ１−９−ｈＰＲＬ、Δ１−１０−ｈＰＲＬ、Δ１−１１−ｈＰＲＬ、Δ１−１２−ｈＰＲＬ、Δ１−１３−ｈＰＲＬ、およびΔ１−１４−ｈＰＲＬアナログをコードする発現プラスミドの構築を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行なった。プラスミドｐＴ７Ｌ−ｈＰＲＬ（PARISら、Biotechnol. Appl. Biochem.、12、436〜449、1990）を、テンプレートとして使用した。５’プライマーの配列は、Ｎ末端の９コドンを欠失したｈＰＲＬｃＤＮＡ（Δ１−９−ｈＰＲＬ）からＮ末端の１４コドンを欠失したｈＰＲＬｃＤＮＡ（Δ１−１４−ｈＰＲＬ）の５’配列に対応する。ＡＴＧコドン（メチオニン開始配列）を含む独特なＮｄｅＩ制限部位（ＣＡＴＡＴＧ）を、５’プライマーに挿入した。Ｃｙｓ１１をコードするＴＧＣコドンを、セリンをコードするＴＣＣに変異させた。５’プライマーの配列は以下のとおりである（５’→３’）：
Δ１−９（配列番号３）：GGCATATGCGATCCCAGGTGACCCTTCG
Δ１−１０（配列番号４）：GGCATATGTCCCAGGTGACCCTTCGAG
Δ１−１１（配列番号５）：GGCATATGCAGGTGACCCTTCGAGACC
Δ１−１２（配列番号６）：GGCATATGGTGACCCTTCGAGACCTGTT
Δ１−１３（配列番号７）：GGCATATGACCCTTCGAGACCTGTTTG
Δ１−１４（配列番号８）：GGCATATGCTTCGAGACCTGTTTGACC

３’プライマーはすべてのアナログについて同一であり、独特なＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の３’側に位置する、ｈＰＲＬｃＤＮＡの非コード領域内の配列に対応する（配列番号９）：^5'CTGTTACACCCACGCATGG^3'。

ＰＲＣ反応を以下のとおり行なった：２００μＭのｄＮＴＰ、４５μＭのＭｇＣｌ₂、１．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（５ｕ／μｌ）、ＰＣＲ緩衝液、１０ｎｇのテンプレート（プラスミドｐＴ７Ｌ−ｈＰＲＬ）、２０ピコモルの各プライマー。ＰＣＲを２５サイクル実行した：９４℃（３０秒）、５６℃（３０秒）、７２℃（１分）。ＰＣＲ生成物を、ＴＡクローニングベクターにサブクローニングし（pCR II.1）、次いで、組換えＴＡプラスミドを、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して消化し、そして精製したインサートを、同じ制限酵素を使用して直線化したｐＴ７Ｌプラスミドに連結した。形質転換の後、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）コロニーを、ＤＮＡ含有量について分析した。プラスミドを抽出しそして消化して、予想されたインサートの存在を確認し、次いで、配列決定して、期待された変異を照合した。

タンパク質の作製および精製
組換えＷＴｈＰＲＬおよびｈＰＲＬアナログを、以前に記載された（PARISら、Biotechnol. Appl. Biochem.、12、436〜449、1990；GOFFINら、Mol. Endocrinol.、6、1381〜1392、1992）ようにして、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ）の１リットル培養物において過剰発現させそして精製した。簡潔に述べると、細菌培養物のＯＤ₆₀₀が約０．９に達したときに、２ｍＭイソプロピルチオールガラクトシド（ＩＰＴＧ）を４時間使用して過剰発現を誘発した（４時間後ＯＤ₆₀₀が約２．５）。細胞粉砕機（cell disintegrator：Basic Z、Cell D、Roquemaure、France）を使用して、細胞溶解を行なった。タンパク質を不溶性封入体として過剰発現させ、不溶性封入体を８Ｍ尿素に溶解し（５５℃にて５分間、次いで室温にて２時間）、そして５０ｍＭのＮＨ₄ＨＣＯ₃（ｐＨ８）に対する連続透析（７２時間、４℃）によってタンパク質をリフォールディングさせた。

AMERSHAM-PHARMACIA BIOTECH（Orsay, France）から購入したクロマトグラフィー装置（GRADIFRAC）およびカラム（HITRAP Q SEPHAROSE, SEPHACRYL S200 High Resolution）を使用して、タンパク質の精製を行なった。

選択し得る２つのプロトコルを使用した。透析したタンパク質を少なくとも６０分間遠心分離して（９０００×ｇ）、凝集体を除去し、その後、明澄化した上清混合物を、陽イオン交換ＨＩＴＲＡＰＱカラム（５０ｍＭのＮＨ₄ＣＯ₃、ｐＨ８で平衡化したもの）にロードした。ＰＲＬが２つのピークに溶出した。大きなピークは、１５０ｍＭＮａＣｌの濃度にて溶出し、小さなピークは、より高い塩濃度（約２００ｍＭ）にて溶出した。これらの画分の分析ゲル濾過により、大きなピークは単量体ＰＲＬに相当し、小さなピークは種々の多量体形態を含むことが示された。代わりに、リフォールディングした（透析した）タンパク質を、YM10 MINIPLATE バイオ濃縮機（bioconcentrator）（MILLIPORE CORP.-AMICON, Bedford, MA；流速５００ｍｌ／分）を使用する接線フロー限界濾過により濃縮し、次いで、濃縮した溶液を遠心分離して（１０分間、９０００×ｇ）、限界濾過の際に生成した凝集体を除去した。５０ｍＭのＮＨ₄ＨＣＯ₃、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８）で平衡化した高解像度SEPHACRYL S-200カラムを使用するゲル濾過クロマトグラフィーによって、上清を精製した。この第２のプロトコルでは、通常、限外濾過工程の際のタンパク質沈降率が高いため、収率は低くなる。単量体ｈＰＲＬに相当する（分子ふるいまたは陽イオン交換カラムから溶出した）画分を、プールし、定量し、アリコートに分け、そして−２０℃にて保存した。

還元（β−メルカプトエタノール）条件下または非還元条件下にて、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、タンパク質のサイズおよび精製度を評価した。タンパク質画分を、参照としてＢＳＡを使用するＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（BIO-RAD Laboratories, Inc., Ivry-sur-Seine, France）により定量した。

二重変異体
ｐＴ７Ｌ−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬプラスミド（Ｇ１２９Ｒ変異を含む）（GOFFINら、J. Biol. Chem.、269、32598〜32606、1994）由来のＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを、ｐＴ７Ｌ−Δ１−９−ｈＰＲＬおよびｐＴ７Ｌ−Δ１−１４−ｈＰＲＬ発現ベクター中の対応するＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントと置換することによって、アナログΔ１−９−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬおよびΔ１−１４−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬをコードする発現プラスミドを構築した。インサートの存在について、得られたクローンを分析し、次いで、配列決定して、期待された変異を照合した。ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌を使用するアナログ発現およびタンパク質精製を上記のように行なった。

細菌中に封入体として生成されたすべてのｈＰＲＬ変異体は、正確にリフォールディングした。このことにより、この種々の変異は、タンパク質の全体的な立体構造を乱さないことが示唆される。このことは、円二色性により行なわれた二次構造中の含有量分析によって確認された（図示せず）。変異ｈＰＲＬとＷＴｈＰＲＬとの間で唯一繰り返された差異は、Ｎ末端の欠失が、タンパク質のリフォールディング後に観察した単量体／多量体の比を増大させる傾向にあったことである。２つのＮ末端システイン（Ｃｙｓ４−Ｃｙｓ１１）の除去は、これら残基間の分子間ジスルフィド結合の原因である共有多量体の形成を防止すると考えられる。

実施例２：ヒトＰＲＬＲに対するｈＰＲＬアナログのアフィニティー
結合研究
ヒトＰＲＬＲに対する種々のｈＰＲＬアナログのアフィニティーを、このレセプターとの結合について［¹²⁵Ｉ］―ｈＰＲＬと競合する能力によって推定した。以前に記載された手順（KINETら、J. Biol. Chem.、274、26033〜26043、1999）に従って、（ヒトＰＲＬＲを発現する）ＨＬ５細胞の細胞ホモジネートを使用して結合アフィニティーを決定した。

簡潔に述べると、ＩＯＤＯＧＥＮを使用してｈＰＲＬにヨウ素付加した。その比活性は、４０〜５０μＣｉ／μｇの範囲であった。３０，０００ｃｐｍの［¹²⁵Ｉ］−ｈＰＲＬおよび漸増濃度（increasing concentrations）の非標識競合物（ＷＴまたは変異ｈＰＲＬ）の存在下で、１５０〜３００μｇの細胞ホモジネートタンパク質を使用して、結合アッセイを室温にて一晩行なった。

スキャッチャード分析により算出される（ＨＬ５細胞ホモジネートを使用する）ヒトＰＲＬＲに対するＷＴｈＰＲＬのアフィニティーは、３．４（±１．３）×１０^-10ＭのＫｄを示した（KINETら、J. Biol. Chem.、1999）。

単一Ｎ末端ｈＰＲＬ変異体の結合アッセイ
ｈＰＲＬアナログの相対的結合アフィニティーを、競合曲線から算出される（Ｓ字の直線部分に回帰）ＷＴｈＰＲＬのＩＣ₅₀に対するそのＩＣ₅₀の比として算出した。図２Ａに示された結果は、二連で（in duplicate）行なった少なくとも３つの独立した実験の代表である。

これらの結果は次のことを示す。すなわち、最初の１０、１１、１２、または１３残基の欠失は、そのレセプターに対するｈＰＲＬのアフィニティーに影響しない（競合曲線が重なり合った）が、Δ１−９−ｈＰＲＬを用いて得られた曲線は、ＷＴｈＰＲＬと比較して左にわずかに移動した。このことは、アフィニティーが２０％ほどわずかに増大したことを示す。他方で、Δ１−１４−ｈＰＲＬの曲線は右に移動した。これは２〜３倍低い（１／２〜１／３の）アフィニティー（４０％の相対アフィニティー）を反映する。

Ｇ１２９Ｒを含む変異体の結合アッセイ
Ｇｌｙ１２９→Ａｒｇ変異を含む３つのアナログを用いて得られた代表的な競合曲線を、図２Ｂに示す。ＷＴｈＰＲＬ（−●−）；単一変異体Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ（−◆−）；二重変異体Δ１−９−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ（−■−）；二重変異体Δ１−１４−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ（−▲−）。

３つの曲線は、ＷＴｈＰＲＬと比較して、ほぼ１オーダーほど右に移動している。このことは、レセプターについての１０倍低い（１／１０の）アフィニティーを反映する。３つの独立した実験を平均すると、ＩＣ₅₀は、（ＷＴｈＰＲＬの）１８±５ｎｇ／ｍｌと比較して、Δ１−９−Ｇ１２９Ｒについては１６６±４７ｎｇ／ｍｌであり、Δ１−１４−Ｇ１２９Ｒについては１８７±４９ｎｇ／ｍｌであった。いずれのＮ末端欠失も、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ（単一変異体）と比較して、アフィニティーを向上させない。

実施例３：ｈＰＲＬアナログの生物活性
実験プロトコル
Ｎｂ２細胞増殖アッセイ
乳腺刺激ホルモンについての参照バイオアッセイは、ラットＮｂ２リンパ腫細胞のラクトゲン誘導増殖である。ラットＮｂ２リンパ腫細胞を、Ｐ．Ｗ．ＧＯＵＴ（Vancouver, Canada）から入手し、そして以前（BERNICHTEINら、Endocrinology、142、3950〜3963、2001）に記載されたようにして培養した。１０％ＨＳと、１０％熱不活化ＦＣＳと、２ｍＭグルタミンと、５０Ｕ／ｍｌペニシリンと、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンと、１００ｍＭのβ―メルカプトエタノールとを補充したＲＰＭＩ１６４０中でＮｂ２細胞を慣用手法に従って維持した。最初（TANAKAら、J. Clin. Endocrinol. Metab.、51、1058〜1063、1980）に記載されたように、しかし僅かに改変して（BERNICHTEINら、Endocrinology、142、3950〜3963、2001）、増殖アッセイを行なった。簡潔に述べると、ホルモンを含む２００μｌの最終容量で、開始日に２×１０⁴細胞／ウェルを使用して、９６ウェルプレートにおいてアッセイを行なった。１０μｌのＷＳＴ−１テトラゾリウム塩（ROCHE, Meylan, France）を添加してホルモン刺激した３日後に、細胞増殖を評価した。この生存試薬（survival reagent）は、生存細胞のミトコンドリアによって代謝される。このことから、血球計によりカウントされる細胞数に比例して（BERNICHTEINら、Endocrinology、142、3950〜3963、2001）、４５０ｎｍにて測定されるＯＤ（ＯＤ₄₅₀）が増加することが導かれる。三連または四連で（in triplicate or quadruplicate）少なくとも３回、この実験を行なった。

ヒトＰＲＬＲ転写バイオアッセイ（ＨＬ５）
クローンＨＬ５は、ヒトＰＲＬＲおよび（ＳＴＡＴ５のＤＮＡ結合エレメントである（KINETら、J. Biol. Chem.、274、26033〜26043、1999）乳腺刺激ホルモン応答エレメント（ＬＨＲＥ）の６反復配列の制御下に、ルシフェラーゼ遺伝子をコードする配列を含む）ＰＲＬ応答性レポーター遺伝子をコードするプラスミドで安定にトランスフェクトされた２９３ＨＥＫ線維芽細胞である。

１０％ＦＣＳと、２ｍＭグルタミンと、５０Ｕ／ｍｌペニシリンと、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンと、７００μｇ／ｍｌのＧ−４１８（クローン選択）とを補充したＤＭＥＭ−ＮｕｔＦ１２培地中でＨＬ５クローンを慣用手法に従って培養した。９６ウェルプレートにおいて、０．５％ＦＣＳのみを含む培地中で５×１０⁴細胞／１００μｌ／ウェルを使用してアッセイを行なった。細胞を一晩接着させ、次いでＦＣＳを含まない培地に希釈した１００μｌのホルモンを各ウェルに添加した。刺激の２４時間後、細胞を溶解させ（５０μｌの溶解緩衝液）、次いで１５μｌの細胞溶解物に含まれるルシフェラーゼ活性を、１０秒間カウントした（BERNICHTEINら、Endocrinology、142、3950〜3963、2001；KINETら、J. Biol. Chem.、274、26033〜26043、1999）。アッセイ間の変動を回避するため、比較するすべてのアナログを、同じ実験において系統的に試験した。アゴニスト作用実験において、１００μｌの試験すべき［２×］ホルモン（「２×」は、必要な最終濃度と比較して２倍に濃縮されていることを示す）を添加する。アンタゴニスト作用実験において、（１μｇ／ｍｌの最終濃度を得るために）５０μｌの［４×］ホルモンアナログを５０μｌの［４×］ＷＴｈＰＲＬと組み合わせた混合物を添加した。

Ｂａ／Ｆ３−ｈＰＲＬＲ細胞増殖バイオアッセイ
Ｂａ／Ｆ３細胞は、増殖についてインターロイキン−３（ＩＬ−３）要求性のマウスｐｒｏ−Ｂリンパ系細胞である。ｈＰＲＬＲをコードするプラスミドを使用するトランスフェクションおよびＧ−４１８処理と増殖培地中のＩＬ−３のｈＰＲＬへの置換とを含む二重選択の後、Ｂａ／Ｆ３−ｈＰＲＬＲ細胞を得た。ｈＰＲＬＲをコードするプラスミドを使用して、細胞をトランスフェクトし（エレクトロポレーション）、そしてレセプターを安定に発現する集団を、Ｇ−４１８処理後に選択した。１０％熱不活化ＦＣＳと、２ｍＭグルタミンと、５０Ｕ／ｍｌペニシリンと、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンと、５００〜１０００μｇ／ｍｌのＧ−４１８と、ＩＬ−３に代えて１０ｎｇ／ｍｌのＷＴ−ｈＰＲＬとを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中でＢａ／Ｆ３−ｈＰＲＬＲ細胞を維持した。リガンドとしてＷＴｈＰＲＬを使用して、バイオアッセイの最適条件（細胞数、飢餓時間および培地など）を決定した。条件は以下のとおりであった。増殖アッセイの前では、細胞を、１％ＦＣＳＲＰＭＩ培地（添加物を含む）において６時間飢餓にし、次いで９６ウェルプレートにおいて、５×１０⁴細胞／ウェルの密度にて、１００μｌの最終容量で、同じ培地（ホルモンを除く）に播種した。アゴニスト作用実験では、１００μｌの［２×］ホルモンを添加し、アンタゴニスト作用実験では、アンタゴニスト特性について試験すべき５０μｌの［４×］ホルモンおよび５０μｌの［４×］ＷＴｈＰＲＬ（１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度）を添加した。１０μｌのＷＳＴ−１を使用したホルモン刺激の３日後に、細胞増殖をモニターした。３連または４連で少なくとも３回実験を行なった。

結果
Ｎ末端欠失アナログ
アゴニスト作用
Ｎｂ２細胞増殖アッセイ
以前の報告によれば、単量体ｈＰＲＬは、古典的なＮｂ２細胞増殖アッセイにおいて、１〜２ｎｇ／ｍｌにて最大効果を有する細胞増殖を誘導する。

図３Ａは、漸増濃度のｈＰＲＬ（−●−）、Δ１−９−ｈＰＲＬ（−□−）、およびΔ１−１４−ｈＰＲＬ（−△−）の存在下での細胞増殖を示す。図３Ｂは、漸増濃度のｈＰＲＬ（−●−）、Δ１−１０−ｈＰＲＬ（−−＊−−）、Δ１−１１−ｈＰＲＬ（−−○−−）、Δ１−１２−ｈＰＲＬ（−−□−−）およびΔ１−１３−ｈＰＲＬ（−−◇−−）の存在下での細胞増殖を示す。

このアッセイの用量−応答曲線は、すべての変異体（Δ１−９−ｈＰＲＬ→Δ１−１４−ｈＰＲＬ）およびＷＴｈＰＲＬについて同様であった（ＥＣ₅₀が０．５７〜０．８７ｎｇ／ｍｌの範囲であった）。このことは、Ｎ末端欠失が、このアッセイにおけるｈＰＲＬの細胞分裂活性を劇的に変化させないことを示す。

Ｂａ／Ｆ３−ｈＰＲＬＲ細胞増殖バイオアッセイ
Ｎｂ２細胞を用いるアッセイとは対照的に、Ｂａ／Ｆ３細胞を用いるｈＰＲＬＲ媒介増殖アッセイは、これらアナログの異なる細胞分裂活性を示した。ＷＴｈＰＲＬは、用量依存的様式でこの細胞集団の増殖を誘導し、ほぼ１０ｎｇ／ｍｌで最大効果を有した。このことは、慣用培養培地中のＩＬ−３を１０ｎｇ／ｍｌのｈＰＲＬに置換することによる細胞選択と相関している。

図４Ａは、漸増濃度のｈＰＲＬ（−●−）、Δ１−９−ｈＰＲＬ（−□−）、およびΔ１−１４−ｈＰＲＬ（−△−）の存在下でのＢａ／Ｆ３細胞の増殖を示す。図４Ｂは、漸増濃度のｈＰＲＬ（−●−）、Δ１−１０−ｈＰＲＬ（−−＊−−）、Δ１−１１−ｈＰＲＬ（−−○−−）、Δ１−１２−ｈＰＲＬ（−−□−−）、Δ１−１３−ｈＰＲＬ（−−◇−−）の存在下でのＢａ／Ｆ３細胞増殖を示す。

アナログΔ１−９−ｈＰＲＬ、Δ１−１０−ｈＰＲＬ、Δ１−１１−ｈＰＲＬ、Δ１−１２−ｈＰＲＬ、およびΔ１−１３−ｈＰＲＬを用いて得られた用量−応答曲線は、ｈＰＲＬを用いて得られた用量−応答曲線に重なった。このことは、生物活性の変化がなかったことを反映している。これに対し、Δ１−１４−ｈＰＲＬの曲線は、自然対数１より大きく右に移動した。このことは、このアッセイにおいて、ｈＰＲＬＲを活性化する能力が顕著に変化したことを反映する。すべてのアナログは、十分なホルモン濃度が本アッセイに添加されると、最大レベルの細胞分裂を誘導することができた。

ヒトＰＲＬＲ転写バイオアッセイ（ＨＬ５）
３回の実験の代表として、二連で実施された１つの典型的な実験データを図５に示す。図５は、漸増濃度（μｌ／ｍｌ）のｈＰＲＬ（−●−）、Δ１−９−ｈＰＲＬ（−□−）、Δ１−１４−ｈＰＲＬ（−△−）、Δ１−１０−ｈＰＲＬ（−−＊−−）、Δ１−１１−ｈＰＲＬ（−−○−−）、Δ１−１２−ｈＰＲＬ（−−□−−）、Δ１−１３−ｈＰＲＬ（−−◇−−）の存在下でのｈＰＲＬ転写活性（ＷＴｈＰＲＬの最大効果を１００％として、何％の活性であるか）を示す。

結果を、ルシフェラーゼ活性誘導の倍数（すなわち、ＷＴｈＰＲＬの最大効果を１００％として、何％の活性であるか）で表現する。

アナログΔ１−９−ｈＰＲＬ、Δ１−１０−ｈＰＲＬ、Δ１−１１−ｈＰＲＬ、Δ１−１２−ｈＰＲＬ、およびΔ１−１３−ｈＰＲＬは、本アッセイでは区別できず、曲線は、ＷＴｈＰＲＬと比較して左に移動した（ＥＣ₅₀がほぼ２倍減少した（１／２））。加えて、これらすべてのアナログによって誘導された最大応答は、優れたアゴニスト特性を反映して、ＷＴｈＰＲＬより高かった（１２０〜１４０％）。

対照的に、Δ１−１４−ｈＰＲＬは、用量−応答曲線（ＥＣ₅₀はほぼ３倍高い）および最大活性（ＷＴホルモンの６０％）の両方に関して、ｈＰＲＬより活性が弱かった。

アンタゴニスト作用
本来のアゴニスト活性に一致して、いずれのＮ末端欠失変異体も、本研究に使用した３つのバイオアッセイのいずれにおいても、アンタゴニスト活性を示さなかった（データは示さず）。

Ｇ１２９Ｒ変異体および二重変異体
すべての実験に、単一変異体（Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ）ならびに二重変異体Δ１−９−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬおよびΔ１−１４−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬが含まれる。

ＷＴｈＰＲＬは、１〜２ｎｇ／ｍｌにて最大増殖を誘導する一方、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬの用量依存的な細胞分裂効果は、高濃度側へシフトし、最大増殖より下のレベルにしか達しない。これに対し、二重Ｎ末端欠失変異体Δ１−９−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬおよびΔ１−１４−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬは共に、有意なアゴニスト活性がない。

以前の報告（GOFFINら、J. Biol. Chem.、269、32598〜32606、1994；BERNICHTEINら、Endocrinology、142、3950〜3963、2001）のように、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬを用いて得られるアゴニスト作用の用量−応答曲線は、ＷＴｈＰＲＬと比較して、２より大きい自然対数単位分ほど右に移動し、最大効果は約０．５〜１μｇ／ｍｌにて達成される。興味深いことに、このアゴニスト活性は、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬのＮ末端テイルを欠失させたとき（すなわち、Δ１−９−Ｇ１２９−ｈＰＲＬアナログおよびΔ１−１４−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬアナログにおいて）、完全に消失する。そしてこのことは、ＷＴｈＰＲＬの最大活性を導く濃度より４オーダーまで高い濃度であってもいえることである（１ｎｇ／ｍｌ対１０μｇ／ｍｌ）。

Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬのアゴニスト活性は、このアッセイにおいて極端に減少し、最大レベルがｈＰＲＬ活性の２％未満にしか達しない。同様に、いずれの二重変異体も、極端に高い濃度（５０μｇ／ｍｌまで）で試験したときでさえ、検出可能なレベルのルシフェラーゼ活性を誘導しなかった。

アンタゴニスト作用。結果を図７Ｂに示す。Δ１−１４−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ（−■−）、Δ１−９−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ（−▲−）、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ（−◆−）。

ｈＰＲＬＲに対する相対アフィニティーと一致して、３つのアナログのアンタゴニスト特性は非常に類似していたが、以下の順序の活性が繰り返し示された。Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ＞Δ１−９−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ＞Δ１−１４−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ。

ＷＴｈＰＲＬの最大効果は、１０ｎｇ／ｍｌにて得られる。Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬは、最大効果より低い増殖を誘導し、用量−応答曲線が高濃度側に自然対数２分ほど移動した。これに対して、二重変異体（Δ１−９−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬおよびΔ１−１４−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ）のいずれも、有意な増殖を誘導しなかった。

Ｎｂ２アッセイのように、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬについて得られた曲線は、ほぼ２の自然対数単位分だけ右に移動し、ｈＰＲＬと比較して、最大効果より低いレベル（５０〜８０％）にしか達しなかった。高濃度にて、ｈＰＲＬおよびＧ１２９Ｒ−ｈＰＲＬは、これらのリガンドを使用するときに典型的に観察される（KINETら、Recent Res. Devel. Endocrinol.、2、1〜24、2001）釣鐘型曲線を示した。Δ１−９−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬおよびΔ１−１４−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬは共に、１０μｇ／ｍｌ程度の高濃度でさえ、アゴニスト活性を示さなかった。

アンタゴニスト作用。固定濃度のＷＴｈＰＲＬ（１０ｎｇ／ｍｌ）を漸増濃度のアナログと競合させることによって、アンタゴニストアッセイを行なった。図８Ｂは、固定濃度のＷＴｈＰＲＬと競合する漸増濃度のΔ１−９−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ（−■−）、Δ１−１４−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ（−▲−）、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ（−◆−）の存在下での細胞増殖を示す。

Ｇｌｙ１２９をＡｒｇに置換した３つの変異体（Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ、Δ１−９−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬおよびΔ１−１４−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ）は、同様なアンタゴニスト活性を示した。このことは、ＷＴｈＰＲＬとの効率的な競合には、Ｎ末端欠失と無関係に、高モル過剰（１０〜５０倍）のアナログを使用することが必要であることを意味する。二重変異体に関しては、これらのアナログが、本来のアゴニスト効果を欠いている（図８Ａ）ので、ＷＴｈＰＲＬ誘導活性の競合阻害は、おそらく、真のアンタゴニスト作用現象を反映しているであろう。これに対し、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬは有意なアゴニスト活性を示すので、競合アッセイにおいて観察された阻害効果は、おそらく、現実のアンタゴニスト作用と自己アンタゴニスト作用現象との組合せを反映しているであろう（GOFFINら、J. Biol. Chem.、269、32598〜32606、1994；BERNICHTEINら、Endocrinology、142、3950〜3963、2001、KINETら、Recent Res. Devel. Endocrinol.、2、1〜24、2001）。

実施例４：Δ１−９−Ｇ１２９Ｒは、野生型ｂａｌｂ−ｃ／Ｊマウス由来の肝臓において、ＰＲＬ誘導ＭＡＰＫ活性化を阻害する
８週齢の野生型雌性ｂａｌｂ−ｃ／Ｊを、１０μｇのｈＰＲＬまたは異なる比のｈＰＲＬ／アンタゴニスト（Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬまたはΔ１−９−Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ）で処置した。ホルモンの腹腔内（ＩＰ）注射の６０分後、慣用プロトコルに従って、マウスを屠殺し、肝臓を迅速に採取し、切り分けそしてホモジナイズし、次いで細胞溶解物を調製した。７０μｇの溶解物を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、続いてニトロセルロース膜に液成分を移した。膜を、５％脱脂乳で１時間室温にてブロックし、そして十二分に洗浄した後、活性形態のＥｒｋ１およびＥｒｋ１Ｍａｐキナーゼ（スレオニン²⁰²およびチロシン²⁰⁴でリン酸化されている）に対して特異的な一次モノクローナル抗体と共に一晩インキュベートした。十二分に洗浄後、膜を、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウス二次抗体と共に１時間インキュベートした。イムノブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）に続いてオートラジオグラフィーによって顕在化させた。

次いで、ストリッピング緩衝液（stripping buffer）を３０分間５０℃にて使用して、膜を脱ハイブリダイズさせ、そして洗浄および再ブロッキングの後、活性形態および不活性形態の両方のＥｒｋ１およびＥｒｋ２Ｍａｐキナーゼを認識する抗Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２ポリクローナル抗体を使用して膜を再検査した。次いで、このブロットを、ＨＲＰ結合抗ウサギ抗体とのインキュベーションの後に顕在化させた。

結果を図９に示す。
Ａ：抗ＭＡＰＫブロット：
上パネル（ＭＡＰＫ−Ｐ）：リン酸化ＭＡＰＫ
下パネル：総ＭＡＰＫ（ＭＡＰＫ）
Ｂ：ＭＡＰＫ−Ｐブロット（上パネル）のデンシトメータによる定量化

本実験は、１０μｇのｈＰＲＬのＩＰ注射により誘導されたＭＡＰキナーゼ活性化が、５０倍モル過剰のΔ１−９Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬアンタゴニストによって阻害されることを示す。これに対し、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬは、より高いモル比（１００倍）でさえ、ＭＡＰＫ活性化を減少させることはなく、増強するようにさえみえる。

実施例５：Δ１−９Ｇ１２９Ｒは、野生型ｂａｌｂ−ｃ／Ｊマウス由来の泌乳中乳腺において、ＰＲＬ誘導ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５活性化を阻害する
アンタゴニスト作用
８週齢の授乳中（１０〜１２日目）の野生型雌性ｂａｌｂ−ｃ／Ｊを、２００μｇブロモクリプチンで処置（ＩＰ）して、内因性ＰＲＬの循環レベルを減少させた（ブロモクリプチンは、ドーパミンアナログの、下垂体プロラクチン分泌の天然阻害剤である）。５時間後、マウスを、１０μｇのｈＰＲＬ単独か、または１：１００比のｈＰＲＬ：Δ１−９Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬかで、３０分間処置（ＩＰ）した。次いで、慣用プロトコルに従って、マウスを屠殺し、第４乳腺（左右）を取り出し、プールし、そしてホモジナイズした。総細胞溶解物（２ｍｇ）を、ポリクローナル抗ＳＴＡＴ５抗体またはポリクローナル抗ＳＴＡＴ３抗体をそれぞれ使用する免疫沈降に（４℃にて一晩、回転下で）使用した。次いで、免疫複合体を、回転下で１時間のインキュベーションによって、２０μｌのプロテインＡセファローススラリを用いて捕獲した。プロテインＡ複合体を遠心分離により沈降させ、ペレットを洗浄し、次いで還元サンプル緩衝液中で５分間煮沸させた。免疫沈降サンプルを、実施例４に記載のように、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウエスタンブロットで分析した。

本実験において使用した一次抗体（ポリクローナル）は、活性化された形態のＳｔａｔ５およびＳｔａｔ３を特異的に認識する（それぞれ、抗リン酸化ＳＴＡＴ５および抗リン酸化ＳＴＡＴ３）。脱ハイブリダイゼーション後、総（リン酸化形態および非リン酸化形態）Ｓｔａｔ５またはＳｔａｔ３を認識するポリクローナル抗体を使用して膜を再検査した。

結果を図１０に示す。
Ａ：抗ＳＴＡＴブロット：
上パネル（Ｐ−Ｓｔａｔ５およびＰ−Ｓｔａｔ３）：リン酸化Ｓｔａｔ５およびリン酸化Ｓｔａｔ３
下パネル（Ｓｔａｔ５およびＳｔａｔ３）：Ｓｔａｔ５およびＳｔａｔ３の合計
Ｂ：抗リン酸化ＳＴＡＴブロット（上パネル）のデンシトメータによる定量化

結果から、泌乳中の乳腺におけるＰＲＬによるＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５の活性化は、１００倍モル過剰のΔ１−９Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬの添加によって阻害されることが示される。

実施例６：Δ１−９−Ｇ１２９Ｒは、ヒトＰＲＬ、ラットＰＲＬおよびＧ１２９Ｒ−ヒトＰＲＬについてトランスジェニックであるマウス由来の前立腺において、ＰＲＬ誘導ＭＡＰＫの構成的活性化を阻害する
ＭＡＰＫ活性化バイオアッセイ
アゴニスト（ＰＲＬ；Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ）
このインビボバイオアッセイは、遍在性メタロチオネインプロモーターの制御下でヒトＰＲＬまたはＧ１２９Ｒ−ｈＰＲＬを発現するトランスジェニックマウス（雄性）（ＴｇＭｅｔ−ｈＰＲＬおよびＴｇＭｅｔ−Ｇ１２９Ｒ）か、または前立腺特異的プロバシンプロモーターの制御下でラットＰＲＬを発現するトランスジェニックマウス（雄性）（ＴｇＰｒｏｂ−ｒＰＲＬ）を使用する。

１年齢の雄性トランスジェニックマウスを屠殺し、尿生殖路を取り出し、そして前立腺を、顕微鏡下で細かく切り分けて、背外葉から腹葉を分離した。次いで、慣用プロトコルに従って、背外葉をホモジナイズし、そして細胞溶解物を調製した。実施例４に肝臓について記載したように、７０μｇの溶解物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードして、Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２ＭＡＰＫの自発的活性化を試験した。

結果を図１１に示す。
Ａ：抗ＭＡＰＫブロット
上パネル（ＭＡＰＫ−Ｐ）：リン酸化ＭＡＰＫ
下パネル（ＭＡＰＫ）：総ＭＡＰＫ
Ｂ：ＭＡＰＫ−Ｐブロット（上パネル）のデンシトメータによる定量化

本実験により、同腹の非トランスジェニックマウス（ＷＴ）と比較すると、ＭＡＰキナーゼは、すべて系統のトランスジェニックマウスの前立腺背外葉において構成的に活性化されていることが示される。このことは、前立腺におけるＰＲＬの局所的な産生が、この組織におけるＭＡＰＫ活性化を導くことを示す。

さらに、図１１より、Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬが、インビボで、野生型プロラクチンに匹敵するアゴニスト活性を示すことが示される。

アンタゴニスト（Δ１−９Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ）
前立腺特異的プロバシンプロモーターの制御下でラットＰＲＬを発現するトランスジェニックマウス系統の７ヶ月齢の雄に、１ｍｇのΔ１−９Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬを６０分間注入（ＩＰ）した。次いで、マウスを屠殺し、尿生殖路を取り出し、そして前立腺を顕微鏡下で細かく切り分けて、背外葉から腹葉を分離した。慣用プロトコルに従って、組織をホモジナイズし、そして細胞溶解物を調製した。実施例４に記載されるように、７０μｇの溶解物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、続いてウエスタンブロットした。

結果を図１２に示す。
Ａ：抗ＭＡＰＫブロット：
上パネル（ＭＡＰＫ−Ｐ）：Δ１−９Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬ変異体の存在下（＋）または非存在下（−）での、前立腺の腹葉および背外葉におけるリン酸化ＭＡＰＫ
下パネル（ＭＡＰＫ）：同じサンプル中の総ＭＡＰＫ
Ｂ：抗リン酸化ＭＡＰＫブロット（上パネル）のデンシトメータによる定量化

本実験により、前立腺におけるＰＲＬ局所発現による構成的なＭＡＰキナーゼ活性化（オートクリン−パラクリン効果、図１１を参照）は、両葉におけるΔ１−９Ｇ１２９Ｒ−ｈＰＲＬの注入によって阻害されることが示される。

Claims

アンタゴニストが、以下の変異：
ａ）Ｎ末端の１４アミノ酸内の変異または変異のセットであって、Ｃｙｓ₄とＣｙｓ₁₁との間のジスルフィドブリッジの形成を防止する、変異または変異のセット、および
ｂ）プロラクチンの結合部位２内に立体障害を起こす変異または変異のセット
を有する哺乳動物プロラクチン変型体である、哺乳動物プロラクチンレセプターのアンタゴニスト。
変異ａ）がプロラクチンのＮ末端の少なくとも４残基の欠失を含む、請求項１に記載のプロラクチン変型体。
変異ａ）がプロラクチンのＮ末端の９残基の欠失を含む、請求項２に記載のプロラクチン変型体。
以下の変異：
−Ｎ末端の少なくとも９残基の欠失であって、Ｎ末端の１４残基までの欠失、および
−Ｇ１２９Ｒ置換
を有する、請求項３に記載のプロラクチン変型体。
ヒトプロラクチンの変型体である、請求項１から４のいずれかに記載のプロラクチン変型体。
請求項１から５のいずれか１つに記載のプロラクチン変型体をコードするポリヌクレオチド。
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
請求項６に記載のポリヌクレオチドより形質転換された宿主細胞。
請求項６に記載のポリヌクレオチドで形質転換されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
または請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、治療組成物。
ＰＲＬが媒介する効果を含む疾患を処置または防止する治療組成物を得るための、請求項１から５のいずれかに記載のプロラクチン変型体または請求項６に記載のポリヌクレオチドの使用。