JPWO2015119154A1 - 表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法 - Google Patents

表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法 Download PDF

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Abstract

表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、チップホルダー、光源、角度調整部、光センサー、フィルターホルダー、励起光カットフィルター、散乱光透過部、散乱光透過部、透過調整部および制御部を有する。散乱光透過部を平面視したときの面積は、励起光カットフィルターまたはフィルターホルダーに配置され、蛍光透過領域を平面視したときの面積より小さい。

Description

本発明は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）を利用して検体に含まれる被検出物質の検出を行う表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法に関する。
臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる分析方法および分析装置が求められている。
被検出物質を高感度に検出できる方法として、表面プラズモン共鳴蛍光分析（表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている（例えば、特許文献１，２参照）。
特許文献１，２には、ＳＰＦＳを利用する分析方法および分析装置が開示されている。これらの分析方法および分析装置では、誘電体からなるプリズムと、プリズムの１面上に形成された金属膜と、金属膜上に固定された捕捉体（例えば抗体）とを有するセンサチップを使用する。金属膜上に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質が捕捉体により捕捉される（１次反応）。捕捉された被検出物質は、さらに蛍光物質で標識される（２次反応）。この状態で、ＳＰＲが生じる角度で励起光を、プリズムを介して金属膜に照射すると、金属膜表面上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が選択的に励起され、蛍光物質から放出された蛍光が観察される。これらの分析方法および分析装置では、蛍光を検出して、被検出物質の存在またはその量を検出する。
このようなＳＰＦＳを利用する分析方法および分析装置では、蛍光を検出する光センサーの前には、励起光を遮り、蛍光を透過させる励起光カットフィルターが設置される。
特開平１０−３０７１４１号公報 国際公開第２０１２／０４２８０５号
ＳＰＦＳを利用する分析方法および分析装置では、検出感度および検出精度を十分に向上させるために、蛍光強度が最大となるように金属膜に対する励起光の入射角を設定する必要がある。
この点について、特許文献１には、金属膜からの反射光の強度が最小となるときの入射角（以下「共鳴角」という）で励起光を照射することが記載されている。しかしながら、蛍光の強度が最大となるときの入射角と共鳴角とはわずかに異なるため、特許文献１に記載の分析方法および分析装置には、検出感度および検出精度に改善の余地がある。
一方、特許文献２に記載の分析方法および分析装置では、励起光と同じ波長を有し、ＳＰＲにより発生する散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）の強度が最大となるときの入射角（以下「増強角」という）で励起光を照射している。増強角は、共鳴角よりも蛍光の強度が最大となるときの入射角に近いため、特許文献２に記載の分析方法および分析装置は、特許文献１に記載の分析方法および分析装置に比べて検出感度および検出精度の点で優れている。しかしながら、特許文献２に記載の分析方法および分析装置では、蛍光を検出するための光センサーを用いてプラズモン散乱光も検出するため、増強角を決定する際にプラズモン散乱光の光路から励起光カットフィルターを完全に退避させなければならず、分析装置が大型化するという問題がある。
本発明の目的は、励起光カットフィルターを受光光学系の光路から大きく移動させることなく、プラズモン散乱光が最大となる増強角を決定することができる表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法を提供することである。
本発明者らは、ＳＰＦＳを利用する分析装置および分析方法において、励起光カットフィルターまたはフィルターホルダーに、プラズモン散乱光を透過させる散乱光透過部を形成し、散乱光透過部を透過したプラズモン散乱光を光センサーで検出することで上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、金属膜を一面に有する誘電体を含む分析チップが装着され、前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上の被検出物質を標識する蛍光物質を励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、前記分析チップを着脱可能に保持するチップホルダーと、励起光を出射する光源と、前記誘電体を介して前記金属膜に所定の入射角で励起光を照射するために、前記金属膜に対する励起光の入射角を調整する角度調整部と、前記金属膜の前記誘電体と対向しない面の近傍から出射される光を検出する光センサーと、前記金属膜の近傍から出射された光を前記光センサーに導く受光光学系と、前記受光光学系内に配置され、前記金属膜上から出射された蛍光を透過させ、励起光の少なくとも一部の波長の光を遮断する蛍光透過領域を含む、励起光カットフィルターと、前記励起光カットフィルターを保持するフィルターホルダーと、前記励起光カットフィルターまたは前記フィルターホルダーに配置され、前記金属膜上から出射されたプラズモン散乱光を透過させる散乱光透過部と、前記散乱光透過部を介するプラズモン散乱光の透過の可否を調整する透過調整部と、を有し、前記散乱光透過部を平面視したときの面積は、前記励起光カットフィルターの蛍光透過領域を平面視したときの面積より小さい。
また、上記課題を解決するため、本発明の他の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、金属膜を一面に有する誘電体を含む分析チップが装着され、前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上の被検出物質を標識する蛍光物質を励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、前記分析チップを着脱可能に保持するチップホルダーと、励起光を出射する光源と、前記誘電体を介して前記金属膜に所定の入射角で励起光を照射するために、前記金属膜に対する励起光の入射角を調整する角度調整部と、前記金属膜の前記誘電体と対向しない面の近傍から出射される光を検出する光センサーと、前記金属膜の近傍から出射された光を前記光センサーに導く受光光学系と、前記受光光学系内に配置され、前記金属膜上から出射された蛍光を透過させ、励起光の少なくとも一部の波長の光を遮断する励起光カットフィルターと、前記金属膜上から出射されたプラズモン散乱光が透過可能となるように、前記励起光カットフィルターを前記金属膜表面の法線に対して傾斜させる透過調整部と、を有する。
また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、前記被検出物質を、誘電体の一面上に配置された金属膜上に配置する工程と、蛍光を透過させ、励起光の少なくとも一部の波長の光を遮断する蛍光透過領域を有する励起光カットフィルター、または前記励起光カットフィルターを保持するためのフィルターホルダーに形成された散乱光透過部を、プラズモン散乱光が透過可能な位置に移動した状態で、前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射され、かつ前記散乱光透過部を透過したプラズモン散乱光の強度を検出して、プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する工程と、前記励起光カットフィルターに配置された蛍光透過領域を蛍光が透過可能な位置に移動した状態で、前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出され、かつ前記蛍光透過領域を透過した蛍光の強度を検出する工程と、を含む。
また、上記課題を解決するため、本発明の他の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、前記被検出物質を、誘電体の一面上に配置された金属膜上に配置する工程と、蛍光を透過させ、励起光の少なくとも一部の波長の光を遮断する励起光カットフィルターを、プラズモン散乱光が透過可能となるように、前記金属膜表面の法線に対して傾斜させた状態で、前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射され、前記励起光カットフィルターを透過したプラズモン散乱光の強度を検出して、プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する工程と、前記励起光カットフィルターを、励起光の少なくとも一部の波長の光を遮断する角度に配置した状態で、前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出され、かつ前記励起光カットフィルターを透過した蛍光の強度を検出する工程と、を含む。
本発明によれば、ＳＰＦＳを利用する被検出物質の検出において、励起光カットフィルターをプラズモン散乱光の光路から大きく退避させることなく、プラズモン散乱光が最大となる増強角を決定することができる。したがって、本発明によれば、高感度、高精度かつ高速に被検出物質の存在またはその量を検出することができる。また、本発明によれば、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置の小型化および低コスト化を実現することもできる。
図１は、実施の形態１に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）の構成を示す模式図である。 図２は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図３Ａ，Ｂは、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置において、プラズモン散乱光の検出および蛍光の検出を説明するための図である。 図４Ａ，Ｂは、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置において、プラズモン散乱光の検出および蛍光の検出を説明するための図である。 図５は、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図６Ａ，Ｂは、実施の形態３に係るＳＰＦＳ装置において、プラズモン散乱光の検出および蛍光の検出を説明するための図である。 図７Ａ，Ｂは、実施の形態４に係るＳＰＦＳ装置において、プラズモン散乱光の検出および蛍光の検出を説明するための図である。 図８は、励起光カットフィルターを透過する波長と、透過率との関係を示すグラフである。 図９は、実施の形態４に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
［実施の形態１］
（ＳＰＦＳ装置の構成）
まず、本発明の実施の形態１に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（以下「ＳＰＦＳ装置」ともいう）について説明する。
ＳＰＦＳ装置は、誘電体と、誘電体の１面に形成された金属膜とを有する分析チップが装着された状態で使用される。金属膜上に被検出物質を含む検体を提供すると、被検出物質が捕捉体により捕捉される。このとき、被検出物質は蛍光物質で標識されていてもよいし、標識されていなくてもよい。捕捉された被検出物質が蛍光物質で標識されていない場合は、捕捉された被検出物質は、さらに蛍光物質で標識される。この状態で、表面に金属膜を有するプリズムに対して全反射条件となるように励起光を照射する。これにより、励起光および金属膜中の自由電子の相互作用（表面プラズモン共鳴）が生じ、局在場光が発生する。一般にこの局在場光は、「増強電場」または「増強されたエバネッセント光」とも呼ばれ、金属膜の表面近傍の物理量変動を測定することが可能である。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が選択的に励起され、蛍光物質から放出された蛍光が観察される。ＳＰＦＳ装置は、蛍光の光量を測定して、被検出物質の存在またはその量を検出する。
図１は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、分析チップ１０を着脱可能に保持するためのチップホルダー１２と、分析チップ１０に励起光αを照射するための励起光学系ユニット１２０と、分析チップ１０から放出された光（プラズモン散乱光βおよび蛍光γ）を検出するための受光光学系ユニット１４０と、これらを制御する制御部１６０とを有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１２に分析チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、分析チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
図１に示されるように、分析チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する誘電体２０と、成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。通常、分析チップ１０は、分析のたびに交換される。
誘電体２０は、励起光αに対して透明な部材（プリズム）からなる。誘電体２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光学系ユニット１２０からの励起光αを誘電体２０の内部に入射させる。成膜面２２の上には、金属膜３０が形成される。誘電体２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０で反射する。より具体的には、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射する。出射面２３は、金属膜３０で反射した励起光αを誘電体２０の外部に出射させる。誘電体２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、誘電体２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分が誘電体２０内に滞留しにくくなる。入射面２１は、励起光αが励起光学系ユニット１２０に戻らないように形成される。励起光αが励起光源であるレーザーダイオードに戻ると、レーザーダイオードの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまうからである。そこで、理想的な増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。たとえば、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。誘電体２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。誘電体２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
金属膜３０は、誘電体２０の成膜面２２上に形成されている。金属膜３０を設けることで、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴；ＳＰＲ）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光を生じさせることができる。金属膜３０の素材は、表面プラズモン共鳴を生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の素材の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。
また、特に図示しないが、金属膜３０の誘電体２０と対向しない面には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定されていてもよい。捕捉体を固定することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。本実施の形態では、金属膜３０上の所定の領域に、捕捉体が均一に固定されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被検出物質に特異的な抗体またはその断片である。
流路蓋４０は、金属膜３０の誘電体２０と対向しない面上に、流路４１を挟んで配置されている。金属膜３０が誘電体２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合は、流路蓋４０は、流路４１を挟んで成膜面２２上に配置されていてもよい。流路蓋４０は、金属膜３０（および誘電体２０）と共に、検体や蛍光標識液、洗浄液などの液体が流れる流路４１を形成する。捕捉体は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された注入口および排出口（いずれも図示省略）とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が注入されると、流路４１内において、これらの液体は捕捉体に接触する。流路蓋４０は、金属膜３０の誘電体２０と対向しない面およびその近傍から放出された光（プラズモン散乱光βおよび蛍光γ）に対して透明な材料からなる。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。これらの光を受光光学系ユニット１４０に導くことができれば、流路蓋４０の一部は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープまたは接着剤による接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０または誘電体２０に接合されている。
図１に示されるように、誘電体２０へ導かれた励起光αは、入射面２１から誘電体２０内に入射する。誘電体２０内に入射した励起光αは、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）となるように入射する。界面からの反射光は、出射面２３から誘電体２０外に出射される（図示省略）。一方、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光αが界面に入射することで、金属膜３０およびその近傍からは、プラズモン散乱光βおよび／または蛍光γが、受光光学系ユニット１４０の方向へ出射される。
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１２、励起光学系ユニット１２０、受光光学系ユニット１４０および制御部１６０を有する。
チップホルダー１２は、所定の位置で分析チップ１０を保持する。分析チップ１０は、チップホルダー１２に保持された状態で、励起光学系ユニット１２０からの励起光αを照射される。このとき、金属膜３０の誘電体２０と対向しない面およびその近傍からは、励起光αと同一波長のプラズモン散乱光βや蛍光物質から放出された蛍光γなどが上方に放出される。また、励起光αは、誘電体２０と金属膜３０との界面で反射して、誘電体２０の外部に出射される（図示省略）。
励起光学系ユニット１２０は、励起光αを出射する光源ユニット１２１と、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を調整する角度調整部１２２を有する。
光源ユニット１２１は、励起光源としてレーザーダイオード（以下「ＬＤ」と略記する）を有し、チップホルダー１２に保持された分析チップ１０の入射面２１に向けて励起光α（シングルモードレーザー光）を出射する。より具体的には、光源ユニット１２１は、分析チップ１０の誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に対して励起光αが全反射角度となるように、界面に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。たとえば、光源ユニット１２１は、ＬＤユニット、整波器および整形光学系（いずれも図示省略）を有する。
ＬＤユニットは、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。ＬＤユニットは、励起光源としてのＬＤと、ＬＤから出射された励起光αをコリメートするコリメーターと、励起光αの光量を一定にするための温度調整回路とを有する。ＬＤから出射される励起光αは、コリメートされてもその輪郭形状が扁平である。このため、界面（成膜面２２）における照射スポットの形状が略円形となるように、ＬＤは所定の姿勢で保持されるか、または後述の整形光学系に所定形状のスリットが挿入される。また、ＬＤから出射される励起光αの波長および光量は、温度によって変化する。このため、温度調整回路は、コリメートされた後の励起光αから分岐させた光の光量をフォトダイオードなどにより監視し、励起光αの波長および光量が一定となるようにヒーターやペルチェ素子などを用いてＬＤの温度を調整する。
整波器は、バンドパスフィルター（以下「ＢＰＦ」と略記する）および直線偏光フィルター（以下「ＬＰ」と略記する）を含み、ＬＤユニットから出射された励起光αを整波する。ＬＤユニットからの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているため、ＢＰＦは、ＬＤユニットからの励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。また、ＬＤユニットからの励起光αは、完全な直線偏光ではないため、ＬＰは、ＬＤユニットからの励起光αを完全な直線偏光の光にする。整波器は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する半波長板を含んでいてもよい。
整形光学系は、誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。整形光学系から出射された励起光αは、分析チップ１０の誘電体２０に照射される。整形光学系は、例えばスリットやズーム手段などである。
なお、光源ユニット１２１に含まれる光源の種類は、特に限定されず、ＬＤでなくてもよい。光源の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
角度調整部１２２は、金属膜３０（誘電体２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））への励起光αの入射角を調整する。角度調整部１２２は、励起光αを誘電体２０を介して金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に所定の入射角で照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１２とを相対的に回転させる。本実施の形態では、角度調整部１２２は、光源ユニット１２１を励起光αの光軸と直交する軸を中心として回転させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０（成膜面２２）上での照射位置がほとんど移動しないように、回転軸の位置を設定する。たとえば、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
受光光学系ユニット（受光光学系）１４０は、チップホルダー１２に保持された分析チップ１０の金属膜３０の誘電体２０と対向しない面に対向するように配置されている。受光光学系ユニット１４０は、金属膜３０上から出射される光（プラズモン散乱光βまたは蛍光γ）を検出する。受光光学系ユニット１４０は、第１レンズ１４１、絞り１４２、フィルターホルダー１４３、励起光カットフィルター１４４、第２レンズ１４５、光センサー１４６および透過調整部１４７を有する。第１レンズ１４１、絞り１４２、フィルターホルダー１４３、励起光カットフィルター１４４、第２レンズ１４５および光センサー１４６は、金属膜３０の表面と対向するように、金属膜３０側からこの順番で配置されている。
第１レンズ１４１および第２レンズ１４５は、迷光の影響を受けにくい共役光学系を構成する。第１レンズ１４１と第２レンズ１４５との間を進行する光は、略平行光となる。第１レンズ１４１および第２レンズ１４５は、金属膜３０上から放出される蛍光γを光センサー１４６の受光面上に結像させる。
絞り１４２は、第１レンズ１４１およびフィルターホルダー１４３の間に配置されている。絞り１４２は、絞り孔１５１を介して、第１レンズ１４１によりコリメートされた光（プラズモン散乱光βおよび／または蛍光γ）の少なくとも一部を透過させる。絞り１４２を透過した光は、励起光カットフィルター１４４の蛍光透過領域１５６に到達する。ここで、「蛍光透過領域」とは、蛍光γの検出時において、絞り１４２（または第１貫通孔１５２）によって制御された蛍光γが透過する励起光カットフィルター１４４の一部の領域を意味する。絞り孔１５１の平面視形状は、特に限定されない。蛍光透過領域１５６の平面視形状は、絞り１４２の絞り孔１５１の平面視形状と同じである。
フィルターホルダー１４３は、励起光カットフィルター１４４を保持しており、絞り１４２および第２レンズ１４５の間に配置されている。フィルターホルダー１４３の形状は、励起光カットフィルター１４４を保持することができれば、特に限定されない。フィルターホルダー１４３の形状には、励起光カットフィルター１４４を下側から保持する形状、励起光カットフィルター１４４の外縁部を把持する形状などが含まれる。本実施の形態では、フィルターホルダー１４３は、励起光カットフィルター１４４より大きく形成されており、励起光カットフィルター１４４を下側から保持する。
フィルターホルダー１４３は、第１貫通孔１５２および第２貫通孔１５３を有する。第１貫通孔１５２は、フィルターホルダー１４３の中央部分に配置されている。本実施の形態では、第１貫通孔１５２は、絞り１４２の絞り孔１５１より大きく形成されている。第１貫通孔１５２は、絞り１４２で絞られた光（プラズモン散乱光βおよび／または蛍光γ）を透過させる。第１貫通孔１５２を透過した光は、励起光カットフィルター１４４の裏面に到達する。第２貫通孔１５３は、励起光カットフィルター１４４を避けるようにフィルターホルダー１４３に配置されている（図１参照）。詳細は後述するが、第２貫通孔１５３は、蛍光透過領域１５６の端部から蛍光透過領域１５６の直径より短い位置に配置されている。第２貫通孔１５３は、プラズモン散乱光βを透過させる散乱光透過部として機能し、後述の増強角の決定時に用いられる。第２貫通孔（散乱光透過部）１５３を透過した光は、第２レンズ１４５を介して光センサー１４６に到達する。なお、散乱光透過部１５３は、プラズモン散乱光βを透過させることができれば、蛍光γを透過させてもよい。散乱光透過部１５３を平面視したときの面積は、特に限定されないが、蛍光透過領域１５６を平面視したときの面積の１／１０００以下であることが好ましい。ここで、「平面視」とは、金属膜３０から見た場合のことを意味する。
励起光カットフィルター１４４は、絞り１４２および第２レンズ１４５の間に配置されている。励起光カットフィルター１４４は、蛍光透過領域１５６を含む。蛍光透過領域１５６は、金属膜３０上から出射された蛍光を透過させ、励起光の少なくとも一部の波長の光を遮断する。励起光カットフィルター１４４は、励起光αの波長の光（プラズモン散乱光β）を反射または吸収する一方で蛍光γを透過させることで、光センサー１４６に蛍光γの波長以外の光が到達することを防ぐ。すなわち、励起光カットフィルター１４４は、光センサー１４６に到達する光からノイズ成分を除去し、微弱な蛍光γの検出精度および感度の向上に寄与する。
励起光カットフィルター１４４は、蛍光成分のみを光センサー１４６に導き、高いＳ／Ｎ比で当該蛍光成分を検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光β）を除去する。励起光カットフィルター１４４の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。励起光カットフィルター１４４は、例えば、所定の光成分を反射することで除去する多層膜からなるフィルターであるが、所定の光成分を一般的には吸収することで除去する色ガラスフィルターであってもよい。
光センサー１４６は、金属膜３０上から出射される蛍光γまたはプラズモン散乱光βを検出する。たとえば、光センサー１４６は、感度およびＳＮ比が高い光電子増倍管である。光センサー１４６は、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）などであってもよい。なお、金属膜３０の一方の面（誘電体２０と対向する面）における励起光αの照射スポットの大きさは、金属膜３０の他方の面（第１レンズ１４１と対向する面）における光センサー１４６による測定領域の大きさよりも小さくなるように調整される。このようにすることで、誘電体２０の各パラメータの誤差により照射スポットがわずかに位置ずれした場合であっても、照射スポットが測定領域から外れることを防止できる。
透過調整部１４７は、光センサー１４６がプラズモン散乱光βを検出する時には、散乱光透過部１５３を受光光学系ユニット１４０内の光路上に移動させ、光センサー１４６が蛍光γを検出する時には、蛍光透過領域１５６を受光光学系ユニット１４０の光路内に移動させると同時に、散乱光透過部１５３を受光光学系ユニット１４０内の光路外に移動させる。透過調整部１４７は、フィルターホルダー１４３を支持するステージ１５４と、ステージ１５４を介してフィルターホルダー１４３（散乱光透過部１５３）を移動させる駆動源となるモーター１５５と、を有する。詳細は後述するが、透過調整部１４７は、散乱光透過部１５３を受光光学系ユニット１４０の光路の内部または外部に移動させることで、フィルターホルダー１４３および励起光カットフィルター１４４を大きく移動させることなく、増強角を求めることができる。
制御部１６０は、各駆動部の制御や、光センサー１４６における受光量の定量化などを一元的に行う。本実施の形態では、制御部１６０は、光源ユニット１２１を制御する光源制御部１６１と、光センサー１４６を制御する光センサー制御部１６２と、モーター１５５を制御するモーター制御部１６３と、制御処理部１６４とを有する。制御処理部１６４は、光源制御部１６１、光センサー制御部１６２およびモーター制御部１６３を包括的に制御して、ＳＰＦＳ装置１００全体の動作を制御する。制御部１６０は、例えば、ソフトウェアを実行するコンピュータである。後述するように、制御部１６０（制御処理部１６４）は、光センサー１４６によるプラズモン散乱光βの測定結果に基づいて、蛍光測定時の金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を制御する。
次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出動作について説明する。図２は、ＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。図３Ａ，Ｂは、プラズモン散乱光の検出および蛍光の検出を説明するための図である。図３Ａは、プラズモン散乱光の検出を説明するための図であり、図３Ｂは、蛍光の検出を説明するための図である。
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００の所定の位置に分析チップ１０を設置する。また、分析チップ１０の流路４１内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体が適切に被検出物質を捕捉できるように、流路４１内を洗浄して保湿剤を除去する。
次いで、検体中の被検出物質と捕捉体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。具体的には、流路４１内に検体を注入して、検体と捕捉体とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は捕捉体により捕捉される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄して、捕捉体に捕捉されなかった物質を除去する。検体の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。
次いで、図３Ａに示されるように、制御処理部１６４は、フィルターホルダー１４３を移動させて、散乱光透過部１５３を受光光学系ユニット１４０内の光路上に配置する（工程Ｓ３０）。そして、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査して、最適な入射角を決定する（工程Ｓ４０）。そして、制御処理部１６４は、光源ユニット１２１および角度調整部１２２を制御して、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査する。また、制御処理部１６４は、光センサー１４６が金属膜３０上（金属膜３０表面およびその近傍）からのプラズモン散乱光βを検出するように、光センサー制御部１６２を制御する。金属膜上（金属膜３０表面およびその近傍）からのプラズモン散乱光βは、第１レンズ１４１によりコリメートされ、散乱光透過部１５３を介して光センサー１４６に到達する。これにより、制御処理部１６４は、励起光αの入射角とプラズモン散乱光βの強度との関係を含むデータを得る。そして、制御処理部１６４は、データを解析して、プラズモン散乱光βの強度が最大となる入射角（増強角）を決定する。なお、増強角は、基本的には、誘電体２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４１内の蛍光物質の種類および量、誘電体２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、分析を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０.１°度程度のオーダーで決定される。
次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を、前の工程で決定した増強角に設定する（工程Ｓ５０）。具体的には、制御処理部１６４は、角度調整部１２２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する。以後の工程では、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角は、増強角のままである。
次いで、図３Ｂに示されるように、制御処理部１６４は、フィルターホルダー１４３を移動させて、蛍光透過領域１５６を受光光学系ユニット１４０の光路内に配置するとともに、散乱光透過部１５３を受光光学系ユニット１４０内の光路外に配置する（工程Ｓ６０）。そして、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、蛍光γと同じ波長の光の強度（光学ブランク値）を測定する（工程Ｓ７０）。具体的には、制御処理部１６４は、光源制御部１６１を制御して、光源ユニット１２１に励起光αを出射させる。同時に、制御処理部１６４は、光センサー１４６が蛍光γと同じ波長の光の強度を検出するように、光センサー制御部１６２を制御する。このとき、励起光カットフィルター１４４は、プラズモン散乱光βを透過させない。よって、光センサー１４６は、正確にノイズとなる光の強度（光学ブランク値）を測定することができる。測定値は、制御処理部１６４に送信され、光学ブランク値として記録される。
次いで、捕捉体に捕捉された被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ８０）。具体的には、流路４１内に蛍光標識液を注入する。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。蛍光標識液が流路４１に注入されると、蛍光標識液が被検出物質に接触し、被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。
最後に、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、金属膜３０（金属膜３０表面およびその近傍）上から放出される蛍光γの強度を測定する（工程Ｓ９０）。具体的には、制御処理部１６４は、光源制御部１６１を制御して、光源ユニット１２１に励起光αを出射させる。同時に、制御処理部１６４は、光センサー１４６が金属膜（金属膜３０およびその近傍）上から放出される蛍光γを検出するように、光センサー制御部１６２を制御する。このとき、励起光カットフィルター１４４はプラズモン散乱光βを透過させないため、蛍光γのみが光センサー１４６に検出される。制御処理部１６４は、測定値から光学ブランク値を引き、被検出物質の量に相関する蛍光強度を算出する。蛍光強度は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。
以上の手順により、蛍光γを検出用の蛍光透過領域１５６を有する励起光カットフィルターの近傍のフィルターホルダー１４３に、プラズモン散乱光βを検出用の散乱光透過部１５３が配置されているため、励起光カットフィルター１４４を大きく移動させることなく、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。
以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの最適な入射角（増強角）を決定する際にも、励起光カットフィルター１４４を受光光学系ユニット１４０の光路から大きく退避させる必要がない。したがって、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、従来のＳＰＦＳ装置（特許文献２参照）のように励起光カットフィルターを蛍光の光路から完全に待避する必要がなく、小型化を実現することができる。また、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、被検出物質の存在または被検出物質の量を高感度かつ高精度に検出することができる。
［実施の形態２］
実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同様に、チップホルダー１２、励起光学系ユニット１２０、受光光学系ユニット２４０および制御部１６０を有する。実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置は、受光光学系ユニット２４０の構成のみが実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と異なる。そこで、本実施の形態では、受光光学系ユニット２４０についてのみ説明する。
図４Ａ，Ｂは、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置において、プラズモン散乱光βの検出および蛍光γの検出を説明するための図である。図４Ａは、プラズモン散乱光βの検出を説明するための図であり、図４Ｂは、蛍光γの検出を説明するための図である。
図４に示されるように、受光光学系ユニット２４０は、第１レンズ１４１、絞り１４２、フィルターホルダー１４３、励起光カットフィルター１４４、第２レンズ１４５、光センサー１４６および透過調整部２４７を有する。実施の形態２に係る受光光学系ユニット２４０における第１レンズ１４１、絞り１４２、フィルターホルダー１４３、励起光カットフィルター１４４、第２レンズ１４５および光センサー１４６は、実施の形態１に係る受光光学系ユニット１４０の各要素とそれぞれ同じである。
透過調整部２４７は、散乱光透過部１５３に向かうプラズモン散乱光βを遮蔽する。透過調整部１４７は、電磁シャッターまたは液晶シャッターである。本実施の形態では、透過調整部２４７は、電磁シャッターである。電磁シャッター（透過調整部）２４７は、シャッター本体２４８と、シャッター本体２４８を透過状態および遮蔽状態とするための電源２４９とを有する。ここで、「透過状態」とは、散乱光透過部１５３の少なくとも一部が開放されており、プラズモン散乱光βが散乱光透過部１５３を透過できる状態を意味する（図４Ａ参照）。また、「遮蔽状態」とは、シャッター本体２４８が散乱光透過部１５３全体を覆っており、プラズモン散乱光βが散乱光透過部１５３を透過できない状態を意味する（図４Ｂ参照）。このように、透過調整部２４７が散乱光透過部１５３を透過状態または遮蔽状態とすることで、プラズモン散乱光βの検出または蛍光γの検出を簡単に切り替えることができる。
次に、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置の検出動作について説明する。図５は、ＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。次いで、検体中の被検出物質と捕捉体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。
次いで、図４Ａに示されるように、制御処理部１６４は、電磁シャッター２４７を開放し、プラズモン散乱光βを透過状態にする（工程Ｓ２３０）。そして、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査して、最適な入射角を決定する（工程Ｓ４０）。
次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を、前の工程で決定した増強角に設定する（工程Ｓ５０）。以後の工程では、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角は、増強角のままである。
次いで、図４Ｂに示されるように、制御処理部１６４は、電磁シャッター２４７を閉じて、プラズモン散乱光βを遮蔽状態とする（工程Ｓ２６０）。そして、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、蛍光γと同じ波長の光の強度（光学ブランク値）を測定する（工程Ｓ７０）。
次いで、捕捉体に捕捉された被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ８０）。最後に、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、金属膜３０（金属膜３０表面およびその近傍）上から放出される蛍光γの強度を測定する（工程Ｓ９０）。
以上の手順により、励起光カットフィルター１４４を移動させることなく、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。
以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置では、励起光カットフィルター１４４を受光光学系ユニット２４０の光路から移動させる必要がない。したがって、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置は、従来のＳＰＦＳ装置（特許文献２参照）のように励起光カットフィルターを待避させるために水平方向に移動する必要がなく、小型化を実現することができる。また、被検出物質の存在または被検出物質の量を高感度かつ高精度に検出することができる。
［実施の形態３］
実施の形態３に係るＳＰＦＳ装置は、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００および実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置と同様に、チップホルダー１２、励起光学系ユニット１２０、受光光学系ユニット３４０および制御部１６０を有する。実施の形態３に係るＳＰＦＳ装置は、受光光学系ユニット３４０の構成のみが実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００および実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置と異なる。そこで、本実施の形態では、受光光学系ユニット３４０についてのみ説明する。
図６Ａ，Ｂは、実施の形態３に係るＳＰＦＳ装置において、プラズモン散乱光βの検出および蛍光γの検出を説明するための図である。図６Ａは、プラズモン散乱光βの検出を説明するための図であり、図６Ｂは、蛍光γの検出を説明するための図である。
図６Ａ，Ｂに示されるように、受光光学系ユニット３４０は、第１レンズ１４１、絞り１４２、フィルターホルダー３４３、励起光カットフィルター３４４、第２レンズ１４５、光センサー１４６および透過調整部１４７を有する。実施の形態３に係る受光光学系ユニット３４０における第１レンズ１４１、絞り１４２、第２レンズ１４５および光センサー１４６は、実施の形態１に係る受光光学系ユニット１４０における各要素とそれぞれ同じである。
本実施の形態では、フィルターホルダー３４３は、第３貫通孔３５２を有する。第３貫通孔３５２は、フィルターホルダー３４３の中央部分に配置されている。すなわち、本実施の形態では、フィルターホルダー３４３は、１つの貫通孔のみ形成されている。第３貫通孔３５２は、実施の形態１に係るフィルターホルダー１４３に形成された第１貫通孔１５２より大きく形成されている。したがって、本実施の形態に係るフィルターホルダー３４３は、実施の形態１に係るフィルターホルダー１４３と比較して、さらに外縁部で励起光カットフィルター３４４を保持している。
励起光カットフィルター３４４は、蛍光γを透過させるための蛍光透過領域１５６と、プラズモン散乱光βを透過させるための散乱光透過部１５３とを有する。散乱光透過部１５３は、蛍光透過領域１５６を避けて配置されている。上述したように、励起光カットフィルター３４４は、例えば、片面または両面が誘電体多層膜でコートされた透明基板を使用することができる。よって、散乱光透過部１５３は、散乱光透過部１５３が形成されるべき領域を予めマスキングした後に、誘電体多層膜を形成し、最後にマスキングを剥がすことで容易に成形することができる。また、散乱光透過部１５３を平面視したときの面積は、蛍光透過領域１５６を平面視したときの面積の１／１０００以下であることが好ましい。
次に、実施の形態３に係るＳＰＦＳ装置の検出動作について説明する。なお、フローチャートは、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同様であるため省略する。
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。次いで、検体中の被検出物質と捕捉体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。次いで、図６Ａに示されるように、制御処理部１６４は、フィルターホルダー３４３を移動させて、散乱光透過部１５３を受光光学系ユニット３４０内の光路上に配置する（工程Ｓ３０）。そして、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査して、最適な入射角を決定する（工程Ｓ４０）。次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を、前の工程で決定した増強角に設定する（工程Ｓ５０）。次いで、図６Ｂに示されるように、制御処理部１６４は、フィルターホルダー３４３を移動させて、蛍光透過領域１５６を受光光学系ユニット３４０の光路内に配置するとともに、散乱光透過部１５３を受光光学系ユニット３４０内の光路外に配置する（工程Ｓ６０）。そして、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、蛍光γと同じ波長の光の強度（光学ブランク値）を測定する（工程Ｓ７０）。次いで、捕捉体に捕捉された被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ８０）。最後に、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、金属膜３０（金属膜３０表面およびその近傍）上から放出される蛍光γの強度を測定する（工程Ｓ９０）。
以上の手順により、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と同様に、励起光カットフィルター３４４を大きく移動させることなく、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。
以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置では、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの最適な入射角（増強角）を決定する際にも、実施の形態１に係るＳＰＦＳ装置１００と比較して、励起光カットフィルター１４４を受光光学系の光路から大きく退避させる必要がない。
なお、特に図示しないが、励起光カットフィルター３４４において、散乱光透過部１５３は、蛍光透過領域１５６内に配置されていてもよい。この場合も、散乱光透過部１５３の大きさは、蛍光透過領域１５６の大きさの１／１０００以下であることが好ましい。このように、散乱光透過部１５３の大きさが蛍光透過領域１５６の大きさと比較して、著しく小さいため、蛍光γの検出をプラズモン散乱光βが阻害することがない。また、プラズモン散乱光βの検出と、蛍光γの検出との間において、励起光カットフィルター３４４を移動する必要がないため、さらに装置を小型化することができる。
［実施の形態４］
実施の形態４に係るＳＰＦＳ装置は、上述のＳＰＦＳ装置と同様に、チップホルダー１２、励起光学系ユニット１２０、受光光学系ユニット４４０および制御部１６０を有する。実施の形態４に係るＳＰＦＳ装置は、受光光学系ユニット４４０の構成のみが実施の形態３に係るＳＰＦＳ装置と異なる。そこで、本実施の形態では、受光光学系ユニット４４０についてのみ説明する。
図７Ａ，Ｂは、実施の形態４に係るＳＰＦＳ装置において、プラズモン散乱光βの検出および蛍光γの検出を説明するための図である。図７Ａは、プラズモン散乱光βの検出を説明するための図であり、図７Ｂは、蛍光γの検出を説明するための図である。
図７Ａ，Ｂに示されるように、受光光学系ユニット４４０は、第１レンズ１４１、絞り１４２、フィルターホルダー１４３、励起光カットフィルター１４４、第２レンズ１４５、光センサー１４６および透過調整部４４７を有する。実施の形態４に係る受光光学系ユニット４４０における第１レンズ１４１、絞り１４２、フィルターホルダー３４３、第２レンズ１４５および光センサー１４６は、実施の形態１に係る受光光学系ユニット１４０における各要素とそれぞれ同じである。
本実施の形態では、フィルターホルダー３４３は、第４貫通孔４５２を有する。第４貫通孔４５２は、励起光カットフィルター１４４の外形とほぼ同じ大きさに、フィルターホルダー３４３の中央部分に形成されている。
透過調整部４４７は、フィルターホルダー３４３を介して励起光カットフィルター１４４を、蛍光γまたはプラズモン散乱光βの光軸に直交する方向を回転軸として、回転自在のθステージ４４８と、θステージ４４８をθ回転させるためのθ回転機構４４９とを有する。
次に、励起光カットフィルター１４４を上記の回転軸を中心にθ回転させることによるプラズモン散乱光βの検出について説明する。図８は、励起光カットフィルター１４４を透過する波長と、励起光カットフィルター１４４の透過率と、の関係を示すグラフである。図８の実線は、励起光カットフィルター１４４の回転角度が０°の場合を示している。図８の破線は、励起光カットフィルター１４４の回転角度が１５°の場合を示している。図８の一点鎖線は、励起光カットフィルター１４４の回転角度が２０°の場合を示している。ここでは、６５２〜６７２ｎｍの範囲内に透過波長帯を有する励起光カットフィルター１４４を例に挙げて説明する。また、励起光の波長は６３５ｎｍとした。
図８に示されるように、上述した多層膜を有する励起光カットフィルター１４４を傾斜させると、励起光カットフィルター１４４を透過する光の波長が短波長側にシフトすることがわかる。すなわち、励起光カットフィルター１４４（多層膜）を傾斜させることにより、プラズモン散乱光βは、励起光カットフィルター１４４を透過することができることがわかる。具体的には、図８の実線に示されるように、励起光カットフィルター１４４の回転角度（入射角）が０°の場合、励起光αが十分に遮蔽されていることがわかる。一方、図８の一点鎖線に示されるように、励起光カットフィルター１４４の回転角度（入射角）が２０°の場合、６３５ｎｍの波長の光は、励起光カットフィルター１４４を２０%程度透過することがわかる。よって、励起光カットフィルター１４４の傾斜角度を調整することにより、プラズモン散乱光βの検出および蛍光γの検出を切り替えることができることがわかる。
次に、実施の形態４に係るＳＰＦＳ装置の検出動作について説明する。図９は、実施の形態４に係るＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。次いで、検体中の被検出物質と捕捉体とを反応させる（１次反応、工程Ｓ２０）。
次いで、図７Ａに示されるように、制御処理部１６４は、フィルターホルダー３４３をθ回転させることで、励起光カットフィルター１４４（多層膜）を所定の角度に傾斜させる（工程Ｓ４３０）。そして、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査して、最適な入射角を決定する（工程Ｓ４０）。
次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を、前の工程で決定した増強角に設定する（工程Ｓ５０）。以後の工程では、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角は、増強角のままである。
次いで、図７Ｂに示されるように、制御処理部１６４は、フィルターホルダー３４３を逆方向にθ回転させることで、励起光カットフィルター１４４をもとの傾斜に戻す（工程Ｓ４６０）。そして、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、蛍光γと同じ波長の光の強度（光学ブランク値）を測定する（工程Ｓ７０）。
次いで、捕捉体に捕捉された被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応、工程Ｓ８０）。最後に、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射して、金属膜３０（金属膜３０表面およびその近傍）上から放出される蛍光γの強度を測定する（工程Ｓ９０）。
以上の手順により、励起光カットフィルター１４４を平面方向に移動させることなく、検体中の被検出物質の存在または被検出物質の量を検出することができる。
以上のように、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置では、実施の形態２に係るＳＰＦＳ装置と同様の効果を得ることができる。
本出願は、２０１４年２月５日出願の特願２０１４−０２０３５６に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置および表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、被検出物質を高い信頼性で測定することができるため、例えば臨床検査などに有用である。
１０ 分析チップ
１２ チップホルダー
２０ 誘電体
２１ 入射面
２２ 成膜面
２３ 出射面
３０ 金属膜
４０ 流路蓋
４１ 流路
１００ 表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）
１２０ 励起光学系ユニット
１２１ 光源ユニット
１２２ 角度調整部
１４０，２４０，３４０，４４０ 受光光学系ユニット
１４１ 第１レンズ
１４２ 絞り
１４３，３４３ フィルターホルダー
１４４，３４４ 励起光カットフィルター
１４５ 第２レンズ
１４６ 光センサー
１４７，２４７，４４７ 透過調整部
１５１ 絞り孔
１５２ 第１貫通孔
１５３ 第２貫通孔（散乱光透過部）
１５４，４４８ ステージ
１５５ モーター
１５６ 蛍光透過領域
１６０ 制御部
１６１ 光源制御部
１６２ 光センサー制御部
１６３ モーター制御部
１６４ 制御処理部
２４８ シャッター本体
２４９ 電源
３５２ 第３貫通孔
４４９ 回転機構
４５２ 第４貫通孔

Claims (14)

  1. 金属膜を一面に有する誘電体を含む分析チップが装着され、前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上の被検出物質を標識する蛍光物質を励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
    前記分析チップを着脱可能に保持するチップホルダーと、
    励起光を出射する光源と、
    前記誘電体を介して前記金属膜に所定の入射角で励起光を照射するために、前記金属膜に対する励起光の入射角を調整する角度調整部と、
    前記金属膜の前記誘電体と対向しない面の近傍から出射される光を検出する光センサーと、
    前記金属膜の近傍から出射された光を前記光センサーに導く受光光学系と、
    前記受光光学系内に配置され、前記金属膜上から出射された蛍光を透過させ、励起光の少なくとも一部の波長の光を遮断する蛍光透過領域を含む、励起光カットフィルターと、
    前記励起光カットフィルターを保持するフィルターホルダーと、
    前記励起光カットフィルターまたは前記フィルターホルダーに配置され、前記金属膜上から出射されたプラズモン散乱光を透過させる散乱光透過部と、
    前記散乱光透過部を介するプラズモン散乱光の透過の可否を調整する透過調整部と、
    を有し、
    前記散乱光透過部を平面視したときの面積は、前記励起光カットフィルターの蛍光透過領域を平面視したときの面積より小さい、
    表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  2. 前記角度調整部および前記透過調整部を制御する制御部をさらに有し、
    前記制御部は、前記透過調整部により前記散乱光透過部を介してプラズモン散乱光を透過させ、前記光センサーによる前記プラズモン散乱光の検出結果に基づいて、前記角度調整部による前記金属膜に対する励起光の入射角を制御する、
    請求項１に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  3. 前記透過調整部は、前記光センサーがプラズモン散乱光を検出する時には、前記散乱光透過部を前記受光光学系内の光路上に移動させ、前記光センサーが蛍光を検出する時には、前記散乱光透過部を前記受光光学系内の光路外に移動させる、請求項１または請求項２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  4. 前記散乱光透過部を平面視したときの面積は、前記蛍光透過領域を平面視したときの１／１０００以下の面積である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  5. 前記透過調整部は、前記散乱光透過部に向かうプラズモン散乱光を遮蔽する、請求項１、２、４のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  6. 前記透過調整部は、電磁シャッターである、請求項５に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  7. 前記透過調整部は、液晶シャッターである、請求項５に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  8. 前記散乱光透過部は、前記フィルターホルダーに配置されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  9. 前記散乱光透過部は、前記蛍光透過領域を避けて前記励起光カットフィルターに配置されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  10. 前記散乱光透過部は、前記励起光カットフィルターの前記蛍光透過領域内に配置されている、請求項１、２、４〜７のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  11. 前記散乱光透過部の中心軸は、前記励起光カットフィルターに到達した光の光軸に沿って配置されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  12. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
    前記被検出物質を、誘電体の一面上に配置された金属膜上に配置する工程と、
    蛍光を透過させ、励起光の少なくとも一部の波長の光を遮断する蛍光透過領域を有する励起光カットフィルター、または前記励起光カットフィルターを保持するためのフィルターホルダーに形成された散乱光透過部を、プラズモン散乱光が透過可能な位置に移動した状態で、前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射され、かつ前記散乱光透過部を透過したプラズモン散乱光の強度を検出して、プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する工程と、
    前記励起光カットフィルターに配置された蛍光透過領域を蛍光が透過可能な位置に移動した状態で、前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出され、かつ前記蛍光透過領域を透過した蛍光の強度を検出する工程と、
    を含む、表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
  13. 金属膜を一面に有する誘電体を含む分析チップが装着され、前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射することで、前記金属膜上の被検出物質を標識する蛍光物質を励起させ、前記蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
    前記分析チップを着脱可能に保持するチップホルダーと、
    励起光を出射する光源と、
    前記誘電体を介して前記金属膜に所定の入射角で励起光を照射するために、前記金属膜に対する励起光の入射角を調整する角度調整部と、
    前記金属膜の前記誘電体と対向しない面の近傍から出射される光を検出する光センサーと、
    前記金属膜の近傍から出射された光を前記光センサーに導く受光光学系と、
    前記受光光学系内に配置され、前記金属膜上から出射された蛍光を透過させ、励起光の少なくとも一部の波長の光を遮断する励起光カットフィルターと、
    前記金属膜上から出射されたプラズモン散乱光が透過可能となるように、前記励起光カットフィルターを前記金属膜表面の法線に対して傾斜させる透過調整部と、を有する、
    表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
  14. 被検出物質を標識する蛍光物質が、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光により励起されて発した蛍光を検出して、前記被検出物質の存在またはその量を検出する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
    前記被検出物質を、誘電体の一面上に配置された金属膜上に配置する工程と、
    蛍光を透過させ、励起光の少なくとも一部の波長の光を遮断する励起光カットフィルターを、プラズモン散乱光が透過可能となるように、前記金属膜表面の法線に対して傾斜させた状態で、前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記金属膜上から出射され、前記励起光カットフィルターを透過したプラズモン散乱光の強度を検出して、プラズモン散乱光の強度が最大となるときの入射角である増強角を決定する工程と、
    前記励起光カットフィルターを、励起光の少なくとも一部の波長の光を遮断する角度に配置した状態で、前記金属膜に対する入射角が前記増強角となるように、前記誘電体を介して前記金属膜に励起光を照射するとともに、前記蛍光物質から放出され、かつ前記励起光カットフィルターを透過した蛍光の強度を検出する工程と、
    を含む、表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
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