WO2012062044A1 - 动点马达蛋白cenp-e小分子抑制剂syntelin及其应用 - Google Patents

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compound
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cenp
protein
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姚雪彪
丁霞
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Yao Xuebiao
Ding Xia
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Definitions

  • the invention relates to a moving point motor protein CENP-E small molecule inhibitor Syntel in and its application.
  • the moving point is a multi-component protein complex structure located on the centromere. It not only directly maintains the connection between the spindle filament and the chromosome, but also regulates the temporal and spatial sequence and fidelity of chromosome movement and chromosome separation.
  • This signal pathway is called "Spindle Checkpoint”. Loss of spindle checkpoints can lead to aneuploidy and chromosomal instability during cell replication and may be involved in tumor development and progression.
  • the molecular mechanism of the protein action network of the spindle checkpoint signaling pathway and its signaling flow remains unclear.
  • Centromere - Associated Protein E is a 312 kDa kinetic point protein containing a motor domain similar to the kinesin at the N-terminus and a coi led-coi l structure containing 1069 amino acid residues. The domain has a total length of 2701 amino acids.
  • CENP-E is a motor protein directly responsible for the connection of spindles to spindle microtubules. It coordinates with other spindle checkpoint proteins to monitor the process of cell mitosis, but the details of CENP-E monitoring cell mitosis are still unknown. . Deletion of CENP-E inactivates the spindle checkpoint, causing errors in chromosome movement and separation resulting in a chromosomal instability phenotype. To this end, a detailed study of the structural-related correlation of the spindle checkpoint regulatory protein CENP-E is a very interesting research work.
  • the compound is a compound of the formula I or formula I I,
  • R 2 are each selected from any of the following groups: C1-C6 alkyl, alkenyl, aryl, cycloalkyl and cycloalkenyl ;
  • X is 0, NR 4 , S or CHR 5 ;
  • Y is 0, NR 4 , S or CHR 6 ;
  • R 4 , R 5 and R 6 are each selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group and an alkyl ester group; and Z is selected from any one of the following groups: H
  • the formula I and formula II, and R 2 are both methyl or phenyl; the phenyl group or The X is 0, NH, NCH 2 CH 2 CH 3 or S;
  • the Y is 0 or S; and the Z is -C00H.
  • the compound of the formula I formula is a compound of the formula ⁇ -formula VI and formula XI,
  • the compound represented by the formula of the formula is a compound of the formula VII-formula X and formula XII,
  • Another object of the present invention is to provide a process for preparing the compound, which comprises the steps of: refluxing a compound of the formula XIII, an intermediate compound and a base in an organic solvent to obtain the compound;
  • each are selected from any one of the following groups: a C1-C6 alkyl group, an alkylene group, an aryl group, a cycloalkyl group and a cycloalkenyl group.
  • the sum is a methyl group or a phenyl group; and the intermediate compound is selected from any one of the compounds represented by the formula XIV-formula XVII:
  • the organic solvent is tetrahydrofuran.
  • the ratio of the compound represented by the formula ⁇ , the intermediate compound, the base and the organic solvent is 1 mmol: 1. Immol: 2 mmol: 10 ml 0
  • the method for preparing the compound further comprises the steps of: after the reaction is completed, the reaction system is cooled, dissolved in chloroform, washed successively with water and saturated brine, dried, and then isopropyl A mixture of an alcohol and dichloromethane was recrystallized to obtain the compound.
  • the invention also provides a process for the preparation of a compound of formula I or formula II wherein X is NCH 2 CH 2 CH 3 , comprising the steps of:
  • the method of the compound of the formula I or the formula II of NCH 2 CH 2 CH 3 further comprises the following steps: after the reaction is completed, the reaction system is cooled, dissolved in chloroform, washed successively with water and saturated brine, and dried. Recrystallization from a mixture of isopropanol and methylene chloride affords the compound of formula I or formula II as X.
  • the compounds provided by the present invention are useful in the preparation of products that inhibit tumor cell proliferation.
  • the tumor cells may be epithelial cancer cells, such as breast cancer cells.
  • the compounds provided herein can also be used to prepare agents that inhibit cell mitosis.
  • the inhibition of cell mitosis is achieved by interfering with motor protein-mediated functional protein trafficking and/or localization.
  • the motor protein is an amino acid sequence such as the protein shown in SEQ ID NO:1 in the Sequence Listing.
  • the motor protein-mediated functional protein is a protein phosphatase.
  • the compounds provided by the present invention are also useful in the preparation of agents that inhibit motor protein driven microtubule slip.
  • the compounds provided by the present invention are also useful in the preparation of motor protein activity inhibitors.
  • the motor protein is an amino acid sequence such as the protein shown in SEQ ID NO:1 in the Sequence Listing.
  • Figure 1 is a nuclear magnetic resonance carbon spectrum (A) and a nitrogen spectrum (B) of the target compound obtained in Example 1.
  • Figure 2 shows the therapeutic effect of Syntel in on experimental breast cancer. Among them, A is the result before administration after modeling; B is the result of the 10th day of administration, and B is from left to right in order of DMS0 control group, paclitaxel treatment group and syntel in treatment group.
  • Figure 3 shows the changes in luciferase fluorescence activity before and after Syntel in treatment.
  • Figure 4 shows the inhibitory effect of Syntel in on CENP-E motor protein walking.
  • the first row is the control ( DMS0) group and the second row is the Syntel in group.
  • Figure 5 shows the phenotypic analysis of mitosis by Syntel in.
  • A is the mitotic phenotype of the DMS0 control group (left) and the Syntelin group (right);
  • B is the phenotype of CENP-E by RNA silencing, the Scramble group on the left and the CENP-E SiRNA group on the right;
  • C is a statistical analysis scheme for the loss of CENP-E function;
  • D is the spatial distribution of chromosomes under various treatment modes (the abscissa is the distribution of poles, and the ordinate is the percentage of centromeres).
  • Figure 6 shows the effect of Syntel in on the chromosomal connections of spindle microtubules.
  • A is the DMS0 group
  • B syntel in
  • C is the result of electron microscopy of syntel in cells
  • D is the observation of high magnification
  • E is a schematic diagram of the mechanism of action of Syntel in.
  • Figure 7 shows the effect of Syntel in on the dynamic process of cell mitosis.
  • A is a flow chart of living cells used to study the effects of syntel in on cell mitosis;
  • B is a real-time observation of Hesa cells treated with DMS0 from the middle to the middle, and the green color in the figure is EGFP-H2B for indicating chromosomes.
  • Position, red is mCherry-tubul in, used to characterize the structure of the spindle;
  • C is the observation of the Synel in-treated Hela cells within 2 hours after the start of the first half.
  • D is a flow chart of living cells used to study the reversibility of syntel in drug treatment
  • E is a diagram showing the unaligned chromosomes after washing synel in from the cells and then gradually reaching The arrangement of the equatorial plate
  • F is a schematic diagram of the mechanism of the effect of syntel in on chromosome movement.
  • Figure 8 shows the effect of Synte l in on the localization of protein phosphatase ⁇ ⁇ .
  • Figure 8A shows the results of the DMS0 group and the syntel in treatment group;
  • Figure 8B shows the results of the scramble s i RNA group and the CENP-E s iRNA group.
  • Figure 1 shows the nuclear magnetic resonance spectrum of a pure VD compound (named Syntelin), A is a carbon spectrum, B It is the nitrogen spectrum. As can be seen from the figure, the compound has the correct structure and is a compound of the formula VI I.
  • the compound 5a is prepared according to the following steps:
  • the compound 5b is prepared according to the following steps:
  • the synthesis procedure refers to the preparation method of the la compound in Example 1.
  • mice after successful modeling ie, tumors reaching 100 mm 3 after 3-4 weeks after tumor inoculation were divided into 3 groups: syntel in treatment group, paclitaxel treatment group and control group.
  • each mouse in the syntel in treatment group was intravenously injected with syntel in DMS0 solution (30 mg syntel in/kg body weight, once every three days), and each mouse in the paclitaxel-treated group was intravenously injected with paclitaxel DMS0 solution. (30 mg paclitaxel/kg body weight), each mouse in the control group was intravenously injected with an equal volume of DMS0.
  • the therapeutic effect of the drug on the tumor is determined by a bioluminescence imager every other day.
  • the success of the above injections can be detected by the bioluminescence detector IVIS Imaging System.
  • Results of the treatment procedure The results on the 10th day of administration are shown in Fig. 2B. Syntel in and paclitaxel can inhibit the growth of breast cancer MDA-MB231 cells.
  • the fluorescence activity of the luciferase after the above three groups of treatments was determined as shown in Fig. 3.
  • the fluorescence activity was significantly lower than that of the control after the administration of Syntelin and paclitaxel.
  • Example 12 Syntel in inhibits mitosis by inhibiting CENP-E motor protein activity. 1. Effect of Syntel in on microtubule walking in vitro
  • CENP-E motor protein utilizes the energy generated by hydrolysis of ATP to drive microtubule motion
  • the experimentally intuitive study of CENP-E motor activity is a microtubule mobility experiment [Wood et al., 1997].
  • a small molecule compound that directly inhibits CENP-E will inhibit the mobility of microtubules without interfering with the binding of motor proteins to microtubules.
  • the in vitro microtubule walking experiment was performed in a space of a sample chamber formed between a slide glass and a cover glass bonded together by a pair of double-sided tapes.
  • the motor portion of the CENP-E protein containing this tag was first coupled to the slide in the sample chamber with an antibody recognizing the eXhistidine tag (Monoclonal Anti-poly-histidine antibody produced in mouse clone HIS-1, Sigma, H-1029). surface. Then add negative-labeled paclitaxel-stabilized, rhodamine-labeled microtubules, ATP, and DMS0 (as a negative control) or syntelin.
  • Syntelin group Effect of 200 nM syntelin on microtubule motion. The microtube labeled 1 slides forward by 0.1 micron in 90 seconds.
  • Cover glass treatment The coverslips were immersed in cold 0.5 M hydrochloric acid for 12 hours, then washed with deionized water, the residual hydrochloric acid was removed, and finally stored in ethanol. The slides were removed from the ethanol during use, rinsed with deionized water, and allowed to air dry.
  • Assembly of the sample chamber Bond one slide and one cover slip together with two double-sided tapes. The distance between the two tapes determines the volume of the sample chamber formed.
  • the volume of the sample chamber is preferably between 10 ⁇ and 20 ⁇ .
  • the antibody recognizing the 6Xhistidine tag was diluted 10-fold with pre-cooled BRB80 solution (80 mM PIPES [pH 6.8], 1 mM EGTA, 1 mM MgCl 2 ), then 10 ⁇ M antibody dilution was added to the sample chamber and incubated at room temperature. 1 minute.
  • ⁇ blocking solution (0.25mg/ml casein protein solution) to one side of the sample chamber. Slowly tilt the sample chamber until the liquid flows out from the opening on the other side, and blot the effluent with filter paper. Repeat the sample four times. Incubate for 5 minutes at room temperature.
  • step 6 Add the motor protein solution (ie containing the fusion protein 5 g/ml and the solvent to DMS0) in the same way as in step 5 for a total of 50 ⁇ l. Incubate for 5 minutes at room temperature.
  • motor protein solution ie containing the fusion protein 5 g/ml and the solvent to DMS0
  • DMS0 negative control 50 ⁇ l of a solution containing 10 ⁇ of paclitaxel and 1 mM ATP prepared with pre-warmed BRB80 solution was added.
  • Syntel in group 50 ⁇ l of a solution containing 10 ⁇ paclitaxel, 1 mM hydrazine, and 200 nM syntel in was added in a pre-warmed BRB80 solution.
  • a solution containing 10 ⁇ of paclitaxel, 1 mM ATP, and 3 ⁇ g/ml rhodamine-labeled microtubes prepared with pre-warmed BRB80 solution.
  • the preparation method of the fusion protein i.e., CENP-E motor protein driving domain (1-473 position of sequence 1)
  • the preparation method of the fusion protein is as follows:
  • the constructed recombinant expression vector pET21a-CENP-E-N473_GFP was transferred into E. col i Rosetta (DE3) pLys strain for protein expression, and protein purification was carried out using M-NTA resin (Qiagen).
  • the protein on the resin was eluted with a solution containing 250 mM imidazole and dialyzed into 50 mM MOPS (pH 7.0), 250 mM KC1, 0.5 mM EGTA, 2 mM MgCl 2 , 10% glycerol.
  • the specific steps for protein expression purification are as follows:
  • the plasmid pET21a-CENP-E-N473_GFP was transformed into ⁇ col i Rosetta (DE3) pLys competent cells, and the cells were coated on LB plates containing 100 u g / ml ampicillin and 34 ug / ml chloramphenicol. On, culture at 37 °C until monoclonal colonies appear.
  • the first group is the DMS0 control group; the second group is the syntel in group; the third group is Scramble.
  • Group, the negative control s iRNA group, the sequence of the transfected s iRNA is 5 '
  • Group 4 is the s iRNA group against CENP-E, and the sequence of the transfected s iRNA is 5 ' - AAACACUUACUGCUCUCCAGUUU-3 '.
  • HeLa cells (Invitrogen) were treated with 1 ⁇ syntel in DMS0 solution [synte l in group] or an equal volume of DMSO [DMS0 control group] for 1 hour, fixed in 4% formaldehyde, punctured and blocked. Chemical.
  • DMS0 solution synte l in group
  • DMSO DMSO
  • Opt i-MEM (Invitrogen Inc.) contains 50 nM s iRNA against CENP-E and 2 ⁇ 1
  • the liposome of Lipof ectamine 2000 (Invitrogen Inc.) was transfected into HeLa cells grown on coverslips for 4 hours and then changed. In group 3, only s iRNA against CENP-E was replaced with negative control siRNA compared with group 4, and the rest of the treatment methods were the same. After 36 hours of transfection, after fixation with 4% formaldehyde, perforation and blocking, immunohistochemistry was performed on microtubules and moving-point marker protein ACA according to the following literature: Yao, X., Anderson, KL, and Cleveland, DW (1997) .
  • CENP-E microtubule-dependent motor centromere-associated protein E
  • FIG. 5 The microtubules of the mitotic cells in Fig. 5A and Fig. 5B are marked green, the moving point is red, and the chromosome is blue.
  • the ruler represents the actual length of 5 ⁇ .
  • FIG. 5 ⁇ The left panel shows the staining localization phenotype of the above three structures in a normal cell (DMS0 control group). On the right is a phenotype of the pre-intermediate cells treated with 1 ⁇ syntel in, and the arrows mark the wrongly arranged chromosomes.
  • Figure 5B shows the phenotype of CENP-E by RNA silencing.
  • the Scramble group on the left is the phenotype of mitotic cells transfected with the negative control SiRNA.
  • the CENP-E siRNA group on the right is the localization phenotype of three structures in the cell after transfection of siRNA against CENP-E.
  • the arrows mark the wrongly arranged chromosomes.
  • Figure 5C is a statistical analysis of CENP-E loss of function. The normalized processing method for the distance measurement method and data standard of the moving point on the chromosome along the nearest pole of the two poles is shown.
  • Fig. 5D shows the spatial distribution of chromosomes in various cell treatment modes obtained by the measurement and processing method of Fig. 5C. It is indicated that two methods for interference with CENP-E function (adding syntel in or s iRNA transfection) will obviously cause abnormal spatial distribution of chromosomes in cells relative to the two negative control cases, indicating that s ynt e 1 in can Like the CE RNA of CENP-E, it interferes with the motor function of CENP-E.
  • the specific step is to place the HeLa cells in a 4 degree refrigerator for 10 minutes and then fix them ( Yao, X., Anderson, KL, and Cleveland, DW ( 1997) .
  • the microtubule-dependent motor centromere-associated protein E (CENP-E) is an integral component of kinetochore corona fibers J Cel 1 Biol 139, 435-447 ), stained microtubules (green), moving points (red) and chromosomes (blue) and observed under deconvolution microscopy with DMS0 ( The normal control group, Figure 6A) or 1 ⁇ syntel in solution (syntel in DMSO, diluted to 1 ⁇ with DMEM medium) (syntel in treatment group, Figure 6B) was used to treat HeLa cells for 30 minutes. The enlarged portion of the four corners shows the connection of the moving point to the microtube. The results are shown in Fig. 5A and Fig.
  • 5B (the scale represents the actual length of 5 ⁇ ), as can be seen from the enlarged graph:
  • the cells in the normal control group are arranged neatly on the equatorial plate, and the moving point and the microtubules from both ends Uniform two-way connection.
  • the chromosomes of the cells in the syntel in treatment group were scattered in the vicinity of the centrosome with a one-way syntelic connection.
  • Figure 6C is a low magnification study of the structure of the entire cell. Except for most of the chromosomes arranged on the equatorial plate, some chromosomes located near the poles can be clearly observed in the electron microscope image.
  • Figure 6D corresponds to the observation of high magnification in the rectangular box of the left picture. The arrows indicate that the microtubules from the same centrosome (star symbol) are connected to the two moving points on one chromosome.
  • the ruler on the left side represents the actual length of 5 ⁇
  • the ruler on the right side represents the actual length of 1 ⁇ .
  • FIG. 7F A schematic diagram of the mechanism of influence of Syntel in on chromosome movement is shown in Fig. 7F.
  • FIG. 7A A flow chart of living cells for studying the effects of syntel in on mitosis is shown in Figure 7A. The specific procedure is to first synchronize HeLa cells in the middle and middle phase with 5 ⁇ monastrol, then wash three times with cell culture solution Opt i-MEM (Invitrogen) and add 1 ⁇ of syntel in solution (dissolve syntel in with DMS0, use Opt i- MEM medium diluted to 1 ⁇ or an equal volume of DMSO for live cell observation (Liu, J., Wang, Z., Jiang, K., Zhang, L., Zhao, L., Hua, S., Yan, F .
  • B is a real-time observation of DMSO-treated Hela cells from the middle to the middle of the period.
  • the green color in the figure is EGFP-H2B to indicate the position of the chromosome, and the red color is
  • mCherry-tubul in used to characterize the structure of the spindle; C is the result of syntel in treatment of Hela cells within 2 hours after the start of the first half, and the arrows indicate unaligned chromosomes. It is shown that inhibiting the motor activity of CENP-E hinders the aggregation of chromosomes into the equatorial plate.
  • FIG. 7D A flow chart of a live cell experiment that studies the reversibility of syntel in drug treatment is shown in Figure 7D.
  • the specific procedure is to treat HeLa cells with 5 ⁇ of monastrol and the above 1 ⁇ of syntel in solution for 60 minutes, then wash three times with the above cell culture medium and observe for living cells.
  • HeLa cells were treated with 1 ⁇ of Syntel in and the same volume of DMS0 for 60 minutes, fixed with 4% formaldehyde, After perforation and blocking, immunohistochemistry was performed using an antibody against phosphatase PP1 Y.
  • Ding et al., 2010 Ding X, Yan F, Yao P, Yang Z, Wan W, Wang X, Liu J, Gao X, Abrieu A, Zhu T, Zhang J, Dou Z, Yao X. (2010) .
  • Figure 8A shows the results of the DMS0 group and the syntel in processing group.
  • DMS0 control treatment
  • phosphatase PP1 Y green
  • CENP-E red
  • the ruler represents the actual length of 5 ⁇ ⁇ . But when syntel in treatment (1 ⁇ M for 30 min), the phosphatase ⁇ gamma (green) and CENP-E (red) signals gradually disappeared CENP-E (red).
  • the amplified portion of the four corners showed a decrease in the site of phosphatase PP1 Y and CENP-E, suggesting that inhibition of CENP-E motor activity inhibits the localization of phosphatase PP1 y at the site of action.
  • the scale represents the actual length of 5 ⁇ m.
  • Figure 8B Results of the scramble siRNA group and the CENP-E siRNA group. In the control siRNA (scramble siRNA) treatment group, phosphatase PPl Y (green) and CENP-E (red) co-localized to the site of action. The enlarged portion of the four corners shows the co-localization of the moving points.
  • the ruler represents the actual length of 5 ⁇ ⁇ .
  • Examples 2-10 The functions of the obtained target compound (treatment of tumor cell proliferation, inhibition of cell mitosis, inhibition of motor protein-driven microtubule slip) were not significantly different from those of the target compound prepared in Example 1.
  • Syntel in as shown by the compound of formula VI I can significantly inhibit the growth of human breast cancer cells. Further mechanistic experiments indicate that Syntel in (the compound of formula VI I) binds to CENP-E to inhibit the walking of the CENP-E motor on the microtubule, but does not affect its interaction with the microtubule, when the compound is added to the cell.
  • the medium can enter the cell to inhibit the function of CENP-E, resulting in partial chromosome alignment errors and long-term maintenance of the spindle checkpoint activity.
  • Syntel in linkage refers to spindle microtubules connecting the sister chromosomes of the same chromosome from the same pole. This phenotype is consistent with the phenotype exhibited by CENP-E silencing cells (Yao et al., 2000). Since the CENP-E function down-regulated the Syntel in chromosome phenotype, the CENP-E small molecule inhibitor was named Syntel in. The inhibitory effect of Syntel in on CENP-E can be eluted, and the eluted cells can successfully complete mitosis.
  • CENP-E regulates the silencing of the cell mitotic spindle checkpoint by regulating the localization of the protein phosphatase PP1Y, thereby allowing the cells to enter the late phase (Anaphase).
  • the CENP-E small molecule inhibitor Syntelin of the present invention will play an important role in cell biology research, and its regulation of tumor cell proliferation can lay a foundation for the development of novel chemotherapy drugs.

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Abstract

本发明公开了一种动点马达蛋白CENP-E小分子抑制剂Syntelin及其应用。本发明提供的与CENP-E马达驱动域结合的有机小分子化合物，它与CENP-E结合后可抑制CENP-E马达在微管上的行走，但不影响其与微管的相互作用，当该化合物加入细胞培养基中能够进入细胞抑制CENP-E的功能，导致部分染色体排列错误并长时间维系纺锤体检验点的活性。

Description

动点马达蛋白 CENP-E小分子抑制剂 Syntelin及其应用 技术领域
本发明涉及动点马达蛋白 CENP-E小分子抑制剂 Syntel in及其应用。
背景技术
细胞精确地自我复制是生命活动的重要组成部分， 复制的高保守性在生物 及物种的繁衍生息过程中举足轻重。 在细胞复制的过程中， 包含在染色体中的 父代遗传信息在经历了诸多复杂的运动之后均等、 准确的分配给两个子细胞。 细胞周期事件是高度有序进行的， 保证细胞周期有条不紊地行进的生化调控通 路被称为 "检验点" （Checkpoint ) 。
动点是位于着丝粒上的多组分蛋白质复合结构。 它不仅直接维系纺锤体丝 与染色体的衔接， 同时亦调控染色体运动及染色体分离的时空序列性及保真性， 此信号通路被称为 "纺锤体检验点" （Spindle Checkpoint)。 纺锤体检验点失 控可导致细胞复制过程中非整倍体及染色体不稳定性的产生， 并可能参与肿瘤 的发生和发展。 但迄今为止， 纺锤体检验点信号通路的蛋白质作用网络及其信 息流传递的分子机制仍不明了。
动点马达蛋白 CENP-E ( Centromere - Associated Protein E) 是一个分子量为 312kDa的动点蛋白， 它含有一个位于 N端的驱动蛋白类似的马达域和包含 1069个 氨基酸残基的 coi led-coi l结构域， 总长为 2701个氨基酸。 CENP-E是一个直接负 责动点对纺锤体微管衔接的马达蛋白， 它与其它纺锤体检验点蛋白的协调作用， 监控细胞有丝分裂的进程， 但 CENP-E监控细胞有丝分裂的细节仍鲜为人知。 CENP-E的缺失使纺锤体检验点失活， 导致染色体运动及分离过程出现差错从而 产生染色体不稳定性表型。 为此， 详尽研究纺锤体检验点调控蛋白 CENP-E的结 构一功能相关性是一项非常有意义的研究工作。
发明公开
本发明的目的是提供一个调控染色体运动马达蛋白 CENP-E的抑制型有机化 合物。
该化合物为式 I或式 I I结构通式所示化合物，
Figure imgf000002_0001
(式 I )
Figure imgf000003_0001
(式 π)
所述式 I和式 II结构通式中， 和 R2均选自下述基团中的任意一种： C1-C6 的烷基、 烷烯基、 芳基、 环烷基和环烷烯基；
为芳基、 含有取代基的芳基、 五元杂环基或六元杂环基；
X为 0、 NR4、 S或 CHR5;
Y为 0、 NR4、 S或 CHR6;
所述 X和 Y中， 所述 R4、 R5、 R6均选自烷基、烷烯基和烷酯基中的任意一种; Z选自如下基团中的任意一种： H
Figure imgf000003_0002
所述式 I和式 II ， 和 R2均为甲基或苯基; 所述 为苯基或
Figure imgf000003_0003
所述 X为 0、 NH、 NCH2CH2CH3或 S;
所述 Y为 0或 S; 所述 Z为- C00H。
所述式 I结构通式所示化合物为式 ΠΙ-式 VI和式 XI所示化合物，
Figure imgf000003_0004
(式 III)
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000004_0002
Figure imgf000004_0003
(式 XI) ；
所述式 Π结构通式所示化合物为式 VII-式 X和式 XII所示化合物，
Figure imgf000005_0001
(式 VII)
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000005_0003
(式 IX)
Figure imgf000005_0004
(式 X)
Figure imgf000006_0001
(式 XII) 。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述化合物的方法， 包括如下步骤： 将式 XIII所示化合物、 中间体化合物和碱于有机溶剂中进行回流反应， 反 应完毕得到所述化合物；
Figure imgf000006_0002
(式 XIII)
所述式 XIII中， 和 均选自下述基团中的任意一种： C1-C6的烷基、 烧 烯基、 芳基、 环烷基和环烷烯基。
所述式 XIII 中， 和 为甲基或苯基； 所述中间体化合物选自式 XIV-式 XVII所示化合物中的任意一种：
Figure imgf000006_0003
(式 XV)
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0002
(式 XVII) ；
所述有机溶剂为四氢呋喃。
在上述方法中， 所述式 ΧΠΙ所示化合物、 中间体化合物、 所述碱和所述有 机溶剂的用量比为 Immol: 1. Immol: 2mmol: 10ml 0
在上述方法中， 所述制备所述化合物的方法， 还包括如下步骤： 在所述反 应完毕后， 将反应体系冷却后用氯仿溶解， 再依次用水和饱和食盐水洗涤， 干 燥后， 用异丙醇和二氯甲烷组成的混合液进行重结晶， 得到所述化合物。
本发明还提供一种制备 X为 NCH2CH2CH3的式 I或式 II所示化合物的方法， 包括如下步骤：
将 X为 NH的式 I或式 II所示化合物、 卤代丙烷和碱于有机溶剂中进行回 流反应， 反应完毕得到所述 X为 ¾(：¾(：¾的式 I或式 II所示化合物。
在制备 X为 NCH2CH2CH3的式 I或式 II所示化合物的方法中， 所述卤代丙烷 为溴丙烷； 所述有机溶剂为四氢呋喃； 所述碱为碳酸钾。
在制备 X为 ¾(¾(¾的式 I或式 II所示化合物的方法中， 所述 X为 NH 的式 I或式 II所示化合物、卤代丙烷、碱和有机溶剂的用量比为 Immol: 1. Immol: 2mmol： 10ml。
在制备 X为 ¾(¾(：¾的式 I或式 II所示化合物的方法中， 所述制备 X为
NCH2CH2CH3的式 I或式 II所示化合物的方法， 还包括如下步骤： 在所述反应完毕 后， 将反应体系冷却后用氯仿溶解， 再依次用水和饱和食盐水洗涤， 干燥后， 用异丙醇和二氯甲烷组成的混合液进行重结晶， 得到所述 X为 ¾(：¾(：¾的式 I 或式 II所示化合物。
本发明所提供的所述化合物可用于制备抑制肿瘤细胞增殖产品。
所述肿瘤细胞可为上皮癌细胞， 如乳腺癌细胞。 本发明所提供的所述化合物还可用于制备抑制细胞有丝分裂的试剂。 所述 抑制细胞有丝分裂是通过干扰马达蛋白介导的功能蛋白运输和 /或定位实现的。 所述马达蛋白是氨基酸序列如序列表中序列 1 所示的蛋白。 所述马达蛋白介导 的功能蛋白是蛋白磷酸酶。
本发明所提供的所述化合物还可用于制备抑制马达蛋白驱动的微管滑动的 试剂。
本发明所提供的所述化合物还可用于制备马达蛋白活性抑制剂。 所述马达 蛋白是氨基酸序列如序列表中序列 1所示的蛋白。
附图说明
图 1为实施例 1制备所得目标化合物的核磁共振碳谱 （A) 和氮谱 （B) 。 图 2为 Syntel in对实验性乳腺癌的治疗作用。 其中， A为造模后给药前的 结果； B为给药第 10天的结果， B图从左往右依次是 DMS0对照组、 紫杉醇治疗 组和 syntel in治疗组。
图 3为 Syntel in治疗前后荧光素酶的荧光活性变化。
图 4 为 Syntel in 对 CENP-E 马达蛋白行走的抑制作用。 其中， 第一排为 control ( DMS0) 组， 第二排为 Syntel in组。
图 5为 Syntel in对细胞有丝分裂的表型分析。其中， A为 DMS0对照组（左） 和 Syntel in组 （右） 的细胞有丝分裂表型； B为 CENP-E经 RNA沉默所体现的表 型， 左边是 Scramble组， 右边是 CENP-E SiRNA组； C为 CENP-E功能缺失的统 计分析方案； D为各种处理方式下染色体的空间分布情况（横坐标为极点的分布， 纵坐标为着丝粒的百分比） 。
图 6为 Syntel in对纺锤体微管对染色体连接的影响。 其中， A是 DMS0组；
B 是 syntel in; C是 syntel in细胞的电镜切片结果； D是高放大率的观察结果；
E是 Syntel in作用机制的示意图。
图 7 为 Syntel in 对细胞有丝分裂动态过程的影响。 其中， A 是用于研究 syntel in对细胞有丝分裂影响的活细胞实验流程图； B是 DMS0处理的 Hela细 胞由前中期到后期的实时观察结果， 图中的绿色为 EGFP-H2B用于指示染色体的 位置， 红色的为 mCherry-tubul in, 用于表征纺锤体的结构情况； C是 syntel in 处理的 Hela细胞由前中期开始后 2个小时内的观察结果。 箭头指示未排列好的 染色体； D是用于研究 syntel in药物处理的可逆性的活细胞实验流程图； E是 图示将 syntel in从细胞中洗去后未排列好的染色体随后逐渐实现了到达赤道板 的排列任务； F是 syntel in对染色体运动影响机制示意图。
图 8为 Synte l in对蛋白磷酸酶 ΡΡΙ γ的定位影响。 其中， 图 8A表示 DMS0 组和 syntel in处理组结果； 图 8B scramble s i RNA组和 CENP-E s iRNA组结果。 每组有 2幅图， 前一幅是 CENP-E (红色）和 PP1 γ (绿色） 的双色定位， 后一幅 是 CENP-E (红色）、 PP1 y (绿色） 及 DNA (蓝色）的三色定位。
实施发明的最佳方式 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明， 但本发明并不限于以下实施 下述实施例中， 如无特殊说明， 均为常规方法。
发明提供的式 I所示化合物可按照如下合成路径制备而得：
Figure imgf000009_0001
(式 I)
实施例 1、 目标化合物式 VII的合成：
Nal
Figure imgf000009_0002
(式 XV)
Figure imgf000009_0003
(式 VII)
三口烧瓶中加入 lmmol 5a、 1. lmmol中间体式 XV所示化合物 （其合成参 考文献 Monatshefte fuer Chemie, 127(5), 549-555， 1996) ， 10 ml THF中， 搅拌下加入 2隱 ol K2C03， 加热回流， TLC 监测至反应完全， 冷却， 抽滤， 减压 回收溶剂， 把所得残余物用氯仿溶解， 水洗， 饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干燥。 抽滤， 回收溶剂，残余物以异丙醇 /二氯甲烷重结晶得式 VII 目标化合物的纯品。
图 1为纯品式 VD化合物 （命名为 Syntelin) 的核磁检测谱图， A是碳谱， B 是氮谱。 由图可知， 该化合物结构正确， 为式 VI I所示化合物。
其中， 化合物 5a是按照如下步骤制备而得：
1 ) la
Figure imgf000010_0001
圆底烧瓶中加入 0. 5mol 环己酮、 1000ml 乙醇，搅拌下依次加入 0. 5mol 氰 乙酸乙酯、 0. 5mol硫粉、 0. 5mol 二乙胺， 室温搅拌 30min后， 加热至 50°C， TLC监测至反应结束， 冷却至室温， 反应混合物倾入 3000ml水中， 有大量固体 析出， 抽滤， 滤饼干燥得中间体 la， 直接用于下一步反应。
Figure imgf000010_0002
0. 4mol la、 1000ml 无水二氯甲烷置于圆底烧瓶中， 室温下剧烈搅拌， 0. 44mol 氯磺酰异氰酸酯的 200ml 无水二氯甲烷溶液氮气保护下缓慢滴入其 中， 滴加完毕， 室温搅拌至反应完全， 减压蒸干二氯甲烷， 得黄色固体 2a粗品。 往反应瓶中加入 2000ml 5% K0H 溶液， 搅拌加热至 90°C， TLC监测至反应结束， 冷却至室温， 抽滤， 滤饼干燥得中间体 3a。
3 ) 中间体 4
Figure imgf000010_0003
将上一步制得的 3a 0. 2mol ， 过量三氯氧磷 （500ml ) 和 DMF ( 40ml ) 加热 回流 5h。 将反应液减压浓縮得深棕色偏黑物质， 冰浴析出大量深棕色沉淀。 抽 滤得到黄色固体， 用三氯甲烷溶解。 再次抽滤除去不溶物， 滤液用 5%碳酸氢钠 溶液洗涤、 水洗， 合并有机层， 无水硫酸钠干燥后加入适量活性碳脱色， 浓縮。 柱层析 （石油醚 /乙酸乙酯 =5 : 1 ) 得到米色固体 4a。
4 ) 中间体 5
Figure imgf000010_0004
将上一步制得的 4a 0. lmol、 四氢呋喃 300ml 投入压力锅， 通入氨气， 温放置 8小时。 过滤的粗品， 以 95%乙醇重结晶， 得白色片状晶体 5a 实施例 2、 目标化合物式 III的合成:
Figure imgf000011_0001
(式 XIV) (式 III) 三口烧瓶中加入 1 ol 5b 1.1 ol 中间体式 XIV所示化合物 （其合成 参考文献 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 16 ( 17 ) 4444-4449, 2006) 10 ml THF中， 搅拌下加入 2 ol K2C03， 加热回流， TLC监 测至反应完全， 冷却， 抽滤， 减压回收溶剂， 把所得残余物用氯仿溶解， 水洗， 饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干燥。 抽滤， 回收溶剂， 残余物以异丙醇 /二氯甲烷 重结晶得式 111所示目标化合物的纯品。
其中， 化合物 5b是按照如下步骤制备而得：
1) 中间体 lb 的合成：
Figure imgf000011_0002
合成步骤参考实施例 1中 la化合物的制备方法 <
2) 中间体 2b 3b的合成：
Figure imgf000011_0003
合成步骤参考实施例 1中 2£1和 3a化合物的制备方法。
3) 中间体 4b的合成：
Figure imgf000011_0004
3b 4b
合成步骤参考实施例 1中 4a化合物的制备方法 <
4) 中间体 5b的合成：
Figure imgf000012_0001
4b
合成步骤参考实施例 1中 5a化合物的制备方法。
Figure imgf000012_0002
(式 XV) (式 VIII) 三口烧瓶中加入 lmmol 5a 1. lmmol 中间体式 XV所示化合物 （其合成参 考文献 Monatshefte fuer Chemie, 127(5), 549-555 1996) 10 ml THF中， 搅拌下加入 2 ol K2C03， 加热回流， TLC 监测至反应完全， 冷却， 抽滤， 减压 回收溶剂， 把所得残余物用氯仿溶解， 水洗， 饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干燥。 抽滤， 回收溶剂， 残余物以异丙醇 /二氯甲烷重结晶得目标化合物式 VIII 的纯
Figure imgf000012_0003
(式 XV) (式 IV)
三口烧瓶中加入 1 ol 5b 1.1 ol 中间体式 XV所示化合物 （其合成参 考文献 Monatshefte fuer Chemie, 127(5), 549-555 1996) 10 ml THF中， 搅拌下加入 2 ol K2C03， 加热回流， TLC 监测至反应完全， 冷却， 抽滤， 减压 回收溶剂， 把所得残余物用氯仿溶解， 水洗， 饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干燥。 抽滤， 回收溶剂， 残余物以异丙醇 /二氯甲烷重结晶得目标化合物式 IV的纯品。
Figure imgf000012_0004
(式 XVI) (式 IX) 三口烧瓶中加入 1 ol 5a 1.1 ol 中间体式 XVI 所示化合物 （其合成 参考文献 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 16 ( 17 ) 4444-4449, 2006) lO ml THF中， 搅拌下加入 2 ol K2C03， 加热回流， TLC监 测至反应完全， 冷却， 抽滤， 减压回收溶剂， 把所得残余物用氯仿溶解， 水洗， 饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干燥。 抽滤， 回收溶剂， 残余物以异丙醇 /二氯甲烷 重结晶得目标化合物式 IX的纯品。
Figure imgf000013_0001
(式 XVI) (式 V) 三口烧瓶中加入 1 ol 5b 1.1 ol 中间体式 XVI 所示化合物 （其合成 参考文献 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 16 ( 17 ) 4444-4449, 2006) lO ml THF中， 搅拌下加入 2 ol K2C03， 加热回流， TLC监 测至反应完全， 冷却， 抽滤， 减压回收溶剂， 把所得残余物用氯仿溶解， 水洗， 饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干燥。 抽滤， 回收溶剂， 残余物以异丙醇 /二氯甲烷 重结晶得目标化合物式 V的纯品。
Figure imgf000013_0002
(式 XVII) (式 XII)
三口烧瓶中加入 lmmol 5a 1. lmmol 中间体式 XVII所示化合物 （其合成 参考文献 Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska, Sectio AA: Physica et Chemia, 31-32 247-55; 1980) lO ml THF中， 搅拌下加入 2mmol K2C03， 加热回流， TLC监测至反应完全， 冷却， 抽滤， 减压回收溶剂， 把所得残 余物用氯仿溶解， 水洗， 饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干燥。 抽滤， 回收溶剂， 残余物以异丙醇 /二氯甲烷重结晶得目标化合物式 XII的纯品。
实施例 8、 目标化合物式 XI的合成：
Figure imgf000014_0001
(式 XVI I ) (式 XI ) 三口烧瓶中加入 1 ol 5b 1. 1 ol 中间体式 XVI I所示化合物 （其合成 参考文献 Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska, Sectio AA : Physica et Chemia, 31-32 247-55 ; 1980) 10 ml THF中， 搅拌下加入 2mmol K2C03， 加热回流， TLC监测至反应完全， 冷却， 抽滤， 减压回收溶剂， 把所得残 余物用氯仿溶解， 水洗， 饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干燥。 抽滤， 回收溶剂， 残余物以异丙醇 /二氯甲烷重结晶得目标化合物式 XI的纯品。
实施例 9、 目标化合物式 X的合成：
Figure imgf000014_0002
(式 XI ) (式 X)
三口烧瓶中加入 1 ol实施例 5制备所得式 XI所示化合物、 1. 1 ol溴丙 烷， 10 ml THF中， 搅拌下加入 2 ol K2C03， 加热回流， TLC监测至反应完全， 冷却， 抽滤， 减压回收溶剂， 把所得残余物用氯仿溶解， 水洗， 饱和食盐水洗， 无水硫酸钠干燥。 抽滤， 回收溶剂， 残余物以异丙醇 /二氯甲烷重结晶得目标化 合物式 X的纯品。
Figure imgf000014_0003
(式 V) (式 VI ) 三口烧瓶中加入 lmmol实施例 6制备所得式 V所示化合物、 1. lmmol溴丙烷， 10 ml THF中， 搅拌下加入 2 ol K2C03， 加热回流， TLC监测至反应完全， 冷却， 抽滤， 减压回收溶剂， 把所得残余物用氯仿溶解， 水洗， 饱和食盐水洗， 无水 硫酸钠干燥。 抽滤， 回收溶剂， 残余物以异丙醇 /二氯甲烷重结晶得目标化合物 式 VI的纯品。
下述实施例 11-12所用的 Syntel in均为实施例 1制备得到的式 VI I所示化合 物。
实施例 11、 Syntel in抑制乳腺癌细胞的生长
1、 实验步骤
造模： 免疫缺陷 N0D/SCID小鼠 （Jackson Laboratory ) 通过尾静脉注射稳 定表达荧光素酶的乳腺癌 MDA-MB231细胞 (将荧光素酶的编码基因导入人乳腺癌 细胞 MDA-MB-231得到的稳定表达荧光素酶的重组细胞，按照 Kang Y, Siegel PM, Shu W, Drobn jak M, Kakonen SM, Cordon-Cardo C, Gui se TA, Massague J. A mult igenic program mediat ing breast cancer metastas i s to bone. Cancer Cel l. 2003 Jun ; 3 (6) : 537-49文献的方法构建 (请提供 Joan Massague ' 博士的 描述该细胞构建方法的文献） ）造模。 每只小鼠静脉注射 2 X 105个稳定表达 LUC 的 MDA-MB231细胞。
治疗： 造模成功后 （即肿瘤接种后 3-4周后当肿瘤达到 100 mm3大小） 的 24 只小鼠， 均分为 3组， 分别为 syntel in治疗组、 紫杉醇治疗组和对照组。
syntel in和紫杉醇均分别用 DMS0 (二甲基亚砜） 溶解用于静脉注射。
syntel in治疗组的每只小鼠分别通过静脉注射 syntel in的 DMS0 溶液（30 mg syntel in/kg体重， 每三日注射一次）， 紫杉醇治疗组的每只小鼠分别通过静脉 注射紫杉醇的 DMS0溶液（30 mg紫杉醇 /kg体重）， 对照组的每只小鼠分别通过静 脉注射等体积的 DMS0。 药物对肿瘤的治疗效果通过每隔一日的生物发光成像仪 确定。
2、 实验结果
上述注射的成功可通过生物发光检测仪 IVIS Imaging System来检测。
造膜步骤结果： 稳定表达荧光素酶的乳腺癌 MDA-MB231注射 4周后造模成功（肿瘤 区域在生物发光成像仪中清晰可见； 见图 2A)。
治疗步骤结果： 给药第 10天的结果如图 2B所示， syntel in及紫杉醇均可抑 制乳腺癌 MDA-MB231细胞的生长。
经检测， 上述三组治疗后的荧光素酶的荧光活性如图 3所示， 经过 Syntel in 及紫杉醇给药后与对照相比， 荧光活性均显著降低。
实施例 12、 Syntel in通过抑制 CENP-E马达蛋白活性从而抑制有丝分裂进行 一、 Syntel in对体外微管行走的影响
(一） 、 实验原理
鉴于 CENP-E马达蛋白利用水解 ATP产生的能量驱动微管运动， 实验学上直观 研究 CENP-E马达活性的评估是微管移动实验 [Wood et al. , 1997]。 为此， 直接 抑制 CENP-E的小分子化合物将是抑制微管的移动能力而不干扰马达蛋白与微管 的结合力。
(二） 、 实验方法与步骤 体外微管行走实验是在一个由一对双面胶带粘合在一起的一片载玻片和盖 玻片之间所形成的样品室的空间中进行的。 首先用识别 eXhistidine标签的抗 体 (Monoclonal Anti-poly-histidine antibody produced in mouse clone HIS-l, Sigma公司， H-1029) 将含有此标签的 CENP-E蛋白的马达部分偶联在样品 室内的玻片表面。 然后加入负端高亮标记的紫杉醇稳定的、 罗丹明标记的微管、 ATP以及 DMS0 (作为阴性对照） 或者 syntelin药物。 最后在去卷积荧光显微镜下 实时观察和记录样品室内玻片表面微管的运动情况。 对照（control)和 syntelin 处理组中呈现的分别是在各自实验中对样品室内玻片表面特定区域每隔 30秒的 观察结果 （图 4) 。
图 4中的阿拉伯数字始终标记发生滑动的微管的正末端， 而白色实心箭头则 指示没有发生运动的微管。 标尺的长度代表实际长度 5微米。
图 4显示， DMS0阴性对照组 （Control) ： CENP-E驱动的微管滑动， 标记为 1的微管在 90秒钟滑动了 7.9微米； 标记为 2的微管在第 30秒的时候开始与一根一 直静止的微管分开， 并在接下来的 60秒内一直向前滑动， 观察到的所有发生滑 动的微管的平均运动速率为 5.3±1.7微米 /分钟 （n=49) 。 Syntelin组： 200 nM syntelin对微管运动的影响。 标记为 1的微管在 90秒内向前滑动了 0.1微米。
体外微管行走实验的具体步骤如下：
1、 盖玻片的处理： 将盖玻片放在冷的 0.5M盐酸浸泡 12个小时， 然后用去离 子水清洗， 去除掉残余的盐酸， 最后保存在乙醇中。 使用时将玻片从乙醇中取 出， 用去离子水冲洗干净， 在空气中晾干。
2、 载玻片的处理： 将载玻片浸泡在去离子水中， 然后超声去除表面杂质， 洗净在空气晾干。
3、样品室的组装：用两条双面胶带将一片载玻片和一片盖玻片粘合在一起。 两条胶带间的距离决定了所形成的样品室的体积， 一般样品室的体积以 10μ 1到 20 μ ΐ之间为宜。
4、 将识别 6Xhistidine标签的抗体用预冷的 BRB80溶液 (80 mM PIPES [pH 6.8], 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2) 稀释 10倍， 然后向样品室中加入 10 μΐ抗体稀释 液， 室温孵育 1分钟。
5、 在样品室的一侧开口处加入 Ιθμΐ封闭液 （0.25mg/ml casein蛋白溶液） 慢慢将样品室倾斜至液体由另一侧的开口处流出， 并将流出液用滤纸吸干。 重 复上样四次。 室温孵育 5分钟。
6、 按照步骤 5中的方式加入马达蛋白溶液 （即含有融合蛋白 5 g/ml， 溶剂 为 DMS0) 共 50 μ 1。 室温孵育 5分钟。
7、 分两组进行实验， 分别是 DMS0阴性对照组 （Control) 和 syntelin药物 处理组。
DMS0阴性对照组 （Control) ： 加入用预热的 BRB80溶液配制的含有 10 μΜ 紫 杉醇和 1 mM ATP的溶液 50 μ1。 Syntel in组： 加入用预热的 BRB80溶液配制的含有 10 μΜ 紫杉醇、 1 mM ΑΤΡ、 和 200 nM syntel in的溶液 50 μ1。
8、加入用预热的 BRB80溶液配制的含有 10 μ Μ 紫杉醇、 ImM ATP和 3 μ g/ml 罗丹明标记微管（该微管是购自美国的 Cytoskeleton 公司的微管蛋白）的溶液。
9、 然后将样品室开口的两侧用透明胶带封住， 并马上在荧光显微镜上实时 观察玻片表面微管的运动情况。
上述步骤 6中融合蛋白 （即 CENP-E马达蛋白驱动域 （序列 1的 1-473位） ） 的 制备方法如下：
制备序列表中序列 2所示的 DNA片段 （该 DNA片段编码序列表中序列 1的 1-473 位所示蛋白） ， 然后插入 pET21a (含有 C_端 6X_hi st idine )载体上的 Nde l和 Xhol 之间， 得到质粒 pET21a_CENP-E-N473。 制备序列表中序列 3所示的 GFP基因， 以 单酶切法接入上述的 pET21a_CENP-E-N473质粒的 Xhol位点， 得到质粒
pET21a-CENP-E-N473-GFP。
将构建好的重组表达载体 pET21a-CENP-E-N473_GFP转入 E. col i Rosetta (DE3) pLys菌株中进行蛋白的表达， 并用 M-NTA树脂（Qiagen公司）进行蛋白的 纯化。 树脂上的蛋白用含有 250 mM imidazole的溶液洗脱下来并透析到 50 mM MOPS (pH 7. 0)， 250 mM KC1, 0. 5 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10% glycerol中。 蛋 白表达纯化的具体步骤如下：
1、 将质粒 pET21a-CENP-E-N473_GFP转化至 Ε· col i Rosetta (DE3) pLys感 受态细胞中， 并将菌体涂在含有 100ug/ml氨苄青霉素和 34ug/ml氯霉素的 LB平板 上， 在 37 °C培养至单克隆菌落出现。
2、 挑取单克隆菌落并接种到 5ml灭菌处理的 LB液体培养基中 （同时加上述 浓度的氨苄青霉素和氯霉素） ， 37 °C摇菌过夜。
3、 将培养过夜的菌液以 1 : 100的比例接种到灭菌处理的 500 ml LB培养基 中 （同时加上述浓度的氨苄青霉素和氯霉素） ， 37 °C摇菌至 0D58。达到 0. 5的时候， 加入终浓度为 0. 1 mM 的 IPTG，并接着在 16 °C下诱导蛋白表达 16小时。
4、 诱导结束后， 5, 000 rpm离心 5分钟收集菌体。
5、 弃上清， 用预冷的裂解溶液 20ml重悬菌体， 然后采用压力破碎法裂解菌 体细胞， 释放蛋白。
6、 4°C下 12, OOOrpm离心 30分钟。
7、 将上清液转移到一个干净的蛋白孵育管里， 然后与 0. 5ml的预先用裂解 溶液平衡过的 M-NTA树脂在 4°C下孵育 2小时。 收集得到带有组氨酸标签的序列 表中序列 1的 1-473位所示蛋白， 将该蛋白称为融合蛋白。
二、 Syntel in对有丝分裂的影响
1、 Syntel in对细胞有丝分裂的表型分析
1 ) 实验步骤
设置如下四组，第 1组是 DMS0对照组；第 2组是 syntel in组；第 3组是 Scramble 组， 即阴性对照 s iRNA组， 所转染的 s iRNA的序列是 5 '
-AAAACCAUCAUACCAGAGACA-3 ' ； 第 4组是针对 CENP-E的 s iRNA组， 所转染的 s iRNA 的序列是 5 ' - AAACACUUACUGCUCUCCAGUUU- 3 ' 。
用含有 1 μΜ syntel in的 DMS0溶液 [ synte l in组】 或等体积的 DMSO【DMS0对 照组】 处理 HeLa细胞 （ Invitrogen公司） 1小时后， 经 4%甲醛固定、 打孔及封闭 后进行免疫组化。 为了验证 CENP-E马达功能抑制后的表型， 另两组实验是转染 针对 CENP-E的 s iRNA及其 scramble序列对照。 第 4组用 400 μΐ
Opt i-MEM (Invitrogen Inc. )含有 50nM针对 CENP-E的 s iRNA和 2μ1
Lipof ectamine2000 (Invitrogen Inc. )的脂质体转染生长在盖玻片上的 HeLa细 胞 4小时后换液。 第 3组与第 4组相比， 只将针对 CENP-E的 s iRNA替换为阴性对照 siRNA, 其余处理方法均相同。 转染 36小时后经 4%甲醛固定、 打孔及封闭后进行 按照如下文献的方法采用针对微管及动点标志蛋白 ACA进行免疫组化： Yao， X. , Anderson, K. L. , and Cleveland, D. W. ( 1997) . The microtubule-dependent motor centromere-associated protein E (CENP-E) i s an integral component of kinetochore corona fibers that l ink centromeres to spindle microtubules. J Cel l Biol 139, 435-447)。
2 ) 实验结果
如图 5所示。 图 5A和图 5B中有丝分裂期细胞的微管标记为绿色，动点为红色， 染色体为蓝色。 标尺代表实际长度 5 μπι。
图 5Α左边的图中是一个正常细胞（DMS0对照组）的上述三种结构的染色定位 表型。 右边是一个用 1 μΜ syntel in处理后异常的前中期细胞的表型， 箭头标记 的是错误排列的染色体。
图 5B为 CENP-E经 RNA沉默所体现的表型。 左边 Scramble组是转染了阴性对照 SiRNA的有丝分裂期细胞的表型。 右边 CENP-E SiRNA组是转染了针对 CENP-E的 SiRNA后细胞内三种结构的定位表型。 箭头标记的是错误排列的染色体。
图 5C为 CENP-E功能缺失的统计分析。 图示对染色体上动点沿两极轴向距最 近一极的距离测量方法及数据标准的归一化处理方式。
图 5D为用图 5C的测量和处理方法所得到的各种细胞处理方式下染色体的空 间分布情况。说明相对于两种阴性对照情况， 两种对 CENP-E功能干扰的方法（加 入 syntel in或者 s iRNA转染） 都会很明显地造成染色体在细胞中空间分布的异 常， 说明 s ynt e 1 i n能像 CENP-E的 s i RNA那样干扰 CENP-E的马达功能。
2、 Syntel in对纺锤体微管对染色体连接的影响
Syntel in作用机制的示意图如图 6E所示。
在冷处理细胞以去解聚非动点连接的微管后 （具体的步骤是把 HeLa细胞放 到 4度冰箱中冷处理 10分钟后再固定 ( Yao, X. , Anderson, K. L. , and Cleveland, D. W. ( 1997) . The microtubule-dependent motor centromere-associated protein E (CENP-E) i s an integral component of kinetochore corona fibers that l ink centromeres to spindle microtubules. J Cel 1 Biol 139, 435-447 ) ， 对微管 （绿色） 、 动点 （红色） 和染色体 （蓝色） 分别染色并在去卷积显微镜 下观察用 DMS0 (正常对照组， 图 6A)或者 1 μΜ syntel in溶液 （用 DMSO溶解 syntel in, 用 DMEM培养基稀释至 1 μΜ) ( syntel in处理组， 图 6B ) 对 HeLa细胞 处理 30分钟的影响。 四角放大的部分显示了动点一微管的连接情况。 结果如图 5A和图 5B (标尺代表实际长度 5 μπι) 所示， 从放大的图中可以看出： 正常对照 组中的细胞染色体整齐排列在赤道板上， 其动点与来自两端的微管成均等双向 连接。 而 syntel in处理组细胞的染色体基本散在中心体附近呈单向 syntel ic连 接。
上述 1 μΜ syntel in处理后细胞的电镜切片观察结果如图 6C和 D所示。 图 6C 是低放大倍数的对整个细胞的结构的观察结果。 除了大多数排列在赤道板上的 染色体外， 在电镜图片中可以清晰地观察到一些位于两极附近的染色体。 图 6D 的对应于左面图片矩形框内的高放大率的观察结果。 箭头指示的是来自同一个 中心粒 （星状符号标记） 的微管与一条染色体上的两个动点都建立了连接。 左 边图中的标尺代表实际长度 5 μπι，右边图中的标尺代表实际长度 1μπι。
3、 Syntel in对细胞有丝分裂动态过程的影响
Syntel in对染色体运动影响机制示意图如图 7F所示。 研究 syntel in对细胞有丝 分裂影响的活细胞实验流程图如图 7A所示。 具体步骤是先用 5 μΜ monastrol把 HeLa细胞同步在前中期， 然后用细胞培养液 Opt i-MEM ( Invitrogen ) 洗三遍并 加入 1 μΜ的 syntel in溶液 （用 DMS0溶解 syntel in, 用 Opt i-MEM培养基稀释至 1 μΜ 或等体积的 DMSO进行活细胞观察 （Liu, J. , Wang, Z. , Jiang, K. , Zhang, L. , Zhao, L. , Hua, S. , Yan, F. , Yang, Y. , Wang, D. , Fu， C. , et al. (2009) . PRC1 cooperates with CLASP 1 to organize central spindle plast icity in mitos i s. J Biol Chem 284, 23059-23071. ) 。
结果如图 7B和 C所示。 B是 DMSO处理的 Hela细胞由前中期到后期的实时观察 结果， 图中的绿色为 EGFP-H2B用于指示染色体的位置， 红色的为
mCherry-tubul in, 用于表征纺锤体的结构情况； C是 syntel in处理的 Hela细胞 由前中期开始后 2个小时内的观察结果， 箭头指示未排列好的染色体。 说明了抑 制 CENP-E的马达活性阻碍染色体向赤道板的聚集。
研究 syntel in药物处理的可逆性的活细胞实验流程图如图 7D所示。 具体步 骤是把 5 μΜ 的 monastrol与上述 1 μΜ的 syntel in溶液处理 HeLa细胞 60分钟， 然 后用上述细胞培养液洗三遍并进行活细胞观察。
结果如图 7E所示， 将 syntel in从细胞中洗去后未排列好的染色体随后逐渐 实现了到达赤道板的排列任务。
4、 Syntel in对蛋白磷酸酶 PP1 γ的定位影响
1 ) 实验步骤
1 μΜ的 Syntel in及同等体积的 DMS0处理 HeLa细胞 60分钟后， 经 4%甲醛固定、 打孔及封闭后进行采用针对磷酸酶 PP1 Y的抗体进行免疫组化。 具体步骤及方法 请见 Ding et al. , 2010 (Ding X, Yan F, Yao P, Yang Z, Wan W, Wang X, Liu J, Gao X, Abrieu A, Zhu T, Zhang J, Dou Z, Yao X. (2010) . Probing CENP-E function in chromosome dynamics using smal l molecule inhibitor syntel in. Cel l Res. 20, 1386-9)。
2 ) 实验结果
结果如图 8所示。
图 8A表示 DMS0组和 syntel in处理组结果。 在对照处理（DMS0)组中， 磷酸酶 PP1 Y (绿色） 与 CENP-E (红色） 共同定位于动点。 四角放大的部分显示了动点 的共定位情况。 标尺代表实际长度 5 μ πι。 但当 syntel in处理后 （1 μ M for 30 min) , 磷酸酶 ΡΡΙ γ (绿色） 与 CENP-E (红色） 信号逐渐消失 CENP-E (红色） 。 四角放大的部分显示了磷酸酶 PP1 Y与 CENP-E在动点定位减少的情况， 提示抑制 CENP-E马达活性可抑制磷酸酶 PP1 y在动点的定位。 标尺代表实际长度 5 μ m。 图 8B scramble siRNA组和 CENP-E siRNA组结果。 在对照 siRNA (scramble siRNA) 处理组中， 磷酸酶 PPl Y (绿色） 与 CENP-E (红色） 共同定位于动点。 四角放大 的部分显示了动点的共定位情况。 标尺代表实际长度 5 μ πι。 当 CENP-E siRNA处 理后 （1 μ Μ for 30 min) , 磷酸酶 PP1 γ (绿色） 与 CENP-E (红色） 信号逐渐 消失 CENP-E (红色） 。 四角放大的部分显示了磷酸酶 PP1 Y与 CENP-E在动点定位 减少的情况，说明磷酸酶 PP1 Y在动点的定位有赖于 CENP-E。 标尺代表实际长度 5 m。
实施例 2-10制备所得目标化合物的功能 （治疗肿瘤细胞增殖、 抑制细胞有 丝分裂、 抑制马达蛋白驱动的微管滑动） 与实施例 1制备所得目标化合物的功能 无显著性差异。
工业应用
动物实验证明， 式 VI I化合物所示的 Syntel in可明显抑制人乳腺癌细胞的 生长。 进一步的机理实验表明 Syntel in (所述式 VI I化合物） 与 CENP-E结合后 可抑制 CENP-E马达在微管上的行走， 但不影响其与微管的相互作用， 当该化合 物加入细胞培养基中能够进入细胞抑制 CENP-E的功能， 导致部分染色体排列错 误并长时间维系纺锤体检验点的活性。 电镜分析发现 CENP-E小分子抑制剂处理 细胞的染色体常形成 Syntel in连接（Syntel in连接指连接同一染色体姐妹动点 的纺锤体微管来自同一极）。此表型与 CENP-E沉默细胞体现的表型一致（Yao et al. , 2000) 。 由于 CENP-E功能下调出现 Syntel in染色体表型， 故命名 CENP-E 小分子抑制剂为 Syntel in。 Syntel in对 CENP-E的抑制作用可以洗脱， 洗脱后 的细胞能够成功完成有丝分裂， 为此 Syntel in 将是非常有效的工具药。 利用 Syntel in对 CENP-E的抑制， 从而干扰 CENP-E介导的功能蛋白质 （群） 运输及 定位， 免疫组化实验表明 CENP-E 马达功能的干扰影响了蛋白磷酸酶 （PP1 Y ) 在动点的定位及随后对磷酸化底物的去磷酸化。 由于动点蛋白的去磷酸化的受 阻， 导致细胞有丝分裂纺锤体检验点处于活化状态。
上述实验结果表明： CENP-E 通过调控蛋白磷酸酶 PP1Y的定位调控细胞有 丝分裂纺锤体检验点的沉默（Silence)，从而使细胞进入分裂后期（Anaphase)。 本发明的 CENP-E小分子抑制剂 Syntelin将在细胞生物学研究中发挥重要作用， 同时其调控肿瘤细胞增殖的功效可为新型化疗药物的研制奠定基础。

Claims

权利要求
1、 式 I或
Figure imgf000022_0001
(式 I I )
所述式 I和式 I I结构通式中， 和 R2均选自下述基团中的任意一种： C1-C6 的烷基、 烷烯基、 芳基、 环烷基和环烷烯基；
为芳基、 含有取代基的芳基、 五元杂环基或六元杂环基；
X为 0、 NR4、 S或 CHR5;
Y为 0、 NR4、 S或 CHR6;
所述 X和 Y中， 所述 R4、 R5、 R6均选自烷基、烷烯基和烷酯基中的任意一种; Z选自如下基团中的任意一种：
Figure imgf000022_0002
2、 根据权利要求 1所述的化合物， 其特征在于： 所述式 I和式 I I结构通 式中， ！^和 R2均为甲基或苯基； 所述 为苯基或
Figure imgf000022_0003
所述 X为 0、 NH、 NCH2CH2CH3或 S;
所述 Y为 0或 S; 所述 Z为- C00H。
3、 根据权利要求 1或 2所述的化合物， 其特征在于： 所述式 I结构通式所 示化合物为式 ΠΙ-式 VI
Figure imgf000023_0001
(式 III)
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000023_0003
(式 V)
Figure imgf000023_0004
(式 VI)
Figure imgf000024_0001
(式 XI) ；
Figure imgf000024_0002
(式 IX)
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0002
(式 XII) 。
4、 一种制备权利要求 1-3任一所述化合物的方法， 包括如下步骤： 将式 XIII所示化合物、 中间体化合物和碱于有机溶剂中进行回流反应， 反 应完毕得到所述权利要求 1-3任一
Figure imgf000025_0003
(式 XIII)
所述式 XIII中， ！^和 R2均选自下述基团中的任意一种： C1-C6的烷基、 浣 烯基、 芳基、 环烷基和环烷烯基。
5、 根据权利要求 4所述的方法， 其特征在于： 所述式 XIII中， 和 为 甲基或苯基； 所述中间体化合物选自式 XIV-式 XVII所示化合物中的任意一种：
Figure imgf000025_0004
(式 XIV)
Figure imgf000026_0001
( XV)
Figure imgf000026_0002
( XVI)
Figure imgf000026_0003
(式 XVII) ；
所述有机溶剂为四氢呋喃。
6、 根据权利要求 4或 5所述的方法， 其特征在于： 所述式 XIII所示化合 物、 中间体化合物、所述碱和所述有机溶剂的用量比为 1 ol: 1.1 ol: 2 ol: 10ml
7、根据权利要求 4-6任一所述的方法，其特征在于：所述制备权利要求 1-3 任一所述化合物的方法， 还包括如下步骤： 在所述反应完毕后， 将反应体系冷 却后用氯仿溶解， 再依次用水和饱和食盐水洗涤， 干燥后， 用异丙醇和二氯甲 烷组成的混合液进行重结晶， 得到所述权利要求 1-3任一所述化合物。
8、一种制备权利要求 1-3中 X为 NCH2CH2CH3的式 I或式 II所示化合物的方 法， 包括如下步骤：
将权利要求 1-3中 X为 NH的式 I或式 II所示化合物、 卤代丙烷和碱于有 机溶剂中进行回流反应， 反应完毕得到所述权利要求 1-3中 X为 (： (： 的式 I或式 II所示化合物。
9、 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于： 所述卤代丙烷为溴丙烷； 所 述有机溶剂为四氢呋喃； 所述碱为碳酸钾。
10、根据权利要求 8或 9所述的方法， 其特征在于： 所述权利要求 1-3中 X 为 NH的式 I或式 I I所示化合物、 卤代丙烷、 碱和有机溶剂的用量比为 lmmol : 1. lmmol： 2mmol： 10ml。
11、 根据权利要求 8-10任一所述的方法， 其特征在于： 所述制备权利要求 1-3中 X为 ¾(： (：¾的式 I或式 I I所示化合物的方法，还包括如下步骤： 在所 述反应完毕后， 将反应体系冷却后用氯仿溶解， 再依次用水和饱和食盐水洗涤， 干燥后， 用异丙醇和二氯甲烷组成的混合液进行重结晶， 得到所述权利要求 1-3 中 X为 NCH2CH2CH3的式 I或式 I I所示化合物。
12、 权利要求 1-3 任一所述的化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖产品中的应 用。
13、如权利要求 12所述的应用， 其特征在于： 所述肿瘤细胞为上皮癌细胞。
14、 如权利要求 13所述的应用， 其特征在于： 所述上皮癌细胞为乳腺癌细 胞。
15、 权利要求 1-3 任一所述的化合物在制备抑制细胞有丝分裂的试剂中的 应用。
16、 如权利要求 15所述的应用， 其特征在于： 所述抑制细胞有丝分裂是通 过干扰马达蛋白介导的功能蛋白运输和 /或定位实现的。
17、 如权利要求 16所述的应用， 其特征在于： 所述马达蛋白是氨基酸序列 如序列表中序列 1所示的蛋白。
18、 如权利要求 16或 17所述的应用， 其特征在于： 所述马达蛋白介导的 功能蛋白是蛋白磷酸酶。
19、 权利要求 1-3 任一所述的化合物在制备抑制马达蛋白驱动的微管滑动 的试剂中的应用。
20、 权利要求 1-3任一所述的化合物在制备马达蛋白活性抑制剂中的应用。
21、 如权利要求 16-20 中任一所述的应用， 其特征在于： 所述马达蛋白是 氨基酸序列如序列表中序列 1所示的蛋白。
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