WO2012105872A1 - Гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена с60, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе - Google Patents

Гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена с60, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе Download PDF

Info

Publication number
WO2012105872A1
WO2012105872A1 PCT/RU2012/000062 RU2012000062W WO2012105872A1 WO 2012105872 A1 WO2012105872 A1 WO 2012105872A1 RU 2012000062 W RU2012000062 W RU 2012000062W WO 2012105872 A1 WO2012105872 A1 WO 2012105872A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fullerene
derivatives
amino acids
drug
polyamino
Prior art date
Application number
PCT/RU2012/000062
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Лев Давидович Раснецов
Яков Юделевич ШВАРЦМАН
Ольга Николаевна СУВОРОВА
Original Assignee
Rasnetsov Lev Davidovich
Shvartsman Iakov Yudelevich
Suvorova Olga Nikolaevna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CN201280003407.9A priority Critical patent/CN103347849B/zh
Priority to AU2012212707A priority patent/AU2012212707B2/en
Priority to ES12741829.1T priority patent/ES2582872T3/es
Priority to CA2810507A priority patent/CA2810507A1/en
Application filed by Rasnetsov Lev Davidovich, Shvartsman Iakov Yudelevich, Suvorova Olga Nikolaevna filed Critical Rasnetsov Lev Davidovich
Priority to US13/820,769 priority patent/US9221746B2/en
Priority to MX2013008545A priority patent/MX354436B/es
Priority to BR112013012910-7A priority patent/BR112013012910A2/pt
Priority to EP12741829.1A priority patent/EP2674415B1/en
Priority to EA201201448A priority patent/EA020801B1/ru
Priority to AP2013007072A priority patent/AP4014A/en
Priority to UAA201301251A priority patent/UA110345C2/ru
Publication of WO2012105872A1 publication Critical patent/WO2012105872A1/ru
Priority to ZA2013/03447A priority patent/ZA201303447B/en
Priority to IL226736A priority patent/IL226736A/en
Priority to HK14103544.9A priority patent/HK1190386A1/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/14—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of carbon skeletons containing rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C227/00—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C227/14—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton from compounds containing already amino and carboxyl groups or derivatives thereof
    • C07C227/18—Preparation of compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton from compounds containing already amino and carboxyl groups or derivatives thereof by reactions involving amino or carboxyl groups, e.g. hydrolysis of esters or amides, by formation of halides, salts or esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/08—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to hydrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/12—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of acyclic carbon skeletons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/06—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2604/00—Fullerenes, e.g. C60 buckminsterfullerene or C70

Definitions

  • the invention relates to the pharmaceutical industry and medicine, in particular to new homo- and hetero-polyamino acid derivatives of C 6 fullerene of formula (I), as well as to a process for their preparation and creation of pharmaceutical compositions based on them.
  • fullerene derivatives in medicine is based on the lipophilic properties of the fullerene nucleus, allowing fullerene derivatives to penetrate cell membranes, and the ability of fullerene to generate singlet oxygen, which breaks down DNA, with a high quantum yield. These properties provide functional fullerene derivatives with cytotoxic, antiviral, and other properties (Bedrov D., Smith GD, Davande N., "Passive transport of fullerenes through a lipid membrane.” J. Pharm. Chem., B, 2008, v .
  • a promising method for producing water-soluble fullerene compositions is the chemical modification of the sphere fullerene by the introduction of hydrophilic solubilizing ligands.
  • International application WO2005 / 070827 presents a series of amino acid derivatives of fullerene obtained by the reaction of cycloaddition of amino acid fragments to fullerene and the products of their incorporation into biologically active organic substrates.
  • the synthesis methods presented in this technical solution are multi-stage and non-technological. The resulting compounds have low solubility in water.
  • Analogues of the present invention are compounds and methods for their preparation described in international application WO2009 / 00203, as well as RF patent JY "2236852.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) equimolar addition of amino acids to fullerene followed by the replacement of active hydrogen with an organic biologically active ligad to form compounds of the type.
  • the obtained compounds have inhibitory activity against tumor metastases, enhance the antileukemic activity of cyclophosphamide, and may be suitable as donors of nitric oxide or as quick-acting vasodilators for antihypertensive therapy.
  • the main disadvantage of the compounds of this application is that they are products of covalent attachment, contain a small amount of polar groups and have a low solubility in water.
  • fullerene polycarboxylic anions of the general formula C 6 oH n [NH (CH 2 ) m C (0) 0 " ] n, where C 60 is the fullerene core, NH ( CH 2 ) m C (0) 0 " is an aminocarboxylic anion; m is an integer from 1 to 5, n is an integer from 2 to 12.
  • an amino acid in the form of a salt (potassium or sodium) is added to a solution of fullerene in o-dichlorobenzene (toluene or any other organic solvent), then a solubilizer is added.
  • a solubilizer various polyalkylene oxides are used: polyethylene glycol whether they say. masses from 150 to 400, and above 400 (for example, PEG-1500), as well as polyethylene glycol dimethyl ether mol. mass 500.
  • any strong reducing agent (alkali metals) is added.
  • the ratio of fullerene to amino acids increased by more than 50 times.
  • water-insoluble fullerene polycarboxylic acid is converted to more preferred pharmaceutically acceptable salts, such as the sodium salt, which are soluble in water.
  • the addition of a salt of weak volatile acid occurs by treating the solution with a salt of an alkali metal and weak volatile acid. When the solution is concentrated by evaporation or lyophilization, the weak acid is removed, and fullerene polycarboxylic acids are released in the form of their alkali metal salts.
  • the target product according to this invention is characterized by a constant composition, the content in the target product of the main substance is only 87.8%.
  • the description does not contain any technological regulations related to determining the optimal amounts of the starting compounds, the ratios of the amounts of solvents used, and, especially, the description of the methods for isolating the desired compounds.
  • fullerene amino acid derivatives obtained by the production method presented in the patent are that this method produces a mixture of fullerene carboxylate anions, both salt and acid forms. Get an individual connection by the method described in the patent, does not seem possible. Also, fullerene polyamino acids obtained by the patented method in the acid form are practically insoluble in water. It was not possible to obtain a stable pharmaceutical composition with fullerene polycarboxylic anions, because during storage, the compounds precipitate.
  • the method uses freshly prepared anhydrous potassium salts of amino acids in a finely divided state, and the precipitation of the solid precipitate of potassium salts of fullerene polyamino acids is carried out by filtration, washing with ethyl alcohol and drying.
  • fullerene polyamino acids of the specified composition can only be obtained using freshly prepared anhydrous potassium salts of amino acids.
  • the interfacial catalyst methyl esters of polyethylene oxides of molecular weight 200, 400, 500 are used.
  • compositions containing, as active substance, homo- and hetero-polyamino acid derivatives of fullerene of the formula (II), having activity against herpes virus, hepatitis C virus, influenza viruses of various nature, HIV, as well as anti - tumor and anti-psoriatic activity.
  • the pharmaceutical compositions may be in the form of tablets, capsules, ointments, emulsions, suppositories, solutions, sprays.
  • compositions according to the proposed technical solution contain a compound of the general formula (II) in an amount effective to achieve the desired result, and can be administered in unit dosage forms (for example, in solid, semi-solid or liquid forms) containing compounds the proposed technical solution as an active ingredient in a mixture with a carrier or excipient suitable for intramuscular, intravenous, oral, sublingual, inhalation, local, nasal, rectal and vaginal administration.
  • the active ingredient may be included in the composition along with commonly used non-toxic pharmaceutically acceptable carriers suitable for the manufacture of solutions, tablets, pills, capsules, dragees, suppositories, emulsions, suspensions, ointments, gels and any other dosage forms.
  • the specific dosage level and frequency of drug administration for each particular patient will depend on a large number of factors, including the activity of a particular derivative of fulle rena, metabolic stability and duration of action, rate of excretion, patient age, body weight, general health, gender, drug combinations, as well as the severity of the disease in the individual being treated.
  • compositions are formulated according to methods well known in the pharmaceutical art and may contain microcrystalline cellulose or derivatives thereof to provide bulk, alginic acid or sodium alginate as suspending agent an agent, methyl cellulose as a viscosity enhancer, and sweeteners and / or perfumes known in the art.
  • such compositions may contain microcrystalline cellulose, calcium phosphate, starch, magnesium stearate and lactose and / or other excipients, binders, diluents, disintegrants, diluents and lubricants known in the art.
  • compositions When used in the form of nasal aerosols or by inhalation, such compositions are prepared by methods well known in the field of pharmaceutical formulations, and they can be produced as solutions in physiological saline, using benzoic acid or other suitable preservatives, adsorption promoters to enhance bio-applicability and / or other solubilizing or dispersing agents known in the art.
  • Injectable solutions or suspensions may be formulated according to known methods using non-toxic, parenterally acceptable diluents or solvents such as mannitol, 1, 3-butanediol, water, Ringer's solution or isotonic sodium chloride solution or suitable dispersing or wetting and suspending agents, such as sterile, soft, stable oils, including synthetic mono- or diglycerides, or fatty acids, including oleic acid.
  • suitable diluents or solvents such as mannitol, 1, 3-butanediol, water, Ringer's solution or isotonic sodium chloride solution or suitable dispersing or wetting and suspending agents, such as sterile, soft, stable oils, including synthetic mono- or diglycerides, or fatty acids, including oleic acid.
  • compositions can be prepared by mixing the drug with a non-irritating excipient such as cocoa butter, synthetic glyceride esters or polyethylene glycols, which are solids at ordinary temperatures but liquefy and / or dissolve in the body cavity with the release of the drug.
  • a non-irritating excipient such as cocoa butter, synthetic glyceride esters or polyethylene glycols, which are solids at ordinary temperatures but liquefy and / or dissolve in the body cavity with the release of the drug.
  • compositions When applied topically in the form of ointments, gels, creams, lines, etc. such compositions may be prepared by mixing the active ingredients with an acceptable ointment base.
  • Fat, hydrocarbon or hydrophilic bases for example, petroleum jelly, paraffin oil, paraffin, wax, lanolin, polyethylene glycol, etc. can be used as ointment bases.
  • Methyl cellulose, sodium salt of carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polyethylene glycol or polyethylene oxide, carbopol, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, etc. can be used as the basis for gels.
  • compositions that contain, as an active substance, homo- and hetero-polyamino acid derivatives of fullerene of the formula (II), having activity against herpes virus, hepatitis C virus, influenza viruses of various nature, HIV, as well as antitumor and anti-psoriatic activity.
  • Pharmaceutical compositions are in the form of tablets, capsules, ointments, suppositories, solutions, sprays.
  • the inventive method allows to obtain various homo- and hetero-polyamino acid derivatives of fullerene depending on the ratio of reagents and process conditions.
  • Example 1 Preparation of fullerene polyamino-caproic acid of the formula C 6 o (H3) ⁇ NH (CH2) 5 COO " ⁇ 3 ⁇ NH 3 + (CH 2 ) 5 COOH ⁇ 3.
  • the yield of the target product is quantitative with respect to the starting fullerene.
  • the compound is a dark brown solid, soluble in dimethyl sulfoxide: water - 1: 200 mixture, sparingly soluble in mixtures of ⁇ 1 ⁇ : ⁇ 2 0 - 1: 1 and DMF- ⁇ 2 0.
  • Thermogravimetric analysis of the product shows the presence in the complex of 3 moles of loosely coupled aminocaproic acid, cleaving with decomposition at a temperature of 200 ° C.
  • the thermal decomposition of fullerene polyamino acid occurs at a temperature of 345 ° C with the release of fullerene and its oxidation products.
  • the amount of solid residue after decomposition of the compound, which is unsubstituted fullerene according to diffraction analysis, corresponds to the ratio C60: amino acid fragment as 1: 6.
  • Acid hydrolysis of compound 0, 1 with a molar solution of HC1 leads to the release of aminocaproic acid hydrochloride in an amount of 3 moles per mole of starting material.
  • the electronic absorption spectrum of the product does not contain absorption bands of free fullerene.
  • the IR spectrum of the product contains absorption bands characteristic of ⁇ -substituted amino acids: -COOH group - 1704 cm “1 , 1658 cm “ 1 , NH 3 + groups - 3100, 2550, 2000 cm “1 , - ⁇ - ⁇ - stretching vibrations of 3300 cm “1 , ⁇ - ⁇ -strain 1552 cm “ 1 , absorption bands ⁇ ⁇ schreib-NH-R-1 104 cm “1 , 930 cm “ 1 , 830 cm “1 .
  • Example 2 Obtaining Y-fullerene-y-aminobutyric acid with ⁇ -alanine of the formula: C 6 schreib ( ⁇ ) ⁇ KH (CH 2 ) cCOO " ⁇ s (KH 3 + CH 2 -CH 2 —COOH) 3 .
  • the compound is a dark brown solid soluble in dimethyl sulfoxide: water - 1: 200 mixture, sparingly soluble in CH 3 CN: H 2 0 - 1: 1 and DMF-H 2 0 mixtures.
  • Thermogravimetric analysis of the product shows the presence in the complex of 3 moles of loosely bound ⁇ -alanine, cleaving at a temperature of 210 ° C.
  • the thermal decomposition of the whole complex takes place at a temperature of 335 ° C with the release of fullerene in the amount corresponding to the ratio of C b o ⁇ amino acid fragments as 1: 6.
  • the spectra of the product in solutions in dimethyl sulfoxide and in a 0, 1 N aqueous solution of NaOH contain absorption bands in the region of 217, 260, 335 nm, characteristic of fullerene derivatives and do not contain absorption bands of free fullerene.
  • the IR spectrum of the compound contains absorption bands characteristic of ⁇ -substituted amino acids and cationic forms of amino acids: —COOH groups “ 1717 cm ” 1 , 1710 cm “1 , 1658 cm ” 1 , groups NH 3 + 3100, 2550, 2000 cm “1, ⁇ - ⁇ -stretching vibrations 3400 cm” 1, NH- stretching vibrations - 3400 cm “1, NH- deformation - 1552 cm” 1, the absorption band of C b-NH-R- 1104 cm “1 930 cm "1 , 830 cm “ 1 .
  • Acid hydrolysis of the compound results in the release of glutamine hydrochloride in an amount of 3 moles per mole of the starting material.
  • the preparation obtained by the method described in example 1 is named for the preparation Ns 1 (fullerenepolyaminocaproic acid).
  • Example 4 Investigation of the activity of the preparation of fullerenpolyaminocaproic acid against human immunodeficiency virus.
  • test drug was added to the cells and infected with the virus at a dose of 0.01 TCID 50 / cell.
  • Cell cultures were incubated at 37 ° C in an atmosphere with 5% C0 2 and 98% humidity for 4-5 days. The results were taken into account by staining the cells with dye and light microscopy: investigation of the cytopathic effect of the virus (JRC) and virus-induced syncytium formation (syncytium is a conglomerate of several cells with a common cell membrane formed as a result of fusion of their membranes).
  • JRC cytopathic effect of the virus
  • virus-induced syncytium formation syncytium is a conglomerate of several cells with a common cell membrane formed as a result of fusion of their membranes.
  • the degree of cytodestruction was evaluated under a microscope according to the generally accepted four-cross ' system with + or - signs, respectively, according to the number of dead cells in each of the four wells corresponding to one studied parameter.
  • Example 5 Investigation of the antiherpetic activity of the preparation of fullerenpolyaminocaproic acid in in vitro experiments. The study was performed by the Research Institute of Virology named after D.I. Ivanovo RAMS, Moscow.
  • the study used transplantable monkey kidney cell culture (VERO), obtained from the tissue culture collection of the Institute of Virology. I.D. Ivanovo RAMS; Herpes simplex virus, type 1, strain L 2 , propagated in Vero cells. Cells were infected with the virus at a dose of 100 TCID 50 / 0.2ml and 1000 TCID 50 / 0.2ml.
  • VEO transplantable monkey kidney cell culture
  • the preparation was initially dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) in a ratio of 1: 20, and then working concentrations were prepared on the MEM NEEDLE medium.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the activity of the tested samples was evaluated by the degree of protection of cells from the virus-induced cytotoxic effect of HSV using the microscopic method and the MTT method of optical density. The results of the study.
  • the toxicity of the substances in the used concentrations, as well as the solvent was studied.
  • the preparation at final concentrations of 50 to 1000 mcg / ml are adding to the monolayer VERO cell culture and incubated in an atmosphere of 5.0% C0 2 at 37 ° C for 24-48 hours.
  • the cell monolayer was stained with a 0.4% trypan blue solution and examined under a microscope.
  • the sample at a concentration of up to 100 ⁇ g / ml did not have a toxic effect on the VERO cell culture; at a concentration of 200 ⁇ g / ml, signs of a toxic effect appear - 25% of the cells are dead. Concentrations of 500 ⁇ g / ml or more are already toxic to Vero cells (Table 3).
  • the study of the protective properties of the sample was carried out with one administration schedule — one hour before infection, and with two doses of the virus — 100 TCID 50 and 1000 TCID 50 .
  • Example 6 Study of the activity of fullerenepolyaminocaproic acid (preparation No. 1) against influenza virus A / IIV-Moscow / 01/2009 (HlNl) swl.
  • the preparation was diluted in DMSO (5 mg of substance + 0.5 ml of DMSO), followed by the addition of 4.5 ml of MEM cell culture medium, thereby obtaining a stock at a concentration of 1.0 mg / ml. Subsequently, wastewater was diluted with MEM medium to working concentrations of 6.5 ⁇ g / ml - 12.5 -25.0 - 50.0 - 100 ⁇ g / ml.
  • the antiviral activity of the substances was determined by reducing the reproduction of the influenza virus in the MDCK cell culture detected by ELISA.
  • MDSK cells were grown in 96-well plates to a complete monolayer, washed from the growth medium, and the substances were added at a double concentration in 100 ⁇ l of MEM medium.
  • Virus infection in a working dose of 100-1000 TTsID 50 was carried out in two modes: 2 hours after the introduction of substances and at the same time.
  • the plates were incubated in a thermostat with C0 2 for 24 hours at 37 ° C. After incubation, the medium was removed and the cells were fixed with 80% acetone in PBS for 15 minutes, dried well and ELISA was performed by adsorption of specific reagents — monoclonal antibodies, conjugate and substrate (orthophenylenediamine).
  • the reaction was taken into account by optical density at 492 nM on a spectrophotometer Biocom firms. Each virus dilution was examined in 3 replicates, for which the average optical density (OD) was calculated. The percentage of inhibition was determined as the ratio between the difference between the OD of experience and the OD of cell control, divided by the difference between the OD of the viral control and the OD of the cell control, multiplied by 100%. Based on the data obtained, the values of the minimum concentration of the substance causing 50.0% inhibition of viral reproduction (MIC 50 ) were determined.
  • Example N-? 7 The study of the antiviral activity of fullerenpolyaminocaproic acid (preparation No. 1) in a model of influenza pneumonia in mice. The studies were carried out at the Center for Chemistry of Medicines (TsHLS-VNIHFI), Moscow.
  • influenza virus A / Aichi / 2/69 H3N2
  • H3N2 H3N2
  • This virus is widely used to determine the effectiveness of antiviral drugs on the model of influenza pneumonia in mice and was obtained from the Museum of Viral Strains and Cell Cultures of the Research Institute of Virology RAMS.
  • the mice were infected intranasally with the allantoic virus, after the onset of signs of the disease, they were killed and, under sterile conditions, lung tissue homogenate was obtained. Further, this homogenate was used to infect 10-day-old chicken embryos from which the allantoic virus was obtained and, after titration on its mice, was used to infect animals.
  • mice Females weighing 12-14 g were obtained from the Andreevka nursery (Moscow region) and kept on a standard diet under regulated vivarium conditions.
  • mice Pre-weighed mice (non-linear females, average weight 12-14 g) were infected intranasally under mild ether anesthesia with the influenza virus A / Aichi / 2/69 (H3N2) (10 LD 50 in 100 ⁇ l).
  • H3N2 influenza virus A / Aichi / 2/69
  • LD 50 was determined by titration of the allantoic virus in the same mice that These were then used in the main experiment.
  • the following treatment regimen was used with the studied drug: 24 hours before infection, 1 hour before infection, 24 hours later, and then once a day, 24 hours for 5 days.
  • a single-use insulin syringe with a special needle (lavage) was used, each dose was administered in a volume of 100 ⁇ l.
  • each dose was also administered in a volume of 100 ⁇ l.
  • the viral control group consisted of 10 mice infected with the virus but not treated with the drugs. Also in the experiment there were two groups of 10 uninfected mice, which were injected intraperitoneally and intramuscularly with 100 ⁇ l of 1.5% DMSO, which was used as a solvent for the preparations. In the remaining groups, there were also initially 10 animals. The treated and control animals were monitored daily; in the first 5 days after infection, the mice were weighed every day, then every other day. The chemotherapeutic activity of the drug in a mouse influenza pneumonia model was evaluated according to three criteria: protection against fatal viral infection, increase in average life expectancy, and decrease in weight loss in the animals treated with the drug compared to the control group.
  • the treatment with fullerenaminocaproic acid was effective, reducing the mortality of mice from influenza pneumonia and weight loss, and increasing the average life expectancy compared with the viral control.
  • the effectiveness of this treatment depended on the dose of the drug and the treatment method.
  • the results are presented in tables 10 - 1 1.
  • the most effective in all three parameters was the intramuscular treatment of fullerenpolyaminocaproic acid, which prevented the death of 60-70% of infected animals and their weight loss at doses of 100 and 200 mg / kg / day , and also increased their life expectancy by almost 2 times.
  • Intraperitoneal treatment with fullerenpolyaminocaproic acid was effective only at doses of 50 and 100 mg / kg / day.
  • Example N2 8. Study of the antitumor effect of fullerenpolyaminocaproic acid (preparation No. 1) in case of transplantable tumors of leukemia L1210, breast adenocarcinoma Ca-755 and Lewis carcinoma.
  • mice DBA / 2 mice with transplanted L1210 leukemia cells.
  • the age of the mice is 6-8 weeks, weight 19-25 g.
  • mice males of the C 57 BL / 6j line with transplanted C-755 cells The age of the mice is 6-8 weeks, weight 19-25 g.
  • mice males of the C 57 BL / 6j line with 3LL transplanted cells Mice males of the C 57 BL / 6j line with 3LL transplanted cells.
  • mice The age of the mice is 6-8 weeks, weight 18-24 g.
  • Table 13 shows the average life expectancy of animals with transplantable tumors of L1210 leukemia and the control group, as well as data on the increase in life expectancy compared to the control group in%.
  • mice of the control group with transplanted tumor cells of leukemia L1210 were 6.0 ⁇ 0.21 days.
  • the introduction of the drug significantly increased the life expectancy of mice to 10.7 ⁇ 0.37 days and 10.60 ⁇ 0.37 days, the percentage increase in duration life compared with the control was 78.33% and 76.67% for doses of the drug 100 mg / kg and 200 mg / kg, respectively, however, the differences between the experimental groups were statistically unreliable.
  • mice receiving the study drug was significantly less than in the control group, and in animals receiving the study drug in a dose of 250 mg / kg, the average weight gain was significantly lower (1.5 times) compared to - Niyu with such an indicator in animals treated with the drug at a dose of 100 mg / kg.
  • the obtained results allow us to conclude that the drug exhibits a pronounced anti-tumor effect and inhibits the growth of tumor cells of L1210 leukemia in mice, which was manifested in a significant increase in life expectancy (78.33% and 76.67%) for doses of 100 and 250 mg / kg and significant inhibition of accumulation of ascites in experimental animals (78-43%). Signs of intoxication against the background of the administration of the study drug were not registered. An analysis of the data revealed significant differences between the dose of 100 mg / kg and the dose of 250 mg / kg - an increase in the dose leads to a significant decrease in ascites accumulation in experimental animals. For other indicators, the contrast (the difference between the means for the groups receiving different doses of the study drug) was at the level of errors caused by the natural spread of data.
  • Table 16 shows the average life expectancy of animals with transplantable tumors of mammary adenocarcinoma Ca-755 and the control group, as well as data on the increase in life expectancy compared to the control group in%.
  • mice in the control group with inoculated tumor cells with mammary adenocarcinoma tumors Ca-755 was 37.9 + 0.74 days /
  • the obtained results allow us to conclude that the drug exhibits a pronounced anti-tumor effect and inhibits the growth of tumor cells of mammary adenocarcinoma Ca-755 in mice, which was manifested in a significant increase in life expectancy (89.71% and 93.67%) for doses of 100 and 250 mg / kg. Signs of intoxication against the background of the administration of the study drug were not registered.
  • tumors developed in 21 of 26 mice (80.8%) the first tumors were registered on the 7th day after inoculation and were registered up to 40 days.
  • the first tumors in the group with the drug at a dose of 100 mg / kg were recorded on the 7th day after inoculation and were recorded up to 60 days; in the group with the drug at a dose of 250 mg / kg were recorded on day 8 after inoculation and were recorded up to 60 days.
  • the drug had a pronounced antitumor effect on the development of Lewis lung carcinoma; the percentage of inhibition in the drug group - 100 mg / kg compared with the control group for 10-17 days was reliably 71.77% and 58.5%, in the drug group - 250 mg / kg compared with the control group at 10- 17 days - 84.37% and 54.2%, respectively.
  • Table 17 shows the effect of the drug on the growth of Lewis carcinoma, analyzed the timing of the tumor reaching a size of 500 mm; in the control group, this indicator ranged from 12 to 20 days, and in the experimental groups from 17 to 28 days. As can be seen from this table, the drug significantly increased this indicator by 22-27% compared with the control.
  • mice in the control group occurred as a result of the progression of tumor growth of the main focus, as well as due to extensive metastatic lung damage.
  • the individual life expectancy of mice in the control group ranged from 28 to 39 days, in groups with the drug from 51 to 60 days.
  • Table 18 shows the effect of the drug on the average life expectancy of mice after tumor inoculation. As can be seen from table 18, the drug significantly increased the average life expectancy by about 70% compared with the control group, the difference between the experimental groups is not statistically significant.
  • the antiherpetic activity of a sample of fullerene polyaminocanoic acid in a Vero cell culture with an infectious dose of herpes virus is 100 TCID 50 / 0.2 ml
  • influenza virus in the culture of

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, а именно к новым гомо- и гетеро-полиаминокислотным производным фуллерена С6 0 общей формулы: C60(H)x{NH(CH2)nCOO-}x{NH3 +(L)COOH)}x, где п = 2-5, х = 3, L = -(СН2)m, где m = 1-5, либо -CO(CH2)kCH(NH2)-, где к = 1-2, характеризующиеся тем, что соединения содержат ковалентно-связанные аминокислотные группы и полярные ионные формы аминокислот, а также к способу их получения и созданию фармацевтических композиций на их основе. Способ получения гомо- и гетеро- полиаминокислотные производных фуллерена, основанный на реакции нуклеофильного присоединения аминокислот к фуллерену с образованием ковалентно связанных аминокислотных производных фуллерена с последующим введением полярных ионных форм аминокислот. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного вещества гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена формулы C60(H)x{NH(CH2)nCOO-}x {NH3 +(L)COOH)}x, где n = 2-5, х = 3, L = -(СН2)m, где m = 1-5, либо - CO(CH2)kCH(NH2)-, где к = 1-2.

Description

Гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена Сбо, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе
Область техники Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, а именно к новым гомо- и гетеро-полиаминокислотным производным фуллерена С6о формулы (I), а также к способу их по- лучения и созданию фармацевтических композиций на их основе.
Figure imgf000003_0001
где п = 2-5, х = 3, L = -(СН2)т, при т = 2-5 или
-CO(CH2)kCH(NH2)-, где к = 1-2.
Предшествующий уровень техники
Применение производных фуллерена в медицине основано на липофильных свойствах фуллеренового ядра, позволяющих фулле- реновым производным проникать через клеточные мембраны, и способности фуллерена с высоким квантовым выходом генериро- вать синглетный кислород, расщепляющий ДНК. Эти свойства обеспечивают функциональным производным фуллерена проявле- ние цитотоксических, антивирусных и других свойств (Bedrov D., Smith G.D., Davande Н., "Passive transport of fullerenes through a lipid membrane." J.Phys.Chem., B, 2008, v. l 12., p.2078-84, Qiao R., Roberts A.E., "Translocation of fullerene and its derivatives across a lipid bilay- er", Nano Lett., 2007, v.7, p.614-9. Nelsen G.D., и др., "In vivo biology and toxicology of fullerenes and their derivatives", Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 2008, v.103, p.197-208, Pat US 6204391 , 2005, "Water soluble fullerenes with antiviral activity").
Основной проблемой, затрудняющей биологические исследо- вания производных фуллеренов и создания лечебных препаратов на их основе связано с нерастворимостью фуллеренов в воде, что за- трудняет их прямое введение в организм человека. Одним из воз- можных вариантов преодоления этих трудностей является введение молекул фуллерена в солюбилизирующие матрицы. Известны спо- собы получения водорастворимых форм фуллерена за счет образо- вания аддукта с поливинилпирролидоном (Kiselev O.I. et al. //Mol. Materials. 1998. V. 1 1. P. 121 ; Piotrovsky L.B. et al. //Ibidem. 2000. V. 13. P. 41). Показана его эффективность против вируса гриппа А- и В-типа.
Известен также способ получения фуллеренов, включающий смешивание предварительно растворенных в органическом раство- рителе фуллеренов с полимерной матрицей в хлороформе, выпари- вание смеси под вакуумом до полного удаления растворителей, рас- творение полученного комплекса в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4-7,6) с последующей обработкой продукта ультразвуком (RU 2162819, 02.10.01). При этом в качестве водорастворимой полимерной матрицы используют мембранные кефалины. Продук- ты, полученные в результате таких модификаций, являются неста- бильными композициями с ограниченными возможностями хране- ния.
Перспективным методом получения водорастворимых фулле- реновых композиций является химическая модификация сферы фуллерена введением гидрофильных солюбилизирующих лигандов. В международной заявке WO2005/070827 представлена серия ами- нокислотных производных фуллерена, полученных по реакции цик- лоприсоединения аминокислотных фрагментов к фуллерену, и про- дуктов их внедрения в биологически-активные органические суб- страты. Представленные в данном техническом решении методы синтеза многостадийны и нетехнологичны. Полученные соединения имеют низкую растворимость в воде.
В настоящее время получен большой ряд функционализиро- ванных фуллеренов, содержащих гидрофильные фрагменты как в боковой цепи присоединенных к фуллерену лигандов (детергент- ный тип комплексов), так и сферический тип производных, когда имеются полярные группы, распределенные по фуллереновой сфере (такой тип включает фуллеренолы, аминоаддукты).
Наиболее перспективными для использования являются ами- нокислотные производные фуллерена.
Аналогами настоящего изобретения являются соединения и способы их получения, описанные в международной заявке WO2009/00203, а также патенте РФ JY« 2236852.
В международной заявке WO2009/00203 описаны полифунк- циональные аминокислотные производные фуллерена формулы
Figure imgf000005_0001
, где R = Н, моно- или дигидроксиалкил, галоидалкил, моно- или динитроксиалкил, малеинимид; N-Z представляет собой фрагмент , β, γ, ω-аминокислоты общей формулы -NH-CmH2m- СООМ или C4H8N-COOM, где m = 2-5, а М представляет собой нитроксиалкильную группу, алкильную группу или соль щелочного металла, или дипептид. Данные соединения получены по реакции
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) эквимолярного присоединения аминокислот к фуллерену с после- дующим замещением активного водорода органическим биологиче- ски активным лигадом с образованием соединений типа. Получен- ные соединения, обладают ингибирующей активностью в отноше- нии метастазов опухоли, усиливают антилейкемическую активность циклофосфамида, и могут быть пригодны в качестве доноров моно- оксида азота или в качестве вазодилататоров быстрого действия для антигипертинезивной терапии.
Основным недостатком соединений по данной заявке являет- ся то, что они являются продуктами ковал ентного присоединения, содержат малое количество полярных групп и имеют низкую рас- творимость в воде.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является средство для ингибирования репродукции обо- лочечных вирусов и способ его получения (патент РФ Ν» 2236852). В результате взаимодействия фуллерена с солью аминокислоты в среде органического растворителя в присутствии полиалкиленокси- да получены фуллеренполикарбоновые анионы общей формулы C6oHn[NH(CH2)mC(0)0"]n, где С60 - фуллереновое ядро, NH(CH2)mC(0)0" - аминокарбоновый анион; m равно целому числу от 1 до 5, п равно целому числу от 2 до 12.
Для получения этих соединений к раствору фуллерена в о-дихлорбензоле (толуоле или любом другом органическом раство- рителе) вносят аминокислоту в виде соли (калиевой или натриевой), затем добавляют солюбилизатор. Порядок внесения в реакционную среду аминокислоты и солюбилизатора не важен, можно вносить их в виде комплекса, предварительно смешав. В качестве солюбилиза- тора используют различные полиалкиленоксиды: полиэтиленглико- ли мол. массы от 150 до 400, и выше 400 (например, ПЭГ- 1500), а также диметиловый эфир полиэтиленгликоля мол. массы 500. Для увеличения скорости реакции добавляют любой сильный восстано- витель (щелочные металлы).
Соотношение фуллерена и аминокислоты увеличено более чем в 50 раз. Превращение в желаемую фармацевтически приемлемую соль, особенно натриевую или калиевую, выполнялось путем обработки кислоты подходящим основанием или путем добавления соли слабой летучей кислоты. В частности, не растворимая в воде фуллеренполикарбоновая кислота превращается в более предпочтительные фармацевтически приемлемые соли, такие как натриевая соль, которые растворимы в воде. Добавление соли слабой летучей кислоты происходит путем обработки раствора солью щелочного металла и слабой летучей кислоты. При концентрировании раствора путем выпаривания или лиофилизации слабая кислота удаляется, а фуллеренполикарбоновые кислоты выделяются в виде их солей щелочных металлов. Целевой продукт по данному изобретению характеризуется постоянством состава, содержание в целевом продукте основного вещества составляет всего 87,8%. В описании отсутствуют технологические регламенты, связанные с определением оптимальных количеств исходных со- единений, соотношений количеств используемых растворителей и, особенно, описания методов выделения искомых соединений.
Основными недостатками фуллеренаминокислотных произ- водных, полученных представленным в патенте методом получения является то, что данным способом получают смесь фуллеренкар- боксилатных анионов, как солевых, так и кислотных форм. Полу- чить индивидуальное соединение способом, описанным в патенте, не представляется возможным. Также фуллеренполиаминокислоты, полученные запатентованным способом, в кислотной форме прак- тически нерастворимы в воде. Получить стабильную фармацевти- ческую композицию с фуллеренполикарбоновыми анионами не удалось, т.к. в процессе хранения соединения выпадают в осадок.
Применение в синтезе большого избытка калиевой или на- триевой солей аминокислот и больших избытков растворителей приводит к возникновению экологических проблем, связанных с утилизацией отходов производства, а также к удорожанию процесса производства. Использование щелочных металлов для увеличения скорости реакции является технологически невозможным при ис- пользовании хлорированных ароматических растворителей.
Однако, представленные в патенте уникальные биохимиче- ские свойства препаратов на основе соединений фуллерена с ами- нокислотными фрагментами ставят задачу получения новых произ- водных фуллерена, разработки высокотехнологичного способа их промышленного получения, отличающегося простотой и эффектив- ностью процесса, чистотой, экологичностью и доступностью ис- ходных реагентов.
Раскрытие изобретения
Для решения данной задачи предлагается группа изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом, а именно: го- мо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена, способ получения производных фуллерена и фармацевтические компози- ции, включающие гомо- и гетеро-полиаминокислотные производ- ные фуллерена в качестве действующего вещества. Варьируя соот- ношение реагентов и условия проведения процесса, по заявляемому способу можно получать различные производные фуллерена. Указанная задача решается гомо- и гетеро- полиаминокислотными производными фуллерена общей формулы (И):
C60(H)x{NH(CH2)nCOO-}x{NH3 +(L)COOH)}x, где п = 2-5, х = 3, L = -(СН2)т ,где т = 1-5, ^ либо -CO(CH2)kCH(NH2)- , где к = 1-2.
В случае, когда т = п получают гомо-полиаминокислотные производные фуллерена, при m п - гетеро-полиаминокислотные - производные фуллерена.
Указанная задача решается способом получения гомо- и гете- ро-полиаминокислотные производных фуллерена, образующихся при взаимодействии фуллерена с 10-кратным мольным избытком безводных калиевых солей аминокислот в среде органического ароматического растворителя при добавлении к полученной сус- пензии межфазного катализатора при перемешивании и нагревании до температуры не выше 60°С до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка, который затем выделяют, раство- ряют в воде, после чего осуществляют обработку водных растворов калиевых солей фуллеренполиаминокислот 1Н раствором органи- ческих или минеральных кислот с последующим добавлением рас- творов аминокислот в полярных растворителях. В способе исполь- зуют свежеприготовленные безводные калиевые соли аминокислот в мелкодисперсном состоянии, а выделение твердого осадка калие- вых солей фуллеренполиаминокислот осуществляют фильтровани- ем, промывкой этиловым спиртом и высушиванием. В процессе экспериментов было выявлено, что фуллеренполиаминокислоты указанного состава могут быть получены только при использовании свежеприготовленных безводных калиевых солей аминокислот. В качестве межфазного катализатора используют метиловые эфиры полиэтиленоксидов молекулярной массы 200, 400, 500.
Указанная задача решается также созданием фармацевтиче- ских композиций, содержащих в качестве активного вещества гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена формулы (II), обладающих активностью против вируса герпеса, вируса гепа- тита С, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противо- опухолевой и противопсориатической активностью. Фармацевтиче- ские композиции могут быть выполнены в форме таблеток, капсул, мазей, эмульсий, суппозиториев, растворов, спреев.
Фармацевтические композиции по предложенному техниче- скому решению содержат соединение общей формулы (II) в количе- стве, эффективном для достижения желаемого результата, и могут быть введены в виде стандартных лекарственных форм (например, в твердой, полутвердой или жидкой формах), содержащих соедине- ния предложенного технического решения в качестве активного ин- гредиента в смеси с носителем или наполнителем, пригодным для внутримышечного, внутривенного, перорального, сублингвального, ингаляционного, местного, назального, ректального и вагинального введения. Активный ингредиент может быть включен в компози- цию вместе с обычно используемыми нетоксичными фармацевти- чески приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, драже, суппозиториев, эмуль- сий, суспензий, мазей, гелей и любых других лекарственных форм.
Конкретный уровень дозировок и частота приема лекарства для каждого конкретного пациента будет зависеть от большого чис- ла факторов, включая активность конкретного производного фулле- рена, метаболическую стабильность и длительность действия, ско- рость выделения, возраст пациента, вес тела, общее состояние здо- ровья, пол, лекарственные комбинации, а также тяжесть заболева- ния у индивида, подвергаемого лечению.
Для орального применения в виде суспензий композиции го- товят согласно методам, широко известным в области приготовле- ния фармацевтических рецептур, и они могут содержать микрокри- сталлическую целлюлозу или ее производные для обеспечения мас- сы, альгиновую кислоту или альгинат натрия в качестве суспенди- рующего агента, метилцеллюлозу в качестве усилителя вязкости и подслащивающие агенты и/или отдушки, известные в этой области. В форме таблеток такие композиции могут содержать микрокри- сталлическую целлюлозу, кальций фосфат, крахмал, стеарат магния и лактозу и/или другие эксципиенты, связующие вещества, расши- рители, дезинтеграторы, разбавители и смазывающие вещества, из- вестные в данной области.
При применении в виде назальных аэрозолей или путем инга- ляции такие композиции готовят методами, хорошо известными в области фармацевтических рецептур, и они могут выпускаться в виде растворов на физиологическом растворе, с использованием бензойной кислоты или других подходящих консервантов, промо- торов адсорбции для усиления биоприменимости, и/или других со- любилизирующих или диспергирующих агентов, известных в дан- ной области.
Растворы или суспензии для инъекций могут формироваться согласно известным методам, с использованием нетоксичных, па- рентерально применимых разбавителей или растворителей, таких как маннит, 1 ,3-бутандиол, вода, раствор Рингера или изотониче- ский раствор хлористого натрия или подходящих диспергирующих или смачивающих и суспендирующих агентов, таких как стериль- ные, мягкие, устойчивые масла, включая синтетические моно- или диглицериды, или жирные кислоты, включая олеиновую кислоту.
При ректальном или вагинальном применении в виде свечей такие композиции могут готовиться путем смешивания лекарства с таким нераздражающим эксципиентом, как масло какао, синтетиче- ские глицеридные сложные эфиры или полиэтиленгликоли, которые являются твердыми веществами при обычных температурах, но сжижаются и/или растворяются в полости тела с выделением лекар- ства.
При местном применении в виде мазей, гелей, кремов, лини- ментов и т.д. такие композиции могут готовиться путем смешива- ния активных ингредиентов с приемлемой мазевой основой.
В качестве мазевой основы могут быть использованы жиро- вые, углеводородные или гидрофильные основы, например вазелин, вазелиновое масло, парафин, воск, ланолин, полиэтиленгликоль и др.
В качестве основы для гелей могут быть использованы ме- тилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, оксипро- пилцеллюлоза, полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид, карбопол, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт и т.д.
Технический результат изобретения состоит в том, что полу- чены новые гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фул- лерена формулы: C60(H)x{NH(CH2)nCOO'}x{NH3 +(L)COOH)}x, где п = 2-5, х = 3, L = -(СН2)т, где т = 1-5, либо -CO(CH2)kCH(NH2)-, где к = 1-2, характеризующиеся тем, что соединения содержат ковалент- но-связанные аминокислотные группы и полярные ионные формы аминокислот, разработан новый промышленный способ получения аминокислотных производных фуллерена С6о с различным соотно- шением компонентов с использованием реакции нуклеофильного присоединения к фуллерену аминокислоты с образованием продук- тов полиприсоединения. Предложены фармацевтические компози- ции, содержащие в качестве активного вещества гомо- и гетеро- полиаминокислотные производные фуллерена формулы (II), обла- дающие активностью против вируса герпеса, вируса гепатита С, ви- русов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью. Фармацевтические компо- зиции выполнены в форме таблеток, капсул, мазей, суппозиториев, растворов, спреев.
Соединения обладают новыми свойствами:
- растворимостью в смеси диметилсульфоксид-вода (1 : 100, 1 :200); - высокой био доступностью;
- высокой эффективностью воздействия на инфицированные клет- ки;
- низкой токсичностью.
Заявляемый способ позволяет получить различные гомо- и ге- теро-полиаминокислотные производные фуллерена в зависимости от соотношения реагентов и условий проведения процесса. Способ основан на использовании в стадии синтеза оптимальных соотно- шений исходных реагентов (1 : 10), минимальных количеств органи- ческого растворителя и межфазного катализатора, с последующем выделением заявляемых композиций с использованием концентри- рованных растворов органических и минеральных кислот, с после- дующим введением аминокислот ряда NH2LCOOH, где L = -(СН2)т, либо -CO(CH2)kCH(NH2), что приводит к количественному получе- нию фуллеренаминокислотных композиций определенного состава и возможности применения заявляемого способа для их промыш- ленного синтеза, отличающегося эффективностью и экологично- стью.
Заявляемое изобретение иллюстрируется следующими при- мерами.
Варианты осуществления изобретения
Пример 1. Получение фуллеренполиаминокапроновой кисло- ты формулы C6o(H3){NH(CH2)5COO"} 3{NH3 +(CH2)5COOH} 3.
К раствору 7,2 г (0,01 моля) фуллерена С6о в 400 мл о- дихлорбензола добавляют 17 г (ОД моля) свежеполученной тонко измельченной безводной калийной соли ε-аминокапроновой кисло- ты. К полученной суспензии при перемешивании и нагревании не выше 80°С прибавляют в течение 2-х часов смесь о-дихлобензола и метилового эфира полиэтиленгликоля 400 в соотношении 2,5: 1. Ре- акционную смесь перемешивают при температуре не выше 60°С в течение 2-3 часов до полного обесцвечивания раствора и формиро- вания твердого осадка. Затем смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают несколькими порциями этилового спирта и высушива- ют в вакууме при температуре не выше 60°С. Выделенную калие- вую соль фуллеренаминокислоты растворяют в 2 л дистиллирован- ной воды. В раствор медленно при перемешивании добавляют 1Н раствор соляной кислоты до рН 5, 1. Смесь отстаивают до полного высаживания продукта. Затем водный слой декантируют. К осадку, представляющему собой тонкую взвесь твердого продукта в воде, медленно при перемешивании добавляют раствор аминокапроновой кислоты в смеси диметилсульфоксида с водой (1 : 10). Смесь пере- мешивают до полного растворения. Затем растворители удаляют отгонкой в вакууме. Твердый остаток высушивают при температуре не выше 60°С в вакуумном сушильном шкафу.
Выход целевого продукта количественный по отношению к исходному фуллерену. Соединение представляет собой темно- коричневое твердое вещество, растворимое в смеси диметилсуль- фоксид:вода - 1 :200, ограниченно растворимое в смесях СНзС1чГ:Н20 - 1 : 1 и ДМФА-Н20.
Термогравиметрический анализ продукта показывает наличие в комплексе 3 молей слабосвязанной аминокапроновой кислоты, отщепляющейся с разложением при температуре 200°С. Термиче- ское разложение фуллеренполиаминокислоты проходит при темпе- ратуре 345°С с выделением фуллерена и продуктов его окисления. Количество твердого остатка после разложения соединения, пред- ставляющего собой по данным дифракционного анализа незаме- щенный фуллерен, соответствует соотношению С60: аминокислот- ный фрагмент как 1 : 6.
Кислотный гидролиз соединения 0, 1 молярным раствором НС1 приводит к выделению гидрохлорида аминокапроновой кисло- ты в количестве 3 молей на моль исходного вещества.
Адсорбция соединения на поверхности силикагеля приводит к расщеплению ионных связей и выделению свободной аминокапро- новой кислоты. Последующим фотометрическим анализом продук- тов реакции аминокапроновой кислоты с нингидрином определено количество ионносвязанных аминокислотных групп. Их количество соответствует составу заявляемых соединений.
Электронный спектр поглощения продукта не содержит полос поглощения свободного фуллерена. ИК-спектр продукта содержит полосы поглощения, характер- ные для Ν-замещенных аминокислот: группа -СООН- 1704 см"1, 1658 см'1, группы NH3 +- 3100, 2550, 2000 см"1, -Ν-Η-валентные ко- лебания 3300 см"1, Ν-Η-деформационные 1552 см"1, полосы погло- щения Сбо-NH-R- 1 104 см"1, 930 см"1, 830 см"1.
Элементный анализ продукта показывает следующие соотно- шения элементов: %С=76,84; %Н=4,80; %N=5,15, для брутто- формулы C96H75N6Oi 2 (молекулярная масса 1503) рассчитано: %С = 76,49, %Н = 4,90, %N = 5,57.
Пример 2. Получение Ы-фуллерен-у-аминомасляной кислоты с β-аланином формулы: С6о(Нз){КН(СН2)зСОО"}з(КН3 +СН2-СН2- СООН)3.
К раствору 7,2 г (0,01 моля) фуллерена С6о в 400 мл о- дихлорбензола добавляют 14 г (0,1 моля) свежепо лученной безвод- ной калиевой соли γ-аминомасляной кислоты. К полученной сус- пензии при перемешивании и нагревании не выше 60°С прибавляют в течение 2-х часов смесь о-дихлобензола и метилового эфира по- лиэтиленгликоля 400 в соотношении 3 : 1. Реакционную смесь пере- мешивают при температуре не выше 60°С в течение 2-3 часов до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка. Затем смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают нескольки- ми порциями этилового спирта и высушивают в вакууме при тем- пературе не выше 60°С. Выделенный продукт растворяют в дистил- лированной воде. В раствор медленно при перемешивании добав- ляют 1Н раствор соляной кислоты до рН 5, 1. Смесь отстаивают до полного высаживания продукта. Затем водный слой декантируют. К осадку, представляющему собой тонкую взвесь твердого продукта в воде, медленно при перемешивании добавляют спиртовый раствор 2,7 г (0,03 моля) β-аланина. Смесь перемешивают в течение 2 часов до полного растворения осадка. После удаления растворителя вы- делено 12 г продукта.
Соединение представляет собой темно-коричневое твердое вещество, растворимое в смеси диметилсульфоксид:вода - 1 :200, ограниченно растворимое в смесях CH3CN:H20 - 1 : 1 и ДМФА-Н20.
Термогравиметрический анализ продукта показывает наличие в комплексе 3 молей слабосвязанного β-аланина, отщепляющегося при температуре 210°С. Термическое разложение всего комплекса проходит при температуре 335°С с выделением фуллерена в коли- честве соответствующем соотношению Сбо^аминокислотные фраг- менты как 1 : 6.
Кислотный гидролиз полученного соединения 0,01 молярным раствором НС1 приводит к образованию гидрохлорида β-аланина в количестве 3 молей на моль исходного вещества.
Спектры продукта в растворах в диметилсульфоксиде и в 0, 1 Н водном растворе NaOH содержат полосы поглощения в области 217, 260, 335 нм, характерные для производных фуллерена и не со- держат полос поглощения свободного фуллерена.
ИК-спектр соединения содержит полосы поглощения, харак- терные для Ν-замещенных аминокислот и катионных форм амино- кислот: группы -СООН" 1717 см"1, 1710 см"1, 1658 см"1, группы NH3 + 3100, 2550, 2000 см"1, Ν-Η-валентные колебания 3400 см"1, N-H- валентные колебания - 3400 см"1, N-H- деформационные - 1552 см"1, полосы поглощения Сбо-NH-R- 1 104 см"1, 930 см"1, 830 см"1.
Элементный анализ продукта показывает следующие соотно- шения элементов: %С=75,24; %Н=3,80; %N=6,25, для брутто- формулы C8iH48N6012 (молекулярная масса 1296) рассчитано: %С = 75,00, %Н = 3,70, %N = 6,48.
Пример 3. Получение Ы-фуллерен-г-аминокапроновой кисло- ты с глутамином формулы: C6o(H3){NH(CH2)5COO"
}3 {NH3 +(CO)(CH2)2CH(NH2)COOH} 3.
Процесс проводят так же, как в примере 1. Только на стадии обработки осадка после осаждения кислой формы фуллерен- аминокапроновой кислоты добавляют раствор 4,5 г глутамина в смеси диметилсульфоксид-вода. Растворители удаляют отгонкой в вакууме.
Элементный анализ твердого продукта показывает следую- щие соотношения элементов: %С=71 ,34; %Н=4,80; %N=8,25, для брутто-формулы C93H69N9Oi5 (молекулярная масса 1551) рассчита- но: %С = 71,95, %Н = 4,50, %N = 8,12.
ИК-спектр соединения содержит полосы поглощения, харак- терные для Ν-замещенных аминокислот и катионных форм амино- кислот: группы -СООН- 1714 см"1, 1707 см"1, -C=O(NH-C60) 1658 см' , группы NH3 + 3000, 2550, 2000 см"1, N-H -валентные колебания 3400 см'1, N-H- деформационные 1552 см"1, полосы поглощения С6о~ NH-R- 1.104 см"1, 930 см"1, 830 см"1.
Кислотный гидролиз соединения приводит к выделению глу- тамин гидрохлорида в количестве 3 молей на моль исходного веще- ства.
Была изучена противовирусная активность соединений в от- ношении ВИЧ, ВПГ, вируса гриппа, а также противоопухолевая ак- тивность. В приведенных ниже примерах препарат, полученный способом, описанным в примере 1 , назван по тексту препарат Ns 1 (фуллеренполиаминокапроновая кислота). Пример 4. Исследование активности препарата фуллеренпо- лиаминокапроновой кислоты в отношении вируса иммунодефицита человека.
Исследования проводились в лаборатории вирусов иммуно- дефицита с испытательным Центром по экспертной оценке проти- вовирусных и дезинфекционных средств (ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН).
К клеткам добавляли исследуемый препарат и инфицировали вирусом в дозе 0,01 ТЦИД50/клетка. Инкубировали культуры клеток при 37°С в атмосфере с 5% С02 и 98% влажности 4-5 дней. Учет ре- зультатов проводили окрашиванием клеток с помощью красителя и световой микроскопии: исследование цитопатического эффекта ви- руса (ЦПД) и вирусиндуцируемого синцитийобразования (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран).
Степень цитодеструкции оценивали под микроскопом по общепринятой четырехкрестовой ' системе знаками + или - соответственно количеству погибших клеток в каждой из четырех лунок, соответствующих одному исследуемому показателю.
++++ - 100%^ гибель клеток в четырех лунках, использованных в опыте на одно разведение
+++ - 75%Μ гибель клеток в каждой из четырех лунок,
++ - 50%Μ гибель клеток в каждой из четырех лунок,
+ - 25%ая гибель клеток в каждой из четырех лунок,
+- - начало дегенерации,
-отсутствие цитодеструкции.
Результаты исследования представлены в таблицах 1-2. Полученные данные (таблица 1 , 2) показали, что исследован- ные препараты фуллеренполиаминокапроновой кислоты обладали противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефи- цита человека типа 1. ЭК50 (50%-эффективная концентрация) пре- парата 0,9 мкг/мл. Препарат в концентрациях 0,5-10 мкг/мл не об- ладал цитотоксическим действием на клетки.
Пример 5. Исследование противогерпетической активности препарата фуллеренполиаминокапроновой кислоты в эксперимен- тах in vitro. Исследование выполнялось ГУ НИИ вирусологии им.Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва.
В процессе исследования были изучены цитотоксическая и противогерпетическая активность препарата в клеточных культурах Vero.
В исследовании были использованы: перевиваемая культура клеток почки обезьян (VERO), полученная из коллекции культур тканей Института вирусологии им. И.Д. Ивановского РАМН; вирус герпеса простого (Herpes simplex virus), тип 1 , штамм Л2, размно- женный в клетках Vero. Клетки инфицировали вирусом в дозе 100 ТЦИД50/0,2мл и 1000 ТЦИД50/0,2мл.
Для исследования представлен образец субстанции в виде по- рошка темного цвета.
Препарат первоначально растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) в соотношении 1 :20, а затем готовили рабочие концентра- ции на среде ИГЛА MEM. Оценку активности испытанных образ- цов проводили по степени защиты клеток от вирусиндуцированного цитотоксического действия ВПГ микроскопическим методом и ме- тодом МТТ по оптической плотности. Результаты исследования. Исследована токсичность веществ в использованных концентрациях, а также растворителя (1 ,5мл ДМСО в 50мл воды).
Препарат в конечных концентрациях от 50 до 1000 мкг/мл до- бавляли к монослою клеточной культуры VERO и инкубировали в атмосфере 5,0 % С02 при 37°С в течение 24-48 часов. Монослой клеток окрашивали 0,4% раствором трипанового синего и исследо- вали под микроскопом.
Образец в концентрации до 100 мкг/мл не оказывал токсиче- ского действия на культуру клеток VERO, при концентрации 200 мкг/мл появляются признаки токсического действия - отмечается гибель 25% клеток. Концентрации в 500 мкг/мл и более уже ток- сичны для Vero клеток (табл. 3).
Исследование защитных свойств образца проводили при од- ной схеме введения - за час до инфицирования, и при двух дозах вируса - 100 ТЦИД50 и 1000 ТЦИД50.
Результаты представлены в таблицах 3 - 7.
Проведенные исследования показали, что введение за 60 ми- нут образца препарата до инфицирования клеточной культуры ви- русом герпеса простого в дозе 100 ТЦИД50 полностью защищает клетки от цитодеструктивного действия вируса при всех испытан- ных концентрациях - от 5,0 мкг/мл и выше (см. табл. 4 и 5).
При увеличении инфицирующей дозы вируса герпеса до 1000 ТЦИД5о/0,2мл (см. табл. 6 и 7), образец препарата обеспечивает полную защиту чувствительной культуры клеток от цитодеструк- тивного действия вируса при данной схеме испытания (инфициро- вание клеток вирусом через 60 минут после внесения препарата в культуральную среду). Пример 6. Изучение активности фуллеренполиаминокапроно- вой кислоты (препарат N° 1) в отношении вируса гриппа A/IIV- Moscow/01/2009 (HlNl)swl.
Исследования проводились в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва. В задачу исследований входило изучение противовирусной активности этих препаратов в культуре клеток MDCK в отношении вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl.
Препарат разводили в ДМСО (5 мг субстанции + 0,5 мл ДМСО) с последующим добавлением 4,5 мл среды для культур кле- ток MEM, получая, таким образом, сток в концентрации 1 ,0 мг/мл. В последующем проводили разведения стоков средой MEM до ра- бочих концентраций 6,5 мкг/мл - 12,5 -25,0 - 50,0 - 100 мкг/мл.
Определение противовирусной активности веществ проводи- ли по снижению репродукции вируса гриппа в культуре клеток MDCK, выявляемой ИФА.
С этой целью клетки МДСК выращивали в 96-луночных планшетах до полного монослоя, отмывали от ростовой среды и вносили вещества в двукратной концентрации в 100 мкл среды MEM. Инфицирование вирусом в рабочей дозе 100-1000 ТЦИД50 проводили в двух режимах: через 2 часа после внесения веществ и одномоментно. Планшеты инкубировали в термостате с С02 в тече- ние 24 часов при 37°С. После инкубации среду удаляли и клетки фиксировали 80% ацетоном в PBS в течение 15 минут, хорошо вы- сушивали и осуществляли постановку ИФА, проводя последова- тельно адсорбцию специфических реагентов - моноклональных ан- тител, конъюгата и субстрата (ортофенилендиамин). Реакцию учи- тывали по оптической плотности при 492 нМ на спектрофотометре фирмы «Биоком». Каждое разведения вируса исследовали в 3-х по- вторах, для которых вычисляли среднее значение оптической плот- ности (ОП). Процент ингибирования определяли, как отношение между разницей ОП опыта и ОП клеточного контроля, разделенное на разницу ОП вирусного контроля и ОП клеточного контроля, ум- ноженное на 100%. На основании полученных данных определены значения минимальной концентрации вещества, вызывающей 50,0% ингибирование вирусной репродукции (МИК50).
Оценку подавления репродукции вируса гриппа A(H1N1) проводили в 3-х опытах при разной множественности заражения. Результаты представлены в табл. 8 (протоколы 3 опытов) и табл. 9 (средние значения полученных результатов 3 опытов).
Как видно из таблицы 9, четко прослеживается зависимость степени репродукции и концентрации препарата: с повышением концентрации - снижается репродукция вируса. Кроме того, значи- тельных отличий в показателях при разных режимах инфицирова- ния (через 2 часа после внесения препарата или одномоментно) не отмечено.
Таким образом, полученные результаты изучения активности разных разведений препарата в отношении вируса гриппа A/IIV- Moscow/01/2009 (HlNl)swl выявили высокую активность подавле- ния его репродукции в культуре клеток MDCK. При этом режимы внесения препаратов за 2 часа до инфицирования или одновременно с инфицированием не влияли на их активность в культуре клеток MDCK.
Пример N-? 7. Изучение противовирусной активности фулле- ренполиаминокапроновой кислоты (препарат N° 1) на модели грип- позной пневмонии мышей. Исследования выполнялись в центре химии лекарственных средств (ЦХЛС-ВНИХФИ), г. Москва.
В работе использовали препарат в виде темно-коричневого кристаллического порошка. Для перорального применения готови- ли необходимые дозы препарата, растворяя навески в 1% растворе крахмала, сваренного на воде. Для внутрибришинного и внутри- мышечного применения навески препарата растворяли в 1,5% рас- творе ДМСО.
В работе был использован вирус гриппа А/Аичи/2/69 (H3N2), адаптированный к мышам. Данный вирус широко используется для определения эффективности противовирусных препаратов на моде- ли гриппозной пневмонии мышей и был получен из музея вирусных штаммов и клеточных культур ГУ НИИ вирусологии РАМН. Для подготовки инфицирующего материала мышей заражали интрана- зально аллантоисным вирусом, после проявления признаков болез- ни их забивали и в стерильных условиях получали гомогенат легоч- ной ткани. Далее этот гомогенат использовали для заражения 10- дневных куриных эмбрионов, из которых получали аллантоисный вирус и после титрования на его мышах использовали для инфици- рования животных.
Белых беспородных мышей (самки) массой 12-14 г получали из питомника «Андреевка» (Московская обл.) и содержали на стан- дартном рационе в регламентированных условиях вивария.
Предварительно взвешенные мыши (самки нелинейные, сред- ний вес 12-14 г) инфицировались интраназально под легким эфир- ным наркозом вирусом гриппа А/Аичи/2/69 (H3N2) (10ЛД50 в 100 мкл). В предварительном опыте было проведено определение ЛД50 путем титрования аллантоисного вируса на таких же мышах, кото- рые затем использовались в основном опыте. Была использована следующая схема лечения исследуемым препаратом: за 24 часа до инфицирования, за 1 час до инфицирования, через 24 часа и далее 1 раз в день через 24 часа в течение 5 дней. Для перорального введе- ния использовали одноразовый инсулиновый шприц со специаль- ной иглой (лаваж), каждую дозу вводили в объеме 100 мкл. Для внутрибрюшинного и внутримышечного лечения также каждую до- зу вводили в объеме 100 мкл. Группа вирусного контроля представ- ляла собой 10 мышей, инфицированных вирусом, но не леченных препаратами. Также в опыте было две группы по 10 неинфициро- ванных мышей, которым вводили внутрибрюшинно и внутримы- шечно по 100 мкл 1,5% ДМСО, который использовался в качестве растворителя препаратов. В остальных группах также изначально было по 10 животных. За леченными и контрольными животными велось ежедневное наблюдение, в первые 5 дней после инфициро- вания мыши взвешивались каждый день, далее - через день. Химио- терапевтическую активность препарата на модели гриппозной пневмонии мышей оценивали по трем критериям: показатель защи- ты от смертельной вирусной инфекции, увеличение средней про- должительности жизни и уменьшение снижение веса в группах жи- вотных, леченных препаратом по сравнению с контрольной груп- пой.
Лечение фуллеренаминокапроновой кислотой было эффек- тивно, уменьшая смертность мышей от гриппозной пневмонии и потерю их веса, и увеличивая среднюю продолжительность жизни по сравнению с вирусным контролем. Эффективность данного ле- чения зависела от дозы препарата и способа лечения. Результаты представлены в таблицах 10 - 1 1. Наиболее эффективным по всем трем параметрам (показатель защиты от смертности, средняя продолжительность жизни и потеря веса) было лечение фуллеренполиаминокапроновой кислотой внут- римышечно, которое в дозах 100 и 200 мг/кг/день предотвращало гибель 60-70% зараженных животных и потерю их веса, а также увеличивало продолжительность их жизни почти в 2 раза. Внутри- брюшинное лечение фуллеренполиаминокапроновой кислотой бы- ло эффективно только в дозах 50 и 100 мг/кг/день. Гибель живот- ных, значительное снижение средней продолжительности жизни и веса мышей при внутрибрюшинном лечении их фуллеренполиами- нокапроновой кислотой в дозе 200 мг/кг/день дают основание пола- гать, что данная доза при этом способе введения является токсич- ной для инфицированных мышей.
Пример N2 8. Изучение противоопухолевого действия фулле- ренполиаминокапроновой кислоты (препарат N° 1) при перевивае- мых опухолях лейкоза L1210, аденокарциномы молочной железы Са-755 и карциномы Льюиса.
Исследования выполнялись в Институте токсикологии, г. Санкт-Петербург, 2006 г. в соответствии с «Методическими ука- заниями по изучению противоопухолевой активности фармаколо- гических веществ» («Руководство по экспериментальному (докли- ническому) изучению новых фармакологических веществ», Мин- здрав РФ, Ремедиум. М., 2000 г., с. 319-325).
Штаммы опухолевых клеток лейкемии L1210, аденокарцино- мы молочной железы Са-755, а также штамм опухолевых клеток карциномы Льюиса (3LL) получены из НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова МЗ РФ (г. Санкт-Петербург).
В исследовании использованы следующие тест- системы: Мыши линии DBA/2 с перевитыми клетками лейкемии L1210. Возраст мышей 6-8 недель, масса 19-25 г.
Мыши самцы линии С 57 BL/6j с перевитыми клетками Са- 755. Возраст мышей 6-8 недель, масса 19-25 г.
Мыши самцы линии С 57 BL/6j с перевитыми клетками 3LL.
Возраст мышей 6-8 недель, масса 18-24 г.
Оценка противоопухолевого действия проводилась на осно- вании:
- оценки накопления асцита по регистрации прибавки веса живот- ных;
- оценки продолжительности жизни животных;
- оценки опухолевого роста. Проводили измерение большего разме- ра опухоли (длина) и перпендикулярного ему меньшего размера (ширина). Рассчитывали объем опухоли и торможение опухолевого роста рассчитывали по формуле. Оценочным критерием являлся день достижения каждой индивидуальной опухолью объема 500 мм3.
Результаты влияния препарата на развитие лейкемии L1210 представлены в таблице 12.
В таблице 13 приведена средняя продолжительность жизни животных с перевиваемыми опухолями лейкемии L1210 и кон- трольной группы, а также данные увеличения продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой в %.
Как видно из таблицы 13 средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками лейкемии L1210 составила 6,0±0,21 дней. Введение препарата дос- товерно увеличило продолжительность жизни мышей до 10,7±0,37 дней и 10,60±0,37 дней, процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 78,33% и 76,67% для доз препарата 100 мг/кг и 200 мг/кг соответственно, однако различия между опытными группами оказались статистически недостовер- ными.
В процессе эксперимента проводилось ежедневное взвешива- ние животных с целью оценки накопления асцита и изучения срав- ниваемых препаратов на данный процесс.
Результаты оценки прибавки веса представлены в таблице 14. Как видно из таблицы 14 препарат достоверно уменьшал на- копление асцита у мышей с перевитыми опухолями лейкемии L1210. Прибавка веса тела у мышей, получавших исследуемый пре- парат, была достоверно меньше, чем в контрольной группе, причем у животных, получавших исследуемый препарат в дозе 250 мг/кг, средняя прибавка веса была достоверно ниже (в 1 ,5 раза) по сравне- нию с таковым показателем у животных, получавших препарат в дозе 100 мг/кг.
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что препарат проявляет выраженное противо- опухолевое действие и тормозит рост опухолевых клеток лейкемии L1210 у мышей, что проявилось в достоверном увеличении про- должительности жизни (78,33% и 76,67%) для доз 100 и 250 мг/кг и достоверном торможении накопления асцита экспериментальных животных (78-43%). Признаков интоксикации на фоне введения ис- следуемого препарата не зарегистрировано. Анализ полученных данных выявил достоверные различия между дозой препарата 100 мг/кг и дозой 250 мг/кг - увеличение дозы препарата приводит к достоверному уменьшению накопления асцита у эксперименталь- ных ивотных. По другим показателям контраст (отличие средних для групп, получавших разные дозы исследуемого препарата) был на уровне ошибок, вызванных естественным разбросом данных.
Результаты влияния препарата на развитие аденокарциномы молочной железы Са-755 представлены в таблице 15.
В таблице 16 приведена средняя продолжительность жизни животных с перевиваемыми опухолями аденокарциномы молочной железы Са-755 и контрольной группы, а также данные увеличения продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой в %.
Как видно из таблицы 16 средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками опухолями аденокарциномы молочной железы Са-755 составила 37,9+0,74 дней/ Введение препарата достоверно увеличило продол- жительность жизни мышей до 71 ,9±2,58 дней и 73,4+0,92 дней, процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 89,71% и 93,67% для доз препарата 100 мг/кг и 200 мг/кг соответственно, однако различия между опытными груп- пами оказались статистически недостоверными.
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что препарат проявляет выраженное противо- опухолевое действие и тормозит рост опухолевых клеток аденокар- циномы молочной железы Са-755 у мышей, что проявилось в дос- товерном увеличении продолжительности жизни (89,71% и 93,67%) для доз 100 и 250 мг/кг. Признаков интоксикации на фоне введения исследуемого препарата не зарегистрировано.
Проведена оценка влияния препарата на средние величины объема опухолей карциномы Льюиса в различные дни после пере- вивки. В контрольной группе опухоли развились у 21 из 26 мышей (80,8%), первые опухоли были зарегистрированы на 7 день после перевивки и регистрировались до 40 дня. Первые опухоли в группе с воздействием препарата в дозе 100 мг/кг были зарегистрированы на 7 день после перевивки и регистрировались до 60 дня; в группе с воздействием препарата в дозе 250 мг/кг были зарегистрированы на 8 день после перевивки и регистрировались до 60 дня. Препарат оказывал выраженный противоопухолевый эффект на развитие кар- циномы легких Льюиса; процент торможения в группе препарата - 100 мг/кг по сравнению с контрольной группой на 10-17 дни досто- верно составлял 71,77% и 58,5%, в группе препарата - 250 мг/кг по сравнению с контрольной группой на 10-17 дни - 84,37% и 54,2% соответственно.
В таблице 17 представлено влияние препарата на рост карци- номы Льюиса, анализировались сроки достижения опухолью разме- ра 500 мм ; в контрольной группе данный показатель колебался от 12 до 20 дней, а в экспериментальных группах - от 17 до 28 дней. Как видно из данной таблицы, препарат достоверно увеличивал этот показатель на 22-27% по сравнению с контролем.
Гибель мышей контрольной группы наступала в результате прогрессирования опухолевого роста основного очага, а также вследствие обширного метастатического поражения легких. Инди- видуальная продолжительность жизни мышей в контрольной груп- пе колебалась от 28 до 39 дней, в группах с препаратом от 51 до 60 дней. В таблице 18 представлено влияние препарата на среднюю продолжительность жизни мышей после перевивки опухоли. Как видно из таблицы 18 препарат достоверно увеличивал среднюю продолжительность жизни примерно на 70% по сравнению с кон- трольной группой, разница между опытными группами статистиче- ски недостоверна.
Индивидуальные вес легких и количество метастазов в легких у мышей контрольной группы и опытных групп с воздействием сравниваемых препаратов представлены в таблице 19.
Как видно из таблицы 19 препарат достоверно уменьшал вес легких и количество метастазов в легких в 1,5-2 раза. Разница меж- ду опытными группами статистически недостоверна.
Таблица 1 Исследование цитотоксичности препарата на модели лимфобласто- идных клеток человека
Количество
Условия опыта, Жизнеспособность
клеток концентрация, мкг/мл клеток, %
х103/мл
Контроль клеток 98 800
0,5 95 833
1 ,0 94 833
Препарат N°
5,0 98 799
1
10,0 94 767
100 95 600
Таблица 2
Исследование противовирусной активности препарата на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ- 1
Figure imgf000032_0001
Таблица 3
Изучение цитотоксического действия образца фуллеренполиамино- капроновой кислоты на культуру клеток Vero
Figure imgf000032_0002
Примечание: ДМСО в концентрации, применяемой для растворе- ния, не оказывает цитотоксического действия на клетки Таблица JSfo 4
Противогерпетическая активность образца фуллеренполиаминока- проновой кислоты в культуре клеток Vero при инфицирующей дозе вируса герпеса - 100 ТЦИД50/0,2мл
Figure imgf000033_0001
Примечание: клетки инфицировали через час после введения образ- цов.
Таблица 5
Защитное действие препарата от цитодеструктивного действия ви- руса герпеса, тип 1 при инфицирующей дозе вируса 100 ТЦИД50
Препарат Ν» 1
Концентрация
Оптическая плот- Отличия от контро- препарата, мкг/мл
ность ля достоверны при р
0 0,403 ± 0,02
5,0 1 ,110 ± 0,08 < 0,01
10,0 1 ,015 ± 0,07 < 0,01
50,0 1, 153 ± 0,06 < 0,01
100,0 1 ,79 ± 0,05 < 0,01
Контроль клеток 1 , 133 ± 0,07 < 0,01 Таблица 6
Противогерпетическая активность образца фуллеренполиаминока- проновой кислоты в культуре клеток Vero при инфицирующей дозе вируса герпеса -1000 ТЦИД50/0,2мл
Figure imgf000034_0001
Примечание: клетки инфицировали через час после введе- ния образцов
Таблица 7
Защитное действие препарата от цитопатического действия вируса герпеса, тип 1 при инфицирующей дозе вируса 1000 ТЦИД50
Концентрация Оптическая Отличия от контро- препарата, мкг\мл плотность ля достоверны при
Р
0 0,796 ± 0,06
5,0 1,027 ± 0,04 < 0,01
10,0 1,021 ± 0,04 < 0,01
50,0 1,033 ± 0,03 < 0,01
100,0 1 ,083 ± 0,01 < 0,01
Контроль клеток 1, 133 ± 0,07 Таблица 8
Результаты изучения активности препарата N« 1 в отношении са гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl
Figure imgf000035_0001
Различия в показателях 2-х опытов зависели от множественности заражения вирусом культуры клеток MDCK. Таблица 9
Результаты изучения активности препаратов в отношении вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (HlNl)swl, средние показатели
Снижение (%) репродукции онцентрац
вируса гриппа в культуре кле-
ИИ
Внесение препарата ток MDCK по отношению к препаратов
контролю в присутствии серий (мкг/мл)
препарата Ν» 1 за 2 часа до 18,0
6,25 инфицирования
одномоментно с 6,0 инфицированием
за 2 часа до 44,0
12,5 инфицирования
одномоментно с 26 инфицированием
за 2 часа до 44,0
25,0 инфицирования
одномоментно с 20,0 инфицированием
за 2 часа до 44,0
50,0 инфицирования
одномоментно с 22,0 инфицированием
за 2 часа до 8
100,0 инфицирования
одномоментно с 29,0 инфицированием Таблица 10
Эффективность фуллеренполиаминокапроновой кислоты на модели гриппозной инфекции у мышей
Figure imgf000037_0001
Примечание: *В опытах смертность в группе вирусного контроля составляла 70%, то есть из 10 мышей погибали 7.
**В опытах смертность в группе вирусного контроля составляла 90%, то есть из 10 мышей погибали 9.
*Схема лечения: за 24 и 1 часа до заражения, далее через 24,48, 72 и 96 часов после заражения
Таблица 11
Изменение веса животных, зараженных вирусом гриппа А/ А и ч и/2/69 (доза LD70) и леченных препаратами
Figure imgf000038_0001
Таблица 12
Влияние препарата на продолжительность жизни мышей с переви- ваемой опухолью лейкемии L 1210
Figure imgf000039_0001
Таблица 13 Влияние препарата на среднюю продолжительность жизни живот- ных с перевиваемой опухолью лейкемии L1210
Figure imgf000039_0002
Примечание: *— достоверные отличия от контроля (при р < 0,05)
Таблица 14
Влияние препарата на развитие асцита у мышей с перевиваемой опухолью лейкемии L1210
Figure imgf000040_0001
Примечание: *— достоверные отличия от контроля (при р < 0,05)
Таблица 15
Влияние препарата на продолжительность жизни мышей с переви- ваемой опухолью лейкемии СА-755
N животного и его продолжительность жизни в
Название
днях
группы
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Контроль 36 39 41 34 35 40 39 38 40 37
Препарат N° 1 ,
79 81 73 82 80 66 63 60 67 68 100 мг/кг
Препарат JSfe 1?
77 72 70 78 76 71 73 70 72 75 250 мг/кг Таблица 16
Влияние препарата на среднюю продолжительность жизни живот- ных с перевиваемой опухолью аденокарциномы молочной железы Са-755
Figure imgf000041_0001
Примечание: *— достоверные отличия от контроля (при р < 0,05)
Таблица 17
Влияние препарата на размеры карциномы Льюиса (достижение V =
500 мм3)
Figure imgf000041_0002
Примечание: * - достоверные отличия от контроля (при р < 0,05) Таблица 18
Влияние препарата на продолжительность жизни мышей после пе- ревивки карциномы Льюиса
Figure imgf000042_0001
Примечание: * - достоверные отличия от контроля (при р < 0,05)
Таблица 19
Влияние препарата на метастазирование карциномы Льюиса у мы- шей
Figure imgf000042_0002
Примечание: *— достоверные отличия от контроля (при р < 0,05)

Claims

Формула изобретения
1. Гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фулле- рена общей формулы C60(H)x{NH(CH2)nCOO-}x{NH3 +(L)COOH)}x, где п = 2-5, х = 3, L = -(СН2)т, где т = 1-5, либо -CO(CH2)kCH(NH2)-, где к = 1-2, характеризующиеся тем, что соединения содержат кова- лентно-связанные аминокислотные группы и полярные ионные формы аминокислот.
2. Производные фуллерена по п. 1 , характеризующиеся тем, что в качестве аминокислотных групп используют фрагменты ами- нокислот алифатического ряда общей формулы NH(CH2)nCOOH, где п = 2-5.
3. Производные фуллерена по п. 1 , характеризующиеся тем, что в качестве и полярных ионных форм аминокислот используют фрагменты амидов дикарбоновых аминокислот общей формулы NH2(CO)(CH2)kCH(NH2)COOH, где k = 1 -2.
4. Способ получения производных фуллерена по п. 1 , харак- теризующийся тем, что они образуются при взаимодействии фулле- рена с 10-кратным мольным избытком безводных калиевых солей аминокислот общей формулы NH2(CH2)nCOOK, где п = 2-5, в среде органического ароматического растворителя при добавлении к по- лученной суспензии межфазного катализатора при перемешивании и нагревании до температуры не выше 60-80°С до полного обесцве- чивания раствора и формирования твердого осадка, который затем выделяют, после чего осуществляют обработку водных растворов калиевых солей фуллеренполиаминокислот 1Н раствором органи- ческих или минеральных кислот с последующим введением раство- ра аминокислоты общей формулы NH2(L)COOH, где L = -(СН2)т, где т = 1-5, либо -CO(CH2)kCH(NH2)-, где к = 1-2 в полярных рас- творителях, перемешиванием, удалением растворителей, промыв- кой и высушиванием осадка.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что используют свеже- приготовленные безводные калиевые соли аминокислот в мелко- дисперсном состоянии, а выделение твердого осадка калиевых со- лей фуллеренполиаминокислот осуществляют фильтрованием, промывкой этиловым спиртом и высушиванием.
6. Способ по любому из пунктов 4, 5, отличающийся тем, что в качестве межфазного катализатора используют метиловые эфиры полиэтил еноксидов молекулярной массы 200, 400, 500.
7. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества содержит производное фуллерена по п. 1.
PCT/RU2012/000062 2011-02-01 2012-02-06 Гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена с60, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе WO2012105872A1 (ru)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MX2013008545A MX354436B (es) 2011-02-01 2012-02-06 Derivados de homo- y hetero-poliaminoácidos de fulereno c60, método para producir los mismos, y composiciones farmacéuticas con base en dichos derivados.
ES12741829.1T ES2582872T3 (es) 2011-02-01 2012-02-06 Derivados homo- y hetero-poliaminoácidos de fullereno C60, método para la producción de los mismos, y composiciones farmacéuticas basadas en dichos derivados
CA2810507A CA2810507A1 (en) 2012-02-06 2012-02-06 Homo- and hetero-polyamino-acid derivatives of fullerene c60, method for producing same, and pharmaceutical compositions based on said derivatives
EP12741829.1A EP2674415B1 (en) 2011-02-01 2012-02-06 Homo- and hetero-polyamino-acid derivatives of fullerene c60, method for producing same, and pharmaceutical compositions based on said derivatives
US13/820,769 US9221746B2 (en) 2011-02-01 2012-02-06 Homo- and hetero-polyamino-acid derivatives of fullerene C60, method for producing same, and pharmaceutical compositions based on said derivatives
AU2012212707A AU2012212707B2 (en) 2011-02-01 2012-02-06 Homo- and hetero-polyamino-acid derivatives of fullerene C60, method for producing same, and pharmaceutical compositions based on said derivatives
BR112013012910-7A BR112013012910A2 (pt) 2011-02-01 2012-02-06 Derivados de fulereno de homo e heteropoli aminoácidos c60, método para a produção dos mesmos e composições famacêuticas com base nos referidos derivados
CN201280003407.9A CN103347849B (zh) 2012-02-06 2012-02-06 富勒烯с60的均聚氨基酸和杂多氨基酸衍生物、其制备方法和基于该衍生物的药物组合物
EA201201448A EA020801B1 (ru) 2011-02-01 2012-02-06 Гомо- и гетерополиаминокислотные производные фуллерена с, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе
AP2013007072A AP4014A (en) 2011-02-01 2012-02-06 Homo- and hetero-polyamino-acid derivatives of fullerene c60, method for producing same, and pharmaceutical compositions based on said derivatives c60
UAA201301251A UA110345C2 (en) 2011-02-01 2012-06-02 Homo- and heteropolyaminoacid derivatives of fullerene c60, and method for their pharmaceutical compositions on their basis
ZA2013/03447A ZA201303447B (en) 2011-02-01 2013-05-13 Homo-and hetero-polyamino-acid derivatives of fullerene c60, method for producing same, and pharmaceutical compositions on said derivatives
IL226736A IL226736A (en) 2011-02-01 2013-06-04 Homo- and hetero derivatives of Fullerene Polyamino Acids 60c, Methods of Preparation and Pharmaceutical Preparations Containing These Derivatives
HK14103544.9A HK1190386A1 (zh) 2011-02-01 2014-04-14 富勒烯 的均聚和雜聚氨基酸衍生物，其生產方法以及基於該衍生物的藥物組合物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011103574 2011-02-01
RU2011103574/04A RU2458914C1 (ru) 2011-02-01 2011-02-01 Гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена c60, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012105872A1 true WO2012105872A1 (ru) 2012-08-09

Family

ID=46602956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2012/000062 WO2012105872A1 (ru) 2011-02-01 2012-02-06 Гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена с60, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9221746B2 (ru)
EP (1) EP2674415B1 (ru)
AP (1) AP4014A (ru)
AU (1) AU2012212707B2 (ru)
BR (1) BR112013012910A2 (ru)
EA (1) EA020801B1 (ru)
ES (1) ES2582872T3 (ru)
HK (1) HK1190386A1 (ru)
IL (1) IL226736A (ru)
MX (1) MX354436B (ru)
RU (1) RU2458914C1 (ru)
UA (1) UA110345C2 (ru)
WO (1) WO2012105872A1 (ru)
ZA (1) ZA201303447B (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103450486A (zh) * 2013-05-14 2013-12-18 成立 双亲有机聚富勒烯树状分子交联的聚阳离子聚合物凝胶物质及其制备方法
CN104478886A (zh) * 2014-12-30 2015-04-01 郑州大学 一种富勒烯双加成氨基酸及其合成方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2162819C2 (ru) 1999-01-05 2001-02-10 Тверской государственный технический университет Способ получения водорастворимых производных фуллеренов
US6204391B1 (en) 1994-01-24 2001-03-20 The Regents Of The University Of California Water soluble fullerenes with antiviral activity
RU2236852C1 (ru) 2003-06-23 2004-09-27 Закрытое акционерное общество "ДЕСКО" Средство для ингибирования репродукции оболоченных вирусов, способ его получения, фармацевтическая композиция и способ ингибирования вирусных инфекций
WO2005070827A2 (en) 2004-01-14 2005-08-04 William Marsh Rice University Fullerene based amino acids
RU2316320C1 (ru) * 2006-06-19 2008-02-10 Лев Давидович Раснецов Противовирусное средство
WO2009000203A1 (fr) 2007-06-28 2008-12-31 Huawei Technologies Co., Ltd. Procede de transmission de donnees, entrelaceur et dispositif de communication

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030027870A1 (en) * 2001-05-15 2003-02-06 Wilson Stephen R. Fullerene derivatives that modulate nitric oxide synthase and clamodulin activity
RU2196602C1 (ru) * 2002-01-22 2003-01-20 Закрытое акционерное общество "ДЕСКО" Средство для ингибирования вич и цмв-инфекций и способ их ингибирования
RU2213048C1 (ru) * 2002-07-08 2003-09-27 Закрытое акционерное общество "ДЕСКО" Способ получения водорастворимых солей аминокислотных производных фуллерена
RU2213049C1 (ru) * 2002-07-08 2003-09-27 Закрытое акционерное общество "ДЕСКО" Способ получения водорастворимых аминокислотных производных фуллерена
CA2687557A1 (en) 2007-06-19 2008-12-31 Institute Of Problems Of Chemical Physics Ras (Ipcp Ras) Polyfunctional fullerene c60 amino acid derivatives

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6204391B1 (en) 1994-01-24 2001-03-20 The Regents Of The University Of California Water soluble fullerenes with antiviral activity
RU2162819C2 (ru) 1999-01-05 2001-02-10 Тверской государственный технический университет Способ получения водорастворимых производных фуллеренов
RU2236852C1 (ru) 2003-06-23 2004-09-27 Закрытое акционерное общество "ДЕСКО" Средство для ингибирования репродукции оболоченных вирусов, способ его получения, фармацевтическая композиция и способ ингибирования вирусных инфекций
WO2005070827A2 (en) 2004-01-14 2005-08-04 William Marsh Rice University Fullerene based amino acids
RU2316320C1 (ru) * 2006-06-19 2008-02-10 Лев Давидович Раснецов Противовирусное средство
WO2009000203A1 (fr) 2007-06-28 2008-12-31 Huawei Technologies Co., Ltd. Procede de transmission de donnees, entrelaceur et dispositif de communication

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Immunodeficiency Viruses Laboratory with the Testing Center on Expert Evaluation of Antiviral Agents and Disinfectants", RUSSIAN ACADEMY OF MEDICINAL SCIENCES
"Ivanovsky Research Institute for Virology", RUSSIAN ACADEMY OF MEDICINAL SCIENCES
"Manual on Experimental (Preclinical) Study of New Pharmacological Agents", 2000, MINISTRY OF PUBLIC HEALTH OF THE RUSSIAN FEDERATION, article "Guidelines for the Study of Antitumor Activity of Pharmacological Agents", pages: 319 - 325
"Museum of Viral Strains and Cell Cultures of the Ivanovsky Research Institute for Virology", RUSSIAN ACADEMY OF MEDICINAL SCIENCES
BEDROV, D.; SMITH, G.D.; DAVANDE; H.: "Passive transport of fullerenes through a lipid membrane", J. PHYS. CHEM., B, vol. 1 12, 2008, pages 2078 - 84
KISELEV, 0.1. ET AL., MOL. MATERIALS, vol. 11, 1998, pages 121
NELSEN, G.D. ET AL.: "In vivo biology and toxicology of fullerenes and their derivatives", BASIC AND CLINICAL PHARMACOLOGY AND TOXICOLOGY, vol. 103, 2008, pages 197 - 208
PIOTROVSKY, L.B. ET AL., MOL. MATERIALS, vol. 13, 2000, pages 41
QIAO, R.; ROBERTS A.E.: "Translocation of fullerene and its derivatives across a lipid bilayer", NANO LETT., vol. 7, 2007, pages 614 - 9
See also references of EP2674415A4

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103450486A (zh) * 2013-05-14 2013-12-18 成立 双亲有机聚富勒烯树状分子交联的聚阳离子聚合物凝胶物质及其制备方法
CN103450486B (zh) * 2013-05-14 2016-09-14 成立 双亲有机聚富勒烯树状分子交联的聚阳离子聚合物凝胶物质及其制备方法
CN104478886A (zh) * 2014-12-30 2015-04-01 郑州大学 一种富勒烯双加成氨基酸及其合成方法

Also Published As

Publication number Publication date
ES2582872T3 (es) 2016-09-15
MX354436B (es) 2018-03-06
AU2012212707A1 (en) 2013-03-07
EP2674415B1 (en) 2016-04-20
HK1190386A1 (zh) 2014-07-04
UA110345C2 (en) 2015-12-25
BR112013012910A2 (pt) 2020-03-31
EA201201448A1 (ru) 2013-03-29
US9221746B2 (en) 2015-12-29
US20130165691A1 (en) 2013-06-27
IL226736A (en) 2016-05-31
AU2012212707B2 (en) 2014-03-20
AP2013007072A0 (en) 2013-08-31
MX2013008545A (es) 2016-09-08
EP2674415A1 (en) 2013-12-18
EP2674415A4 (en) 2014-09-10
AP4014A (en) 2017-01-25
RU2458914C1 (ru) 2012-08-20
ZA201303447B (en) 2014-01-29
EA020801B1 (ru) 2015-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7030093B2 (ja) オキサチアジン様化合物を作製する方法
CN103347849B (zh) 富勒烯с60的均聚氨基酸和杂多氨基酸衍生物、其制备方法和基于该衍生物的药物组合物
US8450318B2 (en) Method to treat infections using anti-infective agents
RU2458914C1 (ru) Гомо- и гетеро-полиаминокислотные производные фуллерена c60, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе
US20130109663A1 (en) N6-(ferrocenmethyl)quinazolin-2,4,6-triamina (h2) and the derivatives and prodrugs thereof as antileishmanial, antiprotozoal, antiparasitic and antimicrobial agents
US7732433B2 (en) Biologically active complex
CA2810515C (en) Hydrated n-fullerene amino acids, method for producing the latter, and pharmaceutical compositions on the basis thereof
DK2851368T3 (en) COMPLEX COMPOUNDS OF GERMANIUM, PROCEDURES FOR PRODUCING THEREOF, AND PHARMACEUTICALS
RU2458046C1 (ru) Гидратированные n-фуллерен-аминокислоты, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе
AU679676B2 (en) Ion pairs of hypericin compounds having antiviral activity
RU2820633C1 (ru) Производное индол-3-карбоновой кислоты, обладающее противовирусной активностью в отношении sars-cov-2
OA16420A (en) Homo-andhetero-polyamino-acid derivatives of fullerence C60, method for producing same, and pharmaceutical compositions based on said derivatives.
JP5302393B2 (ja) 新規ジアリールヘパトノイド系化合物及びその用途
OA16498A (en) Hydrated N-fullerene amino acids, method for producing the latter, and pharmaceutical compositions on the basis thereof.

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201280003407.9

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12741829

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201201448

Country of ref document: EA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012741829

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2810507

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13820769

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012212707

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20120206

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: A201301251

Country of ref document: UA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2013/008545

Country of ref document: MX

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112013012910

Country of ref document: BR

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112013012910

Country of ref document: BR

Free format text: APRESENTE TRADUCAO SIMPLES DA CERTIDAO DE DEPOSITO DA PRIORIDADE NO PAIS DE ORIGEM OU DECLARACAO ASSINADA, AMBAS CONTENDO TODOS OS DADOS IDENTIFICADORES DA PRIORIDADE CONFORME ART. 16, 2O, DA LPI.

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112013012910

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20130524