WO2012057343A1 - Ｎａｄ（ｐ）ｈオキシダーゼ阻害剤、酸化ストレス疾患治療薬、酸化ストレス疾患治療方法及びスクリーニング方法 - Google Patents

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登與志 井口
涼一 ▲高▼▲柳▼
泰孝 前田
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Definitions

  • the present invention relates to an NAD (P) H oxidase inhibitor, an oxidative stress disease therapeutic agent, an oxidative stress disease therapeutic method, and a screening method.
  • NAD NAD
  • NAD (P) H oxidase transfers electrons from NAD (P) H to oxygen. As a result, active oxygen containing O 2 ⁇ and H 2 O 2 is produced.
  • NAD (P) H oxidase is frequently overexpressed and activated in tissues invaded in diseases other than infections. For this reason, the disease state is often aggravated by excessively produced active oxygen. Activation of NAD (P) H oxidase is a major cause of excessive oxidative stress in many diseases.
  • NAD (P) H oxidase Excessive activation of NAD (P) H oxidase can induce inflammation, promote tissue fibrosis and bone resorption, or antagonize the vital protective effect of nitric oxide in blood vessels. Are known. For this reason, inhibiting NAD (P) H oxidase is effective in the prevention and treatment of many diseases.
  • Patent Document 1 discloses diphenyleneiodonium (DPI) as a compound that inhibits NAD (P) H oxidase. DPI inhibits NAD (P) H oxidase by acting on the ⁇ subunit of NAD (P) H oxidase.
  • DPI diphenyleneiodonium
  • an angiotensin converting enzyme inhibitor disclosed in Patent Document 2 inhibits the production of angiotensin type 2 by an angiotensin converting enzyme.
  • an angiotensin converting enzyme inhibitor inhibits the activity of NAD (P) H oxidase.
  • DPI is known to inhibit the mitochondrial respiratory chain complex, and there are concerns about side effects when administered to living bodies.
  • an angiotensin converting enzyme inhibitor inhibits angiotensin converting enzyme in specific tissues such as lung, plasma and kidney.
  • An angiotensin converting enzyme inhibitor inhibits the activation of NAD (P) H oxidase in the state where angiotensin type 2 is excessively present. For this reason, application as an NAD (P) H oxidase inhibitor of an angiotensin converting enzyme inhibitor is restrict
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a highly versatile NAD (P) H oxidase inhibitor, an oxidative stress disease therapeutic agent, an oxidative stress disease therapeutic method, and a screening method. .
  • NAD (P) H oxidase is inhibited by activation of protein kinase A (PKA) in phagocytes (see Non-Patent Documents 2 and 3). It is known that PKA is activated by increasing intracellular cAMP concentration. Intracellular cAMP is produced from ATP by adenyl cyclase by activating the glucagon-like peptide (GLP-1) receptor (see Non-Patent Document 4).
  • GLP-1 glucagon-like peptide
  • NAD (P) H oxidase is inhibited by activating the GLP-1 receptor, thereby completing the present invention. It was.
  • the NAD (P) H oxidase inhibitor according to the first aspect of the present invention comprises a substance that activates a glucagon-like peptide receptor or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the substance may be a glucagon-like peptide.
  • the substance may be a glucagon-like peptide derivative.
  • the substance may be a dipeptidyl peptidase-4 inhibitor.
  • the substance may contain glucagon-like peptide or glucagon-like peptide derivative and dipeptidyl peptidase-4 inhibitor.
  • the therapeutic agent for oxidative stress disease according to the second aspect of the present invention is characterized by containing the above NAD (P) H oxidase inhibitor as an active ingredient.
  • the oxidative stress disease therapeutic agent is selected from injections, rectal suppositories, vaginal suppositories, nasal absorption agents, transdermal absorption agents, pulmonary absorption agents, oral absorption agents, and oral administration agents. It may be any shape.
  • the oxidative stress disease includes diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, metabolic syndrome, chronic kidney disease, ischemic heart disease, myocardial infarction, stroke, peripheral atherosclerosis, cerebrovascular atherosclerosis Atherosclerosis, left ventricular hypertrophy, congestive heart failure, arterial hypertension, liver fibrosis, Parkinson's disease, Alzheimer's dementia, pulmonary hypertension, erectile dysfunction, emphysema, asthma, allergy, osteoporosis, osteoarthritis, gastric ulcer, septic At least one selected from shock, pulmonary fibrosis, cancer, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ulcerative colitis, scleroderma, pathogenic angiogenesis, graft rejection, chronic pain, hypersensitivity and cataract It may be that.
  • the method for treating an oxidative stress disease according to the third aspect of the present invention is characterized by using the above-mentioned NAD (P) H oxidase inhibitor.
  • the screening method according to the fourth aspect of the present invention is characterized in that a NAD (P) H oxidase inhibitor is selected using a change in the activity of a glucagon-like peptide receptor as an index.
  • a highly versatile NAD (P) H oxidase inhibitor, oxidative stress disease therapeutic agent, oxidative stress disease therapeutic method and screening method can be obtained.
  • Embodiment 1 of the present invention will be described in detail.
  • the NAD (P) H oxidase inhibitor according to Embodiment 1 of the present invention includes a substance that activates the GLP-1 receptor or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • GLP-1 receptor is mainly expressed in islet cells, nerve cells, gastrointestinal cells, and is also expressed in heart, vascular smooth cells, endothelial cells, etc. (Ban K et al., Circulation 117, 2340-2350, 2008, Billock BP et al., Endocrinology 137, 2968-2978, 1996, Nystrom T et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 287, E1209-E1215).
  • the ligand for the GLP-1 receptor is GLP-1.
  • GLP-1 is a peptide hormone secreted from L cells of the small intestine in response to food intake.
  • GLP-1 is, for example, naturally occurring human GLP-1.
  • Naturally occurring human GLP-1 is composed of full-length human GLP-1 (1-37) and human GLP-1 (1-36) amide, 31 amino acids excluding the first 6 amino acids.
  • Active human GLP-1 (7-37) and human GLP-1 (7-36) amide composed of 30 amino acids.
  • GLP-1 can be synthesized by a known method, for example, an in vitro cell-free system or an intracellular expression system.
  • GLP-1 can be synthesized by a chemical peptide synthesis method (solid phase method or liquid phase method).
  • GLP-1 can be isolated and purified by a combination of usual purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, high performance liquid chromatography, recrystallization and the like after the synthesis reaction.
  • the substance may be a derivative of GLP-1.
  • the derivative of GLP-1 is not particularly limited as long as it binds to the GLP-1 receptor and activates the GLP-1 receptor.
  • a derivative of GLP-1 is, for example, a GLP-1 analog modified from naturally occurring human GLP-1.
  • a GLP-1 analog is, for example, a peptide in which one or more amino acids contained in GLP-1 are substituted with another amino acid.
  • a peptide substituted with an amino acid can also be synthesized in vitro by a cell-free system, an intracellular expression system, or a chemical peptide synthesis method.
  • the derivative of GLP-1 may be one in which the C-terminus and N-terminus of GLP-1 derived from mammal are chemically modified.
  • the CLP terminus of the GLP-1 derivative may be chemically modified with an ester group in addition to the carboxylate group.
  • the derivative of GLP-1 may be chemically modified at the N-terminus with an acyl group having 1 to 6 carbon atoms such as formyl group and acetyl group.
  • GLP-1 derivatives include peptides in which the N-terminal glutamyl group is pyroglutamine oxidized, substituents on the side chain of amino acids (eg, hydroxyl group, thiol group, amino group, imidazole group, indole group, guanidino A peptide chemically modified with an appropriate functional group (for example, formyl group, acetyl, etc.) and a peptide to which a sugar chain is bonded.
  • substituents on the side chain of amino acids eg, hydroxyl group, thiol group, amino group, imidazole group, indole group, guanidino
  • an appropriate functional group for example, formyl group, acetyl, etc.
  • GLP-1 is rapidly degraded by dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4). Therefore, it is preferable that the derivative of GLP-1 is difficult to be decomposed into DPP-4.
  • Derivatives of GLP-1 that are not easily decomposed into DPP-4 are, for example, liraglutide and exendin-4.
  • Liraglutide is a derivative of human GLP-1 in which the 34th residue of GLP-1 (7-37) is substituted with arginine and N-palmitoyl-glutamic acid is added to the 26th lysine.
  • Exendin-4 was discovered from salivary secretions of lizards and shows 53% sequence homology with the amino acid sequence of human GLP-1 (7-36) amide.
  • the substance may be a DPP-4 inhibitor.
  • the substrate for DPP-4 is GLP-1.
  • a DPP-4 inhibitor suppresses degradation of GLP-1 by DPP-4.
  • the DPP-4 inhibitor activates the GLP-1 receptor via GLP-1.
  • the DPP-4 inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits DPP-4, but a low molecular weight compound is preferable, and a compound contained in an extracted natural product may be used.
  • the low molecular compound may be contained in a library of low molecular compounds.
  • a commercially available low molecular compound library may be used.
  • the DPP-4 inhibitor may be, for example, siRNA, a nucleic acid aptamer, a peptide or the like.
  • the DPP-4 inhibitor is, for example, sitagliptin, vildagliptin or the like.
  • Sitagliptin and vildagliptin can be synthesized and formulated by a known method (US Pat. No. 6,998,871, US Pat. No. 6,166,063, etc.).
  • salts are, for example, acid addition salts derived from GLP-1 and inorganic or organic acids.
  • examples of such salts include hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, oxalate, tartrate, citrate, and maleic acid.
  • salts fumarate, succinate, lactate, glutarate, acetate, trifluoroate, various amino acid salts and the like.
  • the pharmaceutically acceptable salt is a salt formed from GLP-1 and a base, for example.
  • examples of such salts include salts formed from alkali metals (eg, sodium, potassium), alkaline earth metals (eg, calcium, magnesium), ammonium and substituted ammonium (eg, dimethylammonium, triethylammonium). Etc.
  • the cell on which the substance that activates the GLP-1 receptor or a pharmaceutically acceptable salt thereof acts is not particularly limited, and includes all cells that express the GLP-1 receptor and NAD (P) H oxidase. It is.
  • cells that express GLP-1 receptor and NAD (P) H oxidase are mesangial cells, neutrophils, and the like.
  • the NAD (P) H oxidase inhibitor inhibits NAD (P) H oxidase through activation of the GLP-1 receptor.
  • the GLP-1 receptor is expressed in many tissues, and NAD (P) H oxidase inhibitors inhibit NAD (P) H oxidase in many tissues. For this reason, versatility is high.
  • the NAD (P) H oxidase inhibitor according to this embodiment includes GLP-1. Since GLP-1 is a peptide hormone in vivo, it is highly safe.
  • the NAD (P) H oxidase inhibitor according to this embodiment includes a derivative of GLP-1.
  • the NAD (P) H oxidase inhibitor is less susceptible to metabolism such as degradation by DPP-4 in vivo and activates the GLP-1 receptor more.
  • the inhibitory activity against NAD (P) H oxidase can be further enhanced.
  • the NAD (P) H oxidase inhibitor according to this embodiment includes a DPP-4 inhibitor.
  • the NAD (P) H oxidase inhibitor suppresses the degradation of GLP-1 in vivo by DPP-4.
  • GLP-1 makes GLP-1 receptor more activated.
  • the inhibitory activity against NAD (P) H oxidase can be further enhanced.
  • the NAD (P) H oxidase inhibitor according to Embodiment 2 of the present invention includes GLP-1 or a derivative of GLP-1 and a DPP-4 inhibitor.
  • the DPP-4 inhibitor suppresses the degradation of GLP-1 by DPP-4. For this reason, for example, in the case of a combination of GLP-1 or a derivative of GLP-1 and a DPP-4 inhibitor, the DPP-4 inhibitor is a derivative of GLP-1 or a derivative of GLP-1 contained in the combination Decomposition by DPP-4 can be suppressed.
  • GLP-1 or a derivative of GLP-1 and a DPP-4 inhibitor can be mixed in tablets and liquids by a known method. Further, GLP-1 or a derivative of GLP-1 and the DPP-4 inhibitor may be encapsulated in an encapsulant such as a capsule.
  • the NAD (P) H oxidase inhibitor includes a DPP-4 inhibitor in addition to GLP-1 or a derivative of GLP-1.
  • the DPP-4 inhibitor contained in the NAD (P) H oxidase inhibitor suppresses the degradation of GLP-1 or the derivative of GLP-1 by DPP-4, and the NAD (P) H oxidase inhibitor
  • the included GLP-1 or derivative of GLP-1 promotes activation of the GLP-1 receptor.
  • NAD (P) H oxidase can be more strongly inhibited.
  • NAD (P) H oxidase inhibitor according to this embodiment, even when the GLP-1 derivative is not degraded by DPP-4, DPP-4 contained in the NAD (P) H oxidase inhibitor Since the inhibitor suppresses the degradation of GLP-1 in vivo by DPP-4, activation of the GLP-1 receptor is promoted, and NAD (P) H oxidase can be more strongly inhibited.
  • Embodiment 3 of the present invention will be described in detail.
  • the therapeutic agent for oxidative stress disease according to Embodiment 3 of the present invention contains the NAD (P) H oxidase inhibitor described in each of the above embodiments as an active ingredient.
  • NAD (P) H oxidase inhibitor described in each of the above embodiments is considered to treat or prevent an oxidative stress disease caused by activation of NAD (P) H oxidase.
  • Oxidative stress diseases include, for example, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, metabolic syndrome, chronic kidney disease, ischemic heart disease, myocardial infarction, stroke, peripheral atherosclerosis, cerebrovascular atherosclerosis Arteriosclerosis, left ventricular hypertrophy, congestive heart failure, arterial hypertension, liver fibrosis, Parkinson's disease, Alzheimer's dementia, pulmonary hypertension, erectile dysfunction, emphysema, asthma, allergy, osteoporosis, osteoarthritis, gastric ulcer, septic shock Pulmonary fibrosis, cancer, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, ulcerative colitis, scleroderma, pathogenic angiogenesis, graft rejection, chronic pain, hypersensitivity and cataract.
  • the disease to which the therapeutic agent for oxidative stress disease is applied may be a disease caused by activation of NAD (P) H oxidase.
  • the therapeutic agent for oxidative stress disease is, for example, a combination of the above-mentioned GLP-1 and DPP-4 inhibitor alone or in combination with a pharmacologically acceptable carrier.
  • the dosage form of the therapeutic agent for oxidative stress disease is preferably an injection, a rectal suppository, a vaginal suppository, a nasal absorption agent, a transdermal absorption agent, a pulmonary absorption agent, an oral absorption agent or an oral administration agent.
  • the therapeutic agent for oxidative stress disease contains 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 1% by weight of the NAD (P) H oxidase inhibitor based on the weight of the entire composition.
  • Pharmacologically acceptable carriers are various organic carrier materials or inorganic carrier materials used as pharmaceutical materials.
  • examples of pharmacologically acceptable carriers include excipients, lubricants, binders, disintegrants in solid preparations, solvents, solubilizers, suspending agents, isotonic agents, and buffering agents in liquid preparations.
  • it is blended in a therapeutic agent for oxidative stress disease as a soothing agent.
  • additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be used as necessary.
  • Excipients are, for example, lactose, sucrose, D-mannitol, starch, crystalline cellulose, light anhydrous silicic acid and the like.
  • examples of the lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica, and the like.
  • examples of the binder include crystalline cellulose, sucrose, D-mannitol, dextrin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and polyvinylpyrrolidone.
  • Disintegrants are, for example, starch, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium and the like.
  • Solvents are, for example, water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol and the like.
  • solubilizer include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like.
  • Suspending agents are surfactants, hydrophilic polymers, etc., for example, stearyl triethanolamine, sodium lauryl sulfate, lauryl aminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate, Polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose and the like.
  • surfactants for example, stearyl triethanolamine, sodium lauryl sulfate, lauryl aminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate, Polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose and
  • tonicity agents are sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.
  • buffering agent include phosphate, acetate, carbonate, citrate buffer, and the like.
  • the soothing agent is, for example, benzyl alcohol.
  • the preservative include p-hydroxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid, and the like.
  • examples of the antioxidant include sulfite and ascorbic acid.
  • the dose of the therapeutic agent for oxidative stress disease is appropriately determined depending on the subject's sex, age, weight, symptoms, and the like.
  • the dosage is 0.001 mg / kg to 1000 mg / kg per adult day.
  • the therapeutic agent for oxidative stress disease may be administered once or divided into multiple times.
  • the dosage is 0.0001 mg / kg to 100 mg / kg per adult day.
  • the therapeutic agent for oxidative stress disease may be administered once or divided into a plurality of times, and may be administered continuously in a plurality of times of administration.
  • the dose is 0.0001 mg / kg to 100 mg / kg per day for an adult.
  • the therapeutic agent for oxidative stress disease may be administered once or divided into multiple times. If necessary, an amount outside the above range can be used. In particular, since GLP-1 has a short blood half-life, the dosage may exceed the above range.
  • the therapeutic agent for oxidative stress disease includes GLP-1.
  • GLP-1 binds to the GLP-1 receptor, insulin is secreted from pancreatic ⁇ -cells, and the secretion of insulin depends on the glucose concentration.
  • the therapeutic agent for oxidative stress disease according to the present embodiment does not induce insulin secretion when the blood glucose concentration is normal. Thereby, it can administer without taking the risk of hypoglycemia also to the subject who does not have diabetes.
  • GLP-1 is a peptide hormone existing in the living body, it is highly safe.
  • the therapeutic agent for oxidative stress disease since the therapeutic agent for oxidative stress disease according to this embodiment includes a DPP-4 inhibitor, it can suppress the degradation of GLP-1 contained in the therapeutic agent for oxidative stress disease by DPP-4, so NAD (P) It can inhibit H oxidase more strongly.
  • the therapeutic agent for oxidative stress disease includes an injection, a rectal suppository, a vaginal suppository, a nasal absorbent, a transdermal absorbent, a pulmonary absorbent, an oral absorbent, and By making it an orally administered agent, characteristics such as absorption, distribution, metabolism, and excretion of the therapeutic drug for oxidative stress disease into the body can be adjusted. Moreover, the convenience of the therapeutic agent for oxidative stress disease can be improved by selecting a dosage form that matches the condition of the subject.
  • Embodiment 4 of the present invention will be described in detail.
  • the method for treating oxidative stress disease according to Embodiment 4 of the present invention uses the NAD (P) H oxidase inhibitor described in Embodiments 1 and 2.
  • the NAD according to Embodiments 1 and 2 in an amount effective to treat the oxidative stress disease in a subject having or at risk of having the oxidative stress disease.
  • An H oxidase inhibitor is administered.
  • NAD (P) H oxidase inhibitor can be administered by intravenous injection, intramuscular injection, enteral administration, vaginal administration, nasal administration, transdermal administration, transpulmonary administration, intraoral administration and oral administration. There may be administration by infusion.
  • the dose of the NAD (P) H oxidase inhibitor is appropriately determined according to the sex, age, weight, symptom, etc. of the subject as described in the third embodiment.
  • the method for treating oxidative stress disease inhibits NAD (P) H oxidase by activating GLP-1 receptor expressed in many tissues. Oxidative stress diseases in tissues can be treated or prevented.
  • Embodiment 5 of the present invention will be described in detail.
  • a NAD (P) H oxidase inhibitor is selected using a change in GLP-1 receptor activity as an index.
  • the intracellular cAMP concentration increases. For this reason, the activity of the GLP-1 receptor can be determined by quantifying the intracellular cAMP concentration.
  • the concentration of intracellular cAMP can be quantified using, for example, a commercially available cAMP measurement kit.
  • cells that stably express the GLP-1 receptor are cultured.
  • the modification of the cell may be carried out by incorporating a gene corresponding to the GLP-1 receptor into the mass expression system by a known method.
  • a culture solution containing the modified cells is seeded on a plate and cultured at 37 ° C. to fix the cells to the plate.
  • a solution containing the test substance is added to the plate and incubated at 37 ° C. for a predetermined time. After a predetermined time, the cells are collected from the plate, subjected to treatment such as cell disruption, and the cAMP concentration is quantified according to the instructions of the cAMP measurement kit.
  • a negative control a plate added with a solution having the same composition except for the test substance
  • a positive control a plate added with a solution having the same composition containing a known GLP-1 receptor activator such as GLP-1 are processed under the same conditions.
  • the concentration of cAMP quantified in the negative control and the test substance is compared, and the test substance having a concentration higher than the cAMP concentration in the negative control is selected.
  • a test substance having a concentration higher than the cAMP concentration in the positive control is selected.
  • the GLP-1 receptor is a seven-transmembrane type, when the GLP-1 receptor is activated, the intracellular calcium concentration increases. Therefore, the activity of the GLP-1 receptor can be evaluated by quantifying the intracellular calcium concentration.
  • the intracellular calcium concentration can be quantified by chelate coloring method, OCPC method or the like.
  • the screening method according to the present embodiment selects a NAD (P) H oxidase inhibitor using the change in the activity of the GLP-1 receptor as an index. Therefore, activation of the GLP-1 receptor It is suitable for selecting a substance that inhibits NAD (P) H oxidase.
  • NAD (P) H oxidase activity in human kidney mesangial cells by GLP-1) The activity of NAD (P) H oxidase in human cultured mesangial cells was quantified.
  • Human mesangial cells were purchased from Lonza (Walkersville, MD, USA). Mesangial cells were cultured in mesangial cell growth medium (Lonza) containing 5% fetal calf serum (FCS). Cells were subcultured 2-4 times before use in experiments. Intracellularly produced superoxide anions were analyzed by lucigenin chemiluminescence analysis (Hu Q et al., J. Biol.
  • GLP-1 was added to a medium containing mesangial cells at a concentration of 10 nM, 100 nM and 1 ⁇ M, and incubated for 24 hours.
  • mesangial cells express DPP-4, sitagliptin, a DPP-4 inhibitor, was added to the medium containing mesangial cells at a concentration of 100 ⁇ M simultaneously with the addition of GLP-1.
  • the mesangial cells were detached with trypsin / EDTA, 140 mmol NaCl, 5 mmol KCl, 0.8 mmol MgCl 2 , 1.8 mmol CaCl 2 , 1 mmol Na 2 HPO 4 , HEPES 25 and 1% glucose (pH 7. Resuspended in HEPES buffer containing 2).
  • trypsin / EDTA 140 mmol NaC
  • Luminescence was measured every 10 seconds for 10 minutes to obtain a relative light unit (RLU).
  • RLU relative light unit
  • DPI NAD (P) H oxidase activity
  • P NAD
  • P NAD
  • Luminescence was measured every 10 seconds for 10 minutes to obtain a relative light unit (RLU).
  • DPI NAD (P) H oxidase inhibitor
  • FIG. 1 shows the RLU per protein weight.
  • the positive control DPI inhibited the production of reactive oxygen induced by adding NAD (P) H. From this, it was confirmed that the inhibitory activity of NAD (P) H oxidase can be correctly evaluated in this experiment.
  • NAD (P) H-group 1, hereinafter referred to as NAD (P) H-group.
  • DPI + group the group to which DPI was added
  • Exendin-4 a GLP-1 derivative, was added to a medium containing mesangial cells to a concentration of 100 nM and 1 ⁇ M, and incubated for 24 hours. Subsequently, mesangial cells were detached with trypsin / EDTA and resuspended in HEPES buffer. The cell suspension was gently agitated with 0.1% Triton-X100.
  • FIG. 2 shows the RLU per protein weight.
  • the positive control DPI inhibited the production of reactive oxygen induced by adding NAD (P) H. From this, it was confirmed that the inhibitory activity of NAD (P) H oxidase can be correctly evaluated in this experiment.
  • NAD (P) H oxidase production of NAD (P) H oxidase by exendin-4 is due to the effect of exendin-4 on the inhibition of NAD (P) H oxidase through activation of the GLP-1 receptor. It suggests that there is.
  • the present invention is suitable for an NAD (P) H oxidase inhibitor.

Abstract

　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、グルカゴン様ペプチド受容体を活性化する物質又はその薬学的に許容される塩を含む。物質は、グルカゴン様ペプチドであってもよく、グルカゴン様ペプチドの誘導体であってもよく、ジペプチジルペプチターゼ‐４阻害剤であってもよく、グルカゴン様ペプチド又はグルカゴン様ペプチドの誘導体と、ジペプチジルペプチターゼ‐４阻害剤との合剤であってもよい。グルカゴン様ペプチド受容体は、多くの組織で発現しており、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、多くの組織でＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを阻害する。このため、汎用性が高い。

Description

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤、酸化ストレス疾患治療薬、酸化ストレス疾患治療方法及びスクリーニング方法
　本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤、酸化ストレス疾患治療薬、酸化ストレス疾患治療方法及びスクリーニング方法に関する。
　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから酸素に電子を伝達する。その結果、Ｏ２ －とＨ２Ｏ２とを含む活性酸素が産生される。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは、感染症を除く疾患において侵襲された組織に高い頻度で過剰に発現及び活性化している。そのため、過剰に産生された活性酸素による病状の悪化がしばしばみられる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性化は、多くの疾患における過剰な酸化ストレスの主な原因となっている。
　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの過剰な活性化は、炎症を誘発したり、組織の繊維化及び骨再吸収を促進したり、血管における一酸化窒素の極めて重要な防御効果に拮抗したりすることが知られている。このため、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを阻害することは、多くの疾患の予防及び治療に有効である。
　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを阻害する化合物として、ジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）が特許文献１に開示されている。ＤＰＩは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼのβサブユニットに作用することにより、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを阻害する。
また、レニン・アンジオテンシン系を標的とする一部の医薬、例えば、特許文献２に開示されたアンジオテンシン変換酵素阻害剤は、アンジオテンシン変換酵素によるアンジオテンシン２型の産生を阻害する。非特許文献１によれば、アンジオテンシン２型は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを活性化するので、結果的に、アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性を阻害する。
特表２００６－５２０３２６号公報 特開２０１０－２３５５３２号公報
Rajagopalan S et al., J. Clin. Invest. 97, 1916-1923, 1996 Bengis-Garber C et al., Cell Signal. 8, 291-296, 1996 Savitha G et al., Cell Signal. 5, 107-117, 1993 Leech CA et al., Ann. NY Acad. Sci. 805, 81-92, 1996
　しかし、ＤＰＩは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体を阻害することが知られており、生体に投与すると、副作用が懸念される。
　また、アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、肺、血漿、腎等の特定の組織でアンジオテンシン変換酵素を阻害する。また、アンジオテンシン変換酵素阻害剤は、アンジオテンシン２型が過剰に存在する状態においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性化を阻害する。このため、アンジオテンシン変換酵素阻害剤のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤としての適用は、適用する組織や状態によって制限される。
　本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、汎用性の高いＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤、酸化ストレス疾患治療薬、酸化ストレス疾患治療方法及びスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼは、食細胞において、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性化によって阻害されることが報告されている（非特許文献２及び３参照）。ＰＫＡは、細胞内のｃＡＭＰ濃度の上昇によって活性化されることが知られている。細胞内のｃＡＭＰは、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ‐１）受容体を活性化することによって、アデニルシクラーゼによりＡＴＰから産生される（非特許文献４参照）。
　これらの知見に基づいて、本発明者は、鋭意検討を重ねたところ、ＧＬＰ‐１受容体を活性化することで、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼが阻害されることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明の第１の観点に係るＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、グルカゴン様ペプチド受容体を活性化する物質又はその薬学的に許容される塩を含む、ことを特徴とする。
　この場合、前記物質は、グルカゴン様ペプチドである、こととしてもよい。
　また、前記物質は、グルカゴン様ペプチドの誘導体である、こととしてもよい。
　また、前記物質は、ジペプチジルペプチターゼ‐４阻害剤である、こととしてもよい。
　また、前記物質は、グルカゴン様ペプチド又はグルカゴン様ペプチドの誘導体と、ジペプチジルペプチターゼ‐４阻害剤とを含む、こととしてもよい。
　本発明の第２の観点に係る酸化ストレス疾患治療薬は、上記のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤を有効成分として含有する、ことを特徴とする。
　この場合、前記酸化ストレス疾患治療薬は、注射剤、直腸坐剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内吸収剤及び経口投与剤から選択される剤形のいずれかである、こととしてもよい。
　また、前記酸化ストレス疾患は、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、メタボリック症候群、慢性腎疾患、虚血性心疾患、心筋梗塞、脳卒中、抹消アテローム性動脈硬化症、脳血管アテローム性動脈硬化症、左室肥大、うっ血性心不全、動脈高血圧、肝繊維症、パーキンソン病、アルツハイマー認知症、肺高血圧症、勃起不全、肺気腫、喘息、アレルギー症、骨粗鬆症、骨関節炎、胃潰瘍、敗血症性ショック、肺繊維症、癌、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、強皮症、病原性血管新生、移植片拒絶反応、慢性疼痛、知覚過敏症及び白内障から選択される少なくとも１つである、こととしてもよい。
　本発明の第３の観点に係る酸化ストレス疾患治療方法は、上記のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤を用いる、ことを特徴とする。
　本発明の第４の観点に係るスクリーニング方法は、グルカゴン様ペプチド受容体の活性の変化を指標にＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤を選択する、ことを特徴とする。
　本発明によれば、汎用性の高いＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤、酸化ストレス疾患治療薬、酸化ストレス疾患治療方法及びスクリーニング方法が得られる。
実施例に係るＧＬＰ‐１のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害活性を示す図である。 実施例に係るエクセンジン‐４のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害活性を示す図である。
　（実施形態１）
　本発明の実施形態１について、詳細に説明する。本発明の実施形態１に係るＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、ＧＬＰ‐１受容体を活性化する物質又はその薬学的に許容される塩を含む。
　ＧＬＰ‐１受容体は、主に膵島細胞、神経細胞、胃腸細胞に多く発現しているうえ、心臓、血管平滑細胞、内皮細胞等にも発現している（Ban K et al., Circulation 117, 2340-2350, 2008, Billock BP et al., Endocrinology 137, 2968-2978, 1996, Nystrom T et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 287, E1209-E1215）。ＧＬＰ‐１受容体のリガンドは、ＧＬＰ‐１である。ＧＬＰ‐１は、食物の取り込みに応答して、小腸のＬ細胞から分泌されるペプチドホルモンである。
　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤に好適な物質は、例えば、上記のＧＬＰ‐１である。ＧＬＰ‐１は、例えば、天然に存在するヒトＧＬＰ‐１である。天然に存在するヒトＧＬＰ‐１は、完全長のヒトＧＬＰ‐１（１－３７）及びヒトＧＬＰ‐１（１－３６）アミド、最初の６個のアミノ酸を除いた３１個のアミノ酸から構成される活性型のヒトＧＬＰ‐１（７－３７）及び３０個のアミノ酸から構成されるヒトＧＬＰ‐１（７－３６）アミドを含む。
　ＧＬＰ‐１は、周知の方法、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける無細胞系や、細胞内発現系で合成できる。また、ＧＬＰ‐１は、化学的ペプチド合成法（固相法又は液相法）によって合成できる。ＧＬＰ‐１は、合成反応後、通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、再結晶等を組み合わせて単離精製できる。
　また、上記物質は、ＧＬＰ‐１の誘導体であってもよい。ＧＬＰ‐１の誘導体は、ＧＬＰ‐１受容体に結合してＧＬＰ‐１受容体を活性化するものであれば特に限定されない。ＧＬＰ‐１の誘導体は、例えば、天然に存在するヒトＧＬＰ‐１を改変したＧＬＰ‐１アナログである。ＧＬＰ‐１アナログは、例えば、ＧＬＰ‐１に含まれる１個以上のアミノ酸を別のアミノ酸に置換したペプチドである。アミノ酸を置換したペプチドも、上記と同様にｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける無細胞系、細胞内発現系、化学的ペプチド合成法によって合成できる。
　また、ＧＬＰ‐１の誘導体は、哺乳動物由来のＧＬＰ‐１のＣ末端、Ｎ末端が化学修飾されたものでもよい。例えば、ＧＬＰ‐１の誘導体は、そのＣ末端がカルボキシレート基の他、エステル基等で化学修飾されてもよい。ＧＬＰ‐１の誘導体は、そのＮ末端がホルミル基、アセチル基等の炭素数１～６のアシル基等で化学修飾されていてもよい。また、ＧＬＰ‐１の誘導体は、Ｎ末端が切断されたグルタミル基がピログルタミン酸化したペプチド、アミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、水酸基、チオール基、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な官能基（例えば、ホルミル基、アセチル等）で化学修飾されたペプチド及び糖鎖が結合しているペプチドでもよい。
　ＧＬＰ‐１は、ジペプチジルペプチターゼ‐４（ＤＰＰ‐４）によって速やかに分解される。このため、ＧＬＰ‐１の誘導体は、ＤＰＰ‐４に分解されにくいものが好ましい。ＤＰＰ‐４に分解されにくいＧＬＰ‐１の誘導体は、例えば、リラグルチド、エクセンジン‐４である。リラグルチドは、ＧＬＰ‐１（７－３７）の３４番目の残基をアルギニンに置換し、２６番目のリジンにＮ‐パルミトイル-グルタミン酸を付加したヒトＧＬＰ‐１の誘導体である。エクセンジン‐４は、トカゲの唾液分泌物から発見されたもので、ヒトＧＬＰ‐１（７－３６）アミドのアミノ酸配列と５３％の配列相同性を示す。
　また、上記物質は、ＤＰＰ‐４阻害剤であってもよい。上記のように、ＤＰＰ‐４の基質は、ＧＬＰ‐１である。このため、ＤＰＰ‐４阻害剤は、ＤＰＰ‐４によるＧＬＰ‐１の分解を抑制する。この結果、ＤＰＰ‐４阻害剤は、ＧＬＰ‐１を介してＧＬＰ‐１受容体を活性化すると考えられる。
　ＤＰＰ‐４阻害剤は、ＤＰＰ‐４を阻害する物質であれば特に限定されないが、低分子化合物が好ましく、抽出された天然物に含まれる化合物でもよい。低分子化合物は、低分子化合物のライブラリに含まれるものであってもよい。低分子化合物のライブラリは、例えば、市販されているものを用いてもよい。また、ＤＰＰ‐４阻害剤は、例えば、ｓｉＲＮＡ、核酸アプタマー、ペプチド等であってもよい。
　より具体的には、ＤＰＰ‐４阻害剤は、例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン等である。シタグリプチン、ビルダグリプチンは、周知の方法（米国特許第６６９９８７１号明細書、米国特許第６１６６０６３号明細書等）で合成、製剤化できる。
　薬学的に許容される塩は、例えば、ＧＬＰ‐１と無機酸又は有機酸から誘導される酸付加塩である。このような塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、グルタル酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酸塩、種々のアミノ酸塩等がある。
　また、薬学的に許容される塩は、例えば、ＧＬＰ‐１と塩基とから形成される塩である。このような塩としては、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム）、アンモニウム及び置換アンモニウム（例えば、ジメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム）などから形成される塩等がある。
　ＧＬＰ‐１受容体を活性化する物質又はその薬学的に許容される塩が作用する細胞は、特に限定されず、ＧＬＰ‐１受容体及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを発現する細胞の全てが含まれる。例えば、ＧＬＰ‐１受容体及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを発現する細胞は、メサンギウム細胞、好中球等である。
　以上詳細に説明したように、本実施形態に係るＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、ＧＬＰ‐１受容体の活性化を介してＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを阻害する。ＧＬＰ‐１受容体は、多くの組織で発現しており、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、多くの組織でＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを阻害する。このため、汎用性が高い。
　また、本実施形態に係るＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、ＧＬＰ‐１を含む。ＧＬＰ‐１は、生体内のペプチドホルモンであることから、安全性が高い。
　また、本実施形態に係るＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、ＧＬＰ‐１の誘導体を含む。こうすることで、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、生体内においてＤＰＰ‐４による分解等の代謝を受けにくく、ＧＬＰ‐１受容体をより活性化させる。この結果、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼに対する阻害活性をさらに強めることができる。
　また、本実施形態に係るＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、ＤＰＰ‐４阻害剤を含む。こうすることで、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、ＤＰＰ‐４による生体内のＧＬＰ‐１の分解を抑制する。これにより、ＧＬＰ‐１がＧＬＰ‐１受容体をより活性化させる。この結果、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼに対する阻害活性をさらに強めることができる。
　（実施形態２）
　本発明の実施形態２について、詳細に説明する。本発明の実施形態２に係るＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、ＧＬＰ‐１又はＧＬＰ‐１の誘導体と、ＤＰＰ‐４阻害剤とを含む。
　上述のように、ＤＰＰ‐４阻害剤は、ＤＰＰ‐４によるＧＬＰ‐１の分解を抑制する。このため、例えば、ＧＬＰ‐１又はＧＬＰ‐１の誘導体と、ＤＰＰ‐４阻害剤との合剤の場合、ＤＰＰ‐４阻害剤は、合剤に含まれるＧＬＰ‐１又はＧＬＰ‐１の誘導体のＤＰＰ‐４による分解を抑制することができる。
　ＧＬＰ‐１又はＧＬＰ‐１の誘導体とＤＰＰ‐４阻害剤とは、周知の方法で錠剤、液剤中に混在させることができる。また、ＧＬＰ‐１又はＧＬＰ‐１の誘導体とＤＰＰ‐４阻害剤とは、カプセル等の封入体に封入してもよい。
　以上詳細に説明したように、本実施形態に係るＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、ＧＬＰ‐１又はＧＬＰ‐１の誘導体に加えて、ＤＰＰ‐４阻害剤を含む。こうすることで、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤に含まれるＤＰＰ‐４阻害剤がＤＰＰ‐４によるＧＬＰ‐１又はＧＬＰ‐１の誘導体の分解を抑制し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤に含まれるＧＬＰ‐１又はＧＬＰ‐１の誘導体がＧＬＰ‐１受容体の活性化を促進する。この結果、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼをより強く阻害できる。
　また、本実施形態に係るＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤によれば、ＧＬＰ‐１の誘導体がＤＰＰ‐４による分解を受けない場合でも、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤に含まれるＤＰＰ‐４阻害剤がＤＰＰ‐４による生体内のＧＬＰ‐１の分解を抑制するため、ＧＬＰ‐１受容体の活性化が促進され、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼをさらに強く阻害できる。
　（実施形態３）
　本発明の実施形態３について、詳細に説明する。本発明の実施形態３に係る酸化ストレス疾患治療薬は、上記各実施形態に記載のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤を有効成分として含有する。
　上記各実施形態に記載のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性化を起因とする酸化ストレス疾患を治療又は予防すると考えられる。
　酸化ストレス疾患は、例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、メタボリック症候群、慢性腎疾患、虚血性心疾患、心筋梗塞、脳卒中、抹消アテローム性動脈硬化症、脳血管アテローム性動脈硬化症、左室肥大、うっ血性心不全、動脈高血圧、肝繊維症、パーキンソン病、アルツハイマー認知症、肺高血圧症、勃起不全、肺気腫、喘息、アレルギー症、骨粗鬆症、骨関節炎、胃潰瘍、敗血症性ショック、肺繊維症、癌、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、強皮症、病原性血管新生、移植片拒絶反応、慢性疼痛、知覚過敏症及び白内障である。なお、これらの疾患の他にも、上記酸化ストレス疾患治療薬の適用疾患は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性化を起因とする疾患であればよい。
　酸化ストレス疾患治療薬は、例えば、上記したＧＬＰ‐１とＤＰＰ‐４阻害剤とを、それぞれ単独で、又は薬理的に許容される担体と配合された合剤である。酸化ストレス疾患治療薬の剤形は、注射剤、直腸坐剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内吸収剤及び経口投与剤等が好ましい。
　酸化ストレス疾患治療薬は、その全組成物の重量に対して、上記ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤を０．０１～１０重量％、好ましくは、０．１～１重量％を含有する。
　薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、又は液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として酸化ストレス疾患治療薬に配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。
　賦形剤は、例えば、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等である。滑沢剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等である。結合剤は、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ－マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等である。崩壊剤は、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等である。
　溶剤は、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール等である。溶解補助剤は、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等である。懸濁化剤は、界面活性剤、親水性高分子等であって、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等である。
　等張化剤は、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトール等である。緩衝剤は、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩の緩衝液等である。無痛化剤は、例えば、ベンジルアルコール等である。防腐剤は、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等である。抗酸化剤は、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸等である。
　酸化ストレス疾患治療薬の投与量は、被験体の性別、年齢、体重、症状等によって適宜決定される。経口投与の場合、投与量は、成人一日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ乃至１０００ｍｇ／ｋｇである。この場合、酸化ストレス疾患治療薬は、１回、あるいは複数回に分けて投与されてもよい。また、静脈注射の場合、投与量は、成人一日あたり０．０００１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇである。この場合、酸化ストレス疾患治療薬は、１回、あるいは複数回に分けて投与されてもよく、複数回の投与においては、連続して投与されてもよい。
　また、経鼻投与の場合、投与量は、成人一日あたり０．０００１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇである。この場合、酸化ストレス疾患治療薬は、１回、あるいは複数回に分けて投与されてもよい。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。特に、ＧＬＰ‐１は、血中半減期が短いので、投与量は上記の範囲を超えてもよい。
　以上詳細に説明したように、本実施形態に係る酸化ストレス疾患治療薬は、ＧＬＰ‐１を含む。ＧＬＰ‐１がＧＬＰ‐１受容体に結合することによって、膵臓のβ細胞からインスリンが分泌されるが、このインスリンの分泌は、グルコース濃度に依存する。このため、本実施形態に係る酸化ストレス疾患治療薬は、血中グルコース濃度が正常な場合には、インスリンの分泌を誘導しない。これにより、糖尿病がない被験体に対しても、低血糖症のリスクを負わずに投与できる。また、ＧＬＰ‐１は、生体内に存在するペプチドホルモンであるため、安全性が高い。
　また、本実施形態に係る酸化ストレス疾患治療薬は、ＤＰＰ‐４阻害剤を含むため、ＤＰＰ‐４による、酸化ストレス疾患治療薬に含まれるＧＬＰ‐１の分解を抑制できるので、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼをより強く阻害できる。
　また、本実施形態に係る酸化ストレス疾患治療薬は、その剤形を、注射剤、直腸坐剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内吸収剤及び経口投与剤にすることによって、酸化ストレス疾患治療薬の体内への吸収、分布、代謝、排泄等の特性を調節することができる。また、被験体の状態に合わせた剤形を選択することによって、酸化ストレス疾患治療薬の利便性を向上させることができる。
　（実施形態４）
　本発明の実施形態４について、詳細に説明する。本発明の実施形態４に係る酸化ストレス疾患治療方法は、上記実施形態１及び２に記載のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤を用いる。
　当該治療方法では、酸化ストレス疾患を有する被験体または酸化ストレス疾患を有する危険性のある被験体に、その酸化ストレス疾患を治療するのに有効な量の、上記実施形態１及び２に記載のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤を投与する。
　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤の投与は、静脈、筋肉等への注射による投与、経腸投与、経膣投与、経鼻投与、経皮投与、経肺投与、経口腔内投与及び経口投与であってもよく、点滴による投与であってもよい。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤の投与量は、上記実施形態３で説明したように被験体の性別、年齢、体重、症状等によって適宜決定される。
　以上詳細に説明したように、本実施形態に係る酸化ストレス疾患治療方法は、多くの組織で発現するＧＬＰ‐１受容体を活性化することによってＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを阻害するので、多くの組織における酸化ストレス疾患を治療又は予防することができる。
　（実施形態５）
　本発明の実施形態５について、詳細に説明する。本発明の実施形態５に係るスクリーニング方法は、ＧＬＰ‐１受容体の活性の変化を指標にＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤を選択する。
　ＧＬＰ‐１受容体が活性化すると、細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇する。このため、ＧＬＰ‐１受容体の活性は、細胞内のｃＡＭＰの濃度を定量することで決定できる。細胞内のｃＡＭＰの濃度は、例えば、市販のｃＡＭＰ測定キット等で定量できる。
　より詳細には、ＧＬＰ‐１受容体を安定に発現する細胞、好ましくは、ＧＬＰ‐１受容体を過剰に発現するように改変された細胞を培養する。細胞の改変は、既知の方法で大量発現系にＧＬＰ‐１受容体に対応する遺伝子を組み込むようにしてもよい。例えば、改変された細胞を含む培養液をプレートに播き、３７℃で培養することで、該細胞をプレートに定着させる。そのプレートに、被験物質を含む溶液を添加して、３７℃で所定時間培養する。所定時間後、プレートから細胞を回収し、細胞破砕等の処理を行って、ｃＡＭＰ測定キットの説明書に従ってｃＡＭＰの濃度を定量する。
　このとき、陰性対照として、被験物質を除いて同じ組成の溶液を添加したプレート、陽性対照として、ＧＬＰ‐１等の既知のＧＬＰ‐１受容体活性化物質を含む同じ組成の溶液を添加したプレートを同じ条件で処理する。陰性対照と被験物質の定量されたｃＡＭＰの濃度を比較し、陰性対照におけるｃＡＭＰ濃度よりも濃度が大きい被験物質を選択する。好ましくは、陽性対照におけるｃＡＭＰ濃度よりも濃度が大きい被験物質を選択する。
　なお、ＧＬＰ‐１受容体は、７回膜貫通型であるため、ＧＬＰ‐１受容体が活性化すると、細胞内のカルシウム濃度が上昇する。そこで、ＧＬＰ‐１受容体の活性は、細胞内のカルシウム濃度を定量することで評価できる。細胞内のカルシウム濃度は、キレート発色法、ＯＣＰＣ法等により定量できる。
　以上詳細に説明したように、本実施形態に係るスクリーニング方法は、ＧＬＰ‐１受容体の活性の変化を指標にＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤を選択するので、ＧＬＰ‐１受容体の活性化を介してＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを阻害する物質を選択するのに好適である。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　（ＧＬＰ‐１のヒト腎臓メサンギウム細胞におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性の阻害）
　ヒトの培養メサンギウム細胞におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性を定量した。ヒトのメサンギウム細胞は、ロンザ社（Walkersville, MD, USA）から購入した。メサンギウム細胞は、５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むメサンギウム細胞培養培地（Mesangial Cell Growth Medium、ロンザ社）で培養した。細胞は、２回から４回継代培養をしてから実験に使用した。細胞内で産生された超酸化物陰イオンは、ルシゲニン化学発光分析（Hu Q et al., J. Biol. Chem. 275, 15749-15757, 2000, Li Y et al., J. Biol. Chem. 273, 2015-2023, 1998）に基づいて定量した。
　ＧＬＰ‐１を１０ｎＭ、１００ｎＭ及び１μＭの濃度になるようにメサンギウム細胞を含む培地に加え、２４時間保温した。ここで、メサンギウム細胞は、ＤＰＰ‐４を発現しているため、ＧＬＰ‐１の添加と同時に、メサンギウム細胞を含む培地に１００μＭの濃度になるようにＤＰＰ‐４阻害剤であるシタグリプチンを加えた。続いて、メサンギウム細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで剥がし、１４０ｍｍｏｌのＮａＣｌ、５ｍｍｏｌのＫＣｌ、０．８ｍｍｏｌのＭｇＣｌ２、１．８ｍｍｏｌのＣａＣｌ２、１ｍｍｏｌのＮａ２ＨＰＯ４、ＨＥＰＥＳ２５及び１％のグルコース（ｐＨ７．２）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁した。メサンギウム細胞の透過性を高めるために、細胞懸濁液を０．１％のＴｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００でゆっくり撹拌した。暗順応させた５０μｍｏｌ／Ｌのルシゲニンを細胞懸濁液に加え、１０分間３７℃で前保温した後、１００μｍｏｌ／ＬのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを細胞懸濁液に加えた。１０分間で１０秒ごとに発光を測定し、相対的な光量（ＲＬＵ：relative light unit）を得た。
　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性に対する陽性対照として、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤であるＤＰＩを細胞懸濁液に加え、１０分間前保温した。実験を３回行い、全てのデータは、少なくとも３回の独立した実験から得られたものである。超酸化物の産生は、タンパク質重量（μｇ）あたりのＲＬＵで評価した。タンパク質重量は、ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙキット（Pierce Biotechnology）を用いて測定した。なお、以下の全てのデータは、平均値±標準誤差で示す。統計解析は、フィッシャーのＰＬＳＤ（protected least significant difference）による片側分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた。
　（結果）
　図１にタンパク質重量あたりのＲＬＵを示す。陽性対照のＤＰＩは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを加えることによって誘導される活性酸素の産生を阻害した。このことから、本実験において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの阻害活性を正しく評価できることが確認された。ＧＬＰ‐１は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼによる活性酸素の産生を濃度依存的に阻害した。特に、１μＭのＧＬＰ‐１は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼによる活性酸素の産生を有意に阻害した（ｐ＝０．０１０３）。
　また、１μＭのＧＬＰ‐１によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性酸素の産生阻害は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを加えていない群（図１の白抜き、以下、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ－群とする）と有意差がなかった。このことは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加することによって産生される超酸化物陰イオンを、ＧＬＰ‐１が十分に抑制したことを示す。
　なお、１μＭのＧＬＰ‐１のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害活性は、ＤＰＩを加えた群（以下、ＤＰＩ＋群とする）に及ばないものの、両者の間に有意差はなかった。ＤＰＩは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体を阻害するため、生体に投与した場合の副作用が懸念される。一方、ＧＬＰ‐１は、生体内のペプチドホルモンであることから、ＤＰＩよりも安全性の面で有利である。
　（ＧＬＰ‐１誘導体のヒト腎臓メサンギウム細胞におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性の阻害）
　ＧＬＰ‐１誘導体であるエクセンジン‐４を１００ｎＭ及び１μＭの濃度になるようにメサンギウム細胞を含む培地に加え、２４時間保温した。続いて、メサンギウム細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで剥がし、ＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液を０．１％のＴｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００でゆっくり撹拌した。暗順応させた５０μｍｏｌ／Ｌのルシゲニンを細胞懸濁液に加え、１０分間３７℃で前保温した後、１００μｍｏｌ／ＬのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを細胞懸濁液に加えた。１０分間で１０秒ごとに発光を測定し、ＲＬＵを得た。なお、本実験においても、陽性対照としてＤＰＩを用いた。
　（結果）
　図２にタンパク質重量あたりのＲＬＵを示す。陽性対照であるＤＰＩは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを加えることによって誘導される活性酸素の産生を阻害した。このことから、本実験において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの阻害活性を正しく評価できることが確認された。エクセンジン‐４は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼによる活性酸素の産生を濃度依存的に阻害した。特に、１００ｎＭ及び１μＭのエクセンジン‐４は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼによる活性酸素の産生をそれぞれ有意に阻害した（ｐ＝０．００６８及びｐ＝０．０００７）。
　また、１μＭのエクセンジン‐４によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性酸素の産生阻害は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ－群と有意差がなかった。このことは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを添加することによって産生される超酸化物陰イオンを、エクセンジン‐４が十分に抑制したことを示す。
　なお、１μＭのエクセンジン‐４のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害活性は、ＤＰＩ＋群に及ばないものの、両者の間に有意差はなかった。
　さらに、上記のエクセンジン‐４のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性の阻害の実験において、細胞懸濁液にＰＫＡ阻害剤であるＨ８９を加えたところ、エクセンジン‐４によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性酸素の産生阻害がＨ８９の濃度依存的に抑制された（データ不図示）。このことから、エクセンジン‐４によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性の阻害は、ＰＫＡ依存的であることが確認された。ＧＬＰ‐１受容体が活性化すると、アデニルシクラーゼがｃＡＭＰを産生する。ｃＡＭＰはＰＫＡを活性化し、その結果、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼが阻害される。Ｈ８９がエクセンジン‐４によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性酸素の産生阻害を抑制することは、エクセンジン‐４によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの阻害がＧＬＰ‐１受容体の活性化を介した作用であることを示唆している。
　本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態及び実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、上述した実施形態及び実施例ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内およびそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　本出願は、２０１０年１０月２８日に提出された米国特許仮出願番号６１／４０７，５８５に対して優先権を主張する。本明細書中にその全体を参照として取り込むものとする。
　本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤に好適である。

Claims (10)

  1. 　グルカゴン様ペプチド受容体を活性化する物質又はその薬学的に許容される塩を含む、
    　ことを特徴とするＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤。
  2. 　前記物質は、
    　グルカゴン様ペプチドである、
    　ことを特徴とする請求項１に記載のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤。
  3. 　前記物質は、
    　グルカゴン様ペプチドの誘導体である、
    　ことを特徴とする請求項１に記載のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤。
  4. 　前記物質は、
    　ジペプチジルペプチターゼ‐４阻害剤である、
    　ことを特徴とする請求項１に記載のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤。
  5. 　前記物質は、
    　グルカゴン様ペプチド又はグルカゴン様ペプチドの誘導体と、
    　ジペプチジルペプチターゼ‐４阻害剤とを含む、
    　ことを特徴とする請求項１に記載のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤。
  6. 　請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤を有効成分として含有する、
    　ことを特徴とする酸化ストレス疾患治療薬。
  7. 　注射剤、直腸坐剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内吸収剤及び経口投与剤から選択される剤形のいずれかである、
    　ことを特徴とする請求項６に記載の酸化ストレス疾患治療薬。
  8. 　前記酸化ストレス疾患は、
    　糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎障害、メタボリック症候群、慢性腎疾患、虚血性心疾患、心筋梗塞、脳卒中、抹消アテローム性動脈硬化症、脳血管アテローム性動脈硬化症、左室肥大、うっ血性心不全、動脈高血圧、肝繊維症、パーキンソン病、アルツハイマー認知症、肺高血圧症、勃起不全、肺気腫、喘息、アレルギー症、骨粗鬆症、骨関節炎、胃潰瘍、敗血症性ショック、肺繊維症、癌、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、強皮症、病原性血管新生、移植片拒絶反応、慢性疼痛、知覚過敏症及び白内障から選択される少なくとも１つである、
    　ことを特徴とする請求項６又は７に記載の酸化ストレス疾患治療薬。
  9. 　請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤を用いる、
    　ことを特徴とする酸化ストレス疾患治療方法。
  10. 　グルカゴン様ペプチド受容体の活性の変化を指標にＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害剤を選択する、
    　ことを特徴とするスクリーニング方法。
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