WO2012124945A2 - 재조합 대장균을 이용한 감마-아미노부틸산의 제조 방법 - Google Patents

재조합 대장균을 이용한 감마-아미노부틸산의 제조 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing gamma-aminobutyric acid (GABA) from glucose using recombinant E. coli strains.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • PTT polymer products are manufactured using biomass-based 1,3-propanediol produced by DuPont.
  • succinic acid-based PBS is being actively developed, and one of the disadvantages of the biomass-derived polymers mentioned above is low heat resistance, and a representative example of a polymer having high heat resistance is nylon.
  • Nylon 6 and 6 dominate the nylon market, but there is a growing interest in nylon 4, which has both biodegradability and heat resistance. It can be produced from a tee lactones (gamma butyrolactone), and can be produced by dehydrating ring closure reaction of 4-amino-butyric acid.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • Such GABA can be prepared by glutamate decarboxylase based on glutamate, and various glutamate decarboxylases have been reported to date (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8491-8495, 1990; Protein Expression and Purification 8: 430-438, 1996; Biosci.Biotechnol.Biochem.
  • the present inventors have studied to develop a process for producing GABA from glucose through a path that does not lower the carbon yield.
  • the E. coli mutant strain from which a competition circuit using succinic semialdehyde has been removed
  • GABA is produced with low carbon yield.
  • the present invention has been completed by revealing that it can be usefully used for producing from glucose without losing weight.
  • An object of the present invention is to determine a strain of Escherichia coli from which genes encoding succinate-semialdehyde dehydrogenase (GabD) and succinate-semialdehyde dehydrogenase (YneI) enzymes have been removed, and succinicsemialdehyde dehydrogenase (SucD) enzyme and GABA aminotransform
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • GABA 4-aminobutyrate aminotransferase
  • Another object of the present invention is to use a recombinant E. coli strain prepared by transforming an E. coli strain from which the genes encoding the GabD and YneI enzymes are removed with a recombinant vector comprising a gene encoding the SucD enzyme and the GabT enzyme.
  • a recombinant E. coli strain prepared by transforming an E. coli strain from which the genes encoding the GabD and YneI enzymes are removed with a recombinant vector comprising a gene encoding the SucD enzyme and the GabT enzyme.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing gamma-aminobutyl acid from glucose using E. coli strains from which genes encoding GabD and YneI enzymes have been removed.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant E. coli strain of the present invention for producing gamma-aminobutyl acid.
  • Escherichia coli strains of step 1) were transformed with a recombinant vector comprising a succinicsemialdehyde dehydrogenase (SucD) enzyme and a gene encoding a GABA 4-aminobutyrate aminotransferase (GabT) enzyme. It provides a recombinant E. coli strain for the production of gamma-aminobutyric acid (GABA) produced by a manufacturing method comprising the step of converting to produce.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • step 2) preparing a recombinant E. coli strain by transforming the E. coli strain of step 1) with a recombinant vector comprising a gene encoding a SucD enzyme and a GabT enzyme;
  • step 4 provides a gamma-aminobutyl acid production method comprising the step of obtaining gamma-aminobutyl acid from the culture medium of step 3).
  • the present invention provides a recombinant E. coli strain for the production of gamma-aminobutyl acid produced by the production method comprising the step of preparing a E. coli strain from which the genes encoding the GabD and YneI enzyme is removed.
  • 3) provides a gamma-aminobutyl acid production method comprising the step of obtaining gamma-aminobutyl acid from the culture medium of step 2).
  • the present invention provides a recombinant E. coli strain of the present invention for producing gamma-aminobutyl acid.
  • the present invention is a.
  • the GabD preferably has a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the YneI preferably has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the SucD preferably has a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the GabT preferably has a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the E. coli strain may be applied to all kinds of E. coli strains, more preferably XL1-Blue, but is not limited thereto.
  • step 2) preparing a recombinant E. coli strain by transforming the E. coli strain of step 1) with a recombinant vector comprising a gene encoding a SucD enzyme and a GabT enzyme;
  • step 4 provides a gamma-aminobutyl acid production method comprising the step of obtaining gamma-aminobutyl acid from the culture medium of step 3).
  • any medium used for the culture of E. coli strains may be used, but the LB medium is more preferably but not limited thereto.
  • the culture of step 3) is preferably 48 to 96 hours, the culture temperature is preferably 20 to 40 °C, more preferably 37 °C but is not limited thereto.
  • the gamma-aminobutyl acid of step 4) can be obtained by spray-drying the culture broth to obtain a large concentration of low concentration GABA-containing powder.
  • the culture broth is concentrated using a reduced pressure evaporator, followed by lyophilization to obtain a high concentration of GABA.
  • E. coli strains are converted into succinyl coenzyme A.
  • E. coli strains transformed with a recombinant vector containing a gene encoding a SucD enzyme converting to aldehyde (succinic semialdehyde) and a GabT enzyme converting succinic semialdehyde to GABA were cultured in a medium containing glucose. Compared with the E. coli strain deleted YneI significantly increased GABA production capacity was confirmed about two times (see Table 2).
  • the recombinant E. coli strain of the present invention can be usefully used to produce GABA from glucose without lowering the carbon yield.
  • the present invention provides a recombinant E. coli strain for the production of gamma-aminobutyl acid produced by the production method comprising the step of preparing a E. coli strain from which the genes encoding the GabD and YneI enzyme is removed.
  • 3) provides a gamma-aminobutyl acid production method comprising the step of obtaining gamma-aminobutyl acid from the culture medium of step 2).
  • the medium of step 2) may be any medium used for culturing E. coli strains, but more preferably, but not limited to LB medium.
  • the culture of step 2) is preferably 48 to 96 hours, the culture temperature is preferably 20 to 40 °C, more preferably 37 °C but is not limited thereto.
  • the gamma-aminobutyl acid of step 3) can be obtained by spray-drying the culture broth to obtain a large concentration of low concentration GABA-containing powder.
  • the culture broth is concentrated using a reduced pressure evaporator, followed by lyophilization to obtain a high concentration of GABA.
  • E. coli strains of which GabD and YneI are deleted of the present invention can be usefully used to produce GABA from glucose without lowering the carbon yield.
  • the present invention also provides a recombinant E. coli strain of the present invention for producing gamma-aminobutyl acid.
  • the recombinant E. coli strain comprises: 1) preparing an E. coli strain from which genes encoding succinate-semialdehyde dehydrogenase (GabD) and succinate-semialdehyde dehydrogenase (YneI) enzymes that convert succinic semialdehyde (succinic semialdehyde) to succinic acid are removed; And
  • the present invention is prepared by a manufacturing method comprising the step of preparing an E. coli strain from which the genes encoding the GabD and YneI enzymes have been removed.
  • the present invention converts succinyl coenzyme A to succinic semialdehyde and removes succinic semialdehyde from gamma-aminobutyl acid in E. coli strains from which the competition circuit using succinic semialdehyde was removed.
  • the present invention relates to a recombinant Escherichia coli strain expressing a large amount of an enzyme converting to gamma-aminobutyric acid (GABA), and thus may be usefully used for mass production of gamma-aminobutyl acid using glucose.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • GABA production was confirmed using the E. coli XGabDYne I strain prepared in the above ⁇ 1-1> as a host cell for GABA synthesis. Specifically, the E. coli GabDYneI strain was incubated for 72 hours at 30 rpm at 250 °C in LB medium containing 20 g / L of glucose (including 100 ml LB medium in 250 ml flask) was measured GABA.
  • Succinic semi-aldehyde dehydrogenase to tyrosinase succinicsemialdehyde dehydrogenase; SucD
  • GABA-amino-trans-flops raised (4-aminobutyrate aminotransferase; GabT) sucD to confirm that the GABA production from glucose by culturing recombinant E.coli expressing the gene XGabDYneI And a vector expressing the gabT gene.
  • the expression vector pZE12-MCS was modified to have muti-cloning sites (MCS) of pTacLac (Lee et al. Appl . Microbiol . Biotechnol. 79 , 633-641, 2008) and PHA biosynthetic gene transcription terminator of Ralstonia eutropha .
  • the PHA biosynthetic gene transcription terminator gene fragment of Ralstonia eutropha was obtained by PCR using the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 from p619C1437-pct540, and using the obtained gene fragment as a template, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: PCR was performed using primers 6 to obtain PHA biosynthetic gene transcription terminators of RBS, pTacLac MCS and R. eutropha .
  • the PCR product was digested with MfeI and AvrII and inserted into pZE12-MCS digested with EcoRI / AvrII to prepare pKE12-MCS. Plasmids pZE12-MCS and pZA31-MCS were purchased from ESPRESSYS (www.expressys.com) and received.
  • pKE31-MCS EXPRESSYS
  • LtetO of P-1 promoter in a P LlacO-1 promoter obtained by cutting the pKE12-MCS with XhoI / EcoRI
  • the pKA32-MCS was PCR using primers of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 to amplify a gene fragment comprising the P LlacO-1 promoter, MCS and PHA biosynthetic gene transcription terminator of R. eutropha, and the amplified gene.
  • the fragment was inserted into the SspI site of pBR1MCS2 (Kovach et al. Gene , 166, 175-176, 1995) to prepare pKM22-MCS.
  • pKM22SucD was prepared by inserting the sucD gene isolated from Clostridium kluyveri from psM22-MCS using primers of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 into KpnI / XbaI
  • pKM22-SucD from SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: PKM22GabTSucD was prepared by inserting the isolated gabT gene into EcoRI / KpnI using primers 13, and then E. coli GabDYneI (pKM22-GabTSucD) was added to LB medium containing 250 g of glucose (250 ml flask). It was confirmed that the GABA was produced as a result of shaking culture for 72 hours at 30 rpm 250 ° C in 100 ml LB medium).
  • eutropha PHA biosynthesis genes transcription terminator for pKM22-MCS SEQ ID NO: 9 aatattgcctcgcccccgcgagggcc SEQ ID NO: 10 ggtacctttcacacaggaaacaatgagtaatgaagtatctat C. kluyveri DSM555 sucD gene SEQ ID NO: 11 tctagattatccccatatttcctcat SEQ ID NO: 12 gaattcatgaacagcaataaagagtt E. coli gabT gene SEQ ID NO: 13 ggtaccttactgcttcgcctcatcaaaacactggc

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Abstract

본 발명은 재조합 대장균 균주를 이용한 글루코스(glucose)로부터 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid; GABA)의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 글루코스로부터 GABA 전환 생산능이 있는 것으로 확인된 재조합 대장균 균주, 또는 상기 균주에 숙시닉세미알데하이드 디하이드로게네이즈(succinicsemialdehyde dehydrogenase; SucD) 및 GABA 아미노트란스퍼레이즈(4-aminobutyrate aminotransferase; GabT)를 형질전환하여 제조한 재조합 균주에 의해 글루코스로부터 GABA를 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 재조합 대장균 균주는 글루코스로부터 GABA로의 전환 생산능이 있으므로, 상기 방법은 GABA 생산기술에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

재조합 대장균을 이용한 감마-아미노부틸산의 제조 방법
본 발명은 재조합 대장균 균주를 이용한 글루코스(glucose)로부터 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)의 제조 방법에 관한 것이다.
최근 전 세계적인 석유수급 불안과 석유자원 고갈에 대한 위기의식으로 최근에 산업 바이오 기술을 이용하여 바이오매스에서 유래한 대체 생산 방법이나 대체 화합물을 생산하기 위한 전 인류적인 노력이 바이오에너지, 바이오플라스틱, 바이오화합물 등의 다양한 분야에서 가시화되고 있다. 바이오매스를 활용하여 생산되는 바이오 플라스틱 시장의 경우 2002년 Natureworks사에 의해 상업화된 폴리유산 (Poly Lactic acid)이 연 14만 톤 규모로 생산되어 최근 시장이 급속히 확대되고 있다. PHA계 바이오플라스틱인 폴리-(3-하이드록시부틸레이트-코-3-하이드록시발레레이트{poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalarate)}(P(3HB-co-3HV))도 Metabolix와 ADM의 합작회사인 Telles에 의해 5만 톤 규모의 공장이 2010년 완공되어 제품이 시판되고 있다. 또한, 듀폰사가 생산하고 있는 바이오매스 기반의 1,3-프로판디올을 이용하여 PTT 고분자 제품이 현재 상용화되어 있다. 이외에도 숙신산 기반의 PBS 등도 활발히 개발되고 있다. 상기 예로 든 바이오매스 유래 고분자의 단점 중의 하나는 낮은 내열성을 들 수 있다. 높은 내열성을 보유한 고분자의 대표적인 예는 나일론이다. 나일론 6과 나일론 6,6이 나일론 시장의 대부분을 차지하고 있지만 최근 생분해성 특성과 내열성을 동시에 지닌 나일론 4에 대한 관심이 높아지고 있다. 나일론 4의 원료물질인 2-피롤리돈은 감마 부티로락톤(gamma butyrolactone)으로부터 생산될 수 있으며 4-아미노부틸산의 탈수고리반응에 의해 생산될 수 있다.
4-아미노부틸산의 경우 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)이라고도 하는데, 체내에서는 신경전달물질 억제효과에 의한 저혈압 및 진통효과가 있다고 알려져, 현재 식품 및 의약품 소재로 활용되고 있다(Erlander et al., Neurochem Res. 16: 215-226, 1991). 이러한 GABA는 글루타메이트를 원료로 글루타메이트 디카르복실라아제(Glutamate decarboxylase)에 의해 제조될 수 있는데, 현재까지 다양한 글루타메이트 디카르복실라아제가 보고되어 있으며(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8491-8495, 1990; Protein Expression and Purification 8: 430-438, 1996; Biosci. Biotechnol. Biochem. 66(12): 2600-2605, 2002), 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용하여 GABA를 생산하는 공정이 개발된바 있다. 하지만, 효소반응의 경우 고가의 효소를 이용하기 때문에 GABA의 저가의 대량생산공정에는 적합하지 않을 수 있다.
효소반응의 문제점을 해결하기 위하여, 락토바실러스 등을 이용하여 바이오매스에서 생산된 글루탐산나트륨을 이용하여 GABA를 고농도로 전환하는 공정이 개발되어 나일론 4의 모노머로 이용될 수 있는 GABA의 경제적인 제조 공정 기술이 개발된 바 있다. 하지만, 글루탐산나트륨으로부터 GABA를 생산하기 위해서는 기질인 글루탐산나트륨을 코리네박테리움 같은 미생물의 발효공정을 통해 슈가로부터 생산하여야 하며, 글루탐산나트륨이 GABA로 전환될 때 이산화탄소가 방출되기 때문에 탄소 수율이 낮아지는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 글루코스(glucose)로부터 GABA를 탄소 수율이 낮아지지 않는 경로를 통해 생산하는 공정을 개발하기 위하여 연구한 결과, 숙시닉세미알데하이드(succinic semialdehyde)를 사용하는 경쟁회로가 제거된 대장균 돌연변이 균주에 숙시닐 코엔자임 에이(succinyl coenzyme A)를 숙시닉세미알데하이드로 전환하고 숙시닉세미알데하이드를 GABA로 전환하는 효소를 대량발현함으로써 글루코스로부터 GABA가 생산됨을 확인하여, 상기 균주는 GABA를 탄소 수율이 낮아지지 않고 글루코스로부터 생산하는데 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 GabD(succinate-semialdehyde dehydrogenase) 및 YneI(succinate-semialdehyde dehydrogenase) 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 숙시닉세미알데하이드 디하이드로게네이즈(succinicsemialdehyde dehydrogenase; SucD) 효소 및 GABA 아미노트란스퍼레이즈(4-aminobutyrate aminotransferase; GabT) 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 제조된 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid; GABA) 생산용 재조합 대장균 균주를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 SucD 효소 및 GabT 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 제조된 재조합 대장균 균주를 이용하여 글루코스(glucose)로부터 감마-아미노부틸산을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 감마-아미노부틸산 생산용 재조합 대장균 균주를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 이용하여 글루코스로부터 감마-아미노부틸산을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 감마-아미노부틸산을 생산하기 위한 본 발명의 재조합 대장균 균주를 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) GabD(succinate-semialdehyde dehydrogenase) 및 YneI(succinate-semialdehyde dehydrogenase) 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계; 및
2) 단계 1)의 대장균 균주를 숙시닉세미알데하이드 디하이드로게네이즈(succinicsemialdehyde dehydrogenase; SucD) 효소 및 GABA 아미노트란스퍼레이즈(4-aminobutyrate aminotransferase; GabT) 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid; GABA) 생산용 재조합 대장균 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 대장균 균주를 SucD 효소 및 GabT 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 재조합 대장균 균주를 제조하는 단계;
3) 단계 2)의 대장균 균주를 글루코스(glucose)를 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 배양액으로부터 감마-아미노부틸산을 수득하는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 감마-아미노부틸산 생산용 재조합 대장균 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 대장균 균주를 글루코스를 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
3) 단계 2)의 배양액으로부터 감마-아미노부틸산을 수득하는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산 생산방법 제공한다.
아울러, 본 발명은 감마-아미노부틸산을 생산하기 위한 본 발명의 재조합 대장균 균주를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 숙시닉세미알데하이드(succinic semialdehyde)를 숙신산으로 전환하는 GabD(succinate-semialdehyde dehydrogenase) 및 YneI(succinate-semialdehyde dehydrogenase) 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계; 및
2) 단계 1)의 대장균 균주를 숙시닐 코엔자임 에이(succinyl coenzyme A)를 숙시닉세미알데하이드로 전환하는 숙시닉세미알데하이드 디하이드로게네이즈(succinicsemialdehyde dehydrogenase; SucD) 효소 및 숙시닉세미알데하이드를 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid; GABA)으로 전환하는 GABA 아미노트란스퍼레이즈(4-aminobutyrate aminotransferase; GabT) 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 감마-아미노부틸산 생산용 재조합 대장균 균주를 제공한다.
상기 GabD는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 YneI는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 SucD는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 GabT는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 대장균 균주는 모든 종류의 대장균 균주가 적용될 수 있으나, XL1-Blue인 것이 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은
1) GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 대장균 균주를 SucD 효소 및 GabT 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 재조합 대장균 균주를 제조하는 단계;
3) 단계 2)의 대장균 균주를 글루코스(glucose)를 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 배양액으로부터 감마-아미노부틸산을 수득하는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산 생산방법을 제공한다.
상기 단계 3)의 배지는 대장균 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 사용가능하나, LB배지가 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 3)의 배양은 48 내지 96시간인 것이 바람직하고, 배양온도는 20 내지 40℃인 것이 바람직하고, 37℃인 것이 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 4)의 감마-아미노부틸산의 수득은 배양액을 분무 건조하여 저농도의 GABA-함유 분말을 대량으로 얻을 수 있고, 배양액을 감압 증발기를 이용하여 농축한 후 동결건조를 진행하여 고농도의 GABA 수득도 가능하며, 또한 이온교환수지를 이용한 정제방법을 사용한 후 농축 및 건조 공정을 수행하여 고순도의 GABA의 수득할 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 상기 GABA는 온도 및 pH의 변화에 크게 영향을 받지 않고, 공정 안정성이 있기 때문에 회수 공정상의 제한이 없다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, GabD 및 YneI가 결실된 대장균 균주에 숙시닉세미알데하이드를 더욱 축적시키고 GABA로 효율적으로 전환하기 위하여, 대장균 균주를 숙시닐코엔자임 에이(succinyl coenzyme A)를 숙시닉세미알데하이드(succinic semialdehyde)로 전환하는 SucD 효소와 숙시닉세미알데하이드를 GABA로 전환하는 GabT 효소를 코딩하는 유전자를 함유한 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 균주를 글루코스가 포함된 배지에 배양한 결과, GabD 및 YneI가 결실된 대장균 균주와 비교하여 약 2배 이상 유의적으로 상승된 GABA 생산능을 확인하였다(표 2 참조).
따라서, 본 발명의 재조합 대장균 균주는 GABA를 탄소 수율이 낮아지지 않고 글루코스로부터 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 감마-아미노부틸산 생산용 재조합 대장균 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 대장균 균주를 글루코스를 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
3) 단계 2)의 배양액으로부터 감마-아미노부틸산을 수득하는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산 생산방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 배지는 대장균 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 사용가능하나, LB배지가 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 2)의 배양은 48 내지 96시간인 것이 바람직하고, 배양온도는 20 내지 40℃인 것이 바람직하고, 37℃인 것이 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 3)의 감마-아미노부틸산의 수득은 배양액을 분무 건조하여 저농도의 GABA-함유 분말을 대량으로 얻을 수 있고, 배양액을 감압 증발기를 이용하여 농축한 후 동결건조를 진행하여 고농도의 GABA 수득도 가능하며, 또한 이온교환수지를 이용한 정제방법을 사용한 후 농축 및 건조 공정을 수행하여 고순도의 GABA의 수득할 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 상기 GABA는 온도 및 pH의 변화에 크게 영향을 받지 않고, 공정 안정성이 있기 때문에 회수 공정상의 제한이 없다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, GabD 및 YneI가 결실된 대장균 균주를 글루코스가 첨가된 LB 배지에서 배양한 후, GABA 생산능을 확인한 결과, 유의적인 GABA 전환 생산능을 확인하였다(표 1 참조).
따라서, 본 발명의 GabD 및 YneI가 결실된 대장균 균주는 GABA를 탄소 수율이 낮아지지 않고 글루코스로부터 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 감마-아미노부틸산을 생산하기 위한 본 발명의 재조합 대장균 균주를 제공한다.
상기 재조합 대장균 균주는 1) 숙시닉세미알데하이드(succinic semialdehyde)를 숙신산으로 전환하는 GabD(succinate-semialdehyde dehydrogenase) 및 YneI(succinate-semialdehyde dehydrogenase) 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계; 및
2) 단계 1)의 대장균 균주를 숙시닐 코엔자임 에이(succinyl coenzyme A)를 숙시닉세미알데하이드로 전환하는 숙시닉세미알데하이드 디하이드로게네이즈(succinicsemialdehyde dehydrogenase; SucD) 효소 및 숙시닉세미알데하이드를 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid; GABA)으로 전환하는 GABA 아미노트란스퍼레이즈(4-aminobutyrate aminotransferase; GabT) 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 제조하는 단계를 포함하는 제조방법, 또는 GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 숙시닉세미알데하이드(succinic semialdehyde)를 사용하는 경쟁회로가 제거된 대장균 균주에 숙시닐 코엔자임 에이(succinyl coenzyme A)를 숙시닉세미알데하이드로 전환하고 숙시닉세미알데하이드를 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid; GABA)으로 전환하는 효소를 대량 발현하는 재조합 대장균 균주에 관한 것으로, 이를 통해 글루코스를 이용한 감마-아미노부틸산 대량 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> GabD, YneI가 결실된 재조합 대장균을 이용한 GABA의 생산확인
<1-1> GabD 및 YneI가 결실된 재조합 대장균의 제작
숙시닉세미알데하이드(succinic semialdehyde)를 사용하는 경쟁회로를 제거하기 위하여 E.coli XL1-Blue의 염색체에서 숙시닉세미알데하이드를 숙신산으로 전환하는 GabD(succinate-semialdehyde dehydrogenase) 및 YneI(succinate-semialdehyde dehydrogenase) 유전자를 원스텝 불활성화방법(Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97, 6640-6645, 2000; Jung et al., Biotechnol. Bioeng. 105, 161-171, 2010)으로 제거한 E. coli XGabDYneI 균주를 제작하였다.
<1-2> GABA의 생산확인
상기 <1-1>에서 제작한 E. coli XGabDYneI 균주를 GABA 합성을 위한 숙주세포로 사용하여 GABA 생산을 확인하였다. 구체적으로, E. coli GabDYneI 균주를 20 g/L의 글루코오스가 포함된 LB 배지(250 ml 플라스크에 100 ml LB배지 포함)에서 30℃에서 250 rpm으로 72시간 동안 진탕 배양한 후 GABA를 측정하였다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 약 24시간 후에 0.2 g/L의 GABA가 생산되었으며 96시간 후에 0.3 g/L의 GABA가 생산되는 것을 확인하였다(표 1).
표 1
시간(h) GABA 농도 (g/L)
0 시 0
24 시 0.2
48 시 0.3
72 시 0.3
96 시 0.3
<실시예 2> SucD 및 GabT 유전자가 발현하는 재조합 대장균을 이용한 GABA의 생산확인
숙시닉세미알데하이드 디하이드로게네이즈(succinicsemialdehyde dehydrogenase; SucD), GABA 아미노트란스퍼레이즈(4-aminobutyrate aminotransferase; GabT) 유전자를 발현하는 재조합 E.coli XGabDYneI를 배양하여 글루코오스로부터 GABA 생산을 확인하기 위하여, sucD 및 gabT 유전자를 발현하는 벡터를 제작하였다.
발현용 벡터 pZE12-MCS는 pTacLac(Lee et al. Appl.Microbiol.Biotechnol. 79, 633-641, 2008)의 MCS(Muti-cloning sites) 및 Ralstonia eutropha의 PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터를 가지도록 변형시켰다. 구체적으로, Ralstonia eutropha의 PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터 유전자 단편을 p619C1437-pct540로부터 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 PCR로 수득하고, 상기 수득한 유전자 단편을 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 RBS, pTacLac MCS 및 R. eutropha의 PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터를 수득하였다. 상기 PCR 산물을 MfeI 및 AvrII를 처리하여 절단하고, EcoRI/AvrII로 절단된 pZE12-MCS에 삽입하여, pKE12-MCS를 제조하였다. 플라스미드 pZE12-MCS 및 pZA31-MCS는 ESPRESSYS(www.expressys.com)로부터 구입하여 수용하였다.
pKE31-MCS(EXPRESSYS)의 PLtetO-1프로모터를 pKE12-MCS를 XhoI/EcoRI으로 절단하여 수득한 PLlacO-1프로모터로 치환하여 pKA32-MCS를 제조하였다. 상기 pKA32-MCS를 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머를 사용하여 PCR하여, PLlacO-1 프로모터, MCS 및 R. eutropha의 PHA 생합성 유전자 전사 터미네이터를 포함하는 유전자 단편을 증폭시켰고, 상기 증폭된 유전자 단편을 pBR1MCS2(Kovach et al. Gene, 166, 175-176, 1995)의 SspI 부위에 삽입하여, pKM22-MCS를 제조하였다.
pKM22-MCS에 Clostridium kluyveri로부터 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머를 사용하여 분리한 sucD 유전자를 KpnI/XbaI으로 삽입하여, pKM22SucD를 제조하였고, pKM22-SucD에 E. coli로부터 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머를 사용하여 분리된 gabT 유전자를 EcoRI/KpnI으로 삽입하여, pKM22GabTSucD를 제조한 후, E. coli GabDYneI (pKM22-GabTSucD)를 20 g/L의 글루코오스가 포함된 LB 배지(250 ml 플라스크에 100 ml LB배지 포함)에서 30℃에서 250rpm으로 72시간 동안 진탕 배양한 결과 GABA가 생산됨을 확인하였다.
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 약 24시간 후에 0.2 g/L의 GABA가 생산되었으며 96시간 후에 0.6 g/L의 GABA가 생산되는 것을 확인하였다(표 3).
표 2
프라이머 서열(Primer sequence) 표적 유전자(Target gene)
서열번호 5 gagtcgacctgcaggcatgcaagcttcctgccggcctggttcaacc R. eutropha PHA biosynthesis genes transcription terminator
서열번호 6 cctagg gcctcgcccccgcgagggcc
서열번호 7 caattgattaaagaggagaaagaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagctt RBS and MCS for pKE12-MCS
서열번호 8 aatattaattgtgagcggataacaat PLlacO-1 promoter, MCS, and R. eutropha PHA biosynthesis genes transcription terminator for pKM22-MCS
서열번호 9 aatattgcctcgcccccgcgagggcc
서열번호 10 ggtacctttcacacaggaaacaatgagtaatgaagtatctat C. kluyveri DSM555 sucD gene
서열번호 11 tctagattatccccatatttcctcat
서열번호 12 gaattcatgaacagcaataaagagtt E. coli gabT gene
서열번호 13 ggtaccttactgcttcgcctcatcaaaacactggc
표 3
시간(h) GABA 농도 (g/L)
0 시 0
24 시 0.2
48 시 0.5
72 시 0.5
96 시 0.6

Claims (12)

1) GabD(succinate-semialdehyde dehydrogenase) 및 YneI(succinate-semialdehyde dehydrogenase) 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계; 및
2) 단계 1)의 대장균 균주를 숙시닉세미알데하이드 디하이드로게네이즈(succinicsemialdehyde dehydrogenase; SucD) 효소 및 GABA 아미노트란스퍼레이즈(4-aminobutyrate aminotransferase; GabT) 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid; GABA) 생산용 재조합 대장균 균주.
제 1항에 있어서, 단계 1)의 GabD는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 감마-아미노부틸산 생산용 재조합 대장균 균주.
제 1항에 있어서, 단계 1)의 YneI는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 감마-아미노부틸산 생산용 재조합 대장균 균주.
제 1항에 있어서, 단계 2)의 SucD는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 감마-아미노부틸산 생산용 재조합 대장균 균주.
제 1항에 있어서, 단계 2)의 GabT는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 감마-아미노부틸산 생산용 재조합 대장균 균주.
1) GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 대장균 균주를 SucD 효소 및 GabT 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 재조합 대장균 균주를 제조하는 단계;
3) 단계 2)의 대장균 균주를 글루코스(glucose)를 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 배양액으로부터 감마-아미노부틸산을 수득하는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산 생산방법.
제 6항에 있어서, 단계 3)의 배양은 48 내지 96시간 동안 30 내지 40℃에서 실시하는 것을 특징으로 하는 감마-아미노부틸산 생산방법.
GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 감마-아미노부틸산 생산용 재조합 대장균 균주.
1) GabD 및 YneI 효소를 코딩하는 유전자가 제거된 대장균 균주를 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 대장균 균주를 글루코스를 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
3) 단계 2)의 배양액으로부터 감마-아미노부틸산을 수득하는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산 생산방법.
제 9항에 있어서, 단계 2)의 배양은 48 내지 96시간 동안 30 내지 40℃에서 실시하는 것을 특징으로 하는 감마-아미노부틸산 생산방법.
감마-아미노부틸산을 생산하기 위한, 제 1항의 재조합 대장균 균주.
감마-아미노부틸산을 생산하기 위한, 제 8항의 재조합 대장균 균주.
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