WO2012062026A1 - 苦柯胺b盐及制备方法和用途 - Google Patents

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郑新川
刘鑫
周红
王宁
曹红卫
李彦
鲁永玲
赵苛岑
杨景程
杨阳
祝元锋
卫国
黄敏
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中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
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    • C07C63/06—Benzoic acid

Definitions

  • the invention belongs to the technical field of medicine, and particularly relates to a method for preparing a drug for preventing and treating sepsis, and a method for preparing a salt of chloramphenic acid B and a method for preparing the same. Background technique
  • Sepsis is a systemic inflammatory response syndrome (SIRS) mediated by infectious agents. It is a common complication of patients with burns, trauma, tumors and infectious diseases. It has become a globally recognized intensive care unit. (ICU) The primary cause of death in patients.
  • the existing clinical treatments for sepsis mainly include early use of antibiotics and correction of ischemic hypoxic damage. Conventional treatment of organ failure and shock has no specific treatment measures. Drug therapy is usually based on the empirical use of non-specific drugs such as glucocorticoids, insulin, and immunomodulators, but the efficacy has not been confirmed.
  • anti-lipid A monoclonal antibody HA-1A (Centoxin) was used in the US Gulf War and post-burn sepsis treatment during the Gulf War. It has also been used clinically in some European countries and Japan, but Due to the adverse effects on septic shock, it failed to obtain FDA approval in 1992 and immediately disappeared from the European market.
  • Recombinant human activated protein C (rhPC) is currently the only FDA-approved drug for the treatment of sepsis (trade name Xigris). Clinical trials have shown that rhAPC reduces the 28-day mortality rate in patients with sepsis and was approved by the FDA in November 2001.
  • PAMPs pathogen-associated molecular patterns
  • PRRs pattern recognition receptors
  • Kukoamine B also known as scutellaria, is a naturally occurring alkaloid chemical structure isolated from the bone of Chinese medicine.
  • the chemical structure is as follows:
  • bitter bromide B in the different origins and harvesting seasons is quite different. Therefore, the direct extraction, isolation and purification of bitteramine B from plants can be used to prepare drugs for the prevention and treatment of sepsis. Stable, high production costs, high energy consumption and other shortcomings. Chemical synthesis provides a new method for the preparation of bitternamide B, and retrospective studies and patents have been traced, and no full chemical synthesis studies of bitternamide B have been observed.
  • bitteramine B Compared to the natural product, bitteramine B, the bitteramine B salt exists as a new salt with a new chemical structure.
  • the bitteramine B salt and its total chemical synthesis method no patents or literature reports have been reported so far, and no treatment for sepsis has been observed. In particular, no treatment for sepsis by simultaneously antagonizing multiple PAMPs (LPS and CpG DNA) has been observed. Report. Summary of the invention
  • the present invention is directed to the above-mentioned deficiencies, and provides a bitteramine B salt and a preparation method thereof, and the present invention also provides a bitternamide B salt and a pharmaceutical composition comprising the bitteramine B salt in the preparation of a medicament for preventing and treating sepsis the use of.
  • the use of bitternamide B salt and a pharmaceutical composition comprising bitternamide B salt for the treatment of sepsis has a novel mechanism of action, good efficacy, safety and reliability, and provides a new means for the treatment of sepsis.
  • A is an inorganic acid of a anaerobic acid or an oxo acid or an organic acid of a carboxylic acid or a hydroxy acid or a sulfonic acid or an acidic amino acid.
  • the bitternamide B salt forms an acid salt at a basic group portion of the compound structure, and includes an inorganic acid salt and an organic acid.
  • the oxo acid is any one of hydrochloric acid and hydrobromic acid.
  • the oxyacid is any one of sulfuric acid, phosphoric acid and nitric acid.
  • the inorganic acid is any one of hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid, and the effect is good.
  • the carboxylic acid is acetic acid, propionic acid, butyric acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, adipic acid, benzoic acid, phenylpropionic acid, cinnamic acid, stearic acid, trifluoroacetic acid, maleic acid, and fumar. Any of acid, niacin and palmitic acid.
  • the hydroxy acid is any one of malic acid, citric acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, lactobionic acid, tartaric acid, mandelic acid, gluconic acid, glucuronic acid, and ascorbic acid.
  • the sulfonic acid is any one of methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and camphorsulfonic acid.
  • the acidic amino acid is any one of glutamic acid and aspartic acid.
  • the organic acid is preferably any one of acetic acid, maleic acid, succinic acid, malic acid, lactic acid, tartaric acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, glutamic acid and aspartic acid.
  • the acid in the bitteramine salt is widely selected from a plurality of inorganic acids and/or organic acids, and is mainly prepared by selecting 2 to 3 representative acids from various types of acids which are allowed to be used in medicine.
  • the common problem of ketamine salts is described, including hydrochloric acid and hydrobromic acid from the oxoacids in the inorganic acid, sulfuric acid and phosphoric acid in the oxyacid, and acetic acid, maleic acid and the carboxylic acid in the organic acid.
  • malic acid is selected from malic acid, lactic acid and tartaric acid
  • sulfonic acid is selected from methanesulfonic acid and p-toluenesulfonic acid
  • acidic amino acid is selected from glutamic acid and aspartic acid.
  • the medicament for preventing and treating sepsis prepared by using a bitteramine salt and a pharmaceutical composition comprising a bitteramine salt can be administered by the gastrointestinal tract, such as a powder, a tablet, a granule, a capsule.
  • Dosing forms such as agents, solutions, emulsions, suspensions, etc.; or parenteral administration, such as administration by injection, intraluminal administration, mucosal administration, and the like.
  • the dosage is 0.1 ⁇ 15mg per kilogram of body weight per day, and the dosage can be one or more times a day.
  • bitternamide B salt obtained by synthesizing a series of chemical reactions using 3,4-dimethoxyphenylpropionic acid (or 3,4-dihydroxyphenylpropionic acid) and butanediamine as raw materials. as follows:
  • the pharmaceutical composition of the bitternamide B salt comprises the above-mentioned bitternamide B salt as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier and/or diluent.
  • bitternamide B salt in the preparation of a medicament for the prevention and treatment of sepsis.
  • bitternamide B salt for the preparation of a medicament for the prevention and treatment of sepsis.
  • the pharmaceutical composition of the bitternamide B salt of the present invention comprises the bitternamide B salt as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier and/or diluent.
  • the bitternamide B salt of the present invention can be used for the preparation of a medicament for the prevention and treatment of sepsis.
  • the bitteramine B salt can be combined with the active center of the LPS lipid A;
  • bitteramine B salt can neutralize LPS in a dose-dependent manner in vitro
  • the invention uses the bitternamide B salt and the pharmaceutical composition comprising the bitteramine B salt, and the novel mechanism of action for treating sepsis can simultaneously antagonize multiple PAMPs which mediate sepsis, unlike the existing glucocorticoids.
  • insulin, anti-inflammatory mediators, anticoagulant drugs, anti-LPS peptides and lipidA monoclonal antibody can significantly inhibit the induced inflammatory response by simultaneously antagonizing multiple pathogenic molecules, providing treatment for sepsis A new means.
  • the invention broadly selects a plurality of inorganic acids and/or organic acids for explaining the common problem of preparing bitteramine B salt, and those skilled in the chemical and pharmaceutical arts can understand that the same inorganic acid and/or organic acid can be the same.
  • the bitternamide B salt is prepared by a method well known in the chemical art. It will also be understood by those skilled in the art that the bitteramine B can be obtained by extraction, isolation and purification from plants by conventional phytochemical methods. Therefore, it should be noted that the inorganic acid and/or organic acid listed in the present invention is replaced by other inorganic acids and/or organic acids, and the structural modification based on the design idea of the present invention is carried out on the naturally occurring or chemically synthesized bitteramine B. And the modifications are intended to be within the scope of the present invention and the scope of the invention is to be construed as being limited by the scope of the present invention.
  • Figure 1 shows the binding reaction of bitternamide B salt to lipid A.
  • A is an experimental result of bitternamide B malate, succinate, lactate, tartrate, methanesulfonate, hydrochloride and sulfate
  • B is bitternamide B p-toluenesulfonate
  • Figure 2 shows the in vitro neutralization of LPS by bitternamide B salt.
  • A is an experimental result of bitternamide B malate, succinate, lactate, tartrate, methanesulfonate, hydrochloride and sulfate
  • B is bitternamide B p-toluenesulfonate
  • FIG. 3 shows that Kushen B salt inhibits the release of inflammatory mediators from RAW264.7 cells induced by LPS.
  • A, B, C, D, E, F, G, H, I and J are respectively bitteramine B malate, succinate, lactate, tartrate, methanesulfonate, p-toluene
  • Acid salts glutamates, acetates, hydrochlorides, and sulfates
  • Figure 4 shows that the bitteramine B salt inhibits the release of inflammatory mediators from RAW264.7 cells induced by CpG DNA.
  • A, B, C, D, E, F, G, H, I and J are respectively bitteramine B malate, succinate, lactate, tartrate, methanesulfonate, p-toluene
  • Figure 5 shows the protective effects of bitternamide B hydrochloride, methanesulfonate, p-toluenesulfonate and besylate on sepsis model mice.
  • LPS and CpG DNA are the key pathogenic factors leading to the pathogenesis of sepsis.
  • the antagonistic effect of drugs on LPS and CpG DNA reflects its prevention and treatment of sepsis.
  • reagents used herein are of analytical grade.
  • HoN Replacement page (Article 26) (4) Weigh 30 g of compound c in a 250 ml round bottom flask, add 80 ml of THF and 26 ml of triethylamine, and add 21 ml of a mixture of Cbz-Cl and 50 ml of THF at room temperature with stirring. After that, the reaction was stirred at room temperature. After TLC monitoring, after completion of the reaction, the organic solvent was evaporated to dryness, ethyl acetate was extracted, and the mixture was extracted with ethyl acetate.
  • Example 15 Determination of affinity of bitternamide B salt with lipid A
  • the lipidA is coated on the non-derivatized sample cell.
  • the hydrophobic side chain of the lipid A is combined with the sample pool, and the hydrophilic end is free on the outer side, as the hair The target of the binding effect.
  • bitternamide B hydrochloride hydrobromide, sulfate, phosphate, acetate, maleate, succinate, malate, lactate, tartrate, methanesulfonic acid Salt, p-toluenesulfonate, glutamate and aspartate, respectively, in a solution of 20 ⁇ in pyrogen-free water;
  • RAW264.7 cells were diluted to lxl0 6 /ml in DMEM medium and added to 96-well plates (200 ⁇ /well), incubate for 4 hours at 37 ° C, volume fraction of 5% C0 2 , after adherence, replace the cell supernatant with 200 ⁇ serum-free DMEM medium, then add LPS (final concentration 100 ng/ Ml), simultaneously add various bitteramine B salts (including bitteramine, malate, lactic acid, lactate, tartrate, methanesulfonate) at a final concentration of 0, 50, 100, 200 ⁇ M , p-toluenesulfonate, glutamate, acetate, hydrochloride and sulfate), blank control group (Medium) without LPS, continue to incubate for 4 hours, take the supernatant, according to the ELISA kit instructions The concentration of TNF-ct.
  • LPS final concentration 100 ng/ Ml
  • various bitteramine B salts including bitteramine, mal
  • RAW264.7 cells were diluted to lxl6 6 /ml in DMEM medium, added to a 96-well plate (200 ⁇ /well), and incubated for 4 hours at 37 ° C with a volume fraction of 5% C0 2 . After adherence, the cell supernatant was changed to 200 ⁇ l serum-free DMEM medium, then CpG DNA (final concentration 10 g/ml) was added, and various bitteramines were added at a final concentration of 0, 50, 100, 200 ⁇ M.
  • B salt including bitteramine, malate, succinate, lactate, tartrate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, glutamate, acetate, hydrochloride and sulfate
  • blank control group Medium
  • mice 19-21 g, male and female, a total of 120, were randomly divided into 6 groups, 20 in each group, respectively, control group, antibiotic administration group, antibiotic combined with bitteramine B salt
  • the mice were anesthetized with an anesthesia machine, the isoflurane output concentration was 5%, the mixed gas pressure was I MPa, and the anesthesia time was about 5 minutes.
  • the cecal ligation and puncture (CLP) was used to make the model.
  • the mouse was placed in the supine position, and the lower abdomen was passed through the skin.
  • iodophor disinfection use the ophthalmology scissors to cut the skin, muscle layer and peritoneum (incision length about 0.8 cm) downwards 0.3 cm below the midpoint of the abdominal white line.
  • the muscle layer was clamped with an ophthalmology, and the abdominal cavity was examined with an ophthalmologist under direct vision.
  • the end of the cecum was removed and placed outside the abdominal wall, and then ligated with a 4 suture at a distance of 0.5 cm from the end of the cecum.
  • the control group was injected with 0.2 ml of normal saline in the tail vein; the antibiotic (sulphate) in the drug-administered group was administered at a dose of 80 mg/kg, and injected intravenously 4 hours after the mouse was modeled; Kushen B hydrochloride, A
  • the dosage of sulfonate, p-toluenesulfonate and besylate was 2.5 mg/kg, respectively, 0, 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52 after surgery in mice. , 60 and 68 hours of tail vein injection.
  • the general state and mortality of the animals were observed within 7 days, and the difference in survival between the control group and the drug-administered group was compared.
  • the 7-day mortality rate of the CLP control group was 95%, and the survival rate of the sulphatecil (80 mg/kg) mice was 15%.
  • the bitteramine B and the p-toluenesulfonate can increase the survival rate to 20%, the bitteramine B-besylate can increase the survival rate to 30%, and the bitteramine B mesylate can survive. The rate was increased to 50%.
  • the results showed that bitteramine B hydrochloride, methanesulfonate, p-toluenesulfonate and besylate have protective effects on sepsis model mice, among which, bitteramine B Methanesulfonate works best. The result is shown in Figure 5.

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Description

苦柯胺 B盐及制备方法和用途 技术领域
本发明属于医药技术领域， 特别涉及一种苦柯胺 B盐及其制备方法和苦柯胺 B盐用于制 备预防和治疗脓毒症药物的用途。 背景技术
脓毒症是感染因素介导的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 是烧伤、 创伤、 肿瘤和感染性疾病等患者的常见并发症， 现已成为全球公认的导致重 症监护病房 （ICU) 患者死亡的首要因素。 脓毒症的现有临床治疗手段主要为早期使用抗生 素和纠正缺血低氧性损害， 采用常规治疗器官衰竭和休克的方法， 尚无特效治疗措施。 药物 治疗通常以经验性地使用糖皮质激素、 胰岛素、 免疫调节剂等非特异性药物为主， 但疗效一 直未被肯定。 20世纪 90年代， 抗 lipid A的单抗 HA-1A (Centoxin) 曾在海湾战争期间用于 美军战伤和烧伤后脓毒症的治疗， 该药也曾在欧洲部分国家和日本临床使用， 但因对脓毒症 休克反而可能有不利作用， 1992年未能获得美国 FDA的批准， 随即亦从欧洲市场消失。 重 组人活化蛋白 C (recombinant human activated protein C, rhAPC) 是目前唯一被 FDA批准的 治疗脓毒症的药物 （商品名 Xigris)。 临床试验结果显示 rhAPC可降低脓毒症病人 28天死亡 率， 于 2001年 11月经 FDA批准上市。 然而 2005年的第二次临床试验结果却显示 rhAPC组 28天的死亡率与对照组没有差异。 2007年的临床试验中， rhAPC不仅不具有提高脓毒症病人 生存率的作用， 还具有导致患者严重出血倾向的副作用， 因此组织此次临床试验的机构建议 不要推荐使用其作为治疗脓毒症的临床药物。
病原体相关分子模式 （pathogen-associated molecular patterns, PAMPs ) 及其模式识别受 体 （pattern recognition receptors, PRRs ) 的发现， 使人类对脓毒症的认识发生了质的飞跃。 现已证实脓毒症的发病机制是病原体侵入机体后，其菌体的 PAMPs (主要包括脂多糖 /内毒素 ( lipopolysaccharide/endotoxin, LPS )、细菌基因组 DNA (CpG DNA)和肽聚糖 (peptideglycan, PGN) 等） 被机体非特异性免疫系统中炎症反应细胞膜上 /细胞内相应的 PRRs识别， 导致炎 症反应细胞活化， 释放炎症介质而引发全身性炎症反应， 进而导致组织器官的损伤。 因此， 在既往拮抗炎症反应中的重要效应分子， 纠正凝血、 补体等系统的紊乱， 以及单一拮抗 LPS 等治疗措施失败之际， 寻找同时拮抗多个主要 PAMPs (LPS、 CpG DNA和 PGN等） 的药物， 从源头阻断脓毒症的发生可能为其治疗带来突破性进展。
苦柯胺 B (kukoamine B)， 又名地骨皮乙素， 是从中药地骨皮中分离得到的一种天然存 在的生物碱类化合 化学结构如下：
Figure imgf000004_0001
苦柯胺 B最早由日本的 Shinji Funayama于 1995年从地骨皮中发现， 以游离碱形式存在 (S. Funayama, G. Zhang和 S. Nozoe. Phytochemistry. 1995; 38: 1529-1531 )。 除从植物中提取、 分离和纯化方法以及结构表征外， 未见苦柯胺 B的任何生物活性研究报道。 在本申请人较早 提交的中国专利申请中公开了苦柯胺 B在制备预防和治疗脓毒症及自身免疫性疾病药物中的 用途 （中国专利申请号 201010156503.X)。
苦柯胺 B在不同产地、 采收期的地骨皮药材中含量差异较大， 因此从植物中直接提取、 分离和纯化苦柯胺 B用以制备预防和治疗脓毒症的药物具有来源不稳定、 生产成本高、 能耗 大等缺点。 化学合成为苦柯胺 B的制备提供了新的方法， 而追溯既往研究报道和专利， 未见 对苦柯胺 B的全化学合成研究。
较之天然产物苦柯胺 B， 苦柯胺 B盐以新的盐形式存在， 具有新的化学结构。 对于苦柯 胺 B盐及其全化学合成方法， 迄今未见专利、 文献报道， 亦未见其治疗脓毒症， 特别未见通 过同时拮抗多个 PAMPs (LPS和 CpG DNA) 治疗脓毒症的报道。 发明内容
本发明针对上述不足， 提供一种苦柯胺 B盐和制备方法， 本发明还提供一种苦柯胺 B盐 及包含苦柯胺 B盐的药物组合物在制备预防和治疗脓毒症药物中的用途。使用苦柯胺 B盐和 包含苦柯胺 B盐的药物组合物， 治疗脓毒症的作用机制新颖， 疗效好， 安全可靠， 为脓毒症 的治疗提供了一种新的手段。
本发明的技术方案是：
苦柯胺 B盐具
Figure imgf000004_0002
其中， A为无氧酸或含氧酸的无机酸或羧酸或羟基酸或磺酸或酸性氨基酸的有机酸。 所述的苦柯胺 B盐是在化合物结构的碱性基团部位形成酸式盐， 包括无机酸盐和有机酸 所述无氧酸为盐酸和氢溴酸中的任意一种。
所述含氧酸为硫酸、 磷酸和硝酸中的任意一种。
所述无机酸为盐酸、 氢溴酸、 硫酸和磷酸中的任意一种， 效果较好。
所述羧酸为醋酸、 丙酸、 丁酸、 草酸、 丙二酸、 琥珀酸、 己二酸、 苯甲酸、 苯丙酸、 肉 桂酸、 硬脂酸、 三氟醋酸、 马来酸、 富马酸、 烟酸和棕榈酸中的任意一种。
所述羟基酸为苹果酸、 柠檬酸、 乳酸、 羟基丁酸、 乳糖酸、 酒石酸、 扁桃酸、 葡萄糖酸、 葡萄糖醛酸和抗坏血酸中的任意一种。
所述磺酸为甲磺酸、 苯磺酸、 对甲苯磺酸和樟脑磺酸中的任意一种。
所述酸性氨基酸为谷氨酸和天冬氨酸中的任意一种。
所述有机酸为醋酸、 马来酸、 琥珀酸、 苹果酸、 乳酸、 酒石酸、 甲磺酸、 对甲苯磺酸、 谷氨酸和天冬氨酸中的任意一种， 效果较好。
所述的苦柯胺 Β盐中的酸广泛选自多种无机酸和 /或有机酸，主要是从医药上允许使用的 各类酸中分别选取 2~3个具有代表性的酸对制备苦柯胺 Β盐的共性问题进行说明， 包括从无 机酸中的无氧酸中选取盐酸和氢溴酸， 含氧酸中选取硫酸和磷酸， 有机酸中的羧酸中选取醋 酸、 马来酸和琥珀酸， 羟基酸中选取苹果酸、 乳酸和酒石酸， 磺酸中选取甲磺酸和对甲苯磺 酸， 酸性氨基酸中选取谷氨酸和天冬氨酸。 虽然申请人的实验只显示了这四种无机酸和十种 有机酸的实验结果， 但是其他无机酸和 /或有机酸 （包括本发明已例举的和未例举的酸）均是 可以相同方式制备苦柯胺 Β盐。
所述的使用苦柯胺 Β 盐和包含苦柯胺 Β 盐的药物组合物制备的预防和治疗脓毒症的药 物， 可经胃肠道给药， 如以散剂、 片剂、 颗粒剂、 胶囊剂、 溶液剂、 乳剂、 混悬剂等剂型给 药； 或非经胃肠道给药， 如注射给药， 腔道给药， 粘膜给药等方式给药。 对成人而言， 用药 量以每公斤体重每天 0.1~15mg为宜， 用药方式可以为一天一次或多次。
苦柯胺 B盐的制备方法， 是以 3,4-二甲氧基苯丙酸 （或 3,4-二羟基苯丙酸） 和丁二胺为 原料， 通过一系列化学反应合成获得， 具体如下：
( 1 ) 取下式中的化合物 I与氢溴酸在 100~160°C反应， 生成化合物 II， 化合物 I： 氢溴 酸的当量比为 1 : 2-5；
Figure imgf000006_0001
( I ) ( II )
(2)将化合物 II溶于 Ν, Ν-二甲基甲酰胺中， 使反应体系处于 Ν, Ν-二甲基甲酰胺溶液环 境中， 加入碳酸钾和苄氯， 60~100°C反应， 生成化合物 III， 化合物 Π : 碳酸钾： 苄氯的当量 比为 1: 3-6： 3-5；
Figure imgf000006_0002
(III)
(3) 将化合物 III加入氢氧化钠溶液中， 加入甲醇， 使反应体系处于甲醇溶液环境中，
40~90°C反应， 生成化合物 IV， 化合物 III： 氢氧化钠的当量比为 1: 1-3；
Figure imgf000006_0003
( IV)
(4) 将化合物 IV溶解于二氯甲烷中， 加入 N, N-二甲基甲酰胺， 使反应体系处于二氯甲 烷和 Ν, Ν-二甲基甲酰胺混合溶液环境中， 加入二氯亚砜， 45~65°C反应， 生成化合物 V， 化 合物 IV： 二氯亚砜的当量比为 1: 1-2；
Figure imgf000006_0004
( V )
(5) 将氢氧化钠溶液加入化合物 VI中， 加入二碳酸二叔丁酯的乙醇溶液， 室温下反应， 生成化合物 VL 氢氧化钠： 化合物 VI： 二碳酸二 2： 1： 0.5-1；
Figure imgf000006_0005
(VI) (VD)
(6)将化合物 VD溶解于甲醇中， 使反应体系处于甲醇溶液环境中， 加入丙烯腈的甲醇溶 液， 室温下反应， 生成化合物 ， 化合物 VD: 丙烯腈的当量比为 1: 1-2；
NC NHBoc ( ）
(7)在化合物 VIII中加入四氢呋喃和三乙胺， 使反应体系处于四氢呋喃和三乙胺混合溶液 环境中， 加入氯甲酸苄酯的四氢呋喃溶液， 室温下反应， 生成化合物 IX， 化合物 ： 氯甲酸 苄酯的当量比为 1: 1-2；
Figure imgf000007_0001
( IX)
(8)取化合物 IX于高压釜中， 加入饱和的氨气的甲醇溶液至完全溶解， 加入相当于化合 物 IX质量 10~50%的雷尼镍， 换气， 使体系处于 1~10 MPa的氢气压力下， 35~50°C反应， 生 成化合物 X；
NHBoc
( X )
(9)将化合物 X溶解于二氯甲烷中， 加入三乙胺， 使反应体系处于二氯甲烷和三乙胺混 合溶液环境中， 于 0°C以下将化合物 V的二氯甲烷溶液加入其中， 反应生成化合物) (1， 化合
Figure imgf000007_0002
( XI)
( 10) 将化合物) (I溶解于二氯甲烷中， 使反应体系处于二氯甲烷溶液环境中， 加入三氟 乙酸， 室温下反应， 生成化合物 ΧΠ， 化合物 XI： 三氟乙酸的当量比为 1: 2-5；
Figure imgf000007_0003
(ΧΠ)
( 11 ) 将化合物 ΧΠ溶于甲醇中， 加入三乙胺， 使反应体系处于甲醇和三乙胺的混合溶液 环境中， 升温至 50~80°C， 加入丙烯腈的甲醇溶液， 降至室温反应， 生成化合物 XIII， 化合 物) (Π: 丙烯腈的当量比为 1: 1-2；
Figure imgf000008_0001
(XIII)
(12) 将化合物 XIII溶解于二氯甲烷中， 加入三乙胺， 使反应体系处于二氯甲烷和三乙 胺混合溶液环境中， 于 0°C以下将化合物 V的二氯甲烷溶液加入其中， 反应生成化合物 XIV， 化合物 XIII： 化合物 V的当量比为 1: 1-1.5；
Figure imgf000008_0002
(XIV)
(13) 取化合物 XIV于高压釜中， 加入饱和的氨气的甲醇溶液与四氢呋喃的混合溶液至 完全溶解， 使反应体系处于该溶液环境中， 加入相当于化合物 XIV质量 10~50%的雷尼镍， 换 气， 使体系处于 l~10MPa的氢气压力下， 35~50°C反应， 生成化合物 XV；
Figure imgf000008_0003
(XV)
(14) 将化合物 XV与上述的任意一种酸置于高压釜中， 加入甲醇、 四氢呋喃与水的混 合溶液至完全溶解，使反应体系处于该溶液环境中，加入相当于化合物 XV质量 10~30%的钯 碳， 换气， 使反应体系处于 l~10MPa的氢气压力下， 25~45°C反应， 生成苦柯胺 B盐， 化合 物 XV： 酸的当量比为 1: 1~8。
苦柯胺 B盐的药物组合物， 包含上述的苦柯胺 B盐作为活性成分和药学上可接受的载体 和 /或稀释剂。
苦柯胺 B盐在制备预防和治疗脓毒症药物中的应用。
苦柯胺 B盐的药物组合物在制备预防和治疗脓毒症药物中的用途。
经申请人实验证明， 上述合成反应苦柯胺 B盐的收率为 15%。
本发明所述的苦柯胺 B盐的药物组合物， 包含苦柯胺 B盐作为活性成分和药学上可接受 的载体和 /或稀释剂。 本发明所述的苦柯胺 B盐可以用于制备预防和治疗脓毒症药物。
申请人通过药理活性实验显示：
( 1 ) 苦柯胺 B盐能与 LPS的活性中心 lipid A结合；
(2) 苦柯胺 B盐能在体外以剂量依赖的方式中和 LPS;
(3) 苦柯胺 B盐能以剂量依赖的方式分别抑制 LPS和 CpG DNA诱导 RAW264.7细胞 释放炎症介质。
本发明使用苦柯胺 B盐和包含苦柯胺 B盐的药物组合物， 治疗脓毒症的作用机制新颖， 能同时拮抗介导脓毒症的多个 PAMPs,不同于现有的糖皮质激素、胰岛素、抗炎症介质药物、 抗凝药物、 抗 LPS多肽及 lipidA单抗等药物； 疗效好， 能够通过同时拮抗多个病原分子从而 显著抑制其诱导的炎症反应， 为脓毒症的治疗提供了一种新的手段。
本发明广泛选取多种无机酸和 /或有机酸对制备苦柯胺 B盐的共性问题进行说明，化学和 药学领域的技术人员可以理解， 使用同类的无机酸和 /或有机酸均可以相同的方式， 通过化学 领域熟知的方法制备苦柯胺 B盐。 本领域技术人员亦可理解， 其中的苦柯胺 B可通过常规植 物化学方法从植物中提取、 分离和纯化获得。 因此应当说明， 用其他无机酸和 /或有机酸替代 本发明列举的无机酸和 /或有机酸， 以及以天然存在的或化学合成的苦柯胺 B为对象进行基于 本发明设计思想的结构修饰和改造均应属于本发明的技术方案内容和专利保护范围， 本领域 技术人员在本说明的启示下对本发明实施所作的任何变动均在本申请的权利要求范围之内。 附图说明
图 1为苦柯胺 B盐与 lipidA的结合反应。 其中， A是苦柯胺 B苹果酸盐、 琥珀酸盐、 乳 酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸盐、 盐酸盐和硫酸盐的实验结果， B是苦柯胺 B对甲苯磺酸盐、 谷 氨酸盐、 醋酸盐、 马来酸盐、 天冬氨酸盐、 氢溴酸盐和磷酸盐的实验结果；
图 2为苦柯胺 B盐在体外中和 LPS。其中， A是苦柯胺 B苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸盐、 盐酸盐和硫酸盐的实验结果， B是苦柯胺 B对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐、 醋酸盐、 马来酸盐、 天冬氨酸盐、 氢溴酸盐和磷酸盐的实验结果；
图 3为苦柯胺 B盐抑制 LPS诱导 RAW264.7细胞释放炎症介质。 其中， A， B， C， D， E， F, G， H， I和 J分别为苦柯胺 B苹果酸盐、 琥珀酸盐、 乳酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸盐、 对甲苯磺酸盐、 谷氨酸盐、 醋酸盐、 盐酸盐和硫酸盐的实验结果；
图 4为苦柯胺 B盐抑制 CpG DNA诱导 RAW264.7细胞释放炎症介质。 其中， A， B， C， D， E， F, G， H， I和 J分别为苦柯胺 B苹果酸盐、 琥珀酸盐、 乳酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸 盐、 对甲苯磺酸盐、 谷氨酸盐、 醋酸盐、 盐酸盐和硫酸盐的实验结果。 图 5为苦柯胺 B盐酸盐、 甲磺酸盐、 对甲苯磺酸盐和苯磺酸盐对脓毒症模型小鼠的保护 作用。 具体实施方式
LPS和 CpG DNA是导致脓毒症发病的关键致病因子， 药物对 LPS和 CpG DNA的拮抗 反映了其对脓毒症的防治作用。
以下实施例是对本发明的详细说明， 特别优选药用性质成熟的苦柯胺 B苹果酸盐、 琥珀 酸盐、 乳酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸盐、 对甲苯磺酸盐、 谷氨酸盐、 醋酸盐、 盐酸盐、 硫酸盐、 马来酸盐、 天冬氨酸盐、 氢溴酸盐、 磷酸盐和苯磺酸盐进行说明。 应当理解， 以下所述仅为 本发明的较佳实施例， 其不以任何形式限制本发明。 应当说明， 如果不脱离本发明的精神和 范围， 对本发明进行修改或者等同替换的， 均应涵盖在本发明的权利要求的保护范围当中。
若未经特别说明， 本文中所用试剂均为分析纯。
若未经特别说明， 在文中下列英文缩写均具有所述中文含义：
Figure imgf000010_0001
M 摩尔 /升
arc seconds 弧秒
实施例 1 : 苦柯胺 B苹果酸盐的合成
1.1 实验方法：（1 )称取 50 g化合物 fl溶于 100 ml氢溴酸（浓度 40%)中，加热至 O'C 反应。 TLC监测， 反应完全之后， 直接冷却可见黄色晶体析出， 抽滤， 用少量石油醚洗涤， 可得黄色固体化合物 Ώ 40 go将 40 g化合物 Ώ溶于 120 ml DMF中，加入 116 g碳酸钾及 86 ml卞氯升温至 8CTC反应。 TLC监测， 反应完全之后， 直接过滤， 乙酸乙酯萃取， 水洗， 饱 和食盐水洗涤， 无水硫酸钠干燥， 抽滤， 浓缩得化合物 β。 将 14.4 g氢氧化钠溶解于 80 ml 水中， 将 85 g化合物 β加入其中， 再加入 80 ml的甲醇， 升温至 90°C回流反应。 TLC监测， 反应完全之后， 旋转蒸发干， 倾入烧杯中， 加入浓 HC1至强酸性， 过滤， 收集滤饼， 干燥可 得银黄色化合物 f 60 g, 收率 69%, 化学反应方程式如下所示：
Figure imgf000011_0001
(2 )称取 20 g丁二胺 （化合物 a)于 500 ml 圆底烧瓶中， 加入 28%的氢氧化钠溶液 23 ml, 待溶解完全之后，，室温搅拌下缓慢滴入浓度为 12.5% 的 (80 )20 乙醇溶液 200 ml, 待 滴加完全之后， 室温搅拌反应。 TLC监测， 反应完全之后， 浓缩旋转蒸发干乙醇， DCM萃 取多次直至产品萃取完全， 合并有机层， 饱和食盐水洗涤， 无水硫酸钠干燥， 静置， 抽滤， 浓缩得无色油状 b 13.7 g， 收率 64%, 化学反应方程式如下所示：
Figure imgf000011_0002
( 3 )称取 27 g化合物 b溶解于 60 ml 甲醇中， 于窒温搅拌下滴入 12 ml丙烯腈与 20 ml 甲醇的混合溶液， 待滴加完全之后， 室温搅拌反应。 TLC监测， 反应完全之后， 浓缩旋转蒸 发干， 即得
HoN
Figure imgf000011_0003
替换页 （细则第 26条) (4) 称取 30 g化合物 c于 250 ml圆底烧瓶中， 加入 80 ml THF及 26 ml三乙胺， 室温 搅拌下滴入 21 ml Cbz-Cl与 50 ml THF的混合溶液， 待滴加完全之后， 室温搅拌反应。 TLC 监测， 反应完全之后， 浓缩旋转蒸发干有机溶剂， 乙酸乙酯萃取， l mol/LHCl溶液洗涤三次， 水洗， 饱和食盐水洗涤， 无水硫酸钠干燥， 静置， 抽滤， 浓缩得淡黄色油状物。 待浓縮后加 入部分石油醚搅拌可有大量白色固体析出， 抽滤， 白色固体用石油醚洗涤， 得风干的白色同 体 d4 .， 收率 86%, 化学反应方程式如下所示-
NHBoc
Figure imgf000012_0001
(5) 称取 15 g化合物 d于高压釜中， 加入 150 ml饱和的氨气的甲醇溶液溶解至完全澄 清，力 Π入 4.5 gRaneyNi， 换气， 使体系处于 5~10 MPa的氢气压力下， 升温至 50Γ搅拌反应。
TLC监测， 反应完全之后， 硅藻土抽滤， 浓缩得蓝色的油状物 e 13.8 g， 收率 92%, 化学反 应方程式如下所示：
Figure imgf000012_0002
(6) 称取 13.1 g化合物 f溶解于 40ml无水 DCM中， 加入 0.1 ml DMF, 于室温搅拌下 滴入 3.9 ml二氯亚砜，待滴加完毕后，升温至 45〜65°C回流搅拌反应 5h，浓缩旋转蒸发干 DCM, 得化合物 f 0， 在新制的化合物 f 0中加入无水甲苯旋转蒸发干以除去多余的二氯亚砜。 另称 取 13.8 g化合物 e溶解于 50ml无水 DCM中，加入 12ml的三乙胺，于 0°C的条件下将新制的 化合物 f0的 DCM溶液（浓度 10%) 40 ml缓慢滴入其中， TLC监测， 反应完全之后， 抽滤， 浓缩， 用乙醚萃取， 依次用饱和的碳酸钾溶液 3次、 l mol/LHCl溶液、 水、 饱和的食盐水洗 涤， 无水硫酸钠干燥， 静置， 抽滤旋干得红色油状物 g 23 g， 收率 88%, 化学反应方程式如 下所示：
Figure imgf000012_0003
9
(7)称取 13 g化合物 g溶解于 30 ml的 DCM中，加入 5 ml TFA,室温搅拌。 TLC监测，
10 替换页 （细则第 26条） 反应完全之后， 浓缩旋转蒸发干 DCM后， 加入乙酸乙酯萃取， 水洗， 饱和食盐水洗涤， 无 水硫酸钠干燥， 静置， 抽滤， 浓縮得红色油状物 h 11 g, 收率 85%， 化学反应方程式如下所 示： ？ 0
jl J H I H ^
BnO Cbz DCM, rt BnO^^ Cbz
g h
( 8) 称取 18.1 g化合物 h溶于 40 ml MeOH中， 加入 8 ml三乙胺， 升温至 60'C， 在搅 拌的过程中缓慢滴入 2.1 ml丙烯腈与 15 ml甲醇的混合溶液。 待滴加完毕后， 逐渐降至室温 搅拌反应。 TLC监测， 反应完全之后， 直接浓缩旋转蒸发干除掉有机溶剂， 得化合物 i, 化 学反应方程式如下所示-
Figure imgf000013_0001
(9)称 10.5 g取化合物 f于 100 ml的圆底烧瓶中,加入 35 ml无水 DCM，加入 2滴（0.1 ml) DMF， 再缓慢滴加 2.6ml的二氯亚砜， 待滴加完后升温至 45~65°C回流反应 4h， 浓缩旋 转蒸发千 DCM， 得化合物 f0， 加入干燥的甲苯于新制的化合物 f0中旋转蒸发干以除去多余 的二氯亚砜。 另称取 19.6 g化合物 i溶解于 50 ml无水 DCM中， 加入 12 ml三乙胺， 于 0Ό 的条件下将新制的化合物 f0的 DCM溶液（浓度 10%)缓慢滴入其中， TLC监测， 反应完全 之后， 抽滤， 浓缩， 用乙酸乙酯萃取， 依次用饱和的碳酸钾溶液 3次、 l mol/LHCl溶液、水、 饱和的食盐水洗涤， 无水硫酸钠干燥， 静置， 抽滤， 旋转蒸发干得红色油状物。 将此红色油 状物采用硅胶柱层析法进行分离， 以 200〜300目的硅胶为固定相， 乙酸乙酯： 石油醚（2: 1 ) 为流动相， 收集全部流出液并浓缩至干， 可得化合物 j 21 g， 收率 79%， 化学反应方程式如下
Figure imgf000013_0002
( 10)称取 20 g化合物 j于高压釜中，加入饱和的氨气的甲醇溶液: THF为 3:1的溶液 400 ml, 换气使反应体系处于 l~2 MPa下， 50°C搅拌反应。 TLC监测， 反应完全之后， 抽滤， 浓
替换页 （细则第 26条) 缩即得蓝色的油状化合物 k 18.6 ， 收率 93%， 化学反应方程式如下所示:
Figure imgf000014_0001
( 11 ) 称取化合物 k 1 g及苹果酸 0.8 g于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1 : 1的溶液 30 ml溶解澄清后， 加入 0.2 g Pd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 10 MPa的氢气压力下， 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测， 反应完全之后，抽滤，浓縮至干得深绿色的半固体， 加入乙醇 30 ml, 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得深绿色固 体粉末 407 mg， 化学反应方程式如下所示：
Figure imgf000014_0002
1.2 实验结果： 得到深绿色固体粉末 407 mg。 紫外吸收光谱： ^ax nm = 280 (甲醇）； 质 谱： [M+H]+ m/z 531.36； 核磁共振氢谱 1H-NMR (400 MHz, D20): δ (ppm) 6.88-6.73 (m, 6H 4.41(s, 1H)， 3.43-3.23 (m, 6H), 2.86-2.59 (m, 16H), 1.87-1.41 (m, 8H)， 鉴定为苦柯胺 B苹果酸 盐， 化学结构
Figure imgf000014_0003
实施例 2 : 苦柯胺 B琥珀酸盐的合成
12 替换页 （细则第 26条） 2.1 实验方法： 步骤（1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10)；
(11)称取化合物 kl g及琥珀酸 0.71 g于高压釜中，加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的溶液 30 ml溶解澄清后， 加入 0.2gPd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 10 MPa的氢气压力下， 升温至 45Ό条件下反应， .TLC薄层监测，反应完全之后， 抽滤，浓縮至干得墨绿色的半固体, 加入乙醇 30 ml, 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得墨绿色固 体粉末 365 ：
Figure imgf000015_0001
2.2 实验结果： 得到墨绿色粉末状固体 365 mg。 紫外吸收光谱：
Figure imgf000015_0002
280 (甲醇）; 质谱： [ +m/Z 531.36， 鉴定为苦柯胺 B琥珀酸盐， 化学结构如下所示：
Figure imgf000015_0003
实施例 3: 苦柯胺 B乳酸盐的合成
3.1实验方法： 步骤 （1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10)；
(11)称取化合物 k 1 g及乳酸 0.5 ml于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的溶液 3Q ml溶解澄清后， 加入 0.2.gPd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 ίθ MPa的氢气压力下， 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测， 反应完全之后， 抽滤， 浓缩至干得黄色的半固体， 加入乙醇 30ml， 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得黄色固体 粉末 340mg， 化学反应方程式如下所示：
13 替换页 （细则第 26条) Pd/C,H2, lactic acid
MeOHATHF/H20
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0002
3.2 实验结果： 得到黄色粉末状固体 340 mg。 紫外吸收光谱： ；^axnm = 280 (甲醇）； 质 谱： [M+H]+m/z 531.36, 鉴定为苦柯胺 B乳酸盐， 化学结构如下所示：
Figure imgf000016_0003
实施例 4: 苦柯胺 B酒石酸盐的合成
4.1 实验方法： 步骤 （1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10)；
(11) 称取化合物 k 1 g及酒石酸 0.9 g于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的溶液 30 ml溶解澄清后， 加入 0.2gPd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 10 MPa的氢气压力下， 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测， 反应完全之后， 抽滤， 浓缩至干得黄色的半固体， 加入乙醇 30ml， 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得黄色固体 粉末 383m
Figure imgf000016_0004
4.2 实验结果： 得到黄色粉末状固体 383 mg。 紫外吸收光谱： axnm = 280 (甲醇）； 质 谱： [M+H]+m/z 531.36， 鉴定为苦柯胺 B酒石酸盐， 化学结构如下所示：
Figure imgf000017_0001
实施例 5: 苦柯胺 B甲磺酸盐的合成
5.1 实验方法： 步骤 （1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10)；
(11)称取化合物 k 1.0 g及甲磺酸 0.58 g于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的溶 液 30 ml溶解澄清后， 加入 0.2 g Pd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 10 MPa的氢气压力下， 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测， 反应完全之后， 抽滤， 浓缩至干得淡黄色的半固体， 加入乙醇 30ml， 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得淡黄色固 体粉末
Figure imgf000017_0002
5.2 实验结果： 得到淡黄色粉末状固体 355 mg。 紫外吸收光谱： axnm = 280 (甲醇）; 质谱： [M+H]+
Figure imgf000017_0003
实施例 6: 苦柯胺 B对甲苯磺酸盐的合成
6.1 实验方法： 步骤 （1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10)；
(11)称取化合物 k 1 g及对甲苯磺酸盐 1 g于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的 溶液 30 ml溶解澄清后， 加入 0.2gPd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 10 MPa的氢气压力 下， 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测， 反应完全之后， 抽滤， 浓缩至干得淡黄色的半 固体， 加入乙醇 30ml， 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得淡 黄色固体粉末 396 mg， 化学反应方程式如下所示： acid
Figure imgf000018_0001
6.2 实验结果： 得到淡黄色粉末状固体 396 mg。 紫外吸收光谱： ；^axnm = 280 (甲醇）; 质谱： [M+H+m/z 531.36， 鉴定为苦柯胺 B对甲苯磺酸盐， 化学结构如下所示：
Figure imgf000018_0002
实施例 7: 苦柯胺 B谷氨酸盐的合成
7.1 实验方法： 步骤 （1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10)；
(11)称取化合物 k 1.0 g及谷氨酸 0.88 g于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的溶 液 30 ml溶解澄清后， 加入 0.2 g Pd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 10 MPa的氢气压力下， 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体， 加入乙醇 30ml， 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得淡黄色固 体粉末 380 m ， 化学反应方程式如下所示：
Figure imgf000018_0003
7.2 实验结果： 得到淡黄色粉末状固体 380 mg。 紫外吸收光谱： ；^axnm = 280 (甲醇）; 质谱： [M+H]+m/z 531.36， 鉴定为苦柯胺 B谷氨酸盐， 化学结构如下所示：
Figure imgf000019_0001
实施例 8: 苦柯胺 B醋酸盐的合成
8.1 实验方法： 步骤 （1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10)；
(11)称取化合物 k 1.0 g及醋酸 0.4 ml于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的溶液 30 ml溶解澄清后， 加入 0.2gPd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 10 MPa的氢气压力下， 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体， 加入乙醇 30ml， 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得淡黄色固 体粉末 330 m ， 化学反应方程式如下所示：
Figure imgf000019_0002
8.2 实验结果： 得到淡黄色粉末状固体 330 mg。 紫外吸收光谱： ；^axnm = 280 (甲醇）; 质谱： [M+H]+m/z 531.36， 鉴定为苦柯胺 B谷氨酸盐， 化学结构如下所示：
Figure imgf000019_0003
实施例 9: 苦柯胺 B盐酸盐的合成
9.1 实验方法： 步骤 （1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10)；
(11) 称取化合物 k 1 g及盐酸 0.64 ml于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的溶液 30 ml溶解澄清后， 加入 0.2gPd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 10 MPa的氢气压力下， 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测， 反应完全之后， 抽滤， 浓缩至干得黄色的半固体， 加入乙醇 30ml， 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得黄色固体 粉末 32
Figure imgf000020_0001
9.2 实验结果： 得到黄色粉末状固体 320 mg。 紫外吸收光谱： axnm = 280 (甲醇）； 质 谱： [M+H]+m/z531.36， 鉴定为苦柯胺 B盐酸盐， 化学结构如下所示：
Figure imgf000020_0002
实施例 10: 苦柯胺 B硫酸盐的合成
10.1 实验方法： 步骤 （1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10);
(11)称取化合物 k 1.0 g及硫酸 0.4 ml于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的溶液 30 ml溶解澄清后， 加入 0.2gPd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 10 MPa的氢气压力下， 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体， 加入乙醇 30ml， 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得淡黄色固 体粉末 355 mg, 化学反应方程式如下所示：
Figure imgf000020_0003
10.2 实验结果： 得到淡黄色粉末状固体 355 mg。 紫外吸收光谱： maxnm = 280 (甲醇）;
18 替换页 （细则第 26条) 质谱： [M+H]+m/z531.36， 鉴定为苦柯胺 B硫酸盐， 化学结构如下所示:
Figure imgf000021_0001
实施例 11: 苦柯胺 B马来酸盐的合成
11.1 实验方法： 步骤 （1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10)；
(11) 称取化合物 k 1.0 g及马来酸 0.7 g于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的溶 液 30ml溶解澄清后， 加入 0.2gPd/C催化剂，换气，使反应体系处于 lOMPa的氢气压力下, 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测，. 反应完全之后， 抽滤， 浓缩至千得黄色的半固体, 加入乙醇 30ml， 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得黄色固体 粉末 36
醇）； 质 if:
Figure imgf000021_0002
实施例 12: 苦柯胺 B天冬氨酸盐的合成
12.1 实验方法： 步骤 （1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10)；
(11)称取化合物 k 1.0 g及天冬氨酸 0.8 g于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的 溶液 30 ml溶解澄清后， 加入 0.2gPd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 10 MPa的氢气压力 下， 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测， 反应完全之后， 抽滤， 浓缩至干得淡黄色的半 固体， 加入乙醇 30ml， 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得淡
19 替换页 （细则第 26条） 黄色固
Figure imgf000022_0001
12.2 实验结果： 得到淡黄色粉末状固体 374 mg。 紫外吸收光谱： ；^axnm = 280 (甲醇）; 质谱： [M+H+m/z 531.36， 鉴定为苦柯胺 B天冬氨酸盐， 化学结构如下所示：
Figure imgf000022_0002
实施例 13: 苦柯胺 B氢溴酸盐的合成
13.1 实验方法： 步骤 （1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10)；
(11)称取化合物 k 1.0 g及氢溴酸 0.5 ml于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的溶 液 30 ml溶解澄清后， 加入 0.2 g Pd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 10 MPa的氢气压力下， 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体， 加入乙醇 30ml， 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得淡黄色固 体粉末 345mg， 化学反应方程式如下所示： acid
Figure imgf000022_0003
13.2 实验结果： 得到淡黄色粉末状固体 345 mg。 紫外吸收光谱： ；^axnm = 280 (甲醇）; 质谱： [M+H]+m/z 531.36， 鉴定为苦柯胺 B氢溴酸盐， 化学结构如下所示：
Figure imgf000023_0001
实施例 14: 苦柯胺 B磷酸盐的合成
14.1 实验方法： 步骤 （1) ~ (10) 同实施例 1步骤 （1) ~ (10)；
(11)称取化合物 k 1.0 g及磷酸 0.4 ml于高压釜中， 加入 MeOH:THF:水为 3:1:1的溶液 30 ml溶解澄清后， 加入 0.2gPd/C催化剂， 换气， 使反应体系处于 10 MPa的氢气压力下， 升温至 45°C条件下反应， TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体， 加入乙醇 30ml， 超声震荡， 静置沉降， 倾去上层清液， 反复多次， 最后抽滤， 可得淡黄色固 体粉末 354mg， 化学反应方程式如下所示： id
Figure imgf000023_0002
14.2 实验结果： 得到淡黄色粉末状固体 354 mg。 紫外吸收光谱： ；^axnm = 280 (甲醇）; 质谱： [M+H]+m/z 531.36， 鉴定为苦柯胺 B磷酸盐， 化学结构如下所示：
Figure imgf000023_0003
实施例 15: 苦柯胺 B盐与 lipid A的亲和力测定
15.1 实验方法： 参照申请者本人的中国专利 "一种从中草药中筛选、 分离的活性组分或 活性物质在制备治疗脓毒症药物中的应用" （中国专利号 ZL 200510070677.3) 中所述方法进 行实验， 主要包括以下步骤：
(1)按照 IAsys plus亲和传感器仪器使用说明中有关脂质的包被操作说明， 将 lipidA包 被于非衍生型样品池上。 其中， lipid A疏水侧链与样品池结合， 亲水端游离于外侧， 作为发 生结合作用的靶点。
(2) 取苦柯胺 B盐酸盐、 氢溴酸盐、 硫酸盐、 磷酸盐、 醋酸盐、 马来酸盐、 琥珀酸盐、 苹果酸盐、 乳酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸盐、 对甲苯磺酸盐、 谷氨酸盐和天冬氨酸盐各 1 mg， 分别加 PBS (0.01 M, pH 7.4) 1 ml充分溶解；
(3) 取上述溶液各 5 μΐ分别加入已预先包被有 lipid A的亲和传感器样品池中 （样品池 含 45 l PBS)， 进行反应；
(4) 结合反应时间 3分钟， 记录结合反应曲线；
(5) 以 50 ^ PBS冲洗样品池 3次， 记录解离曲线；
(6) 以 0.1 M HC1冲洗样品池 3次， 记录再生曲线。
15.2 实验结果： 各种苦柯胺 B盐均能与 lipid A发生结合， 结合反应曲线如图 1所示。 其中， 图 1.A是苦柯胺 B苹果酸盐、 琥珀酸盐、 乳酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸盐、 盐酸盐和硫 酸盐的实验结果； 图 1.B是苦柯胺 B对甲苯磺酸盐、 谷氨酸盐、 醋酸盐、 马来酸盐、 天冬氨 酸盐、 氢溴酸盐和磷酸盐的实验结果。
实施例 16: 苦柯胺 B盐体外中和 LPS实验
16.1 实验方法： 按照 32 Well Kinetic Tube Reader (ΑΉ321-06)内毒素检测仪操作说明进行 实验， 主要包括以下步骤：
( 1 ) 取苦柯胺 B盐酸盐、 氢溴酸盐、 硫酸盐、 磷酸盐、 醋酸盐、 马来酸盐、 琥珀酸盐、 苹果酸盐、 乳酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸盐、 对甲苯磺酸盐、 谷氨酸盐和天冬氨酸盐， 分别以 无热原水配置成 20 μΜ的溶液；
(2)取上述溶液 100 μΐ分别与等体积的 LPS溶液（0.25 ng/ml)混合， 同时设立对照组， 对照组为 100 μΐ无热原水与等体积的 LPS溶液 （0.25 ng/ml) 混合， 37°C孵育 30分钟， 然后 各组取 100 μ1， 分别加入含有 ΙΟΟμΙ鲎试剂溶液的检测管中， 按照 32 Well Kinetic Tube Reader (ΑΉ321-06)细菌内毒素测定系统操作说明， 采用动态浊度法检测各组 LPS值， 每个浓度重复 检测 3次；
16.2 实验结果： 各种苦柯胺 B盐均能在体外中和 LPS, 结果如图 2所示。 其中， 图 2.A 是苦柯胺 B苹果酸盐、 琥珀酸盐、 乳酸盐、 酒石酸盐、 甲磺酸盐、 盐酸盐和硫酸盐的实验结 果； 图 2.B是苦柯胺 B对甲苯磺酸盐、 谷氨酸盐、 醋酸盐、 马来酸盐、 天冬氨酸盐、 氢溴酸 盐和磷酸盐的实验结果。
实施例 17: 苦柯胺 B盐抑制 LPS诱导 RAW264.7细胞释放炎症介质的实验
17.1 实验方法：采用 DMEM培养液将 RAW264.7细胞稀释至 lxl06/ml，加入 96孔板（200 μΐ/孔）， 在 37°C、 体积分数为 5%的 C02条件下孵育 4小时， 贴壁后更换细胞上清为 200 μΐ 无血清的 DMEM培养液， 然后加入 LPS (终浓度 100 ng/ml), 同时分别加入终浓度为 0， 50， 100， 200 μΜ的各种苦柯胺 B盐 （包括苦柯胺 Β苹果酸盐、 琥珀酸盐、 乳酸盐、 酒石酸 盐、 甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐、醋酸盐、盐酸盐和硫酸盐）， 空白对照组（Medium) 不加 LPS, 继续孵育 4小时， 取上清， 按照 ELISA试剂盒操作说明检测 TNF-ct的浓度。
17.2 实验结果：各种苦柯胺 B盐均能抑制 LPS诱导 RAW264.7细胞释放炎症介质 TNF-ct， 实验结果如图 3所示。 其中， 图 3.A为苦柯胺 B苹果酸盐的实验结果； 图 3.B为苦柯胺 B琥 珀酸盐的实验结果； 图 3.C为苦柯胺 B乳酸盐的实验结果； 图 3.D为苦柯胺 B酒石酸盐的实 验结果； 图 3.E为苦柯胺 B甲磺酸盐的实验结果； 图 3.F为苦柯胺 B对甲苯磺酸盐的实验结 果； 图 3.G为苦柯胺 B谷氨酸盐的实验结果； 图 3.H为苦柯胺 B醋酸盐的实验结果； 图 3.1 为苦柯胺 B盐酸盐的实验结果； 图 3J为苦柯胺 B硫酸盐的实验结果。
实施例 18: 苦柯胺 B盐抑制 CpG DNA诱导 RAW264.7细胞释放炎症介质的试验
18.1 实验方法：采用 DMEM培养液将 RAW264.7细胞稀释至 lxl06/ml，加入 96孔板（200 μΐ/孔）， 在 37°C、 体积分数为 5%的 C02条件下孵育 4小时， 贴壁后更换细胞上清为 200 μΐ 无血清的 DMEM培养液， 然后加入 CpG DNA (终浓度 10 g/ml)， 同时分别加入终浓度为 0， 50， 100， 200 μΜ的各种苦柯胺 B盐 （包括苦柯胺 Β苹果酸盐、 琥珀酸盐、 乳酸盐、 酒石酸 盐、 甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐、醋酸盐、盐酸盐和硫酸盐）， 空白对照组（Medium) 不加 LPS, 继续孵育 4h， 取上清， 按照 ELISA试剂盒操作说明检测 TNF-ct的浓度。
18.2 实验结果： 各种苦柯胺 B盐均能抑制 CpG DNA诱导 RAW264.7细胞释放炎症介质 TNF-α, 实验结果如图 4所示。 其中， 图 4.A为苦柯胺 B苹果酸盐的实验结果； 图 4.B为苦 柯胺 B琥珀酸盐的实验结果； 图 4.C为苦柯胺 B乳酸盐的实验结果； 图 4.D为苦柯胺 B酒石 酸盐的实验结果； 图 4.E为苦柯胺 B甲磺酸盐的实验结果； 图 4.F为苦柯胺 B对甲苯磺酸盐 的实验结果； 图 4.G为苦柯胺 B谷氨酸盐的实验结果；图 4.H为苦柯胺 B醋酸盐的实验结果； 图 4.1为苦柯胺 B盐酸盐的实验结果； 图 4.J为苦柯胺 B硫酸盐的实验结果。
实施例 19: 苦柯胺 B盐对脓毒症模型小鼠的保护作用
19.1 实验方法： Balb/c小鼠， 19-21g， 雌雄各半， 一共 120只， 随机分为 6组， 每组 20 只， 分别为对照组、 抗生素给药组、 抗生素联合苦柯胺 B盐酸盐给药组、 抗生素联合苦柯胺 B甲磺酸盐给药组、 抗生素联合苦柯胺 B对甲苯磺酸盐给药组和抗生素联合苦柯胺 B苯磺酸 盐给药组。 小鼠采用麻醉机麻醉， 异氟烷输出浓度为 5%， 混合气体压力为 I MPa, 麻醉时间 约 5分钟。 采用盲肠结扎穿孔术 （CLP) 造模， 具体步骤为： 小鼠取仰卧位， 下腹部皮肤经 碘伏消毒后， 用眼科剪于腹白线中点下方 0.3 cm处向下逐层剪开皮肤、 肌层和腹膜 （切口长 度约 0.8 cm)。用眼科镊夹起肌层，直视下用眼科镊探查腹腔，将盲肠末端取出并置于腹壁外， 然后用 4号缝合线距盲肠末端 0.5cm处结扎。结扎后用 12号针垂直穿透盲肠 1孔， 并轻轻挤 出少许粪便， 最后将盲肠放回腹腔， 缝合。 对照组尾静脉注射 0.2 ml生理盐水； 给药组抗生 素 （舒氨西林） 给药剂量为 80 mg/kg， 于小鼠手术造模后 4小时尾静脉注射； 苦柯胺 B盐酸 盐、 甲磺酸盐、 对甲苯磺酸盐和苯磺酸盐的每次给药剂量均为 2.5 mg/kg， 分别于小鼠手术造 模后 0、 4、 12、 20、 28、 36、 44、 52、 60和 68小时尾静脉注射。 观察 7天内动物的一般状 态及死亡情况， 比较对照组和给药组之间的存活差异。
19.2 实验结果： CLP对照组小鼠 7天死亡率为 95%， 给予舒氨西林 （80 mg/kg) 小鼠的 存活率为 15%， 当采用苦柯胺 B盐与抗生素联合给药时， 苦柯胺 B盐酸盐和对甲苯磺酸盐能 将存活率提高至 20%， 苦柯胺 B苯磺酸盐可将存活率提高至 30%， 苦柯胺 B甲磺酸盐可将存 活率提高至 50%， 该结果表明苦柯胺 B盐酸盐、 甲磺酸盐、 对甲苯磺酸盐和苯磺酸盐对脓毒 症模型小鼠均具有保护作用， 其中， 苦柯胺 B甲磺酸盐效果最佳。 结果如图 5所示。

Claims

权 利 要 求 书
1. 一种苦柯胺 B盐， 于： 所述苦柯胺 B盐具有如下化学结构
Figure imgf000027_0001
其中， A为无氧酸或含氧酸的无机酸或羧酸或羟基酸或磺酸或酸性氨基酸的有机酸。
2. 根据权利要求 1所述的苦柯胺 B盐， 其特征在于： 所述无氧酸为盐酸和氢溴酸中的任 意一种。
3. 根据权利要求 1所述的苦柯胺 B盐， 其特征在于： 所述含氧酸为硫酸、 磷酸和硝酸中 的任意一种。
4. 根据权利要求 1所述的苦柯胺 B盐， 其特征在于： 所述无机酸为盐酸、 氢溴酸、 硫酸 和磷酸中的任意一种。
5. 根据权利要求 1所述的苦柯胺 B盐， 其特征在于： 所述羧酸为醋酸、 丙酸、 丁酸、 草 酸、 丙二酸、 琥珀酸、 己二酸、 苯甲酸、 苯丙酸、 肉桂酸、 硬脂酸、 三氟醋酸、 马来酸、 富 马酸、 烟酸和棕榈酸中的任意一种。
6. 根据权利要求 1所述的苦柯胺 B盐， 其特征在于： 所述羟基酸为苹果酸、 柠檬酸、 乳 酸、 羟基丁酸、 乳糖酸、 酒石酸、 扁桃酸、 葡萄糖酸、 葡萄糖醛酸和抗坏血酸中的任意一种。
7. 根据权利要求 1所述的苦柯胺 B盐， 其特征在于： 所述磺酸为甲磺酸、 苯磺酸、 对甲 苯磺酸和樟脑磺酸中的任意一种。
8. 根据权利要求 1所述的苦柯胺 B盐， 其特征在于： 所述酸性氨基酸为谷氨酸和天冬氨 酸中的任意一种。
9. 根据权利要求 1所述的苦柯胺 B盐， 其特征在于： 所述有机酸为醋酸、 马来酸、 琥珀 酸、 苹果酸、 乳酸、 酒石酸、 甲磺酸、 对甲苯磺酸、 谷氨酸和天冬氨酸中的任意一种。
10. 制备权利要求 1所述的苦柯胺 B盐的方法， 其特征在于有以下步骤：
( 1 ) 取下式中的化合物 I与氢溴酸在 100~160°C反应， 生成化合物 II， 化合物 I： 氢溴 酸的当量比为 1 : 2-5；
Figure imgf000027_0002
( I ) ( II )
(2)将化合物 II溶于 Ν, Ν-二甲基甲酰胺中， 使反应体系处于 Ν, Ν-二甲基甲酰胺溶液环 境中， 加入碳酸钾和苄氯， 60~100°C反应， 生成化合物 III， 化合物 Π : 碳酸钾： 苄氯的当量 比为 1: 3-6： 3-5；
Figure imgf000028_0001
(Ill)
(3) 将化合物 III加入氢氧化钠溶液中， 加入甲醇， 使反应体系处于甲醇溶液环境中，
•90°C反应， 生成化合物 IV， 化合物 III： 氢氧化钠的当量比为 1: 1-3；
Figure imgf000028_0002
(IV)
(4) 将化合物 IV溶解于二氯甲烷中， 加入 N, N-二甲基甲酰胺， 使反应体系处于二氯甲 烷和 Ν, Ν-二甲基甲酰胺混合溶液环境中， 加入二氯亚砜， 45~65°C反应， 生成化合物 V， 化 合物 IV： 二氯亚砜的当量比为 1: 1-2；
Figure imgf000028_0003
( V )
(5) 将氢氧化钠溶液加入化合物 VI中， 加入二碳酸二叔丁酯的乙醇溶液， 室温下反应， 生成化合物 VL 氢氧化钠： 化合物 VI： 二碳酸二 2： 1： 0.5-1；
Figure imgf000028_0004
(VI) (VD)
(6)将化合物 VD溶解于甲醇中， 使反应体系处于甲醇溶液环境中， 加入丙烯腈的甲醇溶 液， 室温下反应， 生成化合物 ， 化合物 VD: 丙烯腈的当量比为 1: 1-2；
H
( ）
(7)在化合物 中加入四氢呋喃和三乙胺， 使反应体系处于四氢呋喃和三乙胺混合溶液 环境中， 加入氯甲酸苄酯的四氢呋喃溶液， 室温下反应， 生成化合物 IX， 化合物 ： 氯甲酸 苄酯的当量比为 1: 1-2；
Cbz
NC^^Nv ^ 、NHBoc
( IX)
(8)取化合物 IX于高压釜中， 加入饱和的氨气的甲醇溶液至完全溶解， 加入相当于化合 物 IX质量 10~50%的雷尼镍， 换气， 使体系处于 1~10 MPa的氢气压力下， 35~50°C反应， 生 成化合物 X；
Figure imgf000029_0001
( X )
(9)将化合物 X溶解于二氯甲烷中， 加入三乙胺， 使反应体系处于二氯甲烷和三乙胺混 合溶液环境中， 于 0°C以下将化合物 V的二氯甲烷溶液加入其中， 反应生成化合物) (1， 化合 物 X： 化合物 V的当量比为 1: 1-1.5；
Figure imgf000029_0002
( XI)
( 10) 将化合物) (I溶解于二氯甲烷中， 使反应体系处于二氯甲烷溶液环境中， 加入三氟 乙酸， 室温下反应， 生成化合物 ΧΠ， 化合物 XI： 三氟乙酸的当量比为 1: 2-5；
Figure imgf000029_0003
(ΧΠ)
( 11 ) 将化合物 ΧΠ溶于甲醇中， 加入三乙胺， 使反应体系处于甲醇和三乙胺的混合溶液 环境中， 升温至 50~80°C， 加入丙烯腈的甲醇溶液， 降至室温反应， 生成化合物 XIII， 化合 物) (Π: 丙烯腈的当量比为 1: 1-2；
Figure imgf000029_0004
( XIII)
( 12) 将化合物 XIII溶解于二氯甲烷中， 加入三乙胺， 使反应体系处于二氯甲烷和三乙 胺混合溶液环境中， 于 0°C以下将化合物 V的二氯甲烷溶液加入其中， 反应生成化合物 XIV， 化合物 XIII： 化合物 V的当量比为 1: 1-1.5；
Figure imgf000030_0001
(13) 取化合物 XIV于高压釜中， 加入饱和的氨气的甲醇溶液与四氢呋喃的混合溶液至 完全溶解， 使反应体系处于该溶液环境中， 加入相当于化合物 XIV质量 10~50%的雷尼镍， 换 气， 使体系处于 l~10MPa的氢气压力下， 35~50°C反应， 生成化合物 XV；
Figure imgf000030_0002
(XV)
(14) 将化合物 XV与权利要求 2~9 中所述的任意一种酸置于高压釜中， 加入甲醇、 四 氢呋喃与水的混合溶液至完全溶解， 使反应体系处于该溶液环境中， 加入相当于化合物 XV 质量 10~30%的钯碳， 换气， 使反应体系处于 1~10 MPa的氢气压力下， 25~45°C反应， 生成 苦柯胺 B盐， 化合物 XV： 酸的当量比为 1: 1-8
11. 苦柯胺 B盐的药物组合物， 包含权利要求 1所述的苦柯胺 B盐作为活性成分和药学 上可接受的载体和 /或稀释剂。
12. 苦柯胺 B盐在制备预防和治疗脓毒症药物中的应用。
13. 苦柯胺 B盐的药物组合物在制备预防和治疗脓毒症药物中的用途。
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