JP2013137272A - 表面プラズモン励起蛍光計測装置、およびその計測条件の設定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＳＰＦＳ法を利用する光学測定において、得られる信号のＳＮ比を高め得る技術を提供する。
【解決手段】光透過性を有する誘電体媒体の光反射面に形成された導電体膜に当該誘電体媒体側から第１励起光を照射して測定を行う表面プラズモン励起蛍光計測装置は、誘電体媒体側から光反射面に入射させたＳ偏光の第２励起光の入射角を光反射面で全反射する入射角に保持しつつ、第２励起光を光反射面において走査する投光部と、当該走査の際に第２励起光から派生した派生光を受光して測定する測定部と、測定部が派生光を測定した測定結果に基づいて、導電体膜に照射される第１励起光の照射位置を決定する決定部とを備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、表面プラズモン励起蛍光分光法を用いた計測技術に関する。

誘電体媒体の中を進む励起光が金属膜と誘電体媒体との屈折率の異なる界面で全反射された場合は、界面からエバネッセント波がしみだし、金属膜の中のプラズモンとエバネッセント波とが干渉する。界面への励起光の入射角が共鳴角に設定されプラズモンとエバネッセント波とが共鳴する場合にエバネッセント波の電場は著しく増強される。表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）又は表面プラズモン励起蛍光分光法（ＳＰＦＳ法）による計測においては、この増強された電場が用いられて、タンパク質やＤＮＡの検出等が行なわれる。

具体的には、ＳＰＲ法による計測においては、金、銀等からなる金属膜が形成された誘電体媒体に全反射条件を満たすように励起光が入射される。そして、その反射光の角度スペクトル中に現れる吸収ピークから、金属膜に接している被検出物質の屈折率あるいはその変化等の物性が測定される。該測定では、ＳＰＲが発現する入射角や、ＳＰＲが発現している入射角付近における反射光強度が、金属膜の表面上の付着物の厚さ、誘電率によって変化することが利用されている。また、金属膜の表面に付けられた捕捉物質によって被検出物質が金属膜表面付近に結合、または吸着された際に、励起光の入射角や反射率が変化する。ＳＰＲ法では、この変化を検出することにより、被検出物質の結合量（膜厚あるいは質量）を得ることもできる。

一方、ＳＰＦＳ法による計測においては、誘電体媒体上に形成された金属膜の表面に被計測物質が捕捉され、捕捉された被計測物質に、蛍光標識された蛍光標識物質が結合させられ、増強された電場は該蛍光標識に作用する。この結果、試料中に含まれる被検出物質、または該被検出物質に付された蛍光標識と、エバネッセント波との吸収、発光等の光学的な相互作用によって、蛍光標識からは表面プラズモン励起蛍光が放射される。放射された表面プラズモン励起蛍光の光量が測定されることにより、被計測物質の有無、被計測物質の捕捉量等が特定される。

とりわけここ数年、ＣＣＤ等センサーの発達など光検出器の高性能化と相まって、ＳＰＦＳ法は、バイオ研究には欠かせない手法となっている。一方、ＳＰＲ法やＳＰＦＳ法を利用する光学測定では、ユーザビリティー等の観点から血液等の被検出物質が少量であっても抗体を検出できることが求められている。このため、反応促進操作によって、捕捉物質が付着される反応流路の中央部分等の狭い抗体補足領域に、抗体が集積されて測定が行なわれる必要がある。このためには、該狭い抗体補足領域に励起光が正確に照射されて表面プラズモンによる電場増強が行なわれるように、個々のプリズムや反応場の状況に応じて励起光の入射角および位置が高精度に設定される必要がある。このため、例えば、反応流路の中央部に設けられた狭い抗体補足領域に励起光が照射されるように反応流路のサイズ等に応じて励起光の光路が設計的に求められる。そして、求められた光路に沿って励起光が照射される。

しかしながら、プリズム内部の全反射光は、反射角度が浅いため、僅かな寸法誤差、設置誤差によっても励起光の照射位置が大きくずれてしまう。このため、設計的に求められた光路に沿って励起光が照射されたとしても、反応流路の中央部の抗体補足領域に励起光を照射することは容易ではない。それどころか、励起光が反応流路の端部に当たってしまうことも珍しくない。そして、この結果、所望の表面プラズモンを発生させることができず、測定される信号のＳＮ比が低下し、良好な測定を行なうことが困難となる。

そこで、所望の表面プラズモンを発生させ得る励起光の照射に関する設定条件の実現を目的として、例えば、特許文献１〜３にそれぞれ示された技術のように、種々の構成が検討されてきた。

特開２００５−９８７８８号公報 特表２００１−５１１２４９号公報 特開２００７−０７１６１５号公報

しかしながら、特許文献１の装置は、励起光の入射角度を走査するための可動機構を排除した構成を有するが、プリズムの光学的特性のばらつきを制御することによって抑制可能なずれの範囲よりも、励起光の入射位置のずれを抑制することは困難である。

また、特許文献２の装置は、金膜面から反射する反射光の位置と角度とを測定するためのＳＰＲ装置に特有の構成を有する。該構成をＳＰＦＳ法に用いる場合には、反射光の位置を特定可能なセンサーおよび処理回路を新たに設ける必要がある。また、該装置が、金膜面に入射する励起光の位置がずれているのか角度がずれているかを正確に求めることは不可能である。

また、特許文献３の装置は、ＳＰＲ法用に、光路が見えるようプリズムに工夫を施し、光線の反射角度をモニター可能にしている。該技術は、基本的にはＳＰＦＳ法にも適応可能であるが、その場合、検査チップが複雑になるとともに、測定光と、途中の光路から入り込む光との切り分けが容易ではない。

従って、特許文献１〜３の技術を用いたとしても、ＳＰＦＳ法を利用する光学測定において、得られる信号のＳＮ比を高めることは困難であるといった問題がある。

本発明は、こうした問題を解決するためになされたもので、ＳＰＦＳ法を利用する光学測定において、得られる信号のＳＮ比を高め得る技術を提供することを目的とする。

上記の課題を解決するため、第１の態様に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置は、光透過性を有する誘電体媒体の光反射面に形成された導電体膜に当該誘電体媒体側から第１励起光を照射して表面プラズモン励起蛍光分光法により測定を行う表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、前記誘電体媒体側から前記光反射面に入射させたＳ偏光の第２励起光の入射角を前記光反射面で全反射する入射角に保持しつつ、当該第２励起光を当該光反射面において走査する投光部と、前記走査の際に前記第２励起光から派生した派生光を受光して測定する測定部と、前記測定部が前記派生光を測定した測定結果に基づいて、前記導電体膜に照射される前記第１励起光の照射位置を決定する決定部とを備えることを特徴とする。

第２の態様に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置は、第１の態様に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、前記決定部は、前記測定部が前記派生光を測定した光量の最小値に基づいて、前記照射位置を決定することを特徴とする。

第３の態様に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置は、第１または第２の態様に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、前記測定部は、前記派生光のうち蛍光波長成分のみを受光して測定することにより前記測定結果を取得することを特徴とする。

第４の態様に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置は、第１から第３の何れか１つの態様に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、前記投光部は、励起光の偏光方向を調整可能な偏光方向調整機構を備え、当該偏光方向調整機構を通過する励起光の偏光方向を調整することよって前記第１励起光と前記第２励起光とを選択的に投射することを特徴とする。

第５の態様に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置は、第１から第３の何れか１つの態様に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、前記投光部は、蛍光成分の波長を有する励起光を放射する光源を備え、当該光源からの励起光によりＳ偏光の前記第２励起光を生成することを特徴とする。

第６の態様に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置は、第３の態様に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、前記決定部は、前記測定部が前記派生光のうち蛍光波長成分のみを受光して測定することにより取得した前記測定結果に基づいて、前記第１励起光が前記誘電体媒体を通過するときに生ずる自家蛍光の光量を求めることを特徴とする。

第７の態様に係る計測条件の設定方法は、光透過性を有する誘電体媒体の光反射面に形成された導電体膜に当該誘電体媒体側から第１励起光を照射して表面プラズモン励起蛍光分光法により測定を行う表面プラズモン励起蛍光計測装置の計測条件の設定方法であって、前記誘電体媒体側から前記光反射面に入射させたＳ偏光の第２励起光の入射角を前記光反射面で全反射する入射角に保持しつつ、当該第２励起光を当該光反射面において走査する投光ステップと、前記走査の際に前記第２励起光から派生した派生光を受光して測定する測定ステップと、前記測定ステップにおいて前記派生光が測定された測定結果に基づいて、前記導電体膜に照射される前記第１励起光の照射位置を決定する決定ステップと、を備えることを特徴とする。

第１から第７の何れの態様に係る発明によっても、Ｓ偏光の第２励起光が、光反射面で全反射する入射角で光反射面において走査され、当該走査の際に第２励起光から派生した派生光の測定結果に基づいて第１励起光の照射位置が決定される。当該派生光の光量は導電体膜に対して誘電体媒体と反対側の構成物の影響をほとんど受けることがないため、当該照射位置は、測定領域の中心により近い位置に決定され得る。従って、決定された照射位置に第１励起光が照射されることにより発生する表面プラズモン励起蛍光の光量に係る信号のＳＮ比が高められ得る。

実施形態に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置の構成の一例を示す模式図である。 レーザーダイオードユニットの構成例を示す模式図である。 第１整波器の構成例を示す模式図である。 偏光方向調整機構の構成例を示す模式図である。 入射角調整機構の構成例を示す模式図である。 測定光光学系の構成例を示す模式図である。 反応領域、測定領域及び照射領域の関係を示す平面図である。 検査チップの断面図の一例である。 検査チップの断面図の一例である。 励起光の入射角と散乱光の光量との関係の一例を表現したグラフを示す図である。 第１励起光が分析チップに照射される様子を説明する模式図である。 第２励起光が分析チップに照射される様子を説明する模式図である。 反射面に照射される励起光の断面形状を説明するための模式図である。 反射面に照射される励起光の断面形状を説明するための模式図である。 複屈折物質を通過する励起光の偏光状態の変化の一例を示す図である。 励起光の照射領域と、流路の端部との位置関係の一例を示す図である。 励起光の照射領域と、流路の端部との位置関係の一例を示す図である。 第２励起光の走査時に測定される自家蛍光の光量について説明するための図である。 第２励起光の走査時に測定される自家蛍光光量と第２励起光の照射位置との関係の一例を表現したグラフを示す図である。 計測装置の動作フローの一例を示す図である。 計測装置の動作フローの一例を示す図である。 計測装置の動作フローの一例を示す図である。 計測装置の動作フローの一例を示す図である。

以下、本発明の一実施形態を図面に基づいて説明する。図面では同様な構成および機能を有する部分に同じ符号が付され、下記説明では重複説明が省略される。また、各図面は模式的に示されたものであり、例えば、各図面における表示物のサイズおよび位置関係等は必ずしも正確に図示されたものではない。

＜Ａ．実施形態＞
＜Ａ−１．表面プラズモン励起蛍光計測装置の構成＞
（表面プラズモン励起蛍光計測装置の概略）
図１は、実施形態に係る表面プラズモン励起蛍光計測装置の構成の一例として計測装置１０００を示す模式図である。計測装置１０００は、投光部１９１０、分析チップ１００６、測定部１９１２、送液機構１０１４、分析チップ搬送機構１０２２、制御演算部１０２６、およびディスプレイ１０２４を主に備えて構成されている。投光部１９１０は、レーザーダイオードユニット１００２および励起光光学系１００４を主に備えて構成され、測定部１９１２は、測定光光学系１００８および光電子増倍管１０１０を主に備えて構成されている。

投光部１９１０は、第１励起光９００１と第２励起光９００２とを選択的に分析チップ１００６へ照射する。第１励起光９００１は、分析チップ１００６のプリズム１２０４（図９）の反射面１２０６（図９）に形成された導電体膜１２００（図９）に、プリズム１２０４の入射面１２１６（図９）から、すなわち、プリズム１２０４側から照射される。反射面１２０６は、プリズム１２０４と導電体膜１２００との界面である。また、第１励起光９００１は、反射面１２０６における測定光光学系１００８の光軸上の照射位置Ｘに照射される。なお、第１励起光９００１は、Ｐ偏光の偏光成分を主に有する励起光である。

分析チップ１００６へ第１励起光９００１が入射している間は、分析チップ１００６から第１測定光９０２１と、第１励起光９００１が反射面１２０６で反射された第１反射光９０３１とが出射される。第１測定光９０２１は、測定部１９１２において測定光光学系１００８により光電子増倍管１０１０へ導かれる。第１反射光９０３１は、光吸収体１０１２に吸収される。なお、第１励起光９００１が反射面１２０６で全反射する条件を満たす入射角（「共鳴角」）で反射面１２０６に照射されるときは、表面プラズモン共鳴が発生して表面プラズモンが励起され、第１反射光９０３１の光量は、ほぼゼロとなる。制御演算部１０２６は、投光部１９１０の入射角調整機構１０３４（図１、図５）によって第１励起光９００１の入射角θが走査された際の第１測定光９０２１の測定結果に基づいて該共鳴角を決定する。

また、第１励起光９００１が照射される照射位置Ｘの決定のために、投光部１９１０は、第２励起光９００２を分析チップ１００６に照射する。第２励起光９００２は、入射面１２１６からプリズム１２０４に入射され、全反射する入射角で反射面１２０６に照射される。そして、投光部１９１０は、第２励起光９００２の入射角を、当該全反射する入射角に保持しつつ、第２励起光９００２を反射面１２０６において走査する。当該走査の際に、分析チップ１００６からは、第２励起光９００２から派生した第２測定光９０２２（「派生光」とも称される）と、第２励起光９００２が反射面１２０６で反射された第２反射光９０３２とが出射される。第２測定光９０２２は、測定部１９１２において測定光光学系１００８により光電子増倍管１０１０へ導かれる。そして、測定部１９１２は、第２測定光９０２２を受光してその光量を測定する。また、第２反射光９０３２は、光吸収体１０１２に吸収される。なお、全反射する入射角で反射面１２０６に入射した第２励起光９００２は、そのほぼ全てが第２反射光９０３２として反射面１２０６から反射される。そして、制御演算部１０２６は、測定部１９１２が第２測定光９０２２を測定した測定結果に基づいて、導電体膜１２００に照射される第１励起光９００１の照射位置を決定する。

分析チップ１００６には、送液機構１０１４により試料液１１４２及び蛍光標識液１１４６が順次に注入される。分析チップ１００６は、測定が行われるときには、測定室１０１６に配置され、分析チップ保持機構１０１８に保持される。分析チップ１００６は、試料液１１４２又は蛍光標識液１１４６が注入されるときには、前処理室１０２０に配置される。分析チップ１００６は、分析チップ搬送機構１０２２により、前処理室１０２０から測定室１０１６へ移され、また、測定室１０１６から前処理室１０２０へ移される。分析チップ１００６は、望ましくは、計測装置１０００に対して着脱され、検体１１４８ごとに交換される。ただし、分析チップ１００６が再利用されてもよい。

計測装置１０００は、共鳴角および照射位置Ｘの決定のための上述した測定を、通常、分析チップ１００６に設けられた抗体によって試料液１１４２の抗原が捕捉され、該抗原が分析チップ１００６に注入された蛍光標識液１１４６によって蛍光標識された後に行う。しかし、該測定が、試料液１１４２が分析チップ１００６に注入された後であって蛍光標識液１１４６が分析チップ１００６に注入される前に行なわれたとしても、本発明の有用性を損なうものではない。測定部１９１２による測定結果および制御演算部１０２６による演算結果等は、ディスプレイ１０２４に表示される。また、計測装置１０００の各構成物は制御演算部１０２６により制御され、制御演算部１０２６においては各種の演算が行われる。

（制御演算部）
制御演算部（「決定部」とも称される）１０２６は、半波長板回転機構１５０２、反射鏡位置調整機構１６０４、挿抜機構１７０８、分析チップ搬送機構１０２２、送液ポンプ１０４０及び送液ポンプ搬送機構１０４４を制御する。具体的には、制御演算部１０２６は、抗体反応と、蛍光物質を付けるための反応などの検出反応工程の制御、前処理室１０２０と測定室１０１６との間でのチップの移送制御、入射角調整機構１０３４の制御、フィルター切り替えなどの各調整器等の駆動部の制御、受光量の定量化等を一元的に行う。また、制御演算部１０２６は、光電子増倍管１０１０から各種光量の測定結果を取得し、計測条件である第１励起光９００１の反射面１２０６への入射角である共鳴角および照射位置Ｘの決定などの各種の処理も行なう。制御演算部１０２６は、プログラムがインストールされたコンピューターであり、各種の測定結果等を記憶するメモリなどの不図示の記憶部を備えている。制御演算部１０２６の機能の全部又は一部がプログラムを伴わないハードウエアに担われてもよい。ハードウエアは、電子回路であってもよいし、リンク機構等の機械的機構であってもよい。

（分析チップ）
図８、図９の模式図は、分析チップ１００６の断面を示す。図８、図９に示すように、分析チップ１００６は、プリズム１２０４、導電体膜１２００、抗原捕捉体１２０８、流路形成体１２１２、および蓋部材１２１４を主に備えて構成されている。導電体膜１２００の下面は、プリズム１２０４の反射面１２０６に密着する。反射面１２０６は、プリズム１２０４と導電体膜１２００との界面である。導電体膜１２００の上面には、流路形成体１２１２の下面が接合され、流路形成体１２１２の上面に、蓋部材１２１４が接合されている。流路形成体１２１２に、導電体膜１２００と蓋部材１２１４とが接合されることにより、流路形成体１２１２に設けられた貫通孔の側面、導電体膜１２００の上面、および蓋部材１２１４の下面によって流路１２２０が形成されている。そして、流路１２２０を形成している導電体膜１２００の上面には抗原捕捉体１２０８が定着させられる。

プリズム１２０４へ導かれた第１励起光９００１（第２励起光９００２）は、入射面１２１６へ入射し、入射面１２１６へ入射した各励起光は、照射領域１８００に照射される。第１励起光９００１（第２励起光９００２）は、反射面１２０６の照射領域１８００において全反射され、第１反射光９０３１（第２反射光９０３２）として出射面１２１８から出射する。

図１１は、第１励起光９００１が分析チップ１００６に照射される様子を説明するための模式図であり、図１２は、第２励起光９００２が分析チップ１００６に照射される様子を説明するための模式図である。なお、図１１および図１２においては、分析チップ１００６のうちプリズム１２０４の反射面１２０６のみが表示され、導電体膜１２００および抗原捕捉体１２０８などの分析チップ１００６の各構成品の記載は、省略されている。

図１１に示されるように、第１励起光９００１の分析チップ１００６への照射により、表面プラズモンの散乱光９０５１と表面プラズモン励起蛍光９０６１とが、導電体膜１２００（図９）および抗原捕捉体１２０８（図９）から蓋部材１２１４（図９）側へ出射する。また、第１反射光９０３１は、光吸収体１０１２（図９）側へ射出する。自家蛍光９０４１は、第１励起光９００１がプリズム１２０４の内部を進むときに格子欠陥等により発生する蛍光である。同様に、自家蛍光９０４２は、第１反射光９０３１がプリズム１２０４の内部を進むときに格子欠陥等により発生する蛍光である。第１測定光９０２１（図１）は、自家蛍光９０４１および９０４２、散乱光９０５１、および表面プラズモン励起蛍光９０６１を主に含んでいる。

反射面１２０６に第１励起光９００１が全反射されたときに反射面１２０６からしみだすエバネッセント波と導電体膜１２００の中のプラズモンとが共鳴する場合は、導電体膜１２００によりエバネッセント波の電場が増強され、散乱光９０５１及びの表面プラズモン励起蛍光９０６１の光量が増加する。一方、第１反射光９０３１の光量は、ほぼゼロに減少し、これに伴って、自家蛍光９０４２の光量もほぼゼロに減少する。なお、プリズム１２０４と導電体膜１２００との界面である反射面１２０６から生ずるエバネッセント波の届く範囲は、ｎｍオーダーの範囲である。従って、該エバネッセント波は、測定部１９１２によって測定されない。

図１２に示される第２励起光９００２は、反射面１２０６によって全反射される入射角で分析チップ１００６に照射されている。第２励起光９００２は、Ｓ偏光の偏光状態であるため表面プラズモン共鳴を起こさず、プリズム１２０４と導電体膜１２００との界面である反射面１２０６によって略１００％反射されて第２反射光９０３２として光吸収体１０１２（図９）側へ射出する。自家蛍光９０４３は、第２励起光９００２がプリズム１２０４の内部を進むときに格子欠陥等により発生する蛍光である。同様に、自家蛍光９０４４は、第２反射光９０３２がプリズム１２０４の内部を進むときに格子欠陥等により発生する蛍光である。第２励起光９００２と第２反射光９０３２との光量は略等しいため、自家蛍光９０４３と自家蛍光９０４４との光量も略等しい。第２測定光９０２２（図１）は、自家蛍光９０４３および９０４４をおもに含んでいる。

また、図１１を参照して既述したように、第１励起光９００１が反射面１２０６で全反射する条件で照射されたときには、自家蛍光９０４２の光量は、ほぼゼロである。また、第１励起光９００１と第２励起光９００２とは、偏光方向が異なるものの、光量は互いに等しい。従って、自家蛍光９０４１が直接測定されない場合であっても、自家蛍光９０４１の光量Ｖ１は、自家蛍光９０４３および９０４４の合計光量Ｖ２が測定できれば、（１）式により求められる。

そして、制御演算部１０２６は、測定部１９１２が第２測定光９０２２（派生光）のうち蛍光波長成分のみを受光して測定した測定結果に基づいて、第１励起光９００１がプリズム１２０４を通過するときに生ずる自家蛍光の光量を（１）式によって求める。

分析チップ１００６は、望ましくは、各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍである構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物又はより大型の構造物に置き換えられてもよい。

（プリズム）
プリズム１２０４は台形柱体であり、第１励起光９００１（第２励起光９００２）の入射面１２１６、反射面（「光反射面」とも称される）１２０６及び出射面１２１８を有する。該台形柱体の一方の傾斜側面が入射面１２１６であり、台形柱体の幅広の平行側面が反射面１２０６であり、台形柱体の他方の傾斜側面が出射面１２１８である。入射面１２１６、反射面１２０６及び出射面１２１８は、入射面１２１６から入射した励起光が反射面１２０６に反射され、出射面１２１８から出射するような相互関係で配置されている。また、出射面１２１８は、入射面１２１６と同様に励起光が素通りする光学面に形成されている。従って、励起光が出射面１２１８で散乱しプリズム１２０４の内部に溜まることは無い。入射面１２１６、反射面１２０６及び出射面１２１８が備えられる限り、プリズム１２０４の外形形状が台形柱体以外でもよく、プリズム１２０４が「プリズム」の範疇に含まれない形状物に置きかえられてもよい。例えば、プリズム１２０４の外形形状が円柱体であってもよい。

また、プリズム１２０４は、第１励起光９００１（第２励起光９００２）に対して透明な材質からなる誘電体媒体である。すなわち、プリズム１２０４は、光反射面である反射面１２０６を有し、第１励起光９００１（第２励起光９００２）に対して光透過性を有する誘電体媒体である。プリズム１２０４は、ガラス、樹脂等からなる。プリズム１２０４は、望ましくは、屈折率が１．４〜１．６であって複屈折が小さい樹脂からなる。これにより、プリズム１２０４が安価に製造される。プリズム１２０４が樹脂からなる場合は、望ましくは、射出成形によりプリズム１２０４が製造される。ただし、プリズム１２０４が他の方法により製造されてもよい。

（導電体膜）
導電体膜１２００は、表面プラズモン共鳴を発生させる導電体からなる。導電体膜１２００は、望ましくは、金からなる。ただし、導電体膜１２００が、銀、銅、アルミニウム等の金属又はこれらの金属を含む合金からなってもよい。

導電体膜１２００は、薄膜である。導電体膜１２００の膜厚は、望ましくは、３０〜７０ｎｍである。ただし、導電体膜１２００の膜厚がこの範囲外であってもよい。

導電体膜１２００は、スパッタリング、蒸着、メッキ等によりプリズム１２０４の反射面１２０６に形成される。ただし、導電体膜１２００が他の方法により形成されてもよい。

（抗原捕捉体）
抗原捕捉体１２０８は、検出の対象の抗原と反応する抗体を含む非流動体からなる。したがって、試料液１１４２又は蛍光標識液１１４６が抗原捕捉体１２０８に接触しても、抗原捕捉体１２０８は移動しない。該抗体は、均一に分布する。検出の対象の抗原を含む試料液１１４２が抗原捕捉体１２０８に接触した場合は、試料液１１４２に含まれる検出の対象の抗原が抗原捕捉体１２０８に含まれる抗体と反応（「抗原抗体反応」とも称される）して結合し、抗原捕捉体１２０８に捕捉される。抗原捕捉体１２０８は、生化学反応の反応場を提供する。抗原捕捉体１２０８は、望ましくは、表面処理により導電体膜１２００の上面に定着される。抗原捕捉体１２０８が抗体を含む場合は、抗原捕捉体１２０８はタンパク質を含む。この場合は、望ましくは、抗原捕捉体１２０８に保存用の試薬が塗布される。これにより、抗原捕捉体１２０８の捕捉性能が長時間にわたって維持される。保存用の試薬は、望ましくは、抗原捕捉体１２０８の捕捉性能に影響を与えない保湿剤である。例えば、保存用の試薬は、ショ糖水溶液を主成分とする液体である。分析チップ１００６は、保存用の試薬が抗原捕捉体１２０８に塗布され乾燥させられた状態で保管される。このため、試料液１１４２が抗原捕捉体１２０８に接触させられる前には、抗原捕捉体１２０８が洗浄液１１５２で洗浄される。

（流路形成体）
流路形成体１２１２には流路１２２０が形成される。流路形成体１２１２は、望ましくは、散乱光９０５１（図１１）及び表面プラズモン励起蛍光９０６１（図１１）に対して透明な材質の粘着シートからなる。そして、流路形成体１２１２は、導電体膜１２００と蓋部材１２１４とを接合する接合媒体を兼ねる。流路形成体１２１２には、細長の貫通孔が形成されており、該貫通孔と導電体膜１２００の上面と蓋部材１２１４の下面とによって流路１２２０（「反応流路」）が形成されている。流路１２２０は、流路形成体１２１２に平行に延在する。ただし、流路形成体１２１２が粘着シート以外の弾性体からなることも許される。例えば、流路形成体１２１２が弾性シート、Ｏリング等からなることも許される。流路形成体１２１２が接合媒体でない場合は、導電体膜１２００と蓋部材１２１４とのそれぞれは接着、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ圧着等により流路形成体１２１２とそれぞれ接合される。

また、導電体膜１２００の上面のうち流路１２２０を形成する部分には、抗原捕捉体１２０８が定着され、抗原捕捉体１２０８は流路１２２０に露出する。ノズル挿入孔１２２２から試料液１１４２又は蛍光標識液１１４６が注入された場合は、それぞれ、試料液１１４２又は蛍光標識液１１４６で流路１２２０が満たされ、試料液１１４２又は蛍光標識液１１４６が抗原捕捉体１２０８に接触する。ノズル挿入孔１２２２は、蓋部材１２１４の上面に注入口１２２６を有し、注入口１２２６からノズル挿入孔１２２２に試料液１１４２及び蛍光標識液が注入される。流路形成体１２１２および蓋部材１２１４は、試料液１１４２又は蛍光標識液１１４６の飛散を防止し、抗原捕捉体１２０８に接触する試料液１１４２又は蛍光標識液１１４６の量を一定にすることに寄与する。しかし、流路形成体１２１２および蓋部材１２１４が省略され、抗原捕捉体１２０８の上に試料液１１４２又は蛍光標識液１１４６が直接的に滴下されてもよい。

（蓋部材）
蓋部材１２１４は、例えば、直方体形状を持ち、流路形成体１２１２に接合されている。蓋部材１２１４は、散乱光９０５１及び表面プラズモン励起蛍光９０６１に対して透明な材質からなる。蓋部材１２１４は、望ましくは、例えば、樹脂からなり、射出成形などにより製造される。蓋部材１２１４には、ノズル挿入孔１２２２と液溜め孔１２２４とが蓋部材１２１４を貫通して形成されている。

ノズル挿入孔１２２２の一端は、流路１２２０に開口を有し、他端は、分析チップ１００６の上面に設けられた注入口１２２６である。ノズル挿入孔１２２２は、流路形成体１２１２の流路１２２０に対して垂直に延在する。ただし、流路１２２０とノズル挿入孔１２２２とは、異なる方向に延在すればよく、必ずしも相互に垂直に延在しなくてもよい。

液溜め孔１２２４の一端は、流路１２２０に開口を有し、他端は、分析チップ１００６の上面に設けられた開口である。

蓋部材１２１４が、流路形成体１２１２に接合されることにより、ノズル挿入孔１２２２、流路１２２０、および液溜め孔１２２４には、検出の対象の抗原を含む試料液１１４２が流され得る状態となる。また、分析チップ１００６は、望ましくは、流路１２２０が水平方向に延在し、ノズル挿入孔１２２２及び液溜め孔１２２４が鉛直方向に延在するように保持される。これにより、流路１２２０から液体がこぼれにくくなる。また、互いに別体である流路形成体１２１２と蓋部材１２１４とが接合されることにより、流路１２２０とノズル挿入孔１２２２とが形成された構造物の製造が容易になる。ただし、流路形成体１２１２及び蓋部材１２１４が流路１２２０とノズル挿入孔１２２２とが形成された一体の構造物へ置き換えられてもよい。

（レーザーダイオードユニット）
図２の模式図は、レーザーダイオードユニットの構成例を示す。図２に示すように、レーザーダイオードユニット１００２においては、レーザーダイオード（「ＬＤ」とも称される）１３００から放射されたビーム９０１０がビームスプリッタ１３０２により主ビーム９０１２と副ビーム９０１４とに分割される。主ビーム９０１２は、コリメータ１３０４によりコリメート化され、レーザーダイオードユニット１００２から励起光９０００として放射される。

図１３および図１４は、反射面１２０６に照射される第１励起光９００１（第２励起光９００２）の断面形状について説明するための模式図である。

励起光９０００がコリメート化されても励起光９０００のビームの断面形状９２は扁平な楕円形である。また、該ビームの偏光方向は、概ね一方に偏っている。偏光方向が、該楕円の長辺に出るか短辺に出るかはレーザーダイオードの種類によって異なる。第１励起光９００１（第２励起光９００２）は、励起光９０００の偏光方向が偏光方向調整機構１０３０によってそれぞれ調整された励起光である。そして、第１励起光９００１（第２励起光９００２）が全反射する条件で反射面１２０６に照射されるときの反射面１２０６における照射領域１８００の平面形状９４は、円形に近いことが望ましい。そこで、第１励起光９００１（第２励起光９００２）の断面形状９２の楕円形の短軸が、反射面１２０６に照射される第１励起光９００１（第２励起光９００２）の光路を含み、かつ、反射面１２０６に垂直な面に含まれるようにレーザーダイオード１３００の姿勢が調整される。なお、該短軸は、断面形状９２の方向８０２０に沿った軸である。そして、姿勢が調整されたレーザーダイオード１３００は、レーザーダイオード保持機構１３０６により保持される。

レーザーダイオード１３００から放射されるレーザー光（励起光）の波長及び光量が温度に依存する場合は、望ましくは、レーザーダイオード１３００が温度調整回路１３０８に制御される。温度調整回路１３０８においては、副ビーム９０１４の光量がフォトダイオード１３１０により測定され、副ビーム９０１４の光量の測定結果が一定に維持されるようにレーザーダイオード１３００へ供給される電力が電力供給制御回路１３１２により回帰制御される。これにより、レーザーダイオード１３００の温度が一定に維持され、第１励起光９００１（第２励起光９００２）の波長及び光量が一定に維持される。フォトダイオード１３１０がフォトトランジスタ、フォトレジスタ等の他の光量センサに置き換えられてもよい。第１励起光９００１の波長は共鳴角及びエバネッセント波のしみだし量に影響するので、温度調整回路１３０８は抗原の検出の精度及び感度の向上に寄与する。

レーザーダイオード１３００の温度が定常温度になるまでに長時間を要する場合は、計測装置１０００の運転が開始されたときからレーザーダイオード１３００へ電力が常時供給される。レーザーダイオード１３００から放射される励起光の偏光方向は、概ね、特定の方向に偏在する。レーザーダイオード１３００が発光ダイオード、水銀灯、レーザーダイオード以外のレーザー等の他の光源に置き換えられてもよい。光源から放射される光がビームでない場合は、レンズ、鏡、スリット等により光がビームに変換される。光源から放射される光が単色光でない場合は、回折格子等により光が単色光に変換される。光源から放射される光が直線偏光でない場合は、偏光子等により光が直線偏光に変換される。

（励起光光学系）
図１に示すように、励起光９０００は、励起光光学系１００４によりレーザーダイオードユニット１００２から分析チップ１００６へ導かれる間に、第１整波器１０２８、偏光方向調整機構１０３０、整形光学系１０３２及び入射角調整機構１０３４を順次に通過する。励起光９０００が第１整波器１０２８を通過するときに励起光９０００が整波される。励起光９０００が偏光方向調整機構１０３０を通過するときに、主にＰ波の偏光方向を有する第１励起光９００１と、主にＳ波の偏光方向を有する第２励起光９００２とが選択的に反射面１２０６に照射されるように励起光９０００の偏光方向が調整される。第１励起光９００１（第２励起光９００２）が整形光学系１０３２を通過するときに第１励起光９００１（第２励起光９００２）のビームの断面形状がスリット、ズーム光学系等により整形される。第１励起光９００１（第２励起光９００２）が入射角調整機構１０３４を通過するときに反射面１２０６へのこれらの励起光の入射角が調整される。

（第１整波器）
図３の模式図は、第１整波器の構成例を示す。図３に示すように、励起光９０００は、第１整波器１０２８を通過するときに、第１バンドパスフィルタ１４００、直線偏光フィルタ１４０２及び減光フィルタ１４０４を順次に通過する。第１整波器１０２８がこれら以外の光学フィルタを備えてもよい。第１整波器１０２８が光学フィルタ以外の光学素子を備えてもよい。

励起光９０００が第１バンドパスフィルタ１４００を透過するときに、励起光９０００の波長の分布が狭められる。これにより、レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の波長の分布が広くても、波長の分布が狭い励起光９０００が得られる。レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の波長の分布が十分に狭い場合は、第１バンドパスフィルタ１４００が省略されてもよい。

励起光９０００が直線偏光フィルタ１４０２を透過するときに、励起光９０００の偏光方向の分布が狭められる。これにより、レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の偏光方向の分布が広くても、偏光方向の分布が狭い励起光９０００が得られる。レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の偏光方向の分布が十分に狭い場合は、直線偏光フィルタ１４０２が省略されてもよい。

励起光９０００が減光フィルタ１４０４を透過するときに、励起光９０００の光量が減少させられる。レーザーダイオードユニット１００２から放射された励起光９０００の光量が適切である場合は、減光フィルタ１４０４が省略されてもよい。

（偏光方向調整機構）
図４の模式図は、偏光方向調整機構の構成例を示す。図４に示すように、偏光方向調整機構１０３０においては、半波長板１５００に垂直な回転軸の周りに半波長板１５００が半波長板回転機構１５０２により回転させられる。半波長板回転機構１５０２は、ロータリーステッピングモータ等により半波長板１５００を自転させる。半波長板１５００を透過する励起光９０００の偏光方向は、半波長板１５００の回転角に応じて変更される。より詳細には、励起光９０００の偏光方向が半波長板１５００によって変更されることによって、反射面１２０６に照射される励起光の偏光方向は、Ｐ波（Ｐ偏光）の偏光状態からＳ波（Ｓ偏光）の偏光状態にまで自在に変更される。励起光９０００を、主にＰ波の偏光方向を有する第１励起光９００１と、主にＳ波の偏光方向を有する第２励起光９００２とのそれぞれに変換するための半波長板１５００の各回転角は、予め特定されて制御演算部１０２６に記憶されている。Ｐ偏光の偏光状態に対応した半波長板１５００の回転角は、例えば、ロータリーステッピングモータを原点から１ステップずつ順次回転させたときの、各回転角における光電子増倍管１０１０の出力のうち最大値に対応した回転角によって設定される。また、Ｓ偏光の偏光状態に対応した半波長板１５００の回転角は、Ｐ偏光に対応した回転角から４５度ずれた回転角によって設定される。そして、偏光方向調整機構１０３０は、制御演算部１０２６の制御に従って、第１励起光９００１と第２励起光９００２とが選択的に反射面１２０６に照射されるように励起光９０００の偏光方向を調整する。すなわち、投光部１９１０は、励起光９０００の偏光方向を調整可能な偏光方向調整機構１０３０を備え、偏光方向調整機構１０３０を通過する励起光の偏光方向を調整することよって第１励起光９００１と第２励起光９００２とを選択的に投射することができる。

反射面１２０６に第１励起光９００１が入射されると、反射面１２０６からのエバネッセント波のしみだしが最大になり、第２励起光９００２が入射されると、反射面１２０６からのエバネッセント波のしみだしがなくなる。半波長板１５００が用いられることにより、反射面１２０６上の励起光の照射領域１８００の形状を変更することなく、偏光方向だけが変えられる。初期状態においては、例えば、反射面１２０６に第１励起光９００１が照射されるように半波長板１５００の回転角が設定される。なお、偏光方向調整機構１０３０が、例えば、光軸の周りにレーザーダイオードユニット１００２又はレーザーダイオード１３００を回転させる機構などに置き換えられてもよい。

また、互いに異なる光源から生成された第１励起光９００１と第２励起光９００２とが互いに同じ入射光路によって反射面１２０６に照射されるように投光部１９１０が構成されたとしても、本発明の有用性を損なうものではない。この場合は、具体的には、例えば、Ｐ偏光の励起光を出力するＬＤユニットと、Ｓ偏光の励起光を出力するＬＤユニットとが用いられる。そして、各ＬＤユニットからそれぞれ出射された各励起光が、互いに異なる方向からダイクロイックプリズムにそれぞれ入射された後、同一の光路によってダイクロイックプリズムから出射される構成などが採用される。光源が互いに異なることにより第１励起光９００１と第２励起光９００２との分光強度分布などの光学的特性が異なったとしても、該特性の違いが予め把握されていれば、該特性の違いを補正することができる。各励起光の反射面１２０６における照射位置のばらつきの主な要因は、プリズム１２０４の取付状態（取り付き位置・角度）の誤差、部品状態の誤差（角度誤差・寸法誤差）などである。該光学的特性の差異が補正されきらなかったとしても、該補正の残差が該照射位置の決定処理に与える影響は、相対的に小さくなる。従って、上述したように、互いに異なる光源から第１励起光９００１と第２励起光９００２とがそれぞれ生成されたとしても、各励起光の特性の違いを補正することによって、該照射位置の調整が精度よく行われ得る。

なお、第１励起光９００１と第２励起光９００２とが互いに異なる光源から出射される場合には、第２励起光９００２は、第１励起光９００１と同じ励起光の波長である必要は無い。例えば、第２励起光９００２用の光源として蛍光波長の励起光を放射するレーザーダイオードが採用された場合には、測定部１９１２によって測定される第２測定光９０２２の光量は、より大きくなる。従って、該測定光量の信号のＳＮ比が向上し、励起光の照射位置の決定精度が高められ得る。従って、投光部１９１０が、蛍光成分の波長を有する励起光を放射する光源を備え、当該光源からの励起光によりＳ偏光の第２励起光９００２を生成したとしても本発明の有用性を損なうものではない。

（整形光学系）
図１に示される整形光学系１０３２は、第１励起光９００１（第２励起光９００２）のビームサイズやその輪郭形状を照射面上の照射形状に合わせて整形する光学系である。整形光学系１０３２としては、例えば、ビームエキスパンダ、ビームエクスパンダにズーム機能がついたズーム・ビームエキスパンダなどが採用され得る。また、他にも、スリットなど各種の構成が採用され得る。

（入射角調整機構）
図５の模式図は、入射角調整機構の構成例として入射角調整機構１０３４を示す。図５に示すように、第１励起光９００１（第２励起光９００２）は、入射角調整機構１０３４を通過するときに反射鏡１６００に反射される。そして、これらの励起光の進行方向は、第１方向８０１６から分析チップ１００６へ向かう第２方向８０１８へ屈曲させられる。入射角調整機構１０３４は、反射鏡１６００の姿勢および位置を調整することによって、第１励起光９００１（第２励起光９００２）の反射面１２０６に入射する入射角および反射面１２０６における照射位置を調整することができる。

入射角が調整される場合は、反射鏡角度調整機構１６０２により反射鏡１６００の角度が調整される。そして、該調整の際に、入射角の変化によって反射面１２０６における励起光の照射位置の移動をキャンセルするように反射鏡位置調整機構１６０４により反射鏡位置が調整される。これにより、入射角のみが調整され、反射面１２０６における励起光の照射位置が維持される。

第１励起光９００１の反射面１２０６に対する入射角の決定のために、入射角調整機構１０３４は、反射面１２０６に照射された第１励起光９００１の照射位置を変えることなく入射角を走査する。

反射面１２０６における励起光の照射位置が調整される場合は、反射鏡１６００の反射面１２０６への入射角が固定され、反射鏡位置調整機構１６０４により反射鏡１６００の位置が調整される。この調整の際に、反射鏡１６００は、レーザーダイオードユニット１００２から入射角調整機構１０３４に至る励起光の進行方向である第１方向８０１６に沿って直線的に移動される。そして、この調整により、該照射位置のみが調整され、入射角は維持される。

なお、該照射位置の決定の際には、入射角調整機構１０３４は、プリズム１２０４側から反射面１２０６に入射させた第１励起光９００１の入射角を反射面１２０６で全反射する入射角に保持しつつ、第２励起光９００２を反射面１２０６において走査する。

第１励起光９００１（第２励起光９００２）が入射面１２１６へ導かれない遮断状態に入射角調整機構１０３４がされる場合は、反射鏡角度調整機構１６０２により反射鏡角度が調整され、反射鏡１６００の光吸収面に励起光が当てられる。なお、反射鏡１６００の背面は、無反射光吸収物質が張り付けられた光吸収面となっている。各励起光が入射面１２１６へ導かれる非遮断状態に入射角調整機構１０３４がされる場合は、反射鏡角度調整機構１６０２により反射鏡角度が調整され、反射鏡１６００の鏡面に各励起光が当てられる。反射鏡角度調整機構１６０２以外の機構により遮断状態と非遮断状態とが切り替えられてもよい。例えば、励起光９０００の光路に光吸収体が挿抜されてもよい。

反射鏡１６００としては、例えば、多層膜反射鏡が採用されることが望ましい。多層膜反射鏡は、入射光が反射される際に位相角の変動等を起こしにくい反射鏡である。通常の金属反射鏡等は、反射される励起光の偏光角が回転していまい、Ｐ波成分のみを有する励起光が照射されたとしても、反射光にはＳ波成分も含まれる場合がある。しかし、多層膜反射鏡が採用されれば、偏光角の回転が防止され得る。多層膜反射鏡においては、多層膜反射鏡を構成する各層の層厚が薄くされることによって層数が増やされれば、より広い角度範囲で位相のずれが防止され得る。

上述したように、反射鏡１６００の背面には無反射光吸収物質が張り付けられている。そして、反射鏡１６００の姿勢が調整され、第１励起光９００１（第２励起光９００２）が該無反射光吸収物質に照射されれば、レーザーダイオードユニット１００２の電源が遮断されない場合でも各励起光の外部への漏れが防止される。レーザーダイオードユニット１００２の電源がＯＮ／ＯＦＦされると、照射される励起光の状態を安定させるための時間がどうしても必要となる。反射鏡１６００の背面に設けられた無反射光吸収物質により励起光９０００の吸収が可能であれば、レーザーダイオードユニット１００２に常時電源が供給されつつ、必要に応じて、反射鏡１６００からの励起光９０００の照射が停止され得る。従って、ユーザビリティーの観点から、より望ましい構成となる。

反射鏡角度調整機構１６０２は、ロータリーステッピングモータ等により鏡面に平行な回転軸の周りに反射鏡１６００を自転させ、反射鏡角度を調整する。反射鏡位置調整機構１６０４は、リニアステージ等の上においてリニアステッピングモータ等により励起光９０００の光軸に沿った第１方向８０１６に沿って反射鏡角度調整機構１６０２とともに反射鏡１６００を移動させ、反射鏡位置を調整する。

入射角調整機構１０３４には、励起光が反射面１２０６に照射される際の入射角及び照射位置を、簡単な機構によって調整できるという利点がある。ただし、レーザーダイオードユニット１００２の位置及び姿勢を調整する機構により該入射角及び該照射位置が調整されてもよい。又は、分析チップ１００６の位置及び姿勢を調整する機構により該入射角及び該照射位置が調整されてもよい。

（測定光光学系）
図６の模式図は、測定光光学系の構成例として測定光光学系１００８を示す。図１に示されるように、分析チップ１００６から光電子増倍管１０１０側へ出射する第１測定光９０２１（第２測定光９０２２）は、測定光光学系１００８により光電子増倍管１０１０へ導かれる。そして、図６に示されるように、測定光光学系１００８においては、各測定光は、集光レンズ１７００により集光され平行光に変換されて第２整波器１７０２を通過し、結像レンズ１７０４により光電子増倍管１０１０に結像される。集光レンズ１７００及び結像レンズ１７０４は共役光学系を構成する。これにより、迷光の影響が抑制される。

第２整波器１７０２においては、フィルタ１７０６が第２バンドパスフィルタ１７１０および減光フィルタ１７１２を備えている。挿抜機構１７０８は、各測定光の光路に対するフィルタ１７０６の位置を、方向８０２２に沿って変更する。これにより、第２バンドパスフィルタ１７１０と減光フィルタ１７１２とが各測定光の光路に選択的に挿入される。なお、挿抜機構１７０８は、フィルタ１７０６を移動させることにより、第２のバンドパスフィルタ１７１０と減光フィルタ１７１２との何れをも、各測定光の光路から退出させることもできる。

なお、第２のバンドパスフィルタ１７１０と減光フィルタ１７１２との測定光の光路からの挿抜を実現するフィルタ１７０６の移動方向は、直線だけに限られない。例えば、フィルタ１７０６が自転可能に構成され、フィルタ１７０６に設けられた第２のバンドパスフィルタ１７１０と減光フィルタ１７１２とがフィルタ１７０６の自転によって測定光の光路から挿抜される構成が採用されてもよい。

光電子増倍管１０１０により表面プラズモン励起蛍光の光量が測定される場合は、第１測定光９０２１の光路から減光フィルタ１７１２が抜去される。そして、第１測定光９０２１の光路へ第２バンドパスフィルタ１７１０が挿入され、第２バンドパスフィルタ１７１０により第１励起光９００１と同じ波長の光が選択的に減衰させられる。これにより、表面プラズモン励起蛍光９０６１と散乱光９０５１とのうち散乱光９０５１が減衰され、主に表面プラズモン励起蛍光９０６１が光電子増倍管１０１０へ導かれる。その結果、抗原の検出の感度及び精度が向上する。

光電子増倍管１０１０により散乱光９０５１の光量が測定される場合は、第１測定光９０２１の光路から第２バンドパスフィルタ１７１０が抜去され、第１測定光９０２１の光路に挿抜機構１７０８により減光フィルタ１７１２が挿入される。

これにより、光電子増倍管１０１０へ導かれる表面プラズモン励起蛍光９０６１及び散乱光９０５１の光量の差が小さくなり、光量の測定が容易になる。表面プラズモン励起蛍光９０６１の光量が相対的に高感度の光電子増倍管１０１０により測定され、散乱光９０５１の光量が相対的に低感度のフォトダイオード、フォトトランジスタ、フォトレジスタ等により測定されてもよい。

なお、散乱光９０５１の光量が光電子増倍管１０１０の測定可能な光量の範囲内である場合は、フィルタ１７０６が第２バンドパスフィルタ１７１０と減光フィルタ１７１２とのうち第２バンドパスフィルタ１７１０のみを備えて構成されてもよい。この場合において、表面プラズモン励起蛍光９０６１の光量が測定される場合は、挿抜機構１７０８により第１測定光９０２１の光路に第２バンドパスフィルタ１７１０が挿入される。また、散乱光９０５１の光量が測定される場合は、第１測定光９０２１の光路から第２バンドパスフィルタ１７１０が抜去される。ところで、散乱光９０５１の方が、表面プラズモン励起蛍光９０６１よりも、通常、１００倍〜数千倍程度、絶対的な光量が多い。従って、散乱光９０５１の光量が測定される場合に、表面プラズモン励起蛍光９０６１も測定されたとしても、その光量は無視できるので、この構成が採用されたとしても本発明の有用性を損なうものではない。

（光電子増倍管）
第１励起光９００１（第２励起光９００２）の光量は光電子増倍管１０１０により測定される。光電子増倍管１０１０には感度及び信号対雑音比が良好であるという利点がある。ただし、光電子増倍管１０１０が冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ等の他の光量センサに置き換えられてもよい。

（送液機構）
図１に示すように、送液機構１０１４により流路１２２０へ試料液１１４２が注入されるときは、分析チップ１００６及び試薬チップ１０３６が前処理室１０２０に配置される。また、送液ポンプ１０４０により試薬チップ１０３６の希釈容器１０４２から試料液１１４２が吸引され、送液ポンプ１０４０が送液ポンプ搬送機構１０４４により搬送され、送液ポンプ１０４０により注入口１２２６へ試料液１１４２が吐出される。

送液機構１０１４により流路１２２０へ蛍光標識液１１４６が注入されるときも、分析チップ１００６及び試薬チップ１０３６が前処理室１０２０に配置される。また、送液ポンプ１０４０により試薬チップ１０３６の蛍光標識液容器１０４６から蛍光標識液１１４６が吸引され、送液ポンプ１０４０が送液ポンプ搬送機構１０４４により搬送され、送液ポンプ１０４０により注入口１２２６へ蛍光標識液１１４６が吐出される。

分析チップ１００６を前処理室１０２０へ退避させてから試料液１１４２又は蛍光標識液１１４６を分析チップ１００６へ注入することは、光学測定を阻害する構成物を測定室１０１６から排除し測定室１０１６の汚染を抑制することに寄与する。ただし、前処理室１０２０への退避が省略されてもよい。

検体１１４８が希釈されるときには、試薬チップ１０３６が前処理室１０２０に配置される。そして、送液機構１０１４により、検体容器１０４８から希釈容器１０４２へ検体１１４８が送液され、希釈液容器１０５０から希釈容器１０４２へ希釈液１１５０が送液され、試料液１１４２が調製される。送液ポンプ１０４０は、必要に応じて、洗浄液容器１０５２に収容された洗浄液１１５２で洗浄される。検体１１４８が希釈されずに検体１１４８がそのまま試料液１１４２になる場合もある。また、希釈に加えて又は希釈に代えて、血球分離、試薬の混合等の他の前処理が行われてもよい。

検体１１４８は、典型的には、血液等の人間からの採取物であるが、人間以外の生物からの採取物であってもよく、非生物からの採取物であってもよい。蛍光標識液１１４６は、検出対象の抗原と結合し蛍光標識された蛍光標識抗体を含む。流路１２２０へ注入される注入物は典型的には液体であるが気体又は流動性を有する固体であってもよい。送液ポンプ１０４０を送液元から送液先へ搬送する送液機構１０１４に代えて、チューブにより試料液１１４２及び蛍光標識液１１４６を送液する機構が設けられてもよい。

（反応領域、測定領域及び照射領域の関係）
図７の模式図は、反射面１２０６における照射領域、測定領域及び反応領域の望ましい関係を示す平面図である。照射領域１８００は、第１励起光９００１（第２励起光９００２）が照射される領域である。測定領域１８０２は、第１測定光９０２１（第２測定光９０２２）の光量が光電子増倍管１０１０により測定される領域である。反応領域１８０４は、抗原捕捉体１２０８が設けられ、抗原捕捉体１２０８に含まれる抗体と抗原とが結合する領域である。照射領域１８００及び測定領域１８０２の平面形状は、望ましくは、円形である。

照射領域１８００と測定領域１８０２とは、望ましくは照射領域１８００が測定領域１８０２に内包され、さらに望ましくは照射領域１８００が測定領域１８０２の中央に配置される。また、測定領域１８０２と反応領域１８０４とは、望ましくは測定領域１８０２が反応領域１８０４に内包され、さらに望ましくは測定領域１８０２が反応領域１８０４の中央に配置される。これらの関係により、第１測定光９０２１（第２測定光９０２２）の光が全て測定される。

＜Ａ−２．表面プラズモン励起蛍光測定装置の動作＞
図２０〜図２３は、計測装置１０００の動作フローの一例をそれぞれ示す図である。図２０は、抗原の検出処理の概略の動作フローＳ１を示し、図２１は、共鳴角の決定に関する図２０のステップＳ２０の動作フローを示す。また、図２２は、照射位置の決定に関する図２０のステップＳ３０の動作フローを示し、図２３は、表面プラズモン励起蛍光の測定に関する図２０のステップＳ４０の動作フローを示す。以下に、計測装置１０００の動作について、図２０〜図２３の動作フローに沿って説明する。

（抗原の検出処理の概略）
以下に、図２０を参照しつつ、計測装置１０００による抗原の検出処理の概略を説明する。抗原の検出処理の動作フローＳ１が開始されると、計測装置１０００は、予め抗原抗体反応が行なわれ、さらに、蛍光標識の付与処理がされた分析チップ１００６を前処理室１０２０から測定室１０１６に移してセットする（ステップＳ１０）。分析チップ１００６が測定室１０１６にセットされると、計測装置１０００は、第１励起光９００１の反射面１２０６への入射角を、所定の角度範囲において走査しつつ第１測定光９０２１を測定する。そして、計測装置１０００は、該測定結果に基づいて、表面プラズモンが励起される共鳴角を決定する（ステップＳ２０）。共鳴角が決定されると、計測装置１０００は、決定された共鳴角に第２励起光９００２の入射角を保持しつつ、反射面１２０６において第２励起光９００２を走査し、第２測定光９０２２を測定する。そして計測装置１０００は、該測定結果に基づいて、第１励起光９００１の照射位置を決定する（ステップＳ３０）。次に、計測装置１０００は、第１励起光９００１を決定された照射位置に共鳴角で照射し、第１測定光９０２１を測定し、該測定結果に基づいた演算により表面プラズモン励起蛍光９０６１を測定する（ステップＳ４０）。該測定が終了すると、計測装置１０００は測定結果を検体番号とともにメモリ等に記憶するとともに、ディスプレイ１０２４に表示し（ステップＳ５０）、計測装置１０００は、反射鏡１６００等の各可動部を初期位置に移動させて動作フローＳ１を終了する（ステップＳ６０）。

（共鳴角の決定処理の詳細）
以下に、図２１のステップＳ２０の動作フローを参照しつつ、計測装置１０００が行う共鳴角の決定処理を詳しく説明する。第１励起光９００１が、反射面１２０６により全反射される場合、すなわち、共鳴角で反射面１２０６に照射される場合の第１励起光９００１と反射面１２０６とがなす角度は浅い。また、第１励起光９００１は、分析チップ１００６に対して相対的に遠くの反射鏡１６００からプリズム１２０４に照射される。一方、検体の量を減らすというユーザビリティーの観点からは抗体と抗原との反応領域である抗原捕捉体１２０８は小さいことが通常である。このため、共鳴角の決定には、秒オーダーの精度が必要となる。

既述したように、第１励起光９００１が反射面１２０６に投射される際の共鳴角は、プリズム１２０４の光学的特性の他に、導電体膜１２００の厚みおよび密度、反応物質の物理量および屈折率ｎなどによっても変動する。表面プラズモン励起蛍光９０６１（図１１）は光量が小さく、測定される信号のＳＮ比が悪い。また、抗原捕捉体１２０８に捕捉された物質の差異により表面プラズモン励起蛍光９０６１の光量自体にもばらつきがある。従って、表面プラズモン励起蛍光９０６１の測定によって十分な精度で共鳴角を求めることは容易ではない。

一方、表面プラズモンが励起されると、第１反射光９０３１（図１１）は基本的に無くなる。そして、第１励起光９００１の入射角が、共鳴角を中心とする一定の角度範囲で走査された場合には、第１反射光９０３１の反射面１２０６における反射率は、入射角の走査に応じて０％〜１００％までダイナミックに変動する。そこで、従来は、第１反射光９０３１の反射率が０％になる角度を基準として所定の角度が加算されることにより共鳴角が求められていた。しかし、第１反射光９０３１の反射率が０％になる角度と実際の共鳴角との間には角度差があり、該角度差にもばらつきがあるため、第１反射光９０３１を測定して共鳴角を決定したとしても、共鳴角を精度良く求めることは容易ではない。

図１０は、第１励起光９００１の入射角と、表面プラズモンの散乱光９０５１（図１１）の光量との関係の一例を表現したグラフ８１を示す図である。第１励起光９００１は、反射面１２０６における照射位置を維持されたままで、反射面１２０６への入射角が変更されている。そして、各入射角に対する散乱光９０５１の各測定値がグラフ８１として示されている。散乱光９０５１は、第１励起光９００１と同じ波長のラマン散乱光であり、局所プラズモンにより増強される。第１励起光９００１の波長は、例えば、６３０ｎｍ〜６４０ｎｍである。また、第２バンドパスフィルタ１７１０が通過させる光の波長域は、例えば、散乱光９０５１の波長域＋２５ｎｍ〜当該波長域＋３５ｎｍ程度に設定される。図１０に示されるように、散乱光９０５１の光量は、共鳴角θｒにおいて、最大値を示す。なお、散乱光９０５１の光量は、表面プラズモン励起蛍光９０６１に比べて、例えば、１００倍〜数千倍程度光量が大きい。従って、散乱光９０５１の光量は、共鳴角を精度良く決定するために十分な光量となっている。従って、散乱光９０５１を測定することにより精度よく共鳴角が決定され得る。

そこで、計測装置１０００においては、表面プラズモンの散乱光９０５１が用いられて、散乱光９０５１の反射面１２０６への入射角が逐次に増加または減少されることにより、すなわち、該入射角が走査されることによって共鳴角が決定される。

なお、第１励起光９００１が分析チップ１００６に照射されると、より厳密には、表面プラズモンの散乱光以外に、表面プラズモンの表面拡散光も分析チップ１００６から出射される。該散乱光と該表面拡散光とのそれぞれの波長は、励起波長である。該散乱光は表面プラズモンが励起される条件でのみ金属薄膜の表面の細かな凸凹や欠陥によって増強され散乱を発生させる。一方、該表面拡散光は、該散乱光を生ずる欠陥よりも少し荒いレベルの表面欠陥により常時発生する。散乱光と表面拡散光とは、同時に測定されるが、測定結果から両者の光量を切り分けることは、一般的に困難である。しかし、表面拡散光の光量は第１励起光９００１の入射角に関わらず一定であるため、両者が測定されたとしても、散乱光９０５１の光量の変動を測定することができる。

計測装置１０００では、後述するステップＳ３０における照射位置の決定処理に先立って、第１励起光９００１の照射により表面プラズモン共鳴を発生させる共鳴角の決定処理が行なわれる。共鳴角の決定処理の際は、第１励起光９００１の反射面１２０６における照射位置は、計測装置１０００の設計値に基づいて求められる初期位置に設定される。該初期位置は、通常、計測装置１０００の構成品が設計通りに製作されている場合における測定部１９１２の測定領域１８０２（図７）の中心に設定される。第１励起光９００１が該初期位置に投射された場合には、プリズム１２０４の光学的特性の設計値からのずれなどによって、第１励起光９００１の照射位置が、実際の測定領域１８０２の中心から多少外れる場合もある。しかし、第１励起光９００１が全く見当外れの場所に照射されることはない。一方、第１励起光９００１の入射角が、共鳴角を中心とする一定の角度範囲で走査された場合には、図１０に示されるように、散乱光９０５１の光量は、著しく変動する。該変動の態様は、第１励起光９００１の照射位置が実際の測定領域１８０２の中心から若干ずれたとしても影響を受けない。従って、該初期位置が採用されたとしても、共鳴角の決定処理が精度良く行われ得るので、共鳴角の決定処理は、照射位置の決定処理に先立って行なわれることが望ましい。また、ステップＳ３０における照射位置の決定処理の際に、励起光の入射角が定まっていない場合には、照射位置の決定処理に膨大な時間を要する。当該理由によっても、照射位置の決定処理に先立って、共鳴角の決定処理が行なわれることが望ましい。

図２０のステップＳ２０において、共鳴角の決定処理が開始されると、図２１の動作フローに示されるように、計測装置１０００は、先ず、第２整波器１７０２を駆動させ、挿抜機構１７０８（図６）が、第２のバンドパスフィルタ１７１０（図６）を各測定光の光路から退出させる（ステップＳ２１０）。そして、挿抜機構１７０８は、減光フィルタ１７１２（図６）を測定光の光路に挿入する。なお、第１測定光９０２１が減光フィルタ１７１２によって減光されない場合の光量が、光電子増倍管１０１０が測定可能な光量の範囲に収まる場合には、減光フィルタ１７１２は測定光の光路に挿入されなくてもよい。

次に、投光部１９１０は、反射面１２０６に対する第１励起光９００１の入射角が、所定の初期角度となるように、反射鏡角度調整機構１６０２（図５）によって反射鏡１６００の角度を設定する。なお、第１励起光９００１が分析チップ１００６に照射されるように、半波長板１５００（図４）の回転角度は、予め、半波長板回転機構１５０２（図４）により調整されている。

ところで、プリズム１２０４の材質についての標準的な屈折率、プリズム１２０４の設計形状、流路１２２０に充填される流路充填液の標準的な屈折率等により、共鳴角の設計数値的な角度が特定される。一方、抗原捕捉体１２０８に補足された分子の材質や量、プリズム１２０４の設置誤差等により、表面プラズモンが励起される共鳴条件に若干のゆらぎが発生する。具体的には、プリズム１２０４等の光学的特性に起因した共鳴角のずれは、通常、±１〜２度であり、成形条件のばらつきによるプリズム１２０４の形状のばらつきに起因したずれは、通常、±１度弱の範囲である。また、抗原捕捉体１２０８に補足された分子の材質や量による共鳴角のずれは、プリズム１２０４に起因したずれに比べて小さい。従って、設計数値的な共鳴角に対する実際の共鳴角のずれの範囲は、通常、±３度程度となる。従って、散乱光９０５１の光量の変動に基づいて共鳴角を検出するために必要な入射角の走査代を考慮したとしても、共鳴角の決定に要する入射角の走査範囲は、±５度〜±１０度程度で十分である。計測装置１０００は、共鳴角の決定処理において、設計数値的な共鳴角を中心とする、例えば、±１０度以内の角度範囲において、第１励起光９００１の入射角を念入りに走査する。そして、反射面１２０６に対する第１励起光９００１の入射角の初期角度としては、例えば、当該角度範囲の上端、または、下端などが採用される。

反射面１２０６に対する第１励起光９００１の入射角が当該初期角度になるように、投光部１９１０が反射鏡１６００の角度を調整すると、第１励起光９００１が反射鏡１６００の鏡面から分析チップ１００６に照射される。そして、測定部１９１２は、測定光光学系１００８を通過する際に減光フィルタ１７１２によって減光された第１測定光９０２１を光電子増倍管１０１０で受光して光量を測定する。制御演算部１０２６は、該測定結果を取得し、入射角と対応づけてメモリ等に記憶する（ステップＳ２２０）。なお、第１測定光９０２１には、図１１に示されるように、散乱光９０５１の他に、表面プラズモン励起蛍光９０６１、自家蛍光９０４１および９０４２などが含まれるが、第１測定光９０２１のうち散乱光９０５１以外の成分の光量は十分に小さい。従って、減光フィルタ１７１２を通過した第１測定光９０２１の光量の変動を測定することにより、図１０に例示された散乱光９０５１の光量変動を測定することができる。

測定結果が記憶されると、反射鏡位置調整機構１６０４（図５）は、反射鏡角度調整機構１６０２によって、反射鏡１６００を所定のステップ角度回転させる（ステップＳ２３０）。さらに、反射鏡位置調整機構１６０４は、反射面１２０６（導電体膜１２００の下面）における第１励起光９００１の照射位置が、該ステップ角度の回転によってずれないように、反射鏡１６００の鏡面を該ステップ角度に応じて平行移動させる（ステップＳ２４０）。そして、測定部１９１２が第１測定光９０２１を受光して、その光量を測定し、当該測定結果は、制御演算部１０２６により取得され、入射角と対応づけられて記憶される（ステップＳ２５０）。

ステップ２５０での測定結果が記憶されると、制御演算部１０２６は、第１励起光９００１の入射角が走査対象の角度範囲（走査角度範囲）の端に達したか否かを判定する（ステップＳ２６０）。

ステップＳ２６０での判定の結果、第１励起光９００１の入射角が、走査角度範囲の端に達していなければ、計測装置１０００は、ステップＳ２３０以降の処理を再び行なう。ステップＳ２６０での判定の結果、第１励起光９００１の入射角が、走査角度範囲の端に達していれば、制御演算部１０２６は、これまでの入射角の走査によって、記憶された第１測定光９０２１の光量の最大値と、最小値とを求めて記憶する（ステップＳ２７０）。そして、制御演算部１０２６は、第１測定光９０２１の光量の最大値に対応する入射角を取得し、反射鏡位置調整機構１６０４は、反射鏡１６００の回転角度を当該入射角、すなわち、共鳴角に対応した回転角度に設定する（ステップＳ２８０）。なお、測定された第１測定光９０２１の光量が記憶される際には第１励起光９００１の入射角に代えて該入射角に対応した反射鏡１６００の回転角度が、該光量と対応づけられて記憶されてもよい。

（照射位置の決定処理の詳細）
第１励起光９００１が共鳴角で反射面１２０６に照射される場合であっても、測定光光学系１００８の測定領域１８０２に照射されなければ、表面プラズモン励起蛍光は観測されない。また、レンズの周辺部における光量の低下などに起因して、照射領域１８００が測定領域１８０２に内包される場合であっても、照射領域１８００が、測定領域１８０２の中心寄りであればあるほど、表面プラズモン励起蛍光９０６１の測定される光量が大きくなる。そして、表面プラズモン励起蛍光９０６１の測定信号のＳＮ比が高められる。このため、反射面１２０６における第１励起光９００１の照射位置を測定領域１８０２の中心位置にできるだけ近づける制御が必要となる。

プリズム１２０４の内部を進行する第１励起光９００１は該内部で自家蛍光９０４１および９０４２（図１１）を発生させる。この蛍光は第１励起光９００１に比べて微弱であり、その光量は検出限界近くの光量である。しかしながら、抗原捕捉体１２０８に捕捉された特定物質の濃度が低い場合には、自家蛍光の光量は、表面プラズモン励起蛍光９０６１の光量と同等レベルの光量である。表面プラズモン共鳴が発生する条件においては、第１反射光９０３１（図１１）はほとんど無くなり、自家蛍光９０４２（図１１）もほとんど無くなる。このため、表面プラズモン励起蛍光９０６１の測定においては、自家蛍光９０４１が問題となる。自家蛍光９０４１は、プリズム１２０４の内部における第１励起光９００１の光路上の各点から出射される。このため、測定される自家蛍光９０４１の光量は、第１励起光９００１が、測定部１９１２の視野空間に入ってから反射面１２０６に達するまでの光路長（入射側光路長）の長さに応じて増加する。表面プラズモン励起蛍光９０６１の光量を求める際に、予め求められた自家蛍光９０４１の光量を用いた補正が行なわれる。該補正に用いられる自家蛍光９０４１の光量を安定させるためには、第１励起光９００１の照射位置を安定させることが重要となる。従って、表面プラズモン励起蛍光９０６１の測定信号のＳＮ比と安定性とを向上させるためには、第１励起光９００１の照射位置を、測定領域１８０２のできる限り中心において安定させることが重要となる。

図１６および図１７は、反射面１２０６において走査される第１励起光９００１の照射領域と、流路１２２０の端面１２３０および１２３２との位置関係の一例を示す図である。第１励起光９００１は、方向８０２２（図１７）に沿って走査されている。図１６に示される例では、第１励起光９００１の照射領域１８００ａおよび１８００ｃが、位置１１および１２にそれぞれ位置している。測定領域１８０２の形状は、直径Ｄ１の円形である。照射領域１８００ａ上に、端面１２３０が存在し、照射領域１８００ｃ上には、端面１２３２が存在している。図１７に示される例では、第１励起光９００１の照射領域１８００ｂは、測定領域１８０２の中心Ｃ１に位置しており、流路１２２０の何れの端面も、照射領域１８００ｂ上には無い。

表面プラズモンが発生すると、既述したように、格子欠陥等により散乱光９０５１が発生する。流路１２２０の端面１２３０および１２３２が存在しなければ、散乱光９０５１の光量は、第１励起光９００１の照射位置が測定領域１８０２の中心であるときに最も大きく、中心から外れれば外れるほど散乱光９０５１の光量は小さくなる。

しかしながら、図１６に示されるように、第１励起光９００１が、反射面１２０６のうち流路１２２０の端面の下の部分に当たる場合は、散乱光９０５１が流路の端面に当たり、散乱光９０５１の光量が著しく増加することが確かめられた。また、該端面が、照射領域１８００上にあるが、測定領域１８０２に含まれない場合でも、該端面における散乱光９０５１の増加の影響は、測定領域１８０２にも及び、測定される散乱光９０５１の光量が増加することが確かめられた。そして、この場合には、測定される散乱光９０５１の光量は、第１励起光９００１の照射位置が測定領域１８０２の中心にあるときよりも、流路１２２０の端面部分にあるときの方が大きくなることも確かめられた。従って、第１励起光９００１が共鳴角を維持されたまま反射面１２０６において流路の端面を含む所定の範囲で走査され、散乱光９０５１の強度が測定されたとしても、該照射位置が測定領域１８０２の中心に位置しているか否かを正しく判定することは容易ではない。すなわち、流路の端面からの影響により、表面プラズモンの散乱光９０５１の測定光量によって第１励起光９００１の照射位置が測定領域１８０２の中心に正しく位置しているか否かを判定することは、容易ではない。

そこで、計測装置１０００では、第１励起光９００１の照射位置を測定領域１８０２の中心部に設定するために、Ｓ偏光の第２励起光９００２を反射面１２０６に対して共鳴角の入射角で照射する。そして、計測装置１０００は、当該入射角を維持しつつ第２励起光９００２を反射面１２０６において走査し、走査の際の第２測定光９０２２の光量を測定することにより、第１励起光９００１の照射位置を決定する。

共鳴角で照射されたＳ偏光の第２励起光９００２は表面プラズモン共鳴を起こさず、プリズム１２０４と導電体膜１２００との界面である反射面１２０６（導電体膜１２００の下面）で略１００％反射される。そして、導電体膜１２００から測定部１９１２側に出射する光は、基本的には、無くなる。しかし、プリズム１２０４の中を第２励起光９００２が通るときに、媒体中の格子欠陥等のために自家蛍光９０４３（図１２）が第２励起光９００２の光路上の各点から出射される。同様に、第２励起光９００２が反射された第２反射光９０３２の光路上の各点からも同様に自家蛍光９０４４が出射される。一部の例外を除き、略全ての物質において、自家蛍光が発生する。特に、一般的なプラスチックプリズムにおいては、発生する自家蛍光の光量はかなり多くなる。自家蛍光９０４３（９０４４）は、プリズム１２０４の内部で発生する散乱光である。このため、自家蛍光９０４３（９０４４）の光量は、導電体膜１２００の上部にある流路端面等の構造物の影響を受けない。すなわち、第１励起光９００１の照射により発せられる表面プラズモンの散乱光９０５１と異なり、自家蛍光９０４３（９０４４）の光量は、Ｓ偏光の第２励起光９００２が反射面１２０６のうち流路の端面の下部分に当たったとしとも変動することはない。

導電体膜１２００の厚みが厚ければ、自家蛍光９０４３（９０４４）は、導電体膜１２００の上面にまで達しない。しかしながら、表面プラズモン共鳴を発生させるために、導電体膜１２００の膜厚は、例えば、３０ｎｍ〜数十ｎｍなど、一般的なレンズのコーティング膜と同レベルの非常に薄い膜厚に設定される。従って、導電体膜１２００は、自家蛍光９０４３（９０４４）に対して、ある程度の透過率を持つ。該透過率は、数％程度であるが、プリズム１２０４内部で発生したＳ偏光の第２励起光９００２からの自家蛍光９０４３および９０４４は、導電体膜１２００に対してプリズム１２０４の反対側まで導電体膜１２００を透過する。そして、光電子増倍管１０１０による自家蛍光９０４３（９０４１）の測定が可能となる。なお、第１励起光９００１が照射された際に発せられる自家蛍光９０４１も同様に測定され得る。

図１８は、第２励起光９００２の走査時に観測される自家蛍光９０４３および９０４４（図１２）、すなわち、第２測定光９０２２（図１）の光量について説明するための図である。また、図１９は、第２励起光９００２の走査時に観測される自家蛍光９０４３および９０４４の光量と、測定領域１８０２の中心Ｃ１（図１８）から第２励起光９００２の照射位置までの距離との関係の一例を表現したグラフ８３を示す図である。

図１８においては、測定室１０１６（図１）にセットされた分析チップ１００６と、集光レンズ１７００とが、測定光光学系１００８の光軸と、第２励起光９００２ａ（９００２ｂ）の光路とを含む平面によって切断された模式的な断面図が示されている。第２励起光９００２ａと第２励起光９００２ｂとは、投光部１９１０（図１）から照射されて反射面１２０６において走査された第２励起光９００２の一例である。第２励起光９００２ａおよび９００２ｂは、図２０のステップＳ２０の処理において決定された共鳴角で反射面１２０６に照射されている。第２励起光９００２ａは、反射面１２０６のうち流路形成体１２１２の下部分の点Ｐ１に照射されて、点Ｐ１に対して導電体膜１２００の反対側に反射されている。第２励起光９００２ｂは、反射面１２０６における測定部１９１２（図１）の測定領域１８０２の中心Ｃ１に照射されて、中心Ｃ１に対して導電体膜１２００の反対側に反射されている。点２１および２２は、測定領域１８０２の両端部の点であり、点２１と点２２との距離は、測定領域１８０２の直径Ｄ１である。それぞれ実線で示された直線７１および７２は、点２１から拡散される光のうち、集光レンズ１７００の入射瞳に入射して測定部１９１２により測定される光束の両端をそれぞれ示している。それぞれ一点鎖線で示された直線７３および７４は、点２２から拡散される光のうち集光レンズ１７００の入射瞳に入射して測定部１９１２により測定される光束の両端をそれぞれ示している。直線７１および７２の太線部分は、測定部１９１２の立体的な視野空間１８２０の一端を示し、直線７３および７４の太線部分は、視野空間１８２０の他端を示している。光路長Ｌａ１は、点Ｐ１に照射されて点Ｐ１から反射された第２励起光９００２ａの光路のうち視野空間１８２０に含まれた直線状の光路Ｗａ１の光路長を表現している。また、光路長Ｌｂ１は、中心Ｃ１に照射されて中心Ｃ１から反射された第２励起光９００２ｂの光路のうち視野空間１８２０に含まれた折れ線状の光路Ｗｂ１の光路長を表現している。

測定部１９１２は、視野空間１８２０における各点から集光レンズ１７００の入射瞳に入射する光を、フィルタ１７０６（図６）を介して測定可能である。測定光光学系１００８の焦点は、導電体膜１２００上に合わされており、測定光光学系１００８の測定領域１８０２は、反応領域１８０４（図７）に内包され、反応領域１８０４よりも若干狭い領域となっている。また、測定光光学系１００８の視野角度は、一定である。このため、視野空間１８２０のうち測定光光学系１００８の光軸に垂直な平面における測定部１９１２の測定領域が、測定光光学系１００８の光軸方向に沿って測定領域１８０２から離れれば離れるほど該測定部１９１２の測定領域は、広くなる。視野角度は、通常、全反射角度（共鳴角）より小さい、例えば、開口数（Ｎ．Ａ．）０．６の場合、視野角度は約４５度であるのに対して、励起光の全反射角度は、約７０度である。従って、第２励起光９００２の照射位置に関わらず、第２励起光９００２の光路は、測定光光学系１００８の視野空間１８２０と２点で交差し、視野空間１８２０を横切ることとなる。幾何学的な関係から、視野空間１８２０を横切る第２励起光９００２の光路長は、反射面１２０６における第２励起光９００２の照射位置が測定光光学系１００８の焦点面の中心（中心Ｃ１）にあるときに最短となる。そして、該光路長は、該照射位置が測定光光学系１００８の光軸に直交する方向に沿って焦点面の中心から離れれば離れるほど徐々に増加する。図１８の例では、光路長Ｌｂ１が、最短の光路長であり、光路長Ｌｂ１は、光路長Ｌａ１よりも若干長くなっている。自家蛍光９０４３および９０４４（図１２）、すなわち、第２測定光９０２２（図１）は、プリズム１２０４の内部における第２測定光９０２２の光路上の各点から発せられる。従って、図１９のグラフ８３に示されるように、測定部１９１２によって測定される自家蛍光９０４３および９０４４の光量は、第２測定光９０２２が測定領域１８０２の中心Ｃ１に照射されたときに、最小となる。そして、中心Ｃ１と第２測定光９０２２の照射位置との距離に応じて該光量は、徐々に増加する。該光量の変動の程度は、僅かである。しかし、該光量の変動は、導電体膜１２００の上部にある流路端面等の構造物の影響を受けることがなく、中心Ｃ１に対する第２励起光９００２の照射位置の距離が確実に反映される。そして、測定部１９１２によって、該光量の変動を問題無く検出することができ、該光量の最小値を取得できることが確かめられた。

そこで、計測装置１０００は、該最小値を検出し、該最小値が検出されたときの反射鏡１６００の位置を記憶する。そして、計測装置１０００は、表面プラズモン励起蛍光９０６１を測定するときには、反射鏡１６００を記憶した位置に位置決めして、その角度をステップＳ２８０（図２１）で求めた角度に設定し、第１励起光９００１を分析チップ１００６に照射する。これにより、第１励起光９００１の照射位置は、測定領域１８０２の中心部に合わせられる。

なお、第２励起光９００２が第１励起光９００１とは別の光源から生成される場合には、蛍光波長を有するＳ偏光の第２励起光９００２が採用され得る。この場合には、視野空間１８２０を横切る第２励起光９００２の光路から測定される蛍光の光量がより増加するので、第１励起光９００１の照射位置がより精度良く決定され得る。

ここで、Ｓ偏光の第２測定光９０２２の光路に第２バンドパスフィルタ１７１０が挿入されない場合には、第２測定光９０２２自体がプリズム１２０４の内部の光路で拡散した光路拡散光も測定され得る。しかしながら、該光路拡散光は、プリズム１２０４内部で発生するため導電体膜１２００上の構成物の影響を受け無い。また、第２測定光９０２２は、反射面１２０６で全反射されるので、該光路拡散光以外の励起光成分は測定されない。そして、該光路拡散光の光量は、第２励起光９００２が測定領域１８０２の中心Ｃ１に照射されたときに最小となる。従って、該光路拡散光の測定により、第１励起光９００１の照射位置を決定するための測定が可能となるので、第２測定光９０２２の測定時に第２バンドパスフィルタ１７１０が光路に挿入されないとしても、本発明の有用性を損なうものではない。

図１５は、複屈折物質１０２を矢印Ｙ１方向に通過する励起光の偏光状態の変化の一例を示す図である。直線９０１と楕円９０２とは、該通過の前後における該励起光の偏光状態を示している。該励起光は、複屈折物質１０２に入射する前には、Ｓ偏光のみ直線偏光を示す励起光である。しかし、該励起光が複屈折物質１０２を通過するときに位相ずれが生じ、複屈折物質１０２からの出射後には、Ｐ偏光の成分が混じった楕円偏光の偏光状態となっている。出射後の励起光におけるＳ偏光成分とＰ偏光成分とのそれぞれの割合は長さａと長さｂとにそれぞれ対応しており、長さａは、長さｂよりも長い。なお、図１５においては、Ｓ偏光の軸は、視認性を高める観点から紙面に水平な方向に記載されている。

図１５に示された例のように、純粋なＳ偏光の第２励起光９００２がプリズム１２０４に照射されたとしても、第２励起光９００２が反射面１２０６に到達したときには、第２励起光９００２にＰ偏光の偏光成分が僅かに混じる場合がある。第２励起光９００２の入射角は共鳴角に設定されているため、Ｐ偏光成分が第２励起光９００２に僅かに混じると、表面プラズモンの散乱光９０５１が第２測定光９０２２に僅かに混じってくる。

そこで、計測装置１０００は、第２測定光９０２２を測定する際に、第２バンドパスフィルタ１７１０が第２測定光９０２２の光路に挿入されるようにフィルタ１７０６の位置を設定する。これにより、第２測定光９０２２に表面プラズモンの散乱光が含まれていたとしても、自家蛍光９０４３および９０４４と、該散乱光とのうち自家蛍光のみの光量が測定され得る。従って、第１励起光９００１の照射位置は、測定領域１８０２の中心により高精度に決定され得るので、決定された照射位置に第１励起光９００１が照射されることにより発生する表面プラズモン励起蛍光の光量に関する信号のＳＮ比が高められ得る。なお、該Ｐ偏光成分により表面プラズモン励起蛍光９０６１も発生し得るが、Ｓ偏光成分に比べてＰ偏光成分は僅かであるため、自家蛍光９０４３および９０４４の測定結果に影響するものではない。

また、なお、第２励起光９００２に混じったＰ偏光の励起光の割合が高く、例えば、半分程度Ｐ偏光成分が混じっている場合には、散乱光９０５１は第２バンドパスフィルタ１７１０によって除去されるものの、表面プラズモン励起蛍光９０６１の影響が出てくる。この場合であっても、抗原抗体反応が行なわれた後であって、蛍光標識の付着処理が行なわれる前の分析チップ１００６を対象として、該照射位置の決定処理が行なわれれば、表面プラズモン励起蛍光９０６１が生じないため該照射位置の決定精度は悪化しない。

さらに、第２励起光９００２にＰ偏光成分の励起光が混じることにより第２測定光９０２２に散乱光９０５１が含まれる場合において、第２バンドパスフィルタ１７１０が第２測定光９０２２の光路に挿入されない場合には、散乱光９０５１の光量も測定される。そして、測定される散乱光９０５１の光量は、流路１２２０の端面１２３０（１２３２）の影響により、第２測定光９０２２の照射位置が中心Ｃ１から離れれば離れるほど増大する。この増大の態様は、図１９に例示された自家蛍光成分の測定光量の変動の態様と同様の態様である。また、Ｓ偏光の第２励起光９００２が分析チップ１００６に照射された場合には、第２励起光９００２に混じり得るＰ偏光の励起光の割合は、僅かである。従って、第２測定光９０２２の測定時に、第２バンドパスフィルタ１７１０が第２測定光９０２２の光路に挿入されないとしても本発明の有用性を損なうものではない。

以下に、図２２のステップＳ３０の動作フローを参照しつつ、計測装置１０００が行う照射位置の決定処理を詳しく説明する。

図２０のステップＳ３０において、照射位置の決定処理が開始されると、図２２の動作フローに示されるように、計測装置１０００は、先ず、測定光光学系１００８（図６）の第２整波器１７０２を駆動させ、挿抜機構１７０８が、第２のバンドパスフィルタ１７１０を第２測定光９０２２の光路に挿入する（ステップＳ３１０）。

第２バンドパスフィルタ１７１０が挿入されると、偏光方向調整機構１０３０の半波長板回転機構１５０２が、分析チップ１００６にＳ偏光の第２励起光９００２が照射される位置に半波長板１５００を回転させる（ステップＳ３２０）。半波長板１５００の回転駆動が完了すると、反射鏡位置調整機構１６０４（図５）は、反射鏡１６００を移動させて、反射鏡１６００の鏡面を所定の走査範囲の上端に平行移動させる（ステップＳ３３０）。該鏡面の該走査範囲としては、例えば、測定領域１８０２（図７）の中心Ｃ１を通り端面１２３０および１２３２と直交する反射面１２０６上の２〜５ｍｍ程度の長さの線分を、第２励起光９００２の照射位置がトレースする場合における反射鏡１６００の移動範囲などが採用される。当該線分の長さは、流路１２２０の幅、すなわち端面１２３０と端面１２３２との距離に相当する。

反射鏡１６００の移動が完了すると、測定部１９１２は、第２バンドパスフィルタ１７１０により第２測定光９０２２のうち蛍光波長成分のみを受光して測定する。そして、制御演算部１０２６は、測定された光量を反射鏡１６００の位置に対応づけて記憶し（ステップＳ３４０）、反射鏡１６００が走査範囲の下端に達したか否かを判定する（ステップＳ３５０）。

ステップＳ３５０での判定の結果、反射鏡１６００が走査範囲の下端に達していなければ、反射鏡位置調整機構１６０４は、反射鏡１６００の鏡面を所定量だけ下方に平行移動させ（ステップＳ３６０）、計測装置１０００は、ステップＳ３４０、Ｓ３５０の処理を繰り返す。ステップＳ３５０での判定の結果、反射鏡１６００が走査範囲の下端に達していれば、制御演算部１０２６は、記憶した測定結果に基づいて、測定部１９１２が第２測定光９０２２を測定した光量の最小値を取得する。制御演算部１０２６は、該最小値を、（１）式における自家蛍光９０４３および９０４４の合計の光量である光量Ｖ２として記憶する。そして、制御演算部１０２６は、該光量の最小値に対応した反射鏡１６００の位置を決定する（ステップＳ３７０）。該位置の決定により第１励起光９００１の反射面１２０６における照射位置が決定される。すなわち、制御演算部１０２６は、測定部１９１２が第２測定光９０２２を測定した光量の最小値に基づいて、第１励起光９００１の照射位置を決定する。

該光量の最小値に対応した反射鏡１６００の位置が決定されると、反射鏡位置調整機構１６０４は、反射鏡１６００を決定された位置に移動させて（ステップＳ３８０）、計測装置１０００は、ステップＳ３０の処理を終了する。

（表面プラズモン励起蛍光の測定処理の詳細）
以下に、図２３のステップＳ４０の動作フローを参照しつつ、計測装置１０００が行う抗原の検出処理を詳しく説明する。

図２０のステップＳ４０において、表面プラズモン励起蛍光９０６１（図１１）の測定処理が開始されると、図２３の動作フローに示されるように、先ず、偏光方向調整機構１０３０の半波長板回転機構１５０２が、分析チップ１００６にＰ偏光の第１励起光９００１が照射される位置に半波長板１５００を回転させる（ステップＳ４１０）。半波長板１５００の回転駆動が完了すると、測定部１９１２は、第１測定光９０２１の光量Ｇ１を測定し、制御演算部１０２６がメモリに記憶する（ステップＳ４２０）。

測定された光量Ｇ１は、自家蛍光９０４１（図１１）の光量Ｖ１と表面プラズモン励起蛍光９０６１の光量Ｈ１との合計である。そこで、制御演算部１０２６は、予め取得した自家蛍光９０４３および自家蛍光９０４４（図１２）の光量Ｖ２から（１）式により自家蛍光９０４１の光量Ｖ１を演算して算出する。すなわち、制御演算部１０２６は、光量Ｖ２に基づいて第１励起光９００１がプリズム１２０４を通過するときに生ずる自家蛍光９０４１の光量Ｖ１を演算により求める。また、光量Ｖ２は、測定部１９１２が第２測定光９０２２のうち蛍光波長成分のみを受光して測定することにより取得した測定結果である。

光量Ｖ１が第１測定光９０２１の実測により求められる場合には、第１測定光９０２１に表面プラズモン励起蛍光９０６１が含まれないことが必要となる。このためには、例えば、抗原抗体反応が行なわれた後であって、蛍光標識の付着処理が行なわれる前の分析チップ１００６を対象として、図２０のステップＳ２０の共鳴角の決定処理が行なわれる必要がある。この場合には、光量Ｖ１が実測された後、ステップＳ４０の励起蛍光の測定処理が開始されるまでに、抗原捕捉体１２０８に捕捉された抗原に、蛍光標識を付する処理が必要となる。このために、例えば、分析チップ１００６が、一旦、測定室１０１６から前処理室１０２０に搬送されて、蛍光標識を付する処理が施された後に、再度、測定室１０１６に搬送されて測定位置にセットされる必要がある。このため、表面プラズモン励起蛍光９０６１の測定処理の所要時間が長期化するとともに、分析チップ１００６の位置決め精度が悪化し、表面プラズモン励起蛍光９０６１の測定精度が低下する恐れがある。

しかしながら、自家蛍光９０４３および自家蛍光９０４４（図１２）の光量Ｖ２に基づいて、自家蛍光９０４１の光量Ｖ１が求められれば、抗原抗体反応および蛍光標識の付与処理が施された分析チップ１００６を対象として、図２０の動作フローＳ１を行なうことができる。従って、表面プラズモン励起蛍光９０６１の測定処理の所要時間をより短縮できるとともに、表面プラズモン励起蛍光９０６１の測定精度がより向上され得る。

光量Ｖ１が算出されると、制御演算部１０２６は、算出した光量Ｖ１と、測定した光量Ｇ１とを用いて（２）式の演算により表面プラズモン励起蛍光９０６１の光量Ｈ１を取得し（ステップＳ４３０）、計測装置１０００は、ステップＳ４０の処理を終了する。

以上のように構成された本実施形態に係る計測装置によれば、Ｓ偏光の第２励起光９００２が、反射面１２０６で全反射する入射角で反射面１２０６において走査される。そして、当該走査の際に第２励起光９００２から派生した第２測定光９０２２の測定結果に基づいて第１励起光９００１の照射位置が決定される。第２測定光９０２２の光量は導電体膜１２００に対してプリズム１２０４と反対側の構成物の影響をほとんど受けることがないため、当該照射位置は、測定領域１８０２の中心Ｃ１により近い位置に決定され得る。従って、決定された照射位置に第１励起光９００１が照射されることにより発生する表面プラズモン励起蛍光９０６１の光量に係る信号のＳＮ比が高められ得る。

また、以上のように構成された本実施形態に係る計測装置によれば、測定部１９１２は、蛍光波長成分のみを受光して測定することにより第２測定光９０２２の測定結果を取得する。従って、複屈折の影響等によってＳ偏光の第２励起光９００２にＰ偏光の励起光が混じった場合であっても、該Ｐ偏光の励起光の照射により生じた表面プラズモンの散乱光の光量は該測定結果から除かれるので、第１励起光９００１の照射位置がより高精度に決定され得る。

また、以上のように構成された本実施形態に係る計測装置によれば、投光部１９１０は、励起光の偏光方向を調整可能な偏光方向調整機構１０３０を備える。そして、当該偏光方向調整機構を通過する励起光９０００の偏光方向が調整されることよって第１励起光９００１と第２励起光９００２とが選択的に照射される。従って、共通の光源から第１励起光９００１と第２励起光９００２とが生成され得るので計測装置がより小型化され得る。

また、以上のように構成された本実施形態に係る計測装置によれば、投光部１９１０は、蛍光成分の波長を有する励起光を放射する光源を備え、当該光源からの励起光によりＳ偏光の第２励起光９００２を生成することができる。従って、第２励起光９００２の光路から測定される蛍光の光量がより増加するので、測定される第２測定光９０２２の光量が増大し、第１励起光９００１の照射位置がより精度良く決定され得る。

また、以上のように構成された本実施形態に係る計測装置によれば、測定部１９１２が第２測定光９０２２のうち蛍光波長成分、すなわち、自家蛍光９０４３（９０４４）のみを受光して測定する。そして、制御演算部１０２６は、該測定結果に基づいて、第１励起光９００１がプリズム１２０４を通過するときに生ずる自家蛍光９０４１の光量を求める。従って、共鳴角の決定、照射位置の決定、および励起蛍光の測定に係る一連の処理を、抗原抗体反応および蛍光標識の付与処理が施された分析チップ１００６を対象として該チップの搬送処理等を途中に介在させることなく行なうことができる。従って、表面プラズモン励起蛍光９０６１の測定処理の所要時間がより短縮され得るとともに、表面プラズモン励起蛍光９０６１の測定精度がより向上され得る。

本発明は詳細に示され記述されたが、上記の記述は全ての態様において例示であって限定的ではない。したがって、本発明は、その発明の範囲内において、実施の形態を適宜、変形、省略することが可能である。

１０００ 計測装置
１００２ レーザーダイオードユニット
１００４ 励起光光学系
１００６ 分析チップ
１００８ 測定光光学系
１０１０ 光電子増倍管
１０１２ 光吸収体
１０１４ 送液機構
１０１６ 測定室
１０１８ 分析チップ保持機構
１０２０ 前処理室
１０２２ 分析チップ搬送機構
１０２４ ディスプレイ
１０２６ 制御演算部（決定部）
１０２８ 第１整波器
１０３０ 偏光方向調整機構
１０３２ 整形光学系
１０３４ 入射角調整機構
１２０４ プリズム（誘電体媒体）
１２０６ 反射面（光反射面）
１９１０ 投光部
１９１２ 測定部
９００１ 第１励起光
９００２ 第２励起光
９０２１ 第１測定光
９０２２ 第２測定光（派生光）

Claims (7)

1. 光透過性を有する誘電体媒体の光反射面に形成された導電体膜に当該誘電体媒体側から第１励起光を照射して表面プラズモン励起蛍光分光法により測定を行う表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、
   前記誘電体媒体側から前記光反射面に入射させたＳ偏光の第２励起光の入射角を前記光反射面で全反射する入射角に保持しつつ、当該第２励起光を当該光反射面において走査する投光部と、
   前記走査の際に前記第２励起光から派生した派生光を受光して測定する測定部と、
   前記測定部が前記派生光を測定した測定結果に基づいて、前記導電体膜に照射される前記第１励起光の照射位置を決定する決定部と、
   を備えることを特徴とする表面プラズモン励起蛍光計測装置。
2. 請求項１に記載の表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、
   前記決定部は、
   前記測定部が前記派生光を測定した光量の最小値に基づいて、前記照射位置を決定することを特徴とする表面プラズモン励起蛍光計測装置。
3. 請求項１または請求項２に記載の表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、
   前記測定部は、
   前記派生光のうち蛍光波長成分のみを受光して測定することにより前記測定結果を取得することを特徴とする表面プラズモン励起蛍光計測装置。
4. 請求項１から請求項３の何れか１つの請求項に記載の表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、
   前記投光部は、
   励起光の偏光方向を調整可能な偏光方向調整機構を備え、当該偏光方向調整機構を通過する励起光の偏光方向を調整することよって前記第１励起光と前記第２励起光とを選択的に投射することを特徴とする表面プラズモン励起蛍光計測装置。
5. 請求項１から請求項３の何れか１つの請求項に記載の表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、
   前記投光部は、
   蛍光成分の波長を有する励起光を放射する光源を備え、
   当該光源からの励起光によりＳ偏光の前記第２励起光を生成することを特徴とする表面プラズモン励起蛍光計測装置。
6. 請求項３に記載の表面プラズモン励起蛍光計測装置であって、
   前記決定部は、
   前記測定部が前記派生光のうち蛍光波長成分のみを受光して測定することにより取得した前記測定結果に基づいて、前記第１励起光が前記誘電体媒体を通過するときに生ずる自家蛍光の光量を求めることを特徴とする表面プラズモン励起蛍光計測装置。
7. 光透過性を有する誘電体媒体の光反射面に形成された導電体膜に当該誘電体媒体側から第１励起光を照射して表面プラズモン励起蛍光分光法により測定を行う表面プラズモン励起蛍光計測装置の計測条件の設定方法であって、
   前記誘電体媒体側から前記光反射面に入射させたＳ偏光の第２励起光の入射角を前記光反射面で全反射する入射角に保持しつつ、当該第２励起光を当該光反射面において走査する投光ステップと、
   前記走査の際に前記第２励起光から派生した派生光を受光して測定する測定ステップと、
   前記測定ステップにおいて前記派生光が測定された測定結果に基づいて、前記導電体膜に照射される前記第１励起光の照射位置を決定する決定ステップと、
   を備えることを特徴とする計測条件の設定方法。

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