WO2012108323A1 - 表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法 - Google Patents

表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法 Download PDF

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WO2012108323A1
WO2012108323A1 PCT/JP2012/052348 JP2012052348W WO2012108323A1 WO 2012108323 A1 WO2012108323 A1 WO 2012108323A1 JP 2012052348 W JP2012052348 W JP 2012052348W WO 2012108323 A1 WO2012108323 A1 WO 2012108323A1
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WO
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light
measurement
antigen
angle
amount
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PCT/JP2012/052348
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English (en)
French (fr)
Inventor
謙一 宮田
茂昭 栃本
Original Assignee
コニカミノルタホールディングス株式会社
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a surface plasmon excitation fluorescence measurement device and a surface plasmon excitation fluorescence measurement method.
  • the evanescent wave leaks from the interface, and the plasmon and the evanescent wave in the metal film interfere with each other.
  • the incident angle of the excitation light to the interface is set to the resonance angle and the plasmon and the evanescent wave resonate, the electric field of the evanescent wave is remarkably enhanced.
  • SPFS surface plasmon excited fluorescence spectroscopy
  • this enhanced electric field is used. That is, the antigen is captured on the surface of the metal film, the captured antigen is fluorescently labeled, and an enhanced electric field is allowed to act on the fluorescent label.
  • fluorescence is emitted from the fluorescent label.
  • surface plasmon excitation fluorescence spectroscopy the amount of fluorescence emitted from a fluorescent label is measured.
  • Patent Document 1 relates to detection of an antigen by surface plasmon excitation fluorescence spectroscopy.
  • the resonance angle is measured after the antigen is fluorescently labeled.
  • the intensity of the electric field is significantly increased when the incident angle of the excitation light is set to the resonance angle, it is important to accurately identify the resonance angle when detecting antigen by surface plasmon excitation fluorescence spectroscopy. .
  • the resonance angle is measured before the antigen is captured, the change in the resonance angle due to the antigen concentration and the variation in the amount of change are ignored, and the resonance angle is not accurately specified.
  • the resonance angle was measured after the antigen was fluorescently labeled, causing the fading of the fluorescent dye. Both of these cause a decrease in the amount of surface plasmon excitation fluorescence, and cause a large variation in the amount of surface plasmon excitation fluorescence. Therefore, in the prior art, the sensitivity and accuracy of antigen detection are not sufficient.
  • An object of the present invention is to provide a surface plasmon excitation fluorescence measurement device and a surface plasmon excitation fluorescence measurement method that improve the sensitivity and accuracy of antigen detection.
  • the first to seventh aspects of the present invention relate to a surface plasmon excitation fluorescence measuring apparatus.
  • a dielectric medium, a conductor film, and an antigen capturing body are provided.
  • the dielectric medium is transparent to the excitation light.
  • the first main surface of the conductor film is in close contact with the reflective surface of the dielectric medium.
  • the second main surface of the conductor film does not adhere to the reflective surface of the dielectric medium.
  • the antigen capturing body is fixed on the second main surface.
  • the antigen capturer includes an antibody that binds to the antigen.
  • Excitation light emitted from the light source is incident on the incident surface of the dielectric medium.
  • the excitation light incident on the incident surface is totally reflected on the reflecting surface.
  • the excitation light totally reflected by the reflecting surface is emitted from the emitting surface.
  • the incident angle of the excitation light to the reflecting surface is scanned, the amount of light emitted from the conductor film and the antigen capturing body in the direction toward the second main surface is measured, and the relationship between the incident angle and the amount of light is obtained. From the relationship between the incident angle and the light amount, the resonance angle at which the light amount is maximized is specified, and the measurement angle is determined from the resonance angle.
  • the incident angle is set to the measurement angle, the amount of light emitted from the conductor film and the antigen capturing body in the direction in which the second main surface faces is measured, and the first measurement result is obtained.
  • the relationship between the incident angle and the amount of light can be obtained after the sample has contacted the antigen capturing body and before the fluorescently labeled antibody-containing material has contacted the antigen capturing body.
  • the fluorescently labeled antibody-containing material includes a fluorescently labeled antibody that is fluorescently labeled and binds to an antigen.
  • the difference between the first aspect and the second aspect is in specifying the resonance angle.
  • the amount of light emitted from the reflecting surface is measured while scanning the incident angle of the excitation light on the reflecting surface, and the resonance angle at which the light amount is minimized is specified from the relationship between the incident angle and the amount of light.
  • the third aspect adds further matters to the first or second aspect.
  • the direction in which the second main surface faces from the conductor film and the antigen capturing body before the fluorescently labeled antibody-containing material is brought into contact with the antigen capturing body and after the incident angle is set to the measurement angle
  • the amount of light emitted to is measured and a second measurement result is obtained. Further, the second measurement result is subtracted from the first measurement result.
  • the fourth aspect adds further matters to the third aspect.
  • the amount of light emitted from the conductor film and the antigen capturing body toward the second main surface is measured while the irradiation position of the excitation light is scanned, and the relationship between the irradiation position and the amount of light is can get. From the relationship between the irradiation position and the light amount, the first irradiation position and the second irradiation position at which the light amount decreases from the maximum value by the same value are specified, and the middle of the first irradiation position and the second irradiation position is determined as the measurement position. Is done. The irradiation position is set to the measurement position.
  • the fifth aspect adds further matters to any of the first to fourth aspects.
  • the amount of light emitted from the conductor film and the antigen capturing body in the direction in which the second main surface faces is measured in a blocking state where excitation light is not guided to the incident surface, and the third measurement result Is acquired. Further, the third measurement result is subtracted from the first measurement result.
  • the sixth aspect adds further matters to any of the first to fifth aspects.
  • the amount of light emitted from the conductor film and the antigen capturing body toward the second main surface is measured while the polarization direction of the excitation light is scanned, and the relationship between the polarization direction and the amount of light is determined. can get. From the relationship between the polarization direction and the light amount, the polarization direction in which the light amount is maximized is specified, and the measurement polarization direction in which the measurement is performed is determined. The polarization direction is set in the measurement method.
  • the seventh aspect adds further matters to any of the first to sixth aspects.
  • a band-pass filter that selectively attenuates light having the same wavelength as the excitation light while the light amount is measured to obtain the first measurement result is provided from the conductor film and the antigen capturing body. It is inserted into the optical path of the light emitted in the direction in which the main surface of 2 faces.
  • 8th and 9th aspects of the present invention relate to a surface plasmon excitation fluorescence measurement method.
  • a structure including a dielectric medium, a conductor film, and an antigen capturing body is prepared.
  • the dielectric medium is transparent to the excitation light.
  • the first main surface of the conductor film is in close contact with the reflective surface of the dielectric medium.
  • the second main surface of the conductor film does not adhere to the reflective surface of the dielectric medium.
  • the antigen capturer includes an antibody that binds to the antigen.
  • the antigen capturing body adheres to and is fixed on the second main surface.
  • Excitation light emitted from the light source enters the incident surface of the dielectric medium, is totally reflected by the reflecting surface, and exits from the emitting surface.
  • the amount of scattered light is measured while scanning the incident angle of the excitation light to the reflecting surface, and the relationship between the incident angle and the amount of light is obtained. From the relationship between the incident angle and the light amount, the resonance angle at which the light amount is maximized is specified, and the measurement angle is determined from the resonance angle. The incident angle is set as the measurement angle, and the amount of surface plasmon excitation fluorescence is measured.
  • the relationship between the incident angle and the amount of light can be obtained after the sample has contacted the antigen capturing body and before the fluorescently labeled antibody-containing material has contacted the antigen capturing body.
  • the fluorescently labeled antibody-containing material includes a fluorescently labeled antibody that is fluorescently labeled and binds to an antigen.
  • the difference between the eighth aspect and the ninth aspect is in the specification of the resonance angle.
  • the light amount of the reflected light is measured while scanning the incident angle of the excitation light on the reflecting surface, and the resonance angle at which the light amount is minimized is specified from the relationship between the incident angle and the light amount.
  • the relationship between the incident angle and the amount of light is measured after the sample contacts the antigen capturing body, and the resonance angle is accurate regardless of the antigen concentration in the sample. Specified.
  • the relationship between the incident angle and the amount of light is measured before the fluorescently labeled antibody-containing material contacts the antigen-capturing body, and the fluorescent dye is less likely to fade due to excitation light.
  • the difference between the resonance angle and the incident angle at which the electric field enhancement is maximized is reduced, and the sensitivity and accuracy of antigen detection are improved.
  • the measurement result of the amount of autofluorescence is reduced, the influence of autofluorescence is suppressed, and the sensitivity and accuracy of antigen detection are improved.
  • the optical path length of the excitation light in the measurement region is constant, the influence of the amount of autofluorescence is constant, and the sensitivity and accuracy of antigen detection are improved.
  • the measurement result of dark noise is reduced, the influence of dark noise is suppressed, and the sensitivity and accuracy of antigen detection are improved.
  • the decrease of the P wave component due to the birefringence of the dielectric medium is eliminated, and the sensitivity and accuracy of antigen detection are improved.
  • surface plasmon excitation fluorescence is mainly guided to the light quantity sensor, and the sensitivity and accuracy of antigen detection are improved.
  • This desirable embodiment relates to a surface plasmon excitation fluorescence measuring apparatus and a surface plasmon excitation fluorescence measurement method for detecting an antigen by surface plasmon excitation fluorescence spectroscopy.
  • the antigen is captured by the antigen capturing body of the analysis chip, and the fluorescently labeled antibody is bound to the antigen captured by the antigen capturing body.
  • the amount of surface plasmon excitation fluorescence emitted from the fluorescent label when the excitation light enters the analysis chip is measured.
  • the resonance angle ⁇ r is measured after the antigen is captured by the antigen capturing body and before the fluorescently labeled antibody is bound to the antigen. Since the resonance angle ⁇ r is measured after the antigen is captured by the antigen capturing body, the resonance angle ⁇ r is accurately specified regardless of the disturbance factor of the resonance angle ⁇ r such as the antigen concentration. Since the resonance angle ⁇ r is measured before the fluorescently labeled antibody is bound to the antigen, the fluorescent dye is not easily faded by excitation light. These improve the accuracy and sensitivity of antigen detection.
  • FIG. 1 shows a preferred embodiment of a surface plasmon excitation fluorescence measurement apparatus.
  • the excitation light 9000 emitted from the laser diode unit 1002 is guided to the analysis chip 1006 by the excitation light optical system 1004. While the excitation light 9000 is incident on the analysis chip 1006, the measurement light 9002 and the reflected light 9004 are emitted from the analysis chip 1006.
  • the measurement light 9002 is guided to the photomultiplier tube 1010 by the measurement light optical system 1008.
  • the reflected light 9004 is absorbed by the light absorber 1012.
  • the sample liquid 9006 and the fluorescent labeling liquid 9008 are sequentially injected into the analysis chip 1006 by the liquid feeding mechanism 1014.
  • the analysis chip 1006 is arranged in the measurement chamber 1016 and is held in the analysis chip holding mechanism 1018 when measurement is performed.
  • the analysis chip 1006 is placed in the pretreatment chamber 1020 when the sample solution 9006 or the fluorescent labeling solution 9008 is injected.
  • the analysis chip 1006 is loaded from the pretreatment chamber 1020 to the measurement chamber 1016 and unloaded from the measurement chamber 1016 to the pretreatment chamber 1020 by the analysis chip transport mechanism 1022.
  • the analysis chip 1006 is desirably attached to and detached from the surface plasmon excitation fluorescence measurement apparatus 1000 and is replaced for each specimen 9020. However, the analysis chip 1006 may be reused.
  • the incident angle adjustment mechanism 1034 scans the incident angle ⁇ of the excitation light 9000, and the measurement light 9002 is scanned. Is measured by the photomultiplier tube 1010, and the resonance angle ⁇ r is specified.
  • the fluorescent labeling liquid 9008 is injected into the analysis chip 1006 and the incident angle ⁇ is set to the measurement angle ⁇ m, the light quantity of the measurement light 9002 is measured by the photomultiplier tube 1010. The measurement result is displayed on the display 1024.
  • the components of the surface plasmon excitation fluorescence measuring apparatus 1000 are controlled by the control calculation unit 1026, and the control calculation unit 1026 performs calculation.
  • Control calculation part The block diagram of FIG. 2 shows the control calculation unit 1026.
  • control operation block groups are embedded computers that execute software.
  • One embedded computer may be responsible for the functions of these control arithmetic block groups, or two or more embedded computers may be responsible for the functions of these control arithmetic block groups.
  • Hardware without software may be responsible for all or part of the functions of these control operation block groups.
  • the hardware may be an electronic circuit or a mechanical mechanism such as a link mechanism.
  • FIG. 3 The schematic diagram of FIG. 3 shows a cross section of the analysis chip.
  • the first main surface 1202 of the conductor film 1200 is in close contact with the reflecting surface 1206 of the prism 1204, and the second main surface 1210 of the conductor film 1200 is the reflecting surface 1206. It does not adhere to.
  • the antigen-capturing body 1208 is fixed to the second main surface 1210, and the joint surface 1214 of the flow path forming body 1212 is joined.
  • the excitation light 9000 guided to the prism 1204 is incident on the incident surface 1216, and the excitation light 9000 incident on the incident surface 1216 is totally reflected by the reflection surface 1206 in the irradiation region 1800, and the reflected light 9004 is emitted from the emission surface 1218.
  • the analysis chip 1006 is desirably a structure having a length of several millimeters to several centimeters for each piece, but is replaced with a smaller structure or a larger structure not included in the category of “chip”. May be.
  • the prism 1204 is a trapezoidal column.
  • One inclined side surface of the trapezoidal column is an incident surface 1216
  • the wide parallel side surface of the trapezoidal column is a reflecting surface 1206, and the other inclined side surface of the trapezoidal column is an output surface 1218.
  • the prism 1204 is preferably an isosceles trapezoidal column. Thereby, the incident surface 1216 and the exit surface 1218 are symmetric, and the S wave component of the reflected light 9004 is less likely to stay inside the prism 1204.
  • the prism 1204 may be other than the trapezoidal column, and the prism 1204 may be replaced with a shape not included in the category of “prism”.
  • the prism 1204 is a dielectric medium made of a material transparent to the excitation light 9000.
  • the prism 1204 is made of glass, resin, or the like.
  • the prism 1204 is preferably made of a resin having a refractive index of 1.4 to 1.6 and a small birefringence.
  • the conductor film 1200 is made of a conductor that generates surface plasmon resonance.
  • the conductor film 1200 is preferably made of gold.
  • the conductor film 1200 may be made of a metal such as silver, copper, or aluminum, or an alloy containing these metals.
  • the conductor film 1200 is a thin film.
  • the film thickness of the conductor film 1200 is desirably 30 to 70 nm. However, the film thickness of the conductor film 1200 may be outside this range.
  • the conductor film 1200 is formed by sputtering, vapor deposition, plating, or the like. However, the conductor film 1200 may be formed by other methods.
  • the antigen capturing body 1208 is made of a non-fluid body. Therefore, even when the sample liquid 9006 or the fluorescent labeling liquid 9008 comes into contact with the antigen capturing body 1208, the antigen capturing body 1208 does not move.
  • the antigen capturing body 1208 includes an antibody that binds to the antigen to be detected.
  • the antibody is evenly distributed.
  • the antigen to be detected contained in the sample liquid 9006 binds to the antibody contained in the antigen capturing body 1208 and is detected in the sample liquid 9006.
  • the antigen of interest is captured by the antigen capturing body 1208.
  • a flow path 1220 is formed in the flow path forming body 1212.
  • a reaction chamber 1222 is in the middle of the flow path 1220.
  • the reaction chamber 1222 is exposed at the joint surface 1214.
  • the planar position of the reaction chamber 1222 and the planar position of the antigen capturing body 1208 are matched, and the antigen capturing body 1208 is exposed to the reaction chamber 1222.
  • the sample liquid 9006 or the fluorescent labeling liquid 9008 is injected into the channel 1220, the reaction chamber 1222 is filled with the sample liquid 9006 or the fluorescent labeling liquid 9008, respectively, and the sample liquid 9006 or the fluorescent labeling liquid 9008 is the antigen capturing body 1208.
  • the flow path 1220 is exposed to the non-bonding surface 1224 of the flow path forming body 1212, and the inlet 1226 for the sample liquid 9006 and the fluorescent labeling liquid 9008 is formed on the non-bonding surface 1224.
  • the joining surface 1214 and the second main surface 1210 are joined by adhesion, laser welding, ultrasonic welding, clamp pressure bonding, or the like. However, the bonding surface 1214 and the second main surface 1210 may be bonded by other methods.
  • the flow path forming body 1212 is made of a material transparent to scattered light and surface plasmon excitation fluorescence.
  • the flow path forming body 1212 is made of, for example, resin.
  • the flow path forming body 1212 prevents the sample liquid 9006 or the fluorescent labeling liquid 9008 from scattering and contributes to making the amount of the sample liquid 9006 or the fluorescent labeling liquid 9008 in contact with the antigen capturing body 1208 constant. However, the flow path forming body 1212 may be omitted, and the sample liquid 9006 or the fluorescent labeling liquid 9008 may be dropped directly on the antigen capturing body 1208.
  • the schematic diagram of FIG. 4 shows a laser diode unit.
  • a beam 9010 emitted from the laser diode 1300 is split into a main beam 9012 and a sub beam 9014 by a beam splitter 1302.
  • the main beam 9012 is collimated by a collimator 1304 and emitted as excitation light 9000 from the laser diode unit 1002.
  • the laser diode 1300 is moved by the laser diode holding mechanism 1306 in such a posture that an elliptical short axis is included in a plane perpendicular to the reflection surface 1206 including the optical path of the excitation light 9000. Retained.
  • the laser diode 1300 is desirably controlled by the temperature adjustment circuit 1308.
  • the temperature adjustment circuit 13008 the light amount of the sub beam 9014 is measured by the photodiode 1310, and the power supplied to the laser diode 1300 is maintained so that the measurement result of the light amount of the sub beam 9014 is kept constant. Is controlled by regression. Thereby, the temperature of the laser diode 1300 is kept constant, and the wavelength and light amount of the excitation light 9000 are kept constant.
  • the photodiode 1310 may be replaced with another light quantity sensor such as a phototransistor or a photoresistor. Since the wavelength of the excitation light 9000 affects the resonance angle ⁇ r and the amount of evanescent wave oozing, the temperature adjustment circuit 1308 contributes to the improvement in the accuracy and sensitivity of antigen detection.
  • the polarization direction of the excitation light 9000 emitted from the laser diode 1300 is generally unevenly distributed in a specific direction.
  • the laser diode 1300 may be replaced with another light source such as a light emitting diode, a mercury lamp, or a laser other than the laser diode.
  • a light emitting diode such as a mercury lamp, or a laser other than the laser diode.
  • the light emitted from the light source is not a beam
  • the light is converted into a beam by a lens, a mirror, a slit, or the like.
  • the light emitted from the light source is not monochromatic light
  • the light is converted into monochromatic light by a diffraction grating or the like.
  • the light emitted from the light source is not linearly polarized light
  • the light is converted into linearly polarized light by a polarizer or the like.
  • Excitation light optical system As shown in FIG. 1, while the excitation light 9000 is guided from the laser diode unit 1002 to the analysis chip 1006 by the excitation light optical system 1004, the first wave rectifier 1028, the polarization direction adjustment mechanism 1030, and the shaping optical system 1032. And the incident angle adjusting mechanism 1034 sequentially. When the excitation light 9000 passes through the first wave shaper 1028, the excitation light 9000 is tuned. The polarization direction of the excitation light 9000 is adjusted so that the P wave component is mainly incident on the reflection surface 1206 when the excitation light 9000 passes through the polarization direction adjusting mechanism 1030.
  • the cross-sectional shape of the beam of the excitation light 9000 is shaped by a slit, a zoom optical system, or the like.
  • the incident angle adjustment mechanism 1034 the incident angle ⁇ of the excitation light 9000 on the reflection surface 1206 is adjusted.
  • the excitation light 9000 sequentially passes through the first bandpass filter 1400, the linear polarization filter 1402, and the neutral density filter 1404 when passing through the first wave shaper 1028.
  • the first wave adjuster 1028 may include other optical filters.
  • the first wave adjuster 1028 may include an optical element other than the optical filter.
  • the wavelength distribution of the excitation light 9000 is narrowed. Thereby, even if the wavelength distribution of the excitation light 9000 emitted from the laser diode unit 1002 is wide, the excitation light 9000 having a narrow wavelength distribution can be obtained.
  • the first bandpass filter 1400 may be omitted.
  • the linear polarization filter 1402 When the excitation light 9000 passes through the linear polarization filter 1402, the distribution of the polarization direction of the excitation light 9000 is narrowed. Thereby, even if the distribution of the polarization direction of the excitation light 9000 emitted from the laser diode unit 1002 is wide, the excitation light 9000 having a narrow distribution of the polarization direction can be obtained. When the distribution of the polarization direction of the excitation light 9000 emitted from the laser diode unit 1002 is sufficiently narrow, the linear polarization filter 1402 may be omitted.
  • the neutral density filter 1404 When the excitation light 9000 passes through the neutral density filter 1404, the light amount of the excitation light 9000 is decreased. If the amount of excitation light 9000 emitted from the laser diode unit 1002 is appropriate, the neutral density filter 1404 may be omitted.
  • FIG. 6 shows a polarization direction adjusting mechanism.
  • the half-wave plate 1500 is rotated by the half-wave plate rotation mechanism 1502 around the rotation axis perpendicular to the half-wave plate 1500.
  • Half-wave plate rotating mechanism 1502 rotates half-wave plate 1500 by a rotary stepping motor or the like.
  • the polarization direction of the excitation light 9000 that passes through the half-wave plate 1500 is adjusted by the rotation angle of the half-wave plate 1500.
  • the polarization direction of the excitation light 9000 can be adjusted between the polarization direction in which the oozing of the evanescent wave from the reflecting surface 1206 is maximized and the polarization direction in which the oozing of the evanescent wave from the reflecting surface 1206 is eliminated.
  • the rotation angle of the half-wave plate 1500 is set to the rotation angle at which the P-wave component is expected to be incident on the reflecting surface 1206.
  • the polarization direction adjusting mechanism 1030 may be replaced with a mechanism that rotates the laser diode unit 1002 or the laser diode 1300 around the optical axis.
  • the half-wave plate rotation mechanism 1502 may be omitted and the half-wave plate 1500 may be fixed.
  • the optimization of the polarization direction described later is omitted and the laser diode unit 1002 or the laser diode 1300 is held in a posture where the P-wave component is mainly incident on the reflection surface 1206, the half-wave plate 1500 and the half-wave plate rotation
  • the mechanism 1502 may be omitted.
  • FIG. 7 shows an incident angle adjustment mechanism.
  • the excitation light 9000 is reflected by the reflecting mirror 1600 when passing through the incident angle adjustment mechanism 1034, and the traveling direction of the excitation light 9000 is the second direction from the first direction 9016 toward the analysis chip 1006. Bent in direction 9018.
  • the position of the reflecting mirror is set so as to cancel the movement of the irradiation position X due to the change of the incident angle ⁇ while the reflecting mirror angle is adjusted by the reflecting mirror angle adjusting mechanism 1602.
  • the reflecting mirror position is adjusted by the adjusting mechanism 1604. Thereby, only incident angle (theta) is adjusted and the irradiation position X of the excitation light 9000 in the reflective surface 1206 is maintained.
  • the irradiation position X is adjusted by the incident angle adjustment mechanism 1034, the reflector angle is fixed, and the reflector position is adjusted by the reflector position adjustment mechanism 1604. Thereby, only the irradiation position X is adjusted and the incident angle ⁇ is maintained.
  • the incident angle adjustment mechanism 1034 When the incident angle adjustment mechanism 1034 is in a blocking state where the excitation light 9000 is not guided to the incident surface 1216, the reflection mirror angle is adjusted by the reflection mirror angle adjustment mechanism 1602, and the excitation light 9000 is applied to the light absorption surface of the reflection mirror 1600. Is applied.
  • the incident angle adjustment mechanism 1034 When the incident angle adjustment mechanism 1034 is in a non-blocking state where the excitation light 9000 is guided to the incident surface 1216, the reflection mirror angle is adjusted by the reflection mirror angle adjustment mechanism 1602, and the excitation light 9000 strikes the mirror surface of the reflection mirror 1600. It is done.
  • the blocking state and the non-blocking state may be switched by a mechanism other than the reflector angle adjustment mechanism 1602. For example, a light absorber may be inserted into and removed from the optical path of the excitation light 9000.
  • the reflector angle adjustment mechanism 1602 adjusts the reflector angle by rotating the reflector 1600 around a rotation axis parallel to the mirror surface by a rotary stepping motor or the like.
  • the reflecting mirror position adjusting mechanism 1604 moves the reflecting mirror 1600 together with the reflecting mirror angle adjusting mechanism 1602 along the first direction 9016 by a linear stepping motor or the like on the linear stage or the like to adjust the reflecting mirror position.
  • the incident angle adjusting mechanism 1034 has an advantage that the incident angle ⁇ and the irradiation position X can be adjusted by a simple mechanism. However, the incident angle ⁇ and the irradiation position X may be adjusted by a mechanism that adjusts the position and posture of the laser diode unit 1002. Alternatively, the incident angle ⁇ and the irradiation position X may be adjusted by a mechanism that adjusts the position and posture of the analysis chip 1006.
  • the schematic diagram of FIG. 8 shows a measurement light optical system.
  • the measurement light 9002 emitted to the side on which the second main surface 1210 faces is guided to the photomultiplier tube 1010 by the measurement light optical system 1008.
  • the measurement light 9002 is collected by the condenser lens 1700, converted into parallel light, passes through the second wave multiplier 1702, and is connected to the photomultiplier tube 1010 by the imaging lens 1704. Imaged.
  • the condensing lens 1700 and the imaging lens 1704 constitute a conjugate optical system. Thereby, the influence of stray light is suppressed.
  • the second band pass filter 1706 is inserted into and removed from the optical path of the measuring light 9002 by the insertion / extraction mechanism 1708.
  • a second bandpass filter 1706 is inserted into the optical path of the measurement light 9002, and light having the same wavelength as the excitation light 9000 is selectively transmitted by the second bandpass filter 1706. Attenuated. Thereby, the scattered light is attenuated, and mainly the surface plasmon excitation fluorescence is guided to the photomultiplier tube 1010, and the sensitivity and accuracy of antigen detection are improved.
  • the second band pass filter 1706 is removed from the optical path of the measurement light 9002.
  • the neutral density filter may be inserted into and removed from the optical path of the measurement light 9002 by an insertion / extraction mechanism.
  • the neutral density filter is removed from the optical path of the measurement light 9002.
  • a neutral density filter is inserted into the optical path of the measurement light 9002.
  • the amount of surface plasmon excitation fluorescence may be measured by a relatively high sensitivity photomultiplier tube 1010, and the amount of scattered light may be measured by a relatively low sensitivity photodiode, phototransistor, photoresistor, or the like.
  • the amount of measurement light 9002 is measured by a photomultiplier tube 1010.
  • the photomultiplier tube 1010 has the advantage of good sensitivity and good signal to noise ratio.
  • the photomultiplier tube 1010 may be replaced with another light quantity sensor such as a cooled charge coupled device (CCD) camera.
  • CCD charge coupled device
  • the analysis chip 1006 and the reagent chip 1036 are arranged in the pretreatment chamber 1020.
  • the sample liquid 9006 is sucked from the dilution container 1042 of the reagent chip 1036 by the liquid feed pump 1040, the liquid feed pump 1040 is transported by the liquid feed pump transport mechanism 1044, and the sample liquid 9006 is transferred to the inlet 1226 by the liquid feed pump 1040. Discharged.
  • the analysis chip 1006 and the reagent chip 1036 are also arranged in the pretreatment chamber 1020 when the fluorescent labeling solution 9008 is injected into the flow path 1220 by the liquid feeding mechanism 1014. Further, the fluorescent labeling liquid 9008 is sucked from the fluorescent labeling liquid container 1046 of the reagent chip 1036 by the liquid feeding pump 1040, the liquid feeding pump 1040 is conveyed by the liquid feeding pump conveying mechanism 1044, and the fluorescence is supplied to the injection port 1226 by the liquid feeding pump 1040. The labeling liquid 9008 is discharged.
  • the pretreatment chamber 1020 In order to inject the sample solution 9006 or the fluorescent labeling solution 9008 into the analysis chip 1006 after the analysis chip 1006 is retracted to the pretreatment chamber 1020, components that obstruct optical measurement are excluded from the measurement chamber 1016. Contributes to controlling pollution. However, the retreat to the pretreatment chamber 1020 may be omitted.
  • the reagent chip 1036 is placed in the pretreatment chamber 1020.
  • the liquid feeding mechanism 1014 the specimen 9020 is fed from the specimen container 1048 to the dilution container 1042, and the dilution liquid 9022 is sent from the dilution liquid container 1050 to the dilution container 1042, whereby the sample liquid 9006 is prepared.
  • the liquid feed pump 1040 is cleaned with the cleaning liquid 9024 accommodated in the cleaning liquid container 1052 as necessary.
  • the sample 9020 may be directly used as the sample solution 9006 without being diluted.
  • other pretreatments such as blood cell separation and reagent mixing may be performed.
  • the specimen 9020 is typically a collected material from a human such as blood, but may be a collected material from a non-human organism or a non-living material.
  • the fluorescent labeling solution 9008 contains a fluorescently labeled antibody that is fluorescently labeled by binding to the antigen to be detected.
  • the injection injected into the flow path 1220 is typically a liquid, but may be a gas or a solid having fluidity.
  • a mechanism for feeding the sample liquid 9006 and the fluorescent labeling liquid 9008 by a tube may be provided.
  • the schematic diagram of FIG. 9 is a plan view showing a desirable relationship among the irradiation area, the measurement area, and the reaction area on the reflecting surface.
  • the irradiation region 1800 is a region where the excitation light 9000 is irradiated.
  • the measurement region 1802 is a region where the light amount of the measurement light 9002 is measured by the photomultiplier tube 1010.
  • the reaction region 1804 is a region where an antigen capturing body 1208 is provided and an antibody contained in the antigen capturing body 1208 is bound to an antigen.
  • the planar shapes of the irradiation region 1800 and the measurement region 1802 are preferably circular.
  • the irradiation area 1800 and the measurement area 1802 overlap at least.
  • the irradiation region 1800 is included in the measurement region 1802, and more desirably, the irradiation region 1800 is disposed in the center of the measurement region 1802. Accordingly, even if the irradiation position is shifted due to the variation of the prism 1204 or the like, the irradiation region 1800 does not easily deviate from the measurement region 1802, and the light amount of the measurement light 9002 is maintained.
  • the measurement region 1802 and the reaction region 1804 overlap at least, preferably the measurement region 1802 is included in the reaction region 1804, and more preferably, the measurement region 1802 is disposed at the center of the reaction region 1804.
  • FIG. 10 shows an outline of the procedure for detecting an antigen.
  • the measurement is prepared (step S101), the antibody and the antigen are reacted (step S102), and the load control unit 1100 loads the analysis chip 1006 on the analysis chip transport mechanism 1022 (step S103). .
  • the excitation light 9000 is irradiated on the prism 1204 of the loaded analysis chip 1006.
  • the incident angle ⁇ is set to the measurement angle ⁇ m (step S104), preferably the processing to be performed is performed (steps S105 to S107), and the unload control unit 1102
  • the analysis chip transport mechanism 1022 unloads the analysis chip 1006 (step S108), and the antigen and the fluorescently labeled antibody are reacted (step S109).
  • the irradiation position is optimized (step S105) after the incident angle ⁇ is set to the measurement angle ⁇ m (after step S104) and before the analysis chip 1006 is unloaded (before step S108). ), The amount of autofluorescence is measured (step S106), and the polarization direction of the excitation light 9000 is optimized (step S107). All or part of the optimization of the irradiation position (step S105), the measurement of the amount of autofluorescence light (step S106), and the optimization of the polarization direction of the excitation light 9000 (step S107) may be omitted.
  • the reload control unit 1104 reloads the analysis chip 1006 to the analysis chip transport mechanism 1022 (step S110), and the amount of surface plasmon excitation fluorescence light Is measured (step S111), the measurement result is stored and displayed together with the sample number and the like (step S112), and the surface plasmon excitation fluorescence measuring apparatus 1000 is initialized (step S113).
  • a movable object such as a reflecting mirror is returned to the initial position. The light quantity of surface plasmon excitation fluorescence is converted into the absolute amount, concentration, etc. of an antigen as needed.
  • an analysis chip 1006 is prepared (step S1011), and the analysis chip 1006 is placed in the pretreatment chamber 1020 (step S1012).
  • a reagent chip 1036 is prepared (step S1013), the reagent chip 1036 is arranged in the pretreatment chamber 1020 (step S1014), and the pretreatment control unit 1104 causes the liquid delivery mechanism 1014 to pretreat the reagent chip 1036 ( Step S1015).
  • the sample liquid 9006 is prepared and the preparation of the sample liquid 9006 is completed.
  • the preparation of the fluorescent labeling liquid 9008 is completed.
  • the preparation and arrangement (steps S1011 and S1012) of the analysis chip 1006 may be performed after the preparation, arrangement and pretreatment of the reagent chip 1036 (steps S1013, S1014 and S1015). You may perform in parallel with a process (step S1013, S1014, and S1015).
  • the first reaction control unit 1106 causes the liquid feeding mechanism 1014 to inject the sample liquid 9006 into the flow path 1220.
  • the sample liquid 9006 When the sample liquid 9006 is injected into the flow path 1220, the sample liquid 9006 comes into contact with the antigen capturing body 1208, the antigen contained in the sample liquid 9006 is bound to the antibody contained in the antigen capturing body 1208, and the sample liquid 9006 The contained antigen is captured by the antigen capturing body 1208.
  • the flowchart of FIG. 12 shows the procedure for setting the incident angle ⁇ to the measurement angle ⁇ m (step S104).
  • the filter removal control unit 1108 causes the insertion / extraction mechanism 1708 to remove the second bandpass filter 1706 from the optical path of the measurement light 9002 (step S1041). Thereby, the scattered light is not shielded, and the amount of the scattered light can be measured by the photomultiplier tube 1010.
  • the incident angle scanning control unit 1110 acquires the measurement result of the light amount I from the photomultiplier tube 1010 while causing the incident angle adjusting mechanism 1034 to scan the incident angle ⁇ ( Step S1042).
  • the amount of scattered light Is is measured during scanning at the incident angle ⁇ , and the relationship Is ( ⁇ ) between the incident angle ⁇ and the amount of scattered light Is is obtained.
  • the incident angle determination unit 1112 specifies the resonance angle ⁇ r, which is the incident angle ⁇ at which the light amount Is is maximized, from the relationship Is ( ⁇ ), and the measurement is performed from the resonance angle ⁇ r.
  • the measurement angle ⁇ m which is the incident angle ⁇ , is determined (step S1043). Since the deviation between the resonance angle ⁇ r at which the amount of scattered light Is is maximal and the incident angle ⁇ max at which the electric field enhancement is maximal is small, the injection of the fluorescent labeling liquid 9008 has little effect on the resonance angle ⁇ r. Even if the resonance angle ⁇ r determined before the injection of 9008 is set to the measurement angle ⁇ m as it is, the electric field is sufficiently enhanced.
  • the resonance angle ⁇ r may be corrected to the measurement angle ⁇ m.
  • a light amount sensor that measures the amount of surface plasmon excitation fluorescence is used, unlike the case where the resonance angle ⁇ r that minimizes the amount of reflected light Ir is obtained. It becomes possible, and the structure of the surface plasmon excitation fluorescence measuring apparatus 1000 is simplified.
  • the incident angle setting unit 1114 causes the incident angle adjustment mechanism 1034 to set the incident angle ⁇ to the measurement angle ⁇ m (step S1044).
  • the resonance angle ⁇ r is accurately specified regardless of the antigen concentration or the like of the sample liquid 9006. Further, when the relationship Is ( ⁇ ) is obtained before the fluorescent labeling liquid 9008 is injected into the flow path 1220, the fluorescent dye is not easily faded by the excitation light 9000. These improve the sensitivity and accuracy of antigen detection.
  • the measurement angle ⁇ m is required before the fluorescent labeling liquid 9008 is injected into the flow path 1220. Is determined (step S1043) and the incident angle ⁇ is not necessarily set to the measurement angle ⁇ m (step S1044). Therefore, the measurement angle ⁇ m may be determined after the fluorescent labeling liquid 9008 is injected into the flow path 1220 (step S1043), and the incident angle ⁇ may be set to the measurement angle ⁇ m (step S1044).
  • the resonance angle ⁇ r is generally determined by the material and shape of the prism 1204, the refractive index of the injection material into the flow path 1220, and the like. However, the resonance angle ⁇ r slightly changes depending on the type and amount of molecules captured by the antigen capturing body 1208, variation of the prism 1204, and the like. For this reason, in the scan of the incident angle ⁇ , a range of approximately 10 ° or less including the expected resonance angle ⁇ r, which is a range where the total reflection condition is satisfied, is preferentially scanned.
  • the flowchart of FIG. 13 shows the procedure of optimization of an irradiation position (step S105).
  • the irradiation position scanning unit 1116 acquires the measurement result of the light amount I from the photomultiplier tube 1010 while causing the reflecting mirror position adjusting mechanism 1604 to scan the reflecting mirror position (step S1051). While the reflecting mirror position is scanned, the excitation light 9000 moves in parallel while the incident angle ⁇ is maintained at the measurement angle ⁇ m, and the irradiation position 1300 is scanned along a straight line. Thereby, the light amount Is of the scattered light is measured during the scanning of the irradiation position X, and the relationship Is (X) between the irradiation position X and the light amount Is of the scattered light is obtained.
  • the graph of FIG. 14 shows the relationship Is (X) between the irradiation position X and the amount of scattered light Is.
  • the light quantity Is is substantially constant. However, outside the section R, the irradiation area 1800 deviates from the measurement area 1802, and the light amount Is decreases as the irradiation position X moves away from the section R.
  • the irradiation position determination unit 1118 identifies the irradiation positions X1 and X2 where the light amount Is decreases from the maximum value by the same value ⁇ Is from the relationship Is (X), and the irradiation positions X1 and X2 The middle is determined as the measurement position Xm, which is the irradiation position X at which the measurement is performed (step S1052).
  • the relationship Is (X) is measured after the measurement angle ⁇ is set to the measurement angle ⁇ m.
  • the irradiation position X is optimized at the same incident angle ⁇ as when the amount of surface plasmon excitation fluorescence is measured, and the irradiation position X is appropriately optimized.
  • the irradiation position setting unit 1120 causes the reflecting mirror position adjusting mechanism 1604 to set the reflecting mirror position to the reflecting mirror position where the irradiation position X becomes the measurement position Xm (step S1053).
  • the optical path length of the excitation light 9000 in the measurement region 1802 greatly affects the amount of autofluorescence, and when the irradiation position X changes, the amount of autofluorescence also changes.
  • the amount of autofluorescence is small compared to the amount of excitation light 9000, but cannot be ignored compared to the amount of surface plasmon excitation fluorescence.
  • measurement of the amount of surface plasmon excitation fluorescence only affects autofluorescence emitted from the vicinity of the reflecting surface 1206.
  • the irradiation region 1800 is arranged at the center of the measurement region 1802 by the optimization of the irradiation position X (step S105)
  • the optical path length of the excitation light 9000 in the measurement region 1802 is constant, and the influence of the amount of autofluorescence is constant.
  • the sensitivity and accuracy of antigen detection are improved.
  • the irradiation position X is optimized (step S105) before the measurement of the amount of autofluorescence (before step S106). Thereby, the accuracy of measurement of the amount of autofluorescence is improved.
  • the autofluorescence measurement unit 1122 acquires the measurement result of the amount of light I from the photomultiplier tube 1010. As a result, the amount of autofluorescence Iaf is measured. The measurement result is stored in the autofluorescence measuring unit 1122 until the autofluorescence correction described later is completed.
  • the flowchart of FIG. 15 shows the procedure for optimizing the polarization direction of the excitation light (step S107).
  • the polarization direction scanning unit 1124 acquires the measurement result of the light quantity I from the photomultiplier tube 1010 while causing the polarization direction adjustment mechanism 1030 to scan the polarization direction ⁇ (step S1071). As a result, the amount of scattered light Is is measured during scanning in the polarization direction ⁇ , and the relationship Is ( ⁇ ) between the polarization direction ⁇ of the excitation light 9000 and the amount of scattered light Is is obtained.
  • the relationship Is ( ⁇ ) is measured after the measurement angle ⁇ is set to the measurement angle ⁇ m.
  • the polarization direction ⁇ is optimized at the same incident angle ⁇ as when the amount of surface plasmon excitation fluorescence is measured, and the polarization direction ⁇ is appropriately optimized.
  • the relationship Is ( ⁇ ) is measured after the irradiation position X is optimized (after step S105).
  • the polarization direction is optimized at the same irradiation position X as when the amount of surface plasmon excitation fluorescence is measured, and the polarization direction ⁇ is appropriately optimized.
  • the polarization direction determination unit 1126 specifies the polarization direction ⁇ from which the light amount Is is maximized from the relationship Is ( ⁇ ), and sets the measurement polarization direction ⁇ m that is the polarization direction ⁇ in which the measurement is performed. Determination is made (step S1072).
  • the polarization direction setting unit 1128 causes the polarization direction adjustment mechanism 1030 to set the polarization direction ⁇ to the measurement polarization direction ⁇ m (step S1073).
  • Birefringence that cannot be ignored occurs when light travels through a medium made of resin. This birefringence is caused by a change in the density of the medium depending on the position. Since the change in the density of the medium depending on the position occurs when the resin is molded, the strength of birefringence differs for each prism 1204. Therefore, depending on the prism 1204, even if only the P wave component contributing to the exudation of the evanescent wave is caused to enter the reflecting surface 1206, the S wave component is generated and the P wave component is reduced, and the sensitivity of detecting the antigen is increased. And the accuracy decreases.
  • step S107 By optimizing the polarization direction of the excitation light (step S107), the decrease of the P wave component due to the variation of the prism 1204 is eliminated, and the sensitivity and accuracy of antigen detection are improved.
  • the second reaction control unit 1130 causes the liquid feeding mechanism 1014 to inject the fluorescently labeled liquid 9008 into the flow path 1220.
  • the fluorescent labeling liquid 9008 comes into contact with the antigen capturing body 1208, and the fluorescently labeled antibody contained in the fluorescent labeling liquid 9008 binds to the antigen.
  • the flowchart of FIG. 16 shows the procedure for measuring the amount of surface plasmon excitation fluorescence (step S111).
  • the filter insertion control unit 1132 causes the insertion / extraction mechanism 1708 to insert the second band pass filter 1706 into the optical path of the measuring light 9002 (step S1111). Thereby, the scattered light reaching the photomultiplier tube 1010 is reduced, and the sensitivity and accuracy of antigen detection are improved.
  • the blocking control unit 1134 causes the reflector angle adjusting mechanism 1602 to temporarily block the excitation light 9000 (step S1112).
  • the dark noise measurement unit 1136 acquires the measurement result of the light amount I from the photomultiplier tube 1010 (step S1113). Thereby, the dark noise amount In is measured.
  • the blocking of the excitation light (step S1112) and the measurement of the amount of dark noise (step S1113) are performed by resetting the incident angle ⁇ to the measurement angle ⁇ m (step S1114) and measuring the light amount If of the surface plasmon excitation fluorescence.
  • it is performed immediately before (Step S1115), it may be performed at other times as long as it is before dark noise correction (Step S1117).
  • the incident angle resetting unit 1136 causes the reflector angle adjustment mechanism 1602 to reset the incident angle ⁇ to the measurement angle ⁇ m (step S1114).
  • the fluorescence measurement unit 1138 acquires the measurement result of the light amount I from the photomultiplier tube 1010 (step S1115). Thereby, the light amount If of the surface plasmon excitation fluorescence at the measurement angle ⁇ m is measured.
  • the autofluorescence correction unit 1104 After the surface plasmon excitation fluorescence light amount If is measured, the autofluorescence correction unit 1104 performs correction to subtract the autofluorescence light amount Iaf from the surface plasmon excitation fluorescence light amount If (step S1116), and the dark noise correction unit 1142 Correction for subtracting the dark noise amount In from the light amount If of the plasmon excitation fluorescence is performed (step S1117). This improves the sensitivity and accuracy of antigen detection. Autofluorescence correction (step S1116) and dark noise correction (step S1117) may be performed simultaneously, and autofluorescence correction (step S1116) may be performed after dark noise correction (step S1117).
  • the procedure executed by the surface plasmon excitation fluorescence measurement apparatus 1000 may be executed manually, or the procedure executed manually may be executed by the surface plasmon excitation fluorescence measurement apparatus 1000.
  • a resonance angle ⁇ r at which the light amount Is of the scattered light is maximized may be used.
  • a resonance angle ⁇ r at which the light amount Ir of the reflected light 9004 is minimized may be used.
  • a reflected light amount sensor 1902 that measures the amount of reflected light 9004 is added to the surface plasmon excitation fluorescence measuring apparatus 1000 as shown in FIG.
  • the incident angle scanning control unit 1110 acquires the measurement result of the light amount I from the reflected light amount sensor 1902 while causing the incident angle adjustment mechanism 1034 to scan the incident angle ⁇ .
  • the incident angle determination unit 1112 specifies the resonance angle ⁇ r, which is the incident angle ⁇ at which the light amount Ir is minimized, from the relationship Ir ( ⁇ ), and determines the measurement angle ⁇ m from the resonance angle ⁇ r. Since there is a difference between the resonance angle ⁇ r at which the amount Ir of reflected light is minimized and the incident angle ⁇ max at which the electric field enhancement is maximized, it is desirable that correction is performed to increase or decrease the minute angle to the resonance angle ⁇ r. ⁇ m is determined.

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Abstract

　抗原の検出の感度及び精度を向上する表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法を提供する。分析チップの抗原捕捉体に抗原が捕捉され、抗原捕捉体に捕捉された抗原に蛍光標識抗体が結合させられる。励起光が分析チップへ入射したときに蛍光標識から放射される表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される。抗原捕捉体に抗原が捕捉された後であって蛍光標識抗体が抗原に結合させられる前に共鳴角θｒが測定される。共鳴角θｒから測定角θｍが決定される。反射面への励起光の入射角θが共鳴角θｒに設定され、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される。

Description

表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法
　本発明は、表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法に関する。
　誘電体媒体の中を進む励起光が金属膜と誘電体媒体との界面に全反射された場合は、界面からエバネッセント波がもれだし、金属膜の中のプラズモンとエバネッセント波とが干渉する。界面への励起光の入射角が共鳴角に設定されプラズモンとエバネッセント波とが共鳴する場合にエバネッセント波の電場は著しく増強される。表面プラズモン励起蛍光分光法（ＳＰＦＳ）においては、この増強された電場が用いられる。すなわち、金属膜の表面に抗原が捕捉され、捕捉された抗原が蛍光標識され、増強された電場が蛍光標識に作用させられる。増強された電場が蛍光標識に作用した場合は、蛍光標識から蛍光が放射される。表面プラズモン励起蛍光分光法においては、蛍光標識から放射された蛍光の光量が測定される。
　特許文献１は、表面プラズモン励起蛍光分光法による抗原の検出に関する。特許文献１においては、抗原が蛍光標識された後に共鳴角が測定される。
特許第４３７０３８３号公報
　電場の増強度は励起光の入射角が共鳴角に設定された場合に著しく大きくなるので、表面プラズモン励起蛍光分光法により抗原を検出する場合には共鳴角を正確に特定することが重要である。
　しかし、従来の技術においては、抗原が捕捉される前に共鳴角が測定され、抗原濃度等による共鳴角の変化及び変化量のばらつきが無視され、共鳴角が正確に特定されていなかった。又は、特許文献１のように、抗原が蛍光標識された後に共鳴角が測定され、蛍光色素の退色の原因となっていた。これらはいずれも、表面プラズモン励起蛍光の光量が減少する原因になり、表面プラズモン励起蛍光の光量のばらつきが大きくなる原因になっている。したがって、従来の技術においては、抗原の検出の感度及び精度が十分でなかった。
　本発明は、この問題を解決するためになされる。本発明の目的は、抗原の検出の感度及び精度を向上する表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法を提供することである。
　本発明の第１から第７までの局面は、表面プラズモン励起蛍光計測装置に関する。
　（１）第１の局面においては、誘電体媒体、導電体膜及び抗原捕捉体が設けられる。誘電体媒体は、励起光に対して透明である。導電体膜の第１の主面は誘電体媒体の反射面に密着する。導電体膜の第２の主面は誘電体媒体の反射面に密着しない。抗原捕捉体は第２の主面に定着する。抗原捕捉体は抗原と結合する抗体を含む。
　光源から放射される励起光は誘電体媒体の入射面へ入射する。入射面へ入射した励起光は反射面に全反射される。反射面に全反射された励起光は出射面から出射する。
　反射面への励起光の入射角が走査されながら導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光量が測定され、入射角と光量との関係が得られる。入射角と光量との関係から光量が極大になる共鳴角が特定され、共鳴角から測定角が決定される。入射角が測定角に設定され、導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光量が測定され、第１の測定結果が取得される。
　試料が抗原捕捉体へ接触した後であって蛍光標識抗体含有物が抗原捕捉体へ接触する前に入射角と光量との関係が得られる。蛍光標識抗体含有物は蛍光標識され抗原と結合する蛍光標識抗体を含む。
　（２）第１の局面と第２の局面との違いは、共鳴角の特定にある。第２の局面においては、反射面への励起光の入射角が走査されながら反射面から出射する光の光量が測定され、入射角と光量との関係から光量が極小になる共鳴角が特定される。
　（３）第３の局面は、第１又は第２の局面にさらなる事項を付加する。第３の局面においては、蛍光標識抗体含有物が抗原捕捉体に接触させられる前であって入射角が測定角に設定された後に導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光量が測定され、第２の測定結果が取得される。また、第１の測定結果から第２の測定結果が減じられる。
　（４）第４の局面は、第３の局面にさらなる事項を付加する。第４の局面においては、励起光の照射位置が走査されながら導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光量が測定され、照射位置と光量との関係が得られる。照射位置と光量との関係から光量が極大値から同値だけ減少する第１の照射位置及び第２の照射位置が特定され、第１の照射位置及び第２の照射位置の中間が測定位置に決定される。照射位置は測定位置に設定される。
　（５）第５の局面は、第１から第４までのいずれかの局面にさらなる事項を付加する。第５の局面においては、励起光が入射面へ導かれない遮断状態において導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光量が測定され、第３の測定結果が取得される。また、第１の測定結果から第３の測定結果が減じられる。
　（６）第６の局面は、第１から第５までのいずれかの局面にさらなる事項を付加する。第６の局面においては、励起光の偏光方向が走査されながら導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光量が測定され、偏光方向と光量との関係が得られる。偏光方向と光量との関係から光量が極大になる偏光方向が特定され、測定が行われる測定偏光方向が決定される。偏光方向は測定方法に設定される。
　（７）第７の局面は、第１から第６までのいずれかの局面にさらなる事項を付加する。第７の局面においては、第１の測定結果を得るために光量が測定されている間に励起光と同じ波長の光を選択的に減衰させるバンドパスフィルタが導電体膜及び抗原捕捉体から第２の主面が向く方向へ出射する光の光路に挿入される。
　本発明の第８及び第９の局面は、表面プラズモン励起蛍光計測方法に関する。
　（８）第８の局面においては、誘電体媒体、導電体膜及び抗原捕捉体を備える構造体が準備される。誘電体媒体は、励起光に対して透明である。導電体膜の第１の主面は誘電体媒体の反射面に密着する。導電体膜の第２の主面は誘電体媒体の反射面に密着しない。抗原捕捉体は抗原と結合する抗体を含む。抗原捕捉体は第２の主面に密着定着する。
　光源から放射される励起光は誘電体媒体の入射面へ入射し反射面に全反射され出射面から出射する。
　反射面への励起光の入射角が走査されながら散乱光の光量が測定され、入射角と光量との関係が得られる。入射角と光量との関係から光量が極大になる共鳴角が特定され、共鳴角から測定角が決定される。入射角が測定角に設定され、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される。
　試料が抗原捕捉体へ接触した後であって蛍光標識抗体含有物が抗原捕捉体へ接触する前に入射角と光量との関係が得られる。蛍光標識抗体含有物は蛍光標識され抗原と結合する蛍光標識抗体を含む。
　（９）第８の局面と第９の局面との違いは、共鳴角の特定にある。第９の局面においては、反射面への励起光の入射角が走査されながら反射光の光量が測定され、入射角と光量との関係から光量が極小になる共鳴角が特定される。
　第１、第２、第８及び第９の局面によれば、試料が抗原捕捉体に接触した後に入射角と光量との関係が測定され、試料中の抗原濃度等によらず共鳴角が正確に特定される。また、蛍光標識抗体含有物が抗原捕捉体に接触する前に入射角と光量との関係が測定され、蛍光色素が励起光により退色しにくくなる。これらにより、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
　第１及び第８の局面によれば、共鳴角と電場の増強度が最大になる入射角とのずれが小さくなり、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
　本発明の第３の局面によれば、自家蛍光の光量の測定結果が減ぜられ、自家蛍光の影響が抑制され、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
　本発明の第４の局面によれば、測定領域における励起光の光路長が一定になり、自家蛍光の光量の影響が一定になり、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
　本発明の第５の局面によれば、暗ノイズの測定結果が減ぜられ、暗ノイズの影響が抑制され、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
　本発明の第６の局面によれば、誘電体媒体の複屈折によるＰ波成分の減少が解消し、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
　本発明の第７の局面によれば、主に表面プラズモン励起蛍光が光量センサへ導かれ、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
　これらの及びこれら以外の本発明の目的、特徴、局面及び利点は、添付図面とともに考慮されたときに下記の本発明の詳細な説明によってより明白となる。
表面プラズモン励起蛍光計測装置の実施形態を示す模式図である。 制御演算部のブロック図である。 分析チップの断面図である。 レーザーダイオードユニットの模式図である。 第１の整波器の模式図である。 偏光方向調整機構の模式図である。 入射角調整機構の模式図である。 測定光光学系の模式図である。 反応領域、測定領域及び照射領域の関係を示す平面図である。 抗原の検出の手順の概略のフローチャートである。 測定の準備の手順のフローチャートである。 入射角の測定角への設定の手順のフローチャートである。 照射位置の最適化の手順のフローチャートである。 照射位置と散乱光の光量との関係を示すグラフである。 励起光の偏光方向の最適化の手順のフローチャートである。 表面プラズモン励起蛍光の光量の測定の手順を示すフローチャートである。 反射光量センサが付加された状態を示す模式図である。
　（計測の概略）
　この望ましい実施形態は、表面プラズモン励起蛍光分光法により抗原を検出する表面プラズモン励起蛍光計測装置及び表面プラズモン励起蛍光計測方法に関する。
　この望ましい実施形態においては、分析チップの抗原捕捉体に抗原が捕捉され、抗原捕捉体に捕捉された抗原に蛍光標識抗体が結合させられる。励起光が分析チップへ入射したときに蛍光標識から放射される表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される。抗原捕捉体に抗原が捕捉された後であって蛍光標識抗体が抗原に結合させられる前に共鳴角θｒが測定される。抗原捕捉体に抗原が捕捉された後に共鳴角θｒが測定されるので、抗原濃度等の共鳴角θｒのかく乱要因にかかわらず共鳴角θｒが正確に特定される。蛍光標識抗体が抗原に結合させられる前に共鳴角θｒが測定されるので、蛍光色素が励起光により退色しにくくなる。これらにより、抗原の検出の精度及び感度が向上する。
　（表面プラズモン励起蛍光計測装置の概略）
　図１の模式図は、表面プラズモン励起蛍光計測装置の望ましい実施形態を示す。
　表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００においては、レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００が励起光光学系１００４により分析チップ１００６へ導かれる。分析チップ１００６へ励起光９０００が入射している間は、分析チップ１００６から測定光９００２及び反射光９００４が出射する。測定光９００２は、測定光光学系１００８により光電子増倍管１０１０へ導かれる。反射光９００４は、光吸収体１０１２に吸収される。
　分析チップ１００６には、送液機構１０１４により試料液９００６及び蛍光標識液９００８が順次に注入される。分析チップ１００６は、測定が行われるときには、測定室１０１６に配置され、分析チップ保持機構１０１８に保持される。分析チップ１００６は、試料液９００６又は蛍光標識液９００８が注入されるときには、前処理室１０２０に配置される。分析チップ１００６は、分析チップ搬送機構１０２２により、前処理室１０２０から測定室１０１６へロードされ、測定室１０１６から前処理室１０２０へアンロードされる。分析チップ１００６は、望ましくは、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００に対して着脱され、検体９０２０ごとに交換される。ただし、分析チップ１００６が再利用されてもよい。
　試料液９００６が分析チップ１００６に注入された後であって蛍光標識液９００８が分析チップ１００６に注入される前に、入射角調整機構１０３４により励起光９０００の入射角θが走査され、測定光９００２の光量が光電子増倍管１０１０に測定され、共鳴角θｒが特定される。蛍光標識液９００８が分析チップ１００６に注入され入射角θが測定角θｍに設定された後に、測定光９００２の光量が光電子増倍管１０１０に測定される。測定結果は、ディスプレイ１０２４に表示される。
　表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００の構成物は制御演算部１０２６により制御され、制御演算部１０２６においては演算が行われる。
　（制御演算部）
　図２のブロック図は、制御演算部１０２６を示す。
　図２に示される前処理制御部１１０４等の制御演算ブロック群による制御及び演算の内容は、抗原の検出の手順の説明の中で言及される。これらの制御演算ブロック群は、ソフトウエアを実行する組み込みコンピュータである。１個の組み込みコンピュータがこれらの制御演算ブロック群の機能を担ってもよいし、２個以上の組み込みコンピュータが分担してこれらの制御演算ブロック群の機能を担ってもよい。ソフトウエアを伴わないハードウエアがこれらの制御演算ブロック群の全部又は一部の機能を担ってもよい。ハードウエアは、電子回路であってもよいし、リンク機構等の機械的機構であってもよい。
　（分析チップ）
　図３の模式図は、分析チップの断面を示す。
　図３に示すように、分析チップ１００６においては、導電体膜１２００の第１の主面１２０２がプリズム１２０４の反射面１２０６に密着し、導電体膜１２００の第２の主面１２１０は反射面１２０６に密着しない。第２の主面１２１０には、抗原捕捉体１２０８が定着させられ、流路形成体１２１２の接合面１２１４が接合される。プリズム１２０４へ導かれた励起光９０００は入射面１２１６へ入射し、入射面１２１６へ入射した励起光９０００は照射領域１８００において反射面１２０６に全反射され、反射光９００４は出射面１２１８から出射する。散乱光及び蛍光は、導電体膜１２００及び抗原捕捉体１２０８から第２の主面１２１０が向く側へ出射する。反射面１２０６に励起光９０００が全反射条件を満たして入射する場合であって反射面１２０６からしみだすエバネッセント波と導電体膜１２００の中のプラズモンとが共鳴するときには、導電体膜１２００によりエバネッセント波の電場が増強され、散乱光及び蛍光の光量が増加する。分析チップ１００６は、望ましくは、各片の長さが数ｍｍ～数ｃｍである構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物又はより大型の構造物に置き換えられてもよい。
　（プリズム）
　プリズム１２０４は台形柱体である。台形柱体の一方の傾斜側面が入射面１２１６にされ、台形柱体の幅広の平行側面が反射面１２０６にされ、台形柱体の他方の傾斜側面が出射面１２１８にされる。プリズム１２０４は、望ましくは、等脚台形柱体である。これにより、入射面１２１６と出射面１２１８とが対称になり、反射光９００４のＳ波成分がプリズム１２０４の内部に滞留しにくくなる。入射面１２１６、反射面１２０６及び出射面１２１８が備えられる限り、プリズム１２０４が台形柱体以外でもよく、プリズム１２０４が「プリズム」の範疇に含まれない形状物に置き換えられてもよい。
　プリズム１２０４は、励起光９０００に対して透明な材質からなる誘電体媒体である。プリズム１２０４は、ガラス、樹脂等からなる。プリズム１２０４は、望ましくは、屈折率が１．４～１．６であって複屈折が小さい樹脂からなる。
　（導電体膜）
　導電体膜１２００は、表面プラズモン共鳴を発生させる導電体からなる。導電体膜１２００は、望ましくは、金からなる。ただし、導電体膜１２００が、銀、銅、アルミニウム等の金属又はこれらの金属を含む合金からなってもよい。
　導電体膜１２００は、薄膜である。導電体膜１２００の膜厚は、望ましくは、３０～７０ｎｍである。ただし、導電体膜１２００の膜厚がこの範囲外であってもよい。
　導電体膜１２００は、スパッタリング、蒸着、メッキ等により形成される。ただし、導電体膜１２００が他の方法により形成されてもよい。
　（抗原捕捉体）
　抗原捕捉体１２０８は、非流動体からなる。したがって、試料液９００６又は蛍光標識液９００８が抗原捕捉体１２０８に接触しても、抗原捕捉体１２０８は移動しない。
　抗原捕捉体１２０８は、検出対象の抗原と結合する抗体を含む。抗体は、均一に分布する。検出対象の抗原を含む試料液９００６が抗原捕捉体１２０８に接触した場合は、試料液９００６に含まれる検出対象の抗原が抗原捕捉体１２０８に含まれる抗体と結合し、試料液９００６に含まれる検出対象の抗原が抗原捕捉体１２０８に捕捉される。
　（流路形成体）
　流路形成体１２１２には、流路１２２０が形成される。流路１２２０の途中には反応室１２２２がある。反応室１２２２は、接合面１２１４に露出する。反応室１２２２の平面位置と抗原捕捉体１２０８の平面位置とは一致させられ、抗原捕捉体１２０８は反応室１２２２に露出する。流路１２２０へ試料液９００６又は蛍光標識液９００８が注入された場合は、それぞれ、試料液９００６又は蛍光標識液９００８で反応室１２２２が満たされ、試料液９００６又は蛍光標識液９００８が抗原捕捉体１２０８に接触する。流路１２２０は、流路形成体１２１２の非接合面１２２４に露出し、非接合面１２２４には試料液９００６及び蛍光標識液９００８の注入口１２２６が形成される。
　接合面１２１４と第２の主面１２１０とは、接着、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ圧着等により接合される。ただし、接合面１２１４と第２の主面１２１０とが他の方法により接合されてもよい。
　流路形成体１２１２は、散乱光及び表面プラズモン励起蛍光に対して透明な材質からなる。流路形成体１２１２は、例えば、樹脂等からなる。
　流路形成体１２１２は、試料液９００６又は蛍光標識液９００８の飛散を防止し、抗原捕捉体１２０８に接触する試料液９００６又は蛍光標識液９００８の量を一定にすることに寄与する。しかし、流路形成体１２１２が省略され、抗原捕捉体１２０８の上に試料液９００６又は蛍光標識液９００８が直接的に滴下されてもよい。
　（レーザーダイオードユニット）
　図４の模式図は、レーザーダイオードユニットを示す。
　図４に示すように、レーザーダイオードユニット１００２においては、レーザーダイオード１３００から放射されたビーム９０１０がビームスプリッタ１３０２により主ビーム９０１２と副ビーム９０１４とに分割される。主ビーム９０１２は、コリメータ１３０４によりコリメート化され、レーザーダイオードユニット１００２から励起光９０００として放射される。
　励起光９０００がコリメート化されても励起光９０００のビームの断面形状は扁平形である。照射領域１８００の平面形状を円形に近づけるために、励起光９０００の光路を含み反射面１２０６に垂直な面に楕円形の短軸が含まれるような姿勢でレーザーダイオード１３００がレーザーダイオード保持機構１３０６により保持される。
　レーザーダイオード１３００から放射されるレーザー光の波長及び光量が温度に依存する場合は、望ましくは、レーザーダイオード１３００が温度調整回路１３０８に制御される。温度調整回路１３０８においては、副ビーム９０１４の光量がフォトダイオード１３１０により測定され、副ビーム９０１４の光量の測定結果が一定に維持されるようにレーザーダイオード１３００へ供給される電力が電力供給制御回路１３１２により回帰制御される。これにより、レーザーダイオード１３００の温度が一定に維持され、励起光９０００の波長及び光量が一定に維持される。フォトダイオード１３１０がフォトトランジスタ、フォトレジスタ等の他の光量センサに置き換えられてもよい。励起光９０００の波長は共鳴角θｒ及びエバネッセント波のしみだし量に影響するので、温度調整回路１３０８は抗原の検出の精度及び感度の向上に寄与する。
　レーザーダイオード１３００の温度が定常温度になるまでに長時間を要する場合は、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００の運転が開始されたときからレーザーダイオード１３００へ電力が常時供給される。
　レーザーダイオード１３００から放射される励起光９０００の偏光方向は、概ね、特定の方向に偏在する。
　レーザーダイオード１３００が発光ダイオード、水銀灯、レーザーダイオード以外のレーザー等の他の光源に置き換えられてもよい。光源から放射される光がビームでない場合は、レンズ、鏡、スリット等により光がビームに変換される。光源から放射される光が単色光でない場合は、回折格子等により光が単色光に変換される。光源から放射される光が直線偏光でない場合は、偏光子等により光が直線偏光に変換される。
　（励起光光学系）
　図１に示すように、励起光９０００は、励起光光学系１００４によりレーザーダイオードユニット１００２から分析チップ１００６へ導かれる間に、第１の整波器１０２８、偏光方向調整機構１０３０、整形光学系１０３２及び入射角調整機構１０３４を順次に通過する。励起光９０００が第１の整波器１０２８を通過するときに励起光９０００が整波される。励起光９０００が偏光方向調整機構１０３０を通過するときに反射面１２０６に主にＰ波成分が入射するように励起光９０００の偏光方向が調整される。励起光９０００が整形光学系１０３２を通過するときに励起光９０００のビームの断面形状がスリット、ズーム光学系等により整形される。励起光９０００が入射角調整機構１０３４を通過するときに反射面１２０６への励起光９０００の入射角θが調整される。
　（第１の整波器）
　図５の模式図は、第１の整波器を示す。
　図５に示すように、励起光９０００は、第１の整波器１０２８を通過するときに、第１のバンドパスフィルタ１４００、直線偏光フィルタ１４０２及び減光フィルタ１４０４を順次に通過する。第１の整波器１０２８がこれら以外の光学フィルタを備えてもよい。第１の整波器１０２８が光学フィルタ以外の光学素子を備えてもよい。
　励起光９０００が第１のバンドパスフィルタ１４００を透過するときに、励起光９０００の波長の分布が狭められる。これにより、レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の波長の分布が広くても、波長の分布が狭い励起光９０００が得られる。レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の波長の分布が十分に狭い場合は、第１のバンドパスフィルタ１４００が省略されてもよい。
　励起光９０００が直線偏光フィルタ１４０２を透過するときに、励起光９０００の偏光方向の分布が狭められる。これにより、レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の偏光方向の分布が広くても、偏光方向の分布が狭い励起光９０００が得られる。レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の偏光方向の分布が十分に狭い場合は、直線偏光フィルタ１４０２が省略されてもよい。
　励起光９０００が減光フィルタ１４０４を透過するときに、励起光９０００の光量が減少させられる。レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の光量が適切である場合は、減光フィルタ１４０４が省略されてもよい。
　（偏光方向調整機構）
　図６の模式図は、偏光方向調整機構を示す。
　図６に示すように、偏光方向調整機構１０３０においては、半波長板１５００に垂直な回転軸の周りに半波長板１５００が半波長板回転機構１５０２により回転させられる。半波長板回転機構１５０２は、ロータリーステッピングモータ等により半波長板１５００を自転させる。半波長板１５００を透過する励起光９０００の偏光方向は、半波長板１５００の回転角により調整される。励起光９０００の偏光方向は、反射面１２０６からのエバネッセント波のしみだしが最大になる偏光方向と反射面１２０６からのエバネッセント波のしみだしがなくなる偏光方向との間に調整されうる。初期状態においては、反射面１２０６に主にＰ波成分が入射すると予想される回転角に半波長板１５００の回転角が設定される。
　偏光方向調整機構１０３０が、光軸の周りにレーザーダイオードユニット１００２又はレーザーダイオード１３００を回転させる機構に置き換えられてもよい。後記の偏光方向の最適化が省略される場合は、半波長板回転機構１５０２が省略され、半波長板１５００が固定されてもよい。後記の偏光方向の最適化が省略されるとともに反射面１２０６に主にＰ波成分が入射する姿勢でレーザーダイオードユニット１００２又はレーザーダイオード１３００が保持される場合は、半波長板１５００及び半波長板回転機構１５０２が省略されてもよい。
　（入射角調整機構）
　図７の模式図は、入射角調整機構を示す。
　図７に示すように、励起光９０００は、入射角調整機構１０３４を通過するときに反射鏡１６００に反射され、励起光９０００の進む方向が第１の方向９０１６から分析チップ１００６へ向かう第２の方向９０１８へ屈曲させられる。
　入射角調整機構１０３４により入射角θが調整される場合は、反射鏡角度調整機構１６０２により反射鏡角度が調整されながら、入射角θの変化による照射位置Ｘの移動をキャンセルするように反射鏡位置調整機構１６０４により反射鏡位置が調整される。これにより、入射角θのみが調整され、反射面１２０６における励起光９０００の照射位置Ｘが維持される。
　入射角調整機構１０３４により照射位置Ｘが調整される場合は、反射鏡角度が固定され、反射鏡位置調整機構１６０４により反射鏡位置が調整される。これにより、照射位置Ｘのみが調整され、入射角θが維持される。
　励起光９０００が入射面１２１６へ導かれない遮断状態に入射角調整機構１０３４がされる場合は、反射鏡角度調整機構１６０２により反射鏡角度が調整され、反射鏡１６００の光吸収面に励起光９０００が当てられる。励起光９０００が入射面１２１６へ導かれる非遮断状態に入射角調整機構１０３４がされる場合は、反射鏡角度調整機構１６０２により反射鏡角度が調整され、反射鏡１６００の鏡面に励起光９０００が当てられる。反射鏡角度調整機構１６０２以外の機構により遮断状態と非遮断状態とが切り替えられてもよい。例えば、励起光９０００の光路に光吸収体が挿抜されてもよい。
　反射鏡角度調整機構１６０２は、ロータリーステッピングモータ等により鏡面に平行な回転軸の周りに反射鏡１６００を自転させ、反射鏡角度を調整する。
　反射鏡位置調整機構１６０４は、リニアステージ等の上においてリニアステッピングモータ等により第１の方向９０１６に沿って反射鏡角度調整機構１６０２とともに反射鏡１６００を移動させ、反射鏡位置を調整する。
　入射角調整機構１０３４には、簡単な機構により入射角θ及び照射位置Ｘを調整できるという利点がある。ただし、レーザーダイオードユニット１００２の位置及び姿勢を調整する機構により入射角θ及び照射位置Ｘが調整されてもよい。又は、分析チップ１００６の位置及び姿勢を調整する機構により入射角θ及び照射位置Ｘが調整されてもよい。
　（測定光光学系）
　図８の模式図は、測定光光学系を示す。
　図８に示すように、第２の主面１２１０が向く側へ出射する測定光９００２は、測定光光学系１００８により光電子増倍管１０１０へ導かれる。測定光光学系１００８においては、測定光９００２は、集光レンズ１７００により集光され平行光に変換され、第２の整波器１７０２を通過し、結像レンズ１７０４により光電子増倍管１０１０に結像される。
　集光レンズ１７００及び結像レンズ１７０４は共役光学系を構成する。これにより、迷光の影響が抑制される。
　第２の整波器１７０２においては、第２のバンドパスフィルタ１７０６が挿抜機構１７０８により測定光９００２の光路に挿抜される。
　表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される場合は、測定光９００２の光路へ第２のバンドパスフィルタ１７０６が挿入され、第２のバンドパスフィルタ１７０６により励起光９０００と同じ波長の光が選択的に減衰させられる。これにより、散乱光が減衰し、主に表面プラズモン励起蛍光が光電子増倍管１０１０へ導かれ、抗原の検出の感度及び精度が向上する。散乱光の光量が測定される場合は、測定光９００２の光路から第２のバンドパスフィルタ１７０６が抜去される。
　測定光９００２の光路に挿抜機構により減光フィルタが挿抜されてもよい。表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される場合は、測定光９００２の光路から減光フィルタが抜去される。散乱光の光量が測定される場合は、測定光９００２の光路へ減光フィルタが挿入される。これにより、光電子増倍管１０１０へ導かれる表面プラズモン励起蛍光及び散乱光の光量の差が小さくなり、光量の測定が容易になる。表面プラズモン励起蛍光の光量が相対的に高感度の光電子増倍管１０１０により測定され、散乱光の光量が相対的に低感度のフォトダイオード、フォトトランジスタ、フォトレジスタ等により測定されてもよい。
　（光電子増倍管）
　測定光９００２の光量は光電子増倍管１０１０により測定される。光電子増倍管１０１０には感度及び信号対雑音比が良好であるという利点がある。ただし、光電子増倍管１０１０が冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ等の他の光量センサに置き換えられてもよい。
　（送液機構）
　図１に示すように、送液機構１０１４により流路１２２０へ試料液９００６が注入されるときは、分析チップ１００６及び試薬チップ１０３６が前処理室１０２０に配置される。また、送液ポンプ１０４０により試薬チップ１０３６の希釈容器１０４２から試料液９００６が吸引され、送液ポンプ１０４０が送液ポンプ搬送機構１０４４により搬送され、送液ポンプ１０４０により注入口１２２６へ試料液９００６が吐出される。
　送液機構１０１４により流路１２２０へ蛍光標識液９００８が注入されるときも、分析チップ１００６及び試薬チップ１０３６が前処理室１０２０に配置される。また、送液ポンプ１０４０により試薬チップ１０３６の蛍光標識液容器１０４６から蛍光標識液９００８が吸引され、送液ポンプ１０４０が送液ポンプ搬送機構１０４４により搬送され、送液ポンプ１０４０により注入口１２２６へ蛍光標識液９００８が吐出される。
　分析チップ１００６を前処理室１０２０へ退避させてから試料液９００６又は蛍光標識液９００８を分析チップ１００６へ注入することには、光学測定を阻害する構成物を測定室１０１６から排除し測定室１００６の汚染を抑制することに寄与する。ただし、前処理室１０２０への退避が省略されてもよい。
　検体９０２０が希釈されるときには、試薬チップ１０３６が前処理室１０２０に配置される。送液機構１０１４により、検体容器１０４８から希釈容器１０４２へ検体９０２０が送液され、希釈液容器１０５０から希釈容器１０４２へ希釈液９０２２が送液され、試料液９００６が調製される。
　送液ポンプ１０４０は、必要に応じて、洗浄液容器１０５２に収容された洗浄液９０２４で洗浄される。
　検体９０２０が希釈されずに検体９０２０がそのまま試料液９００６になる場合もある。また、希釈に加えて又は希釈に代えて、血球分離、試薬の混合等の他の前処理が行われてもよい。
　検体９０２０は、典型的には、血液等の人間からの採取物であるが、人間以外の生物からの採取物であってもよく、非生物からの採取物であってもよい。
　蛍光標識液９００８は、検出対象の抗原と結合し蛍光標識された蛍光標識抗体を含む。
　流路１２２０へ注入される注入物は典型的には液体であるが気体又は流動性を有する固体であってもよい。
　送液ポンプ１０４０を送液元から送液先へ搬送する送液機構１０１４に代えて、チューブにより試料液９００６及び蛍光標識液９００８を送液する機構が設けられてもよい。
　（反応領域、測定領域及び照射領域の関係）
　図９の模式図は、反射面における照射領域、測定領域及び反応領域の望ましい関係を示す平面図である。照射領域１８００は、励起光９０００が照射される領域である。測定領域１８０２は、測定光９００２の光量が光電子増倍管１０１０により測定される領域である。反応領域１８０４は、抗原捕捉体１２０８が設けられ、抗原捕捉体１２０８に含まれる抗体と抗原とが結合する領域である。照射領域１８００及び測定領域１８０２の平面形状は、望ましくは、円形である。
　照射領域１８００と測定領域１８０２とは少なくとも重なる。望ましくは照射領域１８００が測定領域１８０２に内包され、さらに望ましくは照射領域１８００が測定領域１８０２の中央に配置される。これにより、プリズム１２０４のばらつき等により照射位置がずれても照射領域１８００が測定領域１８０２から逸脱しにくくなり、測定光９００２の光量が維持される。
　照射領域１８００と反応領域１８０４とは少なくとも重なり、望ましくは照射領域１８００が反応領域１８０４に内包され、さらに望ましくは照射領域１８００が反応領域１８０４の中央に配置される。
　測定領域１８０２と反応領域１８０４とは少なくとも重なり、望ましくは測定領域１８０２が反応領域１８０４に内包され、さらに望ましくは測定領域１８０２が反応領域１８０４の中央に配置される。
　（抗原の検出の手順の概略）
　図１０のフローチャートは、抗原の検出の手順の概略を示す。
　図１０に示すように、測定が準備され（ステップＳ１０１）、抗体と抗原とが反応させられ（ステップＳ１０２）、ロード制御部１１００が分析チップ搬送機構１０２２に分析チップ１００６をロードさせる（ステップＳ１０３）。ロードされた分析チップ１００６のプリズム１２０４には励起光９０００が照射される。分析チップ１００６に励起光９０００が照射されている状態において入射角θが測定角θｍに設定され（ステップＳ１０４）、望ましくは行われる処理が行われ（ステップＳ１０５～Ｓ１０７）、アンロード制御部１１０２が分析チップ搬送機構１０２２に分析チップ１００６をアンロードさせ（ステップＳ１０８）、抗原と蛍光標識抗体とが反応させられる（ステップＳ１０９）。
　入射角θが測定角θｍに設定された後（ステップＳ１０４の後）であって分析チップ１００６がアンロードされる前（ステップＳ１０８の前）に、望ましくは、照射位置が最適化され（ステップＳ１０５）、自家蛍光の光量が測定され（ステップＳ１０６）、励起光９０００の偏光方向が最適化される（ステップＳ１０７）。照射位置の最適化（ステップＳ１０５）、自家蛍光の光量の測定（ステップＳ１０６）及び励起光９０００の偏光方向の最適化（ステップＳ１０７）の全部又は一部が省略されてもよい。
　抗原と蛍光標識抗体とが反応させられた後（ステップＳ１０９の後）に、再ロード制御部１１０４が分析チップ搬送機構１０２２に分析チップ１００６を再ロードさせ（ステップＳ１１０）、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定され（ステップＳ１１１）、測定結果が検体番号等とともに記憶及び表示され（ステップＳ１１２）、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００が初期化される（ステップＳ１１３）。表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００が初期化されるときには、反射鏡等の可動物が初期位置に復帰させられる。表面プラズモン励起蛍光の光量は、必要に応じて、抗原の絶対量、濃度等に換算される。
　（測定の準備）
　図１１のフローチャートは、測定の準備（ステップＳ１０１）の手順を示す。
　図１１に示すように、分析チップ１００６が準備され（ステップＳ１０１１）、前処理室１０２０に分析チップ１００６が配置される（ステップＳ１０１２）。
　それとは別に、試薬チップ１０３６が準備され（ステップＳ１０１３）、前処理室１０２０に試薬チップ１０３６が配置され（ステップＳ１０１４）、前処理制御部１１０４が送液機構１０１４に試薬チップ１０３６を前処理させる（ステップＳ１０１５）。これにより、試料液９００６が調製され、試料液９００６の準備が完了する。また、蛍光標識液９００８の準備が完了する。
　分析チップ１００６の準備及び配置（ステップＳ１０１１及びＳ１０１２）は、試薬チップ１０３６の準備、配置及び前処理（ステップＳ１０１３、Ｓ１０１４及びＳ１０１５）の後に行われてもよく、試薬チップ１０３６の準備、配置及び前処理（ステップＳ１０１３、Ｓ１０１４及びＳ１０１５）と並行して行われてもよい。
　（抗体と抗原との反応）
　抗体と抗原との反応（ステップＳ１０２）においては、第１の反応制御部１１０６が送液機構１０１４に試料液９００６を流路１２２０へ注入させる。
　試料液９００６が流路１２２０へ注入された場合は、試料液９００６が抗原捕捉体１２０８に接触し、試料液９００６に含まれる抗原が抗原捕捉体１２０８に含まれる抗体に結合し、試料液９００６に含まれる抗原が抗原捕捉体１２０８に捕捉される。
　（入射角θの測定角θｍへの設定）
　図１２のフローチャートは、入射角θの測定角θｍへの設定（ステップＳ１０４）の手順を示す。
　図１２に示すように、フィルタ抜去制御部１１０８が挿抜機構１７０８に第２のバンドパスフィルタ１７０６を測定光９００２の光路から抜去させる（ステップＳ１０４１）。これにより、散乱光が遮蔽されなくなり、散乱光の光量が光電子増倍管１０１０により測定可能になる。
　第２のバンドパスフィルタ１７０６が抜去された状態において、入射角走査制御部１１１０が、入射角調整機構１０３４に入射角θを走査させながら光電子増倍管１０１０から光量Ｉの測定結果を取得する（ステップＳ１０４２）。これにより、入射角θの走査中に散乱光の光量Ｉｓが測定され、入射角θと散乱光の光量Ｉｓとの関係Ｉｓ（θ）が得られる。
　関係Ｉｓ（θ）が得られた後に、入射角決定部１１１２が、関係Ｉｓ（θ）から光量Ｉｓが極大になる入射角θである共鳴角θｒを特定し、共鳴角θｒから測定が行われる入射角θである測定角θｍを決定する（ステップＳ１０４３）。散乱光の光量Ｉｓが極大になる共鳴角θｒと電場の増強度が極大になる入射角θｍａｘとのずれは小さく、蛍光標識液９００８の注入が共鳴角θｒに与える影響は小さいので、蛍光標識液９００８の注入の前に決定された共鳴角θｒがそのまま測定角θｍにされても電場が十分に増強される。ただし、共鳴角θｒが補正されて測定角θｍにされてもよい。散乱光の光量Ｉｓが極大になる共鳴角θｒが求められる場合は、反射光の光量Ｉｒが極小になる共鳴角θｒが求められる場合と異なり、表面プラズモン励起蛍光の光量を測定する光量センサが援用可能になり、表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００の構造が簡略化される。
　測定角θｍが決定された後に、入射角設定部１１１４が、入射角調整機構１０３４に入射角θを測定角θｍに設定させる（ステップＳ１０４４）。
　試料液９００６が流路１２２０へ注入された後に関係Ｉｓ（θ）が測定された場合は、試料液９００６の抗原濃度等によらず共鳴角θｒが正確に特定される。また、蛍光標識液９００８が流路１２２０へ注入される前に関係Ｉｓ（θ）された場合は、蛍光色素が励起光９０００により退色しにくい。これらにより、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
　蛍光標識液９００８が流路１２２０へ注入される前に関係Ｉｓ（θ）が得られること（ステップＳ１０４２）は必要であるが、蛍光標識液９００８が流路１２２０へ注入される前に測定角θｍが決定されること（ステップＳ１０４３）及び入射角θが測定角θｍに設定されること（ステップＳ１０４４）は必ずしも必要ではない。したがって、蛍光標識液９００８が流路１２２０へ注入された後に測定角θｍが決定されてもよく（ステップＳ１０４３）、入射角θが測定角θｍに設定されてもよい（ステップＳ１０４４）。
　（入射角θの走査範囲）
　プリズム１２０４の材質及び形状、流路１２２０への注入物の屈折率等により、共鳴角θｒは概ね決まる。しかし、抗原捕捉体１２０８に捕捉された分子の種類及び量、プリズム１２０４のばらつき等によって共鳴角θｒはわずかに変化する。このため、入射角θの走査においては、全反射条件が満たされる範囲であって予想される共鳴角θｒを含む概ね１０°以下の範囲が重点的に走査される。
　（照射位置の最適化）
　図１３のフローチャートは、照射位置の最適化（ステップＳ１０５）の手順を示す。
　図１３に示すように、照射位置走査部１１１６が反射鏡位置調整機構１６０４に反射鏡位置を走査させながら光電子増倍管１０１０から光量Ｉの測定結果を取得する（ステップＳ１０５１）。反射鏡位置が走査される間に、入射角θが測定角θｍに維持されたまま励起光９０００が平行移動し、照射位置１３００が直線に沿って走査される。これにより、照射位置Ｘの走査中に散乱光の光量Ｉｓが測定され、照射位置Ｘと散乱光の光量Ｉｓとの関係Ｉｓ（Ｘ）が得られる。
　図１４のグラフは、照射位置Ｘと散乱光の光量Ｉｓとの関係Ｉｓ（Ｘ）を示す。
　図１４に示すように、照射領域１８００が測定領域１８０２に内包される区間Ｒにおいては、光量Ｉｓはほぼ一定である。しかし、区間Ｒ以外においては、照射領域１８００が測定領域１８０２を逸脱し、照射位置Ｘが区間Ｒから離れるにしたがって光量Ｉｓが減少する。
　関係Ｉｓ（Ｘ）が得られた後に、照射位置決定部１１１８が、光量Ｉｓが極大値から同値ΔＩｓだけ減少する照射位置Ｘ１及びＸ２を関係Ｉｓ（Ｘ）から特定し、照射位置Ｘ１及びＸ２の中間を測定が行われる照射位置Ｘである測定位置Ｘｍに決定する（ステップＳ１０５２）。
　望ましくは、測定角θが測定角θｍに設定された後に関係Ｉｓ（Ｘ）が測定される。これにより、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定されるときと同じ入射角θで照射位置Ｘが最適化され、照射位置Ｘが適切に最適化される。
　さらに続いて、照射位置設定部１１２０が反射鏡位置調整機構１６０４に反射鏡位置を照射位置Ｘが測定位置Ｘｍになる反射鏡位置に設定させる（ステップＳ１０５３）。
　共鳴角θｒの近傍の入射角θにおいては、反射光９００４の光量は小さく、反射光９００４はプリズム１２０４から放射される自家蛍光をほとんど発生させない。このため、測定領域１８０２における励起光９０００の光路長が自家蛍光の光量に大きく影響し、照射位置Ｘが変化すると自家蛍光の光量も変化する。自家蛍光の光量は励起光９０００の光量に比べると小さいが、表面プラズモン励起蛍光の光量と比べると無視できない。ただし、自家蛍光の光量は小さいため、表面プラズモン励起蛍光の光量の測定に影響を与えるのは、反射面１２０６の近くから放射された自家蛍光に限られる。
　照射位置Ｘの最適化（ステップＳ１０５）により照射領域１８００が測定領域１８０２の中央に配置された場合は、測定領域１８０２における励起光９０００の光路長が一定になり、自家蛍光の光量の影響が一定になり、抗原の検出の感度及び精度が向上する。望ましくは、照射位置Ｘの最適化（ステップＳ１０５）は、自家蛍光の光量の測定の前（ステップＳ１０６の前）に行われる。これにより、自家蛍光の光量の測定の精度が向上する。
　（自家蛍光の光量の測定）
　自家蛍光の光量の測定（ステップＳ１０６）においては、自家蛍光測定部１１２２が光電子増倍管１０１０から光量Ｉの測定結果を取得する。これにより、自家蛍光の光量Ｉａｆが測定される。測定結果は、後記の自家蛍光の補正が完了するまで自家蛍光測定部１１２２に記憶される。
　（励起光の偏光方向の最適化）
　図１５のフローチャートは、励起光の偏光方向の最適化（ステップＳ１０７）の手順を示す。
　図１５に示すように、偏光方向走査部１１２４が偏光方向調整機構１０３０に偏光方向αを走査させながら光電子増倍管１０１０から光量Ｉの測定結果を取得する（ステップＳ１０７１）。これにより、偏光方向αの走査中に散乱光の光量Ｉｓが測定され、励起光９０００の偏光方向αと散乱光の光量Ｉｓとの関係Ｉｓ（α）が得られる。
　望ましくは、測定角θが測定角θｍに設定された後に関係Ｉｓ（α）が測定される。これにより、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定されるときと同じ入射角θで偏光方向αが最適化され、偏光方向αが適切に最適化される。さらに望ましくは、照射位置Ｘが最適化された後（ステップＳ１０５の後）に関係Ｉｓ（α）が測定される。これにより、表面プラズモン励起蛍光の光量が測定されるときと同じ照射位置Ｘで偏光方向が最適化され、偏光方向αが適切に最適される。
　関係Ｉｓ（α）が得られた後に、偏光方向決定部１１２６が光量Ｉｓが極大になる偏光方向αを関係Ｉｓ（α）から特定し、測定が行われる偏光方向αである測定偏光方向αｍを決定する（ステップＳ１０７２）。
　測定偏光方向αｍが決定された後に、偏光方向設定部１１２８が、偏光方向調整機構１０３０に偏光方向αを測定偏光方向αｍに設定させる（ステップＳ１０７３）。
　樹脂からなる媒体の中を光が進行する場合には無視できない複屈折が生じる。この複屈折は、位置による媒体の密度の変化等により生じる。位置による媒体の密度の変化は樹脂の成形のときに生じるため、複屈折の強さはプリズム１２０４ごとに異なる。このため、プリズム１２０４によっては、エバネッセント波のしみだしに寄与するＰ波成分のみを反射面１２０６へ入射させようとしても、Ｓ波成分が発生してＰ波成分が減少し、抗原の検出の感度及び精度が低下する。
　励起光の偏光方向の最適化（ステップＳ１０７）により、プリズム１２０４のばらつきによるＰ波成分の減少が解消し、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
　（抗原と蛍光標識抗体との反応）
　抗原と蛍光標識抗体との反応（ステップＳ１０９）においては、第２の反応制御部１１３０が送液機構１０１４に蛍光標識液９００８を流路１２２０へ注入させる。蛍光標識液９００８が流路１２２０へ注入された場合は、蛍光標識液９００８が抗原捕捉体１２０８に接触し、蛍光標識液９００８に含まれる蛍光標識抗体が抗原に結合する。
　（表面プラズモン励起蛍光の光量の測定）
　図１６のフローチャートは、表面プラズモン励起蛍光の光量の測定（ステップＳ１１１）の手順を示す。
　図１６に示すように、フィルタ挿入制御部１１３２が挿抜機構１７０８に第２のバンドパスフィルタ１７０６を測定光９００２の光路へ挿入させる（ステップＳ１１１１）。これにより、光電子増倍管１０１０に届く散乱光が減り、抗原の検出の感度及び精度が向上する。
　第２のバンドパスフィルタ１７０６が挿入された後に、遮断制御部１１３４が反射鏡角度調整機構１６０２に励起光９０００を一時的に遮断させる（ステップＳ１１１２）。
　励起光９０００が遮断されている間に、暗ノイズ測定部１１３６が光電子増倍管１０１０から光量Ｉの測定結果を取得する（ステップＳ１１１３）。これにより、暗ノイズ量Ｉｎが測定される。
　望ましくは、励起光の遮断（ステップＳ１１１２）及び暗ノイズ量の測定（ステップＳ１１１３）は、後記の入射角θの測定角θｍへの再設定（ステップＳ１１１４）及び表面プラズモン励起蛍光の光量Ｉｆの測定（ステップＳ１１１５）の直前に行われるが、暗ノイズ補正（ステップＳ１１１７）の前であれば他のときに行われてもよい。
　暗ノイズ量Ｉｎが測定された後（ステップＳ１１１３の後）に、入射角再設定部１１３６が反射鏡角度調整機構１６０２に入射角θを測定角θｍに再設定させる（ステップＳ１１１４）。
　入射角θが測定角θｍに再設定された後に、蛍光測定部１１３８が光電子増倍管１０１０から光量Ｉの測定結果を取得する（ステップＳ１１１５）。これにより、測定角θｍにおける表面プラズモン励起蛍光の光量Ｉｆが測定される。
　表面プラズモン励起蛍光の光量Ｉｆが測定された後に、自家蛍光補正部１１０４が、表面プラズモン励起蛍光の光量Ｉｆから自家蛍光の光量Ｉａｆを減ずる補正を行い（ステップＳ１１１６）、暗ノイズ補正部１１４２が表面プラズモン励起蛍光の光量Ｉｆから暗ノイズ量Ｉｎを減じる補正を行う（ステップＳ１１１７）。これにより、抗原の検出の感度及び精度が向上する。自家蛍光の補正（ステップＳ１１１６）及び暗ノイズの補正（ステップＳ１１１７）が同時に行われてもよく、自家蛍光の補正（ステップＳ１１１６）が暗ノイズの補正（ステップＳ１１１７）の後に行われてもよい。
　上記の手順のうち表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００により実行される手順が手作業により実行されてもよいし、手作業で実行される手順が表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００により実行されてもよい。
　散乱光の光量Ｉｓが極大になる共鳴角θｒに代えて、反射光９００４の光量Ｉｒが極小になる共鳴角θｒが用いられてもよい。後者の共鳴角θｒが用いられる場合は、図１７に示すように、反射光９００４の光量を測定する反射光量センサ１９０２が表面プラズモン励起蛍光計測装置１０００に付加される。また、ステップＳ１０４２においては、入射角走査制御部１１１０が、入射角調整機構１０３４に入射角θを走査させながら反射光量センサ１９０２から光量Ｉの測定結果を取得する。これにより、入射角θの走査中に反射光９００４の光量Ｉｒが測定され、入射角θと反射光９００４の光量Ｉｒとの関係Ｉｒ（θ）が得られる。また、ステップＳ１０４３においては、入射角決定部１１１２が光量Ｉｒが極小になる入射角θである共鳴角θｒを関係Ｉｒ（θ）から特定し、共鳴角θｒから測定角θｍを決定する。反射光の光量Ｉｒが極小になる共鳴角θｒと電場の増強度が極大になる入射角θｍａｘとにはずれがあるので、望ましくは、共鳴角θｒに微小角を増減する補正が行われ、測定角θｍが決定される。
　本発明は詳細に示され記述されたが、上記の記述は全ての局面において例示であって限定的ではない。しがって、本発明の範囲からはずれることなく無数の修正及び変形が案出されうると解される。
　１０００　表面プラズモン励起蛍光計測装置
　１００２　レーザーダイオードユニット
　１００６　分析チップ
　１０１０　光電子増倍管
　１０１４　送液機構
　１０３０　偏光方向調整機構
　１０３４　入射角調整機構
　１２００　導電体膜
　１２０４　プリズム
　１２０６　反射面
　１２１２　流路形成体
　１２１６　入射面
　１２１８　出射面
　１２２０　流路
　１７０６　第２のバンドパスフィルタ
　９００６　試料液
　９００８　蛍光標識液

Claims (9)

  1. 　表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、
    　励起光を放射する光源と、
    　励起光が入射する入射面、前記入射面へ入射した励起光を全反射する反射面及び前記反射面に全反射された励起光が出射する出射面を備え、励起光に対して透明な誘電体媒体と、
    　前記反射面に密着する第１の主面及び前記反射面に密着しない第２の主面を備える導電体膜と、
    　抗原と結合する抗体を含み、前記第２の主面に定着する抗原捕捉体と、
    　前記反射面への励起光の入射角を調整する調整機構と、
    　前記導電体膜及び前記抗原捕捉体から前記第２の主面が向く方向へ出射する光の光量を測定する光量センサと、
    　試料及び抗原と結合する蛍光標識抗体を含む蛍光標識抗体含有物を前記抗原捕捉体に接触させる接触機構と、
    　前記接触機構に前記試料を前記抗原捕捉体へ接触させる第１の反応制御部と、
    　前記試料が前記抗原捕捉体へ接触させられた後に前記調整機構に入射角を走査させながら前記光量センサから光量の測定結果を取得し、入射角と光量との関係を得る第１の走査制御部と、
    　前記入射角と光量との関係が得られた後に前記接触機構に前記蛍光標識抗体含有物を前記抗原捕捉体へ接触させる第２の反応制御部と、
    　前記入射角と光量との関係から光量が極大になる共鳴角を特定し、前記共鳴角から測定が行われる測定角を決定する入射角決定部と、
    　前記調整機構に入射角を前記測定角に設定させる入射角設定部と、
    　前記蛍光標識抗体含有物が前記抗原捕捉体へ接触させられた後であって入射角が前記測定角に設定された後に前記光量センサから光量の測定結果を取得する第１の測定制御部と、
    を備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
  2. 　表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、
    　励起光を放射する光源と、
    　励起光が入射する入射面、前記入射面へ入射した励起光を全反射する反射面及び前記反射面に全反射された励起光が出射する出射面を備え、励起光に対して透明な誘電体媒体と、
    　前記反射面に密着する第１の主面及び前記反射面に密着しない第２の主面を備える導電体膜と、
    　抗原と結合する抗体を含み、前記第２の主面に定着する抗原捕捉体と、
    　前記反射面への励起光の入射角を調整する調整機構と、
    　前記出射面から出射する光の光量を測定する反射光量センサと、
    　前記導電体膜及び前記抗原捕捉体から前記第２の主面が向く方向へ出射する光の光量を測定する光量センサと、
    　試料及び抗原と結合する蛍光標識抗体を含む蛍光標識抗体含有物を前記抗原捕捉体へ接触させる接触機構と、
    　前記接触機構に前記試料を前記流路へ注入させる第１の反応制御部と、
    　前記試料が前記抗原捕捉体へ接触させられた後に前記調整機構に入射角を走査させながら前記反射光量センサから光量の測定結果を取得し入射角と光量との関係を得る第１の走査制御部と、
    　前記入射角と光量との関係が得られた後に前記接触機構に前記蛍光標識抗体含有物を前記抗原捕捉体へ接触させる第２の反応制御部と、
    　前記入射角と光量との関係から光量が極小になる共鳴角を特定し、前記共鳴角から測定が行われる測定角を決定する入射角決定部と、
    　前記調整機構に入射角を前記測定角に設定させる入射角設定部と、
    　前記蛍光標識抗体含有物が前記抗原捕捉体へ接触させられた後であって入射角が前記測定角に設定された後に前記光量センサから光量の測定結果を取得する第１の測定制御部と、
    を備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
  3. 　請求項１又は請求項２の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
    　前記蛍光標識抗体含有物が前記抗原捕捉体に接触させられる前であって入射角が前記測定角に設定された後に前記光量センサから光量の測定結果を取得する第２の測定制御部と、
    　前記第１の測定制御部に取得された光量の測定結果から前記第２の測定制御部に取得された光量の測定結果を減ずる第１の補正部と、
    をさらに備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
  4. 　請求項３の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
    　前記調整機構は、前記反射面における励起光の照射位置を調整し、
    　前記表面プラズモン励起蛍光計測装置は、
    　前記調整機構に照射位置を走査させながら前記光量センサから光量の測定結果を取得し、照射位置と光量との関係を得る第２の走査制御部と、
    　前記照射位置と光量との関係から光量が極大値から同値だけ減少する第１の照射位置及び第２の照射位置を特定し、前記第１の照射位置及び前記第２の照射位置の中間を測定が行われる測定位置に決定する照射位置決定部と、
    　前記調整機構に照射位置を前記測定位置に設定させる照射位置設定部と、
    をさらに備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
  5. 　請求項１又は請求項２の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
    　前記調整機構は、励起光が前記入射面へ導かれる非遮断状態と導かれない遮断状態とを切り替え、
    　前記表面プラズモン励起蛍光計測装置は、
    　前記調整機構を一時的に前記遮断状態にする遮断制御部と、
    　前記調整機構が前記遮断状態にされている間に前記光量センサから光量の測定結果を取得する第３の測定制御部と、
    　前記第１の測定制御部に取得された光量の測定結果から前記第３の測定制御部に取得された光量の測定結果を減ずる第２の補正部と、
    をさらに備える表面プラズモン励起蛍光計測装置。
  6. 　請求項１又は請求項２の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
    　励起光の偏光方向を調整する偏光方向調整機構と、
    　前記偏光方向調整機構に偏光方向を走査させながら前記光量センサから光量の測定結果を取得し、偏光方向と光量との関係を得る偏光方向走査部と、
    　前記偏光方向と光量との関係から光量が極大になる偏光方向を特定し、測定が行われる測定偏光方向を決定する偏光方向決定部と、
    　前記偏光方向調整機構に偏光方向を前記測定偏光方向に設定させる偏光方向設定部と、
    をさらに備える
    表面プラズモン励起蛍光計測装置。
  7. 　請求項１又は請求項２の表面プラズモン励起蛍光計測装置において、
    　励起光と同じ波長の光を選択的に減衰させるバンドパスフィルタと、
    　前記導電体膜及び前記抗原捕捉体から前記第２の主面が向く方向へ出射する光の光路に前記バンドパスフィルタを挿抜する挿抜機構と、
    　前記第１の測定制御部に光量の測定結果が取得される間に前記挿抜機構に前記バンドパスフィルタを挿入させる挿抜制御部と、
    をさらに備える
    表面プラズモン励起蛍光計測装置。
  8. 　表面プラズモン励起蛍光計測方法であって、
    　(a)　入射面、反射面及び出射面を備え励起光に対して透明な誘電体媒体、前記反射面に密着する第１の主面及び前記反射面に密着しない第２の主面を備える導電体膜並びに抗原と結合する抗体を含み前記第２の主面に定着する抗原捕捉体を備える構造体を準備する工程と、
    　(b)　試料を準備する工程と、
    　(c)　抗原と結合する蛍光標識抗体を含む蛍光標識抗体含有物を準備する工程と、
    　(d)　前記試料を前記抗原捕捉体に接触させる工程と、
    　(e)　前記入射面へ入射し前記反射面に全反射され前記出射面から出射する励起光を前記構造体に照射する工程と、
    　(f)　前記工程(d)の後に前記反射面への励起光の入射角を走査しながら第２の主面が向く方向へ出射する散乱光の光量を測定し、入射角と光量との関係を得る工程と、
    　(g)　前記工程(f)の後に前記蛍光標識抗体含有物を前記抗原捕捉体に接触させる工程と、
    　(h)　散乱光の光量が極大になる共鳴角を前記入射角と光量との関係から特定し、前記共鳴角から測定が行われる測定角を決定する工程と、
    　(i)　入射角を前記測定角に設定する工程と、
    　(j)　前記工程(g)及び前記工程(i)の後に表面プラズモン励起蛍光の光量を測定する工程と、
    を備える表面プラズモン励起蛍光計測方法。
  9. 　表面プラズモン励起蛍光計測方法であって、
    　(a)　入射面、反射面及び出射面を備え励起光に対して透明な誘電体媒体、前記反射面に密着する第１の主面及び前記反射面に密着しない第２の主面を備える導電体膜並びに抗原と結合する抗体を含み前記第２の主面に定着する抗原捕捉体を備える構造体を準備する工程と、
    　(b)　試料を準備する工程と、
    　(c)　抗原と結合する蛍光標識抗体を含む蛍光標識抗体含有物を準備する工程と、
    　(d)　前記試料を前記抗原捕捉体に接触させる工程と、
    　(e)　前記入射面へ入射し前記反射面に全反射され前記出射面から出射する励起光を前記構造体に照射する工程と、
    　(f)　前記工程(d)の後に前記反射面への励起光の入射角を走査しながら前記出射面から出射する反射光の光量を測定し、入射角と光量との関係を得る工程と、
    　(g)　前記工程(f)の後に前記蛍光標識抗体含有物を前記抗原捕捉体に接触させる工程と、
    　(h)　反射光の光量が極小になる共鳴角を前記入射角と光量との関係から特定し、前記共鳴角から測定が行われる測定角を決定する工程と、
    　(i)　入射角を前記測定角に設定する工程と、
    　(j)　前記工程(g)及び前記工程(i)の後に表面プラズモン励起蛍光の光量を測定する工程と、
    を備える表面プラズモン励起蛍光計測方法。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015064704A1 (ja) * 2013-10-31 2015-05-07 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置
WO2015064564A1 (ja) * 2013-10-31 2015-05-07 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析方法、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析システム
WO2015152198A1 (ja) * 2014-03-31 2015-10-08 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析方法、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および位置合わせ方法
EP3064928A4 (en) * 2013-10-31 2017-06-14 Konica Minolta, Inc. Detection device, detection method using said detection device, and detection chip used in said detection device
JP2018009802A (ja) * 2016-07-11 2018-01-18 コニカミノルタ株式会社 検出方法および検出装置
WO2018016383A1 (ja) * 2016-07-19 2018-01-25 コニカミノルタ株式会社 検出方法および検出装置
JP2018091861A (ja) * 2013-04-16 2018-06-14 コニカミノルタ株式会社 測定異常の検出方法および表面プラズモン励起増強蛍光測定装置

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009204476A (ja) * 2008-02-28 2009-09-10 Fujifilm Corp センシング装置
JP2010091553A (ja) * 2008-09-09 2010-04-22 Konica Minolta Holdings Inc 生体分子の検出方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009204476A (ja) * 2008-02-28 2009-09-10 Fujifilm Corp センシング装置
JP2010091553A (ja) * 2008-09-09 2010-04-22 Konica Minolta Holdings Inc 生体分子の検出方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUN-JEN HUANG ET AL.: "Long-Range Surface Plasmon-Enhanced Fluorescence Spectroscopy Biosensor for Ultrasensitive Detection of E. coli 0157:H7", ANAL.CHEM., vol. 83, no. 3, 10 January 2011 (2011-01-10), pages 674 - 677 *
FANG YU ET AL.: "Surface Plasmon Field-Enhanced Fluorescence Spectroscopy Studies of the Interaction between an Antibody and Its Surface-Coupled Antigen", ANAL.CHEM., vol. 75, no. 11, 2003, pages 2610 - 2617 *
SANONG EKGASIT ET AL.: "Evanescent Field in Surface Plasmon Resonance and Surface Plasmon Field-Enhanced Fluorescence Spectroscopies", AANAL.CHEM., vol. 76, 2004, pages 2210 - 2219 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018091861A (ja) * 2013-04-16 2018-06-14 コニカミノルタ株式会社 測定異常の検出方法および表面プラズモン励起増強蛍光測定装置
WO2015064564A1 (ja) * 2013-10-31 2015-05-07 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析方法、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析システム
US11215613B2 (en) 2013-10-31 2022-01-04 Konica Minolta, Inc. Detection device, detection method using said detection device, and detection chip used in said detection device
US9535004B2 (en) 2013-10-31 2017-01-03 Konica Minolta, Inc. Surface plasmon resonance fluorescence analysis method and surface plasmon resonance fluorescence analysis device
JPWO2015064564A1 (ja) * 2013-10-31 2017-03-09 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析方法、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析システム
JPWO2015064704A1 (ja) * 2013-10-31 2017-03-09 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置
WO2015064704A1 (ja) * 2013-10-31 2015-05-07 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析方法および表面プラズモン共鳴蛍光分析装置
EP3064928A4 (en) * 2013-10-31 2017-06-14 Konica Minolta, Inc. Detection device, detection method using said detection device, and detection chip used in said detection device
JPWO2015152198A1 (ja) * 2014-03-31 2017-04-13 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析方法、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および位置合わせ方法
WO2015152198A1 (ja) * 2014-03-31 2015-10-08 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン共鳴蛍光分析方法、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および位置合わせ方法
JP2018009802A (ja) * 2016-07-11 2018-01-18 コニカミノルタ株式会社 検出方法および検出装置
WO2018016383A1 (ja) * 2016-07-19 2018-01-25 コニカミノルタ株式会社 検出方法および検出装置
JPWO2018016383A1 (ja) * 2016-07-19 2019-05-09 コニカミノルタ株式会社 検出方法および検出装置
US10809198B2 (en) 2016-07-19 2020-10-20 Konica Minolta, Inc. Detection method and detection device

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