CN103131663B - 提高丁二酸产量的重组菌及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了提高丁二酸产量的重组菌及构建方法。本发明提供的重组菌，为提高大肠杆菌或其突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK酶活，得到的重组菌。本发明的实验证明，本发明利用具有不同表达强度的组成型调控元件分别调控E.coli的ppc和pck基因的表达，探究了PPC与PCK酶活与丁二酸生产之间的规律；并在此基础上，通过协同调控E.coli的ppc和pck基因，同时利用PPC和PCK两个催化酶，发挥各自催化优势，显著提高了E.coli丁二酸的产量和转化率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及提高丁二酸产量的重组菌及构建方法。
背景技术
丁二酸又称为琥珀酸，在生物体中，作为TCA循环过程中重要的中间代谢物,同时也具有重要的应用价值。丁二酸可以作为多种重要化合物的前体原料，如1,4-丁二醇、四氢呋喃等,被广泛应用于食品、医药、化妆品,可降解塑料合成等方面，因此被美国能源部认为是12种最具价值的大宗化学品之一。目前丁二酸主要以不可再生的石油原料，通过化学法合成。由于石油资源的日益枯，利用微生物法产丁二酸引起了人们的极大关注。与化学合成法相比，微生物发酵法具有很多优势，而且由于丁二酸合成过程中吸收CO2,可以有效减缓温室气体的排放。目前,研究较多的产琥珀酸微生物菌株主要有:Actinobacillus succinogenes（McKinlayet al.,2000），Anaerobiospirillum succiniciproducens（Nghiem et al.,1997），Mannheimia succiniciproducens（Lee et al.,2002）以及Escherichia coli（Vemuri etal.,2005;Jantama et al.,2008a;Jantama et al.,2008b;Zhang et al.,2009a;Zhanget al.,2009b）。其中大肠杆菌E.coli由于其遗传背景明确、易操作、生长速率快、易培养及利用碳源广等诸多优点而受到越来越多的重视，被认为是最有潜力的琥珀酸生产菌株（Jantama et al.,2008a；Vemuri et al.,2002a；Zhang et al.,2009b）。
E.coli在厌氧条件下进行混合酸发酵，主要产生乳酸、甲酸、乙酸以及少量的丁二酸（Clark,1989）。对于丁二酸生产而言，副产物乳酸、甲酸、乙酸等的存在会抑制丁二酸的产量和转化率，也给下游的分离纯化带来困难。因此，需要改变E.coli细胞内的代谢流，抑制上述副产物的生成。先前的研究中，以E.coli W1485为出发菌，利用插入抗性基因的方法同时使乳酸脱氢酶（ldhA）以及丙酮酸甲酸裂解酶（pflB）编码基因失活，获得突变菌株NZN111（Stols et al.,1997）。该菌株由于缺少了Ldh以及PflB，使得乳酸和甲酸的产量显著降低，但是由于扰动导致的细胞体内的氧化还原不平衡，丙酮酸大量积累，使得菌株在厌氧条件下不能以葡萄糖为碳源进行生长。Chatterjee等人发现ptsG基因中的突变使得NZN111突变株能够重新利用葡萄糖生长，发酵产物中丁二酸、乙酸和乙醇的比例为2：1：1（Chatterjee et.,2001）。
磷酸转移酶系统（phosphoenolpyruvate(PEP):carbohydrate phosphotransferasesystems(PTS)）是大肠杆菌吸收利用葡萄糖的主要方式（Flores et al.,1996;Gosset,2005;Postma et al.,1993;Zhang et al.,2009a）。该系统由可溶性的酶I/Hpr（ptsHI基因编码）以及酶II（包括IIA/B/C，由crr以及ptsG基因编码）组成（Hernandez-Montalvo et al.,2003；Postma et al.,1993；Lu et al.,2011）。在PTS系统中，吸收一分子的葡萄糖需要消耗一分子的PEP，PEP被认为是E.coli中合成若干重要化合物的前体分子，大量PEP用于葡萄糖的吸收对于E.coli化合物合成而言是不经济的，失活PTS系统将有利于提高PEP的供给以及相关目的产物的生成（Flores et al.,1996;Wang et al.,2006;Yi et al.,2003;Zhanget al.,2009b）。
作为E.coli厌氧条件下丁二酸合成中的前体，PEP是E.coli代谢调控的重要节点（Millard et al.,1996；Zhang et al.,2009b）。在E.coli中，存在着两个PEP催化酶类，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC（GenBank No:ACA79659.1；GI:169756960）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK（GenBank No:AAC76428.1；GI:1789807）。这两个酶在这一催化过程中分别展现出不同的催化性能。其中，PPC是正常条件下的主要催化酶类，对底物之一的CO3 2-或者HCO3 -的Km值低，催化速度快，在催化过程中伴随着Pi的释放。Millard等人通过过表达E.coli来源的ppc基因，使得菌株JCL1208的丁二酸产量提高3.5倍（Millard et al.,1996）。Lin等人的研究也表明，在E.coli GJT001中过表达高粱（Sorghum vulgare）来源的ppc基因，有效地提高了丁二酸的产量（Lin et al.,2005）。正常情况下，E.coli pck基因的表达受到葡萄糖的抑制，只有在糖异生的情况下才会被激活表达，但是与PPC相比，E.coli PCK催化PEP生成OAA的过程中伴随着ATP的生成，是能量节省型的反应（Zhang et al.,2009b）。Kim等人发现在ppc基因缺失的情况下，过表达Actinobacillus succinogenes的pck基因使得野生型E.coli K12菌株的丁二酸产量提高6.5倍（Kim et al.,2004）；Kwon等人的研究结果表明，在含有高浓度的HCO3 -的条件下，过表达E.coli pck基因使得菌株的丁二酸产量提高2.2倍（Kwon et al.,2006）；Zhang等人的研究工作表明，pck上游-64调控元件区域的点突变（pck*）将会解除葡萄糖对pck的阻遏效应，显著提高PCK活性，提高E.coli丁二酸产率（Zhanget al.,2009b）。
PPC和PCK在催化PEP羧化过程中展现出不同的反应特性：PPC酶对HCO3 -亲和能力高（Km:0.1μM，Kai et al.,1999），催化速度快（Wohl and Markus,1972），能够快速地将PEP羧化成OAA，为丁二酸的合成提供前体，但是这一过程中也伴随着能量的损失（Pi的释放）；与之相比，虽然PCK酶对HCO3 -的亲和力较低（Km:13μM，Matte et al.,1996），PEP羧化的速度较慢，催化活性（specific activity）为28μmol/min/g（Krebs and Bridger,1980），但是在这一过程中，伴随着ATP的生成，ATP的产生将有利于菌株在厌氧条件下的生长。
发明内容
本发明提供了提高丁二酸产量的重组菌及构建方法。
本发明提供的重组菌，为提高大肠杆菌或其突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK酶活，得到的重组菌。
上述提高大肠杆菌或其突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK酶活为提高大肠杆菌或其突变株菌体中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK含量。
上述重组菌中，所述提高大肠杆菌或其突变株中PPC和PCK酶活的方法如下：
将所述大肠杆菌或其突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为如下A组调控元件中的任意一种，且将所述大肠杆菌或其突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为如下A组调控元件和B组调控元件中的任意一种：
所述A组调控元件由人工调控元件M1-12、M1-30、M1-46、M1-37和M1-93组成；
所述B组调控元件由人工调控元件Ppck*、RBSL-1、RBSL-2和RBSL-3组成；
所述人工调控元件M1-12的核苷酸序列为序列表中的序列4；
所述人工调控元件M1-30的核苷酸序列为序列表中的序列5；
所述人工调控元件M1-46的核苷酸序列为序列表中的序列6；
所述人工调控元件M1-37的核苷酸序列为序列表中的序列7；
所述人工调控元件M1-93的核苷酸序列为序列表中的序列8；
所述人工调控元件Ppck*的核苷酸序列为序列表中的序列2；
所述人工调控元RBSL-1的核苷酸序列为序列表中的序列11；
所述人工调控元RBSL-2的核苷酸序列为序列表中的序列12；
所述人工调控元RBSL-3的核苷酸序列为序列表中的序列13；
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因调控元件的核苷酸序列为序列表中的序列3；
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因调控元件的核苷酸序列为序列表中的序列9。
上述重组菌中，所述提高大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK酶活的方法为将所述大肠杆菌中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-46，且将所述大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件RBSL-2，得到重组菌ZT-020。
上述替换均采用同源重组的方法，上述将所述大肠杆菌中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-46，且将所述大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件RBSL-2按照实施例2中的重组菌ZT-020的构建方法进行。
上述重组菌中，所述提高大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK酶活的方法为如下1）-8）中任意一种：
1）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-46，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件Ppck*；得到重组菌ZT-015；上述替换均采用同样重组的方法，具体方法见实施例5的（二）；
2）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-12，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件Ppck*；得到重组菌ZT-014；上述替换均采用同样重组的方法，具体方法见实施例5的（二）；
3）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-37，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件Ppck*；得到重组菌ZT-016；上述替换均采用同样重组的方法，具体方法见实施例5的（二）；
4）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-93，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件Ppck*；得到重组菌ZT-017；上述替换均采用同样重组的方法，具体方法见实施例5的（二）；
5）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-12，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-37；得到重组菌ZT-010；上述替换均采用同样重组的方法，具体方法见实施例5的（一）；
6）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-46，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-37；得到重组菌ZT-011；上述替换均采用同样重组的方法，具体方法见实施例5的（一）；
7）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-37，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-37；得到重组菌ZT-012；上述替换均采用同样重组的方法，具体方法见实施例5的（一）；
8）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-93，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-37；得到重组菌ZT-013；上述替换均采用同样重组的方法，具体方法见实施例5的（一）。
上述大肠杆菌突变株Suc-T108为敲除大肠杆菌中的乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因和磷酸烯醇式丙酮酸依赖型的磷酸转移酶I编码基因，且将大肠杆菌中的半乳糖转运蛋白编码基因galP的调控元件替换成人工调控元件Ppck*，得到的重组菌；上述替换均为同源重组的方式，具体方法见实施例1的一；
所述半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件的核苷酸序列为序列表中的序列1；
所述人工调控元件Ppck*的核苷酸序列为序列表中的序列2。
上述重组菌中的所述替换均通过同源重组实现。
上述重组菌中，所述大肠杆菌为ATCC8739。
上述重组菌在生产丁二酸中的应用也是本发明保护的范围。
制备上述重组菌的方法也是本发明保护的范围，方法见上述所示。
本发明的实验证明，本发明利用具有不同表达强度的组成型调控元件分别调控E.coli的PPC与PCK基因的表达，探究了PPC与PCK酶活与丁二酸生产之间的规律；并在此基础上，通过协同调控E.coli ppc和pck基因，同时利用PPC和PCK两个催化酶，发挥各自催化优势，显著提高了E.coli丁二酸的产量和转化率。
附图说明
图1为PCK酶活与丁二酸产率之间的关系
其中1a为ZT-001至ZT-005中PCK酶活与丁二酸产率之间的关系；
1b为Suc-T110以及ZT-004A、ZT-004B、ZT-004C中PCK酶活与丁二酸产率之间的关系；
图2为PCK酶为低活性时，PPC酶活与丁二酸产率之间的关系
图3为PCK酶为中等活性时，PPC酶活与丁二酸产率之间的关系
图4为PCK酶为高活性时，PPC酶活与丁二酸产率之间的关系
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中重组菌株M1-12、M1-30、M1-46、M1-37、M1-93均记载在：Lu,J.,J.Tang,et al.(2012)."Combinatorial modulation of galP and glk gene expression for improvedalternative glucose utilization."Appl Microbiol Biotechnol93(6):2455-2462.公众可从天津工业生物技术研究所获得。
实施例1、大肠杆菌ATCC8739突变株重组大肠杆菌Suc-T108的构建
一、质粒pXZ-CS的构建
质粒构建操作步骤共四步：
第一步，以pACYC184质粒（Mok,Y.K.,Clark,D.R.,Kam,K.M.and Shaw,P.C.BsiY I,a novel thermophilic restriction endonuclease that recognizes5'CCNNNNNNNGG3'andthe discovery of a wrongly sequenced site in pACYC177.Nucleic Acids Res.1991,19:2321-2323；公众可从天津工业生物技术研究所获得）DNA为模板，使用引物184-cat-up/184-cat-down，扩增得到氯霉素抗性基因，基因片段大小为994bp，包含有氯霉素基因启动子序列，称为片段I。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物（10μM）各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。
扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸30秒（30个循环）；72℃延伸5分钟（1个循环）。
第二步，以芽孢杆菌Bacillus subtilis sp subtilis168DNA（该菌购自中国普通微生物菌种保藏中心，CGMCC No.1.1390）为模板，使用引物Bs-sacB-up/Bs-sacB-down进行PCR扩增果聚糖蔗糖转移酶基因（sacB），基因片段大小为1618bp，含有sacB基因启动子序列，称为片段II。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物（10μM）各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。
扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、57℃退火10秒、72℃延伸40秒（30个循环）；72℃延伸5分钟（1个循环）。
第三步，将第一步得到的片段I和第二步得到的片段II分别用限制性内切酶SacI(NEB公司)在37℃酶切30分钟；PCR纯化试剂盒清洗（Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司）；各取20ng片段I和片段II，加入1μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)、1μl T4-DNA快连酶(NEB公司)，补充蒸馏水至10μl，25℃反应5分钟；以酶连片段为底物，取1ul，用引物184-cat-up/Bs-sacB-down PCR扩增，扩增体系和扩增条件同第二步，得到含有cat-sacB连接片段III。
第四步，将PCR获得的片段III取1ul，加入1ul pEASY-blunt simple载体（试剂盒，北京全式金生物技术有限公司），25℃反应15分钟；加入50μl Trans10感受态细胞（购自北京全式金生物技术有限公司）中，冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有氨苄霉素（终浓度为100μg/ml）和氯霉素（终浓度为34μg/ml）的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，引物为M13-F/M13-R。送样测序分析，结果正确的为阳性克隆，得到质粒pXZ-CS(表3)。
二、构建重组大肠杆菌Suc-T108
重组大肠杆菌Suc-T108为将大肠杆菌ATCC8739敲除乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB、磷酸转移酶I编码基因ptsI；且将半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件（序列1）置换成Ppck*（序列2）得到的重组菌。
构建方法具体分为以下4个步骤：
（1）乳酸脱氢酶基因ldhA的敲除
重组菌Suc-T102为采用两步同源重组法将大肠杆菌ATCC8739中的乳酸脱氢酶基因ldhA敲除。
乳酸脱氢酶基因ldhA（GenBank No:YP_001725238.1；GI：170020284）的敲除采用两步同源重组的方法，共分为以下六步：
第一步，以大肠杆菌ATCC8739（Gunsalus IC,Hand DB.The use of bacteria in thechemical determination of total vitamin C.J Biol Chem.1941,141:853-858.公众可从天津工业生物技术研究所获得）基因组DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down，扩增1753bp PCR产物，该PCR产物包含大肠杆菌ATCC8739的乳酸脱氢酶编码基因ldhA及其上下游各400个左右碱基。
扩增体系为：New England Biolabs Phusion5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)各1μl、DNA模板20ng、引物（10μM）2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、59℃退火10秒、72℃延伸1分钟30秒（30个循环）；72℃延伸5分钟（1个循环）。
将上述1753bpPCR产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体（购自北京全式金生物技术有限公司）上。克隆体系为：1μl PCR扩增产物、1μl pEASY-Blunt克隆载体，轻轻混合、室温反应5分钟后加入50μl Trans1-T1感受态细胞中（购自北京全式金生物技术有限公司），冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有卡那霉素（终浓度为15μg/ml）的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了乳酸脱氢酶基因及其上下游各400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ001。
第二步，以pXZ001质粒DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-1/XZ-ldhA-2扩增，得到4758bp的PCR产物，该PCR产物包含pEASY-Blunt载体和乳酸脱氢酶编码基因上下游各400个左右碱基。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)各1μl、DNA模板20ng、引物（10μM）2μl、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、60℃退火10秒、72℃延伸2分钟（30个循环）；72℃延伸5分钟（1个循环）。
第三步，将含有氯霉素基因（cat）和果聚糖蔗糖转移酶基因（sacB）DNA片段cat-sacB连接至第二步的PCR扩增产物，具体如下：
以pXZ-CS为模板，使用引物cat-sacB-up/cat-sacB-down扩增，得到2618bp的PCR产物，即为含有氯霉素基因（cat）和果聚糖蔗糖转移酶基因（sacB）的DNA片段。
连接体系为：10ng的第二步4758bp的PCR产物、30ng的cat-sacB DNA片段，2μl10XT4连接缓冲液（NEB公司），1μl T4连接酶（NEB公司，400,000cohesive end units/ml），补充蒸馏水至20μl。室温连接2小时，取5μl加入50μl Trans1-T1感受态细胞中（购自北京全式金生物技术有限公司），冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有氯霉素（终浓度为17ug/ml）的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒（将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ001中的质粒）进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ002C。
第四步，以pXZ002C质粒DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down扩增出3447bpDNA片段I，扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)各1μl、DNA模板20ng、引物（10μM）2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、59℃退火10秒、72℃延伸1分钟40秒（30个循环）；72℃延伸5分钟（1个循环）。DNA片段I包含乳酸脱氢酶编码基因ldhA上游400个左右碱基、cat-sacBDNA片段、乳酸脱氢酶编码基因ldhA下游400个左右碱基。
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒（，Datsenko,wanner.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.ProcNatl Acad Sci USA.2000.97(12)：6640-6645；公众可从天津工业生物技术研究所获得）通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌ATCC8739，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌ATCC8739。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC8739的电转化感受态细胞（Doweret al.,1988；Dower,W.J.,Miller,J.F.,Ragsdale,C.W.1988.High efficiencytransformation of E.coli by high voltage electroporation.Nucleic Acids Res.16:6127-6145）；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser（Bio-Rad公司）电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2小时。取200μl菌液涂在含有氯霉素（终浓度为17ug/ml）的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down进行验证，挑选一个正确的单菌落，命名为Suc-T101。
第五步，将第二步得到的4758bp的PCR产物进行磷酸化处理，自连得到的质粒用于第二次同源重组；具体步骤如下：将第二步的4758bp的PCR产物首先用PCR纯化试剂盒清洗（Gel/PCR Extration Kit，购自BioMIGA生物技术有限公司）；取30ng纯化后的PCR扩增产物，加入2μl10XT4连接缓冲液(NEB公司)、1μl T4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃反应30分钟；加入1μl T4连接酶(NEB公司，400,000cohesive endunits/ml)，室温反应2小时得到连接产物；取5μl连接产物加入50μl Trans1-T1感受态细胞（购自北京全式金生物技术有限公司）中，冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250μl LB培养基，200rpm，37℃孵育1小时。取200μl菌液涂在含有卡那霉素（终浓度为15ug/ml）的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果上述第二步的PCR扩增产物进行了自连，证明质粒构建正确，得到质粒pXZ003。
第六步，以pXZ003质粒DNA为模板，用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down扩增出829bp DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Suc-T101。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的Suc-T101的电转化感受态细胞；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser（Bio-Rad公司）电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mlLB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30℃孵育4小时，去除pKD46质粒。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基（250ml烧瓶中装50ml培养基），培养24小时后在含有6%蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，所用引物为XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down，正确的菌落扩增产物为763bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Suc-T102（表1）。
敲除ldhA基因所构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2。
（2）丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB的敲除
重组菌Suc-T104为在重组菌Suc-T102中敲除丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB（GenBankNo:ACA78322.1；GI:169755623），操作步骤共以下六步：
第一步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物XZ-pflB-up/XZ-pflB-down，扩增得到2260bp大肠杆菌ATCC8739的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB及其上下游各400个左右碱基。将扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了丙酮酸甲酸裂解酶编码基因及其上下游各400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ014。
第二步，以pXZ014质粒DNA为模板，使用引物XZ-pflB-1/XZ-pflB-2进行PCR扩增，得到4808bp扩增产物，其包含pEASY-Blunt载体和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因上下游各400个左右碱基。
第三步，以pXZ-CS质粒为模板，使用引物cat-sacB-up/cat-sacB-down扩增，得到2618bp的PCR产物，即为含有氯霉素基因（cat）和果聚糖蔗糖转移酶基因（sacB）的DNA片段。
将含有氯霉素基因（cat）和果聚糖蔗糖转移酶基因（sacB）的DNA片段连接至第二步的4808bp PCR扩增产物；转化Trans1-T1感受态细胞。取200μl菌液涂在含有氯霉素（终浓度为17ug/ml）的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒（将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ014中的质粒）进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ015C。
第四步，以pXZ015C质粒DNA为模板，使用引物XZ-pflB-up/XZ-pflB-down扩增出3497bpDNA片段I。DNA片段I包含丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB上游400个左右碱基、cat-sacBDNA片段、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB下游400个左右碱基。
将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至菌株Suc-T102，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的菌株Suc-T102。
电转条件同实施例1步骤（1）第四步。取200μl菌液涂在含有氯霉素（终浓度为17ug/ml）的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，所用引物为XZ-pflB-up/XZ-pflB-down，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Suc-T103。
第五步，将第二步4808bp扩增产物进行磷酸化处理，进行自连。具体步骤同实施例1步骤（1）第五步，得到质粒pXZ016。
第六步，以pXZ016质粒DNA为模板，用引物XZ-pflB-up/XZ-pflB-down扩增出DNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至Suc-T103，电转条件同实施例1步骤（1）第六步。经过PCR验证，所用引物为XZ-pflB-up/XZ-pflB-down，正确的菌落扩增产物为879bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Suc-T104（表1）。
敲除pflB基因所构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2。
（3）磷酸烯醇式丙酮酸依赖型的磷酸转移酶I编码基因ptsI的敲除
重组菌Suc-T106为敲除重组菌Suc-T104中磷酸烯醇式丙酮酸依赖型的磷酸转移酶I编码基因ptsI（GenBank No:AAC75469.1；GI：1788756；）得到的重组菌；具体方法如下，共分为以下六步：
第一步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物XZ-ptsI-up/XZ-ptsI-down，扩增得到913bp扩增产物，为大肠杆菌ATCC8739的磷酸烯醇式丙酮酸依赖型的磷酸转移酶I编码基因ptsI及其上下游各400个左右碱基。将913bp扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了磷酸烯醇式丙酮酸依赖型的磷酸转移酶I编码基因ptsI及其上下游各400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ008。
第二步，以pXZ008质粒DNA为模板，使用引物XZ-ptsI-1/XZ-ptsI-2进行PCR扩增，得到4656bp扩增产物，扩增产物包含pEASY-Blunt载体和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因上下游各400个左右碱基。
第三步，以pXZ-CS质粒为模板，使用引物cat-sacB-up/cat-sacB-down扩增，得到2618bp的PCR产物，即为含有氯霉素基因（cat）和果聚糖蔗糖转移酶基因（sacB）的DNA片段。
将含有氯霉素基因（cat）和果聚糖蔗糖转移酶基因（sacB）DNA片段连接至第二步的4656bp PCR扩增产物；转化Trans1-T1感受态细胞。取200μl菌液涂在含有氯霉素（终浓度为17ug/ml）的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒（将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ008中的质粒）进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ009C。
第四步，以pXZ009C质粒DNA为模板，使用引物XZ-ptsI-up/XZ-ptsI-down扩增出3345bpDNA片段I；DNA片段I包含磷酸烯醇式丙酮酸依赖型的磷酸转移酶I编码基因ptsI上游400个左右碱基、cat-sacB DNA片段、磷酸烯醇式丙酮酸依赖型的磷酸转移酶I编码基因ptsI下游400个左右碱基。
将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至菌株Suc-T104，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的菌株Suc-T104。
电转条件同实施例1步骤（1）第四步。取200μl菌液涂在含有氯霉素（终浓度为17ug/ml）的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，所用引物为XZ-ptsI-up/XZ-ptsI-down，得到验证正确的单菌落，将其命名为Suc-T105。
第五步，将第二步得到4656bp PCR扩增产物进行磷酸化处理，进行自连。具体步骤同实施例1步骤（1）第五步，得到质粒pXZ010。
第六步，以pXZ010质粒DNA为模板，用引物XZ-ptsI-up/XZ-ptsI-down扩增出727bpDNA片段II。DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至菌株Suc-T105。电转条件同实施例1步骤（1）第六步。经过PCR验证，所用引物为XZ-ptsI-up/XZ-ptsI-down，挑选一个正确的单菌落，将其命名为Suc-T106（表1）。
敲除ptsI基因所构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2。
（4）半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件置换成Ppck*
重组菌Suc-T108为将菌株Suc-T106中半乳糖转运蛋白编码基因galP（GenbankNo:AAC75980.1；GI：1789312）调控元件(序列1)置换成调控元件Ppck*（序列2），操作步骤共以下六步：
第一步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down，扩增841bp扩增产物，为大肠杆菌ATCC8739的半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件其上下游各400个左右碱基。将扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了敲除半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件及其上下游各400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ011。
第二步，以pXZ011质粒DNA为模板，使用引物XZ-galP-P-1/XZ-galP-P-2进行PCR扩增，得到4614bp扩增产物，其扩增产物包含pEASY-Blunt载体和半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件以及上下游各400个左右碱基。
第三步，以pXZ-CS质粒为模板，使用引物cat-sacB-up/cat-sacB-down扩增，得到2618bp的PCR产物，即为含有氯霉素基因（cat）和果聚糖蔗糖转移酶基因（sacB）的DNA片段。
将含有氯霉素基因（cat）和果聚糖蔗糖转移酶基因（sacB）DNA片段连接至第二步的4614bp PCR扩增产物。转化Trans1-T1感受态细胞。取200μl菌液涂在含有氯霉素（终浓度为17μg/ml）的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒（将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ010中的质粒）进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ012C。
第四步，以pXZ012C质粒DNA为模板，使用引物XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down扩增出3303bp DNA片段I；该DNA片段I包含半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件上游400个左右碱基、cat-sacB DNA片段、半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件下游400个左右碱基。
将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至菌株Suc-T106，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的菌株Suc-T106。
电转条件同实施例1步骤（1）第四步。取200μl菌液涂在含有氯霉素（终浓度为17ug/ml）的LB平板上，37℃过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证，使用引物为XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down，得到验证正确的单菌落，将其命名为Suc-T107。
第五步，以大肠杆菌ATCC8739基因组DNA为模板，使用引物P-pck*-up-SpeI/P-pck*-down-KpnI扩增大肠杆菌ATCC8739的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的调控元件pck,引物序列见表2。PCR产物进行SpeI（购自NEB公司）和KpnI（购自NEB公司）酶切。将其克隆到经过相同酶酶切的质粒pTrc99A（Amann,E.,Ochs,B.and Abel,K.J.Tightlyregulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteinsin Escherichia coli.Gene.1988,69:301-15.公众可从天津工业生物技术研究所获得）表达载体上，命名为质粒pXZ602。以质粒pXZ602为模板，设计引物pck*-F/pck*-R进行扩增，引物序列为见表2。扩增产物经过T4多核苷酸激酶（购自NEB公司）加磷，自连得到阳性质粒，测序验证无误后，命名为pXZ603。
以pXZ603为模板，使用引物P-pck*-up-SpeI和P-pck*-down-KpnI扩增，得到378bp磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK的突变调控元件Ppck*，与第二步得到的4614bp扩增产物连接，得到质粒pXZ013。
用XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down引物对以质粒pXZ013为模板进行扩增出DNA片段II。
第六步，DNA片段II用于第二次同源重组。将DNA片段II电转至Suc-T107。电转条件同实施例1步骤（1）第六步。经过引物XZ-galP-P-up/XZ-galP-P-down进行PCR以及测序验证，得到1051bp为正确的单菌落，将其命名为Suc-T108（表1）。
将半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件置换成Ppck*所构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2。
表1、生产丁二酸的重组大肠杆菌
Ppck*代表大肠杆菌pck调控元件突变体(在相对于ATG起始处的-64位处G变为A)。M1-12、M1-30、M1-46、M1-37、M1-93是先前构建的人工调控元件元件，以大肠杆菌lacZ基因调控元件诱导后的强度为1，这些人工调控元件元件的调控元件强度分别为它的0.1、0.8、1.7、2.5、5倍。RBSL-pck是本实验室在M1-37-pck调控元件元件的基础上，通过RBS文库构建，筛选获得的pck调控元件元件。
表2、本发明中使用的引物
表3、本发明中构建的质粒
三、重组大肠杆菌Suc-T108生产丁二酸
1、发酵生产丁二酸
种子培养基和发酵培养基均由以下成分组成：
大量元素：葡萄糖和/或木糖、碳酸盐、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O；
微量元素：FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O，ZnCl2、Na2MoO4·2H2O和MnCl2·4H2O2；
水；
以上成分在所述发酵培养基中的浓度分别为：
大量元素：葡萄糖50g/L-150g/L或50g/L或100g/L或150g/L、碳酸盐1g/L-20g/L或1g/L或7.9g/L或8.4g/L或10g/L或20g/L、NH4H2PO40.5g/L-5g/L或0.5g/L或1g/L或5g/L、(NH4)2HPO41g/L-10g/L或1g/L或3g/L或10g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L-5g/L或0.1g/L或1g/L或5g/L和CaCl2·2H2O0.1g/L-5g/L或0.1g/L或1g/L或5g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O0.2μg/L-5μg/L或0.2μg/L或1.5μg/L或5μg/L、CoCl2·6H2O0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L、CuCl2·2H2O0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L、ZnCl20.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L、Na2MoO4·2H2O0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L和MnCl2·4H2O20.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.2μg/L或5μg/L；
所述碳酸盐为KHCO3、NaHCO3或NH4HCO3。
本发明的实施例中具体采用的种子培养基和发酵培养基的组分具体如下：葡萄糖100g/L、碳酸盐7.9g/L、NH4H2PO41g/L、(NH4)2HPO43g/L、MgSO4·7H2O1g/L和CaCl2·2H2O1g/L、FeCl3·6H2O1.5μg/L、CoCl2·6H2O0.1μg/L、CuCl2·2H2O0.1μg/L、ZnCl20.1μg/L、Na2MoO4·2H2O0.1μg/L和MnCl2·4H2O20.2μg/L、KHCO310g/L。
1）、种子培养：250ml三角瓶中种子培养基为50ml，115℃灭菌15min。冷却后将重组大肠杆菌Suc-T108按照1%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在pH值为7.0、37℃和120rpm的条件下培养16小时得到种子液，用于发酵培养基接种。
2）、发酵培养：发酵罐中培养基为250ml，将种子液按照终浓度OD550=0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，150rpm的条件下培养96小时，每隔24h取样得到发酵液，发酵液为发酵罐内所有物质。以ATCC8739为对照。
分析方法：使用安捷伦（Agilent-1200）高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行测定。发酵液中的葡萄糖、丁二酸和其他有机酸浓度测定采用伯乐公司（Biorad）的AminexHPX–87H有机酸分析柱。丁二酸标准品购自SIGMA公司，产品目录号为W327700。
结果：丁二酸标准品的保留时间为14.25min；重组菌Suc-T108厌氧发酵96小时生产了4mM的丁二酸（保留时间为14.25min），糖酸转化率为0.17mol/mol。
ATCC8739发酵96h生产了44mM的丁二酸，糖酸转化率为0.17mol/mol；
2、重组大肠杆菌Suc-T108中PCK酶活的测定
取30mL对数生长中后期的发酵液于50mL离心管中，4℃下以10000r/min离心10min，弃去上清液，收集菌体，用5mL100mmol/L Tris-Cl水溶液（Tris碱溶于水中，用HCl调节pH值为6.6）洗涤2次后，将菌体悬浮3ml100mmol/L Tris-HCl，置于冰槽中超声（功率：25W；开：1s；关：3s）破碎3-5min,4℃下以10000r/min离心20min，收集上清液用于酶活测定。
PCK酶活性检测反应体系为：反应缓冲液995μl（100mM Tris、10mM MgCl2、75mM NaHCO3、5mM MnCl2、10mM ADP、1mM DTT、20U MDH、0.2mM NADH、10mM PEP；pH6.6），加入5μl上述超声离心后的上清液，混匀后置于比色皿中，记录A340的变化情况。空白对照为反应缓冲液液加入5μl的ddH2O。
PPC酶活性检测反应体系为：反应缓冲液995μl（100mM Tris、10mM MgCl2、25mM NaHCO3、1mM DTT、20U MDH、0.2mM NADH、10mM PEP；pH8.0），加入5μl上述超声离心后的上清液，混匀后置于比色皿中，记录A340的变化情况。空白对照为反应缓冲液液加入5μl的ddH2O。
酶活力单位定义为：每分钟每mg蛋白消耗NADH的μMol。
Suc-T108菌株中的PCK酶活：0.11U/mg蛋白；
Suc-T108菌株中的PPC酶活：0.095U/mg蛋白。
ATCC8739的PCK酶活为：0.1U/mg蛋白；
ATCC8739的PPC酶活为：0.1U/mg蛋白。
实施例2、提高大肠杆菌ATCC8739中的PPC和PCK酶活构建重组菌ZT-020
重组菌ZT-020为将大肠杆菌ATCC8739中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件RBSL-2（序列12），且将PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-46（序列6），得到的重组菌；
仅提高大肠杆菌ATCC8739中的PCK酶活的重组菌ZT-018为将大肠杆菌ATCC8739中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件RBSL-2（序列12），得到的重组菌；
仅提高大肠杆菌ATCC8739中的PPC酶活的重组菌ZT-019为将大肠杆菌ATCC8739中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-46（序列6），得到的重组菌；
重组菌ZT-018的构建方法如下：
第一步同源重组：与实施例1的一的步骤（1）的第四步相同，以pXZ-CS质粒为模板，使用引物pck-cat-sacB-up和pck-cat-sacB-down扩增DNA片段I，用于第一次同源重组。引物序列见表2；得到2717bpDNA片段I，将所得DNA扩增片段I电转至带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC8739中，筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落，得到中间重组菌；
第二步同源重组：以后面实施例3中的（一）构建的重组菌ZT-004B的基因组DNA为模板，使用引物pck-RBSL-short-up/pck-RBSL-short-down扩增ZT-004B菌中pck基因的人工调控元件RBSL-2及其上下游各约400bp的同源臂，得到955bp的片段，用于第二步同源重组的调控元件片段，引物序列见表2。
将955bp的片段电转入整合DNA片段I的中间重组菌，得到重组菌。电转化和筛选方法与实施例1的一的步骤（1）的第六步相同。
重组菌的PCR验证的引物pck-RBSL-short-up/pck-RBSL-short-down，得到955bp以及测序正确的为阳性菌落，将其命名为菌株ZT-018；
重组菌ZT-019的构建方法如下：
第一步同源重组：与实施例1的一的步骤（1）的第四步相同，以pXZ-CS为模板，使用引物ppc-cat-sacB-up和ppc-cat-sacB-down扩增DNA片段I，用于第一次同源重组；引物序列见表2；得到2726bp DNA片段I，将所得DNA扩增片段I电转至带有pKD46质粒的大肠杆菌ATCC8739中，筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落，得到中间重组菌；
第二步同源重组：以重组菌M1-46的基因组DNA为模板，使用引物ppc-up-P和ppc-RBS-down，得到包含ppc启动子两侧同源臂和人工调控元件M1-46的193bp的DNＡ片段ppc-M1-46；引物序列见表2。
将上述DNＡ片段ppc-M1-46电转入整合ppc-cat-sacB片段的中间重组菌，得到重组菌。电转化和筛选方法与实施例1的一的步骤（1）的第六步相同。
PCR验证的引物ppc-YZ-up/ppc-YZ-down，得到758bp的为正确的单菌落，将其命名为菌株ZT-019（表1）。
重组菌ZT-020的构建方法具体如下：
第一步同源重组：与实施例1的一的步骤（1）的第四步相同，以pXZ-CS为模板，使用引物ppc-cat-sacB-up和ppc-cat-sacB-down扩增DNA片段I，用于第一次同源重组；引物序列见表2；得到2726bp DNA片段I，将所得DNA扩增片段I电转至带有pKD46质粒的重组菌ZT-018中，筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落，得到中间重组菌；
第二步同源重组：以质粒M1-46为模板，使用引物ppc-up-P和ppc-RBS-down，得到包含ppc启动子两侧同源臂和人工调控元件M1-46的193bp的DNＡ片段ppc-M1-46；引物序列见表2。
将上述DNＡ片段ppc-M1-46电转入整合了片段I（ppc-cat-sacB）的中间重组菌，得到重组菌。电转化和筛选方法与实施例1的一的步骤（1）的第六步相同。
PCR验证的引物ppc-YZ-up/ppc-YZ-down，得到758bp且测序无误的为正确的单菌落，将其命名为菌株ZT-020（表1）。
二、重组大肠杆菌ZT-018、ZT-019、ZT-020生产丁二酸
1、发酵生产丁二酸
种子培养基的配方、发酵培养基的配方、厌氧发酵方法和分析检测方法均与实施例1的二的1相同。以ATCC8739为对照。
结果：厌氧发酵96小时，ATCC8739生产了44mM的丁二酸，糖酸转化率为0.17mol/mol；
ZT-018（RBSL-2-pck）生产了75mM的丁二酸，比ATCC8739的丁二酸产量提高了70%，糖酸转化率为0.29mol/mol，比ATCC8739提高了93%；
ZT-019（ppc-M1-46）生产了104mM的丁二酸，糖酸转化率为0.40mol/mol，比ATCC8739的丁二酸产量提高了136%，糖酸转化率提高了135%；
ZT-020（RBSL-2-pck/M1-46-ppc）生产了115mM的丁二酸，糖酸转化率为0.44mol/mol，比ATCC8739菌株的丁二酸产量提高了160%，糖酸转化率提高了158%；比ZT-018（RBSL-2-pck）单基因调控菌株的丁二酸产量提高了53%，糖酸转化率提高了52%；比ZT-019（M1-46-ppc）单基因调控菌株的丁二酸产量提高了11%，糖酸转化率提高了10%。
2、重组大肠杆菌ZT-020中PCK和PPC酶活的测定
酶活测定方案同实施例1的二的2。
重组大肠杆菌中的PCK酶活为：ZT-020:2.2U/mg蛋白；ZT-018：2.2U/mg蛋白；ZT-019：0.1U/mg蛋白；ATCC8739：0.1U/mg蛋白；
重组大肠杆菌中的PPC酶活为：ZT-020:0.47U/mg蛋白；ZT-018：0.1U/mg蛋白；ZT-019：0.43U/mg蛋白；ATCC8739：0.1U/mg蛋白。
实施例3、提高重组大肠杆菌Suc-T108中PCK酶活构建重组菌
（一）重组大肠杆菌ZT-001至ZT-005的构建
一、重组大肠杆菌ZT-001至ZT-005的构建
重组大肠杆菌ZT-001为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为M1-12（序列4），得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-002为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为M1-30（序列5），得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-003为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件替换为M1-46（序列6），得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-004为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件替换为M1-37（序列7），得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-005为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件替换为M1-93（序列8），得到的重组菌；
具体如下：
第一步同源重组：与实施例1的一的步骤（1）的第四步相同，以pXZ-CS质粒为模板，使用引物pck-cat-sacB-up和pck-cat-sacB-down扩增DNA片段，用于第一次同源重组。引物序列见表2；得到2717bp DNA片段I，将所得DNA扩增片段I电转至带有pKD46质粒的重组菌Suc-T108，筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落，得到中间重组菌；
第二步同源重组：分别以重组菌株M1-12、M1-30、M1-46、M1-37、M1-93的基因组DNA为模板，使用引物pck-up-P/pck-RBS-down扩增，分别得到184bp的包含pck启动子两侧同源臂和人工调控元件M1-12、M1-30、M1-46、M1-37、M1-93的DNA片段pck-M1-12、pck-M1-30、pck-M1-46、pck-M1-37、pck-M1-93，引物序列见表2。
将上述DNA片段pck-M1-12、pck-M1-30、pck-M1-46、pck-M1-37、pck-M1-93分别电转入整合片段I的中间菌，得到重组菌。电转化和筛选方法与实施例1的一的步骤（1）的第六步相同。经过PCR验证，使用引物为pck-YZ-up/pck-YZ-down，得到676bp为正确的单菌落，将其命名为重组菌ZT-001至005（表1）。
二、重组大肠杆菌ZT-001至ZT-005生产丁二酸
1、发酵生产丁二酸
种子培养基的配方、发酵培养基的配方、厌氧发酵方法和分析检测方法均与实施例1的二的1相同。
结果：厌氧发酵96小时，ZT-001生产了17mM的丁二酸，糖酸转化率为0.15mol/mol；ZT-002生产了31mM的丁二酸，糖酸转化率为0.38mol/mol；ZT-003生产了31mM的丁二酸，糖酸转化率为0.38mol/mol；ZT-004生产了55mM的丁二酸，糖酸转化率为0.48mol/mol；ZT-005生产了12mM的丁二酸，糖酸转化率为0.18mol/mol。
2、重组大肠杆菌ZT-001至ZT-005中PCK酶活的测定
酶活测定方案同实施例1的二的2。
重组大肠杆菌中的PCK酶活为：ZT-001：0.24U/mg蛋白；ZT-002：0.38U/mg蛋白；ZT-003：0.38U/mg蛋白；ZT-004：0.53U/mg蛋白；ZT-005：0.21U/mg蛋白。
各菌株中PCK酶活与丁二酸产量的关系如图1a所示。
（二）、重组大肠杆菌Suc-T110以及ZT-004A、ZT-004B、ZT-004C的构建
一、重组大肠杆菌Suc-T110以及ZT-004A、ZT-004B、ZT-004C的构建
重组大肠杆菌Suc-T110为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件Ppck*(序列2)，得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-004A、ZT-004B、ZT-004C为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为含有兼并碱基的人工调控元件M1-37-RBSL（序列10），得到的三个单克隆重组菌，通过测序确定其各自具体的人工调控元件序列。具体为：
重组大肠杆菌ZT-004A为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件RBSL-1（序列11），得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-004B为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件RBSL-2（序列12），得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-004C为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件RBSL-3（序列13），得到的重组菌；
具体如下：
第一步同源重组：与实施例1的一的步骤（1）的第四步相同，以pXZ-CS为模板，使用引物pck-cat-sacB-up和pck-cat-sacB-down扩增DNA片段I，用于第一次同源重组。引物序列见表2；得到2717bp DNA片段I，将所得DNA扩增片段I电转至带有pKD46质粒的重组菌Suc-T108，筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落，得到中间重组菌；
第二步同源重组：以pXZ603质粒为模板，使用引物P-pck*-up-SpeI/P-pck*-down-KpnI扩增（引物序列见表2），得到378bp人工调控元件Ppck*；将378bp人工调控元件Ppck*电转入整合了片段I的中间重组菌，得到重组菌1。重组菌1PCR验证的引物pck-YZ-up/pck-YZ-down，得到676bp且测序正确的单菌落，将其命名为菌株Suc-T110；
另外，以重组菌ZT-004的基因组DNA为模板，使用引物pck-RBSL-up/pck-RBSL-down扩增（引物序列见表2），得到619bp的DNA片段III。将619bp的DNA片段III电转入整合片段I的中间重组菌，在得到的重组菌中挑出三个单克隆，分别命名为重组菌2、重组菌3、重组菌4。电转化和筛选方法与实施例1的一的步骤（1）的第六步相同。
重组菌2、重组菌3、重组菌4的PCR验证的引物为pck-YZ-up/pck-YZ-down，得到676bp的为正确的单菌落，分别命名为重组菌ZT-004A、ZT-004B和ZT-004C。
二、重组大肠杆菌Suc-T110、ZT-004A至ZT-004C生产丁二酸
1、发酵生产丁二酸
种子培养基的配方、发酵培养基的配方、厌氧发酵方法和分析检测方法均与实施例1的二的1相同。
结果：厌氧发酵96小时，Suc-T110生产了226mM的丁二酸，糖酸转化率为1.12mol/mol；ZT-004A生产了217mM的丁二酸，糖酸转化率为0.99mol/mol；ZT-004B生产了264mM的丁二酸，糖酸转化率为1.20mol/mol；ZT-004C生产了256mM的丁二酸，糖酸转化率为1.16mol/mol。
2、重组大肠杆菌Suc-T110、ZT-004A至ZT-004C中PCK酶活的测定
酶活测定方案同实施例1的二的2。
重组大肠杆菌中的PCK酶活为：Suc-T110:1.84U/mg蛋白；ZT-004A：1.52U/mg蛋白；ZT-004B：2.22U/mg蛋白；ZT-004C：1.98U/mg蛋白；
各菌株中PCK酶活与丁二酸产量的关系如图1b所示。
实施例4、提高重组大肠杆菌Suc-T108中PPC酶活构建重组菌ZT-006至ZT-009的构建
一、重组大肠杆菌ZT-006至ZT-009的构建
重组大肠杆菌ZT-006为将重组菌Suc-T108中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-12(序列4)，得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-007为将重组菌Suc-T108中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-46(序列6)，得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-008为将重组菌Suc-T108中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-37(序列7)，得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-009为将重组菌Suc-T108中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-93(序列8)，得到的重组菌；
具体如下：
第一步同源重组：与实施例1的一的步骤（1）的第四步相同，以pXZ-CS质粒为模板，使用引物ppc-cat-sacB-up和ppc-cat-sacB-down扩增DNA片段I，用于第一次同源重组；引物序列见表2；得到2726bp DNA片段I，将所得DNA扩增片段I电转至带有pKD46质粒的重组菌Suc-T108，筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落，得到中间重组菌；
第二步同源重组：以重组菌株M1-12、M1-46、M1-37、M1-93的基因组DNA为模板，使用引物ppc-up-P和ppc-RBS-down，分别得到193bp的包含ppc启动子两侧同源臂和人工调控元件M1-12、M1-46、M1-37、M1-93的DNA片段ppc-M1-12、ppc-M1-46、ppc-M1-37、ppc-M1-93；引物序列见表2。
将上述DNA片段ppc-M1-12、ppc-M1-46、ppc-M1-37、ppc-M1-93分别电转入整合了片段I的中间重组菌，分别得到重组菌。电转化和筛选方法与实施例1的一的步骤（1）的第六步相同。
PCR验证的引物ppc-YZ-up/ppc-YZ-down，得到758bp的为正确的单菌落，将其命名为菌株ZT-006至ZT-009（表1）。
二、重组大肠杆菌ZT-006至ZT-009生产丁二酸
1、发酵生产丁二酸
种子培养基的配方、发酵培养基的配方、厌氧发酵方法和分析检测方法均与实施例1的二的1相同。
结果：厌氧发酵96小时，ZT-006生产了75mM的丁二酸，糖酸转化率为0.65mol/mol；ZT-007生产了94mM的丁二酸，糖酸转化率为0.63mol/mol；ZT-008生产了58mM的丁二酸，糖酸转化率为0.59mol/mol；ZT-009生产了56mM的丁二酸，糖酸转化率为0.49mol/mol。
2、重组大肠杆菌ZT-006至ZT-009中PPC酶活的测定
酶活测定方案同实施例1的二的2。
重组大肠杆菌中的PPC酶活为：ZT-006：0.34U/mg蛋白；ZT-007：0.47U/mg蛋白；ZT-008：0.60U/mg蛋白；ZT-009：1.01U/mg蛋白。
各菌株中PPC酶活与丁二酸产量的关系如图2所示。
实施例5、提高重组大肠杆菌Suc-T108中的PPC和PCK酶活构建重组菌
（一）重组大肠杆菌ZT-010至ZT-013的构建
重组大肠杆菌ZT-010为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件M1-37（序列7），且将PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-12（序列4），得到的重组菌；也就是将重组菌ZT-004中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-12（序列4），得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-011为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件M1-37（序列7），且将PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-46（序列6）；也就是将重组菌ZT-004中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-46（序列6），得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-012为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件M1-37（序列7），且将PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-37（序列7）；也就是将重组菌ZT-004中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-37（序列7），得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-013为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件M1-37（序列7），且将PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-93（序列8）；也就是将重组菌ZT-004中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-93（序列8），得到的重组菌；
具体如下：
第一步同源重组：与实施例1的一的步骤（1）的第四步相同，以pXZ-CS质粒为模板，使用引物ppc-cat-sacB-up和ppc-cat-sacB-down扩增DNA片段I，用于第一次同源重组；引物序列见表2；得到2726bp DNA片段I，将所得DNA扩增片段I电转至带有pKD46质粒的重组菌ZT-004，筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落，得到中间重组菌；
第二步同源重组：以重组菌株M1-12、M1-46、M1-37、M1-93基因组DNA为模板，使用引物ppc-up-P和ppc-RBS-down，分别得到193bp的包含ppc启动子两侧同源臂和人工调控元件M1-12、M1-46、M1-37、M1-93的DNA片段ppc-M1-12、ppc-M1-46、ppc-M1-37、ppc-M1-93；引物序列见表2。
将上述DNA片段ppc-M1-12、ppc-M1-46、ppc-M1-37、ppc-M1-93分别电转入中间重组菌，分别得到重组菌。电转化和筛选方法与实施例1的一的步骤（1）的第六步相同。
PCR验证的引物ppc-YZ-up/ppc-YZ-down，得到758bp的为正确的单菌落，将其命名为菌株ZT-010至ZT-013（表1）。
二、重组大肠杆菌ZT-010至ZT-013生产丁二酸
1、发酵生产丁二酸
种子培养基的配方、发酵培养基的配方、厌氧发酵方法和分析检测方法均与实施例1的二的1相同。
结果：厌氧发酵96小时，ZT-010（M1-12-ppc/M1-37-pck）生产了119mM的丁二酸，糖酸转化率为0.94mol/mol，比ZT-006（单调控ppc至M1-12-ppc）的产量提高了59%，糖酸转化率提高了45%；比ZT-004（单调控pck至M1-37-pck）的产量提高了116%，糖酸转化率提高了96%；
ZT-011（M1-46-ppc/M1-37-pck）生产了156mM的丁二酸，糖酸转化率为1.09mol/mol，比ZT-007（单调控ppc至M1-46-ppc）的产量提高了66%，糖酸转化率提高了73%；比ZT-004（单调控pck至M1-37-pck）的产量提高了184%，糖酸转化率提高了127%；
ZT-012（M1-37-ppc/M1-37-pck）生产了138mM的丁二酸，糖酸转化率为1.01mol/mol，比ZT-008（单调控ppc至M1-37-ppc）的产量提高了138%，糖酸转化率提高了71%；比ZT-004（单调控pck至M1-37-pck）的产量提高了151%，糖酸转化率提高了110%；
ZT-013（M1-93-ppc/M1-37-pck）生产了130mM的丁二酸，糖酸转化率为1.02mol/mol，比ZT-009（单调控ppc至M1-93-ppc）的产量提高了132%，糖酸转化率提高了108%；比ZT-004（单调控pck至M1-37-pck）的产量提高了136%，糖酸转化率提高了112%。
2、重组大肠杆菌ZT-010至ZT-013中PPC/PCK酶活的测定
酶活测定方案同实施例1的二的2。
重组大肠杆菌中的PPC酶活为：ZT-010：0.34U/mg蛋白；ZT-011：0.47U/mg蛋白；ZT-012：0.60U/mg蛋白；ZT-013：1.01U/mg蛋白；
重组大肠杆菌中的PCK酶活为：ZT-010：0.53U/mg蛋白；ZT-011：0.53U/mg蛋白；ZT-012：0.53U/mg蛋白；ZT-013：0.53U/mg蛋白；
PPC酶活与丁二酸的产量之间的关系如图3。
（二）、重组大肠杆菌ZT-014至ZT-017的构建
重组大肠杆菌ZT-014为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件Ppck*（序列2），且将PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-12（序列4），得到的重组菌；也就是将重组菌Suc-T110中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-12（序列4），得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-015为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件Ppck*（序列2），且将PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-46（序列6），得到的重组菌；也就是将重组菌Suc-T110中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-46（序列6），得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-016为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件Ppck*（序列2），且将PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-37（序列7），得到的重组菌；也就是将重组菌Suc-T110中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-37（序列7），得到的重组菌；
重组大肠杆菌ZT-017为将重组菌Suc-T108中的PCK基因的调控元件（序列3）替换为人工调控元件Ppck*（序列2），且将PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-93（序列8），得到的重组菌；也就是将重组菌Suc-T110中的PPC基因的调控元件（序列9）替换为人工调控元件M1-93（序列8），得到的重组菌；
具体如下：
第一步同源重组：与实施例1的一的步骤（1）的第四步相同，以pXZ-CS质粒为模板，使用引物ppc-cat-sacB-up和ppc-cat-sacB-down扩增DNA片段I，用于第一次同源重组；引物序列见表2；得到2726bp DNA片段I，将所得DNA扩增片段I电转至带有pKD46质粒的重组菌Suc-T110，筛选氨苄青霉素与氯霉素抗性的菌落，得到中间重组菌；
第二步同源重组：以重组菌株M1-12、M1-46、M1-37、M1-93为模板，使用引物ppc-up-P和ppc-RBS-down，分别得到193bp的包含ppc启动子两侧同源臂和人工调控元件M1-12、M1-46、M1-37、M1-93的DNA片段ppc-M1-12、ppc-M1-46、ppc-M1-37、ppc-M1-93；引物序列见表2。
将上述DNA片段ppc-M1-12、ppc-M1-46、ppc-M1-37、ppc-M1-93分别电转入中间重组菌，分别得到重组菌。电转化和筛选方法与实施例1的一的步骤（1）的第六步相同。
PCR验证的引物ppc-YZ-up/ppc-YZ-down，得到758bp的为正确的单菌落，将其命名为菌株ZT-014至ZT-017（表1）。
二、重组大肠杆菌ZT-014至ZT-017生产丁二酸
1、发酵生产丁二酸
种子培养基的配方、发酵培养基的配方、厌氧发酵方法和分析检测方法均与实施例1的二的1相同。
结果：厌氧发酵96小时，Suc-T110（ppc wt/pck*）生产了226mM的丁二酸，糖酸转化率为1.12mol/mol，比XZ-T014（ppc wt）的产量提高了近7倍，糖酸转化率提高了5.6倍；
ZT-014（M1-12-ppc/pck*）生产了270mM的丁二酸，糖酸转化率为1.18mol/mol，比ZT-006（单调控ppc至M1-12-ppc）的产量提高了2.6倍，糖酸转化率提高了82%；
ZT-015（M1-46-ppc/pck*）生产了282mM的丁二酸，糖酸转化率为1.24mol/mol，比ZT-007（单调控ppc至M1-46-ppc）的产量提高了2倍，糖酸转化率提高了97%；
ZT-016（M1-37-ppc/pck*）生产了237mM的丁二酸，糖酸转化率为1.16mol/mol，比ZT-008（单调控ppc至M1-37-ppc）的产量提高了3倍，糖酸转化率提高了97%；
ZT-017（M1-93-ppc/pck*）生产了210mM的丁二酸，糖酸转化率为1.16mol/mol，比ZT-009（单调控ppc至M1-93-ppc）的产量提高了2.75倍，糖酸转化率提高了137%；
在这些调控菌株中，ZT-015（M1-46-ppc/pck*）的调控效果最好，丁二酸产量为282mM，糖酸转化率为1.24mol/mol，分别比ZT-014（ppc wt/pck*）的产量提高了23%，转化率提高了10%。
2、重组大肠杆菌ZT-014至ZT-017中PPC/PCK酶活的测定
酶活测定方案同实施例1的二的2。
重组大肠杆菌中的PPC酶活为：ZT-014：0.34U/mg蛋白；ZT-015：0.47U/mg蛋白；ZT-016：0.60U/mg蛋白；ZT-017：1.01U/mg蛋白；
重组大肠杆菌中的PCK酶活为：ZT-014：1.8U/mg蛋白；ZT-015：1.8U/mg蛋白；ZT-016：1.8U/mg蛋白；ZT-017：1.8U/mg蛋白。
PPC酶活与丁二酸的产量之间的关系如图4所示。
Claims (8)
1.重组菌，为提高大肠杆菌或其突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK酶活，得到的重组菌；
所述提高大肠杆菌或其突变株中PPC和PCK酶活的方法如下：
将所述大肠杆菌或其突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为如下A组调控元件中的任意一种，且将所述大肠杆菌或其突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为如下A组调控元件和B组调控元件中的任意一种：
所述A组调控元件由人工调控元件M1-12、M1-30、M1-46、M1-37和M1-93组成；
所述B组调控元件由人工调控元件Ppck*、RBSL-1、RBSL-2和RBSL-3组成；
所述人工调控元件M1-12的核苷酸序列为序列表中的序列4；
所述人工调控元件M1-30的核苷酸序列为序列表中的序列5；
所述人工调控元件M1-46的核苷酸序列为序列表中的序列6；
所述人工调控元件M1-37的核苷酸序列为序列表中的序列7；
所述人工调控元件M1-93的核苷酸序列为序列表中的序列8；
所述人工调控元件Ppck*的核苷酸序列为序列表中的序列2；
所述人工调控元RBSL-1的核苷酸序列为序列表中的序列11；
所述人工调控元RBSL-2的核苷酸序列为序列表中的序列12；
所述人工调控元RBSL-3的核苷酸序列为序列表中的序列13；
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因调控元件的核苷酸序列为序列表中的序列3；
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因调控元件的核苷酸序列为序列表中的序列9。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：
所述提高大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK酶活的方法为将所述大肠杆菌中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-46，且将所述大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件RBSL-2。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：
所述提高大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK酶活的方法为如下1）-8）中任意一种：
1）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-46，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件Ppck*；
2）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-12，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件Ppck*；
3）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-37，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件Ppck*；
4）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-93，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件Ppck*；
5）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-12，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-37；
6）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-46，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-37；
7）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-37，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-37；
8）将所述大肠杆菌突变株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-93，且将所述大肠杆菌突变株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK基因的调控元件替换为所述人工调控元件M1-37。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述大肠杆菌突变株为敲除大肠杆菌中的乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因和磷酸烯醇式丙酮酸依赖型的磷酸转移酶I编码基因，且将大肠杆菌中的半乳糖转运蛋白编码基因galP的调控元件替换成人工调控元件Ppck*，得到的重组菌；
所述半乳糖转运蛋白编码基因galP调控元件的核苷酸序列为序列表中的序列1；
所述人工调控元件Ppck*的核苷酸序列为序列表中的序列2。
5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述替换均通过同源重组实现。
6.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述大肠杆菌为ATCC 8739。
7.权利要求1-6中任一所述重组菌在生产丁二酸中的应用。
8.制备权利要求1-6中任一所述重组菌的方法。
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