EA020801B1

EA020801B1 - Гомо- и гетерополиаминокислотные производные фуллерена с, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе

Info

Publication number: EA020801B1
Application number: EA201201448A
Authority: EA
Inventors: Лев Давидович РАСНЕЦОВ; Яков Юделевич ШВАРЦМАН; Ольга Николаевна СУВОРОВА
Original assignee: Лев Давидович РАСНЕЦОВ
Priority date: 2011-02-01
Filing date: 2012-02-06
Publication date: 2015-01-30
Also published as: AU2012212707A1; IL226736A; AP2013007072A0; EA201201448A1; US9221746B2; AP4014A; ES2582872T3; MX354436B; EP2674415B1; UA110345C2; US20130165691A1; MX2013008545A; BR112013012910A2; EP2674415A1; HK1190386A1; WO2012105872A1; AU2012212707B2; RU2458914C1; ZA201303447B; EP2674415A4

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, а именно к новым гомо- и гетерополиаминокислотным производным фуллерена Собщей формулы C(H){NH(CH)COO}{NH(L)COOH}, где n=2-5, х=3, L=-(СН), где m=1-5, либо -CO(CH)CH(NH)-, где k=1-2, характеризующиеся тем, что соединения содержат ковалентно-связанные аминокислотные группы и полярные ионные формы аминокислот, а также к способу их получения и созданию фармацевтических композиций на их основе. Способ получения гомо- и гетерополиаминокислотных производных фуллерена, основанный на реакции нуклеофильного присоединения аминокислот к фуллерену с образованием ковалентно связанных аминокислотных производных фуллерена с последующим введением полярных ионных форм аминокислот. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного вещества гомо- и гетерополиаминокислотные производные фуллерена формулы C(H){NH(CH)COO}{NH(L)COOH}, где n=2-5, х=3, L=-(СН), где m=1-5, либо -CO(CH)CH(NH)-, где k=1-2.

Description

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, а именно к новым гомои гетерополиаминокислотным производным фуллерена С₆₀ формулы (I), а также к способу их получения и созданию фармацевтических композиций на их основе.

где η = 2-5, х = 3, Ь = -(СТТ₂)_П1, при т = 2-5 или СО(СН₂)_кСН(ЦН₂)-, где к = 1-2.

Предшествующий уровень техники

Применение производных фуллерена в медицине основано на липофильных свойствах фуллеренового ядра, позволяющих фуллереновым производным проникать через клеточные мембраны, и способности фуллерена с высоким квантовым выходом генерировать синглетный кислород, расщепляющий ДНК. Эти свойства обеспечивают функциональным производным фуллерена проявление цитотоксических, антивирусных и других свойств (Вебгоу Ό., διηίΐΐι Ο.Ό., Иауаибе Н., Рак51уе Лайкрой оГ 1и11егепе8 1йгоидй а Ιίρίά тетЪгапе. 1. Рйу8. Сйет., В, 2008, ν. 112, р. 2078-84, О1ао К., КоЪей8 А.Е., ТгаиДосайоп оГ Гийегепе апб йк бегйшйек асгокк а 1ΐρϊ6 Ъйауег. Ыапо Ьей., 2007, ν. 7, р. 614-9. №1кеп Ο.Ό., и др., 1п νί\Ό Ъю1оду апб 1ох1со1о§у оГ &11егепе8 апб 1йей бепуабуек. Ва81с апб Сйшса1 Рйагтасо1оду апб Тохюо1оду, 2008, ν. 103, р. 197-208, Ра! И8 6204391, 2005, \Уа1ег ко1иЪ1е Гийегепек тейй апбуйа1 асйсйу).

Основная проблема, затрудняющая биологические исследования производных фуллеренов и создания лечебных препаратов на их основе, связана с нерастворимостью фуллеренов в воде, что затрудняет их прямое введение в организм человека. Одним из возможных вариантов преодоления этих трудностей является введение молекул фуллерена в солюбилизирующие матрицы. Известны способы получения водорастворимых форм фуллерена за счет образования аддукта с поливинилпирролидоном (К|8е1еу 0.1. е! а1.//Мо1. Ма1епа18. 1998. V. 11. Р. 121; Рюйоткку Ь.В. е! а1./ДЫбет. 2000. V. 13. Р. 41). Показана его эффективность против вируса гриппа А- и В-типа.

Известен также способ получения фуллеренов, включающий смешивание предварительно растворенных в органическом растворителе фуллеренов с полимерной матрицей в хлороформе, выпаривание смеси под вакуумом до полного удаления растворителей, растворение полученного комплекса в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4-7,6) с последующей обработкой продукта ультразвуком (КН № 2162819, 02.10.01). При этом в качестве водорастворимой полимерной матрицы используют мембранные кефалины. Продукты, полученные в результате таких модификаций, являются нестабильными композициями с ограниченными возможностями хранения.

Перспективным методом получения водорастворимых фуллереновых композиций является химическая модификация сферы фуллерена введением гидрофильных солюбилизирующих лигандов. В международной заявке \70 2005/070827 представлена серия аминокислотных производных фуллерена, полученных по реакции циклоприсоединения аминокислотных фрагментов к фуллерену, и продуктов их внедрения в биологически активные органические субстраты. Представленные в данном техническом решении методы синтеза многостадийны и нетехнологичны. Полученные соединения имеют низкую растворимость в воде.

В настоящее время получен большой ряд функционализированных фуллеренов, содержащих гидрофильные фрагменты как в боковой цепи присоединенных к фуллерену лигандов (детергентный тип комплексов), так и сферический тип производных, когда имеются полярные группы, распределенные по фуллереновой сфере (такой тип включает фуллеренолы, аминоаддукты).

Наиболее перспективными для использования являются аминокислотные производные фуллерена.

Аналогами настоящего изобретения являются соединения и способы их получения, описанные в международной заявке \70 2009/00203, а также патенте РФ № 2236852.

В международной заявке \70 2009/00203 описаны полифункциональные аминокислотные производные фуллерена формулы

где К=Н, моно- или дигидроксиалкил, галоидалкил, моно- или динитроксиалкил, малеинимид;

Ν-Ζ представляет собой фрагмент α, β, γ, ω-аминокислоты общей формулы -НН-С_тН_2т-С00М или

С₄Н₈Ы-С00М, где т=2-5, а М представляет собой нитроксиалкильную группу, алкильную группу или

- 1 020801 соль щелочного металла, или дипептид.

Данные соединения получены по реакции эквимолярного присоединения аминокислот к фуллерену с последующим замещением активного водорода органическим биологически активным лигадом с образованием соединений. Полученные соединения обладают ингибирующей активностью в отношении метастазов опухоли, усиливают антилейкемическую активность циклофосфамида, и могут быть пригодны в качестве доноров монооксида азота или в качестве вазодилататоров быстрого действия для антигипертинезивной терапии.

Основным недостатком соединений по данному изобретению является то, что они являются продуктами ковалентного присоединения, содержат малое количество полярных групп и имеют низкую растворимость в воде.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является средство для ингибирования репродукции оболочечных вирусов и способ его получения (патент РФ № 2236852). В результате взаимодействия фуллерена с солью аминокислоты в среде органического растворителя в присутствии полиалкиленоксида получены фуллеренполикарбоновые анионы общей формулы С₆₀Н_п[ИН(СН₂)_тС(О)О^-]_п, где С₆₀ - фуллереновое ядро, ИН(СН₂)_тС(О)О^- - аминокарбоновый анион; т равно целому числу от 1 до 5, п равно целому числу от 2 до 12.

Для получения этих соединений к раствору фуллерена в о-дихлорбензоле (толуоле или любом другом органическом растворителе) вносят аминокислоту в виде соли (калиевой или натриевой), затем добавляют солюбилизатор. Порядок внесения в реакционную среду аминокислоты и солюбилизатора не важен, можно вносить их в виде комплекса, предварительно смешав. В качестве солюбилизатора используют различные полиалкиленоксиды: полиэтиленгликоли мол. массы от 150 до 400 и выше 400 (например, ПЭГ-1500), а также диметиловый эфир полиэтиленгликоля мол. массы 500. Для увеличения скорости реакции добавляют любой сильный восстановитель (щелочные металлы).

Соотношение фуллерена и аминокислоты увеличено более чем в 50 раз. Превращение в желаемую фармацевтически приемлемую соль, особенно натриевую или калиевую, выполнялось путем обработки кислоты подходящим основанием или путем добавления соли слабой летучей кислоты. В частности, не растворимая в воде фуллеренполикарбоновая кислота превращается в более предпочтительные фармацевтически приемлемые соли, такие как натриевая соль, которые растворимы в воде. Добавление соли слабой летучей кислоты происходит путем обработки раствора солью щелочного металла и слабой летучей кислоты. При концентрировании раствора путем выпаривания или лиофилизации слабая кислота удаляется, а фуллеренполикарбоновые кислоты выделяются в виде их солей щелочных металлов. Целевой продукт по данному изобретению характеризуется постоянством состава, содержание в целевом продукте основного вещества составляет всего 87,8%. В описании отсутствуют технологические регламенты, связанные с определением оптимальных количеств исходных соединений, соотношений количеств используемых растворителей и, особенно, описания методов выделения искомых соединений.

Основными недостатками фуллеренаминокислотных производных, полученных представленным в патенте методом получения, является то, что данным способом получают смесь фуллеренкарбоксилатных анионов как солевых, так и кислотных форм. Получить индивидуальное соединение способом, описанным в патенте, не представляется возможным. Также фуллеренполиаминокислоты, полученные запатентованным способом, в кислотной форме практически нерастворимы в воде. Получить стабильную фармацевтическую композицию с фуллеренполикарбоновыми анионами не удалось, так как в процессе хранения соединения выпадают в осадок.

Применение в синтезе большого избытка калиевой или натриевой солей аминокислот и больших избытков растворителей приводит к возникновению экологических проблем, связанных с утилизацией отходов производства, а также к удорожанию процесса производства. Использование щелочных металлов для увеличения скорости реакции является технологически невозможным при использовании хлорированных ароматических растворителей.

Однако представленные в патенте уникальные биохимические свойства препаратов на основе соединений фуллерена с аминокислотными фрагментами ставят задачу получения новых производных фуллерена, разработки высокотехнологичного способа их промышленного получения, отличающегося простотой и эффективностью процесса, чистотой, экологичностью и доступностью исходных реагентов.

Раскрытие изобретения

Для решения данной задачи предлагается группа изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом, а именно гомо- и гетерополиаминокислотные производные фуллерена, способ получения производных фуллерена и фармацевтические композиции, включающие гомо- и гетерополиаминокислотные производные фуллерена в качестве действующего вещества. Варьируя соотношение реагентов и условия проведения процесса, по заявляемому способу можно получать различные производные фуллерена.

Указанная задача решается гомо- и гетерополиаминокислотными производными фуллерена общей формулы (II)

- 2 020801 ε₆ο(Η)_χ{ΝΗ(ΟΗ₂)„εθΟ-}_χ{ΝΗ₃ ⁺(Ε)ΟΟΟΗ}_Χί (Π) где η = 2-5, χ = 3, Ь = -(СН₂)_т, где ш = 1-5, либо -СО(СН₂)_кСН(ЛН₂)-, где к = 1-2.

В случае, когда т=п, получают гомополиаминокислотные производные фуллерена, при июп - гетерополиаминокислотные производные фуллерена.

Указанная задача решается способом получения гомо- и гетерополиаминокислотных производных фуллерена, образующихся при взаимодействии фуллерена с 10-кратным мольным избытком безводных калиевых солей аминокислот в среде органического ароматического растворителя при добавлении к полученной суспензии межфазного катализатора при перемешивании и нагревании до температуры не выше 60°С до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка, который затем выделяют, растворяют в воде, после чего осуществляют обработку водных растворов калиевых солей фуллеренполиаминокислот 1н. раствором органических или минеральных кислот с последующим добавлением растворов аминокислот в полярных растворителях. В способе используют свежеприготовленные безводные калиевые соли аминокислот в мелкодисперсном состоянии, а выделение твердого осадка калиевых солей фуллеренполиаминокислот осуществляют фильтрованием, промывкой этиловым спиртом и высушиванием. В процессе экспериментов было выявлено, что фуллеренполиаминокислоты указанного состава могут быть получены только при использовании свежеприготовленных безводных калиевых солей аминокислот. В качестве межфазного катализатора используют метиловые эфиры полиэтиленоксидов молекулярной массы 200, 400, 500.

Указанная задача решается также созданием фармацевтических композиций, содержащих в качестве активного вещества гомо- и гетерополиаминокислотные производные фуллерена формулы (II), обладающих активностью против вируса герпеса, вируса гепатита С, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью. Фармацевтические композиции могут быть выполнены в форме таблеток, капсул, мазей, эмульсий, суппозиториев, растворов, спреев.

Фармацевтические композиции по предложенному техническому решению содержат соединение общей формулы (II) в количестве, эффективном для достижения желаемого результата, и могут быть введены в виде стандартных лекарственных форм (например, в твердой, полутвердой или жидкой формах), содержащих соединения предложенного технического решения в качестве активного ингредиента в смеси с носителем или наполнителем, пригодным для внутримышечного, внутривенного, перорального, сублингвального, ингаляционного, местного, назального, ректального и вагинального введения. Активный ингредиент может быть включен в композицию вместе с обычно используемыми нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, драже, суппозиториев, эмульсий, суспензий, мазей, гелей и любых других лекарственных форм.

Конкретный уровень дозировок и частота приема лекарства для каждого конкретного пациента будет зависеть от большого числа факторов, включая активность конкретного производного фуллерена, метаболическую стабильность и длительность действия, скорость выделения, возраст пациента, вес тела, общее состояние здоровья, пол, лекарственные комбинации, а также тяжесть заболевания у индивида, подвергаемого лечению.

Для орального применения в виде суспензий композиции готовят согласно методам, широко известным в области приготовления фармацевтических рецептур, и они могут содержать микрокристаллическую целлюлозу или ее производные для обеспечения массы, альгиновую кислоту или альгинат натрия в качестве суспендирующего агента, метилцеллюлозу в качестве усилителя вязкости и подслащивающие агенты и/или отдушки, известные в этой области. В форме таблеток такие композиции могут содержать микрокристаллическую целлюлозу, кальций фосфат, крахмал, стеарат магния и лактозу и/или другие эксципиенты, связующие вещества, расширители, дезинтеграторы, разбавители и смазывающие вещества, известные в данной области.

При применении в виде назальных аэрозолей или путем ингаляции такие композиции готовят методами, хорошо известными в области фармацевтических рецептур, и они могут выпускаться в виде растворов на физиологическом растворе, с использованием бензойной кислоты или других подходящих консервантов, промоторов адсорбции для усиления биоприменимости, и/или других солюбилизирующих или диспергирующих агентов, известных в данной области.

Растворы или суспензии для инъекций могут формироваться согласно известным методам с использованием нетоксичных, парентерально применимых разбавителей или растворителей, таких как маннит, 1,3-бутандиол, вода, раствор Рингера или изотонический раствор хлористого натрия или подходящих диспергирующих или смачивающих и суспендирующих агентов, таких как стерильные, мягкие, устойчивые масла, включая синтетические моно- или диглицериды, или жирные кислоты, включая олеиновую кислоту.

- 3 020801

При ректальном или вагинальном применении в виде свечей такие композиции могут готовиться путем смешивания лекарства с таким нераздражающим эксципиентом, как масло какао, синтетические глицеридные сложные эфиры или полиэтиленгликоли, которые являются твердыми веществами при обычных температурах, но сжижаются и/или растворяются в полости тела с выделением лекарства.

При местном применении в виде мазей, гелей, кремов, линиментов и т.д. такие композиции могут готовиться путем смешивания активных ингредиентов с приемлемой мазевой основой.

В качестве мазевой основы могут быть использованы жировые, углеводородные или гидрофильные основы, например вазелин, вазелиновое масло, парафин, воск, ланолин, полиэтиленгликоль и др.

В качестве основы для гелей могут быть использованы метилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, оксипропилцеллюлоза, полиэтиленгликоль или полиэтиленоксид, карбопол, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт и т.д.

Технический результат изобретения состоит в том, что получены новые гомо- и гетерополиаминокислотные производные фуллерена формулы С₆₀(Н)_Х{ЫН(СН₂)_ПСОО^-}Х{ПНЗ⁺(Ь)СООН}Х, где п=2-5, х=3, Ь=-(СН₂)_т, где т=1-5, либо -СО(СН₂)_кСН(ИН₂)-, где к=1-2, характеризующиеся тем, что соединения содержат ковалентно-связанные аминокислотные группы и полярные ионные формы аминокислот, разработан новый промышленный способ получения аминокислотных производных фуллерена С₆₀ с различным соотношением компонентов с использованием реакции нуклеофильного присоединения к фуллерену аминокислоты с образованием продуктов полиприсоединения. Предложены фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного вещества гомо- и гетерополиаминокислотные производные фуллерена формулы (II), обладающие активностью против вируса герпеса, вируса гепатита С, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью. Фармацевтические композиции выполнены в форме таблеток, капсул, мазей, суппозиториев, растворов, спреев.

Соединения обладают новыми свойствами:

растворимостью в смеси диметилсульфоксид-вода (1:100, 1:200);

высокой биодоступностью;

высокой эффективностью воздействия на инфицированные клетки; низкой токсичностью.

Заявляемый способ позволяет получить различные гомо- и гетерополиаминокислотные производные фуллерена в зависимости от соотношения реагентов и условий проведения процесса. Способ основан на использовании в стадии синтеза оптимальных соотношений исходных реагентов (1:10), минимальных количеств органического растворителя и межфазного катализатора, с последующем выделением заявляемых композиций с использованием концентрированных растворов органических и минеральных кислот, с последующим введением аминокислот ряда ИЩЬСООН, где Ь=-(СН₂)_т, либо -СО(СН₂)_кСН(ИН₂), что приводит к количественному получению фуллеренаминокислотных композиций определенного состава и возможности применения заявляемого способа для их промышленного синтеза, отличающегося эффективностью и экологичностью.

Заявляемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Варианты осуществления изобретения

Пример 1. Получение фуллеренполиаминокапроновой кислоты формулы С₆0(Нз){ПН(СН2)5СОО^-}з{ПНз⁺(СН2)5СООН}з.

К раствору 7,2 г (0,01 моль) фуллерена С₆₀ в 400 мл о-дихлорбензола добавляют 17 г (0,1 моль) свежеполученной тонко измельченной безводной калийной соли ε-аминокапроновой кислоты. К полученной суспензии при перемешивании и нагревании не выше 80°С прибавляют в течение 2 ч смесь одихлобензола и метилового эфира полиэтиленгликоля 400 в соотношении 2,5:1. Реакционную смесь перемешивают при температуре не выше 60°С в течение 2-З ч до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка. Затем смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают несколькими порциями этилового спирта и высушивают в вакууме при температуре не выше 60°С. Выделенную калиевую соль фуллеренаминокислоты растворяют в 2 л дистиллированной воды. В раствор медленно при перемешивании добавляют 1н. раствор соляной кислоты до рН 5,1. Смесь отстаивают до полного высаживания продукта. Затем водный слой декантируют. К осадку, представляющему собой тонкую взвесь твердого продукта в воде, медленно при перемешивании добавляют раствор аминокапроновой кислоты в смеси диметилсульфоксида с водой (1:10). Смесь перемешивают до полного растворения. Затем растворители удаляют отгонкой в вакууме. Твердый остаток высушивают при температуре не выше 60°С в вакуумном сушильном шкафу.

Выход целевого продукта количественный по отношению к исходному фуллерену. Соединение представляет собой темно-коричневое твердое вещество, растворимое в смеси диметилсульфоксид:вода 1:200, ограниченно растворимое в смесях СН_ЗСЫ:Н₂О - 1:1 и ДМФА-Н₂О.

Термогравиметрический анализ продукта показывает наличие в комплексе з моль слабосвязанной аминокапроновой кислоты, отщепляющейся с разложением при температуре 200°С. Термическое разложение фуллеренполиаминокислоты проходит при температуре з45°С с выделением фуллерена и продук- 4 020801 тов его окисления. Количество твердого остатка после разложения соединения, представляющего собой по данным дифракционного анализа незамещенный фуллерен, соответствует соотношению С₆₀: аминокислотный фрагмент как 1:6.

Кислотный гидролиз соединения 0,1-молярным раствором НС1 приводит к выделению гидрохлорида аминокапроновой кислоты в количестве 3 моль на 1 моль исходного вещества.

Адсорбция соединения на поверхности силикагеля приводит к расщеплению ионных связей и выделению свободной аминокапроновой кислоты. Последующим фотометрическим анализом продуктов реакции аминокапроновой кислоты с нингидрином определено количество ионно-связанных аминокислотных групп. Их количество соответствует составу заявляемых соединений.

Электронный спектр поглощения продукта не содержит полос поглощения свободного фуллерена.

ИК-спектр продукта содержит полосы поглощения, характерные для Ν-замещенных аминокислот: группа -СООН- 1704, 1658 см^-1; группы ΝΗ3+- 3100, 2550, 2000 см^-1; -Ν-Н-валентные колебания 3300 см^-1; Ν-Н-деформационные 1552 см^-1; полосы поглощения С60-ИН-К- 1104, 930, 830 см^-1.

Элементный анализ продукта показывает следующие соотношения элементов: %С=76,84; %Н=4,80; %Ν=5,15, для брутто-формулы 4₆Η₇₅Ν₆Θ₁₂ (молекулярная масса 1503) рассчитано: %С=76,49; %Н=4,90; %Ν=5,57.

Пример 2. Получение Ν-фуллерен-у-аминомасляной кислоты с β-аланином формулы С60(Н3){ПН(СН2)эСОО^-}3^Н3⁺СН2-СН2-СООН)3.

К раствору 7,2 г (0,01 моль) фуллерена С₆₀ в 400 мл о-дихлорбензола добавляют 14 г (0,1 моль) свежеполученной безводной калиевой соли γ-аминомасляной кислоты. К полученной суспензии при перемешивании и нагревании не выше 60°С прибавляют в течение 2 ч смесь о-дихлобензола и метилового эфира полиэтиленгликоля 400 в соотношении 3:1. Реакционную смесь перемешивают при температуре не выше 60°С в течение 2-3 ч до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка. Затем смесь фильтруют, осадок на фильтре промывают несколькими порциями этилового спирта и высушивают в вакууме при температуре не выше 60°С. Выделенный продукт растворяют в дистиллированной воде. В раствор медленно при перемешивании добавляют 1н. раствор соляной кислоты до рН 5,1. Смесь отстаивают до полного высаживания продукта. Затем водный слой декантируют. К осадку, представляющему собой тонкую взвесь твердого продукта в воде, медленно при перемешивании добавляют спиртовой раствор 2,7 г (0,03 моль) β-аланина. Смесь перемешивают в течение 2 ч до полного растворения осадка. После удаления растворителя выделено 12 г продукта.

Соединение представляет собой темно-коричневое твердое вещество, растворимое в смеси диметилсульфоксид:вода - 1:200, ограниченно растворимое в смесях СН₃С№Н₂О - 1:1 и ДМФА-Н₂О.

Термогравиметрический анализ продукта показывает наличие в комплексе 3 моль слабосвязанного β-аланина, отщепляющегося при температуре 210°С. Термическое разложение всего комплекса проходит при температуре 335°С с выделением фуллерена в количестве, соответствующем соотношению С60:аминокислотные фрагменты как 1:6.

Кислотный гидролиз полученного соединения 0,01-молярным раствором НС1 приводит к образованию гидрохлорида β-аланина в количестве 3 моль на 1 моль исходного вещества.

Спектры продукта в растворах в диметилсульфоксиде и в 0,1н. водном растворе №ОН содержат полосы поглощения в области 217, 260, 335 нм, характерные для производных фуллерена и не содержат полос поглощения свободного фуллерена.

ИК-спектр соединения содержит полосы поглощения, характерные для Ν-замещенных аминокислот и катионных форм аминокислот: группы -СООН^- 1717, 1710, 1658 см^-1; группы ИН3⁺ 3100, 2550, 2000 см^-1; Ν-Н-валентные колебания 3400 см^-1; Ν-Н-валентные колебания - 3400 см^-1; Ν-Ндеформационные - 1552 см^-1; полосы поглощения С60-ЛН-К- 1104, 930, 830 см^-1.

Элементный анализ продукта показывает следующие соотношения элементов: %С=75,24; %Н=3,80; %Ν=6,25, для брутто-формулы С^Н^Ю^ (молекулярная масса 1296) рассчитано: %С=75,00, %Н=3,70, %Ν=6,48.

Пример 3. Получение Ν-фуллерен-е-аминокапроновой кислоты с глутамином формулы С60(Н3){ИН(СН2)5СОО^-}3{ИН3⁺(СО)(СН2)2СН(ИН2)СООН}3.

Процесс проводят так же, как в примере 1. Только на стадии обработки осадка после осаждения кислой формы фуллеренаминокапроновой кислоты добавляют раствор 4,5 г глутамина в смеси диметилсульфоксид-вода. Растворители удаляют отгонкой в вакууме.

Элементный анализ твердого продукта показывает следующие соотношения элементов: %С=71,34; %Н=4,80; %Ν=8,25, для брутто-формулы С₉₃Н₆₂Н₉О1₅ (молекулярная масса 1551) рассчитано: %С=71,95, %Н=4,50, %Ν=8,12.

ИК-спектр соединения содержит полосы поглощения, характерные для Ν-замещенных аминокислот и катионных форм аминокислот: группы -СООН- 1714, 1707 см^-1; -С=О(ИН-С60) 1658 см^-1; группы ИН3⁺3000, 2550, 2000 см^-1; Ν-Н-валентные колебания 3400 см^-1; Ν-Н-деформационные 1552 см^-1; полосы поглощения С₆₀-ИН-К- 1104, 930, 830 см^-1.

Кислотный гидролиз соединения приводит к выделению глутамин гидрохлорида в количестве 3

- 5 020801 моль на 1 моль исходного вещества.

Была изучена противовирусная активность соединений в отношении ВИЧ, ВПГ, вируса гриппа, а также противоопухолевая активность. В приведенных ниже примерах препарат, полученный способом, описанным в примере 1, назван по тексту препарат 1 (фуллеренполиаминокапроновая кислота).

Пример 4. Исследование активности препарата фуллеренполиаминокапроновой кислоты в отношении вируса иммунодефицита человека.

Исследования проводились в лаборатории вирусов иммунодефицита с испытательным Центром по экспертной оценке противовирусных и дезинфекционных средств (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН).

К клеткам добавляли исследуемый препарат и инфицировали вирусом в дозе 0,01 ТЦИД₅₀/клетка. Инкубировали культуры клеток при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ и 98% влажности 4-5 дней. Учет результатов проводили окрашиванием клеток с помощью красителя и световой микроскопии: исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПД) и вирусиндуцируемого синцитийобразования (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран).

Степень цитодеструкции оценивали под микроскопом по общепринятой четырехкрестовой системе знаками + или - соответственно количеству погибших клеток в каждой из четырех лунок, соответствующих одному исследуемому показателю.

++++ - 100%-я гибель клеток в четырех лунках, использованных в опыте на одно разведение;

+++ - 75%-я гибель клеток в каждой из четырех лунок;

++ - 50%-я гибель клеток в каждой из четырех лунок;

+ - 25%-я гибель клеток в каждой из четырех лунок;

+- - начало дегенерации;

- -отсутствие цитодеструкции.

Результаты исследования представлены в табл. 1, 2.

Полученные данные (табл. 1, 2) показали, что исследованные препараты фуллеренполиаминокапроновой кислоты обладали противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека типа 1. ЭК₅₀ (50%-эффективная концентрация) препарата 0,9 мкг/мл. Препарат в концентрациях 0,510 мкг/мл не обладал цитотоксическим действием на клетки.

Пример 5. Исследование противогерпетической активности препарата фуллеренполиаминокапроновой кислоты в экспериментах ίη νίίτο. Исследование выполнялось ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва.

В процессе исследования были изучены цитотоксическая и противогерпетическая активность препарата в клеточных культурах Уего.

В исследовании были использованы перевиваемая культура клеток почки обезьян (Уето), полученная из коллекции культур тканей Института вирусологии им. И.Д. Ивановского РАМН; вирус герпеса простого (Негрек 81шр1ех νίπΐδ). тип 1, штамм Л₂, размноженный в клетках Уего. Клетки инфицировали вирусом в дозе 100 ТЦИД₅₀/0,2 мл и 1000 ТЦИД₅₀/0,2 мл.

Для исследования представлен образец субстанции в виде порошка темного цвета.

Препарат первоначально растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) в соотношении 1:20, а затем готовили рабочие концентрации на среде ИГЛА МЕМ. Оценку активности испытанных образцов проводили по степени защиты клеток от вирусиндуцированного цитотоксического действия ВПГ микроскопическим методом и методом МТТ по оптической плотности.

Результаты исследования.

Исследована токсичность веществ в использованных концентрациях, а также растворителя (1,5 мл ДМСО в 50 мл воды).

Препарат в конечных концентрациях от 50 до 1000 мкг/мл добавляли к монослою клеточной культуры Уего и инкубировали в атмосфере 5,0% СО₂ при 37°С в течение 24-48 ч. Монослой клеток окрашивали 0,4% раствором трипанового синего и исследовали под микроскопом.

Образец в концентрации до 100 мкг/мл не оказывал токсического действия на культуру клеток Уего, при концентрации 200 мкг/мл появляются признаки токсического действия - отмечается гибель 25% клеток. Концентрации в 500 мкг/мл и более уже токсичны для Уего клеток (табл. 3).

Исследование защитных свойств образца проводили при одной схеме введения - за час до инфицирования, и при двух дозах вируса - 100 ТЦИД50 и 1000 ТЦИД50.

Результаты представлены в табл. 3-7.

Проведенные исследования показали, что введение за 60 мин образца препарата до инфицирования клеточной культуры вирусом герпеса простого в дозе 100 ТЦИД₅₀ полностью защищает клетки от цитодеструктивного действия вируса при всех испытанных концентрациях - от 5,0 мкг/мл и выше (см. табл. 4 и 5).

При увеличении инфицирующей дозы вируса герпеса до 1000 ТЦИД50/0,2 мл (см. табл. 6 и 7) образец препарата обеспечивает полную защиту чувствительной культуры клеток от цитодеструктивного

- 6 020801 действия вируса при данной схеме испытания (инфицирование клеток вирусом через 60 мин после внесения препарата в культуральную среду).

Пример 6. Изучение активности фуллеренполиаминокапроновой кислоты (препарат 1) в отношении вируса гриппа А/11У-Мо8СОу/01/2009 (Η1Ν1)8^1.

Исследования проводились в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва. В задачу исследований входило изучение противовирусной активности этих препаратов в культуре клеток МОСК в отношении вируса гриппа А/11У-Мо8соу/01/2009 (Η1Ν1)δΜ.

Препарат разводили в ДМСО (5 мг субстанции + 0,5 мл ДМСО) с последующим добавлением 4,5 мл среды для культур клеток МЕМ, получая, таким образом, сток в концентрации 1,0 мг/мл. В последующем проводили разведения стоков средой МЕМ до рабочих концентраций 6,5 мкг/мл - 12,5-25,050,0-100 мкг/мл.

Определение противовирусной активности веществ проводили по снижению репродукции вируса гриппа в культуре клеток МЭСК, выявляемой ИФА.

С этой целью клетки МДСК выращивали в 96-луночных планшетах до полного монослоя, отмывали от ростовой среды и вносили вещества в двукратной концентрации в 100 мкл среды МЕМ. Инфицирование вирусом в рабочей дозе 100-1000 ТЦИД₅₀ проводили в двух режимах: через 2 ч после внесения веществ и одномоментно. Планшеты инкубировали в термостате с СО₂ в течение 24 ч при 37°С. После инкубации среду удаляли и клетки фиксировали 80% ацетоном в РВ§ в течение 15 мин, хорошо высушивали и осуществляли постановку ИФА, проводя последовательно адсорбцию специфических реагентов моноклональных антител, конъюгата и субстрата (ортофенилендиамин). Реакцию учитывали по оптической плотности при 492 нМ на спектрофотометре фирмы Биоком. Каждое разведения вируса исследовали в 3 повторах, для которых вычисляли среднее значение оптической плотности (ОП). Процент ингибирования определяли, как отношение между разницей ОП опыта и ОП клеточного контроля, разделенное на разницу ОП вирусного контроля и ОП клеточного контроля, умноженное на 100%. На основании полученных данных определены значения минимальной концентрации вещества, вызывающей 50,0% ингибирование вирусной репродукции (МИК₅₀).

Оценку подавления репродукции вируса гриппа Α(Η1Ν1) проводили в 3 опытах при разной множественности заражения. Результаты представлены в табл. 8 (протоколы 3 опытов) и табл. 9 (средние значения полученных результатов 3 опытов).

Как видно из табл. 9, четко прослеживается зависимость степени репродукции и концентрации препарата: с повышением концентрации - снижается репродукция вируса. Кроме того, значительных отличий в показателях при разных режимах инфицирования (через 2 ч после внесения препарата или одномоментно) не отмечено.

Таким образом, полученные результаты изучения активности разных разведений препарата в отношении вируса гриппа А/11У-Мо8соу/01/2009 (Η1Ν1)δ^1 выявили высокую активность подавления его репродукции в культуре клеток МЭСК. При этом режимы внесения препаратов за 2 ч до инфицирования или одновременно с инфицированием не влияли на их активность в культуре клеток МЭСК.

Пример 7. Изучение противовирусной активности фуллеренполиаминокапроновой кислоты (препарат 1) на модели гриппозной пневмонии мышей.

Исследования выполнялись в центре химии лекарственных средств (ЦХЛС-ВНИХФИ), г. Москва.

В работе использовали препарат в виде темно-коричневого кристаллического порошка. Для перорального применения готовили необходимые дозы препарата, растворяя навески в 1% растворе крахмала, сваренного на воде. Для внутрибришинного и внутримышечного применения навески препарата растворяли в 1,5% растворе ДМСО.

В работе был использован вирус гриппа А/Аичи/2/69 (Η3Ν2), адаптированный к мышам. Данный вирус широко используется для определения эффективности противовирусных препаратов на модели гриппозной пневмонии мышей и был получен из музея вирусных штаммов и клеточных культур ГУ НИИ вирусологии РАМН. Для подготовки инфицирующего материала мышей заражали интраназально аллантоисным вирусом, после проявления признаков болезни их забивали и в стерильных условиях получали гомогенат легочной ткани. Далее этот гомогенат использовали для заражения 10-дневных куриных эмбрионов, из которых получали аллантоисный вирус и после титрования на его мышах использовали для инфицирования животных.

Белых беспородных мышей (самки) массой 12-14 г получали из питомника Андреевка (Московская обл.) и содержали на стандартном рационе в регламентированных условиях вивария.

Предварительно взвешенные мыши (самки нелинейные, средний вес 12-14 г) инфицировались интраназально под легким эфирным наркозом вирусом гриппа А/Аичи/2/69 (Η3Ν2) (10ЛД5₀ в 100 мкл). В предварительном опыте было проведено определение ЛД50 путем титрования аллантоисного вируса на таких же мышах, которые затем использовались в основном опыте. Была использована следующая схема лечения исследуемым препаратом: за 24 ч до инфицирования, за 1 ч до инфицирования, через 24 ч и далее 1 раз в день через 24 ч в течение 5 дней. Для перорального введения использовали одноразовый инсулиновый шприц со специальной иглой (лаваж), каждую дозу вводили в объеме 100 мкл. Для внутрибрюшинного и внутримышечного лечения также каждую дозу вводили в объеме 100 мкл. Группа вирус- 7 020801 ного контроля представляла собой 10 мышей, инфицированных вирусом, но не леченных препаратами. Также в опыте было две группы по 10 неинфицированных мышей, которым вводили внутрибрюшинно и внутримышечно по 100 мкл 1,5% ДМСО, который использовался в качестве растворителя препаратов. В остальных группах также изначально было по 10 животных. За леченными и контрольными животными велось ежедневное наблюдение, в первые 5 дней после инфицирования мыши взвешивались каждый день, далее - через день. Химиотерапевтическую активность препарата на модели гриппозной пневмонии мышей оценивали по трем критериям: показатель защиты от смертельной вирусной инфекции, увеличение средней продолжительности жизни и уменьшение снижение веса в группах животных, леченных препаратом по сравнению с контрольной группой.

Лечение фуллеренаминокапроновой кислотой было эффективно, уменьшая смертность мышей от гриппозной пневмонии и потерю их веса, и увеличивая среднюю продолжительность жизни по сравнению с вирусным контролем. Эффективность данного лечения зависела от дозы препарата и способа лечения. Результаты представлены в табл. 10, 11.

Наиболее эффективным по всем трем параметрам (показатель защиты от смертности, средняя продолжительность жизни и потеря веса) было лечение фуллеренполиаминокапроновой кислотой внутримышечно, которое в дозах 100 и 200 мг/кг/день предотвращало гибель 60-70% зараженных животных и потерю их веса, а также увеличивало продолжительность их жизни почти в 2 раза. Внутрибрюшинное лечение фуллеренполиаминокапроновой кислотой было эффективно только в дозах 50 и 100 мг/кг/день. Гибель животных, значительное снижение средней продолжительности жизни и веса мышей при внутрибрюшинном лечении их фуллеренполиаминокапроновой кислотой в дозе 200 мг/кг/день дают основание полагать, что данная доза при этом способе введения является токсичной для инфицированных мышей.

Пример 8. Изучение противоопухолевого действия фуллеренполиаминокапроновой кислоты (препарат 1) при перевиваемых опухолях лейкоза Ь1210, аденокарциномы молочной железы Са-755 и карциномы Льюиса.

Исследования выполнялись в Институте токсикологии, г. Санкт-Петербург, 2006 г. в соответствии с Методическими указаниями по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, Минздрав РФ, Ремедиум. М., 2000, с. 319-325).

Штаммы опухолевых клеток лейкемии Ь1210, аденокарциномы молочной железы Са-755, а также штамм опухолевых клеток карциномы Льюиса (3ЬЬ) получены из НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова МЗ РФ (г. Санкт-Петербург).

В исследовании использованы следующие тест-системы.

Мыши линии ΌΒΑ/2 с перевитыми клетками лейкемии Ь1210. Возраст мышей 6-8 недель, масса 1925 г.

Мыши самцы линии С 57 ВЬ/6_) с перевитыми клетками Са-755. Возраст мышей 6-8 недель, масса 19-25 г.

Мыши самцы линии С 57 ВЬ/6_) с перевитыми клетками 3ЬЬ. Возраст мышей 6-8 недель, масса 1824 г.

Оценка противоопухолевого действия проводилась на основании: оценки накопления асцита по регистрации прибавки веса животных; оценки продолжительности жизни животных;

оценки опухолевого роста.

Проводили измерение большего размера опухоли (длина) и перпендикулярного ему меньшего размера (ширина). Рассчитывали объем опухоли и торможение опухолевого роста рассчитывали по формуле. Оценочным критерием являлся день достижения каждой индивидуальной опухолью объема 500 мм³.

Результаты влияния препарата на развитие лейкемии Ь1210 представлены в табл. 12.

В табл. 13 приведены средняя продолжительность жизни животных с перевиваемыми опухолями лейкемии Ь1210 и контрольной группы, а также данные увеличения продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой в %.

Как видно из табл. 13, средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками лейкемии Ь1210 составила 6,0±0,21 дней. Введение препарата достоверно увеличило продолжительность жизни мышей до 10,7±0,37 дней и 10,60±0,37 дней, процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 78,33% и 76,67% для доз препарата 100 мг/кг и 200 мг/кг соответственно, однако различия между опытными группами оказались статистически недостоверными.

В процессе эксперимента проводилось ежедневное взвешивание животных с целью оценки накопления асцита и изучения сравниваемых препаратов на данный процесс.

Результаты оценки прибавки веса представлены в табл. 14.

Как видно из табл. 14, препарат достоверно уменьшал накопление асцита у мышей с перевитыми опухолями лейкемии Ь1210. Прибавка веса тела у мышей, получавших исследуемый препарат, была дос- 8 020801 товерно меньше, чем в контрольной группе, причем у животных, получавших исследуемый препарат в дозе 250 мг/кг, средняя прибавка веса была достоверно ниже (в 1,5 раза) по сравнению с таковым показателем у животных, получавших препарат в дозе 100 мг/кг.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что препарат проявляет выраженное противоопухолевое действие и тормозит рост опухолевых клеток лейкемии Ь1210 у мышей, что проявилось в достоверном увеличении продолжительности жизни (78,33% и 76,67%) для доз 100 и 250 мг/кг и достоверном торможении накопления асцита экспериментальных животных (78-43%). Признаков интоксикации на фоне введения исследуемого препарата не зарегистрировано. Анализ полученных данных выявил достоверные различия между дозой препарата 100 мг/кг и дозой 250 мг/кг - увеличение дозы препарата приводит к достоверному уменьшению накопления асцита у экспериментальных животных.

По другим показателям контраст (отличие средних для групп, получавших разные дозы исследуемого препарата) был на уровне ошибок, вызванных естественным разбросом данных.

Результаты влияния препарата на развитие аденокарциномы молочной железы Са-755 представлены в табл. 15.

В табл. 16 приведена средняя продолжительность жизни животных с перевиваемыми опухолями аденокарциномы молочной железы Са-755 и контрольной группы, а также данные увеличения продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой в %.

Как видно из табл. 16, средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками опухолями аденокарциномы молочной железы Са-755 составила 37,9±0,74 дней. Введение препарата достоверно увеличило продолжительность жизни мышей до 71,9±2,58 дней и 73,4±0,92 дней, процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 89,71 и 93,67% для доз препарата 100 и 200 мг/кг соответственно, однако различия между опытными группами оказались статистически недостоверными.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что препарат проявляет выраженное противоопухолевое действие и тормозит рост опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы Са-755 у мышей, что проявилось в достоверном увеличении продолжительности жизни (89,71 и 93,67%) для доз 100 и 250 мг/кг. Признаков интоксикации на фоне введения исследуемого препарата не зарегистрировано.

Проведена оценка влияния препарата на средние величины объема опухолей карциномы Льюиса в различные дни после перевивки. В контрольной группе опухоли развились у 21 из 26 мышей (80,8%), первые опухоли были зарегистрированы на 7 день после перевивки и регистрировались до 40 дня. Первые опухоли в группе с воздействием препарата в дозе 100 мг/кг были зарегистрированы на 7 день после перевивки и регистрировались до 60 дня; в группе с воздействием препарата в дозе 250 мг/кг были зарегистрированы на 8 день после перевивки и регистрировались до 60 дня. Препарат оказывал выраженный противоопухолевый эффект на развитие карциномы легких Льюиса; процент торможения в группе препарата - 100 мг/кг по сравнению с контрольной группой на 10-17 дни достоверно составлял 71,77% и 58,5%, в группе препарата - 250 мг/кг по сравнению с контрольной группой на 10-17 дни - 84,37% и 54,2% соответственно.

В табл. 17 представлено влияние препарата на рост карциномы Льюиса, анализировались сроки достижения опухолью размера 500 мм³; в контрольной группе данный показатель колебался от 12 до 20 дней, а в экспериментальных группах - от 17 до 28 дней. Как видно из данной таблицы, препарат достоверно увеличивал этот показатель на 22-27% по сравнению с контролем.

Гибель мышей контрольной группы наступала в результате прогрессирования опухолевого роста основного очага, а также вследствие обширного метастатического поражения легких. Индивидуальная продолжительность жизни мышей в контрольной группе колебалась от 28 до 39 дней, в группах с препаратом от 51 до 60 дней. В табл. 18 представлено влияние препарата на среднюю продолжительность жизни мышей после перевивки опухоли. Как видно из табл. 18, препарат достоверно увеличивал среднюю продолжительность жизни примерно на 70% по сравнению с контрольной группой, разница между опытными группами статистически недостоверна.

Индивидуальные вес легких и количество метастазов в легких у мышей контрольной группы и опытных групп с воздействием сравниваемых препаратов представлены в табл. 19.

Как видно из табл. 19, препарат достоверно уменьшал вес легких и количество метастазов в легких в 1,5-2 раза. Разница между опытными группами статистически недостоверна.

- 9 020801

Таблица 1

Исследование цитотоксичности препарата на модели лимфобластоидных клеток человека

Условия опыта, концентрация, мкг/мл	Жизнеспособность клеток, %	Количество клеток х10³/мл
Контроль клеток	98	800
Препарат № 1	0,5	95	833
1,0	94	833
5,0	98	799
10,0	94	767
100	95	600

Таблица 2

Исследование противовирусной активности препарата на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1

Условия опыта	Концентрация, мкг/мл	Жизнеспо- собность клеток, %	Кол-во клеток х 10³/мл	ЦПЭ/син цитии (+)
Контроль клеток	0	98	800	0
Контроль вируса	0	20	66	4,0
Препарат № 1	0,5	18	33	4,0
1,0	26	495	4,0
5,0	98	633	0
10	98	600	0

Таблица 3

Изучение цитотоксического действия образца фуллеренполиаминокапроновой кислоты на культуру клеток Уего

Концентрация вещества, мкг\мл	Цитотоксическое действие на клетки,⁰/»
50	0,0
100	0,0
200	25,0
500	100,0
1000	100,0

Примечание: ДМСО в концентрации, применяемой для растворения, не оказывает цитотоксического действия на клетки.

Таблица 4

Противогерпетическая активность образца фуллеренполиаминокапроновой кислоты в культуре клеток Уего при инфицирующей дозе вируса герпеса -100 ТЦИД₅₀/0,2 мл

Концентрация вещества, мкг\мл	Защита клеток от цитопатического действия вируса герпеса, %
5,0	81,25 ± 12,5
10,0	100 ± 0,0
50,0	100 ±0,0
100,0	100 ±0,0

Примечание: клетки инфицировали через час после введения образцов.

- 10 020801

Таблица 5

Защитное действие препарата от цитодеструктивного действия вируса герпеса, тип 1 при инфицирующей дозе вируса 100 ТЦИД₅₀

Концентрация препарата, мкг/мл	Препарат № 1
Оптическая плотность	Отличия от контроля достоверны при р
0	0,403 ± 0,02
5,0	1,110± 0,08	<0,01
10,0	1,015 ±0,07	<0,01
50,0	1,153 ±0,06	<0,01
100,0	1,79 ±0,05	<0,01
Контроль клеток	1,133 ±0,07	<0,01

Таблица 6

Противогерпетическая активность образца фуллеренполиаминокапроновой кислоты в культуре клеток Уего при инфицирующей дозе вируса герпеса -1000 ТЦИД₅₀/0,2 мл

Концентрация вещества, мкг/мл	Защита клеток от цитопатического действия вируса герпеса, %
5,0	100 ±0,0
10,0	100 ±0,0
50,0	100 ±0,0
100,0	100 ±0,0

Таблица 7

Защитное действие препарата от цитопатического действия вируса герпеса, тип 1 при инфицирующей дозе вируса 1000 ТЦИД₅₀

Концентрация	Оптическая плот-	Отличия от контроля
препарата, мкг\мл	ность	достоверны при Р
0	0,796 ± 0,06
5,0	1,027 ±0,04	<0,01
10,0	1,021 ±0,04	<0,01
50,0	1,033 ±0,03	<0,01
100,0	1,083 ±0,01	<0,01
Контроль клеток	1,133 ±0,07

- 11 020801

Результаты изучения активности препарата 1 в отношении вируса гриппа Л/ПУ-Моксо^/О1/2009 (Η1Ν1)5\υ1

Таблица 8

Концентрац ИИ препаратов (мкг/мл)	Внесение препарата	Снижение (%) репродукции вируса гриппа в культуре клеток МЦСК по отношению к контролю в присутствии серий препарата № 1
6,25	за 2 часа до инфицирования	27,0 - 28,0 - 0
одномоментно с инфицированием	18,0-0-0
12,5	за 2 часа до инфицирования	47,0 - 74,0 - 9,5
одномоментно с инфицированием	39,0-13,0-0
25,0	за 2 часа до инфицирования	41,0-79,0-12
одномоментно с инфицированием	40,0 - 0
50,0	за 2 часа до инфицирования	28,0-72,0-31,0
одномоментно с инфицированием	33,0 -10,0
100,0	за 2 часа до инфицирования	4,0 - 0 - 20,0
одномоментно с инфицированием	29,0 - 28,0

Различия в показателях 2 опытов зависели от множественности заражения вирусом культуры клеток МИСК.

- 12 020801

Таблица 10

Эффективность фуллеренполиаминокапроновой кислоты на модели гриппозной инфекции у мышей

Доза препарата	иэ70*	Ы790**
Показатель защиты от смертности (%)	Средняя продолжительность жизни (дни)**	Показатель защиты от смертности (%)	Средняя продолжительность жизни (дни)**
Фуллеренполиаминокапроновая кислота перорально
100 мг/кг/день	40	13,1 (1-8 д,, 1-10 д,, 1-11д)	30	10,8 (2-7д.,1-9д,2-10д,1-11д.)
200 мг/кг/день	70	>16	60	13,4 (1-10д„ 2-11д.)
300 мг/кг/день	40	12,8(1-8д.,2-9д.)	не изучали	не изучали
Фуллеренполиаминокапроновая кислота внутримышечно
50 мг/кг/день	50	13,3(1-7д,1-8д.)	40	11,4 (2-7д.1-8д., 2-11д.,)
100 мг/кг/день	70	>16	60	13,0 (1-8д. 1-9д.,1-11д.,)
200 мг/кг/день	50	13,8(1-7д.,1-13д.)	60	13,1 (1-7д„ 2-11д.)
1,5% раствор ΏΜ3Ο		>16		>16
Фуллеренполиаминокапроновая кислота внутрибрюшинно
50 мг/кг/день	50	13,4 (2-8д.)	40	11,5 (2-7д.Д-9д.,2-11д.)
100 мг/кг/день	60	13,7 (1-Зд.)	30	10ДЗ-7д.,2-8д.,1-9д.)
200 мг/кг/день	0	3,1(3-1д,1-2д,2-3д,1-5д,1-8д.)	не изучали	не изучали
1,5% раствор ΌΜ5Ο		>16		>16
Вирусный контроль (ЮЬОзо)		10,1(4-8д.,2-10д.,1-11д.)		7,3 (5-7д.,4-8д.)

Примечание. * В опытах смертность в группе вирусного контроля составляла 70%, т.е. из 10 мышей погибали 7. ** В опытах смертность в группе вирусного контроля составляла 90%, т.е. из 10 мышей погибали 9. * Схема лечения: за 24 и 1 ч до заражения, далее через 24, 48, 72 и 96 ч после заражения.

Изменение веса животных, зараженных вирусом гриппа А/А и ч и/2/69 (доза ЬО70) и леченных препаратами

Таблица 11

Доза препарата	Изменение веса в % по дням после инфицирования
1 день	2 день	3 день	4 день	5 день	7 день	9 день	11 день	13 день
Фуллеренполиаминокапроновая кислота перорально
100 мг/кг/день	+19	+23	+25	+22	+16	+ 17	+24	+43	+51
200 мг/кг/день	+26	+31	+36	+36	+36	+38	+47	+51	+57
300 мг/кг/день	+24	+27	+28	+24	+19	+23	+35	+36	+38
Фуллеренполиаминокапроновая кислота внутримышечно
50 мг/кг/день	+20	+22	+22	+17	+11	+9	+11	+19	+26
100 мг/кг/день	+21	+25	+27	+23	+20	+21,5	+32	+35,5	+38
200 мг/кг/день	+25	+27	+28	+24	+20	+23	+22	+25	+36,5
Фуллеренполиаминокапроновая кислота внутрибрюшинно
50 мг/кг/день	+21	+27	+29	+21	+16	+15	+31	+36	+40
100 мг/кг/день	+19	+23	+22	+18	+15	+18	+25	+33	+41
200 мг/кг/день	+7	+6	+5	-4	-3	-7	+4	+6	+15
Вирусный контроль	+19	+24	+31	+9	+0,9	-И	+4	+27	+37

Таблица 12

Влияние препарата на продолжительность жизни мышей с перевиваемой опухолью лейкемии Ь1210

Название группы	№ животного и его продолжительность жизни в днях
1	2	3	4	5	6	7	8	9	1 0
Контроль	6	7	7	6	6	5	6	6	5	6
Препарат № 1		1	1	1	1	1	1	1	1	1
100 мг/кг		1	3	1	2	0	1	0	0	0
Препарат № 1	1	!	1		1	1	1	1	1	1
250 мг/кг	0	0	0		0	1	3	0	1	2

- 13 020801

Таблица 13

Влияние препарата на среднюю продолжительность жизни животных с перевиваемой опухолью лейкемии Б1210

Название группы	СПЖ в днях, М+т	УПЖ, %
Контроль	6,0±0,21
Препарат № 1,100 мг/кг	10,7±0,37*	78,33
Препарат № 1, 250 мг/кг	10,60±0,37*	76,67

Примечание: * - достоверные отличия от контроля (при р < 0,05).

Таблица 14

Влияние препарата на развитие асцита у мышей с перевиваемой опухолью лейкемии Б1210

Ден ь	Контрольная группа	Препарат 100 мг/кг	Препарат 250 мг/кг
Средняя прибавка веса, М+т	Средняя прибавка веса, М±т	% торможения по сравнению с контролем	Средняя прибавка веса, М±т	% торможения по сравнению с контролем
1	0,4±0,2	0,3±0,2		0,3±0,1
2	0,9±0,3	0,8±0,4		0,5+0,3
3	5,0±0,8	2,5±0,5	50,0%*	1,1 ±0,4	78,0%*
4	И,4±1,1	4,2+1,0	63,2%*	2,8+0,9	75,4%*
5	16,3 ±2,0	8,4+1,2	48,5%*	4,7+1,2	71,2%*
6	21,2+2,1	12,1±2,1	42,9%*	8,4+1,6	60,4%*
7	26,3±1,7	14,2±2,2	46,0%*	10,0+1,3	62,0%*

Примечание: * достоверные отличия от контроля (при р < 0,05).

Таблица 15

Влияние препарата на продолжительность жизни мышей с перевиваемой опухолью лейкемии СА-755

Название группы	N животного и его продолжительность жизни в днях
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Контроль	36	39	41	34	35	40	39	38	40	37
Препарат № 1, 100 мг/кг	79	81	73	82	80	66	63	60	67	68
Препарат № 1, 250 мг/кг	77	72	70	78	76	71	73	70	72	75

с перевиваемой опухолью аденокарциномы молочной железы Са-755

Таблица 16

Влияние препарата на среднюю продолжительность жизни животных

Название группы	СПЖ в днях, М+т	УПЖ, %
Контроль	37,9±0,74
Препарат № 1,100 мг/кг	71,9±2,58*	89,71
Препарат № 1,250 мг/кг	73,40±0,92*	93,67

- 14 020801

Таблица 17

Влияние препарата на размеры карциномы Льюиса (достижение У=500 мм³)

	День достижения опухолью объема 500 мм³
Группа	М ± ш	% увеличения, статистическая значимость
Контроль	16,7 ±0,65
Препарат № 1,100 мг/кг	21,3 ±1,21	27,3 % *
Препарат № 1, 250 мг/кг	20,5± 1,20	22,9 %*

Таблица 18

Влияние препарата на продолжительность жизни мышей после перевивки карциномы Льюиса

	Продолжительность жизни
Группа	М±ш	% увеличения, статистическая значимость
Контроль	32,81 ± 0,86
Препарат 100 мг/кг	55,92 ± 0,98	70,42%*
Препарат 250 мг/кг	5б,38±0,68	71,85%*

Таблица 19

Влияние препарата на метастазирование карциномы Льюиса у мышей

Группа № (число животных)	Вес легких, мг М ± ш	Количество метастазов в легких, М ± т	Количество крупных (> 3 мм) метастазов в легких, М ±ш
Контроль (п = 21)	1486,7 ±64,08	70,5 ± 5,50	13,4 ±2,05
Препарат № 1, 100 мг/кг (и = 12)	491,9 ±63,72*	53,5 ± 11,23*	5,8 ± 1,91*
Препарат № 1, 250 мг/кг (п-13)	505,4 ± 68,82*	55,8 ± 11,60*	5,7 ±1,54*

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Гомо- и гетерополиаминокислотные производные фуллерена общей формулы 0₆ο(Η)_χ{ΝΗ(ΟΗ₂)_ηΟΟΟ^-}χ{ΝΗ3⁺(Ε)ΟΟΟΗ}χ, где п=2-5, х=3, Ь=-(СН₂)_т, где т=1-5, либо -СО(СН₂)_кСН(ИН₂)-, где к=1-2, характеризующиеся тем, что соединения содержат ковалентно-связанные аминокислотные группы и полярные ионные формы аминокислот.
2. Производные фуллерена по п.1, характеризующиеся тем, что в качестве аминокислотных групп используют фрагменты аминокислот алифатического ряда общей формулы ΝΗ(ίΉ₂)_ηίΌΟΗ. где п=2-5.
3. Производные фуллерена по п.1, характеризующиеся тем, что в качестве полярных ионных форм аминокислот используют фрагменты амидов дикарбоновых аминокислот общей формулы ΝΗ2(ΟΟ)^Η2)^Η(ΝΗ2)αΟΟΗ, где к=1-2.
4. Способ получения производных фуллерена по п.1 взаимодействием фуллерена с 10-кратным мольным избытком безводных калиевых солей аминокислот общей формулы ΝΗ₂(ΟΗ₂)^ΟΟΚ, где п=25, в среде органического ароматического растворителя при добавлении к полученной суспензии межфазного катализатора при перемешивании и нагревании до температуры не выше 60-80°С до полного обесцвечивания раствора и формирования твердого осадка, который затем выделяют, после чего осуществляют обработку водных растворов калиевых солей фуллеренполиаминокислот 1н. раствором органических или минеральных кислот с последующим введением раствора аминокислоты общей формулы ΝΗ₂(Ε^ΟΟΗ, где Ь=-(СН₂)_т, где т=1-5, либо +Ο(ΟΗ₂)]£Η(ΝΗ₂)-, где к=1-2, в полярных растворителях,

- 15 020801 перемешиванием, удалением растворителей, промывкой и высушиванием осадка.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что используют свежеприготовленные безводные калиевые соли аминокислот в мелкодисперсном состоянии, а выделение твердого осадка калиевых солей фуллеренполиаминокислот осуществляют фильтрованием, промывкой этиловым спиртом и высушиванием.
6. Способ по любому из пп.4, 5, отличающийся тем, что в качестве межфазного катализатора используют метиловые эфиры полиэтиленоксидов молекулярной массы 200, 400, 500.
7. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью против вируса герпеса, вируса гепатита С, вирусов гриппа различной природы, ВИЧ, а также противоопухолевой и противопсориатической активностью, содержащая в качестве активного вещества производное фуллерена по п.1 в эффективном количестве.