BR112013030995B1

BR112013030995B1 - Anticorpo mat3 ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, seus usos, sequência de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira e seu método de uso, composição farmacêutica, e kits

Info

Publication number: BR112013030995B1
Application number: BR112013030995-4A
Authority: BR
Inventors: Christoph Freiberg; Christiane Otto; Lars Linden; Axel Harrenga; Mark Trautwein; Simone Greven; Andreas Wilmen
Original assignee: Bayer Intellectual Property Gmbh
Priority date: 2011-06-03
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2021-11-09
Also published as: CN103764679B; US20160319029A1; US20140141003A1; CU20130163A7; EP2530089A1; AU2012264765B2; AU2012264765A1; SI2714740T1; AR086631A1; EA201301356A1; TWI548649B; CN103764679A; EP2714740A1; EP2714740B1; JP2014522239A; HRP20160506T1; DK2714740T3; BR112013030995A2; US9777063B2; TW201302798A

Abstract

anticorpo contra receptor de prolactina neutralizante mat3 e sua utilização terapêutica. a presente invenção se refere ao anticorpo contra receptor de prolactina neutralizante mat3, e fragmentos de ligação antigênica, composições farmacêuticas contendo os mesmos e sua utilização no tratamento ou prevenção de distúrbios benignos e indicações mediadas pelo receptor de prolactina tais como endometriose, adenomiose, contracepção feminina não hormonal, doença de mama benigna e mastalgia, inibição de lactação, hiperplasia de próstata benigna, fibroides, perda de cabelo hiper- e normoprolactinêmica, e cotratamento em terapia hormonal combinada para inibir proliferação de células epiteliais mamárias e para o tratamento e prevenção de câncer de mama resistente a antiestrogênicos. o anticorpo da invenção bloqueia sinalização mediada por receptores de prolactina.

Description

[0001] A presente invenção se refere ao anticorpo contra receptor de prolactina Mat3 e proporciona regiões recombinantes de ligação an- tigênica do anticorpo Mat3 e fragmentos funcionais contendo as regiões de ligação antigênica referidas, que especificamente ligam e neutralizam o receptor de prolactina, sequências de ácido nucleico codificando o anticorpo precedente, vetores contendo as mesmas, composições farmacêuticas contendo as mesmas e sua utilização no tratamento ou prevenção de endometriose e outras doenças as quais se beneficiam de inibição de sinalização mediada por receptores de prolactina.

[0002] A prolactina (PRL) é um hormônio polipeptídico composto de 199 aminoácidos. A prolactina pertence à família do hormônio do crescimento (GH), lactogênio placentário (PL) de hormônios polipeptí- dicos e é sintetizada em células lactotróficas da pituitária e em vários tecidos extrapituitários tais como linfócitos, células epiteliais de mamíferos, o miométrio, e a próstata. Dois promotores diferentes regulam a síntese de prolactina pela pituitária e extrapituitária (BioEssays 28:1051-1055, 2006).

[0003] A prolactina (PRL) liga ao receptor de prolactina (PRLR), um receptor transmembrana único pertencente à superfamília de receptores de citocina classe 1 (Endocrine Reviews 19:225-268, 1998). O PRLR existe em três diferentes isoformas, a curta, a longa, e a forma intermediária que podem ser diferenciadas pela extensão de suas caudas citoplasmáticas. Depois de ligação de ligante, um processo sequencial leva a ativação do receptor de prolactina (PRLR). A prolac- tina interage através de seu sítio de ligação 1 com uma molécula de PRLR e em seguida atrai através de seu sítio de ligação 2 uma segunda molécula de receptor levando a um dímero ativo de receptores de prolactina. A dimerização de PRLR leva à ativação predominante do caminho JAK/STAT (Janus Quinase/ transdutores de Sinal e ativado- res de transcrição). Depois de dimerização de receptor, JAKs (predominantemente JAK2) associadas com o receptor, transfosforilam e ativam umas às outras. Além disso o PRLR também é fosforilado e pode ligar a proteínas contendo domínio SH2 tais como STATs. STATs ligadas a receptor são subsequentemente fosforilados, dissociam do receptor e translocam para o núcleo onde estimulam a transcrição de genes alvo. Além disso, foram descritas a ativação do caminho Ras- Raf-MAPK e ativação da quinase citoplasmática src por PRLRs (para revisão Endocrine Reviews 19: 225-268, 1998).

[0004] A sinalização mediada por PRLR tem um papel em uma variedade de processos tais como o desenvolvimento das glândulas mamárias, lactação, reprodução, crescimento de tumores mamários e de próstata, doenças autoimunes, crescimento geral e metabolismo, e imunomodulação (Endocrine Reviews 19: 225-268, 1998; Annu. Rev. Physiol. 64: 47-67, 2002).

[0005] Atualmente, não existe nanhuma medicação disponível que possibilite completa interferência com a sinalização mediada por PRLR além da inibição da secreção de PRL pela pituitária pela utilização de bromocriptina e outros agonistas de receptores 2 da dopamina (Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism 2(10): 571-581, 2006). No entanto, estes agentes não suprimem a síntese de PRL extrapitui- tária que pode compensar com sucesso a inibição da síntese de PRL pela pituitária levando a sinalização mediada por PRLR quase inalterada (Endocrine Reviews 19:225-268, 1998). Portanto não é surpreendente que agonistas de receptores da dopamina tipo 2 não tenham sido benéficos em pacientes sofrendo de câncer de mama ou de do- enças autoimunes tais como lúpus sistêmico ou artrite reumatoide (Breast Cancer Res. Treat. 14:289-29, 1989; Lupus 7:414-419, 1998) embora a prolactina tenha sido implicada nestas doenças. A síntese de prolactina local em células de câncer de mama ou linfócitos a qual tem um papel fundamental no carcinoma mamário ou em doenças au- toimunes, respectivamente, não foi bloqueada por agonistas de receptores da dopamina.

[0006] Anticorpos ligando a PRLR para diagnóstico de câncer de mama foram descritos na patente internacional No. WO2003/004989 (Millenium Pharmaceuticals) Pela primeira vez. Na patente internacional No. WO03/004989 referida numerosos genes e proteínas correspondentes incluindo PRLR sendo superexpressadas em vários tecidos de tumores de mama foram considerados como marcadores adequados para detecção precoce de malignidade. Na patente internacional No. WO03/008583, focando em linfoma e leucemia, são descritos genes e proteínas associados com carcinoma inclusive PRLR.

[0007] Além disso, na patente internacional No. WO2006/110585 (Novartis) foram descritos a super-expressão de PRLR como um marcador de câncer e a utilização de anticorpos específicos contra PRLR para diagnóstico e tratamento de câncer de mama e de outros tipos de câncer (câncer de pulmão, de próstata e de pele). Desta vez, foram reivindicados anticorpos monoclonais com atividade antagonista com base em duas evidências experimentais: a) bloqueio da expressão de PRLR por siRNA específico contra PRLR em células de câncer de mama MCF7 leva a inibição da proliferação destas células e b) prolac- tina induz a fosforilação de STAT5 e MAPK em células de câncer de mama tais como T47D. No entanto, nem foi proporcionada qualquer evidência de que um anticorpo monoclonal na verdade inibiu a proliferação de linhagens celulares de câncer de mama nem foi revelado qualquer anticorpo concreto.

[0008] A primeira prova de conceito in vivo de que antagonistas de PRLR interferem com sucesso com o desenvolvimento de câncer de mama foi publicada em 1988. No modelo de tumor de mama de camundongo DMBA, um anticorpo monoclonal contra PRLR levou a incidência reduzida de tumores mamários (Am J Pathol 133:589595,1988).

[0009] Primeiro anticorpos contra PRLR, reivindicados para a pre venção e o tratamento de câncer de mama, foram descritos na patente dos Estados Unidos No. US 2007/0269438 (Biogen). O produtos de expressão (anticorpos) de cinco linhagens celulares de hibridoma foram descritos por sua capacidade para ligar firmemente linhagens celulares de câncer de mama T47D e MCF7 e para bloquear sinalização mediada por PRL (fosforilação de STAT5, de MAPK e de AKT). No entanto, não foi revelada nenhuma prova de conceito in vivo. Além disso, não foi proporcionada nenhuma evidência além do conhecimento do estado da arte para a declaração de que especialmente depois do câncer do paciente se tornar independente de antiestrogênicos, o anticorpo anti-PRLR pode ser administrado ao paciente.

[00010] Um segundo grupo de anticorpos monoclonais específicos contra PRLR junto com sequências primárias reveladas foi described na patente internacional No. WO 2008/022295 (Novartis). Embora estes anticorpos tenham sido reivindicados como agentes terapêuticos para câncer de mama, de pulmão e de próstata, um modelo de linfoma serviu para mostrar o efeito antiproliferativo destes agentes in vivo.

[00011] Por outro lado, antagonistas de PRLR peptidérgicos que são derivados de prolactina e que carregam uma deleção N-terminal e uma mutação de ponto (por exemplo, delta1-9G129R prolactina) também se comportam como antagonistas do PRLR, no entanto sofrem de reduzido tempo da meia-vida (15 a 20 min) e baixa potência caso comparados com prolactina (Pituitary 6:89-95, 2003). Portanto, anti- corpos contra PRLR neutralizantes são superiores especialmente com respeito à inibição de sinalização de prolactina autócrina reforçada que tem um papel no câncer de mama e no câncer de próstata.

[00012] O papel da sinalização mediada por PRLR também foi investigado no contexto da doença benigna endometriose. Em um estudo o padrão de expressão do PRLR em amostras endometrióticas e endométrio eutópico de pacientes com endometriose foi analisado (Acta Obstet Gynecol Scand 81:5-10, 2002) durante a fase proliferativa média final do ciclo menstrual. Foi demonstrado que o mRNA de PRLR estava presente no endométro eutópico em 79% dos pacientes com endometriose analisados, ao passo que estava ausente nas lesões endometrióticas em 86% dos pacientes com endometriose. Estes dados sugeriram uma possível regulação diferencial da expressão de PRLR entre tecido normal e endometriótico. No entanto, a partir destes dados de expressão não pode ser concluído que a inibição do PRLR pode representar uma terapia para endometriose adequada - especialmente desde que não foi visto que o PRLR é expressado nas lesões endometrióticas (Acta Obstet Gynecol Scand 81:5-10, 2002).

[00013] Em conclusão, embora a sinalização mediada por PRLR tenha um papel em uma variedade de processos celulares, foram revelados muito poucos resultados e parcialmente contraditórios demonstrando o valor terapêutico de antagonismo de PRLR para a maioria das doenças benignas incluindo endometriose.

[00014] Foram publicados muitos dados indicando que PRLR pode ter um papel causal no câncer de mama. E conceitualmente, potentes antagonistas de PRLR podem ser agentes apropriados para demonstrar o valor terapêutico da inibição de PRLR para câncer de mama. Não obstante, não foi proporcionada até o momento prova de conceito in vivo de que o bloqueio de PRLR na verdade leva a inibição de crescimento tumoral (com a exceção de tratamento de linfoma e inibição do desenvolvimento de câncer de mama) e além do mais de que anticorpos antagonistas contra PRLR podem ser usados para o tratamento de doenças benignas as quais se beneficiam de bloqueio da sinalização de PRLR. Portanto, os anticorpos atualmente disponíveis podem ser usados em modelos preditivos os quais possibilitam estudos pré-clínicos de prova de conceito.

[00015] Existe a necessidade de anticorpos os quais ligam com alta afinidade ao PRLR em humano, macaco e camundongo sem ligar competitivamente a PRL e deste modo neutralizam a sinalização mediada por PRLR em todas as três espécies, e os quais permitam realizar estudos pré-clínicos de prova de conceito em camundongo bem como - em doses razoáveis - também em macaco.

[00016] Portanto o problema sujbacente da presente invenção se situa na provisão de novos anticorpos contra PRLR os quais possam ser usados em modelos preditivos os quais possibilitem estudos pré- clínicos de prova de conceito e os quais possam ser usados para tratamento de doenças as quais se beneficiam de bloqueio de sinalização de receptores de prolactina.

[00017] O problema é resolvido pela provisão do novo anticorpo Mat3.

[00018] Foi agora visto que o anticorpo referido é surpreendente mente específico para e tem uma alta afinidade por PRLR em humano, de macaco e de camundongo em estudos bioquímicos bem como de ligação celular sem ligação competitivamente a PRL e deste modo neutraliza a sinalização mediada por PRLR em todas as três espécies, em contraste com estes anticorpos conforme revelado na patente internacional No. WO 2008/022295, os quais ligam de modo não competitivo a PRL tais como HE06642. Deste modo, o anticorpo referido permite realizar estudos pré-clínicos de prova de conceito em camundongo bem como - em doses razoáveis - também em macaco. Além disso, foi agora visto que o anticorpo referido pode liberar um benefício terapêutico para o sujeito sendo mais potente e mais intitamente relacionado com sequências de linhagens germinativas humanas e portanto oferece a oportunidade de um perfil de efeito colateral aprimorado, isto é, risco de imunogenicidade reduzido devido a dosagem reduzida e aumentada similaridade com sequências de linhagens germinativas humanas, comparados com estes anticorpos conforme revelado na patente internacional No. WO 2008/022295, os quais ligam de modo não competitivo a PRL tais como HE06642.

[00019] O novo anticorpo Mat3 preferencialmente tem reação cruzada com PRLR de diferentes espécies tais como Macaca mulatta (macaco rhesus) e Macaca fascicularis (cynomolgus), Mus musculus (camundongo) e Homo sapiens (humano). Reatividade cruzada aqui significa que os valores de afinidades (valores de KD) e valores de ligação celular da EC50 do anticorpo referido para PRLR humano, de macaco e de camundongo são abaixo de 10 x 10-9 M (vide a Tabela 1, exemplos 9, 10, 13 e 14) e os valores de IC50 de inibição de proliferação estão abaixo de 20 x 10-9 M (vide os exemplos 1 a 3). A presente invenção se baseia na descoberta do novo anticorpo Mat3 o qual pode liberar um benefício terapêutico para o sujeito (sequências do novo anticorpo são como na SEQ ID NO: 1 a 10). O anticorpo da invenção, o qual pode ser o mais preferencialmente toitalmente humano com relação muito íntima com sequências de linhagens germinativas humanas ou o qual pode ser variantes humanizadas ou quiméricas ou humanas manipuladas do mesmo carregando as CDRs da versão totalmente humana, pode ser usado em muitos contextos os quais são mais plenamente descritos aqui, neste requerimento de patente.

[00020] De modo a mostrar superioridade em potência e reatividade cruzada com humano-macaco-camundongo do anticorpo referido em relação ao anticorpo conhecido mais profundamente caracterizado da patente internacional No. WO 2008/022295 ligação não-competitiva a PRL, em estudos de proliferação in vitro o anticorpo referido foi comparado com HE06642 da patente internacional No. WO 2008/022295 (Exemplo 1-3). Os HE06642 ou HE06.642 ou 06.642 mencionados aqui contêm os domínios variáveis de SEQ ID NOs: 14 e 15, os quais são idênticos às sequências de he06.642-2 na patente internacional No. WO 2008/022295.

[00021] O anticorpo Mat3 foi caracterizado em vários sistemas celulares para determinar sua especificidade de espécie e suia potência bem como a eficácia em diferentes paradigmas de leitura abordando a inativação de sinalização e proliferação mediada por PRLR. Provas de proliferação foram realizadas em linhagens celulares Ba/F ou transfec- tadas de modo estável com o PRLR humano (Exemplo 1), o PRLR murino (Exemplo 2) ou o PRLR de rhesus (Exemplo 3). Anticorpo Mat3 inibiu completamente a proliferação de células carregando o PRLR humano, o PRLR murino, e o PRLR de rhesus (Exemplo 1 a 3). O anticorpo HE06642 (patente internacional No. WO 2008/022295) foi inativo nas células carregando o PRLR murino e apresentou atividade for-temente reduzida nas células-PRLR de rhesus caso comparado com Mat3. O anticorpo Mat3 também foi mais potente no PRLR humano do que o anticorpo HE06.642. Também existe evidência de que Mat3 inibe a proliferação de células de linfoma (lymphomy) NB2 de rato com maior potência do que HE06422. Além de provas de proliferação celular, provas de reporter de luciferase foram realizadas usando linhagens celulares HEK293 transfectadas de modo estável com ou o PRLR humano ou murino (Exemplo 12) e transfectadas de modo transitório com um gene reporter de luciferase sob o controle de LHRE’s (elementos de resposta a hormônio lactogênico). Usando estes sistemas, pode ser confirmado que um promotor dependente de sinalização mediada por PRLR é desligado na presença de Mat3. A incapacidade do anticorpo HE06.642 para bloquear de modo eficaz sinalização mediada por PRLR murino se tornou novamente evidente.

[00022] Em conclusão, o anticorpo Mat3 é portanto adequado para testar a inibição de sinalização mediada por PRLR em modelos muri- nos e de macaco.

[00023] O anticorpo contém domínios variáveis sendo mais similares a genes V de linhagem germinativa humana transladados do que HE06642. A Figura 6 mostra que os domínios VH e VL são cada um 90% idênticos aos genes V de cadeia pesada e V de cadeia leve lâm- bda de linhagem germinativa humana transladados [banco de dados VBASE2; Retter I, Althaus HH, Münch R, Müller W: VBASE2, a integrative V gene database. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33 (Database issue): D671-4]. HE06642 apresenta 89% de identidade com a se-quência de linhagem germinativa VH transladada mais similar e somente 80% de identidade com a sequência V de cadeia leve kappa de linhagem germinativa transladada mais similar encontrada no VBA- SE2. Este achado oferece a oportunidade de ter um menor risco de imunogenicidade quando se tratta pacientes com Mat3.

[00024] Estudos de ligação de Mat3 e HE06642 com os domínios extracelulares de PRLR humano, de macaco e de camundongo indicam que ambos os anticorpos interagem t com estes domínios purificados (vide abaixo, o Exemplo 10 e a Tabela 1). No entanto, quando estes domínios são expostos sobre superfícies celulares podem ser observadas diferenças mais pronunciadas entre Mat3 e HE06642. Mais surpreendentemente, HE06642 não liga PRLR murino quando células Ba/F expressam este receptor, ao passo que Mat3 liga (Tabela 2, e Figura 5, e Exemplo 9). Este achado é consistente com a observação de que Mat3 bloqueia sinalização e proliferação mediada por PRLR murino em contraste com HE06642. Uma varredura de peptí- deos com o domínio extracelular do PRLR humano, a qual é ligada por Mat3 e HE06642 quando purificado bem como quando exposto sobre superfícies celulares, revelou que Mat3 liga ao subdomínio S2 (Exemplo 11) tal como HE06642 conforme reportado previamente (patente internacional No. WO 2008/022295). Esta varredura mostrou adicionalmente que há diferenças na ligação aos domínios S2 entre Mat3 e HE06642 (Figura 8). Recentemente, foi publicado que diferente ligação de anticorpos observados por uma varredura de peptídeo semelhante permitiu explicar diferenças das propriedades de anticorpos’ (Nieder- fellner et al., Blood. 2011, Mar 28. doi:10.1182/blood-2010-09-305847). Em conclusão, os resultados da varredura de peptídeos indicam porque o anticorpo Mat3 mostra uma especificidade de espécies e potência diferentes comparado com HE06642.

[00025] É proporcionado um anticorpo monoclonal humano Mat3 de acordo com a tabela 5 (SEQ ID NO. 1 a 10) ou fragmentos de ligação antigênica do mesmo os quais antagonizam sinalização mediada por receptores de prolactina. O anticorpo especificamente liga ao domínio extracelular (ECD) de PRLR (SEQ ID NO: 12) ou variantes polimórfi- cas humanas de SEQ ID No: 12 tais como as variantes I146L e I76V sendo descritas em PNAS 105 (38), 14533, 2008, e J. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (1), 271, 2010. Além disso, o anticorpo especificamente liga ao domínio extracelular (ECD) de PRLR de macaco rhesus e cyno- mulgus (SEQ ID NO: 11) bem como de PRLR murino (SEQ ID NO: 13).

[00026] Em uma modalidade anticorpo humano Mat3, ou anticorpo humanizado, manipulado humano ou quimérico ou fragmento de ligação antigênica do mesmo são revelados por meio do que o anticorpo compreende uma região pesada variável correspondente com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 3, e uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, e uma região leve variável com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 4, e uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2 as quais antagonizam sinalização mediada por receptores de prolactina.

[00027] Em uma modalidade um anticorpo ou fragmento de ligação antigênica compreendendo as CDRs do anticorpo conforme descrito acima, por meio do que a cadeia pesada variável contém as sequências de CDRs correspondentes a SEQ ID NO: 5, 6, e 7 e a cadeia leve variável contém as sequências de CDRs correspondentes a SEQ ID NO: 8, 9, e 10.

[00028] Em outra modalidade da presente invenção o anticorpo Mat3 consiste de uma região de ligação antigênica que liga especificamente a uma ou mais regiões do domínio extracelular de PRLR de humano, de macaco e de camundongo, e por meio do que as sequências de aminoácidos do PRLR humano são representadas pelas sequências de aminoácidos da posição 1 a 210 de SEQ ID NO: 12 e variantes polimórficas humanas de SEQ ID NO: 12, pelas sequências de aminoácidos da posição 1 a 210 do PRLR de macaco de acordo com a SEQ ID NO: 11 e do PRLR de camundongo de acordo com a SEQ ID NO: 13.

[00029] Em outra modalidade da presente invenção o Mat3 consiste de uma região de ligação antigênica por meio do que a afinidade para o domínio extracelular de PRLR de humano, macaco e camundongo é de no mínimo 100 nM, de preferência menos de cerca de 100 nM, mais de preferência menos de cerca de 30 nM, ainda mais preferencial menos de cerca de 10 nM.

[00030] Em outra modalidade o anticorpo Mat3 consiste de uma região de ligação antigênica que liga especificamente a uma ou mais regiões do domínio extracelular de PRLR humano e por meio do que a afinidade é de no mínimo 10 nM, mais preferencial de menos de cerca de 1 nM.

[00031] Também é objeto da presente invenção o Mat3 supracitado, em que os domínios constantes de cadeia pesada determinam uma IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 modificada ou não modificada.

[00032] A Tabela 1 proporciona um sumário de constantes de dissociação (afinidades) e taxas de dissociação do anticorpo Mat3 da invenção, conforme determinado por ressonância de plasmon superficial (Biacore) com domínios extracelulares monoméricos (aminoácido 1 a 210) de PRLR humano (SEQ ID NO: 12), PRLR de rhesus e de cyno- molgus (SEQ ID NO: 11, por meio do que a fusão Fc-His tenha sido removida por digestão por Fator Xa proteolítico) e PRLR murino (SEQ ID NO: 13) sobre o anticorpo imobilizado diretamente (Exemplo 10). Tabela 1: Constantes de dissociação monovalente e taxas de dissociação do domínio extracelular de PRLR humano, de macaco rhesus/cynomolgus e de camundongo expressado em células HEK293 determinadas para Mat3 como molécula de IgG humana por ressonância de plasmon superficial (vide o Exemplo 10)

[00033] As afinidades reveladas para HE06642 na patente internacional No. WO 2008/022295 são 2,6 x 10-9 M sobre o domínio extrace- lular de PRLR humano, 38,9 x 10-9 M sobre o domínio correspondente de PRLR de cynomolgus e 2,7 x 10-9 M sobre o domínio correspondente de PRLR murino.

[00034] A afinidade celular do anticorpo Mat3 foi determinada por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) combinada com análise de Scatchard (Exemplo 9).

[00035] A Tabela 2 denota a força de ligação de Mat3 como molécula de IgG2 humana sobre a linhagem celular HEK293 transfectada de modo estável com PRLR humano e de macaco rhesus, respectivamente. Tabela 2: Potência de ligação à base de células de anticorpo anti- PRLR Mat3 em formato de IgG2 determinada por FACS sobre a linhagem celular HEK293 transfectada de modo estável com PRLR humano e de macaco Rhesus, respectivamente (vide o Exemplo 9)

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

[00036] De modo a isolar um painel de anticorpos capazes de bloquear funcionalmente o PRLR humano e murineo, foram investigados em paralelo dois formatos da biblioteca de fago de anticorpo humano sintético denominada n-CoDeR® da Bioinvent (Soderlind et al. 2000, Nature BioTechnology. 18, 852-856.), expressando os fragmentos scFv e Fab, respectivamente,. Os alvos usados para seleção de scFv ou Fab foram o ECD solúvel de PRLR humano (posições de aminoáci- dos 1 a 210 de SEQ ID NO. 12) e PRLR de camundongo (posições de aminoácidos 1 a 210 de SEQ ID NO: 13), aplicados como variante bio- tinilada (NHS-LC biotina, Pierce) e como variante não-biotinilada bem como a linhagem celular de câncer de mama humano T47D expressando PRLR.

[00037] Uma combinação de várias abordagens em tecnologia de display de fago (PDT) foi usada para isolar anticorpos monoclonais humanos de alta afinidade, PRLR-específicos, por uma combinação de pannings de proteína e de célula inteira e através do desenvolvimento de ferramentas específicas. As ferramentas de panning e os métodos de triagem incluem o ECD do PRLR humano e de camundongo ex- pressados de modo recombinante em fusão com um domínio Fc (R&D Systems, catálogo no. 1167-PR e 1309-PR, respectivamente; pos. 1216 de SEQ ID NO: 12 e 13, respectivamente, cada uma fundida ao domínio de Fc de IgG1 humana, pos. 100 a 330 de IgG1 humana), o domínio extracelular do PRLR humano expressado de modo recombi- nante em fusão com uma etiqueta de seis histidinas (SEQ ID NO: 12), a linhagem celular HEK293 e a linhagem celular de linfoma murino Ba/F cada uma transfectada de modo estável com PRLR humano e murino, respectivamente, e a linhagem celular de câncer de mama T47D e a célula de linfoma de rato Nb2 cada uma expressando naturalmente PRLR bem como o desenvolvimento de procedimentos de panning e provas de triagem capazes de identificar anticorpos neutrali- zantes que ligam preferencialmente a PRLR apresentado sobre a superfície celular e que têm reação cruzada com PRLR de camundongo.

[00038] Foi realizada triagem primeiro identificando ligantes para PRLR humano e eventualmente PRLR de camundongo em testes ELISA usando antígenos expressados de modo recombinante. A combinação destes métodos específicos permitiu o isolamento de - entre outros - o anticorpo “005-C04”.

[00039] Por maturação por afinidade de “005-C04” sobre os domínios extracelulares de PRLR humano e PRLR murino, substituições benéficas foram identificadas de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 8. Finalmente, substituições individuais benéficas para aprimorada afinidade foram avaliadas com relação a sua influência sobre a termoestabilidade do anticorpo. Especialmente, desdobramento cooperativo do domínio Fab durante desnaturação dos anticorpos ma- turados (por exemplo, por elevação de termperatura) deve ter sido assegurado (referência relativa a desdobramento cooperativo: Roethlisberger, D. et al., J. Mol. Biol. 2005: 347, 773-789). O anticorpo Mat3 resultou da descoberta de anticorpo descrita acima e da abordagem de maturação. VARIANTES DE PEPTÍDEOS

[00040] Anticorpos da invenção não são limitados às sequências de peptídeo específicas proporcionadas aqui, neste requerimento de patente. Ao invés, a invenção também engloba variantes destes polipep- tídeos. Com referência à presente descoberta e tecnologias e referências disponíveis convencionalmente, o trabalhador especializado será capaz de preparar, testar e utilizar variantes funcionais dos anticorpos revelados aqui, neste requerimento de patente, enquanto apreciando que variantes tendo a capacidade para ligar e para bloquear funcionalmente PRLR estão dentro do âmbito da presente invenção.

[00041] Uma variante pode incluir, por exemplo, um anticorpo que tem no mínimo uma região determinante de complementaridade alterada (CDR) (hiper-variável) e/ou domínio/posição de framework (FR) (variável), com relação a uma sequência de peptídeo revelada aqui, neste requerimento de patente. De modo a melhor ilustrar este conceito, segue-se uma breve descrição da estrutura de anticorpo.

[00042] Um anticorpo é composto de duas cadeias de peptídeo, cada uma contendo um (cadeia leve) ou três (cadeia pesada) domínios constantes e uma região variável (VL, VH), a última das quais é em cada caso composta de quatro regiões de FR (VH: HFR1, HFR2, HFR3, HFR4; VL: LFR1, LFR2, LFR3, LFR4) e três CDRs intercaladas (VL: LCDR1, LCDR2, LCDR3; VH: HCDR1, HCDR2, HCDR3). O sítio de ligação antigênica é formado por uma ou mais CDRs, mas as regiões de FR proporcionam o framework estrutural para as CDRs e, portanto, tem um papel importante na ligação antigênica. Alterando um ou mais resíduos aminoácidos em uma região de CDR ou de FR, o trabalhador especializado rotineiramente pdoe gerar sequências de anticorpos mutadas ou diversificadas, as quais podem ser triadas contra o antígeno, para propriedades novas ou aprimoradas, por exemplo.

[00043] A Figura 4 proporciona os esquemas para numeração de cada posição de aminoácido nos domínios variáveis VL e VH. As Tabelas 3 (VH) e 4 (VL) delineiam as regiões de CDR para o anticorpo Tabela 3: Sequência VH de anticorpo Mat3 incluindo anotação de CDR

Tabela 4: Sequência VL de anticorpo Mat3 incluindo anotação de CDR

Tabela 5: Sequências dos anticorpos

Tabela 6: Sequências dos domínios extracelulares de PRLR de humano, de macaco e de camundongo

[00044] O trabalhador especializado pode usar os dados nas Tabelas 3, 4 e 5 para projetar variantes de peptídeos que estejam dentro do âmbito da presente invenção. É preferencial que as variantes sejam construídas alterando aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de CDR; uma variante pode ter também uma ou mais regiões de framework (FR) alteradas. Por exemplo, um domínio FR de peptídeo pode ser alterado onde há um desvio em um resíduo comparado com uma sequência de linhagem germinativa.

[00045] Além disso, podem ser obtidas variantes por maturação, isto é, usando um anticorpo como pohnto de partida para otimização por diversificação de um ou mais resíduos aminoácidos no anticorpo, preferencialmente resíduos aminoácidos em uma ou mais CDRs, e por triagem da coleção de variantes de anticorpos resultante para variantes com propriedades aprimoradas. É particularmente preferencial di-versificação de um ou mais resíduos aminoácidos em LCDR3 de VL, HCDR3 de VH, LCDR1 de VL e/ou HCDR2 de VH. Pode ser feita di-versificação por sintetização de uma coleção de moléculas de DNA usando tecnologia de mutagênese de trinucleotídeo (TRIM) [Virnekas, B., Ge, L., Plückthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G., e Moroney S.E. (1994) Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucl. Acids Res. 22, 5600; vide também o Exemplo 8]. Variantes de Aminoácidos Conservadoras

[00046] Variantes de polipeptídeos podem ser produzidas que conservam a estrutura molecular glogal de uma sequência de peptídeo de anticorpo descrita aqui, neste requerimento de patente. Dadas as propriedades dos aminoácidos individuais, algumas substituições racionais serão reconhecidas pelo trabalhador especializado. Substituições de aminoácidos, isto é, "substituições conservadoras," podem ser feitas, por exemplo, com base na similaridade na polaridade, carga, so- lubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou na natureza anfipática dos resíduos envolvidos.

[00047] Por exemplo, (a) aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, tripto- fano, e metionina; (b) aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, e glutamina; (c) aminoáci- dos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina, e his- tidina; e (d) aminoácidos negativamente carregados (acidíferos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Substituições tipicamente podem ser feitas dentro dos grupos (a) a (d). Além disso, glicina e prolina podem ser substituídas uma pela outra com base em sua capacidade para romper a-hélices. De modo similar, alguns aminoácidos, tais como alanina, cisteína, leucina, metionina, ácido glutâmico, gluta- mina, histidina e lisina são mais comumente encontrados em a-hélices, ao passo que valina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano e treo- nina são mais comumente encontrados em folhas β-plissadas (β-pleated sheets). Glicina, serina, ácido aspártico, asparagina, e prolina são comumente encontrados alternadamente. Algumas substituições preferenciais podem ser feitas entre os seguintes grupos: (i) S e T; (ii) P e G; e (iii) A, V, L e I. Dado o código genético conhecido, e técnicas de DNA recombinante e sintético, o cientista versado prontamente pode construir DNAs codificando as variantes de aminoácidos conservadoras.

[00048] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "identidade de sequência" entre duas de sequências polipeptídeos, indica a percentagem de aminoácidos que são idênticas entre as sequências. "Homologia de sequência" indica a percentagem de amino- ácidos que ou são idênticos ou que representam substituições de ami- noácidos conservadoras. Sequências de polipeptídeos preferenciais da invenção contêm sequências de aminoácidos, por meio do que a. a sequência de aminoácidos da HCDR1 é idêntica à SEQ ID NO: 5 em no mínimo 7 de 8 aminoácidos, e b. a sequência de aminoácidos da HCDR2 é idêntica à SEQ ID NO: 6 em no mínimo 14 de 19, mais preferencial 15 de 19, mais preferencial 16 de 19, mais preferencial 17 de 19, ou ainda mais prefe-rencial 18 de 19 aminoácidos, e c. a sequência de aminoácidos da HCDR3 é idêntica à SEQ ID NO: 7 em no mínimo 8 de 11, mais preferencial 9 de 11, ou ainda mais preferencial 10 de 11 aminoácidos, e d. a sequência de aminoácidos da LCDR1 é idêntica à SEQ ID NO: 8 em no mínimo 12 de 14, ou mais preferencial 13 de 14 ami- noácidos, e e. a sequência de aminoácidos da LCDR2 é idêntica à SEQ ID NO: 9 em no mínimo 4 de 7, mais preferencial 5 de 7, ou ainda mais preferencial 6 de 7 aminoácidos, e f. a sequência de aminoácidos da LCDR3 é idêntica à SEQ ID NO: 10 em no mínimo 11 de 12 aminoácidos. Moléculas de DNA da invenção

[00049] A presente invenção também se refere às moléculas de DNA que codificam um anticorpo da invenção. Estas sequências incluem, mas não estão limitadas a, as moléculas de DNA estipuladas nas SEQ ID NOs 3 e 4.

[00050] As moléculas de DNA da invenção não estão limitadas às sequências reveladas aqui, neste requerimento de patente, mas também incluem variantes das mesmas. Variantes de DNA dentro da invenção podem ser descritas por meio de referência a suas propriedades físicas em hibridização. O trabalhador especializado reconhecerá que pode ser usado DNA para identificar seu complemento e, como o DNA tem duplo filamento, seu equivalente ou homólogo, usando técnicas de hibridização de ácido nucleico. Também será reconhecido que pode ocorrer hibridização com menos de 100% de complementaridade. No entanto, dada a escolha apropriate de condições, podem ser usadas técnicas de hibridização para diferenciar entre sequências de DNA com base em sua relação estrutural com uma sonda em particular. Para orientação com relação a semelhantes condições vide, Sam- brook et al., 1989 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA)] e Ausubel et al., 1995 [Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons].

[00051] A similaridade estrutural entre duas sequências de polinu- cleotídeos pode ser expressada como uma função da "estringência" das condições sob as quais as duas sequências vão hibridizar uma com a outra. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "estringência" se refere à extensão que as condições desfavorecem hibridização. Condições estringentes desfavorecem fortemente hibridização, e sometne as moléculas mais estruturalmente relacionadas vão hibridizar uma com a outra sob semelhantes condições. Ao contrário, condições não-estringentes favorecem hibridização de moléculas apresentando um menor grau de relação estrutural. Portanto, a estringência de hibridização se correlaciona diretamente com as relações estruturais de duas sequências de ácido nucleico. As relações que se seguem são úteis para correlacionar hibridização e relacionali- dade (onde Tm é a temperatura de fusão de um duplex de ácido nu- cleico): a. Tm = 69,3 + 0,41(G+C)% b. A Tm de um DNA duplex diminui por 1°C com cada aumento de 1% no número de pares de bases incompatíveis. c. (Tm)μ2- (Tm) μ1 = 18,5 log10μ2/μ1 onde μ1 e μ2 são as forças iônicas de duas soluções.

[00052] A estringência de hibridização é uma função de muitos fatores, incluindo concentração de DNA total, força iônica, temperatura, tamanho de sonda e a presença de agentes os quais rompem ligação de hidrogênio. Fatores que promovem hibridização incluem concentrações de DNA elevadas, forças iônicas elevadas, baixas temperaturas, tamanho de sonda mais longo e a ausência de agentes que rompem ligação de hidrogênio. Hibridização tipicamente é realizada em duas fases: a fase de “ligação” e a fase de “lavagem”.

[00053] Primeiro, na fase de ligação, a sonda é ligada ao alvo sob condições favorecendo hibridização. A estringência geralmente é con-trolada neste estágio alterando a temperatura. Para estringência elevada, a temperatura é geralmente entre 65°C e 70°C, a menos que sejam usadas sondas de oligonucleotídeos curtas (< 20 nt). Uma solução de hibridização representativa compreende 6x SSC, 0,5% de SDS, 5x solução de Denhardt e 100 μg de DNA de veículo inespecífico [vide Ausubel et al., section 2.9, supplement 27 (1994)]. Logicamente, são conhecidas muitas condições tampão diferentes, mas funcionalmente equivalentes. Onde o grau de relacionalidade é menor, pode ser escolhida uma temperatura menor. Temperaturas de ligação de baixa estringência estão entre cerca de 25°C e 40°C. Estringência média é entre no mínimo cerca de 40°C a menos de cerca de 65°C. Alta estringência é no mínimo cerca de 65°C.

[00054] Segundo, o excesso de sonda é removido por lavagem. É nesta fase que geralmente são aplicadas condições mais estringentes. Portanto, é este estágio de "lavagem" que é o mais importante para determinar a relacionalidade através de hibridização. As soluções de lavagem tipicamente contêm menores concentrações de sal. Uma so-lução de estringência média exemplar contém 2x SSC e 0,1% de SDS. Uma solução de lavagem de alta estringência contém o equivalente (em força iônica) de menos de cerca de 0,2x SSC, com uma solução estringente preferencial contendo cerca de 0,1x SSC. As temperaturas associadas com várias estringências são as mesmas conforme discutido acima para "ligação." A solução de lavagem tipicamente também é substituída uma série de vezes durante a lavagem. Por exemplo, condições de lavagem de alta estringência típicas compreendem lavagem duas vezes por 30 minutos a 55° C e três vezes por 15 minutos a 60° C.

[00055] Por conseguinte, é assunto da presente invenção uma sequência de ácido nucleico isolada que codifica o anticorpo e fragmentos de ligação antigênica da presente invenção.

[00056] Outra modalidade da presente invenção é a sequência de ácido nucleico isolada supracitada, a qual codifica os anticorpos da presente invenção, por meio do que as sequências de ácido nucleico são conforme dado na tabela 5.

[00057] Por conseguinte, a presente invenção inclui moléculas de ácido nucleico que hibridizam para as moléculas estipuladas na Tabela 5 sob condições de ligação e de lavagem de alta estringência, onde as mo-léculas nucléicas referidas codificam um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo tendo propriedades conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Moléculas preferenciais (de uma perspectiva de mRNA) são as que têm no mínimo 75% ou 80% (preferencialmente no mínimo 85%, mais preferencialmente no mínimo 90% e o mais preferencialmente no mínimo 95%) de identidade de sequência com uma das moléculas de DNA descritas aqui, neste requerimento de patente. As moléculas bloqueiam sinalização mediada por receptores de prolactina. Variantes Funcionalmente Equivalentes

[00058] Ainda outra classe de variantes de DNA dentro do âmbito da invenção pode ser descrita com referência ao produto que codificam. Es- tes genes funcionalmente equivalentes são caracterizados pelo fato de que codificam as mesmas sequências de peptídeos encontradas nas SEQ ID No: 1 e 2 devido à degeneração do código genético.

[00059] É reconhecido que variantes de moléculas de DNA proporci-onadas aqui, neste requerimento de patente, podem ser construídas em vários modos diferentes. Por exemplo, podem ser construídas como DNAs completamente sintéticos. Métodos para sintetizar de modo eficaz oligonucleotídeos na faixa de 20 a cerca de 150 nucleotídeos estão am-plamente disponíveis. Vide Ausubel et al., section 2.11, Supplement 21 (1993). Oligonucleotídeos de sobreposição podem ser sintetizados e montados em um modo reportado pela primeira vez por Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971); vide também Ausubel et al., supra, Section 8.2. DNAs sintéticos preferencialmente são projetados com sítios de res-trição convenientes manipulados nas extremidades 5' e 3' do gene para facilitar clonagem em um vetor apropriado.

[00060] Conforme indicado, um método para gerar variantes é iniciar com um dos DNAs revelados aqui, neste requerimento de patente, e em seguida conduzir mutagênese sítio-direcionada. Vide Ausubel et al., supra, chapter 8, Supplement 37 (1997). Em um método típico, um DNA alvo é clonado em um veículo de bacteriófago de DNA de filamento único. DNA de filamento único é isolado e hibridizado com um oligonucleotídeo contendo a uma ou mais alterações de nucleotídeos desejadas. O filamento complementar é sintetizado e o fago de filamento duplo é introduzido em um hospedeiro. Parte da progênie resultante conterá o mutante desejado, o qual pode ser confirmado usando sequenciamento de DNA. Além disso, estão disponíveis vários métodos que aumentam a probabilidade de que o fago da progê- nie venha a ter o mutante desejado. Estes métodos são de conhecimento geral das pessoas na área e estão disponíveis comercialmente kits para produzir os mutantes referidos. Constructos de DNA recombinante e expressão

[00061] A presente invenção proporciona adicionalmente construc- tos de DNA recombinante compreendendo uma ou mais das sequências de nucleotídeos da presente invenção. Os constructos recombi- nantes da presente invenção são usados em conexão com um vetor, tal como um plasmídeo, fagomídio, fago ou vetor viral, no qual uma molécula de DNA codificando um anticorpo da invenção é inserida.

[00062] O gene codificado pode ser produzido por técnicas descritas em Sambrook et al., 1989, e Ausubel et al., 1989. Alternativamente, as sequências de DNA podem ser sintetizadas quimicamente usando, por exemplo, sintetizadores. Vide, por exemplo, as técnicas descritas em Oligonucleotide SYNTHESIS (1984, Gait, ed., IRL Press, Oxford), o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, em sua totalidade. O especilista na área é capaz de fundir DNA codificando os domínios variáveis com fragmentos genéticos codificando regiões constantes de vários isotipos de IgG humana ou derivados dos mesmos, quer mutados ou não- mutados. Ele é capaz de aplicar tecnologia de DNA recombinante de modo a fundir ambos os domínios variáveis em um formato de cadeia única usando encadeadores tais como um trecho de quinze aminoácidos contendo três vezes glicina-glicina-glicina-glicina-serina. Os construc- tos recombinantes da invenção compreendem vetores de expressão que são capazes de expressar o RNA e/ou produtos de proteína do um ou mais DNAs codificados. O vetor pode compreender adicionalmente sequências reguladoras, incluindo um promotos encadeados operavelmente ao frame de leitura aberta (ORF). O vetor pode com- preendeer adicionalmente uma sequência de marcador selecionável. Sinais de iniciação específica e secretores bacterianos também podem ser necessários para translação eficaz de sequências codificantes de genes alvo inseridos.

[00063] A presente invenção proporciona adicionalmente células hospedeiras contendo no mínimo um dos DNAs da presente invenção. A célula hospedeira pode ser virtualmente qualquer célula para a qual estejam disponíveis vetores de expressão. Pode ser, por exemplo, uma célula hospedeira eucariótica superior, tal como uma célula de mamífero, uma célula hospedeira eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura, e pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. A introdução do constructo recombinante na célula hospedeira pode ser efetuada por transfecção de fosfato de cálcio, DEAE, transfecção mediada por dextrano, eletroporação ou infecção por fago. Expressão Bacteriana

[00064] Vetores de expressão úteis para utilização bacteriana são construídos por insersão de uma sequência de DNA estrutural codifi-cando uma proteína desejada junto com sinais de iniciação e de termi-nação de translação adequados em fase de leitura operável com um promotor funcional. O vetor compreenderá um ou mais marcadores selecionáveis fenotípicos e uma origem de replicação para assegurar a manutenção do vetor e, caso desejável, para proporcionar amplificação dentro do hospedeiro. Hospedeiros procarióticos adequados para transformação incluem E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimuri- um e várias espécies dentro dos gêneros Pseudomonas, Strep- tomyces, e Staphylococcus.

[00065] Vetores bacterianos podem ser, por exemplo, à base de bacteriófagos, de plasmídeos ou de fagomídios. Estes vetores podem conter um marcador selecionável e origem bacteriana de replicação derivada a partir de plasmídeos disponíveis comercialmente tipicamente contendo elementos do vetor de clonagem de conhecimento geral pBR322 (ATCC 37017). Depois de transformação de uma cepa hos-pedeira adequada e crescimento da cepa hospedeira até uma densi- dade celular apropriada, o promotor selecionado é des- reprimido/induzido por meios apropriados (por exemplo, mudança de temperatura ou indução química) e as células são cultivadas por um período adicional. As células são tipicamente colhidas por centrifugação, rompidas por meios físicos ou químicos, e o extrato bruto resultante conservado para purificação posterior.

[00066] Em sistemas bacterianos, uma série de3 vetores de expressão podem ser selecionados vantajosamente dependendo da utilização pretendida para a proteína sendo expressada. Por exemplo, quando uma grande quantidade de uma proteína semelhante deve ser produzida, para a geração de anticorpos ou para triagem de bibliotecas de peptídeos, por exemplo, podem ser desejáveis vetores os quais dirigem a expressão de altos níveis de produtos de proteínas de fusão que são prontamente purificadas.

[00067] Portanto um objeto da presente invenção é um vetor de ex-pressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando para os novos anticorpos da presente invenção. Expressão Mamária e Purificação

[00068] Sequências reguladoras preferenciais para expressão de células hospedeiras de mamífero incluem elementos virais que dirigem altos níveis de expressão de proteína em células d emamífero, tais como promotores e/ou reforçadores derivados de cytomegalovírus (CMV) (tais como o promotor/reforçador CMV), Simian Virus 40 (SV40) (tais como o promotor/reforçador SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Para descrição adicional de elementos reguladores virais, e sequências dos mesmos, vide, por exemplo, a patente dos Estados Unidos No. U.S. 5.168.062 por Stinski, a patente dos Estados Unidos No. U.S. 4.510.245 por Bell et al. e a patente dos Estados Unidos No. U.S. 4.968.615 por Schaffner et al. Os vetores de expressão recombinante também podem incluir origens de replicação e marcadores selecionáveis (vide, por exemplo, a patente dos Estados Unidos No. U.S. 4.399.216, a patente dos Estados Unidos No. U.S. 4.634.665 e a patente dos Estados Unidos No. U.S. 5.179.017, por Axel et al.). Marcadores selecionáveis adequados incluem genes que conferem resistência a fármacos tais como G418, higromicina ou metotrexato, sobre uma célula hospedeira na qual o vetor tenha sido introduzido. Por exemplo, o gene da diidrofolato redutase (DHFR) confere resistência a metotrexato e o gene neo confere resistência a G418.

[00069] Pode ser realizada transfecção do vetor de expressão em uma célula hospedeira usando técnicas de rotina tais como eletropora- ção, precipitação de fosfato de cálcio, e transfecção de DEAE- dextrano.

[00070] Células hospedeiras de mamífero adequadas para expressão dos anticorpos, porções de ligação antigênica, ou derivados das mesmas proporcionados aqui, neste requerimento de patente, incluem células de ovário de hamster chinês (células CHO, Chinese Hamster Ovary) [incluindo células CHO dhfr-, descritas em Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, conforme descrito em R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]], células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é projetado de tal modo que a proteína expressada é secretada no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos, porções de ligação antigênica, ou derivados dos mesmos podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína de rotina.

[00071] Anticorpos da invenção ou um fragmento de ligação antigê- nica dos mesmos podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes por meio de métodos de conhecimento geral incluindo, mas não limitados a sulfato de amônio ou precipitação por etanol, extração com ácido, cromatografia de Proteína A, cromato- grafia de Proteína G, cromatografia de permuta de ànions ou de cá- tions, cromatografia de fosfo-celulose, cromatografia de interação hi- drofóbica, cromatografia por afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. Cromatografia líquida de alta performance (“HPLC”) também pode ser empregada para purificação. Vide, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, ou Current Proto-cols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), por exemplo, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada uma inteiramente incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00072] Anticorpos da presente invenção ou fragmento de ligação antigênica dos mesmos incluem produtos purificados naturalmente, produtos de procedimentos sintéticos químicos, e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro eucariótico, in-cluindo, por exemplo, células de levedura, de plantas superiores, de inseto e de mamífero. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, o anticorpo da presente in-venção pode ser glicosilado ou pode ser não glicosilado. Os métodos referidos são descritos em muitos manuais de laboratório de rotina, tais como Sambrook, supra, Sections 17.37-17.42; Ausubel, supra, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 e 20.

[00073] Portanto um objeto da presente invenção são também células hospedeiras compreendendo o vetor ou uma molécula de ácido nucleico, por meio do que a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira eucariótica superior, tal como uma célula de mamífero, uma célula hospedeira eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura, e pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacte- riana.

[00074] Outro objeto da presente invenção é um método de utilizar a célula hospedeira para produzir um anticorpo e fragmentos de ligação antigênica, compreendendo cultivar a célula hospedeira sob condições adequadas e recuperar o anticorpo referido.

[00075] Portanto outro objeto da presente invenção é o anticorpo conforme descrito na presente invenção produzido com as células hospedeiras da presente invenção e purificado até no mínimo 95% de homogeneidade por peso. Endometriose e adenomiose (endometriose interna)

[00076] Endometriose é um distúrbio ginecológico benigno, dependente de estrogênio, que é caracterizado pela presença de tecido endometrial (glândulas e estroma) fora da cavidade uterina. Lesões en- dometrióticas são essencialmente encontradas sobre o peritônio pélvico, nos ovários e no septo retovaginal (Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. 24:235-238, 1997). A endometriose é frequentemente associada com infertilidade e sintomas de dor tais como dismenorréia. Além disso, muitos pacientes sofrem de doenças autoimunes (Hum. Reprod. 17(19):2715-2724, 2002). Adenomiose uterina também conhecida como endometriose interna descreve uma subforma de endometriose a qual é restrita ao útero. Em caso de adenomiose uterina, as glândulas endometriais invadem o miométrio e a parede uterina.

[00077] De acordo com a teoria de transplantação, fragmentos en- dometriais são liberados por menstruação retrógrada para dentro da cavidade peritoneal tanto em pacientes quanto em mulheres saudáveis (Obstet. Gynecol. 64:151-154, 1984). Quatro fatores principais parecem estar crucialmente envolvidos no êxito do estabelecimento de lesões endometrióticas na cavidade pélvica das pacientes: a) Na fase secretora final do ciclo menstrual, as células en- dometriais em mulheres saudáveis se tornam apoptóticas. Em pacientes, a extensão da apoptose em células endometriais é claramente reduzida (Fertil. Steril. 69:1042-1047,1998). Portanto, em pacientes há uma maior probabilidade do que em mulheres saudáveis, de que fra-gmentos endometriais que tenham sido liberados para dentro da cavidade peritoneal por menstruação retrógrada não morram e implantem com sucesso. b) Para implantação com sucesso no peritônio e sobrevida de longo termo dos fragmentos endometriais ectópicos, devem se formar novos vasos sanguíneos (British Journal of Pharmacology, 149:133-135, 2006). c) Muitas pacientes sofrem de doenças autoimunes e por-tanto têm um sistema imune comprometido (Hum. Reprod. 17(19): 2002, 2715-2724, 2002). Isto pode levar à conclusão de que uma resposta imune intacta - conforme está presente em mulheres saudáveis - pode ter um papel importante para a prevenção do estabelecimento de lesões endometrióticas. d) As lesões precisam crescer e portanto dependem da presença de estímulos mitogênicos e de fatores de crescimento.

[00078] Para o tratamento de endometriose, atualmente existem as seguintes abordagens: a) Análogos do hormônio de liberação de gonadotropina (GnRH): leva a supressão da síntese de estradiol ovariana e induzem a atrofia de implantes endometrióticos ectópicos que dependem cruci-almente da presença de estradiol para crescimento. b) Inibidores da aromatase: inibem a produção local de es-tradiol por implantes endometrióticos, induzem apoptose e inibem a proliferação de fragmentos endometrióticos ectópicos. c) Moduladores de receptores de estrogênio seletivos: têm atividfade antagonista de receptores de estrogênio em implantes en- dometriais normais e ectópicos e portanto levam a atrofia de tecido endometriótico ectópico implantado. d) Agonistas de receptores da: progesterona inibem a pro- liferação de células endometriais normais e ectópicas, induzem diferenciação e apoptose. e) Contraceptivos orais combinados: mantêm o status quo, previnem a progressão da doença, e induzem atrofia do endométrio ectópico e eutópico. f) Excisão cirúrgica de lesões.

[00079] Análogos de GnRH, SERMs, e inibidores da aromatase têm graves efeitos colaterais e levam a ondas de calor e perda óssea em mulheres jovens sofrendo de endometriose. O tratamento com agonis- tas de receptores da progesterona leva a inibição da ovulação, san- gramento menstrual irregular seguido por amenorréia, ganho de peso corporal e depressão. Devido ao aumento do risco de trombembolismo venoso, contraceptivos orais combinados não são indicados em mulheres com mais de 35 anos, fumantes e indivíduos sofrendo de sobrepeso. A excisão cirúrgica de lesões é propensa a altas taxas de recidiva.

[00080] O anticorpo da presente invenção interfere com sinalização mediada por PRLR estimulada por prolactina produzida pela pituitária e produzida localmente ou devida a ativação de mutações de PRLR e portanto são mais eficazes do que agonistas de receptores da dopa- mina 2 os quais interferem somente com a secreção de prolactina pela pituitária.

[00081] Portanto um objetivo da presente invenção é o anticorpo ou fragmentos de ligação antigênica conforme descrito na presente invenção como um medicamento.

[00082] PRL e o PRLR são expressados no útero e têm um papel na fisiologia uterina normal; a PRL pode agir como um potente mitóge- no e tem uma função imunomoduladora. Na presente invenção é mostrado que alterações no sistema PRL/PRLR têm um papel na endome- triose humana. Uma análise da expressão de PRL e do PRLR no en- dométrio de mulheres saudáveis e no endométrio e em lesões de pa-cientes (vide o Exemplo 4) por PCR Taqman quantitativo é mostrada nas Figuras 1 e 2.

[00083] Conforme demonstrado na Figura 1 (expressão de PRL) e na Figura 2 (expressão de PRLR), tanto PRL quanto seu receptor são fortemente hiperegulados em lesões endometrióticas. Estes achados são surpreendentes e em nítido contraste com um estudo previamente publicado (Acta Obstet Gynecol Scand 81:5-10, 2002) o qual descreve ausência quase completa de expressão de PRLR em lesões endome- trióticas humanas.

[00084] Os achados da presente invenção produzem pela primeira vez evidência experimental de que a sinalização de PRL autócrina tem um papel fundamental no estabelecimento, crescimento, e manutenção de lesões endometrióticas.

[00085] O anticorpo contra PRLR Mat3 foi testado com sucesso em um modelo animal de endometriose interna, isto é, adenomiose uterina em camundongos (vide o Exemplo 5). A adenomiose é caracterizada por crescimento infiltrativo de glândulas endometriais na camada mio- metrial do endométrio. Assemelha-se a uma forma de endometriose restrita ao útero - a única forma de endometriose que espécies não- menstruando podem desenvolver.

[00086] Danazol o qual é eficaz no tratamento clínico de pacientes sofrendo de endometriose também é eficaz no tratamento de adeno- miose uterina (Life Sciences 51:1119-1125, 1992). No entanto o dana- zol é uma progestina androgênica e leva a graves efeitos colaterais androgênicos em mulheres jovens, os quais limitam sua utilização.

[00087] O anticorpo da presente invenção resolve o problema de proporcionar novos tratamentos ou prevenção para endometriose e apresenta menos efeitos colaterais do que as terapias de rotina atuais.

[00088] Outro aspecto da presente invenção é a utilização do anti- corpo Mat3 e fragmentos de ligação antigênica conforme descrito na presente invenção para o tratamento ou prevenção de endometriose e adenomiose (endometriose interna). Doença de mama benigna e mastalgia

[00089] Doença de mama benigna engloba uma variedade de sintomas, tais como doença de mama fibrocística, fibroadenoma, mastal- gia, e macrocistos. 30 a 50% das mulheres na pré-menopausa sofrem de doença de mama fibrocística (Epidemiol Rev 19:310-327, 1997). Dependendo da idade das mulheres, doença de mama benigna pode se apresentar com fenótipos distintos (J Mammary Gland Biol Neoplasia 10: 325-335, 2005): durante as fases reprodutivas iniciais (15 a 25 anos) quando ocorre desenvolvimento lobular na mama normal, doença de mama benigna resulta em fibroadenomas. São observados fi-broadenomas gigantes únicos bem como múltiplos adenomas. Estes fibroadenomas são compostos de células estromais bem como epiteli- ais e se originam dos lóbulos. Na fase reprodutiva madura (25 a 40 anos) a mama está sujeita a alterações cíclicas durante cada ciclo menstrual. Mulheres doentes se apresentam com mastalgia cíclica e vários nódulos em suas mamas. Posteriormente (35 a 55 anosof age), a mama normal involui ao passo que a mama doente apresenta ma- crocistos e pode ser observada hiperplasia epitelial com e sem atipia. Estas formas de doença de mama benigna que são acompanhadas por proliferação de células epiteliais aumentada têm um maior risco de desenvolvimento de carcinomas mamários. Este risco pode ser de até 11% se houver atipias celulares presentes ma fração celular prolifera- tiva (Zentralbl Gynakol 119: 54-58, 1997). 25 % das mulheres com 60 a 80 anos de idade também sofrem de doença de mama benigna, frequentemente a terapia de reposição de estrogênio ou adiposidade são as razões para persistência de doença de mama benigna depois da menopausa (Am J Obstet Gynecol 154: 161-179, 1986).

[00090] A patofisiologia da doença de mama fibrocística é determinada por predominância de estrogênio e deficiência de progesterone que resulta em hiperproliferação de tecidos conjuntivos (fibrose) a qual é seguida por proliferação de células epiteliais facultativa. Conforme já mencionado, o risco de câncer de mama é elevado em pacientes apresentando proliferação de células epiteliais aumentada dentro dos focos fibrocísticos. A doença de mama clinicalmente fibrocística se apresenta com dor nas mamas e sensibilidade nas mamas. 70 % das pacientes com doença de mama fibrocística sofrem ou de insuficiência de corpo lúteo ou de anovulação (Am J Obstet 154: 161-179, 1986). A insuficiência de corpo lúteo resulta em níveis reduzidos de progestero- na e predominância de estrogênio.

[00091] A mastalgia (dor nas mamas) afeta cerca de 70 % das mulheres em algum momento em seu tempo de vida reprodutiva. A dor nas mamas pode ser ou não associada com outros critérios da sín- drome pré-menstrual. Foi demonstrado que mulheres sofrendo de mastalgia respondem com um excesso de liberação de prolactina depois da estimulação do eixo hipotalâmico pituitário (Clin Endocrinol 23: 699-704, 1985).

[00092] As terapias de rotina para doença de mama benigna e mas- talgia são: 1) Bromocriptina

[00093] A bromocriptina como um agonista da dopamina bloqueia somente a síntese de prolactina pela pituitária, mas não a síntese local de prolactina nas células epiteliais mamárias. Portanto somente é eficaz nestas formas de mastalgia e doença de mama benigna que se baseiam em níveis elevados de prolactina sistêmica. Os principais efeitos colaterais da bromocriptina são:

[00094] Náusea, vômito, edema, hipotensão, vertigem, perda de cabelo, cefaléia, e alucinações. 2) Danazol

[00095] Danazol é uma progestina androgênica que através de sua atividade antigonadotrófica combate a predominância de estrogênio observada na doença de mama benigna. Os principais efeitos colaterais são:

[00096] Irregularidades menstruais, depressão, acne, hirsutismo, engrossamento da voz, e ondas de calor bem como ganho de peso. 3) Tamoxifeno

[00097] Tamoxifeno é um modulador de receptores estrogênicos seletivos com atividade antiestrogênica na mama e atividade estrogê- nica no útero. Os principais efeitos colaterais são: sintomas de pós-menopausa tais como perda óssea e ondas de calor, cistos de ovário, e carcinoma endometrial. 4) Progestinas

[00098] As progestinas inibem doença de mama benigna através de supressão do eixo pituitário gonadal, inibição da ovulação e depleção de estrogênio. A depleção de estrogênio leva a sintomas de menopausa tais como perda óssea e ondas de calor. 5) Contraceptivos orais combinados de baixa dose

[00099] Este tratamento não é indicado em mulheres com mais de 35 anos de idade, fumantes bem como pacientes diabéticas e com so-brepeso.

[000100] Em geral, tem sido visto que os níveis de prolactina estão aumentados em um terço das mulheres com doença de mama benigna. Como os estrogênios aumentam a secreção de prolactina pela pituitária, imagina-se que o aumento nos níveis séricos de prolactina seja uma consequência da predominância de estrogênios nesta doença. Foi reportado que uma mutação de PRLR ativante está frequentemente presente em mulheres sofrendo de múltiplos adenomas de mama - de modo semelhante a um subtipo de doença de mama fibrocística Paul Kelly, Breast Congress Turin, 2007 e Proc Natl Acad Sci 105: 14533-14538; 2008).

[000101] Doença de mama benigna, mastalgia e tensão mamária pré-menstrual se baseiam em um mecanismo patofisiológico comum: aumento da sinalização de prolactina. A sinalização de prolactina elevada pode ser a consequência de: ■ hiperprolactinemia sistêmica (devida a adenoma da pi-tuitária) ■ hiperprolactinemia local (devida a síntese de prolactina em células epiteliais de glândulas mamárias proliferativas). A hiperpro- lactinemia local não se traduz em níveis elevados de prolactina no sangue. ■ sinalização de PRLR constitutivamente ativa na presença de níveis normais de prolactina (devido a uma mutação de PRLR ativante).

[000102] Dado que algumas formas de doença de mama benigna podem dar origem ao câncer de mama, existe uma necessidade médica para o tratamento desta doença.

[000103] De modo a demonstrar a eficácia de anticorpo contra PRLR neutralizante Mat3 em um modelo pré-clínico de doença de mama be-nigna, foi empregado um modelo de camundongo baseado em hiper- prolactinemia sistêmica. Camundongos adultos Balb/c foram transplan-tados com isoenxertos de pituitária sob a cápsula renal conforme descrito no Exemplo 6 (In: Methods in Mammary gland Biology and Breast Cancer Research, 101-107, 2000). No modelo de camundongo da presente invenção para doença de mama benigna, não tinha sido usado um carcinogênio tal como DMBA; os camundongos foram enxertados somente com glândulas pituitárias de modo a estudar a consequência da aplicação de anticorpo Mat3 sobre a proliferação de células epiteliais benignas aumentada. Em um estudo anterior os animais iso- enxertados com pituitária foram tratados além disso com o carcinogê- nio DMBA e foram analisados os efeitos de um anticorpo monoclonal contra PRLR diferente sobre o desenvolvimento de câncer de mama (Am J Pathol 133:589-595,1988). Estes anticorpos foram eficazes no tratamento de câncer de mama, no entanto os efeitos sobre doença de mama benigna não foram analisados (Am J Pathol 133:589-595,1988).

[000104] No modelo da presente invenção, hiperprolactinemia sistêmica causou aumento da proliferação de células epiteliais na glândula mamária, e estimulou ramificação lateral e desenvolvimento lobuloal- veolar em comparação com camundongos de controle virgens não tratados. Conforme descrito no Exemplo 6, o anticorpo contra PRLR neu- tralizante Mat3 foi testado neste modelo de camundongo Balb/c em comparação com um anticorpo inespecífico com respeito a sua capacidade para: ■ bloquear ramificação lateral e desenvolvimento lobulo- alveolar ■ inibir a proliferação de células epiteliais mamárias ■ inibir a expressão do gene elf5 alvo de prolactina

[000105] O anticorpo contra PRLR neutralizante Mat3 inibiu ramificação lateral (Figura 3A) e expressão do gene elf5 alvo de prolactina (Figura 3B).

[000106] Outro aspecto da presente invenção é a utilização do anticorpo Mat3 e fragmentos de ligação antigênica conforme descrito na presente invenção para tratamento de doença de mama benigna e mastalgia em mulheres na pré- e na pós-menopausa.

[000107] Outras indicações as quais se beneficiam do bloqueio de sinalização mediada por PRLR pelo anticorpo Mat3: Contracepção feminina não-hormonal:

[000108] As abordagens correntes para contracepção feminina são as seguintes: a) Contraceptivos orais combinados contendo estrogênios e progestinas.

[000109] O componente progestogênico media o efeito contraceptivo através de feedback negativo sobre o eixo hipotalâmico-pituitário- gonadal. O componente estrogênico garante um bom controle de san- gramento e potencializa a ação gestagênica através de indução do re-ceptor de progesterona em células alvo. b) Dispositivos intrauterinos contendo progestinas somente.

[000110] A progestina liberada localmente torna o endométrio em um estado resistente a implantação. Além disso, o muco cervical se torna quase impermeável para células do esperma. c) Pílulas e implantes de somente progestina.

[000111] A progestina inibe a ovulação através de feedback negativo sobre o eixo hipotalâmico-pituitário-gonadal. Além da permeabilidade do muco cervical para células do esperma ser reduzida. d) Anéis vaginais contendo etinilestradiol mais progestinas

[000112] O principal efeito colateral de contraceptivos oraois combinados é o risco elevado para tromboembolismo venoso (VTE). Além disso, mulheres com sobrepeso ou fumantes, bem como mulheres sofrendo de doenças autoimunes tais como lúpus e mulheres com mais de 35 anos não podem usar contraceptivos orais combinados.

[000113] Dispositivos intrauterinos e implantes contendo progestinas somente podem levar a sangramento uterino disfuncional.

[000114] Pílulas de progestina somente podem causar padrões irre-gulares de sangramento, spotting, amenorréia. Aumenta o risco de gravidezes ectópicas. Ganho de peso e reduções na densidade da massa óssea são efeitos colaterais adicionais.

[000115] Anéis vaginais podeom levar a vaginite, leucorréia ou expulsão.

[000116] Camundongos deficientes de PRLR tinham sido gerados alguns anos atrás (Genes Dev 11:167-178, 1997). De modo interessante, fêmeas deficientes de PRLR, mas não camundongos machos, são completamente estéreis. As fêmeas PRLR-/- apresentaram uma parada do desenvolvimento de ovo imediatamente depois da fertilização, isto é, apresentaram uma parada do desenvolvimento pré- implantação ao passo que a ovulação foi normal. Somente muito poucos oócitos atingiram o estágio de blastocisto e foram incapazes de implantar em fêmeas mutantes mas desenvolveram até embriões normais em mães adotivas selvagens depois da transplantação. O fenóti- po de infertilidade de camundongos deficientes de PRLR pode ser resgatado até gestação de médio termo por suplementação de proges- terona. Obviamente, a sinalização mediada por PRLR tem um papel importante na manutenção e na função do corpo lúteo produzindo pro- gesterona que é necessária para possibilitar e manter a gestação. Além disso Fêmeas deficientes de PRLR, mas não machos, apresentaram uma redução no peso corporal associada com uma redução na massa de gordura abdominal e nos níveis de leptina.

[000117] Até o momento, não é conhecida mutação de PRLR humano inativante, portanto ainda é desconhecido o papel preciso da sinalização mediada por PRLR na fertilidade humana. No entanto, existe evidência crescente de que também em humanos; é necessário um nível mínimo de prolactina para possibilitar gestação com sucesso. Pacientes sofrendo de infertilidade primária devido a insuficiência de corpo lúteo hiperprolactinêmica foram tratados com bromocriptina. Em alguns casos, os níveis de prolactina foram supersuprimidos e fases luteínicas encurtadas reapareceram de novo (Bohnet HG et al. in Lisu- ride and other dopamine agonists editado por D.B. Calne et al, Raven Press, New York, 1983). A partir destes dados foi concluído que estados hiper- e hipoprolactinêmico interferem negativamente com a fertili- dade feminina. Isto pode ser explicado pela interação de PRL com seu receptor. No caso de baixos níveis de prolactina, não há ativação de receptor suficiente, ao passo que no caso de hiperprolactinemia, também não há ativação de receptor suficiente, uma vez que todos os receptores são bloqueados por uma molécula de prolactina e não podem mais dimerizar. Em outras palavras, a dose resposta para prolactina é em forma de sino e é obtida ativação ótima de receptor somente em uma determinada faixa de concentração. Existe evidência de um segundo estudo de que a falta de expressão de prolactina endometrial em pacientes leva a falha de implantação precoce (Human Reprod. 19:1911-1916, 2004). Além disso, foi mostrado que, ex vivo, a prolacti- na pode prevenir a apoptose de células da granulosa humana cultivadas e portanto mantém a função do corpo lúteo precoce conforme tinha sido demonstrado em camundongos deficientes de PRLR (Human Reprod. 18:2672-2677,2003).

[000118] Comparada com as abordagens de rotina supracitadas, a contracepção feminina com anticorpos contra PRLR neutralizantes tem várias vantagens: • os anticorpos podem ser usados em mulheres fumantes, com sobrepeso, e mais velhas bem como em mulheres sofrendo de lúpus eritematoso (anticorpos contra PRLR podem mesmo ser benéficos para o tratamento do lúpus e para a redução da gordura abdominal, isto é, camundongos deficientes de PRLR tinham menos gordura abdominal). • os anticorpos contra PRLR não elevam o risco VTE (trombembólico venoso) • em contraste com estrogênios e progestinas usados em contracepção oral combinada, a neutralização de sinalização mediada por PRLR leva à inibição de proliferação epitelial de mama e em contraste com abordagens hormonais para controle de fertilidade pode mesmo proteger as usuárias contra câncer de mama.

[000119] Outro objeto da presente invenção é a utilização do anticorpo Mat3 para contracepção feminina com efeitos colaterais reduzidos comparado com tratamentos de rotina. Inibição da lactação

[000120] A prolactina é o principal hormônio envolvido na lactação depois do parto. Isto é evidenciado pelo fenótipo de camundongos deficientes de PRLR. Mesmo camundongos heterozigotos têm vários problemas lactacionais e são completamente incapazes de amamentar sua prole (Frontiers in Neuroendocrinology 22:140-145, 2001).

[000121] Por muitas razões, as mulheres têm de parar o aleitamento materno, isto é, ingestão materna de drogas potencialmente perigosas para o bebê, infecções graves (mastite, nefrite), hemorragia pós-parto profusa, e doenças maternas graves tais como diabetes, carcinoma, e debilidade ou doenças do recém-nascido. Atualmente, agonistas de receptores da dopamina tais como bromocriptina e lisurida são usados para inibir a lactação depois do parto. No entanto, estes compostos podem provocar graves efeitos colaterais tais como náusea, vômito, edema, hipotensão, vertigem, perda de cabelo, cefaléia, e alucinações. Além disso os agonistas de receptores da dopamina não são indicados em mulheres sofrendo de doença cardiovascular e hipertensão. Uma desvantagem adicional da bromocriptina é seu curto tempo de meia- vida requerendo ingestão de fármaco 4 a 6 vezes ao dia durante um período de 14 dias.

[000122] Portanto, nós esperamos que os anticorpos contra PRLR neutralizantes sejam adequados para inibição de lactação. Em uma publicação anterior um antissoro produzido contra PRLR parcialmente purificado foi administrado a ratas em lactação. Foi especulado que o antissoro levou a inibição de lactação uma vez que houve uma pequena diminuição no peso da ninhada (Endocrinology 102:1657- 1661,1978). No entanto os autores não foram capazes de excluir que mesmo outros mecanismos podem ter levado à ligeira redução no peso da ninhada. Além disso eles observaram que o anti-soro causou um aumento no corpo lúteo em ratos tratados ((Endocrinology 102:1657-1661,1978). Esta observação está em nítido contraste com o fenóitipo de camundongos deficientes de PRLR ((Genes Dev 11:167-178, 1997) nos quais a ovulação foi inalterada e nos quais não foi observado nenhum aumento no corpo lúteo. Mais provavelmente o anti-soro empregado bloqueou algumas moléculas desconhecidas adicionais.

[000123] Outro objeto da presente invenção é a utilização do anticorpo Mat3 para inibição da lactação. Hiperplasia prostática benigna

[000124] A hiperplasia prostática benigna (BPH) é a quarta condição de saúde mais prevalente em homens idosos. O aumento da próstata é uma progressiva condição dependente da idade que afeta mais de 50% dos homens com > 50 anos de idade. A hiperplasia prostática benigna é caracterizada por hiperplasia de células prostáticas estromais e epiteliais, resultando na formação de grandes nódulos discretos na região periuretral da próstata a qual comprime o canal uretral. Deste modo, a diminuição do fluxo de urina é uma consequência importante da hiperplasia prostática benigna.

[000125] Terapias de rotina para hiperplasia prostática benigna englobam: a) Antagonistas de receptores a1-adrenérgicos (por exemplo, tansulosin, alfuzosin, terazosin, doxazosin) aliviam os sintomas da hiperplasia prostática benigna no trato urinário inferior. Diminuem a obstrução da saída da bexiga por bloqueio de estimulação do músculo liso da próstata mediada por alfa-receptores. Os principais efeitos colaterais são eventos adversos vasodilatadores, vertigem e falha de ejaculação. b) Inibidores da 5α-redutase (por exemplo, finasterida)

[000126] Os inibidores da 5α-redutase previnem a formação de di- hidrotestosterona, a forma ativa de testosterona na próstata, a qual é responsável pelo aumento da próstata. Os principais efeitos colaterais são disfunção sexual, tal como distúrbios eréteis e redução da libido. c) Ressecção transuretral da próstata (TURP)

[000127] Este tratamento cirúrgico é associado com alta morbidez. Os efeitos colaterais são sangramento, incontinência, formação de estenose, perda de ejaculação, e perfuração da bexiga. d) Colocação de stent de próstata

[000128] Um stent é inserido dentro da parte prostática da uretra para garantir fluxo de urina apropriado. Os principais efeitos colaterais são encrustação, infecção do trato urinário, e migração do stent. Além disso, os stents têm de ser removidos antes de qualquer manipulação transuretral.

[000129] Conforme descrito para a glândula mamária, a PRL e o PRLR agem em um modo autócrino/parácrino (J. Clin. Invest. 99:618 pp,1997) dentro da próstata.

[000130] Estudos clínicos indicam que hiperprolactinemia (e acromegalia) está associada com aumento prostático e acumulação estromal de células inflamatórias. O hormônio do crescimento humano pode ligar ao PRLR humano na presença de zinco o qual pode explicar porque acromegalia pode levar a hiperplasia prostática benigna. Frequentemente os níveis séricos de PRL estão elevados em pacientes com hiperplasia prostática benigna.

[000131] Animais transgênicos superexpressando o gene de PRL ubiquamente, develop severe stromal prostate hiperplasia, indicando PRL como um importante fator patofisiológico para o desenvolvimento de hiperplasia prostática (Endocrinology 138:4410 pp,1997). Além disso, a superexpressão local de PRL em camundongos transgênicos sob o promotor prostático específico probasina resulta em expansão es- tromal, acumulação de células inflamatórias e displasia epitelial focal as quais são características básicas da hiperplasia prostática benigna humana (Endocrinology 144:2269 pp,2003).

[000132] Outro aspecto da presente invenção é a utilização do anticorpo Mat3 ou fragmentos de ligação antigênica conforme descrito na presente invenção para tratamento de hiperplasia prostática benigna. Terapia hormonal combinada

[000133] Para o tratamento de ondas de calor em mulheres na pós- menopausa que ainda têm útero, foram usadas combinações de es- trogênio (estradiol, ou estrogênios equinos conjugados = CEE) e pro- gestinas (por exemplo, acetato de medroxiprogesterona (MPA), pro- gesterona, drospirenona, levonorgestrel). Progestinas têm de ser adi-cionadas para inibir a proliferação de células epiteliais uterinas ativadas por estradiol. No entanto, a adição de progestinas aumenta a proliferação de células epiteliais mamárias. Como tanto as células epiteliais mamárias normais quanto as células epiteliais mamárias cancerosas respondem com proliferação ao tratamento combinado de estrogênio mais progestina, foi visto que o risco relativo de câncer de mama aumentou depois de tratamento com CEE mais MPA (JAMA 233:321- 333;2002).

[000134] O anticorpo da presente invenção resolve o problema para tratar proliferação de células epiteliais de mama aumentada observada sob terapia hormonal combinada.

[000135] Outro objeto da presente invenção é a utilização de anticorpo contra PRLR neutralizante Mat3 ou fragmentos de ligação antigêni- ca em terapia hormonal combinada (isto é, terapia de estrogênio + progestina) para inibir a proliferação de células epiteliais mamárias. Perda de cabelo

[000136] O tratamento de perda de cabelo ainda é uma necessidade não satisfeita. O cabelo do couro cabeludo cresce em ciclos: a fase anágena é caracterizada por crescimento de cabelo ativo; a fase catá- gena mostra involução e é seguida pela fase telógena (repouso). A fase exógena (a liberação do cabelo morto) coincide com o fim da fase telógena. A perda de cabelo pode ser a consequência de crescimento de perturbado em qualquer fase.

[000137] A perda de cabelo telógena pode ter muitos gatilhos (fisiológicos e stress emocional, condições médicas, deficiência de ferro e zinco), de modo importante alopecia androgênica em seus estágios iniciais mostra queda de cabelo telógena (Cleveland clinic journal of medicine 2009;76:361-367). A perda de cabelo anágena é frequentemente a consequência de radiação ou quimioterapia.

[000138] Minoxidil e Finasterida são usados para o tratamento de perda de cabelo androgenética, ao passo que glicocorticoides sãio usados para alopecia areata. Em geral, todos estes tratamentos têm efeitos colaterais (finasterida: perda da libido e impotência em homens, glicocorticoides: diabetes, ganho de peso, osteoporose), e o problema do tratamento da perda de cabelo não foi completamente resolvido.

[000139] Em roedores, experimentos de raspagem em animais adultos foram usados para analisar o efeito de compostos sobre a perda de cabelo usando recrescimento de pelo na área raspada como paradigma de leitura (British Journal of dermatology 2008;159:300-305). A raspagem de animais adultos (pelo principalmente na fase telógena) induz a fase anágena que é caractzerizada por crescimento de pelo.

[000140] Foi visto que prolactina e o PRLR são expressados nos fo- lículos capilares. A partir dos dados de expressão foi sugerido que in-terferência com sinalização mediada por PRLR pode ser útil contra perda de cabelo, mas não foram mostrados dados funcionais para comprovar esta hipótese (Aktuelle Dermatologie 31:109-116,2005).

[000141] O anticorpo da presente invenção resolve o problema de proporcionar novos tratamentos para perda de cabelo hiper- e normo- prolactinêmica em mulheres e homens.

[000142] Portanto um aspecto adicional da presente invenção é empregar o anticorpo Mat3 ou fragmentos de ligação antigênica para o tratamento ou prevenção de perda de cabelo hiper- e normoprolacti- nêmica. Tratamento e prevenção de câncer de mama resistente a anti- estrogênicos

[000143] Foi sugerido que o PRLR é superexpressado em câncer de mama humano (J Clin Endocrinol Metab 83:667-674,1998) e que inter-ferência negativa com a interação PRL-PRLR pode ter impacto positivo sobre o tratamento do câncer de mama (Int. J. Cancer: 55(5): 712721, 1993). Existe evidência de que em geral os níveis plasmáticos de prolactina se correlacionam com o risco de câncer de mama (Cancer Lett 243:160-169,2006). Em pacientes com câncer de mama resistente a tamoxifeno, o desenvolvimento de doença progressiva se correlaciona com os níveis plasmáticos de prolactina (Eur J Surg Oncol 20:118-121,1994). Camundongos transgênicos superexpressando prolactina são mais propensos ao desenvolvimento de câncer de mama (J Clin Invest 100:2744-2751,1997).

[000144] Outro aspecto da presente invenção é a utilização do anticorpo Mat3 ou fragmentos de ligação antigênica conforme descrito na presente invenção para tratamento ou prevenção de câncer de mama resistente a antiestrogênicos. DEFINIÇÕES

[000145] O "PRLR" humano de antígeno alvo conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um polipeptídeo humano tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos em seu domínio extracelular que as posições de aminoácidos 1 a 210 de SEQ ID NO. 12 e variantes que ocorrem naturalmente alélicas e/ou de união da mesma. "ECD de PRLR" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere à porção extracelular de PRLR representada pelos aminoácidos mencionados acima. Além do PRLR humano alvo também engloba versões mutadas do receptor, tais como a mutação de ativação I146L descrita por Paul Kelly (Proc Natl Acad Sci U S A.105 (38): 14533-14538, 2008; e comunicação oral em Turin, 2007).

[000146] O "PRLR" de macaco de antígeno alvo conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um polipeptídeo de rhesus bem como de cynomolgus tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos em seu domínio extracelular que as posições de aminoácidos 1 a 210 de SEQ ID NO. 11 e variantes que ocorrem naturalmente alélicas e/ou de união da mesma. "ECD de PRLR" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere à porção extracelular de PRLR representada pelos aminoácidos mencionados acima.

[000147] O "PRLR" murino ou de camundongo de antígeno alvo conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um poli- peptídeo murino tendo substancialmente a mesma sequência de ami- noácidos em seu domínio extracelular que as posições de aminoáci- dos 1 a 210 de SEQ ID NO. 13 e variantes que ocorrem naturalmente alélicas e/ou de união da mesma. "ECD de PRLR" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere à porção extracelular de PRLR representada pelos aminoácidos mencionados acima.

[000148] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, a expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" pretende se referir a uma quantidade de anticorpo terapêutico ou profilático que seria apropriado para provocar o efeito ou resposta terapêutico ou profilático desejado, inclusive aliviando alguns ou todos os sintomas de doença referidos ou reduzindo a predisposição para a doença, quando administrada de acordo com o regime de tratamento desejado.

[000149] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, um anticorpo “liga especificamente a,” é “específico a/para” ou “reconhece especificamente” um antígeno (aqui, PRLR) se um anticorpo semelhante for capaz de discriminar entre o referido antígeno e um ou mais antígenos de referência, uma vez que especificidade de ligação não é uma propriedade absoluta, porém relativa. Em sua forma mais geral (e quando não é mencionada nenhuma referência definida), “ligaão específica” é referente à capacidade do anticorpo para discriminar entre o antígeno de interesse e um antígeno não relacionado, conforme determinado, por exemplo, de acordo com um dos métodos que se seguem. Os métodos referidos compreendem, mas não estão limitados a Western blots, testes ELISA, RIA, ECL, IRMA e varreduras de peptídeos. Por exemplo, pode ser realizado um ensaio ELISA de rotina. A classificação pode ser realizada por desenvolvimento de cor padrão (por exemplo, anticorpo secundário com peróxido de raiz forte e tetrametil benzidina com peróxido de hidrogênio). A reação em algumas cavidades é classificada pela densidade ótica, por exemplo, a 450 nm. Fundo típico (= reação negativa) pode ser 0,1 OD; reação positiva típica pode ser 1 OD. Isto significa que a diferença positivo/negativo pode ser de mais de 10 vezes. Tipicamente, a determinação da especificidade de ligação é realizada usando não um único antígeno de referência, mas um conjunto de cerca de três a cinco antígenos não relacionados, tais como leite em pó, BSA, transferrina ou semelhantes.

[000150] No entanto, “ligação específica” também pode se referir à capacidade de um anticorpo para discriminar entre o antígeno alvo e um ou mais antígenos intimamente relacionados, os quais são usados como pontos de referência. Adicionalmente, “ligação específica” também pode se referir à capacidade de um anticorpo para discriminar entre diferentes partes de seu antígeno alvo, por exemplo, diferentes domínios, subdomínios ou regiões de PRLR, tais como epítopes na região N-terminal ou na região C-terminal do ECD de PRLR, ou entre um ou mais resíduos aminoácidos chave ou trechos de resíduos ami- noácidos do ECD de PRLR.

[000151] "Afinidade" ou "afinidade de ligação" KD são frequentemente determinadas por medição da constante de associação de equilíbrio (ka) e da constante de dissociação de equilíbrio (kd) e calculando o quociente de kd para ka (KD = kd/ka). O termo "imunoespecífico" ou "ligando especificamente" significa que o anticorpo liga a PRLR ou seu ECD com uma afinidade KD de menos do que ou igual a 10-6M (afinidade monovalente). O termo “alta afinidade” significa que o anticorpo liga a PRLR ou seu ECD com uma afinidade (KD) de menos do que ou igual a 10-7M (afinidade monovalente). O anticorpo pode ter substancialmente maior afinidade pelo antígeno alvo comparado com outras moléculas não relacionadas. O anticorpo também pode ter substancialmente maior afinidade pelo antígeno alvo comparado com homólogos, por exemplo, no mínimo 1,5 vez, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 10-3 vezes, 10-4 vezes, 10-5 vezes, 10-6 vezes ou maior afinidade relativa pelo antígeno alvo. As afinidades referidas podem ser prontamente determinadas usando técnicas convencionais, tal como por diálise de equilíbrio; usando o instrumento BIAcore 2000, usando procedimentos gerais esboçados pelo fabricante; por radioimunoensaio usando antígeno alvo radiomarcado; ou por outro método de conhecimento da pessoa versada. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51: 660 (1949).

[000152] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, a expressão “anticorpos antagonizam sinalização mediada por prolacti- na” pretende se referir a um bloqueio da ativação de receptores de prolactina pelos anticorpos da presente invenção o qual leva a uma completa inibição de sinalização mediada por receptores de prolactina.

[000153] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, a expressão “anticorpos competem para ligação” pretende se referir a uma competição entre um anticorpo e um segundo ligante para ligação ao receptor de prolactina.

[000154] O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e inclui anticorpos totalmente montados, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos bies- pecíficos), fragmentos de anticorpos que podem ligar o antígeno ( por exemplo, Fab', F'(ab)2, Fv, anticorpos de cadeia única, diabodies), es-truturas de camelo e peptídeos recombinantes compreendendo o acima exposto contato que apresentem a atividade biológica desejada. Os anticorpos podem carregar diferentes domínios constantes (domínios Fc) sobre sua cadeia pesada preferencialmente derivados de iso- tipos de IgG1, IgG2, ou IgG4 (vide abaixo). Podem ser introduzidas mutações para modificação de funções efetoras. Resíduos aminoáci- dos no domínio Fc que desempenham um papel dominante nas interações com a proteína do complemento C1q e os receptores de Fc foram identificados e mutações influenciando funções efetorar foram descritas (para uma revisão vide Labrijn et al., Current opinion in Immunology 20: 479-485, 2008). Particularmente, aglicosilação de IgG1 pode ser realizada por mutação de asparagina para alanina ou de asparagina para glutamina na posição de aminoácido 297, a qual foi reportada para abolir citotoxicidade mediada por células derivada de anticorpos (ADCC) (Sazinsky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 105 (51): 20169, 2008; Simmons et al., J. of Immunological Methods 263: 133147, 2002). A substituição de lisina por alanina na posição 322 leva à redução de ADCC e remoção de citotoxicidade derivada do complemento (CDC), ao passo que a substituição simultânea das duas leuci- nas na posição 234 e na posição 235 por alaninas leva à evitação de ADCC e CDC [Hezareh et al., J. of Virology, 75 (24): 12161-12168, 2001]. De modo a aplicar isotipos de IgG4 como terapêuticos bivalentes in vivo os quais conservam a avidez, pode ser introduzida uma modificação tal como a permuta de serina para prolina na ‘região de articulação de núcleo’ (Schuurman, J. et al. Immunology 97: 693-698, 1999). A tendência de moléculas de IgG2 humana para formar díme- ros covalentes heterogêneos pode ser contornada por permuta de uma das cisteínas na posição 127, 232 e 233 para serina (Allen et al., Bio-chemistry, 2009, 48 (17), pp 3755-3766). Um formato alternativo com reduzida função efetora pode ser o formati IgG2m4, derivado de IgG2 carregando quatro alterações de resíduos aminoácidos IgG4- específicos (An et al., mAbs 1(6), 2009). Fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos e são descritos adicionalmente abaixo. Exemplos não limitantes de anticorpos mono- clonais incluem immunoglobulinas murinas, quiméricas, humanizadas, humanas, e manipuladas humanas Human Engineered™, anticorpos, proteínas de fusão quiméricas tendo sequências derivadas de imuno- globulinas, ou muteínas ou derivados das mesmas, cada um descrito adicionalmente abaixo. São contemplados multímeros ou agregados de moléculas intactas e/ou fragmentos, incluindo anticorpos derivados quimicamente.

[000155] O termo "anticorpo monoclonal" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos com a exceção de possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em menores quantidades. Anticorpos mono- clonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante sobre o antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos mono- clonais são vantajosos poelo fato de que são sintetizados pela cultura homogênea, não contaminada por outras imunoglobulinas com diferentes especificidades e características.

[000156] O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser considerado como requerendo produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados podem ser produzidos pelo método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 [1975, ou podem ser produzidos por métodos de DNA re- combinante (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. U.S. 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser recombi- nantes, quiméricos, humanizados, humanos, manipulados humanos Human Engineered™, ou fragmentos de anticorpos, por exemplo.

[000157] Uma "imunoglobulina" ou "anticorpo nativo" é uma glicopro- teína tetramérica. Em uma imunoglobulina que ocorre naturalmente, cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de duas cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50 a 70 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região "variável" de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos essencialmente responsáveis por reconhecimento anti- gênico. A porção carbóxi- terminal de cada cadeia define uma região constante essencialmente responsável por função efetora. Imunoglo- bulinas dpoemo ser atribuídas a diferentes classes dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas. As cadeias pesadas são classificadas como mu (μ), delta (Δ), gama (Y), alfa (α), e épsilon (ε), e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Vários destes podem ser adicionalmente divididos em subclasses ou isotipos, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Diferentes isotipos têm diferentes funções efetoras; por exemplo, os isotipos IgG1 e IgG3 frequentemente têm atividade de ADCC. Cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kappa (K) e lâmbda (À). Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de mais 10 aminoácidos. Vide de modo geral, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)).

[000158] Um “fragmento funcional” ou “fragmento de anticorpo de ligação antigênica” de um anticorpo/uma imunoglobulina pelo presente é definido como um fragmento de um anticorpo/uma imunoglobulina (por exemplo, uma região variável de uma IgG) que conserva a região de ligação antigênica. Uma “região de ligação antigênica” de um anticorpo tipicamente é encontrada em uma ou mais regiões hipervariá- veis de um anticorpo, isto é, as regiões CDR-1, -2, e/ou -3; no entanto, as regiões de “framework” variáveis também podem ter um papel importante na ligação antigênica, tal como proporcionando um andaime para as CDRs. Preferencialmente, a “região de ligação antigênica” compreende no mínimo os resíduos aminoácidos 4 a 103 da cadeia leve variável (VL) e 5 a 109 da cadeia pesada variável (VH), mais preferencialmente os resíduos aminoácidos 3 a 107 de VL e 4 a 111 de VH, e de modo particularmente preferencial são as cadeias VL e VH completas [posições de aminoácidos 1 a 109 de VL e 1 a 113 de VH, enquanto a numeração das posições de aminoácidos ocorre de acordo com o banco de dados de Kabat (Johnson and Wu, Nucleic Acids Res., 2000, 28, 214-218)]. Uma classe preferencial de imunoglobuli- nas para utilização na presente invenção é IgG.

[000159] O termo região "hipervariável" se refere aos resíduos ami- noácidos dos domínios variáveis VH e VL de um anticorpo ou fragmento funcional os quais são responsáveis pela ligação antigênica. A região hipervariável compreende resíduos aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou CDR [isto é, os resíduos 24 a 34 (LCDR1), 50 a 56 (LCDR2) e 88 a 97 (LCDR3) no domínio variável de cadeia leve e os resíduos 29 a 36 (HCDR1), 48 a 66 (HCDR2) e 93 a 102 (HCDR3) no domínio variável de cadeia pesada conforme descrito in Fig. 12] e/ou os resíduos de um loop hipervariável [isto é, resíduos 26 a 32 (dentro de LCDR1), 50 a 52 (dentro de LCDR2) e 91 a 96 (dentro de LCDR3) no domínio variável de cadeia leve e 26 a 32 (dentro de HCDR1), 53 a 55 (dentro de HCDR2) e 96 a 101 (dentro de HCDR3) no domínio variável de cadeia pesada conforme descrito por Chothia et al., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)].

[000160] Exemplos não limitantes de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpo de domínio (dAb), fragmentos de região determinante de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), fragmentos de anticorpo de cadeia única, diabodies, triabodies, tetrabodies, minibodies, anticorpos lineares (Zapata et al., Protein Eng.,8 (10): 1057-1062 (1995)); anticorpos recombinantes que- lantes, tribodies ou bibodies, intrabodies, nanobodies, imunofármacos modulares pequenos (SMIPs), uma proteína de fusão de imunoglobu- lina de domínio de ligação antigênica, um anticorpo camelizado, um anticorpo contendo VHH, ou muteínas ou derivados do mesmo, e poli- peptídeos que contêm no mínimo uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir ligação antigênica específica ao polipep- tídeo, tal como uma sequência de CDR, contanto que o anticorpo conserve a atividade biológica desejada; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Ox- ford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Anti-body Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Um anticorpo diferente de um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é tentendido como tendo cada um de seus sítios de ligação idênticos. O F(ab’)2 ou Fab pode ser manipulado para minimizar ou remover com-pletamente as interações de dissulfeto intermoleculares que ocorrem entre os domínios CH1 e CL. Digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação antigênica idênticos, denominados fra-gmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação antigênica, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade para cristalizar prontamente. Tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois fragmentos "Fv". Um fragmento "Fv" é o mínimo fragmento de anticorpo que contém um sítio completo de reconhecimento e ligação de antígeno. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em firme, associação não-covalente. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação antigênica sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação antigênica ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo somente três CDRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar antígeno.

[000161] Fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "sFv" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo.

[000162] Preferencialmente, o polipeptídeo Fv compreende adicio-nalmente um encadeador de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que o Fv forme a estrutura desejada para ligação antigê- nica. Para uma revisãoi de sFv vide Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

[000163] O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab diferem de fragmentos Fab' pela adição de uns poucos resíduos no térmico carbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação de anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui, neste requerimento de patente, para Fab' no qual o um ou mais resíduos cisteína dos domínios constantes carregam um grupamento tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' os quais têm cisteínas de articulação entre os mesmos.

[000164] Resíduos de “framework" ou resíduos FR são os resíduos de domínio variável deiferentes dos resíduos de região hipervariável.

[000165] A expressão "região constante" se refere à porção da molécula de anticorpo que confere funções efetoras.

[000166] O termo "muteína" ou "variante" pode ser usado de modo intercambiável e se refere à sequência de polipeptídeo de um anticorpo que contém no mínimo uma substituição, deleção, ou inserção de aminoácido na região variável ou na porção equivalente à região variável, contanto que a muteína ou variante conserve a afinidade de ligação ou atividade biológica desejada.

[000167] Muteínas podem ser substancialmente homólogas ou subs-tancialmente idênticas ao anticorpo de origem.

[000168] O termo "derivado" se refere a anticorpos modificados de modo covalente por técnicas tais como ubiquitinação, conjugação a agentes terapêuticos ou de diagnóstico, marcação (por exemplo, com radionuclídeos ou várias enzimas), fixação de polímero covalente tal como peguilação (derivação com polietileno glicol) e inserção ou subs-tituição por síntese química de aminoácidos não naturais.

[000169] Um anticorpo “humano” ou fragmento de anticorpo humano funcional é definido pelo presente como um que é não quimético ou “humanizado” e não de (quer no todo ou em parte) uma espécie não humana. Um anticorpo humano ou fragmento de anticorpo funcional pode ser derivado a partir de um humano ou pode ser um anticorpo humano sintético. Um “anticorpo humano sintético” é definido aqui, neste requerimento de patente, como um anticorpo tendo uma sequência derivada, no todo ou em parte, in silico a partir de sequências sintéticas que são baseadas na análise de sequências de anticorpos humanos conhecidas. O esquema in silico de uma sequência de anticorpo humano ou fragmento da mesma pode ser obtido, por exemplo, analisando um banco de dados de anticorpo humano ou sequências de fragmentos de anticorpos e imaginando uma sequência de polipep- tídeo utilizando os dados obtidos a partir do mesmo. Outro exemplo de um anticorpo humano ou fragmento de anticorpo funcional é um que é codificado por um ácido nucleico isolado a partir de uma biblioi- teca de sequências de anticorpos de origem humana (isto é, a biblioi- teca referida sendo baseada em anticorpos tomados de uma fonte natural humana). Exemplos de anticorpos humanos incluem anticorpos à base de n-CoDeR conforme descrito por Carlsson and Soderlind Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1), 102-108 (2001), Soderlin et al. Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000) e na Patente dos Estados Unidos No. U.S. 6.989.250.

[000170] Um “anticorpo humanizado” ou fragmento humanizado de anticorpo funcional é definido aqui, neste requerimento de patente, como um que é (i) derivado a partir de uma fonte não humana (por exemplo, um camundongo transgênico o qual carrega um sistema imune heterólogo), cujo anticorpo é baseado em uma sequência de linhagem germinativa humana; ou (ii) enxertado com CDR, em que as CDRs do domínio variável são de uma origem não humana, ao passo que um ou mais frameworks do domínio variável são de origem humana e o domínio constante (se houver) é de origem humana.

[000171] A expressão "anticorpo quimérico," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma sequência contendo anticorpo derivado a partir de dois anticorpos diferentes (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. U.S. 4.816.567) os quais tipicamente se originam de diferentes espécies. Mais tipicamente, anticorpos quiméricos compreendem fragmentos de anticorpos humano e murino, geralmente regiões constante humana e variável de camundongo.

[000172] Anticorpos manipulados humanos “Human EngineeredTM” produzidos alterando a sequência de origem de acordo com os métodos estipulados em Studnicka et al., na Patente dos Estados Unidos No. U.S. 5.766.886 tais como o anticorpo representados pelas SEQ ID NOs 14 e 15 e descritos no requerimento de patente internacional No. WO08/022295.

[000173] Um anticorpo da invenção pode ser derivado a partir de uma bibliioteca genética de anticorpos recombinantes. O desenvolvimento de tecnologias para produzir repertórios de genes de anticorpos humanos recombinantes, e o display dos fragmentos de anticorpos modificados sobre a superfície de bacteriófago filamentoso, proporcionou um meio recombinante para produzir e selecionar diretamente anticorpos humanos, o qual também pode ser aplicado a anticorpos humanizados, quiméricos, murinos ou de muteína. Os anticorpos produzidos por tecnologia de fago são produzidos como fragmentos de ligação antigênica - geralmente fragmentos Fv ou Fab - em bactérias e portanto carecem de funções efetoras. Funções efetoras podem ser introduzidas por uma de duas estratégias: Os fragmentos podem ser manipulados ou em anticorpos completos para expressão em células de mamífero, ou em fragmentos de anticorpos biespecíficos com um segundo sítio de ligação capaz de provocar uma função efetora. Tipicamente, o fragmento Fd (VH-CH1) e cadeia leve (VL-CL) de anticor- pos são separadamente clonados por PCR e recombinados aleatoria-mente em bibliotecas de display de fago combinatorial, as quais podem ser então selecionadas para ligação a um antígeno em particular. Os fragmentos Fab são expressados sobre a superfície do fago, isto é, fisicamente ligados aos genes que os codificam. Deste modo, a seleção de Fab por ligação antigênica co-seleciona as sequências codificando Fab, as quais podem ser amplificadas subsequentemente. Por várias rodadas de ligação antigênica e re-amplificação, um procedimento denominado panning, Fab específicos para o antígeno são enriquecidos e finalmente isolados.

[000174] Foram descritos uma variedade de procedimentos para derivar anticorpos humanos a partir de bibliotecas de display de fago. As bibliotecas referidas podem ser construídas em uma única estrutura mestre (master framework), na qual CDRs diversas formadas in vivo (isto é, derivadas de humanos) são deixadas para recombinar conforme descrito por Carlsson and Soderlind Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1), 102-108 (2001), Soderlin et al. Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000) e na Patente dos Estados Unidos No. U.S. 6.989.250. Alternativamente, uma biblioteca de anticorpos semelhante pode ser baseada em sequências de aminoácidos que tenham sido projetadas in silico e codificadas por ácidos nucleicos que são criados sinteticamente. O esquema in silico de uma sequência de anticorpo é obtido, por exemplo, analisando um banco de dados de sequências humanas e imaginando uma sequência de polipeptídeo utilizando os dados obtidos a partir da mesma. Métodos para projetar e obter sequências criadas in silico estão descritos, por exemplo, em Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67; e na Patente dos Esetados Unidos No. U.S. 6.300.064. Para uma revisão de técnicas de display de fago, vide a patente internacional No. WO08/022295 (Novartis).

[000175] Alternativamente, um anticorpo desta invenção pode ser proveniente de animais. Um anticorpo semelhante pode ser humanizado ou manipulado humano Human Engineered resumido na patente internacional No. WO08/022295 (Novartis); um anticorpo semelhante pode ser proveniente de animais transgênicos [vide também a patente internacional No. WO08/022295 (Novartis)].

[000176] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, diferentes ‘formas’ de antígeno, por exemplo, PRLR, são pelo presente definidas como diferentes moléculas de proteína resultantes de diferentes modificações translacionais e pós-translacionais, tais como, mas não limitadas a, diferenças na emenda do transcripto receptor de prolactina primário, diferenças na glicosilação, e diferenças na clivagem proteolítica pós-translacional.

[000177] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo ‘epítope’ inclui qualquer determinante de proteína capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de células T. Determinantes epitópicos geralmente consistem de grupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares e geralmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga espe-cíficas. Diz-se que dois anticorpos ‘ligam o mesmo epítope’ se for de-mostrado que um anticorpo compete com o segundo anticorpo em uma prova de ligação competitiva, por qualuqer um dos métodos de conheciemento geral das pessoas versadas na arte, e todos os ami- noácidos do epítope são ligados pelos dois anticorpos.

[000178] O termo ‘anticorpos maturados’ ou ‘fragmentos de ligação antigênica maturados’ tais como variantes Fab maturadas inclui deri-vados de um anticorpo ou fragmento de anticorpo apresentando ligação mais forte - isto é, ligação com afinidade aumentada - para um dado antígeno tal como o domínio extracelular do PRLR. Maturação é o processo de identificação de um pequeno número de mutações dentro das seis CDRs de um anticorpo ou fragmento de anticorpo levando a este aumento de afinidade. O processo de maturação é a combinação de métodos de biologia molecular para introdução de mutações no anticorpo e triagem para identifoicação dos ligantes aprimorados. Métodos Terapêuticos

[000179] Métodos terapêuticos envolvem administrar a um sujeito que necessite de tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo contemplado pela invenção. Uma quantidade "tera- peuticamente eficaz" pela presente é definida como a quantidade de um anticorpo que é de quantidade suficiente para bloquear a proliferação de células PRLR-positivas em uma área tratada de um sujeito quer como uma dose única ou de acordo com um regime de dose múltipla, isolada ou em combinação com outros agentes, a qual leva ao alívio de uma condição adversa, mas cuja quantidade é toxicologica- mente tolerávell. O sujeito pode ser um animal humano ou não humano (por exemplo, coelho, rato, camundongo, macaco ou outro primata de ordem inferior).

[000180] Um anticorpo da invenção pode ser coadministrado com medicamentos conhecidos, e em alguns casos o próprio anticorpo pode ser modificado. Por exemplo, um anticorpo pode ser conjugado a uma imunotoxina ou a um radioisótopo de modo a potencialmente aumentar adicionalmente a eficácia.

[000181] Os anticorpos da invenção podem ser usados como um te-rapêutico ou como uma ferramenta de diagnóstico em uma variedade de situações em que PRLR é indesejavemente altamente expressado. Distúrbios e condições particularmente adequados para tratamento com um anticorpo das invenções são endometriose, adenomiose, con-tracepção e fertilidade feminina não hormonal, doença de mama benigna e mastalgia, inibição de lactação, hiperplasia de próstata benig- na, fibroides, perda de cabelo hiper- e normoprolactinêmica, e cotra- tamento em terapia hormonal combinada de modo a inibir a proliferação de células epiteliais mamárias.

[000182] Para tratar qualquer um dos distúrbios precedentes, podem ser formuladas composições farmacêuticas para utilização de acordo com a presente invenção em uma maneira convencional usando um ou mais veículos ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. Um anticorpo da invenção pode ser administrado por quaisquer meios adequados, os quais podem variar, dependendo do tipo de distúrbio sendo tratada. Vias de administração possíveis incluem parenteral (por exemplo, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, ou subcutânea), intrapulmonar e intranasal, e, caso desejado para tratamento imunossupressivo local, administração intralesional. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser administrado por infusão pulsátil, com, por exemplo, doses decrescentes do anticorpo. Preferencialmente, a dosagem é adminsitrada por injeções, o mais preferencialmente por injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crônica. A quantidade a ser administrada dependerá de uma variedade de fatores tais como os sintomas clínicos, o peso do indivíduo, se outros fármacos são administrados. O técnico versado reconhecerá que a via de administração vai variar dependendo do distúrbio ou condição a ser tratado.

[000183] A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz do novo polipeptídeo, de acordo com esta invenção, vai depender em grande parte de características do paciente em particular, da via de administração, e da natureza do distúrbio sendo tratado. Orientação geral pode ser encontrada, por exemplo, nas publicações da Conferência Internacional sobre Harmonização e em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, chapters 27 e 28, pp. 484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Mais especifi- camente, a determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz vai depender de fatores tais como toxicidade e eficácia do medicamento. A toxicidade pode ser determinada usando métodos de conhecimento geral na arte e encontrados nas referências precedentes. A eficácia pode ser determinada utilizando a mesma orientação em combinação com os métodos descritos abaixo nos Exemplos. Composições farmacêuticas e Administração

[000184] A presente invenção também se refere a composições far-macêuticas as quais podem compreender anticorpos contra PRLR, isolados ou em combinação com no mínimo um outro agente, tal como composto estabilizante, o qual pode ser administrado em qualquer veí-culo estéril, farmacêutico biocompatível, incluindo, mas não limitado a, salina, salina tamponada, dextrose, e água. Qualquer uma destas mo-léculas pode ser administrada a um paciente isolada, ou em combinação com outros agentes, fármacos ou hormônios, em composições farmacêuticas onde é misturada com um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em uma modalidade da presente invenção, o veículo farmaceuticamente aceitável é farmaceuticamente inerte.

[000185] A presente invenção também se refere à administração de composições farmacêuticas. Semelhante administração é realizada por via parenteral. Métodos de liberação parenteral incluem administração tópica, intra-arterial (diretamente no tumor), intramuscular, subcutânea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina ou intranasal. Além dos ingredientes ativos, estas composições farmacêuticas podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares os quais facilitam o processamentdo dos compostos ativos em preparações as quais podem ser usados farmaceuticamente. Detalhes adicionais sobre técnicas para formulação e administração podem ser en- contrados na última edição da Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.).

[000186] Formulações farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas de compostos ativos. Para injeção, as com-posições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou salina fisiolo- gicamente tamponada. Suspensões para injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosiade da suspensão, tais como sódio carboximetil celulose, sorbitol, ou dextrano. Adicionalmente, suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões para injeção oleosa apropriada. Solventes ou veículos lipofíli- cos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como oleato de etila ou trigli- cerídeos, ou lipossomas. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes adequados ou agentes os quais aumentam a solubilidade dos compostos de modo a possibilitar a preparação de soluções altamente concentradas.

[000187] Para administração tópica ou nasal, penetrantes apropriados para a barreira em particular a ser permeada são usados na formulação. Os penetrantes referidos geralmente são conhecidos na arte.

[000188] A administração parenteral também compreende métodos de liberação parenteral os quais também incluem administração intraarterial, intramuscular, subcutânea, intramedular, intratecal, e intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina, vaginal, ou intranasal. Kits

[000189] A invenção adicionalmente se refere a pacotes farmacêuticos e kits compreendendo um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais dos ingredientes das composições supracitadas da invenção. Associada com o um ou mais recipientes referidos pode estar uma notificação sob a forma prescrita por uma agência governamental regulando a fabricação, a utilização ou a venda de fármacos ou produtos biológicos, espelhando a aprovação pela agência da fabricação, utilização ou venda do produto para administração humana.

[000190] Em outra modalidade, os kits podem conter sequências de DNA codificando os anticorpos da invenção. Preferencialmente as sequências de DNA codificando estes anticorpos são proporcionadas em um plasmídeo adequado para transfecção em e expressão por uma célula hospedeira. O plasmídeo pode conter um promotor (frequentemente um promotor indutível) para regular a expressão do DNA na célula hospedeira. O plasmídeo também pode conter sítios de restrição apropriados para facilitar a inserção de outras sequências de DNA no plasmídeo para produzir vários anticorpos. Os plasmídeos também podem conter numerosos outros elementos para facilitar a clonagem e a expressão das proteínas codificadas. Os elementos referidos são de conhecimento geral das pessoas versadas na arte e incluem, por exemplo, marcadores selecionáveis, códons de iniciação, códons de terminação, e semelhantes. Fabricação e Armazenamento

[000191] As composições farmacêuticas da presente invenção pdoem ser fabricadas em uma maneira que é conhecida na arte, por exemplo, por meio de processos convencionais de misturação, dissolução, granulação, produção de drágeas, levigação, emulsificação, en- capsulação, aprisionamento ou liofilização.

[000192] A composição farmacêutica pode ser proporcionada como um pó liofilizado em 1 mM a 50 mM de histidina, 0,1% a 2% de sacarose, 2% a 7% de manitol em uma faixa de pH de 4,5 a 5,5 que é combinado com tampão antes da utilização.

[000193] Depois de terem sido preparadas composições farmacêuticas compreendendo um composto da invenção formulado em um veí- culo aceitável, podem ser colocadas dentro de um recipiente apropriado e rotulado para tratamento de uma condição indicada. Para administração de anticorpos contra PRLR, a rotulação referida deve incluir quantidade, frequência e método de administração. Dose Terapeuticamente Eficaz

[000194] Composições farmacêuticas adequadas para utilização na presente invenção incluem composições e mque os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para obter o propósito pre-tendido, isto é, tratamento de um estado de doença em particular ca-racterizado por expressão de PRLR. A determinação de uma dose eficaz está bem dentro da capacidade das pessoas versadas na arte.

[000195] Para qualquer composto, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente ou em ensaios de cultura celular, por exemplo, células de linfoma, ou em modelos animais, geralmente camundongos, ratos, coelhos, cães, porcos ou macacos. O modelo animal tamém é usado para obter uma faixa de concentração e uma via de administração desejáveis. A informação referida pode ser então usada para determinar doses e vias de administração úteis em humanos.

[000196] Uma dose terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de proteína ou seus anticorpos, antagonistas, ou inibidores que melhoram os sintomas ou condição. A eficácia terapêutica e a toxicidade de semelhantes compostos podem ser determinadas por meio de proce-dimentos farmacêuticos de rotina em culturas celulares ou animais ex-perimentais, por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da população). A proporção de dose entre efeitos terapêuticos e tóxicos é o índice terapêutico, e pode ser expressada como a proporção, ED50/LD50. São preferenciais composições farmacêuticas que apresentam grandes índices terapêutico. Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura celular e estudos com animais são usados na formulação de uma faixa de dosagem para utilização humana. A dosagem de semelhantes compostos se situa preferencialmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada, da sensibilidade do paciente, e da via de administração.

[000197] A dosagem exata é escolhida pelo médico do indivíduo em vista do paciente a ser tratado. A dosagem e a administração são ajustadas para proporcionar níveis suficientes da porção ativa ou para manter o efeito desejado. Fatores adicionais que podem ser levados em conta incluem a gravidade do estado de doença, por exemplo, tamanho e localização das lesões endometrióticas; a idade, o peso e o sexo do paciente; a dieta, a hora e a frequência de administração, a(s) combinação(s) de fármacos, as sensibilidades de reação, e a tolerân- cia/resposta à terapia. Composições farmacêuticas de longa ação podem sr administradas a cada 3 a 4 dias, a cada semana, ou a cada duas semanas, ou uma vez ao mês dependendo da meia-vida e da taxa de clearance da formulação em particular.

[000198] Quantidades de dosagens normais podem variar a partir de 0,1 a 100.000 microgramas, até uma dose total de cerca de 2 g, dependendo da via de administração. Orientação quanto a dosagens particulares e métodos de liberação é proporcionada na literatura. Vide a patente dos Estados Unidos No. US. 4.657.760; a patente dos Estados Unidos No. US 5.206.344; ou a patente dos Estados Unidos No. US 5.225.212. As pessoas versadas na arte empregarão diferentes formulações para polinucleotídeos do que para proteínas ou seus inibidores. De modo similar, a liberação de polinucleotídeos ou polipeptídeos será específica para células particulares, condições, localizações, etc. Atividades específicas preferenciais para um anticorpo radiomarcado pode variar a partir de 0,1 a 10 mCi/mg de proteína (Riva et al., Clin. Cancer Res. 5: 3275s-3280s, 1999; Wong et al., Clin. Cancer Res. 6: 38553863, 2000; Wagner et al., J. Nuclear Med. 43: 267-272, 2002).

[000199] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos exemplos que se seguem. Os exemplos são proporcionados uincamente para ilustrar a invenção por meio de referência a modalidades específicas. Estas exemplificações, apesar de ilustrarem alguns aspectos específicos da invenção, não representam as limitações ou circunscrevem o âmbito da invenção revelada.

[000200] Todos os exemplos foram realizados usando técnicas de rotina, as quais são de conhecimento geral e de rotina para as pessoas versadas na arte, exceto onde de outro modo descritos em detalhes. Técnicas de biologia molecular de rotina dos exemplos que se seguem podem ser realizadas conforme descrito em manuais de labo- ratória do rotina, tais como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[000201] Figura 1: Expressão de prolactina-mRNA (PRL-mRNA) (analisada por análise por PCR TaqMan em tempo real) em endomé- trio humano e lesões (tecido ectópico) de mulheres saudáveis e mulheres sofrendo de endometriose.

[000202] Figura 2: Expressão of receptor de prolactina-mRNA (PRLR-mRNA) (analisada por análise por PCR TaqMan em tempo real) em endométrio humano e lesões (tecido ectópico) de mulheres saudáveis e mulheres sofrendo de endometriose.

[000203] Figura 3A: Anticorpo contra receptor de prolactina neutrali- zante Mat3 inibiu ramificação lateral em glândulas mamárias de camundongos as quais tinham sido empregadas em um modelo substituto hiperprolactinêmico de doença de mama benigna. O anticorpo ines- pecífico não teve nenhum efeito. Camundongos saudáveis normopro- lactinêmicos (sem pituitária) apresentaram reduzida ramificação lateral, ao passo que transplante de pituitária (hiperprolactinemia) reforçou a ramificação lateral e o desenvolvimento lobuloalveolar. O anticorpo específico Mat3 antagonizou os efeitos de hiperprolactinemia.

[000204] Figura 3B: O anticorpo contra receptor de prolactina neutra- lizante Mat3 inibiu a indução do gene alvo de prolactina elf5 em glândulas mamárias de camundongos em um modelo substituto hiperpro- lactinêmico de doença de mama benigna. O anticorpo inespecífico não teve nenhum efeito. Camundongos saudáveis normoprolactinêmicos (sem pituitária) apresentaram reduzida expressão de elf 5 na glândula mamária, ao passo que transplante de pituitária (hiperprolactinemia) estimulou fortemente a expressão do gene elf 5. O anticorpo específico Mat3 mas não o anticorpo de controle inespecífico antagonizou os efeitos de hiperprolactinemia.

[000205] Figura 4: Numeração Kabat de posições de aminoácidos de framework de acordo com Johnson e Wu (Nucleic Acids Res. 2000, 28, 214-218).

[000206] Figura 5A: Resultados de análise FACS com o anticorpo anti-PRLR HE06642. A ligação do anticorpo foi determinada em uma concentração fixa sobre células HEK293 expressando o PRLR humano e de camundongo em comparação com a linhagem celular parental não expressando PRLR. Eixo Y: No., Intensidade de Fluorescência Mediana a 0,37 μg/ml de HE06642 como molécula de IgG1. *, 1 = HEK293 com PRLR humano; 2 = HEK293 com PRLR murino; 3 = HEK293 sem PRLR.

[000207] Figura 5B: Resultados de análise FACS com o anticorpo anti-PRLR Mat3. A ligação do anticorpo foi determinada em uma série de concentrações diferentes sobre células HEK293 expressando o PRLR humano e células Ba/F expressando o PRLR de rhesus em comparação com uma linhagem celular (HEK293) não expressando PRLR. Intensidades de sinal máximas nas maiores concentrações de anticorpos dependem do número de PRLRs expressados sobre as su-perfícies celulares, isto é, células HEK293 e Ba/F não carregam o mesmo número de PRLRs sobre sua superfície. Eixo Y: No., Intensidade de Fluorescência Mediana; eixo X: °, diferentes concentrações em μg/ml do anticorpo Mat3 como molécula de IgG2; *, 1 (círculos) = HEK293 com PRLR humano; 2 (triângulos) = Ba/F com PRLR de macaco rhesus; 3 (quadrados) = HEK293 sem PRLR.

[000208] Figura 6A: Alinhamento da região de sequência do domínio Mat3-VL com o segmento V humano mais similar identificado em VBASE2 (Mat3-VL é 90% idêntico à sequência de linhagem germinati- va humIGLV056).

[000209] Figura 6B: Alinhamento da região de sequência do domínio Mat3-VH com o segmento V humano mais similar identificado em VBASE2 (Mat3-VH é 90% idêntico à sequência de linhagem germinati- va humIGHV313).

[000210] Figura 6C: Alinhamento da região de sequência do domínio HE06642-VL com o segmento V humano mais similar identificado em VBASE2 (HE06642-VL é 80% idêntico à sequência de linhagem ger- minativa humIGKV083).

[000211] Figura 6D: Alinhamento da região de sequência do domínio HE06642-VH com o segmento V humano mais similar identificado em VBASE2 (HE06642-VH é 89% idêntico à sequência de linhagem ger- minativa humIGHV313).

[000212] Figura 7: Testes de ligação à base de ELISA de uma variante de Fab maturada:

[000213] Sobrenadantes de E. coli contendo Fab foram testados para ligação ao domínio extracelular imobilizado do PRLR humano. A figura ilustraa a ligação dos variantes de Fab como um diagrama de barra. As intensidades de sinal (extinção) são dados sobre os eixos y (No. ), os nomes das variantes de Fab (*) sobre os eixos x. Elevada intensidade de sinal da variante de Fab maturada 005-C04-20-2 com-parada com o Fab não-maturado do anticorpo parental 005-C04 de-monstra melhor ligação a PRLR de 005-C04-20-2 comparado com 005-C04. O pET28 “variante” representa um sobrenadante de uma cepa de E. coli carregando o plasmídeo pET28a de expressão de Fab (Novagen, EMD Chemicals Group, Merck, Darmstadt, Alemanha) o qual não expressa qualquer Fab.

[000214] Figura 8: Representação de gráfico de barras dos resultados de Pepscan ELISA.

[000215] Cada valor plotado representa o valor médio obtido para 54 peptídeos com S.E.M (erro padrão da média). As barras pretas repre-sentam a força de ligação relativa do anticorpo HE06642. As barras brancas representam a força de ligação relativa do anticorpo Mat3. Os dados foram normalizados para média ao longo de todo o conjunto de dados de 2916 peptídeos e corrigidos para sinal de fundo.

[000216] A Figura 8A mostra os resultados do ELISA para um subgrupo de peptídeos variando a partir dos aminoácidos 103- PDPPLELAVEVKQPE-117 indicado como ‘117’ sobre o eixo X até 127-WSPPTLIDLKTGWFT-141 (indicado como ‘141’). Isto é, estes peptídeos, os quais foram deslocados por três aminoácidos ao longo da sequência de aminoácidos de ECD, cobrem a região a partir da posição de aminoácido 103 até 141 do ECD de PRLR humano. As mais fortes diferenças observadas dentro deste conjunto de dados são para o peptídeo 109-LAVEVKQPEDRKPYL-123 (indicado como ‘123’) com um p-valor de significância de 4x10-12, e para o peptídeo 121- PYLWIKWSPPTLIDL-135 (indicado como ‘135’) com um p-valor de significância de 7x10-40.

[000217] A Figura 8B mostra os resultados do ELISA para um sub- grupo de peptídeos variando a partir de 139-WFTLLYEIRLKPEKA-153 (indicado como ‘153’ sobre o eixo X) até 163-QQTEFKILSLHPGQK- 177 (indicado como ‘177’). Isto é, estes peptídeos, os quais foram deslocados por três aminoácidos ao longo da sequência de aminoácidos de ECD, cobrem a região a partir da posição de aminoácido 139 até 177 do ECD de PRLR humano. As mais fortes diferenças observadas dentro deste conjunto de dados são para o peptídeo 148- LKPEKAAEWEIHFAG-162 (indicado como ‘162’) com um p-valor de significância de 6x10-26, e para o peptídeo 160-FAGQQTEFKILSLHP- 174 (indicado como ‘174’) com um p-valor de significância de 8x10-8.

[000218] Estes dados demonstram que ambos os anticorpos ligam ao subdomínio S2 do ECD de PRLR humano (aminoácido 101 a 210) e portanto são não-competitivos para o PRL ligante natural o qual essencialmente liga ao domínio S1. No entanto, esta vearredura de pep- tídeo mostrou que há diferenças na ligação aos domínios S2 entre Mat3 e HE06642. Esta descoberta indica porque o anticorpo Mat3 mostra uma diferente especificidade de espécie e potência comparada com HE06642.

[000219] Figura 9: Inibição de proliferação, induzida por prolactina, de células BaF3 (células monoclonais transfectadas de modo estável com receptor de prolactina humano) por anticorpos neutralizantes contra receptor de prolactina e anticorpos de controle inespecíficos. Os valores da IC50 foram determinados para os anticorpos que se seguem em formato de IgG1: Mat3 (círculos fechados), IC50 = 0,7 nM [100% de inibição a 1 μg/ml (= 6,7 nM)]; HE06.642 (quadrados abertos), IC50 = 4,2 nM [81% de inibição a 1 μg/ml (= 6,7 nM)]; anticorpo de controle inespecífico (triângulos abertos): nenhum efeito inibitório.

[000220] Figura 10: Inibição de proliferação, induzida por prolactina, de células BaF3 (células monoclonais transfectadas de modo estável com o receptor de prolactina murino) por anticorpos neutralizantes contra receptor de prolactina e anticorpos de controle inespecíficos. Os valores da IC50 foram determinados para os anticorpos que se seguem em formato de IgG1: Mat3 (círculos fechados), IC50 = 3,0 nM [97,4% de inibição a 1 μg/ml (= 6,7 nM)]; HE06.642 (quadrados abertos), nenhum efeito inibitório; anticorpo de controle inespecífico (triângulos abertos): nenhum efeito inibitório.

[000221] Figura 11A e B: de proliferação, induzida por prolactina, de células BaF3 (células monoclonais transfectadas de modo estável com o receptor de prolactina de rhesus) por anticorpos neutralizantes contra receptor de prolactina e anticorpos de controle inespecíficos. Os valores da IC50 foram determinados para os anticorpos que se seguem em formato de IgG1: Mat3 (círculos fechados), IC50 = 4,6 nM [99,1% de inibição a 1 μg/ml (= 6,7 nM)] (vide Figura 11A); HE06.642 (quadrados abertos), IC50 = 206 nM [92,4% de inibição a 240 μg/ml (= 1600 nM)] (vide Figura 11A e 11B); anticorpo de controle inespecífico (triângulos abertos): nenhum efeito inibitório (vide Figura 11A e 11B).

[000222] Figura 12: Tratamento de adenomiose uterina (= endometriose interna) em camundongos SHN com anticorpo contra PRLR neu- tralizante Mat3. Os resultados são representados sobre o eixo y como escores de doença (escores de adenomiose) conforme descrito no Exemplo 5. O escore de doença médio para cada grupo experimental é indicado como uma barra horizontal. Os grupos experimentais são os seguintes grupos: grupo 1, sem isoenxerto de pituitária (camundongos normoprolactinêmicos desenvolvem endometriose interna até certo ponto, escore de doença médio = 1); grupo 2, com isoenxerto de pituitária (hiperprolactinemia devida ao isoenxerto de pituitária aumenta o escore de doença, escore de doença médio = 3); grupo 3, com isoenxerto de pituitária tratado com anticorpo de controle isotipo IgG2a murino inespecífico uma vez por semana em uma dose de 30 mg/kg (escore de doença médio = 3); grupo 4, com isoenxerto de pituitária tratado com anticorpo Mat3 no formato de IgG2a murino (Mat3- mIgG2a) uma vez por semana em uma dose de 30 mg/kg (Mat3 curou completamente os animais. O escore de doença depois de 30 mg/kg de Mat3 administrado uma vez por semana foi ainda menor (escore de doença médio = 0) do que o escore de doença de camundongos nor- moprolactinêmicos (escore de doença médio = 1); grupo 5, com isoen- xerto de pituitária tratado com anticorpo Mat3-mIgG2a uma vez por semana em uma dose de 10 mg/kg (escore de doença médio = 2); grupo 6, com isoenxerto de pituitária tratado com anticorpo Mat3- mIgG2a uma vez por semana em uma dose de 3 mg/kg (escore de doença médio = 2,5); grupo 7, com isoenxerto de pituitária tratado com anticorpo Mat3-mIgG2a uma vez por semana em uma dose de 1 mg/kg (escore de doença médio = 2,5). Tratamento com anticorpo Mat3 mostra uma redução dose-dependente no escore de doença médio . Mat3 é portanto adequado para tratar endometriose interna (= adenomiose uterina) e endometriose externa em mulheres.

[000223] Figura 13A e B: Inibição da atividade de gene reporter de luciferase em células HEK293 transfectadas de modo estável com o PRLR humano e murino. Na Figura 13A a atividade dependente de PRLR humano é plotada contra as concentrações de anticorpos, ao passo que a Figura 13B mostra a atividade dependente de PRLR murino. A atividade de luciferase é dada como percentagem da atividade de luciferase máxima obtida sem adição de qualquer anticorpo. Os valores da IC50 foram determinados para os anticorpos que se seguem em formato de IgG1: Mat3 (círculos fechados), IC50 = 0,5 nM (Fig. 13A, hPRLR) e 1,3 nM (Fig. 13B, mPRLR); HE06.642 (quadrados abertos), IC50 = 4,6 nM (Fig. 13A, hPRLR) e >>1333 nM (= 20 μg/ml) (Fig. 13B, mPRLR); anticorpo de controle de isotipo inespecífico (triângulos abertos): nenhum efeito inibitório (vide Figura 13A e B). Estes dados mostram a aprimorada atividade de Mat3 sobre hPRLR comparado com HE06.642 e demonstram a atividade de Mat3 sobre mPRLR ao passo que HE06.642 não inibe atividade de luciferase dependente de mPRLR.

[000224] Figura 14: Ligação celular de anticorpos contra PRLR neu- tralizantes sobre células expressando PRLR de humano, de camundongo e de macaco usando citometria de fluxo. A intensitdade de sinal fluorescente mediana é plotada contra a concentração de anticorpos. Foram aplicados os anticorpos de IgG1 que se seguem: Mat3 (círculos fechados), HE06.642 (quadrados abertos), anticorpo de controle de isotipo inespecífico (triângulos abertos). Foram testadas diferentes li-nhagens celulares: A) linhagem celular HEK293 transfectada de modo estável com PRLR humano, B) linhagem celular HEK293 transfectada de modo estável com PRLR murino, C) linhagem celular HEK293 não transfectada com qualquer gene de PRLR (linhagem celular de controle negativo), D) linhagem celular de câncer de mama humano T47D, E) linhagem celular BaF3 transfectada de modo estável com PRLR de macaco rhesus, F) linhagem celular BaF3 transfectada de modo estável com PRLR humano, G) linhagem celular BaF3 transfectada de modo estável com PRLR murino. A potência de ligação das linhagens celulares dos anticorpos sobre as diferentes linhagens celulares foram deduzidas a partir das curvas de dose-resposta como valores da EC50 (vide a Tabela 8). Os gráficos de dose-resposta indicam as propriedades superiores de ligação celular de Mat3 comparado com HE06.642. A Seq ID NO: 1 representa a sequência de aminoácidos de VH, Mat3 A Seq ID NO: 2 representa a sequência de aminoácidos de VL, Mat3 A Seq ID NO: 3 representa a sequência de ácido nucleico VH, Mat3 A Seq ID NO: 4 representa a sequência de ácido nucleico VL, Mat3 A Seq ID NO: 5 representa a sequência de aminoácidos de HCDR1, Mat3 A Seq ID NO: 6, representa a sequência de ácido nucleico HCDR2, Mat3 A Seq ID NO: 7 representa a sequência de ácido nucleico HCDR3, Mat3 A Seq ID NO: 8 representa a sequência de ácido nucleico LCDR1, Mat3 A Seq ID NO: 9 representa a sequência de ácido nucleico LCDR2, Mat3 A Seq ID NO: 10 representa a sequência de ácido nucleico LCDR3, Mat3 A Seq ID NO: 11 representa a sequência de aminoácidos de domínio extracelular de PRLR de macaco cynomolgus e rhesus fundida a Fc- His A Seq ID NO: 12 representa ECD_PRLR humano, posição de aminoá- cido 1 a 210, domínio S1 1-100 (constructo do domínio S1 1-102), do-mínio S2 101-210 A Seq ID NO: 13 representa ECD_PRLR murino, posição de aminoá- cido 1 a 210 A Seq ID NO: 14 representa a sequência de aminoácidos de VH, HE06642, Novartis (patente internacional No. WO2008/22295) A Seq ID NO: 15 representa a sequência de aminoácidos de VL, HE06642, Novartis (patente internacional No. WO2008/22295) A Seq ID NO: 16 representa a sequência de ácido nucleico VH, HE06642, Novartis (patente internacional No. WO2008/22295) A Seq ID NO: 17 representa a sequência de ácido nucleico VL, HE06642, Novartis (patente internacional No. WO2008/22295) EXEMPLOS Exemplo 1 Inibição de proliferação induzida por prolactina de células BaF3 (células monoclonais transfectadas de modo estável com o receptor de prolactina humano) por anticorpos contra receptor de prolactina neutrali- zantes e anticorpos de controle inespecíficos.

[000225] De modo a analisar a eficácia in vitro dos anticorpos contra PRLR neutralizantes, foi usada a inibição de proliferação celular ativadas por prolactina de células BaF3. As células foram transfectadas de modo estável com PRLR humano e foram cultivadas rotineiramente em meio RPMI contendo 2 mM de glutamina na presença de 10% de FCS e 10 ng/ml de prolactina humana. Depois de seis horas de privação em meio isento de prolactina contendo 1% de FCS, as células foram semeadas em placas de 96 cavidades em uma densidade de 25000 células por cavidade. As células foram estimuladas com 35 ng/ml de prolactina e coincubadas com doses crescentes de anticorpos contra PRLR neutralizantes por dois dias. A proliferação celular foi analisada usando uma prova de viabilidade celular Luminescente Cell- Titer-Glo (CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, da Promega). Curvas de dose-resposta para a inibição de crescimento celular estimulado por prolactina foram geradas e foram calculados valores da IC50. Como controle negativo, foi usada estimulação com um anticorpo de controle inespecífico. Anticorpo Mat3 foi testado em comparação com anticorpo HE 06.642 (ambos foram no formato de IgG1) (Figura 9). Exemplo 2 Inibição de proliferação induzida por prolactina de células BaF3 (células monoclonais transfectadas de modo estável com o receptor de pro- lactina murino) por anticorpos contra receptor de prolactina neutrali- zantes e anticorpos de controle inespecíficos.

[000226] De modo a analisar a eficácia in vitro dos anticorpos contra PRLR neutralizantes, foi usada a inibição de proliferação celular ativadas por prolactina de células Ba/F3. As células foram transfectadas de modo estável com o PRLR murino e foram cultivadas rotineiramente em meio RPMI contendo 2 mM de glutamina na presença de 10% de FCS e 10 ng/ml de prolactina humana. Depois de seis horas de privação em meio isento de prolactina contendo 1% de FCS, as células foram semeadas em placas de 96 cavidades em uma densidade de 20000 células por cavidade. As células foram estimuladas com 50 ng/ml de prolactina e coincubadas com doses crescentes de anticorpos contra PRLR neutralizantes por três dias. A proliferação celular foi analisada usando uma prova de viabilidade celular Luminescente Cell- Titer-Glo (CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, da Promega). Curvas de dose-resposta para a inibição de crescimento celular estimulado por prolactina foram geradas e foram calculados valores da IC50. Como controle negativo, foi usada estimulação com um anticorpo de controle inespecífico. Anticorpo Mat3 foi testado em comparação com anticorpo HE 06.642 (ambos foram no formato de IgG1) (Figura 10). Exemplo 3 Inibição de proliferação induzida por prolactina de células BaF3 (células monoclonais transfectadas de modo estável com o receptor de prolactina de rhesus) por anticorpos contra receptor de prolactina neutrali- zantes e anticorpos de controle inespecíficos.

[000227] De modo a analisar a eficácia in vitro dos anticorpos contra PRLR neutralizantes, foi usada a inibição de proliferação celular ativadas por prolactina de células Ba/F3. As células foram transfectadas de modo estável com o PRLR de rhesus e foram cultivadas rotineiramente em meio RPMI contendo 2 mM de glutamina na presença de 10% de FCS e 10 ng/ml de prolactina humana. Depois de seis horas de privação em meio isento de prolactina contendo 1% de FCS, as células foram semeadas em placas de 96 cavidades em uma densidade de 25000 células por cavidade. As células foram estimuladas com 100 ng/ml prolactina e coincubadas com doses crescentes de anticorpos contra PRLR neutralizantes por dois dias. A proliferação celular foi analisada usando uma prova de viabilidade celular Luminescente Cell- Titer-Glo (CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, da Promega). Curvas de dose-resposta para a inibição de crescimento celular esti-mulado por prolactina foram geradas e foram calculados valores da IC50. Como controle negativo, foi usada estimulação com um anticorpo de controle inespecífico. Anticorpo Mat3 foi testado em comparação com anticorpo HE 06.642 (ambos foram no formato de IgG1) (Figura 11). Exemplo 4 Análise quantitativa da expressão genética de prolactina e de receptor de prolactina por análise por PCR TaqMan em tempo real em endomé- trio eutópico e ectópico e lesões endometrióticas de pacientes e controles saudáveis.

[000228] Foi realizada análise por PCR TaqMan em tempo real (Re- al-timeTaqman PCR) usando o sistema ABI Prism 7700 Sequence Detector System de acordo com as instruções do fabricante (PE Applied Biosystems) e conforme descrito em Endocrinology 2008, 149 (8): 3952-3959) e sabido pelo especilista na área. Níveis de expressão re-lativos de PRL e do PRLR foram normalizados para a expressão de ciclofilina. Nós analisamos a expressão de PRL e do PRLR no endo- métrio de mulheres saudáveis e no endométrio e em lesões endome- trióticas de pacientes usando análise por PCR TaqMan em tempo real quantitativa. A expressão de prolactina e seu receptor foi claramente hiper-reguladas em lesões endometrióticas comparadas com endomé- trio saudável ou endométrio derivado de pacientes.

[000229] Os resultados são mostrados na Figura 1 e 2.

[000230] Estes achados implicam que sinalização de prolactina autó- crina tem um papel no desenvolvimento e manutenção de endometri- ose e adenomiose uterina (endometriose interna, uma forma de endo- metriose restrita ao útero). Exemplo 5 Tratamento de adenomiose uterina (= endometriose interna) em ca-mundongos SHN com anticorpo contra PRLR neutralizante Mat3.

[000231] De modo a testar a eficácia de anticorpos contra PRLR neutralizantes na endometriose, foi empregado o modelo de adenomi- ose uterina em camundongos SHN dependente de hiperprolactinemia sistêmica (Acta anat. 116:46-54,1983). Hiperprolactinemia em camun-dongos SHN foi induzida por isoenxerto de pituitária sob a cápsula renal de camundongos fêmeas de 7 semanas de idade (Acta anat. 116:46-54,1983). Anticorpo contra PRLR neutralizante Mat3 (30 mg/kg; 10 mg/kg, 3 mg/kg, 1 mg/kg) ou anticorpo inespecífico (30 mg/kg) foram administrados por via subcutânea iniciando duas semanas depois de isoenxerto de pituitária. Os animais foram tratados uma vez por semana com os anticorpos por sete semanas. A infiltração da camada muscular uterina por tecido glandular foi avaliada conforme descrito previamente (Laboratory Animal Science 1998,48:64-68). Na autópsia (dia 66 depois do transplante de pituitária), os úteros foram fixados de um dia para o outro em 4% de formalina tamponada e embutidos em parafina. O grau de adenomiose (= endometriose interna) foi avaliado como se segue: Grau 0 = sem adenomiose Grau 1 = a camada interna do miométrio perde sua orientação con-cêntrica Grau 2 = glândulas endometriais invadindo a camada interna do mi- ométrio Grau 3 = glândulas endometriais entre a camada interna e externa do miométrio uterino Grau 4 = glândulas endometriais invadindo a camada externa do mi- ométrio uterino Grau 5 = glândulas endometriais fora da camada externa do miomé- trio uterino O experimento compreendeu os grupos experimentais que se seguem: 1. Animais sem transplante de pituitária, isto é, camun dongos normoprolactinêmicos 2. Animais com transplante de pituitária, isto é, camun dongos hiperprolactinêmicos 3. Animais com transplante de pituitária, tratados com an-ticorpo de controle inespecífico uma vez por semana em uma dose de 30 mg/kg 4. Animais com transplante de pituitária, tratados com o anticorpo contra receptor de prolactina neutralizante Mat3 no formato de IgG2a murina uma vez por semana em uma dose de 30 mg/kg 5. Animais com transplante de pituitária, tratados com o anticorpo contra receptor de prolactina neutralizante Mat3 no formato de IgG2a murina uma vez por semana em uma dose de 10 mg/kg 6. Animais com transplante de pituitária, tratados com o anticorpo contra receptor de prolactina neutralizante Mat3 no formato de IgG2a murina uma vez por semana em uma dose de 3 mg/kg 7. Animais com transplante de pituitária, tratados com o anticorpo contra receptor de prolactina neutralizante Mat3 no formato de IgG2a murina uma vez por semana em uma dose de 1 mg/kg

[000232] O anticorpo contra PRLR neutralizante Mat3 inibiu endome- triose interna (= adenomiose) (Figura 12). O anticorpo contra PRLR neutralizante Mat3 é portanto adequado para tratar endometriose interna (= adenomiose uterina) e endometriose externa em mulheres. Exemplo 6 Anticorpo contra PRLR neutralizante Mat3 é adequado para o tratamento de doença de mama benigna.

[000233] Uma mutação de PRLR ativante ou hiperprolactinemia local ou sistêmica pode provocar doença de mama benigna. Portanto, foi empregado um modelo de camundongo hiperprolactinêmico com proli-feração reforçada na glândula mamária (característica das formas mais graves de doença de mama benigna). Camundongos Balb/c fêmeas de 12 semanas de idade receberam um isoenxerto de pituitária sob a cápsula renal ou permaneceram inoperados. Camundongos com isoenxerto de pituitária permaneceram não tratados ou foram tratados por via subcutânea uma vez por semana com anticorpo contra PRLR neutralizante Mat3 no formato de IgG2 (= IgG2 Mat3) ou anticorpo de controle inespecífico em formato de IgG2 no dia 15, 22, 29, e 36 depois de transplante de pituitária. As doses de anticorpo foram de 30 mg/kg. O tamanho do grupo experimental foi de 8 animais.

[000234] O experimento compreendia os grupos experimentais que se seguem: 1. Animais sem transplante de pituitária, isto é, camundongos normoprolactinêmicos 2. Animais com transplante de pituitária, isto é, camundongos hiperprolactinêmicos 3. Animais com transplante de pituitária, tratados com anti-corpo de controle inespecífico uma vez por semana em uma dose de 30 mg/kg 4. Animais com transplante de pituitária, tratados com o an-ticorpo contra receptor de prolactina neutralizante Mat3 uma vez por semana em uma dose de 30 mg/kg

[000235] No dia 38 depois do transplante de pituitária os camundongos foram sacrificados. Duas horas antes da morte, os animais receberam uma injeção intraperitoneal de BrdU para monitorar a proliferação de células epiteliais. A glândula mamária inguinal esquerda foi fixada em solução de Carnoy e foram preparadas e coradas montagens inteiras de glândula mamária com Carmine alaune. A ramificação lateral foi avaliada nas montagens inteiras de glândula mamária. Os resul- tados são representados na Figura 3A. Anticorpo Mat3 inibiu ramificação lateral na glândula mamária, anticorpo de controle inespecífico foi sem efeito (Figura 3A).

[000236] Depois disso as montagens inteiras de glândula mamária foram embutidas em parafina e foram realizadas imunocolorações com BrdU conforme previamente descrito (Endocrinology 149 (8): 39523959; 2009). A proliferação de células epiteliais foi analisada em 4 cortes histológicos de glândula mamária por animal.

[000237] O um terço lateral da glândula mamária inguinal direita sem o linfonodo foi congelado em nitrogênio líquido e processado para pre-paração de RNA. Depois de transcrição reversa, foi realizada análise por PCR Taqman em tempo real usando o sistema ABI Prism 7700 Sequence Detector System de acordo com as instruções do fabricante (PE Applied Biosystems). A expressão do gene elf5 alvo de prolactina foi avaliada e normalizada para expressão de citoqueratina 18. Os níveis relativos de mRNA foram calculados pelo método de ΔCT comparativo. Isoenxerto de pituitária, isto é, hiperprolactinemia reforçou a expressão do gene elf5 alvo de prolactina (Figura 3B). Anticorpo específico Mat3, mas não o anticorpo de controle inespecífico inibiu a expressão do gene elf5 indicando bloqueio com sucesso do receptor de prolactina (Figura 3B).

[000238] Portanto o anticorpo Mat3 é adequado para tratar doença de mama benigna. Exemplo 7 Isolamento de anticorpos alvo-específicos a partir de bibliotecas de display de fago de anticorpo humano

[000239] De modo a isolar um painel de anticorpos capazes de neutralizar a atividade de PRLR humano, três bibliotecas de display de fago de anticorpo humano, expressando fragmentos Fab e scFv, foram investi-gadas em paralelo. O alvo usado para o panning de biblioteca foi o do- mínio extracelular solúvel (ECD) do receptor de prolactina humano e de camundongo, respectivamente, representado pelos aminoácidos 1-210, de SEQ ID NOs. 12 e 13. .Alvos alternativos foram o ECD de PRLR en-cadeado C-terminalmente a seis histidinas ou a um domínio IgG1-Fc humano através do encadeador com a sequência de aminoácidos ‘’iso- leucina-glutamato-glicina-arginina-metionina-aspartato’’.

[000240] Seleção de anticorpos alvo-específicos a partir de display de fago foi realizada de acordo com métodos descritos por Marks et al. (Methods MoI Biol. 248:161-76, 2004). A biblioteca de display de fago foi incubada com 50 pmols do ECD biotinilado em temperatura ambiente por 1 hora e o complexo formado foi em seguida capturado usando 100 μl de suspensão de contas de Estreptavidina (Dynabeads ® M280 Streptavidin, Invitrogen). Fagos inespecíficos foram removidos por lavagem das contas com tampão de lavagem (PBS + 5% de Milk,). Fagos ligados foram elutriados com 0,5 ml de 100 nM de Trietilamina (TEA,) e imediatamente neutralizados por adição de um volume igual de IM TRIS-Cl pH 7,4. Pool de fago elutriado foi usado para infectar células de E. coli TG1 crescendo em fase logarítmica, e fagomídio foi resgatado conforme descrito (Methods MoI Biol. 248:161-76, 2004),. A seleção foi repetida por um total de três rodadas. Colônias únicas obtidas a partir de células TG1 infectadas com fago elutriado da terceira rodada de panning foram triadas para atividade de ligação em um ensaio ELISA. Em resumo, colônias únicas obtidas a partir de célula TG1 infectada com fago elutriado foram usadas para inocular meios em placas de 96 cavidades.

[000241] Microculturas foram cultivadas até uma OD60O = 0,6 em cujo ponto a expressão de fragmento de anticorpo solúvel foi induzida por adição de 1 mM de IPTG depois de cultura de um dia para o outro em uma shaker incubadora a 30°C. As bactérias foram centrifugadas e o extrato periplasmático foi preparado e usado para detectar a atividade de ligação de anticorpo a ECD imobilizado sobre microplacas de 96 cavidades (placas Immunosorb de fundo liso de 96 cavidades, Nunc) seguindo o protocolo ELISA de rotina proporcionado pelo fabricante de microplacas.

[000242] As afinidaders dos anticorpos anti-Receptor de prolactina (PRLR) para ligação ao domínio extracelular recombinant (ECD) foram estimadas usando o Biacore® 2000 e usadas para classificação por afinidade de anticorpos. Exemplo 8 Maturação de variantes de anticorpos:

[000243] Anticorpo afinidade maturação é um processo de duas etapas onde mutagênese por saturação e triagem de alta produtividade bem baseada são combinadas para identificar um pequeno número de mutações resultando em aumentos de afinidade. Na primeira rodada de maturação por afinidade, diversificação posicional de anticorpo selvagem é introduzida por mutagênese sítio-direcionada usando cassetes de NNK-trinucleotídeo (por meio do que N representa uma mistura a 25% de cada um dos nucleotídeos adenina, timina, guanina, e citosi- na e K representa uma mistura a 50% de cada um dos nucleotídeos timina e guanina) de acordo com BMC Biotechnology 7: 65, 2007. Deste modo, todos os 20 aminoácidos são introduzidos em uma posição de aminoácido individual. Esta randomização posicional é restrita às seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Na segunda rodada de maturação por afinidade, substituições benéficas foram recombinadas e triadas para aprimoramentos posteriores. Triagem de variantes Fab “005-C04” maturadas por testes ELISA:

[000244] Placas de microtítulo de 96 cavidades foram revestidas com 1 μg por mililitro de PRLR humano. As placas foram incubadas de um dia para o outro a 4°C. Depois de bloqueio com tampão de PBS contendo 3% de albumina sérica bovina, foram adicionados sobrenadan- tes derivados de E. coli normalizados contendo as variantes de Fab. A detecção de complexos formados ocorreu através da adição de um anticorpo anti-flag (Sigma, A8592) marcado com peroxidase de raiz forte.

[000245] Amplex Red como substrato fluorogênico para peroxidase de raiz forte foi adicionado e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente. A absorção a 570 nm e extinção a 585 nm foi medida usando a leitora Tecan Infinite F500. Os resultados obtidos o hit de triagem “005-C04-20-2” são mostrados na Figura 7. Substituições individuais no hit de triagem “005-C04-20-2” (Figura 7) benéficas para aprimoramento da afinidade foram avaliadas com relação a sua influência sobre a termoestabilidade do anticorpo, de modo a assegurar desdobramento cooperativo do domínio Fab durante desnaturação por elevação da temperatura. O anticorpo Mat3 foi um derivado de “005-C04-20-2”, no qual as substituições termo-desestabilizantes foram revertidas par o anticorpo parental “005-C04”. Exemplo 9 Reatividade cruzada de anticorpos sobre PRLR de camundongo e humano expressado sobre superfícies celulares a) De modo a entender a atividade antiproliferativa que falt de anticorpo HE06642 sobre células carregando o PRLR murino, as características de ligação de HE06642 sobre PRLR de camundongo e humano expressado sobre células foi determinada por citometria de fluxo sobre células HEK293 expressando de modo estável o PRLR humano e murino, respectivamente. As células bem como a linhagem celular HEK293 parental sem PRLR foram colhidas, centrifugadas e ressuspendidas em aproximadamente 5x106 células/ml em 1xPBS contendo 2% de FBS e 0,1 % de azida de sódio (tampão FACS). O anticorpo HE06642 foi diluído até 2 vezes concentração final em tampão FACS e adicionado a cavidades de amostras apropriadas (50 μl/cavidade). Para controles de autofluorescência e anticorpo secundário, 50 μl de tampão FACS foi adicionado a cavidades apropriadas. 50 μl de suspensão celular foi adicionado a cada cavidade de amostra. As amostras foram incubadas a 4°C por uma hora, lavadas duas vezes com tampão FACS a frio e ressuspendidas em tampão FACS contendo IgG de cabra anti-humana conjugada a PE em uma diluição a 1:100. Depois de um período de 30 min de incubação a 4°C, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS a frio, ressuspendidas em tampão FACS contendo 1 mg/ml de iodeto de propídio (Invitrogen, San Diego, CA) e analisadas por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 5A, o anticorpo HE06.642 somente liga ao PRLR humano e não ao PRLR murino. Esta observação é consistente com o achado reportado no Exemplo 2 e no Exemplo 12 sobre a atividade que falta de HE06.642 na proliferação dependente de PRLR murino e provas de gene reporter de luciferase. b) De modo a demonstrar a ligação celular de anticorpo Mat3 sobre células carregando o PRLR humano e o PRLR de macaco rhesus, dos quais a sequência de aminoácidos do domínio extracelular é idêntica à de macaco cynomolgus, as características de ligação de Mat3 sobre PRLR humano e de macaco expressado sobre as células foi determinada por citometria de fluxo sobre células HEK293 expressando de modo estável o PRLR humano e de macaco, respectivamente. As células foram colhidas, centrifugadas e ressuspendidas a aproximadamente 2x106 células/ml em 1xPBS contendo 3% de FBS e 0,05 % de azida de sódio (tampão FACS). O anticorpo Mat3 foi diluído até 2 vezes concentração final em tampão FACS e adicionado a cavidades de amostras apropriadas (50 μl/cavidade). Para controles de autofluo- rescência e anticorpo secundário, 50 μl de tampão FACS foi adicionado a cavidades apropriadas. 50 μl de suspensão celular foi adicionado a cada cavidade de amostra. As amostras foram incubadas a 4°C por uma hora, lavadas duas vezes com tampão FACS a frio e ressuspen- didas em tampão FACS contendo IgG de cabra anti-humana conjugada a PE em uma diluição a 1:100. Depois de um período de 30 min de incubação a 4°C, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS a frio, ressuspendidas em tampão FACS contendo 1 mg/ml de iodeto de propídio (Invitrogen, San Diego, CA) e analisadas por cito- metria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 5B, o anticorpo Mat3 liga ao PRLR humano bem como ao PRLR de macaco. As intensidades de sinal máximas nas maiores concentrações de anticorpo dependem do número de PRLR expressado sobre as superfícies celulares, isto é, células HEK293 e Ba/F não carregam o mesmo número de PRLRs sobre sua superfície. Os valores da EC50 foram calculados com base nas curvas de dose resposta ilustradas na Figura 5B, de modo a derivar um valor de medição para força de ligação de Mat3 sobre as células (Tabela 2). A potência de ligação celular de Mat3 foi de 0,53 nM sobre células HEK293 com PRLR humano e de 2,94 nM sobre células Ba/F com PRLR de macaco. Estes dados corroboram a descoberta de que Mat3 é não somente um agente específico contra humanos muito potente, mas também em doses razoáveis ativo sobre PRLR de macaco na baixa faixa nanomolar. Exemplo 10 Estudos de ligação com domínios de PRLR extracelulares purificados usando análise por ressonância de plasmon superficial

[000246] As afinidades de ligação de anticorpo Mat3 foram determinadas por análise por ressonância de plasmon superficial em um instrumento Biacore T100 (GE Healthcare Biacore, Inc.). Anticorpos foram imobilizados sobre um chip sensor CM5 através de um reagente de captura indireta, Fc de IgG anti-humana. Reagentes do kit de captura de anticorpo humano “Human Antibody Capture Kit” (BR-1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.) foram usados conforme descrito pelo fa- bricante. Aproximadamente 5000 RU de anticorpo monoclonal de IgG (Fc) anti-humana de camundongo foram imobilizados por célula. Anticorpo Mat3 foi injetado em uma concentração de 5 μg/ml a 10 μl/min por 10 segundos para atingir um nível de captura de aproximadamente 200 a 600 RU. Várias concentrações (400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM, e 3,12 nM) em tampão HEPES-EP (GE Healthcare Biacore, Inc.) do ECD de PRLR humano, de macaco ou murino foram injetados sobre anticorpo Mat3 imobilizado em uma taxa de fluxo de 60 μl/min por 3 minutos e a dissociação foi permitida por 10 minutos. Os ECDs do PRLR humano (SEQ ID NO: 12), do PRLR de macaco (SEQ ID NO: 11, depois da remoção proteolítica da etiqueta de Fc-His (Fc-His-tag) através de digestão por Fator Xa) e do PRLR murino (SEQ ID NO: 13) representaram analitos monovalentes. Sen- sogramas foram gerados depois da correção celular de referência inline seguida por subtração de amostra de tampão. A constante de equilíbrio de dissociação (KD) foi calculada com base na proporção das constantes de associação (kon) e dissociação nominal (koff = kd), obtidas por sensorgramas de ajuste com um modelo de ligação a 1:1 de primeira ordem usando o programa BiaEvaluation Software. Os valores das constantes de dissociação monovalente (KD, afinidade) e das taxas de dissociação (kd = koff) são mostrados na Tabela 1. Exemplo 11 Varredura de peptídeo a) Síntese de peptídeo:

[000247] De modo a reconstruir epíitopes discontínuos da molécula alvo SEQ ID NO. 12 da posição de aminoácido 1 a 210, o ECD do PRLR humano, foi sintetizada uma biblioteca de peptídeos estruturados. Isto foi feito usando a tecnologia CLIPS (Chemically Linked Peptides on Scaffolds) proprietária da Pepscan (Timmerman et al., 2007, J. Mol. Recognit. 20:283-99; Pepscan Therapeutics, Lelystad, Países Baixos). A tecnologia CLIPS permite estruturar peptídeos em loops únicos, loops duplos, loops triplos, dobras semelhantes a folhas (sheet-like folds), dobras semelhantes a hélice (helix-like folds) e combinações dos mesmos. Modelos de CLIPS foram acoplados a resíduos cisteína. As cadeias laterais de múltiplas cisteínas nos peptídeos foram acopladas a um ou dois modelos de CLIPS. Por exemplo, uma solução a 0,5 mM do modelo de T2 CLIPS de 1,3-bis (bromometil) benzeno foi dissolvida em bicarbonato de amônio (20 mM, pH 7,9)/acetonitrilo (a 1:1 (em vol/vol). Esta solução foi adicionada sobre os arrays de peptídeos. O modelo de CLIPS ligou a cadeias laterais de duas cisteínas como presentes nos peptídeos ligados de fase sólida dos arrays de peptídeos (placa de 455 cavidades com cavidades de 3 ul). Os arrays de peptídeos foram suavemente agitados na solução por 30 a 60 minutos enquanto completamente cobertos em solução. Finalmente, os arrays de peptídeos foram lavados extensivamente com excesso de H2O e sonicados em tampão de disrupção contendo 1 por cento de SDS/0,1 por cento de beta-mercaptoetanol em PBS (pH 7,2) a 70°C por 30 minutos, seguido por sonicação em H2O por outros 45 minutos. Os CLIPS T3 carregando peptídeos foram produzidos em um modo similar mas agora com três cisteínas. b) Pepscan ELISA:

[000248] A ligação de anticorpo Mat3 e de anticorpo HE06642 a cada peptídeo foi testada em um ELISA à base de PEPSCAN (Slootstra et al., 1996, Molecular Diversity 1: 87-96). Os arrays de peptídeos foram pré-incubados com 5% a 100% de tampão de ligação (1 hora, 20°C). O tampão de ligação foi composto de 1% de Tween-80, 4% de soro de cavalo, 5% de Ovalbumina (em peso/volume) e foi diluído com PBS. Depois de lavagem os arrays de peptídeos foram incubados com solução de anticorpo primário (1 a 5 Qg/ml) em PBS contendo 1% de Tween-80 (de um dia para o outro a 4°C). Depois de lavagem, os ar rays de peptídeos foram incubados com uma diluição a 1/1000 em 100% de tampão de ligação de um conjugado de anticorpo peroxidase por uma hora a 25°C (anti-humano, humpo). Depois de lavagem, o substrato de peroxidase sulfonato de 2,2’-azino-di-3-etilbenztiazolina (ABTS) e 2 microlitros/mililitro de 3 por cento de H2O2 foram adicionados. Depois de uma hora, foi medido o desenvolvimento de cor. O desenvolvimento de cor foi quantificado com uma câmera- CCD (dispositivo acoplado a carga) e um sistema de processamento de imagem. c) Processamento de dados:

[000249] Os dados brutos foram valores óticos obtidos por uma câ- mera-CCD. Os valores variaram de 0 a 3000 mAU, de modo similar a uma leitora ELISA de placa de 96 cavidades de rotina. Os resultados foram quantificados e armazenados no banco de dados Peplab. Os valores de ligação foram extraídos para análise. Ocasionalmente uma cavidade continha uma bolha de ar resultando em um valor falso positivo, as placas foram inspecionadas manualmente e quaisquer valores causados por uma bolha de ar foram classificados como 0. d) Análise de dados e representação:

[000250] Um mapa de calor é uma representação gráfica de dados onde os valores empíricos de dados experimentais são organizados em um mapa bidimensional, e são então representados como cores (Brinton, 1914, Graphic Methods for Presenting Facts, New York: The Engineering Magazine Company; Gower and Digby, 1981, ), “Expressing complex relashionships in two dimensions” in Interpreting Multivariate Data, ed. Barnett, V., Chichester, UK: John Wiley & Sons, pp. 83118.). Para peptídeos CLIPS de loop duplo, um mapa bidimensional semelhante pode ser derivado das sequências independentes do primeiro loop e do segundo loop.

[000251] Para a proteína alvo (ECD de PRLR humano), os 2916 pep- tídeos CLIPS tinham sequências que foram de modo eficaz permuta- ções de 54 sub-sequências únicas, combinadas em dois loops de CLIPS sequenciais. Deste modo, os dados de Pepscan ELISA observados podem ser plotados em uma matriz de 54x54, onde cada coordenada X foi a sequência de aminoácidos do primeiro loop, e cada coordenada Y foi a sequência de aminoácidos do segundo loop. Para cada coordenada XY na matriz, foi colocado o valor do Pepscan ELISA que é derivado do peptídeo com sequência X+Y. De modo a facilitar a visualização, os valores de Pepscan ELISA foram substituídos com cores de um gradiente contínuo. Neste caso, valores extremamente baixos eram de cor verde, valores extremamente elevados eram de cor vermelha, e valores médios foram de cor preta. Quando este mapa de cor foi aplicado à matria de dados descrita, resultou um mapa térmico colorido. Os peptídeos revelando as diferenças mais marcantes nos resultados do ELISA entre os anticorpos Mat3 e HE06642 foram selecionados com base nesta representação de mapa térmico. Para estes peptídeos, cada valor de sinal ELISA foi processado para representação em um gráfico de barras (Figura 8A e 8B). Cada valor plota- do representou o valor médio obtido para 54 peptídeos com S.E.M (erro padrão da média). Os dados foram normalizados para média sobre todo o cojnunto de dados de 2916 peptídeos e corrigido para sinal de fundo.

[000252] A Figura 8A mostra os resultados do ELISA para um subgrupo de peptídeos variando de aminoácidos 103- PDPPLELAVEVKQPE-117 indicado como ‘117’ sobre o eixo X a 127- WSPPTLIDLKTGWFT-141 (indicado como ‘141’). Isto é, estes peptí- deos, os quais foram deslocados por três aminoácidos ao longo da sequência de aminoácidos ECD, cobrem a região da posição de aminoá- cido 103 a 141 do ECD de PRLR humano. As diferenças mais fortes observadas dentro deste grupo de dados são para o peptídeo 109- LAVEVKQPEDRKPYL-123 (indicado como ‘123’) com um p-valor de significância de 4x10-12, e para o peptídeo 121-PYLWIKWSPPTLIDL- 135 (indicado como ‘135’) com um p-valor de significância de 7x10-40.

[000253] A Figura 8B mostra os resultados do ELISA para um subgrupo de peptídeos variando de 139-WFTLLYEIRLKPEKA-153 (indicado como ‘153’ sobre o eixo X) a 163-QQTEFKILSLHPGQK-177 (indicado como ‘177’). Isto é, estes peptídeos, os quais foram deslocados por três aminoácidos ao longo da sequência de aminoácidos ECD, cobrem a região da posição de aminoácido 139 a 177 do ECD de PRLR humano. As diferenças mais fortes observadas dentro deste grupo de dados são para o peptídeo 148-LKPEKAAEWEIHFAG-162 (indicado como ‘162’) com um p-valor de significância de 6x10-26, e para o peptí- deo 160-FAGQQTEFKILSLHP-174 (indicado como ‘174’) com um p- valor de significância de 8x10-8.

[000254] Estes dados demonstram que ambos os anticorpos ligam ao subdomínio S2 do ECD de PRLR humano (aminoácido 101 a 210) e portanto são não-competitivos para o PRL ligante natural o qual liga essencialemnte ao domínio S1. No entanto, esta varredura de peptí- deo mostrou que há diferenças na ligação aos domínios S2 entre Mat3 e HE06642. Este achado indica porque o anticorpo Mat3 mostra uma especificidade de espécie e potência diferentes comparado a HE06642. Exemplo 12 Inibição da atividade de gene reporter de luciferase em células HEK293 transfectadas de modo estável com o PRLR humano e murino

[000255] De modo a analisar a atividade in vitro do anticorpo contra PRLR neutralizante Mat3 sobre o PRLR humano e o PRLR murino, foi usado um teste de gene reporter. Células HEK293 transfectadas de modo estável com o PRLR murino foram transfectadas de modo transitório com um gene reporter de luciferase sob o controle de LHREs (elementos de resposta a hormônio lactogênico) . Depois disso, as células foram semeadas em uma densidade de 20000 células por cavidade (80 μl) so-bre uma placa de 96 cavidades em meio DMEM High Glucose (DMEM de alto teor de glicose) com 4,5 g/L de glicose, 2 mM de Glutamax, 0,5% de FCS, e 1% de Penicilina/Estreptomicina. No dia seguinte foram adici-onados 200 ng/ml de prolactina humana (10 μl) com e sem doses cres-centes de anticorpos de teste (10 μl). Vinte e quatro horas depois, foi de-terminada a atividade de luciferase. Para comparação, o anticorpo HE06642 e um anticorpo inespecífico tendo por alvo coleratoxina deno-minada CTX também foram testados. Todos os anticorpos foram testa-dos como moléculas de IgG1 (Figura 13A e 13B). Exemplo 13 Estudos de ligação com domínios de PRLR extracelulares purificados usando análise por ressonância de plasmon superficial

[000256] As afinidades de ligação de anticorpos Mat3 e HE06642 foram determinadas por análise por ressonância de plasmon superficial em um instrumento Biacore T100 (GE Healthcare Biacore, Inc.) em paralelo. Os anticorpos foram imobilizados sobre um chip sensor CM5 através de um reagente de captura indireta, Fc de IgG anti-humana. Reagentes do kit de captura de anticorpo humano “Human Antibody Capture Kit” (BR-1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.) foram usados conforme descrito pelo fabricante. Aproximadamente 5000 RU de anticorpo monoclonal de IgG (Fc) de camundongo anti-humana foram imobilizados por célula. Cada anticorpo de teste foi injetado em uma concentração de 5 μg/ml a 10 μl/min por 10 segundos para atingir um nível de captura de aproximadamente 200 a 600 RU. Várias concentrações (400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM, e 3,12 nM) em tampão HEPES-EP (GE Healthcare Biacore, Inc.) do ECD de PRLR humano, de macaco ou murino foram injetados sobre o anticorpo de teste imobilizado em uma taxa de fluxo de 60 μl/min por 3 minutos e a dissociação foi permitida por 10 minutos. Os ECDs do PRLR humano (SEQ ID NO: 12), do PRLR de macaco (SEQ ID NO: 11, depois da remoção proteolítica da etiqueta de Fc-His (Fc-His-tag) através de digestão por Fator Xa) e do PRLR murino (SEQ ID NO: 13) representaram analitos monovalentes. Sensorgramas foram gerados depois da correção celular de referência in-line seguida por subtração de amostra de tampão. A constante de equilíbrio de dissociação (KD) foi calculada com base na proporção das constantes de associação (kon) e dissociação nominais (koff = kd), obtida por sensorgramas de ajuste com um modelo de ligação a 1:1 de primeira ordem usando o programa BiaEvaluation Software (vide a Tabela 7). Tabela 7: Constantes de dissociação monovalente e taxas de dissociação de domínios extracelulares purificados de PRLR humano, de macaco e murino (expressado em células HEK293) determinados para Mat3 e HE06.642 por ressonância de plasmon superficial

#As afinidades reveladas para HE06642 na patente internacional No. WO2008/022295 são KD (PRLR humano) = 2,6x10-9 M, KD (PRLR de macaco) = 38,9 x 10-9 M, e KD (PRLR murino) = 2,7 x 10-9 M.

[000257] Conforme mostrado na Tabela 7, Mat3 apresenta afinidades aprimoradas para PRLR de macaco e murino comparado com HE06.642. A aprimorada ligação celular e atividade antiproliferativa de Mat3 sobre PRLR humano não é refletida por aprimorada afinidade para hPRLR comparado com HE06.642. Apesar de ligação ao ECD purificado de PRLR murino, HE06.642 não liga células ou inibe a proliferação de células expressando o PRLR murino (Figura 10 e 14, Tabela 8). Em contraste, Mat3 bloqueia a proliferação celular em escala nanomolar a subnanomolar em todas as três espécies.

[000258] Adicionalmente, o ECD-PRLR solúvel (SEQ ID NO: 12) foi capturado sobre a superfície através dos anticorpos de teste imobilizados Mat3 e HE06642, portanto, o epítope do anticorpo de captura foi bloqueado para todas as moléculas de ECD-PRLR ligadas. PRL humano foi imediatamente passado sobre a superfície para ligar ao ECD- PRLR imobilizado. Deste modo, pode ser medido se PRL ligou o ECD- PRLR, embora o ECD seja capturado pelo anticorpo de teste.

[000259] Pode ser observado que PRL liga o ECD-PRLR de modo independente de ligação a Mat3 e HE06.642. Deste modo, ambos os anticorpos não competem com o ligante natural PRL sobre ECD- PRLR.. Exemplo 14 Estudos de ligação celular de anticorpos sobre várias linhagens celulares expressando PRLR humano, de camundongo e de macaco

[000260] Foi realizado um estudo de ligação celular com anticorpo Mat3 e HE06642 bem como um controle de isotipo específico para co- leratoxina, todos sendo em formato de IgG1. As linhagens celulares testadas foram células HEK293 expressando de modo estável PRLR humano e de camundongo, respectivamente, a linhagem celular de câncer de mama humana T47D bem como as linhagens celulares Ba/F expressando PRLR humano, de camundongo e de macaco rhesus. A ligação celular foi determinada por citometria de fluxo sobre as células mencionadas acima. As células foram colhidas, centrifugadas e res- suspendidas em aproximadamente 2x106 células/ml em 1xPBS contendo 3% de FBS e 0,05 % de azida de sódio (tampão FACS). Cada anticorpo de teste foi diluído até concentração final de 2 vezes em tampão FACS e adicionado a cavidades de amostras apropriadas (50 μl/cavidade). Para controles de autofluorescência e anticorpo secundário, 50 μl de tampão FACS foi adicionado a cavidades apropriadas. 50 μl de suspensão celular foi adicionado a cada cavidade de amostra. As amostras foram incubadas a 4°C por uma hora, lavadas duas vezes com tampão FACS a frio e ressuspendidas em tampão FACS contendo IgG de cabra anti-humana conjugada a PE em uma diluição a 1:100. Depois de um período de 30 min de incubação a 4°C, as células foram lavadas duas vezes com tampão FACS a frio, ressuspendidas em tampão FACS contendo 1 mg/ml de iodeto de propídio (Invitrogen, San Diego, CA) e analisadas por citometria de fluxo.

[000261] Os dados obtidos são mostrados como curvas de dose- resposta na Figura 14. A partir destas curvas foram deduzidos os valores da EC50 indicando as potências de ligação celular (Tabela 8). Em conclusão, os dados indicam as propriedades superiores de ligação celular de Mat3 comparado com HE06.642 entre as differentes linhagens celulares expressando PRLR. Tabela 8: Potência de ligação celular de anticorpos contra PRLR neutralizantes Mat3 e He06.642 em formato de IgG1 sobre células expressando PRLR de humano, camundongo e macaco deduzida a partir de citometria de fluxo

*sem ligação significativa; no. de diagramas de dose-resposta na Figura 14

Claims

1. Anticorpo Mat3 que antagoniza a sinalização mediada por receptor de prolactina ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a. uma região pesada variável com uma sequência de ami- noácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1 e b. uma região leve variável com uma sequência de aminoá- cidos de acordo com à SEQ ID NO: 2.

2. Anticorpo ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que consiste em uma região de ligação a antígeno que se liga especificamente a uma ou mais regiões do domínio extracelular do receptor de prolactina (PRLR) humano, de macaco e de camundongo, e de forma que as sequências de aminoácidos do PRLR humano são representadas pelas sequências de aminoácidos da posição 1 a 210 de SEQ ID NO: 12 e variantes polimórficas humanas de SEQ ID NO: 12, pelas sequências de aminoácidos da posição 1 a 210 do PRLR de macaco de SEQ ID NO: 11 e do PRLR de camundongo de SEQ ID NO: 13.

3. Anticorpo ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a afini-dade para o domínio extracelular de PRLR humano, de macaco e de camundongo é 100 nM, menor que 30 nM, ou com uma afinidade de 10 nM, e pelo qual a afinidade foi medida por ressonância plasmônica de superfície (Biacore).

4. Anticorpo ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anti-corpo consiste em uma região de ligação ao antígeno que se liga especi-ficamente a uma ou mais regiões do domínio extracelular do PRLR hu-mano e em que a afinidade é de 10 nM ou 1 nM, e pelo qual a afinidade foi medida por ressonância plasmônica de superfície (Biacore).

5. Anticorpo ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os domínios constantes da cadeia pesada são IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 modificados ou não modificados.

6. Sequência de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que as sequências isoladas de ácido nucleico são selecionadas do grupo con-sistindo em SEQ ID NO: 3 e 4, ou sequências de nucleotídeo degene-radas das mesmas codificando as mesmas sequências de aminoácidos.

7. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que com-preende uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 6.

8. Célula hospedeira de microrganismo transgênica, carac-terizada pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindi-cação 7 ou uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindi-cação 6, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucarió- tica inferior ou uma célula procariótica.

9. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 8, ca-racterizada pelo fato de que a célula hospedeira eucariótica inferior é uma célula de levedura.

10. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 8, ca-racterizada pelo fato de que a célula procariótica é uma célula bacteri- ana.

11. Método para usar a célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 10, ou uma célula hospedeira com-preendendo o vetor como definido na reivindicação 7 ou uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 6, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira eucariótica superior, para produzir um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 8 ou a referida célula hospedeira eucariótica superior em condições adequadas e recuperar o referido anticorpo.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, caracteri-zado pelo fato de que é produzido pelo método como definido na reivin-dicação 11.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que que é purificado para pelo menos 95% de homogeneidade em peso.

14. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso como medicamento.

15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um veículo farma- ceuticamente aceitável compreendendo excipientes e auxiliares.

16. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo Mat3 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, embalado em um recipiente, o referido kit opcionalmente contendo um segundo agente terapêutico e compreendendo ainda uma bula anexada ou embalada com o recipiente, o rótulo que descreve o conteúdo do recipiente e fornecendo indicações e/ou instruções sobre o uso do conteúdo do recipiente para tratar endometriose, adenomiose, doenças benignas da mama e mastal- gia, inibição da lactação, perda de cabelo hiper e normoprolactinêmica, hiperplasia benigna da próstata, fibróides ou para uso em contracepção feminina não hormonal ou para tratar mulheres sob terapia hormonal combinada, terapia com estrogênio e progestina, para inibir a proliferação de células epiteliais mamárias ou para tratamento e prevenção de câncer de mama resistente a antiestrogênio.

17. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso em um medicamento para tratamento e/ou prevenção de endometriose e adenomiose, endometriose interna.

18. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso em um medicamento para tratamento de doenças benignas da mama e mastalgia.

19. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso em um medicamento para tratamento ou prevenção de câncer de mama resistente a antiestrogênio.

20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que compreende anticorpos PRLR ou frag-mento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em combinação com pelo menos um outro agente.

21. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno anti- gênica do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método de tratamento ou prevenção de câncer de mama resistente a antiestrogênicos.