CN102552274A - 动点马达蛋白小分子抑制剂在抑制肿瘤细胞增殖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动点马达蛋白小分子抑制剂在抑制肿瘤细胞增殖中的应用。所述动点马达蛋白小分子抑制剂为式I或式II结构通式所示化合物，其名称为Syntelin。动物实验证明，式VII化合物所示的Syntelin可明显抑制人乳腺癌细胞的生长。进一步的机理实验表明，式VII化合物所示的Syntelin与CENP-E结合后可抑制CENP-E马达在微管上的行走，但不影响其与微管的相互作用，当该化合物加入细胞培养基中能够进入细胞抑制CENP-E的功能，导致部分染色体排列错误并长时间维系纺锤体检验点的活性。本发明的CENP-E小分子抑制剂Syntelin在细胞生物学研究中具有重要作用，同时其调控肿瘤细胞增殖的功效可为新型化疗药物的研制奠定基础。(式I) (式II)
Description
技术领域
本发明涉及动点马达蛋白小分子抑制剂在抑制肿瘤细胞增殖中的应用。
背景技术
细胞精确地自我复制是生命活动的重要组成部分，复制的高保守性在生物及物种的繁衍生息过程中举足轻重。在细胞复制的过程中，包含在染色体中的父代遗传信息在经历了诸多复杂的运动之后均等、准确的分配给两个子细胞。细胞周期事件是高度有序进行的，保证细胞周期有条不紊地行进的生化调控通路被称为“检验点”(Checkpoint)。
动点是位于着丝粒上的多组分蛋白质复合结构。它不仅直接维系纺锤体丝与染色体的衔接，同时亦调控染色体运动及染色体分离的时空序列性及保真性，此信号通路被称为“纺锤体检验点”(Spindle Checkpoint)。纺锤体检验点失控可导致细胞复制过程中非整倍体及染色体不稳定性的产生，并可能参与肿瘤的发生和发展。但迄今为止，纺锤体检验点信号通路的蛋白质作用网络及其信息流传递的分子机制仍不明了。
动点马达蛋白CENP-E(Centromere-Associated Protein E)是一个分子量为312kDa的动点蛋白，它含有一个位于N端的驱动蛋白类似的马达域和包含1069个氨基酸残基的coiled-coil结构域，总长为2701个氨基酸。CENP-E是一个直接负责动点对纺锤体微管衔接的马达蛋白，它与其它纺锤体检验点蛋白的协调作用，监控细胞有丝分裂的进程，但CENP-E监控细胞有丝分裂的细节仍鲜为人知。CENP-E的缺失使纺锤体检验点失活，导致染色体运动及分离过程出现差错从而产生染色体不稳定性表型。为此，详尽研究纺锤体检验点调控蛋白CENP-E的结构-功能相关性是一项非常有意义的研究工作。
发明内容
本发明的目的是提供动点马达蛋白小分子抑制剂在制备抑制肿瘤细胞增殖产品中的应用。
上述动点马达蛋白小分子抑制剂为式I或式II结构通式所示化合物，其名称为Syntelin：
(式I)
(式II)
所述式I和式II结构通式中，R1和R2均选自下述基团中的任意一种：C1-C6的烷基、烷烯基、芳基、环烷基和环烷烯基；
R3为芳基、含有取代基的芳基、五元杂环基或六元杂环基；
X为O、NR4、S或CHR5；
Y为O、NR4、S或CHR6；
所述X和Y中，所述R4、R5、R6均选自烷基、烷烯基和烷酯基中的任意一种；
Z选自如下基团中的任意一种：
所述式I和式II结构通式中，R1和R2均为甲基或苯基；
所述R3为苯基或
所述X为O、NH、NCH2CH2CH3或S；
所述Y为O或S；所述Z为-COOH。
所述式I结构通式所示化合物为式III-式VI和式XI所示化合物，
(式III)
(式IV)
(式V)
(式VI)
(式XI)；
所述式II结构通式所示化合物为式VII-式X和式XII所示化合物，
(式VII)
(式VIII)
(式IX)
(式X)
(式XII)。
所述肿瘤细胞可为上皮癌细胞，如乳腺癌细胞。
本发明的另一个目的是提供所述的式I或式II结构通式化合物在制备抑制细胞有丝分裂的试剂中的应用。
所述抑制细胞有丝分裂是通过干扰马达蛋白介导的功能蛋白运输和/或定位实现的。
所述马达蛋白介导的功能蛋白是蛋白磷酸酶。
所述的式I或式II结构通式化合物还可用于制备抑制马达蛋白驱动的微管滑动的试剂。
所述的式I或式II结构通式化合物还可用于制备马达蛋白活性抑制剂。
所述的式I或式II结构通式化合物还可用于制备肿瘤抑制剂。
所述马达蛋白是氨基酸序列如序列表中序列1。
动物实验证明，式VII化合物所示的Syntelin可明显抑制人乳腺癌细胞的生长。进一步的机理实验表明Syntelin(所述式VII化合物)与CENP-E结合后可抑制CENP-E马达在微管上的行走，但不影响其与微管的相互作用，当该化合物加入细胞培养基中能够进入细胞抑制CENP-E的功能，导致部分染色体排列错误并长时间维系纺锤体检验点的活性。电镜分析发现CENP-E小分子抑制剂处理细胞的染色体常形成Syntelin连接(Syntelin连接指连接同一染色体姐妹动点的纺锤体微管来自同一极)。此表型与CENP-E沉默细胞体现的表型一致(Yao etal.，2000)。由于CENP-E功能下调出现Syntelin染色体表型，故命名CENP-E小分子抑制剂为Syntelin。Syntelin对CENP-E的抑制作用可以洗脱，洗脱后的细胞能够成功完成有丝分裂，为此Syntelin将是非常有效的工具药。利用Syntelin对CENP-E的抑制，从而干扰CENP-E介导的功能蛋白质(群)运输及定位，免疫组化实验表明CENP-E马达功能的干扰影响了蛋白磷酸酶(PP1γ)在动点的定位及随后对磷酸化底物的去磷酸化。由于动点蛋白的去磷酸化的受阻，导致细胞有丝分裂纺锤体检验点处于活化状态。
上述实验结果表明：CENP-E通过调控蛋白磷酸酶PP1γ的定位调控细胞有丝分裂纺锤体检验点的沉默(Silence)，从而使细胞进入分裂后期(Anaphase)。本发明的CENP-E小分子抑制剂Syntelin将在细胞生物学研究中发挥重要作用，同时其调控肿瘤细胞增殖的功效可为新型化疗药物的研制奠定基础。
附图说明
图1为实施例1制备所得目标化合物的核磁共振碳谱(A)和氮谱(B)。
图2为Syntelin对实验性乳腺癌的治疗作用。其中，A为造模后给药前的结果；B为给药第10天的结果，B图从左往右依次是DMSO对照组、紫杉醇治疗组和syntelin治疗组。
图3为Syntelin治疗前后荧光素酶的荧光活性变化。
图4为Syntelin对CENP-E马达蛋白行走的抑制作用。其中，第一排为control(DMSO)组，第二排为Syntelin组。
图5为Syntelin对细胞有丝分裂的表型分析。其中，A为DMSO对照组(左)和Syntelin组(右)的细胞有丝分裂表型；B为CENP-E经RNA沉默所体现的表型，左边是Scramble组，右边是CENP-E SiRNA组；C为CENP-E功能缺失的统计分析方案；D为各种处理方式下染色体的空间分布情况(横坐标为极点的分布，纵坐标为着丝粒的百分比)。
图6为Syntelin对纺锤体微管对染色体连接的影响。其中，A是DMSO组；B是syntelin；C是syntelin细胞的电镜切片结果；D是高放大率的观察结果；E是Syntelin作用机制的示意图。
图7为Syntelin对细胞有丝分裂动态过程的影响。其中，A是用于研究syntelin对细胞有丝分裂影响的活细胞实验流程图；B是DMSO处理的Hela细胞由前中期到后期的实时观察结果，图中的绿色为EGFP-H2B用于指示染色体的位置，红色的为mCherry-tubulin，用于表征纺锤体的结构情况；C是syntelin处理的Hela细胞由前中期开始后2个小时内的观察结果。箭头指示未排列好的染色体；D是用于研究syntelin药物处理的可逆性的活细胞实验流程图；E是图示将syntelin从细胞中洗去后未排列好的染色体随后逐渐实现了到达赤道板的排列任务；F是syntelin对染色体运动影响机制示意图。
图8为Syntelin对蛋白磷酸酶PP1γ的定位影响。其中，图8A表示DMSO组和syntelin处理组结果；图8B scramble siRNA组和CENP-E siRNA组结果。每组有2幅图，前一幅是CENP-E(红色)和PP1γ(绿色)的双色定位，后一幅是CENP-E(红色)、PP1γ(绿色)及DNA(蓝色)的三色定位。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
发明提供的式I所示化合物可按照如下合成路径制备而得：
(式I)
实施例1、目标化合物式VII的合成：
(式XV) (式VII)
三口烧瓶中加入1mmol 5a、1.1mmol中间体式XV所示化合物(其合成参考文献Monatshefte fuer Chemie，127(5)，549-555，1996)，10ml THF中，搅拌下加入2mmol K2CO3，加热回流，TLC监测至反应完全，冷却，抽滤，减压回收溶剂，把所得残余物用氯仿溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。抽滤，回收溶剂，残余物以异丙醇/二氯甲烷重结晶得式VII目标化合物的纯品。
图1为纯品式VII化合物(命名为Syntelin)的核磁检测谱图，A是碳谱，B是氮谱。由图可知，该化合物结构正确，为式VII所示化合物。
其中，化合物5a是按照如下步骤制备而得：
1)中间体1a的合成：
圆底烧瓶中加入0.5mol环己酮、1000ml乙醇，搅拌下依次加入0.5mol氰乙酸乙酯、0.5mol硫粉、0.5mol二乙胺，室温搅拌30min后，加热至50℃，TLC监测至反应结束，冷却至室温，反应混合物倾入3000ml水中，有大量固体析出，抽滤，滤饼干燥得中间体1a，直接用于下一步反应。
2)中间体2a、3a的合成：
0.4mol 1a、1000ml无水二氯甲烷置于圆底烧瓶中，室温下剧烈搅拌，0.44mol氯磺酰异氰酸酯的200ml无水二氯甲烷溶液氮气保护下缓慢滴入其中，滴加完毕，室温搅拌至反应完全，减压蒸干二氯甲烷，得黄色固体2a粗品。往反应瓶中加入2000ml 5％KOH溶液，搅拌加热至90℃，TLC监测至反应结束，冷却至室温，抽滤，滤饼干燥得中间体3a。
3)中间体4a的合成：
将上一步制得的3a 0.2mol，过量三氯氧磷(500ml)和DMF(40ml)加热回流5h。将反应液减压浓缩得深棕色偏黑物质，冰浴析出大量深棕色沉淀。抽滤得到黄色固体，用三氯甲烷溶解。再次抽滤除去不溶物，滤液用5％碳酸氢钠溶液洗涤、水洗，合并有机层，无水硫酸钠干燥后加入适量活性碳脱色，浓缩。柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5∶1)得到米色固体4a。
4)中间体5a的合成：
将上一步制得的4a 0.1mol、四氢呋喃300ml投入压力锅，通入氨气，室温放置8小时。过滤的粗品，以95％乙醇重结晶，得白色片状晶体5a。
实施例2、目标化合物式III的合成：
(式XIV) (式III)
三口烧瓶中加入1mmol 5b、1.1mmol中间体式XIV所示化合物(其合成参考文献Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 16(17)，4444-4449，2006)，10ml THF中，搅拌下加入2mmol K2CO3，加热回流，TLC监测至反应完全，冷却，抽滤，减压回收溶剂，把所得残余物用氯仿溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。抽滤，回收溶剂，残余物以异丙醇/二氯甲烷重结晶得式III所示目标化合物的纯品。
其中，化合物5b是按照如下步骤制备而得：
1)中间体1b的合成：
合成步骤参考实施例1中1a化合物的制备方法。
2)中间体2b、3b的合成：
合成步骤参考实施例1中2a和3a化合物的制备方法。
3)中间体4b的合成：
合成步骤参考实施例1中4a化合物的制备方法。
4)中间体5b的合成：
合成步骤参考实施例1中5a化合物的制备方法。
实施例3、目标化合物式VIII的合成：
(式XV) (式VIII)
三口烧瓶中加入1mmol 5a、1.1mmol中间体式XV所示化合物(其合成参考文献Monatshefte fuer Chemie，127(5)，549-555，1996)，10ml THF中，搅拌下加入2mmol K2CO3，加热回流，TLC监测至反应完全，冷却，抽滤，减压回收溶剂，把所得残余物用氯仿溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。抽滤，回收溶剂，残余物以异丙醇/二氯甲烷重结晶得目标化合物式VIII的纯品。
实施例4、目标化合物式IV的合成：
(式XV) (式IV)
三口烧瓶中加入1mmol 5b、1.1mmol中间体式XV所示化合物(其合成参考文献Monatshefte fuer Chemie，127(5)，549-555，1996)，10ml THF中，搅拌下加入2mmol K2CO3，加热回流，TLC监测至反应完全，冷却，抽滤，减压回收溶剂，把所得残余物用氯仿溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。抽滤，回收溶剂，残余物以异丙醇/二氯甲烷重结晶得目标化合物式IV的纯品。
实施例5、目标化合物式IX的合成：
(式XVI) (式IX)
三口烧瓶中加入1mmol 5a、1.1mmol中间体式XVI所示化合物(其合成参考文献Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 16(17)，4444-4449，2006)，10ml THF中，搅拌下加入2mmol K2CO3，加热回流，TLC监测至反应完全，冷却，抽滤，减压回收溶剂，把所得残余物用氯仿溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。抽滤，回收溶剂，残余物以异丙醇/二氯甲烷重结晶得目标化合物式IX的纯品。
实施例6、目标化合物式V的合成：
(式XVI) (式V)
三口烧瓶中加入1mmol 5b、1.1mmol中间体式XVI所示化合物(其合成参考文献Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 16(17)，4444-4449，2006)，10ml THF中，搅拌下加入2mmol K2CO3，加热回流，TLC监测至反应完全，冷却，抽滤，减压回收溶剂，把所得残余物用氯仿溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。抽滤，回收溶剂，残余物以异丙醇/二氯甲烷重结晶得目标化合物式V的纯品。
实施例7、目标化合物式XII的合成：
(式XVII) (式XII)
三口烧瓶中加入1mmol 5a、1.1mmol中间体式XVII所示化合物(其合成参考文献Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska，Sectio AA：Physica et Chemia，31-32，247-55；1980)，10ml THF中，搅拌下加入2mmol K2CO3，加热回流，TLC监测至反应完全，冷却，抽滤，减压回收溶剂，把所得残余物用氯仿溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。抽滤，回收溶剂，残余物以异丙醇/二氯甲烷重结晶得目标化合物式XII的纯品。
实施例8、目标化合物式XI的合成：
(式XVII) (式XI)
三口烧瓶中加入1mmol 5b、1.1mmol中间体式XVII所示化合物(其合成参考文献Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska，Sectio AA：Physica et Chemia，31-32，247-55；1980)，10ml THF中，搅拌下加入2mmol K2CO3，加热回流，TLC监测至反应完全，冷却，抽滤，减压回收溶剂，把所得残余物用氯仿溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。抽滤，回收溶剂，残余物以异丙醇/二氯甲烷重结晶得目标化合物式XI的纯品。
实施例9、目标化合物式X的合成：
(式XI) (式X)
三口烧瓶中加入1mmol实施例5制备所得式XI所示化合物、1.1mmol溴丙烷，10ml THF中，搅拌下加入2mmol K2CO3，加热回流，TLC监测至反应完全，冷却，抽滤，减压回收溶剂，把所得残余物用氯仿溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。抽滤，回收溶剂，残余物以异丙醇/二氯甲烷重结晶得目标化合物式X的纯品。
实施例10、目标化合物式VI的合成：
(式V) (式VI)
三口烧瓶中加入1mmol实施例6制备所得式V所示化合物、1.1mmol溴丙烷，10ml THF中，搅拌下加入2mmol K2CO3，加热回流，TLC监测至反应完全，冷却，抽滤，减压回收溶剂，把所得残余物用氯仿溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。抽滤，回收溶剂，残余物以异丙醇/二氯甲烷重结晶得目标化合物式VI的纯品。
下述实施例11-12所用的Syntelin均为实施例1制备得到的式VII所示化合物。
实施例11、Syntelin抑制乳腺癌细胞的生长
1、实验步骤
造模：免疫缺陷NOD/SCID小鼠(Jackson Laboratory)通过尾静脉注射稳定表达荧光素酶的乳腺癌MDA-MB231细胞(将荧光素酶的编码基因导入人乳腺癌细胞MDA-MB-231得到的稳定表达荧光素酶的重组细胞，按照Kang Y，Siegel PM，Shu W，Drobnjak M，Kakonen SM，Cordón-Cardo C，Guise TA，MassaguéJ.A multigenic program mediating breast cancermetastasis to bone.Cancer Cell.2003Jun；3(6)：537-49文献的方法构建(请提供JoanMassague′博士的描述该细胞构建方法的文献))造模。每只小鼠静脉注射2×105个稳定表达LUC的MDA-MB231细胞。
治疗：造模成功后(即肿瘤接种后3-4周后当肿瘤达到100mm3大小)的24只小鼠，均分为3组，分别为syntelin治疗组、紫杉醇治疗组和对照组。
syntelin和紫杉醇均分别用DMSO(二甲基亚砜)溶解用于静脉注射。
syntelin治疗组的每只小鼠分别通过静脉注射syntelin的DMSO溶液(30mgsyntelin/kg体重，每三日注射一次)，紫杉醇治疗组的每只小鼠分别通过静脉注射紫杉醇的DMSO溶液(30mg紫杉醇/kg体重)，对照组的每只小鼠分别通过静脉注射等体积的DMSO。药物对肿瘤的治疗效果通过每隔一日的生物发光成像仪确定。
2、实验结果
上述注射的成功可通过生物发光检测仪IVIS Imaging System来检测。
造膜步骤结果：稳定表达荧光素酶的乳腺癌MDA-MB231注射4周后造模成功(肿瘤区域在生物发光成像仪中清晰可见；见图2A)。
治疗步骤结果：给药第10天的结果如图2B所示，syntelin及紫杉醇均可抑制乳腺癌MDA-MB231细胞的生长。
经检测，上述三组治疗后的荧光素酶的荧光活性如图3所示，经过Syntelin及紫杉醇给药后与对照相比，荧光活性均显著降低。
实施例12、Syntelin通过抑制CENP-E马达蛋白活性从而抑制有丝分裂进行
一、Syntelin对体外微管行走的影响
(一)、实验原理
鉴于CENP-E马达蛋白利用水解ATP产生的能量驱动微管运动，实验学上直观研究CENP-E马达活性的评估是微管移动实验[Wood et al.，1997]。为此，直接抑制CENP-E的小分子化合物将是抑制微管的移动能力而不干扰马达蛋白与微管的结合力。
(二)、实验方法与步骤
体外微管行走实验是在一个由一对双面胶带粘合在一起的一片载玻片和盖玻片之间所形成的样品室的空间中进行的。首先用识别6×histidine标签的抗体(MonoclonalAnti-poly-histidine antibody produced in mouse clone HIS-1，Sigma公司，H-1029)将含有此标签的CENP-E蛋白的马达部分偶联在样品室内的玻片表面。然后加入负端高亮标记的紫杉醇稳定的、罗丹明标记的微管、ATP以及DMSO(作为阴性对照)或者syntelin药物。最后在去卷积荧光显微镜下实时观察和记录样品室内玻片表面微管的运动情况。对照(control)和syntelin处理组中呈现的分别是在各自实验中对样品室内玻片表面特定区域每隔30秒的观察结果(图4)。
图4中的阿拉伯数字始终标记发生滑动的微管的正末端，而白色实心箭头则指示没有发生运动的微管。标尺的长度代表实际长度5微米。
图4显示，DMSO阴性对照组(Control)：CENP-E驱动的微管滑动，标记为1的微管在90秒钟滑动了7.9微米；标记为2的微管在第30秒的时候开始与一根一直静止的微管分开，并在接下来的60秒内一直向前滑动，观察到的所有发生滑动的微管的平均运动速率为5.3±1.7微米/分钟(n＝49)。Syntelin组：200nM syntelin对微管运动的影响。标记为1的微管在90秒内向前滑动了0.1微米。
体外微管行走实验的具体步骤如下：
1、盖玻片的处理：将盖玻片放在冷的0.5M盐酸浸泡12个小时，然后用去离子水清洗，去除掉残余的盐酸，最后保存在乙醇中。使用时将玻片从乙醇中取出，用去离子水冲洗干净，在空气中晾干。
2、载玻片的处理：将载玻片浸泡在去离子水中，然后超声去除表面杂质，洗净在空气晾干。
3、样品室的组装：用两条双面胶带将一片载玻片和一片盖玻片粘合在一起。两条胶带间的距离决定了所形成的样品室的体积，一般样品室的体积以10μl到20μl之间为宜。
4、将识别6×histidine标签的抗体用预冷的BRB80溶液(80mM PIPES[pH 6.8]，1mMEGTA，1mM MgCl2)稀释10倍，然后向样品室中加入10μl抗体稀释液，室温孵育1分钟。
5、在样品室的一侧开口处加入10μl封闭液(0.25mg/ml casein蛋白溶液)慢慢将样品室倾斜至液体由另一侧的开口处流出，并将流出液用滤纸吸干。重复上样四次。室温孵育5分钟。
6、按照步骤5中的方式加入马达蛋白溶液(即含有融合蛋白5μg/ml，溶剂为DMSO)共50μl。室温孵育5分钟。
7、分两组进行实验，分别是DMSO阴性对照组(Control)和syntelin药物处理组。
DMSO阴性对照组(Control)：加入用预热的BRB80溶液配制的含有10μM紫杉醇和1mMATP的溶液50μl。
Syntelin组：加入用预热的BRB80溶液配制的含有10μM紫杉醇、1mM ATP、和200nMsyntelin的溶液50μl。
8、加入用预热的BRB80溶液配制的含有10μM紫杉醇、1mM ATP和3μg/ml罗丹明标记微管(该微管是购自美国的Cytoskeleton公司的微管蛋白)的溶液。
9、然后将样品室开口的两侧用透明胶带封住，并马上在荧光显微镜上实时观察玻片表面微管的运动情况。
上述步骤6中融合蛋白(即CENP-E马达蛋白驱动域(序列1的1-473位))的制备方法如下：
制备序列表中序列2所示的DNA片段(该DNA片段编码序列表中序列1的1-473位所示蛋白)，然后插入pET21a(含有C-端6X-histidine)载体上的Nde1和Xho1之间，得到质粒pET21a-CENP-E-N473。制备序列表中序列3所示的GFP基因，以单酶切法接入上述的pET21a-CENP-E-N473质粒的Xho1位点，得到质粒pET21a-CENP-E-N473-GFP。
将构建好的重组表达载体pET21a-CENP-E-N473-GFP转入E.coli Rosetta(DE3)pLys菌株中进行蛋白的表达，并用Ni-NTA树脂(Qiagen公司)进行蛋白的纯化。树脂上的蛋白用含有250mM imidazole的溶液洗脱下来并透析到50mM MOPS(pH 7.0)，250mM KCl，0.5mMEGTA，2mM MgCl2，10％glycerol中。蛋白表达纯化的具体步骤如下：
1、将质粒pET21a-CENP-E-N473-GFP转化至E.coli Rosetta(DE3)pLys感受态细胞中，并将菌体涂在含有100ug/ml氨苄青霉素和34ug/ml氯霉素的LB平板上，在37℃培养至单克隆菌落出现。
2、挑取单克隆菌落并接种到5ml灭菌处理的LB液体培养基中(同时加上述浓度的氨苄青霉素和氯霉素)，37℃摇菌过夜。
3、将培养过夜的菌液以1∶100的比例接种到灭菌处理的500ml LB培养基中(同时加上述浓度的氨苄青霉素和氯霉素)，37℃摇菌至OD580达到0.5的时候，加入终浓度为0.1mM的IPTG，并接着在16℃下诱导蛋白表达16小时。
4、诱导结束后，5,000rpm离心5分钟收集菌体。
5、弃上清，用预冷的裂解溶液20ml重悬菌体，然后采用压力破碎法裂解菌体细胞，释放蛋白。
6、4℃下12,000rpm离心30分钟。
7、将上清液转移到一个干净的蛋白孵育管里，然后与0.5ml的预先用裂解溶液平衡过的Ni-NTA树脂在4℃下孵育2小时。收集得到带有组氨酸标签的序列表中序列1的1-473位所示蛋白，将该蛋白称为融合蛋白。
二、Syntelin对有丝分裂的影响
1、Syntelin对细胞有丝分裂的表型分析
1)实验步骤
设置如下四组，第1组是DMSO对照组；第2组是syntelin组；第3组是Scramble组，即阴性对照siRNA组，所转染的siRNA的序列是5′-AAAACCAUCAUACCAGAGACA-3’；第4组是针对CENP-E的siRNA 组，所转染的siRNA的序列是5′-AAACACUUACUGCUCUCCAGUUU-3′。
用含有1μMsyntelin的DMSO溶液【syntelin组】或等体积的DMSO【DMS0对照组】处理HeLa细胞(Invitrogen公司)1小时后，经4％甲醛固定、打孔及封闭后进行免疫组化。为了验证CENP-E马达功能抑制后的表型，另两组实验是转染针对CENP-E的siRNA及其scramble序列对照。第4组用400μlOpti-MEM(Invitrogen Inc.)含有50nM针对CENP-E的siRNA和2μl Lipofectamine2000(Invitrogen Inc.)的脂质体转染生长在盖玻片上的HeLa细胞4小时后换液。第3组与第4组相比，只将针对CENP-E的siRNA替换为阴性对照siRNA，其余处理方法均相同。转染36小时后经4％甲醛固定、打孔及封闭后进行按照如下文献的方法采用针对微管及动点标志蛋白ACA进行免疫组化：Yao，X.，Anderson，K.L.，and Cleveland，D.W.(1997).The microtubule-dependent motor centromere-associated protein E(CENP-E)is an integral component of kinetochore corona fibers that link centromeres to spindlemicrotubules.J Cell Biol 139，435-447)。
2)实验结果
如图5所示。图5A和图5B中有丝分裂期细胞的微管标记为绿色，动点为红色，染色体为蓝色。标尺代表实际长度5μm。
图5A左边的图中是一个正常细胞(DMSO对照组)的上述三种结构的染色定位表型。右边是一个用1μMsyntelin处理后异常的前中期细胞的表型，箭头标记的是错误排列的染色体。
图5B为CENP-E经RNA沉默所体现的表型。左边Scramble组是转染了阴性对照SiRNA的有丝分裂期细胞的表型。右边CENP-E SiRNA组是转染了针对CENP-E的SiRNA后细胞内三种结构的定位表型。箭头标记的是错误排列的染色体。
图5C为CENP-E功能缺失的统计分析。图示对染色体上动点沿两极轴向距最近一极的距离测量方法及数据标准的归一化处理方式。
图5D为用图5C的测量和处理方法所得到的各种细胞处理方式下染色体的空间分布情况。说明相对于两种阴性对照情况，两种对CENP-E功能干扰的方法(加入syntelin或者siRNA转染)都会很明显地造成染色体在细胞中空间分布的异常，说明syntelin能像CENP-E的siRNA那样干扰CENP-E的马达功能。
2、Syntelin对纺锤体微管对染色体连接的影响
Syntelin作用机制的示意图如图6E所示。
在冷处理细胞以去解聚非动点连接的微管后(具体的步骤是把HeLa细胞放到4度冰箱中冷处理10分钟后再固定(Yao，X.，Anderson，K.L.，and Cleveland，D.W.(1997).Themicrotubule-dependent motor centromere-associated protein E(CENP-E)is an integralcomponent of kinetochore corona fibers that link centromeres to spindle microtubules.J Cell Biol 139，435-447)，对微管(绿色)、动点(红色)和染色体(蓝色)分别染色并在去卷积显微镜下观察用DMSO(正常对照组，图6A)或者1μMsyntelin溶液(用DMSO溶解syntelin，用DMEM培养基稀释至1μM)(syntelin处理组，图6B)对HeLa细胞处理30分钟的影响。四角放大的部分显示了动点-微管的连接情况。结果如图6A和图6B(标尺代表实际长度5μm)所示，从放大的图中可以看出：正常对照组中的细胞染色体整齐排列在赤道板上，其动点与来自两端的微管成均等双向连接。而syntelin处理组细胞的染色体基本散在中心体附近呈单向syntelic连接。
上述1μMsyntelin处理后细胞的电镜切片观察结果如图6C和D所示。图6C是低放大倍数的对整个细胞的结构的观察结果。除了大多数排列在赤道板上的染色体外，在电镜图片中可以清晰地观察到一些位于两极附近的染色体。图6D的对应于左面图片矩形框内的高放大率的观察结果。箭头指示的是来自同一个中心粒(星状符号标记)的微管与一条染色体上的两个动点都建立了连接。左边图中的标尺代表实际长度5μm，右边图中的标尺代表实际长度1μm。
3、Syntelin对细胞有丝分裂动态过程的影响
Syntelin对染色体运动影响机制示意图如图7F所示。研究syntelin对细胞有丝分裂影响的活细胞实验流程图如图7A所示。具体步骤是先用5μMmonastrol把HeLa细胞同步在前中期，然后用细胞培养液Opti-MEM(Invitrogen)洗三遍并加入1μM的syntelin溶液(用DMSO溶解syntelin，用Opti-MEM培养基稀释至1μM或等体积的DMSO进行活细胞观察(Liu，J.，Wang，Z.，Jiang，K.，Zhang，L.，Zhao，L.，Hua，S.，Yan，F.，Yang，Y.，Wang，D.，Fu，C.，et al.(2009).PRC1cooperates with CLASP1to organize central spindleplasticity in mitosis.J Biol Chem 284，23059-23071.)。
结果如图7B和C所示。B是DMSO处理的Hela细胞由前中期到后期的实时观察结果，图中的绿色为EGFP-H2B用于指示染色体的位置，红色的为mCherry-tubulin，用于表征纺锤体的结构情况；C是syntelin处理的Hela细胞由前中期开始后2个小时内的观察结果，箭头指示未排列好的染色体。说明了抑制CENP-E的马达活性阻碍染色体向赤道板的聚集。
研究syntelin药物处理的可逆性的活细胞实验流程图如图7D所示。具体步骤是把5μM的monastrol与上述1μM的syntelin溶液处理HeLa细胞60分钟，然后用上述细胞培养液洗三遍并进行活细胞观察。
结果如图7E所示，将syntelin从细胞中洗去后未排列好的染色体随后逐渐实现了到达赤道板的排列任务。
4、Syntelin对蛋白磷酸酶PP1γ的定位影响
1)实验步骤
1μM的Syntelin及同等体积的DMSO处理HeLa细胞60分钟后，经4％甲醛固定、打孔及封闭后进行采用针对磷酸酶PP1γ的抗体进行免疫组化。具体步骤及方法请见Ding et al.，2010(Ding X，Yan F，Yao P，Yang Z，Wan W，Wang X，Liu J，Gao X，Abrieu A，Zhu T，ZhangJ，Dou Z，Yao X.(2010).Probing CENP-E function in chromosome dynamics using smallmolecule inhibitor syntelin.Cell Res.20，1386-9)。
2)实验结果
结果如图8所示。
图8A表示DMSO组和syntelin处理组结果。在对照处理(DMSO)组中，磷酸酶PP1γ(绿色)与CENP-E(红色)共同定位于动点。四角放大的部分显示了动点的共定位情况。标尺代表实际长度5μm。但当syntelin处理后(1μM for 30min)，磷酸酶PP1γ(绿色)与CENP-E(红色)信号逐渐消失CENP-E(红色)。四角放大的部分显示了磷酸酶PP1γ与CENP-E在动点定位减少的情况，提示抑制CENP-E马达活性可抑制磷酸酶PP1γ在动点的定位。标尺代表实际长度5μm。
图8B scramble siRNA组和CENP-E siRNA组结果。在对照siRNA(scramble siRNA)处理组中，磷酸酶PP1γ(绿色)与CENP-E(红色)共同定位于动点。四角放大的部分显示了动点的共定位情况。标尺代表实际长度5μm。当CENP-E siRNA处理后(1μM for 30min)，磷酸酶PP1γ(绿色)与CENP-E(红色)信号逐渐消失CENP-E(红色)。四角放大的部分显示了磷酸酶PP1γ与CENP-E在动点定位减少的情况，说明磷酸酶PP1γ在动点的定位有赖于CENP-E。标尺代表实际长度5μm。
实施例2-10制备所得目标化合物的功能(治疗肿瘤细胞增殖、抑制细胞有丝分裂、抑制马达蛋白驱动的微管滑动)与实施例1制备所得目标化合物的功能无显著性差异。
Claims (10)
1.式I或式II结构通式所示化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖产品中的应用；
(式I)
(式II)
所述式I和式II结构通式中，R1和R2均选自下述基团中的任意一种：C1-C6的烷基、烷烯基、芳基、环烷基和环烷烯基；
R3为芳基、含有取代基的芳基、五元杂环基或六元杂环基；
X为O、NR4、S或CHR5；
Y为O、NR4、S或CHR6；
所述X和Y中，所述R4、R5、R6均选自烷基、烷烯基和烷酯基中的任意一种；
Z选自如下基团中的任意一种：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述式I和式II结构通式中，R1和R2均为甲基或苯基；
所述R3为苯基或
所述X为O、NH、NCH2CH2CH3或S；
所述Y为O或S；所述Z为-COOH。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述式I结构通式所示化合物为式III-式VI和式XI所示化合物，
(式III)
(式IV)
(式V)
(式VI)
(式XI)；
所述式II结构通式所示化合物为式VII-式X和式XII所示化合物，
(式VII)
(式VIII)
(式IX)
(式X)
(式XII)。
4.权利要求1-3任一所述的式I或式II结构通式化合物在制备抑制细胞有丝分裂的试剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抑制细胞有丝分裂是通过干扰马达蛋白介导的功能蛋白运输和/或定位实现的。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述马达蛋白介导的功能蛋白是蛋白磷酸酶。
7.权利要求1-3任一所述的式I或式II结构通式化合物在制备抑制马达蛋白驱动的微管滑动的试剂中的应用。
8.权利要求1-3任一所述的式I或式II结构通式化合物在制备马达蛋白活性抑制剂中的应用。
9.权利要求1-3任一所述的式I或式II结构通式化合物在制备肿瘤抑制剂中的应用。
10.如权利要求5-9中任一所述的应用，其特征在于：所述马达蛋白是氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白。
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