WO2012046717A1

WO2012046717A1 - 2成分系組織接着剤及びその製造方法

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Publication number: WO2012046717A1
Application number: PCT/JP2011/072835
Authority: WO
Inventors: 田口　哲志; 美幸松田
Original assignee: 独立行政法人物質・材料研究機構
Priority date: 2010-10-05
Filing date: 2011-10-04
Publication date: 2012-04-12
Also published as: US20130220174A1; US9499728B2; JP5594633B2; EP2626086B1; JPWO2012046717A1; EP2626086A1; EP2626086A4

Abstract

本発明は、接着強度が高く、かつ、生体親和性の高い2成分系組織接着剤及びその製造方法を提供することを課題とする。本発明は、疎水化ゼラチンを第１剤とし、架橋用分子を第２剤とする2成分系組織接着剤であって、前記疎水化ゼラチンは、その側鎖にアミノ基と疎水性官能基とを備えており、前記架橋用分子は一分子内に２個以上の活性エステル基又は酸無水物を有している。

Description

2成分系組織接着剤及びその製造方法

本発明は、2成分系組織接着剤及びその製造方法に関する。

　組織接着剤とは、心臓血管外科等の手術の際、血管、皮膚等の生体組織（以下、組織）を行う接着剤のことである。これを用いることにより、血液の漏出等を防止でき、手術の安全性を高めることができる。

現在、大きく分けて、以下の３種類の組織接着剤がある。
　第１の接着剤は、シアノアクリレート系組織接着剤であり、製品としてはＤＥＲＭＡＢＯＮＤがある。この接着剤は、接着強度は高いが、生体親和性が低いという課題がある。
　第２の接着剤は、バイオポリマーとアルデヒド系の組織接着剤であり、製品としてはＧＲＦ　ｇｌｕｅがある。この接着剤も、接着強度は高いが、生体親和性が低いという課題がある。
　第３の接着剤は、フィブリン系組織接着剤であり、製品としてはボルヒール（Ｂｏｌｈｅａｌ）がある。この接着剤は、逆に、生体親和性は高いが、接着強度が低いという課題がある。
　このように、接着強度と生体親和性の両方の特性に優れた組織接着剤がないというのが、従来技術の課題であった。

　近年、フィブリン系組織接着剤において、ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ：以下、ＨＳＡ）と架橋剤とからなる組織接着剤の接着強度が高いことが分かってきた（非特許文献１）。
　ＨＳＡは、血液製剤から作られる血清タンパク質であり、分子量６９０００、直径約１０ｎｍの球状タンパク質である。また、マイナスチャージを持った酸性タンパク質である。また、架橋剤としては、酒石酸（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　Ｔａｒｔａｒａｔｅ：以下、ＤＳＴ）が用いられている。

　しかし、血液製剤を使うと医薬品の分類となるため、承認認可の面で多大な労力を必要とする。また、医薬品となる場合には、認可後も、使用履歴を２０年間継続して残さねばならず、多大な労力を必要とするという課題がある。

　そのため、ＨＳＡに代わり、非血液製剤であるゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）を用いることが考えられる。例えば、特許文献１は、ゼラチンをスクシンイミド化ポリ－Ｌ－グルタミン酸により架橋して調製する医用材料が開示されている。また、特許文献２は、組織接着フィルムに関するものであり、ゼラチン又はコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）から作成される組織接着フィルムが開示されている。しかし、これらは、接着力が十分でないという課題がある。
　また、特許文献３は、組織接着構成物に関するものであり、粒子形態の合成および／または架橋性の材料と、粒子状材料とが混合された組織接着構成物が開示されている。しかし、この組織接着構成物も、接着力が十分でないという課題がある。
　更にまた、側鎖にアルキル基を導入したゼラチンに関する論文がある（非特許文献２、３）。
　しかし、上記課題を解決するには、至っていない。

特開平９―１０３４７９号公報特開２００８－２８４２５６号公報特表２００６－５２３１１３号公報

Ｊ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｃｏｍｐａｃｔ．Ｐｏｌｙｍ．，２４，５４６－５５９（２００９）Ｌｉ－Ｈｕｅｉ　Ｌｉｎ，Ｋｅｎｇ－Ｍｉｎｇ　Ｃｈｅｎ，ＣＯＬＬＯＩＤＳ　ＡＮＤ　ＳＵＲＦＡＣＥＳ　Ａ，２７２，２００６，８－１４Ｌｉ－Ｈｕｅｉ　Ｌｉｎ，Ｋｅｎｇ－Ｍｉｎｇ　Ｃｈｅｎ，Ｃｈｅｅ－Ｃｈａｎ　Ｗａｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０５，２００７，３３７１－３３７７

　本発明は、接着強度が高く、かつ、生体親和性の高い2成分系組織接着剤及びその製造方法を提供することを課題とする。

　本発明者らは、ＨＳＡに代わり、分子量が１００００以上５００００未満のゼラチンに疎水性官能基を導入した疎水化ゼラチンを用いることで、接着強度が高く、かつ、生体親和性の高い2成分系組織接着剤を提供することができることを発見し、本発明を完成した。
　本発明は、以下の構成を有する。

　本発明の2成分系組織接着剤は、側鎖にアミノ基と疎水性官能基とを備えた疎水化ゼラチンを含有する第1剤；及び、一分子内に２個以上の活性エステル基又は酸無水物を有する架橋用分子を含有する第2剤；からなる。

　本発明の2成分系組織接着剤においては、前記疎水化ゼラチンを、２個以上のアミノ酸が直鎖状に連結された高分子であり、且つ当該アミノ酸中のＬｙｓ残基の一部が前記疎水性官能基で置換されているものとすることができる。

　本発明の2成分系組織接着剤においては、前記疎水性官能基をコレステリル基、オレイル基、イソステアリル基、ステアリル基、イソパルミチル基、ミリスチル基、ラウリル基、カプリン基、ペラルゴル基、カプリル基、カプロル基、α－リロレニル基、ステアリドニル基、エイコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエニル基からなる群より選択される１種、または２種以上の組み合わせとすることができる。

　本発明の2成分系組織接着剤においては、ヒト、ブタ、ウシ、魚由来の天然ゼラチン、及びこれらの遺伝子組換えゼラチンからなる群より選択される、１種、または２種以上の組み合わせであるゼラチンを前記第1剤に更に含めることができる。

　本発明の2成分系組織接着剤においては、前記疎水化ゼラチンの分子量を１００００以上５００００未満とすることができる。

　本発明の2成分系組織接着剤においては、前記架橋用分子を、ゲニピン、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサル酢酸、ｃｉｓ－アコニット酸、２－ケトグルタル酸、ポリ酒石酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、及びポリアスパラギン酸からなる群から選ばれる、１種または２種以上の組合せとすることができる。

　本発明の2成分系組織接着剤の製造方法においては、ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加し、前記ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化ゼラチンを合成する工程；及び、前記疎水化ゼラチンを含む溶液に一分子内に２個以上の活性エステル基又は酸無水物を有する架橋用分子を混合する工程；を有する。

　本発明の2成分系組織接着剤は、疎水化ゼラチンを含有する第1剤、及び架橋用分子を含有する第2剤からなる2成分系組織接着剤でる。ここで、疎水化ゼラチンは、その側鎖にアミノ基と疎水性官能基とを備えており、架橋用分子は一分子内に２個以上の活性エステル基又は酸無水物を有している。そのため、前記疎水化ゼラチンを構成するアミノ基同士を、架橋用分子の活性エステル基あるいは酸無水物で架橋して、化学的に強固な結合を形成することができる。更に、疎水性官能基を組織に浸透させ（アンカーリングして）、組織との間に物理的に強固な結合を形成して、接着強度を高くすることができる。更には、疎水化ゼラチンは、組織の創傷治癒過程において酵素（コラゲナーゼ）により容易に分解させるものであるため、生体親和性を高くすることができる。従って本発明によれば接着強度が高く、かつ、生体親和性の高い組織接着剤を提供することができる。

　本発明の2成分系組織接着剤の製造方法は、ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加し、前記ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化ゼラチンを合成して、これを第１容器に充填する工程；及び一分子内に２個以上の活性エステル基又は酸無水物を有する架橋用分子を第２容器に充填する工程；を有する。そのため、第１容器内の疎水化ゼラチン及び第２容器内の架橋分子を混合すると、上述したように接着強度が高く、かつ、生体親和性の高い組織接着剤を容易に得ることができる。

本発明の組織接着剤の構成の一例を示す概略図である。本発明の組織接着剤を用いた接着方法の一例を示す概略図である。本発明の組織接着剤を用いた接着の一例を示す概略図である。ブタ血管中膜を用いた疎水化ゼラチン-ＤＳＴ接着剤の接着試験の結果を示す図である。ブタ血管中膜を用いた疎水化ゼラチン-ＤＳＴ接着剤の接着試験の結果を示す図である。ブタ血管中膜を用いた疎水化ゼラチン-ＤＳＴ接着剤の接着試験の結果を示す図である。

（本発明の実施形態）
　以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態である組織接着剤及びその製造方法について説明する。
　図１に示すように、本発明の実施形態である2成分系組織接着剤は、疎水化ゼラチンを含有する第1剤と、架橋用分子を含有する第2剤とからなる。なお、当該第1剤には、ヒト、ブタ、ウシ、魚由来の天然ゼラチン、及び遺伝子組換えゼラチンからなる群より選択される１種、又は２種以上の組合わせであるゼラチンを含んでいてもよい。
　なお、前記組織接着剤を用いて、生体組織を接着する際には、疎水化ゼラチンと架橋用分子とを架橋反応させるために、水を必要とする。前記水は、ｐＨ６～８の緩衝液であることが好ましい。この範囲のｐＨの緩衝液を用いることにより、架橋反応を最も早く進行させることができる。

　疎水化ゼラチンは、ゼラチンからなる主鎖と、その側鎖にアミノ基と前記疎水性官能基とを備えている。ゼラチン骨格を用いることにより、酵素により容易に分解させることができ、生体親和性が高くできる。

　疎水化ゼラチンの分子量は、１０,０００以上５０,０００未満であることが好ましい。疎水化ゼラチンの分子量をこの範囲とすることによって、接着強度を向上させることができる。疎水化ゼラチンの分子量が５０,０００以上の場合には、ゼラチン自身の自己会合が強く、組織への浸透性が悪いため、接着強度が低下する。また、疎水化ゼラチンの分子量が１０,０００未満の場合には、疎水化により水への溶解性が著しく低下するため、組織接着剤の成分として用いることが難しい。

　Ｌｙｓは、タンパク質を構成するα－アミノ酸の一つであり、必須アミノ酸である。側鎖にε－アミノ基を持つアミノ酸である。Ｌｙｓのアミノ基の一部は、公知の方法により、疎水性官能基で容易に置換することができる。本発明の第1剤中の疎水化ゼラチンにおいては、１１のＬｙｓのアミノ基の一部が疎水性官能基で置換されている。

　ゼラチンに導入した疎水性官能基は、架橋分子との反応の際に組織にアンカーリングして、ゼラチンを組織に強固に固定することができる。これにより、疎水化ゼラチンを組織に物理的に強固に接着させることができ、接着強度を向上させることができる。
　疎水性官能基が水溶性の場合には、疎水性度が低いため、疎水性官能基を組織に突き刺すことが困難となり、疎水化ゼラチンを組織に強固に固定することはできない。一方、疎水性官能基が水に対して不溶性の場合には、疎水性を示すので、疎水性官能基を組織にアンカーリングすることが困難となり、疎水化ゼラチンを組織に強固に固定することが難しい。
　疎水性官能基として、例えば、次式（１）に示すコレステリル基の他、オレイル基、イソステアリル基、ステアリル基、イソパルミチル基、ミリスチル基、ラウリル基、カプリン基、ペラルゴル基、カプリル基、カプロル基、α－リロレニル基、ステアリドニル基、エイコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエニル基を挙げることができ、これらからなる群より選択される１種、又は２種以上の組合わせとすることができる。

　架橋用分子は、一分子内に２個以上の活性エステル基あるいは酸無水物を有する有機分子からなる。一分子内に２個以上の活性エステル基あるいは酸無水物を有することにより、これらの架橋用分子は、疎水化ゼラチンの２つのアミノ基と反応して、結合することができ、２個以上の疎水化ゼラチンを架橋して、強固な接着構造体を形成することができる。

　架橋分子としては例えば、ゲニピン又は、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサル酢酸、ｃｉｓ－アコニット酸、２－ケトグルタル酸、ポリ酒石酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸の群から選ばれる一の分子であって、前記分子の一分子中に２個以上の活性エステル基を有するもの又は酸無水物を挙げることができる。
　前記活性エステル基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル基の１種または２種以上の組み合わせであることが好ましい。スクシンイミドは、生体内の代謝経路に存在するコハク酸の誘導体であり、アメリカ食品医薬品局で認可された組織接着剤（シーラント）に使用されている実績があるためである。
　より具体的には、例えば、架橋用分子として、次式（２）に示す酒石酸ジスクシンイミジルを挙げることができる。

＜本実施形態の2成分系組織接着剤を用いた組織の接着について＞
　次に、本実施形態の2成分系組織接着剤を用いた組織の接着について説明する。
　図２は、本実施形態の組織接着剤を用いた組織の接着方法の一例を説明する工程概略図である。
　まず、図２左上に示すように、平面視略矩形状（例えば、長さ３ｃｍ×幅１ｃｍ、高さ０．５ｃｍ）のプラスチック基板の一面の一部に平面視略矩形状（例えば、長さ１ｃｍ×幅１ｃｍ、高さ０．５ｃｍ）の組織を形成する。組織としては、疑似皮膚としてｃｏｌｌａｇｅｎ、ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ｇｌｙｃｅｒｉｎ等の成分から成るコラーゲンケーシングを用いる。

　次に、同様に、別の平面視略矩形状のプラスチック基板の一面の一部に組織を形成する。
　次に、疎水化ゼラチンの水溶液（第１剤）と架橋用分子（第２剤）を混合し、液状の接着材料を調製する。なお、本発明の2成分系組織接着剤の第１剤及び第２剤に用いる溶媒は、ｐＨ６～８の緩衝液であることが好ましい。
　次に、図２右上に示すように、プラスチック基板の一面上の組織上に上記の液状の接着材料を塗布する。
　次に、図２下段に示すように、プラスチック基板の一面上の組織を、組織上の液状の接着材料に押しつけ、錘を置いて加重を付加した状態で一定時間放置する。
　なお、前記放置時間は、組織接着剤が固化するのに必要な時間であり、組織接着剤中の構成材料の割合によって適宜設定する。例えば、１０分程度とする。また、この際、例えば、３７℃程度に加熱してもよい。

　図３は、本発明の実施形態である組織接着剤を用いた組織の接着の一例を示す概略図である。
　図３に示すように、加水分解反応により、疎水化ゼラチンのアミノ基と架橋用分子の一の活性エステル基が反応して、アミド結合が形成する。その際、活性エステル基中のＮ－ヒドロキシスクシンイミドが遊離する。また、この架橋用分子の他の活性エステル基が他の疎水化ゼラチンおよび生体組織中に存在するコラーゲンなどのタンパク質のアミノ基と反応して、アミド結合が形成する。これにより、２つの疎水化ゼラチンが一の架橋用分子により架橋される。
　この架橋反応が連鎖的に行われることにより、複数の疎水化ゼラチンが架橋用分子により強固に結合された構造体が形成される。これにより、この構造体は、化学的に強固なものとされる。
　つまり、次式（３）で表される化学反応が生じていると考えられる。式（３）において、－ＣＯＯＲは、架橋剤の活性エステル、－ＮＨ_２は、疎水化ゼラチン中のアミノ基を示す。

　また、図３に示すように、疎水的な相互作用により、一定の分子量及び大きさを有する疎水性官能基が組織に突き刺さっている。これにより、疎水化ゼラチンは、強固に組織に固定される。これにより、前記構造体は、物理的に強固に、組織の表面に接着される。

　なお、本実施形態では、接着後固化するまで室温で放置したが、３７℃以下であれば硬化速度を上げるために加熱しても良い。

＜2成分系組織接着剤の製造方法＞
　次に、本発明の実施形態である2成分系組織接着剤の製造方法について説明する。
本発明の実施形態である2成分系組織接着剤の製造方法は、疎水化ゼラチンを合成して容器に充填する工程と、架橋用分子を別容器に充填する工程とを有する。

（疎水化ゼラチン合成及び充填工程）
　疎水化ゼラチン合成工程は、ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加し、前記ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化ゼラチンを合成する工程である。
　なお、前記ゼラチンとしては、分子量が１０,０００以上５０,０００未満となるものを選択する。

　まず、有機溶媒に溶解したゼラチンにトリエチルアミン存在下で、アミノ基に反応性を有する疎水性官能基を有する酸クロライドを混合して、混合溶液を容器に調製する。
　有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いる。
　有機分子としては、例えば、次式（４）に示すコレステリルクロロフォルメイトを挙げることができる。
　次に、前記混合溶液を、不活性ガス雰囲気下、加熱し、攪拌する。例えば、窒素雰囲気下、加熱温度は８０℃とし、攪拌時間は一昼夜とする。

　次に、この混合溶液を、氷冷したエタノール溶媒中に滴下する。次に、この溶液をガラスフィルター等で濾過する。
　更に、濾過物を有機溶媒で洗浄する。これにより、濾過物中の不純物を除去することができ、疎水化ゼラチンの純度を向上させることができる。この洗浄用の有機溶媒としては、例えば、エタノールあるいは酢酸エチルを用いる。
　以上の工程により、ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を疎水性官能基で置換した疎水化ゼラチンを生成でき、これを適宜、所定の量の水または緩衝液と混合した後、容器に充填して第１剤とする。

（架橋用分子充填工程）
　架橋用分子充填工程は、一分子内に２個以上の活性エステル基又は酸無水物を有する架橋用分子を第１剤とは別個の容器に充填する工程である。

　以上の工程により、前記の疎水化ゼラチンを含有する第１剤、及び架橋用分子を含有する第２剤とからなる2成分系組織接着剤を製造することができる。
　なお、本発明の実施形態である2成分系組織接着剤においては、第１剤中に、未修飾のゼラチン（オリジナルゼラチンと呼称する）を更に混合して、組織接着剤中の疎水化ゼラチンの割合を最適な値に調製して、接着強度をより向上させてもよい。

　なお、組織接着剤を製造する際は、本発明の実施形態である疎水化ゼラチンを製造してから、所定の量の水または緩衝液を混合すればよい。水または緩衝液のｐＨを適宜設定することにより、固化までの時間を適宜設定することができる。

　本発明の実施形態である2成分系組織接着剤は、疎水化ゼラチンを含有する第１剤、及び架橋用分子を含有する第２剤からなるものであり、当該疎水化ゼラチンは、その側鎖にアミノ基と疎水性官能基とを備えており、架橋用分子は２個以上の活性エステル基又は酸無水物を有する構成をとる。そのため、当該疎水化ゼラチン同士のアミノ基同士および生体組織中に存在するコラーゲンなどのタンパク質のアミノ基同士を、架橋用分子の活性エステル基または酸無水物で架橋して、化学的に強固な結合を形成することができる。更には、当該疎水性官能基を組織に打ち込んで（アンカーリングして）物理的に強固な結合を形成して、接着強度を高くすることができるとともに、疎水化ゼラチンを創傷治癒過程において酵素（コラゲナーゼ）により容易に分解するため、炎症反応、石灰化などを抑制できる。

　本発明の実施形態である2成分系組織接着剤においては、前記疎水化ゼラチンが、２個以上のアミノ酸が直鎖状に連結された高分子であり、且つ当該アミノ酸中のＬｙｓ残基の一部が疎水性官能基で一部置換されている構成をとる。そのため、当該疎水化ゼラチン中に存在するアミノ基同士を、架橋用分子の活性エステル基で架橋して、化学的に強固な結合を形成することができ、接着強度を高くすることができるとともに、疎水化ゼラチンを創傷治癒過程において酵素（コラゲナーゼ）により容易に分解させることができ、生体親和性を高くすることができる。

　本発明の実施形態である2成分系組織接着剤においては、前記疎水性官能基がコレステリル基、オレイル基、イソステアリル基、ステアリル基、イソパルミチル基、ミリスチル基、ラウリル基、カプリン基、ペラルゴル基、カプリル基、カプロル基、α－リロレニル基、ステアリドニル基、エイコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエニル基からなる群より選択される１種、または２種以上の組み合わせである構成をとる。そのため、当該疎水性官能基を組織に打ち込んで（アンカーリングして）物理的に強固な結合を形成して、接着強度を高くすることができる。

　本発明の実施形態である2成分系組織接着剤においては、ヒト、ブタ、ウシ、魚由来の天然ゼラチン、又はこれらの遺伝子組換えゼラチンからなる群より選択される１種、または２種以上の組み合わせであるゼラチンを含む構成をとる。そのため、組織接着剤の結合を化学的に強固な結合にすることができる。

　本発明の実施形態である2成分系組織接着剤においては、前記疎水化ゼラチンの分子量が１００００以上５００００未満である構成をとる。そのため、組織接着剤の結合を化学的に強固な結合にすることができる。

　本発明の実施形態である2成分系組織接着剤においては、前記架橋用分子が、ゲニピン又は、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサル酢酸、ｃｉｓ－アコニット酸、２－ケトグルタル酸、ポリ酒石酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸からなる群から選ばれる１種、または２種以上の組合せであって、前記分子の一分子中に２個以上の活性エステル基を有するもの又は酸無水物である構成をとる。そのため、疎水化ゼラチン同士のアミノ基同士および生体組織中に存在するコラーゲンなどのタンパク質のアミノ基同士を、架橋用分子の活性エステル基または酸無水物で架橋して、組織接着剤の結合を化学的に強固な結合にすることができる。

　本発明の実施形態である2成分系組織接着剤の製造方法においては、ゼラチンを溶解させた溶液にトリエチルアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加し、前記ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化ゼラチンを合成して、これを第１容器に充填する工程、及び一分子内に２個以上の活性エステル基又は酸無水物を有する架橋用分子を第２容器に充填する工程、を有する構成をとる。そのため、接着強度が高く、かつ、生体親和性の高い組織接着剤を容易に製造できる。

　本発明の実施形態である2成分系組織接着剤及びその製造方法は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
（疎水化ゼラチン（コレステリル化ゼラチン）の合成）
　まず、ゼラチン３００ｇを２．９７ＬのＤＭＳＯ中で撹拌して溶解し８０℃に保った。次に、０．０３Ｌのトリエチルアミンを添加した。
　次に、ゼラチンのアミノ基に対して１０％となるようコレステリル化クロロフォルメイト（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ　ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）を添加し、８０℃で撹拌して溶解し、窒素雰囲気化で一昼夜撹拌しながら反応させた。

　次に、得られた粗コレステリル化ゼラチン溶液を氷冷した９Ｌエタノール中に添加して反応を停止し、反応物を析出させた後、ガラスフィルターでろ過した。さらに３Ｌのエタノールでさらに３回洗浄した。さらに残渣を３Ｌの酢酸エチルで３回洗浄した後、凍結乾燥し白色の固体（コレステリル化ゼラチン）を得た。

（架橋用分子との混合：組織接着剤の調製）
　得られた疎水化ゼラチン（分子量２００００）をオリジナルゼラチン（分子量２００００）と種々の割合で混合した溶液を０．１Ｍ－リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）により調製した。得られた溶液２００μＬをスクシンイミジル基／アミノ基がモル比で１となるように架橋用分子であるＤＳＴと混合した。その後、５秒間攪拌することにより、組織接着剤を調製した。
　実施例１では、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製した。
　なお、分子量２００００、コレステロール導入率１０％の収量は、２５０．３ｇであり収率８２％であった。実施例１の組織接着剤の接着強度は、５８．２ｋＰａであった。
　コレステリル基の導入は、プロトン核磁気共鳴装置（１Ｈ－ＮＭＲ）によりＣ１８プロトンのピークを０．６７ｐｐｍ付近に確認した。

（組織接着剤の接着強度評価）
　まず、一面の約１／３の面積（１ｃｍ×１ｃｍ）を覆うようにコラーゲンケーシングを貼付したプラスチック板（縦３ｃｍ、横１ｃｍ、厚さ０．５ｍｍ）を２枚準備した。
　次に、一のプラスチック板に貼り付けたコラーゲンケーシングの一面に、実施例１の組織接着剤を塗布した。なお、前記塗布は、前記得られた疎水化ゼラチンをオリジナルゼラチンと種々の割合で混合したリン酸緩衝溶液に、ＤＳＴを分散させてから、すぐに実施した。
　次に、他のプラスチック板に貼り付けたコラーゲンケーシングの一面を押し付け、５０ｇの錘を乗せた状態で、３７℃で１０分間放置した。

　次に、公知の引張試験機（テクスチャーアナライザーＴＡ．ＸＴｐｌｕｓ（英弘精機））により、プラスチック基板の一面に平行な方向であって、互いに逆の方向に、０．１ｍｍ／ｓの速度及び環境温度２５℃の条件で、引張力を加えて、２枚のプラスチック板の引張試験を行った。
　これにより、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製した実施例１の組織接着剤の接着強度（平均）は、５７．１ｋＰａであった。なお、接着強度（平均）は、１回目から３回目までの平均の値を示すものであり、１回目とは、ある条件で単独に測定したものである。２回目とは１回目と同一条件で単独に調製した接着剤の強度である。３回目とは、１，２回目と同一条件で単独に調製した接着剤の強度である。

（組織接着剤の生体親和性評価（１））
　種々の組成を有する組織接着剤硬化物を直径８ｍｍ、厚さ１ｍｍに成形し、ラット背部皮下における分解性および周辺組織の炎症を３～２８日間経時的に評価した。
比較例として、ＧＲＦグルー（日本ビー・エックス・アイ株式会社）を用いた。

（組織接着剤の生体親和性評価（２））
　種々の組成を有する組織接着剤硬化物を直径５ｍｍ、厚さ１ｍｍに成形し、炎症性の転写因子レセプターのプロモーター領域にルシフェラーゼ活性のある遺伝子改変マウス（２０週齢、ＢＡＬＢ／Ｃ－Ｔｇ（ＮＦκＢ－ＲＥ－ｌｕｃ）－Ｘｅｎ）の背部皮下に埋入した。７日後、炎症の程度を３００μＬのルシフェリン腹腔内投与１５分後の発光をＩＶＩＳ　ＬｕｍｉｎａII（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製）を用いて発光量（ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃ）を評価した。３匹に埋入した組織接着剤硬化物の平均値を発光量とした。比較例として、ＧＲＦグルー（日本ビー・エックス・アイ株式会社）を用いた。

（実施例２）
　組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が２０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製した他は実施例１と同様にして、実施例２の組織接着剤を製造した。
　実施例２の組織接着剤の接着強度は、６１．５ｋＰａであった。また、１４日で分解吸収性が認められ、生体親和性を示した。

（実施例３）
　組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が３０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製した他は実施例１と同様にして、実施例３の組織接着剤を製造した。
　実施例３の組織接着剤の接着強度は、５８．６ｋＰａであった。

（実施例４）
　組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が５０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製した他は実施例１と同様にして、実施例４の組織接着剤を製造した。
　実施例４の組織接着剤の接着強度は、６２．０ｋＰａであった。

（実施例５）
　組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が７０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製した他は実施例１と同様にして、実施例５の組織接着剤を製造した。
　実施例５の組織接着剤の接着強度は、６８．５ｋＰａであった。
　また、１４日で分解吸収性が認められ、生体親和性を示した。また、実施例５の遺伝子改変マウスを用いたＮＦκＢ－ＲＥの発光量は、３００．７７（ｘ１０⁶ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃ）であり、生体親和性を示した。

（実施例６）
　組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１００（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製した他は実施例１と同様にして、実施例６の組織接着剤を製造した。
　実施例６の組織接着剤の接着強度は、５４．７ｋＰａであった。

（実施例７）
　組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で２となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例７の組織接着剤を製造した。
　実施例７の組織接着剤の接着強度は、６２．０ｋＰａであった。

（実施例８）
　組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が２０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で２となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例８の組織接着剤を製造した。
　実施例１０の組織接着剤の接着強度は、７５．０ｋＰａであった。また、実施例１０の遺伝子改変マウスを用いたＮＦκＢ－ＲＥの発光量は、２８２．１７（ｘ１０⁶ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃ）であり、生体親和性を示した。

（実施例９）
　組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が３０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で２となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例９の組織接着剤を製造した。
　実施例９の組織接着剤の接着強度は、５１．１ｋＰａであった。

（実施例１０）
　組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が５０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で２となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例１０の組織接着剤を製造した。
　実施例１０の組織接着剤の接着強度は、６３．０ｋＰａであった。

（実施例１１）
　組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が７０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で２となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例１１の組織接着剤を製造した。
　実施例１１の組織接着剤の接着強度は、５８．９ｋＰａであった。

（実施例１２）
　組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１００（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で２となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例１２の組織接着剤を製造した。
　実施例１２の組織接着剤の接着強度は、５５．９ｋＰａであった。

（実施例１３）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１０（ｗｔ％）（最終濃度６０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で０．２となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例１３の組織接着剤を製造した。
　なお、分子量５００００、コレステロール導入率１０％の収量は、２５２．２ｇであり収率８１％であった。コレステリル基の導入は、プロトン核磁気共鳴装置（１Ｈ－ＮＭＲ）によりＣ１８プロトンのピークを０．６７ｐｐｍ付近に確認した。
　実施例１３の組織接着剤の１０分後の接着強度は、１１．６ｋＰａであった。

（実施例１４）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１０（ｗｔ％）（最終濃度６０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で０．５となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例１４の組織接着剤を製造した。
　実施例１４の組織接着剤の１０分後の接着強度は、１２．２ｋＰａであった。

（実施例１５）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１０（ｗｔ％）（最終濃度６０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で１となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例１５の組織接着剤を製造した。
　実施例１５の組織接着剤の１０分後の接着強度は、１３．９ｋＰａであった。

（実施例１６）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１０（ｗｔ％）（最終濃度６０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で２となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例１６の組織接着剤を製造した。
　実施例１６の組織接着剤の１０分後の接着強度は、５．５ｋＰａであった。

（実施例１７）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で０．２となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例１７の組織接着剤を製造した。
　実施例１７の組織接着剤の１０分後の接着強度は、１７．１ｋＰａであった。

（実施例１８）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で０．５となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例１８の組織接着剤を製造した。
　実施例１８の組織接着剤の１０分後の接着強度は、３０．１ｋＰａであった。

（実施例１９）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で１となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例１９の組織接着剤を製造した。
　実施例１９の組織接着剤の１０分後の接着強度は、２２．８ｋＰａであった。

（実施例２０）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が２０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で１となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例２０の組織接着剤を製造した。
　実施例２０の組織接着剤の１０分後の接着強度は、２８．６ｋＰａであった。

（実施例２１）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が３０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で１となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例２１の組織接着剤を製造した。
　実施例２１の組織接着剤の１０分後の接着強度は、２４．１ｋＰａであった。

（実施例２２）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が５０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で１となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例２２の組織接着剤を製造した。
　実施例２２の組織接着剤の１０分後の接着強度は、１８．９ｋＰａであった。

（実施例２３）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が７０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で１となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例２３の組織接着剤を製造した。
　実施例２３の組織接着剤の１０分後の接着強度は、２４．３ｋＰａであった。

（実施例２４）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１００（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で１となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例２４の組織接着剤を製造した。
　実施例２４の組織接着剤の１０分後の接着強度は、２６．９ｋＰａであった。

（実施例２５）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が１０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で２となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例２５の組織接着剤を製造した。
　実施例２５の組織接着剤の１５分後の接着強度は、１９．５ｋＰａであった。
また、７日で分解吸収性が認められ、生体親和性を示した。

（実施例２６）
　分子量５００００のゼラチンおよびコレステリル化ゼラチンを用いて、組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が８０（ｗｔ％）（最終濃度７０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で２となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例２６の組織接着剤を製造した。
　実施例２６の組織接着剤の１５分後の接着強度は、２５．９ｋＰａであった。
また、７日で分解吸収性が認められ、生体親和性を示した。

（実施例２７）
　組織接着剤中のコレステリル化ゼラチンの質量％が８０（ｗｔ％）（最終濃度８０ｗｔ％）となるように調製し、スクシンイミジル基／アミノ基がモル比で２となるようにした他は実施例１と同様にして、実施例２７の組織接着剤を製造した。
　実施例２７の組織接着剤の接着強度は、７６．２ｋＰａであった。但し、最終濃度７０ｗｔ％のものと比較して、粘性が高く操作性が劣っていた。

（比較例１）
　市販のアルデヒド系接着剤ＧＲＦグルー（日本ビー・エックス・アイ株式会社）を用いた他は実施例１と同様にして、比較例１の接着強度および生体親和性を評価した。
　比較例１の組織接着剤の接着強度は、４１．２ｋＰａであった。
　また、１４日においても分解吸収性が認められず、生体親和性が低かった。また、比較例１の遺伝子改変マウスを用いたＮＦκＢ－ＲＥの発光量は、５１６．３０（×１０⁶ｐｈｏｔｏｎ／ｓｅｃ）であり、実施例と比較して炎症性を示した。

（比較例２）
　分子量２０００のコレステリル化ゼラチンも同様に合成したが、溶液粘度が低く接着強度が得られなかった。

　表１に、実施例１～６の条件及び接着強度をまとめた。

　表２に、実施例７～１２の条件及び接着強度をまとめた。

　表３に、実施例１３～１６の条件及び接着強度をまとめた。

　表４に、実施例１７～１８の条件及び接着強度をまとめた。

　表５に、実施例１９～２４の条件及び接着強度をまとめた。

　表６に、実施例２５～２６の条件及び接着強度をまとめた。

　表７に、実施例２７の条件及び接着強度をまとめた。

　表８に、比較例１の条件及び接着強度をまとめた。

　表９および表１０に、生体親和性の結果をまとめた。

　表１～８に示すように、実施例１～２７の組織接着剤の接着強度は、比較例１の組織接着剤の接着強度に比べて高いものであった。また、表９に示すように、実施例２、５、８、２７、２５、２６の組織接着剤の生体親和性（分解性）は、比較例１の組織接着剤の生体親和性に比べて高いものであった。また、表１０に示すように、実施例５、８の組織接着剤の炎症性は、比較例１の組織接着剤の炎症性に比べて低く、実施例５、８の生体親和性が高いものであった。

（実施例２８）
ブタ血管中膜を用いた疎水化ゼラチン-ＤＳＴ接着剤の接着試験
（実験方法）
　ブタ血管中膜を露出させ、１ｃｍ×３ｃｍに切り出し、基材として用いた。分子量２０,０００の疎水化ゼラチンを０．１Ｍ、ｐＨ６のＰＢＳで７０w/v&に調製し、３７℃に保った。そこに、ゼラチン中のアミノ基：ＤＳＴスクシンイミジル基が１：１となるように秤量したジスクシンイミジル・タルタレート（ＤＳＴ）粉末を添加した。ペンシルミキサーで５秒間撹拌し、すぐに暑さ０．５ｍｍの１ｃｍ×１ｃｍに切りぬいたシリコーンシートでマスクした基材に塗布し、３７℃で１０分間インキュベートし、直ちに接着強度を測定した。

（結果と考察）
　せん断試験の結果を図４～図６に示す。
　図４中、Ｈｘはヘキサノイル基、Ｐａｍはパルミトイル基、Ｓｔｅはステアリル基、Ｏｌｅはオレイル基を意味する。また、１０Ｈｘ、１０ＯＰａｍ、１０Ｓｔｅ、１０Ｏｌｅは、それぞれゼラチン中のアミノ基に対する疎水基導入率が１０％であることを意味する。また５０Ｈｘ、５０ＯＰａｍ、５０Ｓｔｅ、５０Ｏｌｅは、それぞれゼラチン中のアミノ基に対する疎水基導入率が５０％であることを意味する。ＧＲＦは、市販品のＧＲＦグルーを意味し、Ｇｌｔｎは、未処理ゼラチンを意味する。
　図５中、３０％-１０Ｏｌｅは、疎水化率１０％のゼラチンと未処理のゼラチンを３０：７０（w/w）で混合したものを意味する。５０％-１０Ｏｌｅは、疎水化率１０％のゼラチンと未処理のゼラチンを５０：５０（w/w）で混合したものを意味する。７０％-１０Ｏｌｅは、疎水化率１０％のゼラチンと未処理のゼラチンを７０：３０（w/w）で混合したものを意味する。１００％-１０Ｏｌｅは、疎水化率１０％のゼラチンを意味する。
　図６中、３０％-１０Ｓｔｅは、疎水化率１０％のゼラチンと未処理のゼラチンを３０：７０（w/w）で混合したものを意味する。５０％-１０Ｓｔｅは、疎水化率１０％のゼラチンと未処理のゼラチンを５０：５０（w/w）で混合したものを意味する。７０％-１０Ｓｔｅは、疎水化率１０％のゼラチンと未処理のゼラチンを７０：３０（w/w）で混合したものを意味する。１００％-１０Ｓｔｅは、疎水化率１０％のゼラチンを意味する。
　２０－１０Ｓｔｅ（ステアリル基）及びＯｌｅ（オレイル基）において、効果的な接着強度が確認された。これはゲルの強度自体が高いこと、ステアロイル基の基材への浸透によるものと示唆される。疎水基の導入率が多くなると、接着強度は弱くなった。

　本発明の2成分系組織接着剤及びその製造方法は、接着強度が高く、かつ、生体親和性の高い特性を有する組織接着剤に関するものなので、組織接着剤、組織封止剤（Ｓｅａｌａｎｔ）、止血剤等を必要とする産業等において利用可能性がある。

Claims

　側鎖にアミノ基と疎水性官能基とを備えた疎水化ゼラチンを含有する第1剤；及び
　一分子内に２個以上の活性エステル基又は酸無水物を有する架橋用分子を含有する第2剤；からなる、2成分系組織接着剤。
　前記疎水化ゼラチンが、２個以上のアミノ酸が直鎖状に連結された高分子であり、且つ当該アミノ酸中のＬｙｓ残基の一部が前記疎水性官能基で置換されている、請求項１に記載の2成分系組織接着剤。
　前記疎水性官能基がコレステリル基、オレイル基、イソステアリル基、ステアリル基、イソパルミチル基、ミリスチル基、ラウリル基、カプリン基、ペラルゴル基、カプリル基、カプロル基、α－リロレニル基、ステアリドニル基、エイコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエニル基からなる群より選択される１種、または２種以上の組み合わせである、請求項１又は請求項２に記載の2成分系組織接着剤。
　ヒト、ブタ、ウシ、魚由来の天然ゼラチン、及びこれらの遺伝子組換えゼラチンからなる群より選択される、１種、または２種以上の組み合わせであるゼラチンを前記第1剤に更に含むことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の2成分系組織接着剤。
　前記疎水化ゼラチンの分子量が１００００以上５００００未満である、請求項１～４のいずれか一項に記載の2成分系組織接着剤。
　前記架橋用分子が、ゲニピン、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサル酢酸、ｃｉｓ－アコニット酸、２－ケトグルタル酸、ポリ酒石酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、及びポリアスパラギン酸からなる群から選ばれる、１種または２種以上の組合せである、請求項１～５のいずれか一項に記載の2成分系組織接着剤。
　ゼラチンを溶解させた溶液にアミン存在下で疎水性官能基を有する有機分子を添加し、前記ゼラチンの側鎖のアミノ基の一部を前記疎水性官能基で置換して、疎水化ゼラチンを合成して、これを第１容器に充填する工程；及び
　一分子内に２個以上の活性エステル基又は酸無水物を有する架橋用分子を第２容器に充填する工程；
を有する、2成分系組織接着剤の製造方法。