BR112013012910A2

BR112013012910A2 - Derivados de fulereno de homo e heteropoli aminoácidos c60, método para a produção dos mesmos e composições famacêuticas com base nos referidos derivados

Info

Publication number: BR112013012910A2
Application number: BR112013012910-7A
Authority: BR
Inventors: Davidovich Rasnetsov Lev; Iakov Yudelevich Shvartsman; Olga Nikolaevna Surova
Original assignee: Davidovich Rasnetsov Lev
Priority date: 2011-02-01
Filing date: 2012-02-06
Publication date: 2020-03-31
Also published as: AU2012212707B2; WO2012105872A1; UA110345C2; MX354436B; EA201201448A1; RU2458914C1; US9221746B2; EA020801B1; US20130165691A1; AU2012212707A1; ZA201303447B; ES2582872T3; IL226736A; EP2674415A4; EP2674415B1; EP2674415A1; AP2013007072A0; AP4014A; HK1190386A1; MX2013008545A

Abstract

derivados de fulereno de homo e heteropoli aminoácidos c60, método para a produção dos mesmos e composições farmacêuticas com base nos referidos derivados a presente invenção relaciona-se com a indústria farmacêutica e a medicina, especificamente com novos derivados de fulereno de homo e heteropoli aminoácidos c60 de fórmula geral: c60(h)k{nh(ch2)nc00- },({nh3+(l)cooh)}x, onde n = 2-5, x = 3, l = -(ch2)m, onde m = 1-5, ou - co(ch2)kch(nh2)-, onde k = 1-2, caracterizado em que os compostos compreendem grupos de aminoácidos covalentemente ligados e formas fônicas polares dos aminoácidos, e também um método para produzir os referidos derivados, e para a produção de composições farmacêuticas com base neles; o método para a produção de derivados de fulereno de homo e heteropoli aminoácidos baseia-se na reação de uma ligação nucleofílica de aminoácidos de fulereno, formando derivados de fulereno de aminoácidos covalentemente ligados, com a subseqüente introdução de formas fônicas polares dos aminoácidos; uma composição farmacêutica compreende, como substância ativa, derivados de fulereno de honro e heteropoli aminoácidos de fórmula: clio(h),{nh(cha)nc00-},{nh3+(l)cooh)}x, onde n = 2-5, x = 3, l = -(ch2)m onde m = 1-5, ou-co(ch2)kch(nh2)-, onde k = 1-2.

Description

DERIVADOS DE FULERENO DE HOMO E HETEROPOU AMINOÁCIOOS C6Ô, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DOS MESMOS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COM BASE NOS REFERIDOS DERIVADOS,

Campo da Técnica

Esta invenção relaciona-se com a indústria farmacêutica e a medicina, a saber, os novos derivados de fulereno de homo e heteropoh (aminoãcidos) C§q de fórmula (I), e com um método para sua preparação e a preparação de composições farmacêuticas compreendendo os mesmos.

pw ί _s (N typcooH g caracterizado em que n ~ 2-5, x * 3, L «~(CH₂U quando m = 2-5 ou CO(CHACH(NH₂K onde k « 1-2.

HMânSSdiIécmcã

A utilização médica de derivados de fulereno baseiais se nas propriedades lipofílicas do. núcleo de fulereno, que permite que os derivados de fulereno permeiem as membranas celulares, e a capacidade dos fulerenos de gerar em oxigênio slngleto de alto rendimento quântico, que divide DNAs. Estas propriedades conferem derivados de fulereno funcionais com propriedades dtotóxicas, antivirals e outras propriedades (ver Sedrov, D., 20 Smith, G.D., Davande, H., Passive transport of fullerenes through a lipid membrane, 1 Phys. Chem., B, 2008, Vol 112., pp. 2078-84; Qiao, R., and Roberts A.E., Translocation of fullerene and its derivatives across a lipid bilayer, Nano Lett, 2007, Vol. 7, pp. 614-9; Nelsen, G.D., et al, In vivo biology and toxicology of fullerenes and their derivatives, Farmacologia e Toxkologia 25 Básica e Clínica, 2008, Vol. 103, pp. 197-208; e a Patente dos EUA 6204391, 2005, Water soluble fullerenes with antiviral activity).

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O principal problema que dificulta os estudos biológicos de derivados de fulereno e a criação de medicamentos com base neles surge da insolubilidade em água dos fuíerenos, o que dificulta sua administração direta em um corpo humano, Uma possível maneira de superar 5 essas dificuldades é incorporar moléculas de fulereno em matrizes de solubillzação. São conhecidos métodos para a preparação de espécies de fulereno solúveis em água através da formação de um aduto de polivinlípírrolidona (ver Kiselev, O.k, et ai., Mol. Materiais, 1998, Vol. 11, p. 121; Piotrovsky, L.B, et al. Ibid, 20Q0, Vol. 13, p. 41). Este aduto mostrou ser eficaz to contra os vírus de influenza A e B.

Além disso, um método é conhecido para a preparação de fuíerenos, o qual compreende a mistura dos fuíerenos prédissolvida em um solvente orgânico com uma matriz polimérica em clorofórmio, concentrando a mistura sob vácuo até que os solventes sejam completamente 15 removidos, e dissolvendo o complexo resultante em um buffer salino de fosfato (pH 7,4-7,6), seguido de um tratamento de ultrassônico do produto (ver RU No. 2.162.819, 2 de outubro de 2001). As matrizes poiíméricas solúveis em água utilizadas de acordo com a patente são cefalinas de membrana. Os produtos obtidos como resultado das referidas modificações são composições instáveis 20 que possuem potencial de armazenamento limitado.

Um método promissor para a preparação de composições de fulereno solúveis em água é oferecido pela modificação química da esfera de fulereno por incorporação de ligantes solubilizadores hidrofílicos. O pedido internacional W02005/070827 mostra um conjunto de 25 derivados de aminoácidos de fulereno preparado através da reação de cicloadição de porções de aminoácidos ao fulereno, e os produtos da sua inserção em substratos orgânicos biologicamente ativos. Os métodos de síntese descritos na solução técnica são de múltiplos passos e pouco adaptáveis. Os compostos resultantes possuem baixa solubilídade em água.

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Atualmente, uma grande variedade de fulerenos funcionalizados foi preparada, caracterizado em que porções hídrofílicas estão presentes nas cadeias laterais dos lígantes conectados ao fulereno (o tipo de detergente do complexo), assim corno derivados esféricas, caracterizado em 5 que os grupos polares são distribuídos ao longo da esfera de fulereno (este tipo inclui fulerenos e adutos de amina).

Os derivados de aminoáddos de fulerenos possuem o maior potencial para uso.

Análogos da presente invenção são os compostos e w os métodos para produzi-los, conforme descrito no pedido internacional W02009/00203 e aqueles descritos na patente da Federação Russa No. 2236852.

O pedido internacional W02009/002Õ3 descreveu derivados de aminoáddos polifuncionais de fórmula

onde R ~ H, mono ou dihidroxialquila, haloalquila, mono ou dinitroxialqulla, mateinimde; NZ é uma porção de um aminoácido α, β, y ou ω de fórmula geral 2ô NH-C_mH2_m.COOM ou C^N-COOM, onde m = 3..5, _e M é um grupo de nitroxialquila, grupo de alquila, ou um sal de metal alcalino, ou de um dípeptídeo, Estes compostos foram preparados através da reação de adição equimolar de um amínoácído ao fulereno, seguida pela substituição de um ligante orgânico biologicamente ativo para hidrogênio para formar o tipo de 25 composto. Qs compostos resultantes possuem uma atividade inibidora contra tumores em metástase, aumentar a atividade antileucêmka da ciclofósfamida, e podem ser adequados como doadores de monóxido de nitrogênio ou vasodílatadores de ação rápida para a terapia anti-hipertensiva.

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A principal desvantagem dos compostos de acordo com essa aplicação consiste em que eles são produtos de adição covalentes, contêm pequenas quantidades de grupos polares e possuem baixa solubilidade em água.

A parte mais pertinente da técnica anterior no contexto da essência técnica e o resultado atingível consistem de um agente para inibir a reprodução de vírus envelopados e o método de preparação do mesmo de acordo com a patente de RU No. 2.236.852. Como resultado da reação de um fulereno com um sal de aminoácido em um solvente orgânico na w presença de óxldo de poliaíquileno, aníões policarboxílicos de fulereno de fórmula geral C^HJNHICHèkCfOJOJn foram preparados, caracterizado em que o C_so é o núcleo de fulereno, NHfCHsLCfOJO' é um amão aminocarboxílíco, m é um número inteiro de 1 a 5 e n é um número inteiro de 2 a 12.

Para preparar estes compostos, a uma solução de is fulereno, em o-diclcrobenzeno (ou toluene ou outro solvente orgânico), um aminoácido é introduzido como um sal (sal de potássio ou de sódio) e um agente de solubilização é adicionado. A ordem de adição do aminoácido e do agente de solubilização não é importante; eles podem ser adicionados como um complexo pré-misturado, Agentes de solubilização úteis são vários óxidos de 20 polialquileno (políetileno giicóis com pesos molares de 150-400 ou superior a 400 (por exemplo, PEG-1500h bem como éster de políetileno-glicol dimetil com peso molar de 500. Para aumentar as taxas de reação, qualquer agente redutor forte (um metal alcalino) é adicionado.

A proporção de fulereno para aminoácido é 25 aumentada em mais de 50 vezes. A conversão ao sal aceitável farmaceutiçamente desejado, especialmente um sal de sódio ou de potássio, foi realizada por tratamento do ácido com uma base adequada, ou pela adição de um sal de um ácido fraco volátil Em particular, um ácido policerboxílico de fuiereno insolúvel em água é convertido em um sal solúvel em água mais /34 preferível e farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um sal de sódio. A adição de um sal de um ácido fraco volátil é realizada através do tratamento da solução com um sal de metal alcalino de um ácido fraco volátil. Após concentrar a solução por evaporação ou secagem por congelamento, o ácido fraco é 5 removido e ácidos policarboxílicos de fulereno são recuperados como seus sais de metais alcalinos. O produto alvo da invenção apresenta uma composição constante; o teor da substância principal no produto alvo é tão baixo quanto 87,8%. A especificação carece de protocolos de fluxograma para a determinação de quantidades ideais dos compostos iniciais, as proporções das quantidades m dos solventes utilizados e, mais importante, a descrição de métodos para isolar os compostos procurados.

Os principais inconvenientes dos derivados de aminoácidos de fulereno preparados pelo método mostrado na patente citada consistem em produzir uma mistura de aniões de fulereno-carboxilato na forma is de sal e espécies de ácido. Um composto individual não pode ser preparado pelo método descrito na patente citada. Além disso, os poli (aminoácidos) fulereno preparados por esto método da técnica anterior na forma de ácido são quase insolúveis em água. As tentativas para a preparação de uma composição farmacêutica estável com aniões policarboxílicos de fulereno falhou, porque os to compostos precipitam durante o armazenamentô.

A necessidade de utilizar na síntese de grandes excessos de um sal de sódio ou de potássio de aminoácidos e grandes excessos de solventes origina problemas ambientais na reciclagem de resíduos e aumenta o custo do processo de produção. Por razões tecnológicas, os metais 25 alcalinos não podem ser utilizados para aumentar a taxa de reação quando solventes aromáticos dorados são usados.

No entanto, as propriedades bioquímicas únicas dos agentes que compreendem os compostos de fulereno com porções de aminoácidos descritas na patente citada apresentam o problema da preparação /34 de novos derivados de fulereno, desenvolvendo um processo em grande escala altamente adaptável para sua produção, que seria distinguido pela simplicidade e eficiência, ausência de contaminantes, segurança ambiental e disponibilidade dos reagentes iniciais,

Divulgação da Invenção

Para resolver o problema acima, propomos um grupo de invenções que são ligadas umas às outras de modo a formar um único conceito inventivo, a saber: derivados de fulereno de homo e heteropoli (aminoâddos), um método para a produção de derivados de fulereno, e 10 composições farmacêuticas que compreendem derivados de fulereno homo e heteropoli (aminoáddos) corno um agente ativo. Variando a proporção de reagentes e os parâmetros do processo,, podem-se preparar diferentes derivados de fulereno pelo método reivindicado.

O problema mencionado acima é resolvido por meio 15 de derivados de fulereno de homo e heteropoli (aminoácidos) de fórmula geral (II)·

C6o(H)_n{NH(CH₂)_mCOO'yMH₃*(LKOOH)|_Xf caracterizado em que n ~ 2-5, x » 3, L ~ ~(CH₂U caracterizado em que m ® 1-5, ou -CO(CH J_kCH(NH₂h onde k »1-2.

Quando m - n, derivados de fulereno homopoli 2ô (aminoáddo) são preparados; quando m * n, derivados de fulereno heteropoli (ammoâtido) são preparados.

O problema ê resolvido pelo método para a preparação de derivados de fulereno de homo e heteropoli (aminoácidos), caracterizado em que estes derivados são produzidos por reação do fulereno 25 com um excesso de dez vezes de sais de potássio amdricos de aminoácidos em um meio de solvente orgânico, com adição de um catalisador de transferência de fase para a suspensão resultante sob agitação e aquecimento a uma temperatura não superior a 6D^ÔC até que a solução seja completamente descorada e um precipitado sólido seja formado para ser separado e novamente

Ί /34 dissolvido em água, seguido por tratamento de soluções aquosas de saís de potássio de poli (ammoácidos) de fuíereno, com solução de 1 N de um ácido orgânico ou mineral em um solvente polar. O método utiliza saís de aminoáeidos de potássio anídrico recém-preparados em um estado finamente 5 disperso, e a separação de um precipitado sólido de saís de potássio de polí (aminoáeidos) de fuíereno é realizada por filtração, lavagem de etanol e secagem. No decorrer dos experimentos, verificou-se que os poli (aminoáddos) de fuíereno da composição especificada podem ser preparados apenas quando sais de aminoáeidos de potássio anídrico recém-preparados são utilizados.

Catalisadores de transferência de fase úteis são os ésteres metOicos de óxídos de polietileno com pesos moleculares de 2Ü0,400, ou 500.

Outra forma de resolver o problema é a concepção de composições farmacêuticas em que os agentes ativos são derivados de fuíereno homo e heteropoli (aminoáeidos) de fórmula (II), que possuem 15 atividade antiviral contra herpes, o vírus da hepatite C, vários vírus da gripe e

HIV e atividades antitumorais e antipsoriáticas. As composições farmacêuticas podem ser implementadas na forma de comprimidos, cápsulas, pomadas, emulsões, supositórios, soluções ou sprays.

As composições farmacêuticas de acorda com a 20 solução técnica reivindicada compreendem um composto de fórmula geral (li), em uma quantidade que é eficaz para atingir o resultado desejado, e podem ser administradas como formas de dosagem padrão (por exemplo, formas de dosagem sólidas, semissólidas ou líquidas) que compreendem um composto da solução técnica reivindicada como um agente ativo formulado com um veículo 25 ou excipients adequado para ser administrado na via intramuscular, intravenosa, oral, sublingual, inalação, tópica, nasal, retal ou vaginal. O agente ativo pode ser formulado na composição em conjunto com transportadores ordinários não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para a fabricação de soluções, comprimidos, pílulas, cápsulas, grânulos, suposltórios, emulsões, suspensões, pomadas, géis e outras formas de dosagem.

Os níveis e a periodicidade de administração do fármaco em particular para um paciente particular dependerão de vários fatores, incluindo a atividade de um derivado de fulereno específico, a estabilidade metabólica e a duração da ação,' a taxa de excreção, a idade do paciente, o peso corporal, a saúde geral e o sexo, combinações de fármacos; e a gravidade da doença no paciente a ser tratado.

Para administração oral na forma de suspensões, as composições são preparadas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica de preparação de formulações farmacêuticas e podem incluir celulose microcnstallna ou derivados para proporcionar o peso desejado, ácido algínico ou alginato de sódio como agente de suspensão, metílcelulose como intensrficador de viscosidade e agentes edulcorant.es e/ou aromas conhecidos na técnica. Quando preparadas sob a forma de comprimidos, estas composições podem compreender celulose microcristalina, fosfato de cálcio, amido, estearato de magnésio e lactose e/ou outros exciplentes, agentes aglutínantes, expansores, desintegrantes, diluentes e lubrificantes conhecidos na técnica.

Quando destinadas para administração como aerossóis nasais ou por inalação, as composições são preparadas por métodos bem conhecidos na técnica de formulações farmacêuticas e podem ser produzidas na forma de soluções em soro fisiológico, utilizando ácido beruoíco ou outros conservantes adequados, promotores de adsorção para melhorar a bíoapíicabilidade e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes conhecidos na técnica.

As soluções ou suspensões para injeções podem ser formadas de acordo com métodos conhecidos que utilizam diluentes ou solventes não tóxicos parentericamente aplicáveis, tais como manitol, 1,3butanodíol, água, solução de Ringer ou soluções isotônicas de cloreto de sódio;

/34 ou agentes de suspensão e dispersão ou umedecímento, tais como óleos estéreis, suaves e estáveis, incluindo mono ou d iglicerídeos sintéticos, ou ácidos gordos, incluindo o ácido oleico.

Quando destinadas a serem administradas na via ratal ou vaginal na forma de supositóríos, as composições podem ser preparadas por mistura de um fármaco com um excipiente não irritante, tal como manteiga de cacau, ésteres de glicerídeos sintéticos ou poiietíleno glicóis, que são sólidos em temperaturas normais, más liquefazem e/ou dissolvem na cavidade do corpo para liberar o fármaco.

¹⁰ Quando administradas por via tópica na forma de unguentos, géis, loções, linimentos, etc, as composições podem ser preparadas através da mistura de ingredientes ativos com uma base de unguento aceitável Como uma base de pomada útil está o petróleo, graxa ou bases hidrofüícas, tais como vaselina, óleo mineral parafina, cera de is abelha, lanolina, poiietíleno-glicol e outros.

Como base para géis úteis estão metilcelulose, carboximetd celulose de sódio, oxipropil celulose, polietileno-glicol ou oxido de poiietíleno, carbopol, poiivinilpirrolidona, álcool polivinilico, etc

O resultado técnico da invenção consiste no 20 seguinte: novos derivados de fulereno homo e heteropoü (aminoácidos) de fórmula

CeaiHIxfNH^CHzJnCOO'MNH^iLjCQOH}}^ onde n ~ 25, x » 3, L ~ “(CHj)^, onde m » 1-5, ou onde k ~ l~2_f foram preparados, caracterizado em que os compostos compreendem grupos de 25 aminoácídos covalentemente ligados e formas íônicas polares dos aminoáddos,: um novo método em grande escala foi desenvolvido para produzir os derivados de amínoacidos de fulereno C® com proporções de componentes diversas, utilizando a reação da adição nucleofílica do ammoácido ao fulereno para formar produtos de poíiadíção. As composições farmacêuticas são reivindicadas, /34 caracterizado eni que © agente ativo é derivado homo e heteropoli (aminoácidos) de fulereno de fórmula (II), possuindo estes derivados uma atividade antiviral contra herpes, hepatite C, várias gripes e vírus do HIV e possuindo atividades antitumor e antipsoriátícas. As composições farmacêuticas 5 são incorporadas sob a forma de comprimidos, cápsulas, pomadas, suposítórios, soluções e sprays.

Os compostos possuem as seguintes novas propriedades:

- solubilidade em misturas de água-dimetil sulfóxido (1:100 ou 1:2.00);

- elevada biodispombilídade;

- alta eficiência em afetar as células infectadas; e ~ baixa toxicidade,

O método reivindicado proporciona a preparação de diversos derivados de fulereno homo e heteropoli (aminoácidos), dependendo 15 da proporção de reagentes e dos parâmetros do processo. A idéia subjacente do método consiste em que ele utiliza, no passo de síntese, proporções ideais de reagentes (1:10) e quantidades mínimas de um solvente orgânico e um catalisador de transferência de fase, seguido pela recuperação de uma composição reivindicada utilizando soluções concentradas de ácidos orgânicos e 20 minerais, seguido pela adição de aminoácidos da série NH^lCOOH, caracterizado em que L ~ -(CHj)_!U, ou -COfCH^KCHCNl·^), fornecendo a produção quantitativa de composições de aminoácidos de fulereno adaptados e tomando o método reivindicado apropriado para síntese em larga escala eficiente e ambientalmente segura dessas composições.

is A invenção reivindicada será ilustrada por meio dos exemplos que seguem.

Configurações Variáveis da Invenção

Exemplo 1, Preparação de poli (ácido amínocapróico) fulereno de fórmula C₆Q(H3){NH(CH₂)₅CÕO-}₃{NH₃ ^fí(CH₂)₅COaH)₃.

Z34

A uma solução de 7,.2 g (0,01 mol) de fulereno em 400 ml de a-diclorobenzeno adiciona-se 17 g (0,1 mol) de sal de potássio anídrico recém-preparado e finamente dividido do ácido amínocapróice 01 À suspensão resultante, adicionou-se durante duas horas, sob agitação e aquecimento a uma temperatura não superior a 80X, uma mistura de odidorobenzeno e éter de metil polietilenoglicol 400 na proporção de 2,5:1. A mistura da reação é agitada a uma temperatura não superior a 60X durante 2 a 3 horas até que a solução descolara completamente e um precipitado sólido é formado. Depois disso, a mistura é filtrada; o precipitado é lavado no filtro com várias porções de etanol e seco em vácuo a uma temperatura nao superior a 60*C. O sal de potássio isolado do aminoácido de fulereno é dissolvido em dois htros de água destilada. A esta solução, 1 N de ácido clorídrico é adicionados lentamente, sob agitação, até que o pH se torna 5.1. A mistura é deixada em repouso até que o produto é completamente precipitado. Em seguida, a camada aquosa é decantada. Ao precipitado, que é uma suspensão fina de um produto sólido em água, uma solução de ácido aminocapróico em mistura de dimetil sulfóxido/ (1,10} é adicionada lentamente, sob agitação. A mistura é agitada até a dissolução completa. Em seguida, os solventes são removidos por destilação a vácuo. Um resíduo sólido é seco a uma temperatura não superior a 60*C no interior de um secador a vácuo.

O rendimento do produto alvo é quantitativa em relação ao fulereno inicial O composto é um sólido marrom escuro que é solúvel em dimetil sulfóxido/água (1:200) e totalmente solúvel em CH._?CN:H₂O (1:1) e DMF-HA

A análise termogravimétríca do produto mostra que o complexo contém três moles de ácido aminocapróico levemente ligados, que são divididos com decomposição a 200*C. A decomposição térmica do poli (aminoácido) de fulereno ocorre a 345’C corn a evolução do fulereno e seus produtos de oxídação. A quantidade do resíduo sólido após a decomposição do /34 composto, que representa fuiereno não substituído, conforme mostrado por difração de raios X, corresponde à proporção de C^: fração de aminoácido de 1:6.

A hidrólíse ácida do composto com uma solução de

HC1 0,1 M leva à liberação do, hidroclpreto de ácido aminocaprúíco em uma quantidade de 3 moles por mole da substância iniciai,

A adsorção do composto em gel de silica provoca a divisão de ligações iônicas e a evolução do ácido aminocaprõico livre, O número de grupos de amínoâcídos ligados ionicamente é determinado na análise fotométrica subsequente dos produtos da reação do ácido aminocapróico com a ninidrina. Seu número corresponde às composições dos compostos reivindicados.

O espectro de absorção eletrônica do produto está isento de bandas de absorção de fuiereno livre.

O espectro infravermelho do produto apresenta bandas de absorção características de aminoácidos substituídos N: para o grupo de -COOH-, a 1704 cm'¹ e 1658 cm'¹; para os grupos de NH/, a 3100, 2550 e 2000 cm'¹; para as vibrações de estiramento de H-H-, a 3300 cm¹; e para as vibrações de curvamento de N-H-, a 1552 cm'¹; para C60-NH-R-, as bandas de absorção aparecem a 1104 cm⁴,930 cm’¹ e 830 cm⁴.

A análise elementar apresenta as seguintes proporções de elementos no produto: %O76,84; %H~4,80; %N~5,15; para a fórmula em massa «^§Η₇₅Ν_δΟ_Χ2 (peso da fórmula: 1503), calculado: %C - 76,49; %H ~ 4,90; %N ~ 5,57.

Exemplo 2» Preparação do ácido aminobutíríco y de fuiereno N com alanina β da fórmula C^Q(H₃)(NH(CH₂hCOOl₃(HHrCH₂<H_r' COOH)₃.

A uma solução de 7,2 g (0,01 mol) de fuiereno C_sa em 400 ml de o-diclorobenzeno adicíona~se 14 g (0,1 mol) de sal de potássio /34 apídrico recém-preparado de ácido amlnobutrico y. À suspensão resultante adicionou-se durante duas horas, sob agitação e aquecimento a uma temperatura não superior a 60*C, uma mistura de o~didorobenzeno e éter de metil polietilenoglicol 400 na proporção de 3:1. A mistura da reação é agitada a s uma temperatura não superior a 60*€ durante 2 a 3 horas até que a solução.

descolora completamente e um precipitado sólido é formado. Depois disso, a mistura é filtrada; o precipitado é lavado no filtro com várias porções de etanol e seco em vácuo a uma temperatura não superior a 60’0. O produto isolado é dissolvido em água destilada. A esta solução, 1 N de ácido clorídrico é 10 adicionados lentamente, sob agitação, até que o pH se torna 5.1. A mistura é deixada em repouso até que o produto é completamente precipitado. Em seguida, a camada aquosa é decantada. Ao precipitado, que é uma suspensão fina de um produto sólido em água, uma solução etanólica de 2,7 g (0,03 mol) de alanina β é adicionada lentamente sob agitação. A mistura é agitada durante is duas horas até dissolver o precipitado completamente. Depois que o solvente é removido, o produto (12 g) é isolado.

O composto é um sólido marrom escuro que é solúvel em dimetií sulfóxido/água (1:200) e totalmente solúvel em misturas de CH₃CN:H₂O (1:1) e DMRH-A

A análise termogravimétnca do produto mostra que o complexo contém três moles de alanina β levemente ligada, que são divididos com decomposição a 21(FC. A decomposição térmica de todo o complexo ocorre a 335^aC com a evolução do fulereno em uma quantidade correspondente á proporção de C_SQ; fração de aminoácido de 1:6.

A hidrólise ácida do composto resultante com uma solução de HC1 0,01 M leva à liberação do hidrocloreto de alanina β em uma quantidade de 3 moles por mole da substância inicial.

Os espectros do produto registrados em soluções de sulfóxidq de dimetil e em 0,1 N de NáOH aquoso apresentam bandas de

14/34 absorção na região de 217, 260, e 335 nm, que são características dos derivados de fulereno, e não apresentam bandas de absorção de fulereno livre.

O espectro infravermelho do composto apresenta bandas de absorção características de amínoácídos substituídos N e as formas 5 catiõnicas de amínoácídos: para o grupo ™CQOH', a 1717 cm⁴,1710 cm'¹, e 1658 cm'¹; para o grupo ΝΗ-Λ a 3100, 2550 e 2000 cm⁴; vibrações de estiramento de N-H aparecem a 3400 cm'¹; vibrações de estiramento de N»H aparecem a 3400 cm'¹; vibrações de curvamento de N-H aparecem a 1552 cm⁴; e para C_SO-NH-R<·, as bandas de absorção aparecem a 1104 cm⁴, 930 cm'¹, e 830 cm λ ^u· A análise elementar apresenta as seguintes proporções de elementos no produto: %O75,24; %H-3>80; %N~6,25; para a formula em massa CsiH^hUQ;·» (peso da formula de 1296), análise calculada.: %C = 75,00, %H - 3,70, %N 6,48. >

Fxernplo 3. Preparação de ácido aminocaproico e de 15 fulereno N com glutamine de fórmula:

QeiHaHNHCCHahCOQ'MNH^COitCHJjCH^NH^COOHh.

O processo é realizado da mesma maneira que o Exemplo 1, A única diferença consiste no seguinte: no passo de tratamento do precipitado, depois que a forma ácida do ácido aminocaproico de fulereno é 20 precipitada, uma solução de 4,5 g de glutamina em dímetíl sulfóxido-água é adicionada. Os solventes são removidos por destilação a vácuo,

A análise elementar apresenta as seguintes proporções de elementos no produto: %C-71,34; %H~4,80; %N~8,25_; para a fórmula em massa C₉₃H_S9N₃O_1S (peso da fórmula: 1551), calculado: %C ~ 71,95, 25 %H - 4,50, 8,12.

O espectro infravermelho do produto apresenta bandas de absorção características de aminoácldos substituídos M e as formas catiõnicas de amlnoácidos: para o grupo -C0OH-, a 1714 cm' e 1707 cm⁴; para C=0(NH“C60), a 1658 cm'¹; para o grupo ΝΉ3ζ a 3000, 2550 e 2000 cm'¹; as

15734 vibrações de esti ramen to de N-H aparecem a 3400 cm’³; as vibrações de curvamento de N-H aparecem a 1552 cm’5 e as bandas de absorção de Csq-NHR-_f a 1104 cm'¹, 930 cm⁴, e 330 cm’¹.

A hidróHse ácida do composto leva à liberação do 3 hidrodoreto de hidrodoreto de glutamina em uma quantidade de 3 moles per mole da substância inicial.

A atividade antiviral dos compostos foi estudada contra o vírus da gripe, HIV e HSV; sua atividade antitumor também foi estudada. Nos exemplos a seguir, o agente preparado pelo método descrito no 18 Exemplo 1 será referido no texto como agente 1 (fulereno poll(áddo amínocapróíco)).

BémtloJl. Estudos de atividade antí-HIV do agente de fulereno poli (ácido amínocapróico).

Estes estudos foram realizados no Laboratório de

Vírus da Imunodeficiência com o Centro de Testes de Avaliação de Peritos de Agentes Antivirals e Desinfetantes (Instituto de Pesquisa Ivanovsky para Virologia, Academia Russa de Ciências Medicinais).

As células foram adicionadas com a formulação do teste e infectadas com o vírus em uma dose de 0,01 TCD_$e/célula. As culturas .2?) celulares foram incubadas a 37X em uma atmosfera de 5% de CO2 e 98% de umidade durante 4 a 5 dias. Os resultados foram determinados por coloração das células com um corante e por microscopia óptica: estudos do efeito dtopático (CPE) do vírus e formação de sincído induzida por (síncício é um conglomerado de várias células com membrana celular totalmente envolvente 25 formada pela fusão da membrana).

O grau de citodestruição foi avaliado no microscópio, de acordo com o sistema comumente aceito de quatro mais, utilizando símbolos ν^Λ e dependendo do número de células mortas em cada uma das quatro cavidades correspondentes a um parâmetro de teste.

/34

4-H+ significa a morte de 100% das células das quatro cavidades utilizadas em um teste de diluição única;

+++ significa a morte de 75% das células das quatro cavidades;

4+ significa a morte de 50% das células das quatro cavidades;

4 significa a morte de 25% das células em cada uma das quatro cavidades;

+»significa a degeneração inicial; e

- significa a ausência de dtodestruição.

Os resultados destes estudos são apresentados nas Tabelas 1 e 2.

Estes resultados (ver as Tabelas 1 e 2} mostram que as amostras de fulereno poli (ácido aminocapróico) estudadas possuem uma atividade antiviral contra o vírus tipo 1 da imunodeficiência humana. A EC_S0(concentração efetiva de 50%) da amostra é 0,9 mcg / mL Em concentrações de 0,5 a 10 mcg/ml, o agente não possui nenhum efeito citotóxico nas células.

¹⁵ Estudos experimentais in vitro da atividade anti-her pética do agente de fulereno poli (ácido aminocapróico). Estes estudos foram realizados no Instituto de Pesquisa Ivanovsky de Vírología da Academia Russa de Ciências Medicinais, Moscou.

O objeto do estudo foi a atividade citotóxica e antiso herpétíca do agente em culturas de células Vero.

No estudo foram utilizados: cultura de células renais de macaco transpiantáveis (VERO), adquiridas da Coleção de Cultura de Tecidos do Instituto de Pesquisa Ivanovsky de Vlrologia, da Academia Russa de Ciências Medicinais; e o vírus simplex de Herpes tipo 1, linhagem Lg propagado em 25 células Vero. As células foram infectadas com ó vírus em uma dose de 100 TCD_sa/0,2 ml e 1000 TCD_S0/0,2mL.

A amostra de teste da substância utilizada foi um pó de cor escura.

/34

A amostra foi inicialmente dissolvida em dimetH sulfúxldo (DMSO) na proporção de 1:20 e em seguida as concentrações de trabalho foram preparadas no melo IGLA MEM, As atividades das amostras de teste foram avaliadas quanto ao grau de proteção das células do efeito cítotóxico induzido por vírus de HSV. utilizando um método microscópico e o ensaio de MTT como densidade óptica.

Resultados dos estudos. A toxicidade das substâncias nas concentrações utilizadas e a toxicidade do solvente (1,5 ml de DMSO em 50 ml de água) foram estudadas.

O agente em concentrações finais de 50 a 1000 mcg/mL foi adicionado a uma monocamada de cultura de células VERO e incubada em uma atmosfera de 5,0% de CO₂ a 37”C durante 24 a 48 horas, A monocamada de célula foi corada com uma solução de 0,4% de Azul Tripan e inspecionada em microscópio,

A amostra não causou um efeito tóxico na cultura de células VERO, quando utilizada em concentrações de até 100 mcg/mL e, quando a concentração era de 200 mcg/mL, as assinaturas de efeito tóxico apareceram: a taxa de morte celular foi de 25%. Concentrações de 500 mcg/mL ou superiores são tóxicas para as células Vero (Tabela 3).

As propriedades protetoras da amostra foram estudadas em um esquema de administração, ou seja, uma hora antes da infecção e com duas doses de vírus (100 T€D_S0 e 1000 TCD<J.

Os resultados são apresentados nas Tabelas 3 a 7. Qs estudos acima descritos demonstram que a administração do agente 60 minutos antes da Infecção de uma cultura de células com vírus simples de herpes em uma dose de 100 TCD₅₅ protege completamente as células contra o efeito dtodestrutlvo do vírus para todas as concentrações testadas, que foram de 5,0 mcg/mL e mais (ver as Tabelas 4 e 5).

/34

Quando a dose do vírus herpes da infecção aumentou para 1000 ICD^y/co ml (ver as Tabelas 6 e 7), a amostra de agente forneceu proteção completa de uma cultura de células sensíveis ao efeito çitodestrutivo do vírus no esquema de teste escolhido (as células foram 5 Infectadas com o vírus 60 minutos após a inserção do agente no meio de cultura).

ExemglojB, Estudos atividade antiviral de fulereno poli (ácido aminocaprólco) (agente n- 1) contra o vírus influenza (HlNl)swl A/IIV-Moscou/01/2009.

¹⁰ £stes estudos foram realizados no Instituto de

Pesquisa Ivanovsky de Virotogia da Academia Russa de Ciências Medicinais, Moscou. A tarefa era estudar a atividade antiviral destes 12 agentes em cultura de células MDCK contra o vírus influenza (HlNl)swl A/IIV-Moscou/01/2009.

agente foi diluído com DMSO (5 mg de substância 15 + 0,5 ml de DMSO), seguido pela adição de 4,5 ml de meio de cultura de células

MEM para obter uma solução de reserva com uma concentração de 1,0 Mr/mL Subsequentemente, as reservas foram diluídas com o meio de MEM para obter a seguinte série de concentrações de trabalho: 6,5 mcg/m.L-12,5 ~ 25,ü ~ 50,0 100 mcg/ml.

²⁰ A atividade antiviral foi determinada a partir da redução da reprodução do vírus influenza em cultura de células MDCK, conforme reconhecido por ELISA.

Para este efeito, as células MOCK foram cultivadas em placas de 96 cavidades para obter uma monocamada completa, lavadas a 25 partir do meio de crescimento e adicionadas com substâncias em uma concentração de duas vezes em 100 mcL de meio MEM. A infecção com o vírus em uma dose de trabalho variando de 100 a 1000 TCD_S0 foi realizada em dois protocolos: 2 horas após a introdução das substâncias e simultaneamente. As placas foram incubadas em um termostato cheio de CO3 durante 24 horas a /34

37*C. Apos a incubação, o meio foi removido e as células foram fixadas em 80% de acetone em PBS durante 15 minutos e, em seguida, foram bem secas, e ELISA foi realizada por absorção consecutiva de reagentes específicos, ou seja, anticorpos monoclonais, conjugado e substrato (ortofenHenodiamina). O grau 5 de reação foi monitorado pela medição da densidade optica a 492 nM em um espectrofotômetro Biokom. Cada diluição do vírus foi estudada em três réplicas, para as quais um valor médio da densidade óptica (OD) foi calculado. A percentagem de inibição foi definida como o quociente da diferença entre a densidade óptica experimental e a densidade óptica do controle celular, io dividido pela diferença entre a densidade óptica do controle de vírus e a densidade óptica do controle celular, multiplicado por 100%. Os dados obtidos deste modo foram usados para determinar a concentração mínima do agente que causou a inibição de 50,0% da reprodução viral (MIO®).

A inibição da replicação do vírus da influenza is A(H1N1) foi determinada em três experimentos com diferentes multiplícidades de infecção. 0$ resultados são apresentados na Tabela 8 (como protocolos dos três experimentos), e na Tabela 9 (conforme os resultados médios dos três experimentos).

Pode-se ver na Tabela 9 que existe uma correlação 20 nítida entre o grau d? reprodução e a concentração do agente: na medida em que a concentrar aumenta, a reprodução do vírus diminui. Além disso, não há nenhuma difere τ notável nos valores, independentemente do protocolo de infecção (duas oras após a inserção do agente ou simultaneamente).

Assim, os resultados da atividade obtidos para 25 diferentes diluições do agente contra o vírus da influenza A(HÍNl)swl A/IIVMoscou/01/2009 demonstram uma elevada atividade iniWora da reprodução na cultura du .das MDCK. O protocola de inserção do agente (duas horas antes da infecção «u simultaneamente com a infecção) não afeta a atividade do agente na cultura céluhs MOCK.

20/34

Exemplo 7. Estudos atividade antiviral de fulereno poli (ácido amínocapróico) (agente n® 1) na pneumonia de influenza induzida em camundongos.

Estes estudos foram realizados no Centro de Química 5 Medicinal (TsKhLS-VNIIChFI) em Moscou.

O agente utilizado nos estudos estava na forma de um pó cristalino marrom escuro. As doses do agente necessárias para a administração oral foram preparadas por dissolução de porções pesadas em uma solução de 1% de amido cozida com água. Para administração por via lô intraperitoneal ou por via intramuscular, porções pesadas do agente foram dissolvidas em solução uma de 1,5% de DMSO.

O vírus usado foi o vírus da influenza adaptado para ratos A/Aichi/2/69 (H3N2). Este vírus é amplamente utilizado para determinar a eficácia de agentes antivirals no tratamento de pneumonia de influenza is induzida em camundongos e foi adquirido no Museu de Linhagens Viraís e Culturas Celulares do Instituto de Investigação Ivanovsky de Viroíogia da Academia Russa de Ciências Medicinais. Para preparar o material de infecção, os ratos foram infectados por via intranasal com p vírus alantóiw; uma vez que os sintomas da doença se desenvolveram, os ratos foram mortas e um so homogenate de tecido de pulmão foi preparado em condições estéreis. Em seguida, este homogenato foi utilizado para infectar embriões de galinha de 10 dias, a partir do qual o vírus alantoico foi derivado para ser utilizado, depois de titulação em ratos, para infectar animais.

Camundongos brancos sem pedigree (femininos), 25 com pesos corporais de 12 a 14 g, foram adquiridos no berçário do Andreevka (Moscou Oblast) e mantidos com uma ração padrão em condições de biotério reguladas.

Ratos pré-pesado (ratos fêmeas não lineares com pesos corporais médios de 12 a 14 g) foram infectados por via intranasal sob /34 leve anestesia com éter, com o vírus de influenza A/Aichi/2/69 (H3N2) (101¾ em 100 mel). DL_SQ foi determinado em um experimento preliminar por titulação do vírus alantóico nos mesmos ratos que foram utilizados no experimento principal. O esquema de tratamento com o agente de teste foi o seguinte: 24 5 horas antes da infecção, 1 hora antes da infecção, 24 após a infecção e uma vez por dia em 24 horas durante 5 dias. Para a administração oral, foi utilizada uma seringa de insulina com uma agulha especial (lavagem); cada dose foi administrada em uma quantidade de 100 mcL Para administração por via intraperitoneal e por via intramuscular, cada dose também foi injetada em uma is quantidade de 100 mel. Q grupo de controle de vírus foi constituído por 10 ratos que foram infectados com o vírus, mas não foram tratados com agentes.

Na experiência havia também dois grupos com 10 ratos não infectados em cada um, cada rato recebeu por via intraperitoneal e por via intramuscular 100 mcL de 1,5% de DMSO, que foi utilizado como solvente para os agentes. Os outros is grupos inicialmente também foram constituídos por 10 animais cada um. Os animais tratados e controlados foram monitorados diariamente; nos primeiros cinco dias após a infecção, os ratos foram pesados todos os dias, e depois a cada dia seguinte. A atividade quimioterapica do agente no tratamento de pneumonia de influenza induzida foi determinada por três critérios, a saber: a 20 porcentagem de proteção contra a infecção viral mortal, um aumento no tempo de vida médio e uma diminuição na perda de peso corporal em grupos de animais tratados com o agente, comparado ao grupo de controle.

O tratamento com ácido aminocapróico de fulereno foi eficiente na diminuição da taxa de mortalidade por pneumonia de influenza 25 em ratos e perda de peso e aumento da vida média em relação ao controle do vírus. A eficácia deste tratamento depende da dose do agente e do esquema de tratamento. Os resultados são apresentados nas Tabelas 10 e 11.

O tratamento intramuscular com fulereno poli (ácido aminocapróico) foi mais eficiente em termos de todos os três parâmetros

22/34 (porcentagem de proteção contra morte, tempo de vida médio e perda de peso); quando administrado em doses de 100 e 200 mg/kg/dia, este tratamento impediu a morte de 60 a 70% dos animais infectados e a perda de peso, e também aumentou seu tempo de vida quase o dobro. O tratamento s intraperitoneal com fulereno poli (ácido aminocapróico) fui eficiente apenas em doses de 50 e 100 mg/kg/dia. A taxa de morte, uma redução considerável no tempo de vida médio e no peso corporal em ratos por meio de tratamento intraperitoneal com fulereno poli (ácido aminocapróico) em uma dose de 200 mg/kg/dia implica que esta dose com este método de tratamento é tóxica para to ratos infectados.

^xempjo.. 8, Estudos atividade antítumoral de fulereno polí (ácido aminocapróico) (agente n& 1) em L121D leucose, adenocarcinoma de mama Ca-755 e os tumores de carcinoma de Lewis transplantáveis.

Estes estudos foram realizados no Instituto de

Toxícologia em São Petersburgo em 2006, de acordo com as '’Diretrizes para o Estudo da Atividade Antítumoral de Agentes Farmacológícos (Manual sobre o Estudo Experimental (Prechnícal) de Novos Agentes Farmacológícos^v, Ministério da Saúde Pública da Federação Russa, Remedium, Moscou, 200(3, pp 319-325). 20 3 19-325).

A linha de células tumorais de L1210 leucemia, adenocarcinoma de mama Ca-755, e carcinoma de Lewis (311) foi adquirida no Instituto de Pesquisa de Oncologia Petrov, Ministério da Saúde Pública da Federação da Rússia (São Petersburgo).

Estes estudos utilizaram os seguintes sistemas de ensaio:

Ratos da linha DBA/2 com células de leucemia L1210 transplantadas. Idades dos ratos: 6 a 8 semanas; pesos corporais: 19 a 25 g.

/34

Ratos machos da linha C 57 BL/6J com células Ca-755 transplantadas. Idades dos ratos: 6 a 8 semanas; pesos corporals: '19 a 25 g.

Ratos machos da linha C 57 BL/6J com células 3LL transplantadas. Idades dos ratos: 6 a 8 semanas; pesos corporais: 18 a 24 g» ⁵ θ efeito antitumoral foi determinado através dos seguintes parâmetros:

- acumulo de ascíte com o ganho de peso corporal do animal;

~ tempo de vida dos animals; e

- crescimento do tumor. A maior dimensão do tumor (comprimento) e a menor to dimensão normal (largura) foram medidas. O volume do tumor foi calculado e a inibição do crescimento do tumor foi calculada pela fórmula. Q critério de. apuração foi o dia em que cada tumor individual atingiu um volume de 500 mm x

Os resultados sobre o efeito do agente no 15 desenvolvimento da leucemia L1210 são apresentados na Tabela 1.2»

A Tabela 13 mostra valores do tempo de vida médio nos animais com tumores tmnsplantáveis de leucemia LI21Ô e o grupo de controle, bem como o aumento do tempo de vida em comparação com o grupo de controle, em porcentagem.

Pode-se ver na Tabela 13 que o tempo médio de vida nos ratos do grupo de controle com células de leucemia 11210 transplantadas foi de 6,0 ± 0,21 dias, A administração do agente de aumentou confiavelmente os tempos de vidas nos ratos para 10,7 ± 0,37 dias e 10,60 ± 0,37 dias. O aumento percentual do tempo de vida em comparação com o controle foi de

78,33% e 76,67% para as doses de agente de 100 mg/kg e 200 mg/kg, respectiva mente; no entanto, as diferenças entre os grupos experimentais pareceu estatisticamente confiável.

/34

Durante o experimento, os animais foram pesados diariamente com o objetivo de avaliar o acúmulo de asclte e estudar os agentes comparados neste processo.

Os resultados das avaliações do ganho de peso s corporal são apresentados na Tabela 14, Pode-se ver na Tabela 14 que o agente testado reduziu confiava!mente o acumulo de asclte nos ratos com tumores de leucemia 11210 transplantados, O ganho de peso corporal nos ratos que receberam o agente de teste foi conflavelmente menor do que no grupo de controle e, além disso, nos animais que receberam o agente testado em uma ia dose de 250 mg/kg, o ganho de peso corporal médio foi confiável mente (por um fator de 1,5) menor do que o mesmo parâmetro nos animais que receberam o agente em uma dose de 100 mg/kg,

Assim, os resultados acima implicam que o agente possui uma atividade antitumoral bem definida e inibe o crescimento do tumor is de leucemia 11210 em ratos, o que se manifestou no aumento confiável do tempo de vida (78,33% e 76,67%) para as doses de 100 e 250 mg/kg, respectivamente, e em uma inibição confiável do acúmulo de asclte nos animais experimentais (78 para 43%), Nenhuma assinatura de intoxicação foi detectada no histórico da administração do agente testado. Uma inspeção dos resultados 2δ mostra diferenças confiáveis entre uma dose de 100 mg/kg e uma dose de 250 mg/kg: o aumento na dose do agente leva a uma diminuição confiável no acúmulo de asclte nos animais experimentais,

Para os outros parâmetros, o contraste (a diferença das médias para os grupos que receberam anteriormente diferentes doses do 25 agente de teste) estava no nível de erros causados por variação natural.

Os resultados sobre o efeito do agente no desenvolvimento do adenocarcinoma de mama Ca~755 são apresentados na Tabela 15.

/34

A Tabela 16 mostra valores do tempo de vida médio nos anirnais com tumores transplantáveis de adenocarcinoma de mama Ca-755 e os animais do grupo de controle, bem como o aumento do tempo de vida em comparação com o grupo de controle, em porcentagem.

Pode-se ver na Tabela 16 que o tempo médio de vida nos ratos do grupo de controle com células de adenocarcinoma de mama Ca755 transplantadas foi de 37,9 + 0,74 dias. A administração do agente aumentou confíavelmente o tempo de vida nos ratos para 71,9 ± 2,58 dias e 73,4+0,92 dias; o aumento da porcentagem no tempo de vida em comparação com o 10 controle foi de 89,71% e 93,67% para as doses do agente de 100 mg/kg e 200 mg/kg, respectivamente; no entanto, as diferenças entre os grupos experimentais pareceu estatisticamente não confiável.

Assim, os resultados acima implicam que o agente tem um efeito antitumor pronunciado e inibe o crescimento de células tumorais 15 de adenocarcinoma de mama Ca-755 em ratos, que se manifestou como um aumento confiável no tempo de vida (89,71% e 93,67%} para as doses de 100 e 250 mg/kg. Nenhuma assinatura de intoxicação foi detectada no histórico da administração do agente testado.

O efeito do agente no volume médio dos tumores de carcinoma de Lewis foi determinado em diferentes dias após a transplantação. No grupo controle, tumores se desenvolveram em 2'1 dos 26 ratos (80,8%); os primeiros tumores apareceram no dia 7 após o transplante e foram observados até ao dia 4G. Os primeiros tumores no grupo afetado pelo agente em uma dose de 100 mg/kg foram observados no dia 7 apôs o transplante e observados até ao dia 60; no grupo afetado pelo agente em uma dose de 250 mg/kg, eles apareceram no dia 8 após o transplante e foram observados até o dia 60. O agente teve um efeito antitumoral proeminente no desenvolvimento de carcinoma pulmonar de Lewis; a porcentagem de inibição no grupo afetado pelo agente em uma dose de 100 mg/kg no dia 10 até o dia 17 foi confiavelmente /34

71,77% e 58,5% em comparação com o grupo de contrate; no grupo afetado peto agente em uma dose de 250 mg/kg em comparação com o grupo d® controle, a porcentagem de inibição no dia 10 até o dia 17 foi de 84,37% e 54,2%, respectivamente.

⁵ A Tabela 17 mostra o efeito do agente no crescimento do carcinoma pulmonar de Lewis; os parâmetros analisados foram prazos para o tumor alcançar um tamanho de 500 mm⁵; no grupo de controle, este parâmetro variou entre 12 e 20 dias, e nos grupos experimentais, 17 a 28 dias. Como se pode ver nesta tabela, o agente aumentou confiavelmente este 10 parâmetro em 22 a 27% em relação ao controle.

Nos ratos do grupo de controle, a morte acorreu como resultado da progressão do crescimento do tumor do foco principal, e devido à grande metástase do pulmão. Os tempos de vida individuais dos ratos do grupo de controle variaram de 28 a 39 dias; nos grupos em que os ratos is receberam o agente, de 51 a 6G dias. A Tabela 18 mostra o efeito do agente no tempo de vida médio em ratos após o transplante do tumor. Podemos ver na Tabela 18 que o agente aumentou confiavelmente o tempo médio de vida em aproximadamente 70% em relação ao grupo de controle; a diferença entre os grupos tests é estatisticamente não confiável,

Os valores individuais do peso dos pulmões e do número de metastases nos pulmões de ratos do grupo de controle e nos ratos dos grupos de toste que receberam as agentes sob comparação são apresentados na Tabela 19.

Podemos ver na Tabela 19 que o agente diminuiu 25 confiavelmente o peso dos pulmões e o número de metástases nos pulmões por um fator de 1,5 a 2. A diferença entre os grupos de teste é estatisticamente não confiável.

Tabela 1

27/34

- Cítotexícidade do agente estudado no medeio de células linfoblastóides humanas:

Tabela 2:

~ Atividade antiviral do agente estudado no modelo de célula humana infectada

Tabela 3 ~ Efeito citotoxico de uma amostra de fulereno poli (ácido aminecaproico) em cultura de células Vero_________'

Concentração do agente, ™ Êfeítoeitotdxlco nas çéiüíã%%~”1

Mcg/ml | |

Observação: O DMSQ na concentração usada para a io dissolução não causa um efeito dtotóxico nas células.

2S /34

Tabela 4 ~ Atividade anti-herpética de uma amostra de fulereno poli (ácido aminocapróico) em cultura de células Vero com uma dose infectante de vírus

Observação: As células foram infectadas uma hora após a inserção da amostra

Tabela 5

Efeito protetor do agente contra o efeito destrutivo do vírus de Herpes Tipo 1

w Tabela 6 ·· Atividade anti-herpética de uma amostra de fulereno poli (ácido aminocapróico) em cultura de células Vero com uma dose infectante de vírus

Herpes de 1000 TCD_K70,.2ml

29/34

Observação: As células furam infectadas uma hora após a Inserção da amostra.

Tabela 7 ’ Efeito protetor do agente número 1 contra a ação citopátíca do vírus de herpes tipo 1 com uma dose mfectante da vírus de herpes de 1000 TCD^ | Concentração do agente, Densidade ôptícã A dlferen^do conüdeé i mcg/ml ; confiável para p

100.0 controle celular

5.0

10.0

SÕJ

0.796 +0.06 rÕ27±ÕÕ4 1021+0.04 TÕ33±Ò.O3

1.08310.01

1.133 10.07

<0.01 <aõi <õõi <oBT

~ Valores da atividade do agente No. 1 contra o vírus da influenza A/ílVMoscou/01/2009 (HIMl)swi Concentração do~] agente (mcg/ml)

6,25

Protocolo de administração

300,0

Ovas horas antes da infecção Simultaneamente com a infecção

12,5

25,0

Duas horas antes da infecção

Simultaneamente com a infecção

50,0

Duas horas, antes da Infecção Simultaneamente com a infecção

Duas horas antes da infecção

Simultaneamente com a infecção

Duas horas antes da infecção Simultaneamente com a infecção

Porcentagem (%) de redução da | reprodução do vírus da Influenza em i cultura de células MOCK em relação ao | controle na presença da série do agente | número 1 |

27,0-28,0-0 ””™~ ΐ

18,q'¥Õ'

47,0-74,0-9,5

39,0-13,0-0 '41,0-79,0-12 ”28A72A3£F

33,0-10,0

.........ξ(μ&203) “Ίί9Α2ί$

As diferenças entre us valores das duas execuções dependiam da multiplicidade da Infecção viral da cultura de células MDCK.

Z34

Tabela 9

- Valores da atividade do agente contra o vírus da influenza A/IIVMoscou/01/2009 (HlNl)swl, valores médios ί Concentração do agente (mcg/mL)

6,25

I Porcentagem de redução da reprodução do Protocolo de administração virus da Influenza em cultura de células MUCK em relação so controle na presença da série do agente número 1 lãÕ

44,0 __

4ξθ 20,0 Ζζΰ ~22Õ

IDuas horas antes da infecção

I Simultaneamente com a infecção 12,5 i Doas horas antes da infecção

Simultaneamente com a infecção Duas horas antes da infecção | Simultaneamente com a Infecção Duas horas antes da infecção Simultaneamente com a infecção Duas horas antes da infecção Simultaneamente com a infecção

25,0

50,0 χοο,ο

Tabeh 10

29T

- Eficiência de fulereno polí (ácido amínocapróico) na infecção de influenza induzida em ratos

1070*

Dose do agente

Porcentagem Tempo de vida de proteção médio (dias)**

100 mg/kg/díá

200 mg/kg/dia

300 mg/kg/dia

Porcentagem de proteção contra morte contra morte ______ (%)

Fulereno poli (sminoácido), oralmente 13,f(ÍSd., 1-10 d.,

1-lld.)

LD90**

Tempo de vida médio | (dias)*

10,8 (2-78., 1-98.,210d,, 1-lld) 13,4(Í-10d.,2-lld) Não estudado

Não estudado ______2,,8(1-88,,2-94.)

Fulereno (políaminoácidd), intramuscular

^50 mg/kg/dla 100 mg/kg/dia 1200 mg/kg/dia	50 70	13,3(!-7d,,i-8d.) >16
\|15% DMSO	^_”50	13^(078^0131) >1S

11,4(2-74.,1-88,,2- | lld)|

13,0 (l-8d., 1-98., 1- | lld.)|

13,1(1-78.,211d)| >16I

Fu lereno (po liaml noád do), intra perito nea I

50 mg/kg/dia	50	13,4 (2-8d,) \|	40	j 11,S (2-7 d. D-98.,
100 mg/kg/dia	60	13,7 (l-3d.)	30	lld.) 10O3-7d.,2-
200 mg/kg/dia	0	3„l(3-ld,,l-2d._r2- \|	Não	j 8d.,l-9d.)

[SdluçãO de DMSQ [ \1,5%OMSO |Controle viral (XO lAo)

3d.,l-5d._fl-8d.) | estudado

_______>16

10,1 (4-8d.,2-10d.,llld.)

Não estudada >16________

Ã3 (5-7 d., 4-Sd)

Observações:

Nos experimentos a taxa de mortalidade no grupo de controle do vírus foi de

70%, ou seja, sete dos 10 ratos morreram.

** Nos experimentos a taxa de mortalidade no grupo de controle do vírus foi de s 90%, ou seja, nove dos dez ratos morreram.

* Esquema de tratamento: 24 horas e 1 hora antes da infecção, em seguida, 24, 48,72, e 96 horas após a Infecção. '

Tabela 11

Mudança de peso nos animais infectados com o vírus da influenza io A/Aichi/2/69 (dose LD70) e tratados com agentes

Dose do agente	__Por dia 1	cent age dia 2	m de mc dia 3	rdança d dia 4	8 peso c díalT	orporaí em dias após a infecção dia F] dia 9[~dia ΐΐ \| dia Ϊ3
Fulereno poli (aminoác	dot	mente
100 mg/kg/dia	+19	+23	+25	+22	+16	+17	+24	+43	*51
200 mg/kg/dia	+20	+31	+35	+36	+36	+38	+47	+S1	-57
300 mg/kg/día	+24	+27	+28	+24	+19	+23	+33	+36	+38
Fulereno poli (amíndácidô), intramuscular
SO mg/kg/día	+20	+22	+22	+17	+11	+9	+11	+19	+26
100 mg/kg/dia	+21	+25	+27	+23	+20	+21,5	+32	+35,5	+38
200 mg/kg/dia	+25	+27	+28	+24	+20	+23	+22	+25	+36,5
Fulereno poli {amínoácidcp, intraperitoneal
50 mg/kg/dia	+21	+27	+29	+21	+16	+15	+31	+36	+40
100 mg/kg/día	+19	+23	+22	+18	+15	+18	+25	+33	+41
200 mg/kg/dia	+7	+6	+5 '	«4	-3	-7	+4	+6	+15
Controle viral	+19	+24	+31	+9	+0,9	-11	+4	+27	+37

Tabela 12 « Efeito do agente no tempo de vida em ratos com tumor de leucemia LI210 transplantável

	Número do ar	úmaí e tempo	de vida em dias
\| Nome do grupo	1 1 §	2 3	4	1	8	7	8	9	1 0
j Controle	1 6 \|	7 p	j 6	1 6	5	6	6	5	6
Agente No. 1	9	1 1		1 1	1	1	1	1	1
100 mg/kg	1 \|	1 1 3	ίξ	\| 2	0	1	0	0	0
Agente No. 1	1	i í 1		i 1	1	1	1	1	1
1 25G mg/kg	1 θ 1	0 0			1	3	0	1	2

32/34

Tabela 13 ~ Efeito do agente no tempo de vida médio em animais com tumor de leucemia

LQlOtransplantável

Nome do grupo

ALT em dias, M±m

Controle

Agente No. 1,100 mg/kg

Agente No. 1, 2S0 mg/kg

6,0+0,21

10,7137*

10,6010,37*

78,67

78,33

Observação: * Diferença confiável do controle (para p < 0,05),

Tabela 14.

- Efeito do agente no desenvolvimento de ascite em ratos com tumor de leucemia 11210 transplantável | Grupo de contrate i________________________„„

Dia l Ganho médio de peso corporal, M+m

0,4+6,2

0,3+0,2

0,3+0.3

0,810,4

5,010,8

2,510,5

11,411,1

4,211,0

16,3+2,0

Ganho médio de peso corporal, M+m

21,212,1

26,311,7

8,411,2

12,1+2,1

Porcentagem de inibição relativa ao controle

Agente 100 mg/kg

Agente 250 mg/kg

Ganho medio de peso, M+m

Porcentagem de inibição relativa ao controle

0,3+0,1

0.5+0,3

1,110,4

63,2%*

2,8+0,9

4.711,2

8,4+1,6

78,0%*

75,4%*

71,2%*

60,4%*

62,0%*

42,9%*

46,0%* | .10,0+1,5

Observação: * Diferença confiável do controle (para p < 0,05)

Tabela 15

- Efeito do agente no tempo de vida sm ratos com tumor de leucemia CA-755

/34

Tabefe 16

Efeito do agente no tempo de vida médio em animais com tumor de adenocarcinoma de mama Ca-755 transplantável

Γ ”lonw do grupo [ ™......ALT em diããjvSm Γ ΰχ%“'Ί

Γ Controle I ' 379+0,74 j j

Γ Agente No, X, 100 mg/kg 71,912,58* | 89,71 | Agente No. 1,250 mg/kg 7MÕ±Õ32*” | 9^67~™]

Observação: * Diferença confiável do controle (para p < 0,05).

Tabela 17

- Efeito do agente no tamanho do carcinoma de Lewis (obtenção de V ~ 10 500 m m³)______________ | pia em que o tumor alcança o vüiüme de 500 mm™l

I______________________________...._________________________________________ | ............ ..........................

Observação: * Diferença confiável do controle (para p <0,05).

Tabela 18 » Efeito do agente no tempo de vida em ratos após a transplantação do carcinoma de Lewis ________ i Tempo de vida

Grupo i M±m	1 Aumento da porcentagem, sigmficânda
	> \<A x J a? K <
Controle [ 32,81 ±0,86
Agente 100 mg/kg 1 55,92 +.0,98	70 42%*
Agente 250 mg/kg \| 55,38*0,58	Ί ~ 71,85%*

Observação: * Diferença confiável do controle (para p < 0,05).

Tabela 19

- Efeito do agente no carcinoma de Lewis metastático em ratos

34/34

21)

No. 1

100 mg/kg (n-12) [ Número do grupo I , (número de enimãh

Peso des pulmões, mg Número de metástases^ _m nos pulmões, M±m

1486,7 ±64,08

491,9 ±53,72*

Agente No, 1 (η~13)

55,8 ±11,60*

Número de metóstases grandes (>3mm) nos pulmões, M±m

70,5 ±5,50

53,5 ±11,23*

13,4+2,05

5,8 ±.1.91*

5,7 ±1,54*

Observação: * Diferença confiável do controle (para

Claims

REIVINDICAÇÕES

1) DERIVADOS DE FULERENO DE HOMO E HETEROPOLI AMINOACIDOS CSÕ, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DOS MESMOS E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COM BASE NOS REFERIDOS DERIVADOS”, derivados de 5 fulereno home e heteropoli(aminoácído) de formula geral C_aí('H)_>;{NH(CH₂)_?!COOMNH/(L)COOH)L onde n ~ 2-5, x « 3, L ® ~(CH₂U onde m = 1-5, ou CO(CH₃hCH(NH₂X onde k - 1»2, corocter/zodo por os compostos compreenderem grupos de aminoácidos ligados covalentemente e formas iônícas polares de aminoácidos,

j.ô
2) DERIVADOS DE FULERENO”, de acordo com á reivindicação 1, cgrocterfeodo por os grupos de aminoácidos serem grupos de aminoácidos alifáticos de fórmula geral NH(CH_?)_r!COGH, onde n ~ 2-5.
3) DERIVADOS DE FULERENO, de acordo com a reivindicação 1, coroçterizudo por as formas iônicas polares de aminoácidos serem porções de amidos de

15 aminoácidos dlcaboxíllcos de fórmula geral NH₂(CO)(CHJ_kCH(NH₂)COOH, onde k = 1 -2.
4) MÉTODO PARA PRODUZIR OS DERIVADOS DE FULERENO”, de acordo com a reivindicação 1, cprçcterfeodo por os derivados de fulereno serem produzidos por reação do fulereno com um excesso molar de dez vezes dos sais de potássio

20 anídricos de ammoácidos de fórmula geral NH₂(CH₂),_;COOK, onde n ~ 2-5 , em um meio de solvente orgânico aromático, compreendendo adicionar à suspensão resultante um catalisador de transferência de fase, sob agitação, e aquecimento a uma temperatura não superior a 60-80’C até que a solução seja completamente descolorada e um precipitado sólido seja formado, referido 25 precipitado sendo então separado, depois disso as soluções aquosas de sais de potássio de fulereno de poli (aminoácidos) são tratadas com uma solução de 1 N de ácidos orgânicos ou minerais, seguido pela introdução de uma solução, em solventes polares, de um aminoácido de fórmula geral NH₂(L)CQOH, onde L - 2/2 (CHJrm onde m ~ 1-S, ou onde k ~ 1-2, sob agitação, removendo os solventes, lavando e secando o precipitado.
5) MÉTODO*, de acordo com a reivindicação 4, çorocter/zadq por os sais de potássio anldricos recém-preparados de aminoácidos serem utilizados em um 5 estado finamente disperso e a separação dos sais de potássio de fulereno de poli (aminoácidos) ser realizada por filtração, lavagem de etanol e secagem.

o) “MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, por o catalisador de transferência de fase ser um éster de oxido de metil polietileno com peso molecular de 200, 400, ou SOO.

10 7) COMPOSIÇÃO FARMACêUTICA^, carocterwdo por o agente ativo ser o derivado de fulereno, de acordo com a reivindicação 1.