WO2012036193A1 - P2x7受容体阻害物質を有効成分とする脂肪性肝疾患治療剤 - Google Patents

P2x7受容体阻害物質を有効成分とする脂肪性肝疾患治療剤 Download PDF

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receptor
fld
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阿部　邦威
敦生 田原
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for fatty liver disease (FLD) comprising a P2X 7 receptor inhibitor as an active ingredient.
  • FLD fatty liver disease
  • FLD is a disease that causes liver damage due to abnormal accumulation of fat in hepatocytes.
  • the initial pathology of FLD is simple fatty liver in which only hepatocytes have fat deposits, followed by hepatocyte necrosis, steatohepatitis with inflammation and fibrosis, advanced fibrosis, fibrosis, and cirrhosis and liver cancer It is known that the condition progresses.
  • causes of fat deposition in the liver include excessive alcohol intake, obesity, diabetes, abnormal lipid metabolism, drugs (steroids, tetracycline, etc.), Wilson disease, poisoning (yellow phosphorus, etc.), severe nutritional disorders, etc. .
  • the causes of FLD are broadly divided into those derived from alcohol and those derived from non-alcohol.
  • the liver disease caused by the former is called alcoholic liver disorder, and the liver disease caused by the latter is called nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD).
  • NAFLD has no history of alcohol consumption that causes liver damage (the amount of alcohol is 20 g / day or less) and eliminates obvious causes such as viral hepatitis and autoimmune hepatitis. It is defined as a disease that causes fat deposition. NAFLD is roughly classified into simple fatty liver and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Simple fatty liver is a condition in which only hepatic fat deposits are observed.
  • NASH hepatocellular injury such as oxidative stress, endotoxin, fatty acid and / or cytokine
  • inflammation, hepatocyte necrosis, balloon-like change, and steatohepatitis with fibrosis develop.
  • NASH is considered to be a severe form of NAFLD, and NASH is progressive compared to simple prosthetic liver prognosis, with 5-20 % Have been reported to progress to cirrhosis. In the United States, more than 20% of the total population suffers from NAFLD, and the incidence of NASH is said to be 2-3%. In Japan, NASH is estimated to be more than 1% of all adults. In order to prevent progression to liver cirrhosis or liver dysfunction, it is considered that treatment with NAFLD or NASH is necessary at an early stage.
  • NAFLD The principle of treatment for NAFLD is to improve lifestyle such as diet and exercise, but it is difficult to implement reliably and has not been fully effective. In many cases, it is accompanied by insulin resistance, obesity, diabetes and hyperlipidemia. Therefore, thiazolidine derivatives that are insulin resistance improvers, biguanides, vitamin E that is an antioxidant, and dyslipidemia Attempts have been made to treat certain fibrates, but they have not been fully effective and none have been approved for the treatment of NASH. In addition, polyemphosphatidylcholine (EPL), which is marketed as a treatment for simple fatty liver, is mentioned, but its therapeutic effect on NASH has not been clarified. As described above, at present, a sufficient treatment method has not been established for FLD, particularly NASH or NAFLD, and development of a therapeutic agent having high effectiveness for these diseases is desired.
  • EPL polyemphosphatidylcholine
  • the P2X 7 receptor is a kind of cation channel type purine receptor and is mainly expressed in monocytes, macrophages, mast cells, etc. (Physiol. Rev. 2002, 82, 1013-1067).
  • the receptor has ATP as a ligand, and its activation leads to secretion of inflammatory cytokines IL-1 ⁇ and IL-18, and is known as a receptor involved in the development of various immunity and inflammatory diseases (Immunity 2001, 15, 825-835). Furthermore, inhibition of the production of inflammatory cytokines such as IL-1 ⁇ and IL-18 by inhibiting P2X 7 receptor has been confirmed, suggesting that P2X 7 receptor inhibitors are effective in treating inflammatory diseases. (Non-Patent Document 1).
  • Examples of immune / inflammatory diseases involving P2X 7 receptor include rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases, osteoarthritis, uveitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, inflammatory bowel disease, etc. It is done. Furthermore, P2X 7 receptor has been reported to be involved in neuropathic pain, and P2X 7 receptor inhibitors have been described as useful as preventive or therapeutic agents for various neuropathic pain and related diseases (non- Patent Document 2, Non-Patent Document 3).
  • Patent Literature 1-8 and Non-Patent Literature 1-3 are, for example, in Patent Literature 1, chronic rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriasis, allergic dermatitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), airway hyperresponsiveness, septic shock, glomerulonephritis, irritable bowel disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, atherosclerosis, malignant cell proliferation and metastasis, myoblast leukemia, diabetes It is known to be useful for diseases such as Alzheimer's disease, meningitis, osteoporosis, burn injury, and ischemic heart disease.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • Respiratory tube Obstructive airway disease: including asthma (including bronchial asthma, allergic asthma, intrinsic asthma, extrinsic asthma, exercise-induced asthma, drug-induced asthma (including aspirin-induced and NSAID-induced), and dust-induced asthma ) (Including both intermittent and persistent, including all severity and including other causes of airway hyperresponsiveness); chronic obstructive pulmonary disease (COPD); bronchitis (infectious and eosinophils) Emphysema; bronchiectasis; cystic fibrosis; sarcoidosis and the like.
  • asthma including bronchial asthma, allergic asthma, intrinsic asthma, extrinsic asthma, exercise-induced asthma, drug-induced asthma (including aspirin-induced and NSAID-induced), and dust-induced asthma )
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • bronchitis infectious and eosinophils
  • Emphysema Emphysema
  • Bones and joints Arthritis with or including osteoarthritis / both osteoarthritis (including both primary and secondary) (eg congenital pelvic dysplasia); cervical spondylitis and lumbar spondylitis, and back and neck pain; rheumatoid arthritis and Still's disease, etc. .
  • osteoporosis Paget's disease, or osteonecrosis
  • Polychondritis scleroderma, mixed connective tissue disease, spondyloarthropathy, or periodontal disease (eg periodontitis).
  • Skin Psoriasis, atopic dermatitis, contact dermatitis, or other eczema skin diseases, and delayed-type hypersensitivity reactions; such as plant and photodermatitis.
  • eye Blepharitis; conjunctivitis (including perennial and spring allergic conjunctivitis); irisitis; anterior and posterior uveitis, etc.
  • Gastrointestinal tract Glossitis, gingivitis, periodontal disease; esophagitis (including reflux); eosinophilic gastroenteritis, mastocytosis, Crohn's disease, colitis, etc. abdomen: Hepatitis (including autoimmunity, alcoholic and viral); liver fibrosis and cirrhosis; cholecystitis; pancreatitis (including both acute and chronic); Urogenital organs: Nephritis (including interstitial nephritis and glomerulonephritis); nephrotic syndrome; cystitis (including acute cystitis and chronic (interstitial) cystitis) and Hunner ulcer; acute and chronic urethritis, prostatitis and the like.
  • Allograft rejection For example, acute and chronic rejection after kidney, heart, liver, lung, bone marrow, skin or cornea transplant, or after blood transfusion.
  • CNS Alzheimer's disease and other dementing diseases (including CJD and nvCJD); amyloidosis; multiple sclerosis and other demyelinating syndromes; cerebral arteriosclerosis and vasculitis.
  • Cardiology Atherosclerosis affecting coronary vessels and peripheral circulation; epicarditis and the like.
  • tumor Prostate cancer, breast cancer, lung cancer, uterine cancer, pancreatic cancer, intestinal and colon cancer, etc.
  • Gastrointestinal tract Celiac disease, proctitis, eosinophilic gastroenteritis, mastocytosis, Crohn's disease, ulcerative colitis, etc.
  • the P2X 7 receptor inhibitor disclosed in Patent Document 12-16 is known to be useful for the following diseases, for example, in Patent Document 12.
  • Chronic joint pain conditions are rheumatoid arthritis, osteoarthritis, rheumatoid spondylitis, gouty arthritis and juvenile arthritis. Pain associated with functional bowel disorders is non-ulcer dyspepsia, non-cardiac chest pain and irritable bowel syndrome.
  • Neuropathic pain syndromes include diabetic neuropathy, sciatica, nonspecific low back pain, trigeminal neuralgia. Fever, inflammation, immune disease, abnormal platelet function (eg, vaso-occlusive disease), impotence or erectile dysfunction; bone disease characterized by abnormal bone metabolism or resorption; non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAID's ) And cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitors, hemodynamic side effects, cardiovascular disease; neurodegenerative diseases and neurodegeneration, neurodegeneration after trauma, tinnitus, dependence-inducing substances such as opioids (eg morphine) Dependence on CNS inhibitors (eg ethanol), psychostimulants (eg cocaine) and nicotine; complications of type 1 diabetes, kidney dysfunction, liver dysfunction (eg hepatitis, cirrhosis), gastrointestinal disorders (eg Diarrhea) etc.
  • opioids eg morphine
  • CNS inhibitors eg ethanol
  • psychostimulants eg
  • Inflammatory conditions include skin conditions (eg, sunburn, burns, eczema, dermatitis, allergic dermatitis, psoriasis), meningitis, eye diseases such as glaucoma, retinitis, retinopathy, uveitis and eye tissue Acute injury (eg, conjunctivitis); inflammatory lung disorders (eg, asthma, bronchitis, emphysema, allergic rhinitis, respiratory distress syndrome, Aicho's disease, farmer's lung, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), Airway hypersensitivity).
  • the immune disease is an autoimmune disease, an immunodeficiency disease or an organ transplant.
  • Bone diseases characterized by abnormal bone metabolism or resorption include osteoporosis (especially postmenopausal osteoporosis), hypercalcemia, hyperparathyroidism and the like.
  • Cardiovascular diseases include hypertension or myocardial ischemia; atherosclerosis; functional or organic venous failure.
  • Neurodegenerative diseases are dementia, especially degenerative dementia (senile dementia, dementia associated with Lewy bodies, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's chorea, Parkinson's disease and Creutzfeldt-Jakob disease, muscle atrophic side. Including sclerosis (ALS) and motor neuron disease).
  • ALS sclerosis
  • the present invention provides a therapeutic agent for FLD, preferably NAFLD, particularly a therapeutic agent for NASH, comprising a P2X 7 receptor inhibitor as an active ingredient.
  • Hepatitis disclosed in Patent Document 9-16 above are considered to be intended to simply inflammation in the liver, which is inferred from the context of the street inflammatory cytokines and P2X 7 receptors described above.
  • these patent documents and non-patent documents have no report on the treatment of FLD via the P2X 7 receptor, and there is no suggestion related thereto.
  • the state of the liver is determined by measuring aspartate aminotransferase (ALT) and alanine aminotransferase (AST) levels in the blood, but these references are pharmacological tests related to liver disease. Not disclosed.
  • the present invention relates to the following (1) to (7).
  • a preventive or therapeutic agent for FLD comprising a P2X 7 receptor inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating FLD comprising a P2X 7 receptor inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a method for preventing or treating FLD comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of a P2X 7 receptor inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a method for preventing or treating FLD comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of a substance that binds to P2X 7 receptor and inhibits the function of this receptor, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a therapeutically effective amount of a substance having a function of binding to the P2X 7 receptor and suppressing calcium influx into cells expressing this receptor or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to a patient.
  • a method for preventing or treating FLD comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of a P2X 7 receptor inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention is useful as a preventive or therapeutic agent for FLD by inhibiting P2X 7 receptor.
  • the present invention is also useful for providing a preventive or therapeutic agent for NAFLD by inhibiting this receptor.
  • the present invention is particularly useful as a preventive or therapeutic agent for NASH by inhibiting this receptor.
  • Example 2 shows the action on plasma AST and ALT in Example 1.
  • Student's t-test between normal diet and high-fat high-cholesterol diet (Vehicle) group, # between vehicle and compound-administered group at high-fat high-cholesterol diet load As a result of using Dunnett's multiple range test, it was shown that there was a significant difference of less than 5% of each risk.
  • the vertical axis shows plasma AST and ALT activity.
  • the horizontal axis indicates the amount of the test compound.
  • Normal indicates a normal food group.
  • Vehicle indicates a high fat and high cholesterol diet group.
  • Example 2 shows the action on plasma IL-1 ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ in Example 1.
  • # indicates the vehicle group and the compound-administered group at high-fat high-cholesterol diet load
  • the vertical axis represents plasma IL-1 ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ levels, respectively.
  • the horizontal axis indicates the amount of the test compound.
  • Normal indicates a normal food group.
  • Vehicle indicates a high fat and high cholesterol diet group.
  • FLD is a general term for diseases in which neutral fat is deposited in hepatocytes and causes liver dysfunction, and is also generally referred to as fatty liver in clinical practice.
  • FLD can be classified according to its etiology into alcoholic fatty liver disease in which the patient's drinking calendar is recognized as the etiology, and NAFLD in which the drinking calendar is not identified as the etiology.
  • FLD includes both alcoholic fatty liver disease and NAFLD.
  • NAFLD is an embodiment of FLD.
  • NAFLD has no history of alcohol consumption enough to cause liver damage (the amount of alcohol is 20 g / day or less), and alcoholic liver damage to the liver that excludes obvious causes such as viral hepatitis and autoimmune hepatitis It is a disease with similar fat deposits.
  • NAFLD is a concept that includes non-alcoholic simple fatty liver and NASH.
  • NASH is a disease in which alcoholism is not recognized as an etiology, but hepatic steatosis accompanied by necrosis, inflammation, or fibrosis is observed as a symptom in liver tissue.
  • P2X 7 receptor means the official name purinergic receptor p2x, ligand-gated ion channel, 7.
  • p2x7, p2rx7, p2x7r, and p2z are known as aliases of the receptor.
  • the P2X 7 receptor inhibitor means a substance that exhibits receptor affinity for the P2X 7 receptor and inhibits the function of the receptor. P2X 7 binding to a receptor comprising a compound that inhibits the function of the receptor.
  • affinity for P2X 7 receptor A compound that exhibits sex and inhibits the function of the receptor is an IC 50 value of 100 ⁇ M or less, a compound having an activity of 50 ⁇ M or less, or a compound having an activity of 10 ⁇ M or less.
  • a substance having a function of binding to the P2X 7 receptor and suppressing calcium inflow to cells expressing this receptor has, for example, an action of suppressing calcium inflow into human cells by the experimental method described in Example 5 below. It is a substance.
  • the P2X 7 receptor inhibitor is, for example, the experimental method described in Patent Document 3, page 32, line 21-page 33, line 22 or the experimental method of Example 5 described later or an evaluation method obvious to those skilled in the art according to these. accordingly it is possible to evaluate the P2X 7 receptor inhibitory activity of compounds is obtained by screening compounds that P2X 7 receptor inhibitory activity is observed.
  • HTS High-throughput screening
  • a compound to be evaluated a newly synthesized compound, a commercially available compound, a compound synthesized by combinatorial chemistry, a compound registered in a compound library composed of these, or a known compound can be used. .
  • various natural compounds and their derivatives isolated from microorganisms or animals and plants can be used.
  • further P2X 7 receptor inhibitors can be obtained by developing peripheral derivatives of compounds having P2X 7 receptor inhibitory activity obtained by HTS evaluation.
  • P2X 7 receptor inhibitors include, for example, P2X 7 receptor inhibitor described in the literature below.
  • International Publication No. WO2001 / 094338 Pamphlet Journal of Medicinal Chemistry, 2007, Volume 50, pages 5882-5588
  • International Publication No. WO2000 / 061569 International Publication No.
  • P2X 7 a receptor inhibitors include acceptable salts eg compound selected from the group of compounds shown below or a pharmaceutically.
  • one aspect of FLD is NAFLD, and another aspect is NASH.
  • the P2X 7 receptor inhibitor may form an acid addition salt or a salt with a base, and is included in the present invention as long as such a salt is a pharmaceutically acceptable salt.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Acid addition salts with organic acids such as lactic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, aspartic acid, glutamic acid, inorganic bases such as sodium, potassium, magnesium, calcium, aluminum, methylamine, Examples include salts with organic bases such as ethylamine, ethanolamine, lysine, ornithine, ammonium salts, and the like.
  • the P2X 7 receptor inhibitor or pharmaceutically acceptable salt thereof may be various hydrates or solvates, and further includes those polymorphic substances.
  • Pharmaceutically acceptable salts of these P2X 7 receptor inhibitors can be produced by salt-forming methods that can be generally employed by those skilled in the art.
  • the P2X 7 receptor inhibitor includes various stereoisomer mixtures such as geometric isomers, tautomers, and optical isomers, and isolated substances. These isomers can be isolated and purified by known methods such as extraction, precipitation, fractional chromatography, fractional crystallization, recrystallization and the like.
  • the optical isomers can be resolved by a conventional method such as fractional crystallization by recrystallization with an appropriate salt or column chromatography.
  • the P2X 7 receptor inhibitor also includes a pharmacologically acceptable prodrug.
  • a pharmacologically acceptable prodrug is a compound that is converted to a P2X 7 receptor inhibitor by solvolysis or under physiological conditions.
  • prodrug “Progress in Medicine”, 1985, Volume 5, p.2157-2161 and “Drug Development”, Yodogawa Shoten, 1990, Volume 7, Molecular Examples include groups described in Design, p. 163-198.
  • Prodrugs of these P2X 7 receptor inhibitors can be readily prepared by methods those skilled in the art may be commonly employed.
  • a preparation containing a P2X 7 receptor inhibitor as an active ingredient is usually prepared using carriers, excipients, and other additives used for formulation.
  • Administration is oral by tablet, pill, capsule, granule, powder, liquid, etc., or parenteral by injection, intravenous injection, intramuscular injection, suppository, transdermal agent, nasal agent, inhalant, etc. Either form may be sufficient.
  • the dosage is appropriately determined depending on the individual case in consideration of symptoms, age of the administration subject, sex and the like.
  • the daily dose is about 0.001 to 100 per body weight. mg / kg, preferably 0.1-30 mg / kg, more preferably 0.1-10 mg / kg is appropriate and should be administered once or divided into 2 to 4 doses.
  • the daily dosage is about 0.0001 to 10 per body weight mg / kg is appropriate and should be administered once to several times a day.
  • a transmucosal agent about 0.001 to 100 per body weight Administer mg / kg once or multiple times daily.
  • the present P2X 7 receptor inhibitors can be used in combination with other prophylactic or therapeutic agents that would show efficacy against FLD.
  • the combination may be administered simultaneously, separately separately, or at desired time intervals.
  • the simultaneous administration preparation may be a combination drug or may be separately formulated.
  • the solid composition for oral administration according to the present invention tablets, powders, granules and the like are used.
  • one or more active substances are present in at least one inert excipient such as lactose, mannitol, glucose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch, polyvinylpyrrolidone, metasilicate. Mixed with magnesium aluminate acid.
  • the composition may contain an inert additive, for example, a lubricant such as magnesium stearate, a disintegrant such as sodium carboxymethyl starch, a solubilizer, and a solubilizing agent according to a conventional method. If necessary, tablets or pills may be coated with a sugar coating or a gastric or enteric coating agent.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs, etc., and include commonly used inert solvents such as purified water, ethanol, etc. .
  • the composition may contain adjuvants such as solubilizers, wetting agents, and suspending agents, sweeteners, corrigents, fragrances, and preservatives.
  • Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • aqueous solvent include distilled water for injection and physiological saline.
  • non-aqueous solvent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, alcohols such as ethanol, polysorbate 80 (trade name), and the like.
  • Such compositions may further contain isotonic agents, preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, solubilizers, and solubilizing agents. These are sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericidal agent or irradiation.
  • a sterile solid composition can also be used by producing a sterile solid composition and dissolving and suspending it in sterile water or a sterile solvent for injection before use.
  • External preparations include ointments, plasters, creams, jellies, poultices, sprays, lotions, eye drops, eye ointments and the like. Contains commonly used ointment bases, lotion bases, aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, and the like.
  • ointment or lotion bases include polyethylene glycol, propylene glycol, white petrolatum, white beeswax, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, glyceryl monostearate, stearyl alcohol, cetyl alcohol, lauromacrogol, sorbitan sesquioleate, etc.
  • Transmucosal agents such as inhalants and nasal agents are used in the form of solids, liquids, and semisolids, and can be produced according to conventionally known methods.
  • excipients such as lactose and starch, and pH adjusters, preservatives, surfactants, lubricants, stabilizers, thickeners and the like may be added as appropriate.
  • an appropriate device for inhalation or insufflation can be used.
  • a known device such as a metered dose inhalation device or a nebulizer
  • the compound is administered alone or as a powder in a formulated mixture or as a solution or suspension in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the dry powder inhaler or the like may be for single or multiple administration, and a dry powder or a powder-containing capsule can be used.
  • it may be in the form of a pressurized aerosol spray using a suitable propellant, for example, a suitable gas such as chlorofluoroalkane, hydrofluoroalkane or carbon dioxide.
  • Example 1 Evaluation in High Fatty High Cholesterol Diet Induced Mouse Hepatitis / Fibrosis Model This test was carried out according to the test method shown in Hepatology, 2007, 46, 1392-1403, and specifically, the following operation was performed.
  • the test compound is dissolved in purified water, mixed in a high-fat high-cholesterol powder feed (Research Diets D12336) at a rate of 0.33 ml / g, molded, freeze-dried, 150, 500, 1500 ppm (18, 60, 180 mg / kg / day equivalent) food containing compound was prepared.
  • CE-2 (manufactured by Claire Japan) was used as the normal food.
  • Male ICR mice (6 weeks old, manufactured by SLC Japan) are randomly divided into groups (5 cases each), and a normal diet containing no compound, a high fat high cholesterol diet, or a compound containing high fat high cholesterol diet. I gave it for 4 weeks.
  • Blood was collected from the abdominal vena cava under isoflurane anesthesia and the liver was removed. The blood was centrifuged (3000 rpm, 10 minutes), and ALT and AST were measured on the obtained supernatant plasma using a transaminase C-II test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • a part of the liver was immersed and fixed in formalin, and small pieces (about 100 mg) were stored frozen for lipid and hydroxyproline content measurement.
  • a tissue section was prepared from a formalin-fixed sample, stained with Sirius red, and the fibrosis area rate was calculated using an image analyzer.
  • Lipids neutral fat and cholesterol
  • Triglyceride E Test Wako and Cholesterol E Test Wako manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Hydroxyproline content was measured based on a conventional method using chloramine-T reagent (GK Reddy and CS Enwemeka, A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues, Clin Biochem 29 (1996), pp. 225-229 reference. ).
  • Plasma concentrations of various cytokines were measured using OPTEIA MS ELISA kit (manufactured by Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) as usual, and plasma IL-1 ⁇ , IL-6 and TNF- ⁇ concentrations were measured.
  • Statistical analysis was performed using Student's t-test between the normal diet group and the high fat high cholesterol diet (Vehicle) group, and Dunnett's multiple between the vehicle group and the compound administration group at the high fat high cholesterol diet load. Performed using range test. A risk ratio of less than 5% was considered significant.
  • compounds 1 and 2 which are P2X 7 receptor inhibitors, have an improving effect on steatohepatitis and fibrosis induced by high-fat and high-cholesterol diets, and both compounds are prophylactic or therapeutic agents for FLD It was suggested to be effective.
  • compound 1 is the compound of Example 5 of Patent Document 3, N- (1-adamantylmethyl) -5-chloro-2-[(piperidin-4-ylmethyl) amino] isonicotinamide dihydrochloride
  • Compound 2 is Compound 22 of Non-Patent Document 1, 2- (adamantan-1-yl) -N- [2-methyl-5- (9-oxa-3,7-diazabicyclo [3.3.1] non- 3 represents the hydrochloride of 3-ylcarbonyl) phenyl] acetamide, respectively.
  • Example 2 Evaluation in high fat high cholesterol diet induced mouse hepatitis model
  • Male ICR mice (6 weeks old, manufactured by SLC Japan) were randomly divided into groups (5 cases each), and 1 group was normal diet (CE-2, Claire) The other group was loaded with a high fat high cholesterol diet (Research Diets D12336) for 3 days. Thereafter, the high-fat and high-cholesterol diet loaded group was replaced with the compound-containing high-fat and high-cholesterol diet prepared in Example 1, leaving 1 group as the vehicle group, and given for 3 days.
  • Example 3 Evaluation in High Fatty High Cholesterol Diet-Induced Mouse Hepatitis Model CE-2 (CLEA Japan) was used as the normal diet.
  • Male ICR mice (6 weeks old, manufactured by SLC Japan) were randomly divided into groups (5 cases each), one group was normal diet (CE-2, manufactured by Claire), and the other groups were high in fat Cholesterol diet (Research Diets D12336) was loaded until the end of the test.
  • the test compound suspended in 0.5% MC solution was orally administered twice a day from the morning of the 4th day of food loading for 3 days.
  • One group of normal diet group and high fat high cholesterol diet load was orally administered only 0.5% MC solution as a control.
  • Example 4 Cell death inhibition evaluation of rat liver parenchymal cells
  • plasma ALT / AST increases.
  • ALT is particularly specific for liver parenchymal cells.
  • ALT is also abundant in liver parenchymal cells
  • the measurement of plasma ALT / AST is widely used clinically as a liver injury marker.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • Liver parenchymal cells were prepared from normal male Wister rats (Charles River) weighing 400g-500g according to a conventional method, suspended in a HepatoSTIM medium set (BD), and then coated on a collagen-coated 96 well plate (AGC). 20,000 cells were seeded per well.
  • the medium was replaced with 80 ⁇ l of a medium in which an equal amount of HepatoSTIM medium set and MEMalpha (manufactured by Invitrogen) were mixed.
  • the test compound was serially diluted with DMSO and added to the cells as a DMSO solution to a final concentration of 0.1%. Then add 2 '(3')-O- (4-benzoylbenzoyl) adenosine 5'-triphosphate ammonium triethylammonium salt (manufactured by Sigma) diluted to a final concentration of 100 ⁇ M as a ligand and continue incubation for 6 hours did.
  • LDH activity was measured using a cytotoxicity detection kit (Roche) according to the instruction manual.
  • ALT and AST can be measured using Transaminase C-II Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the degree of inhibition by the test compound was calculated with the ligand non-added group as 100%, the ligand added and the test compound non-added group as 0%, and IC 50 was calculated.
  • IC 50 of LDH inhibitory activity of compounds 1, 2, AZD-9056, and A-438079 was 0.87, 0.054, 0.84, and 1.8 ⁇ M, respectively.
  • Example 5 Inhibition of intracellular calcium influx associated with P2X 7 inhibition
  • C6-15 cells were transfected with pcDNA3.1 plasmid (invitrogen) incorporating a gene expressing human P2X 7 , and GENETICIN (invitrogen) was used.
  • a cell hP2X 7 / C6-15 cell stably expressing human P2X 7 was constructed by drug selectivity. Using D-MEM medium (Sigma), 10% FBS (Fetal bovine serum), 1% Pc./Sm (Penicillin streptomycin, Invitrogen), GENETICIN (Invitrogen) Cultured.
  • test compound was suspended in DMSO at a 4-fold common ratio with 10 mM as the maximum concentration, and 8 doses were prepared. 1 ⁇ l of this compound solution was prepared by diluting with 200 ⁇ l of test buffer. Immediately before the test, the compound dilution solution was added to the cells at 10 ⁇ l per well.
  • the P2X 7 ligand-dependent calcium influx test was measured using FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader; manufactured by Molecular Devices).
  • Example 6 IL-1 ⁇ secretion inhibitory activity in human THP-1 cells RPMI1640 (Sigma), 10% FBS (Fetal bovine serum), 1% Pc./Sm (penicillin streptomycin, Invitrogen) For example).
  • the cells were suspended in the above medium containing 100 ng / ml lipopolysaccharide (LPS, Sigma) and 100 ng / ml human IFN- ⁇ (Chemicon), and a 96-well plate (Asahi Techno Glass) ) was seeded at 10,000 per well, and differentiated and adhered.
  • the medium was replaced with 80 ⁇ l of serum-free RPMI 1640 medium containing 100 ng / ml LPS. After reacting for 2 hours, 10 ⁇ l of serum-free RPMI1640 medium containing a test compound dissolved in DMSO at a final DMSO concentration of 0.1% was added and incubated for 10 minutes. After that, 2 '(3')-O- (4-benzoylbenzoyl) adenosine 5'-triphosphate triethylammonium salt (manufactured by Sigma), which is a specific agonist of P2X 7 , is adjusted to a final concentration of 250 ⁇ M.
  • IL-1 ⁇ secretion inhibitory activity by the test compound in each experiment was calculated as an IC 50 value with 100% when DMSO alone was added and 0% when DMSO and the ligand alone were added.
  • the IC 50 values of Compound 1, Compound 2, AZD-9056, and A-438079 were 0.16, 2.2, 0.0015, and 0.28 ⁇ M, respectively.
  • P2X 7 receptor inhibitor dose-dependently and significantly lowers plasma AST and ALT, which are markers of liver damage, in a high-fat high-cholesterol diet-induced mouse hepatitis model, etc. to improve fatty liver and liver fibrosis It was found to have excellent in vivo pharmacological effects such as a significant decrease in hydroxyproline content as a marker and a significant decrease in the fibrosis area ratio, and showed an improvement effect on FLD. Furthermore, using primary cultured cells, it was shown that P2X 7 receptor inhibitors have a more direct effect on liver parenchymal cell death, so P2X 7 receptor inhibitors are FLD, especially NAFLD and NASH. It can be used as a preventive or therapeutic agent.

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Abstract

【課題】本発明は、P2X7受容体阻害物質を有効成分とするる脂肪性肝疾患(fatty liver disease：FLD)治療剤、好ましくは非アルコール性脂肪性肝疾患(nonalcoholic fatty liver disease:NAFLD)、特に非アルコール性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis:NASH)治療剤を提供する。 【解決手段】　本発明者らは、FLD治療剤を創製すべく鋭意検討した結果、P2X7受容体阻害物質がFLD病態モデルにおいて、肝障害のマーカーである血漿中AST及びALTを用量依存的かつ有意に低下させ、脂肪肝の改善、肝臓線維化のマーカーであるハイドロキシプロリン含量の有意な低下、線維化面積率の有意な減少等の優れたin vivo薬理作用を有することを見い出した。さらに、初代培養細胞を用いて、P2X7受容体阻害物質がより直接的に肝実質細胞の細胞死抑制作用を有することを示した。これらのことにより、P2X7受容体阻害物質がFLDの予防又は治療剤となりうることを知見して本発明を完成した。

Description

P2X7受容体阻害物質を有効成分とする脂肪性肝疾患治療剤
　本発明はP2X7受容体阻害物質を有効成分とする脂肪性肝疾患(fatty liver disease：FLD)治療剤に関する。
　FLDとは、肝細胞に脂肪が異常蓄積することに起因して肝障害をきたす疾患である。FLDの初期病態は、肝細胞に脂肪沈着のみを認める単純性脂肪肝であり、その後、肝細胞壊死、炎症や線維化を伴う脂肪性肝炎、線維化が進行した肝線維症、そして肝硬変や肝癌に病態が進行することが知られている。一般に、肝臓に脂肪が沈着する原因としては、過剰なアルコール摂取、肥満、糖尿病、脂質代謝異常、薬剤(ステロイド、テトラサイクリンなど)、Wilson病、中毒(黄燐など)、高度の栄養障害などが挙げられる。FLDの原因は大きくアルコール由来のものと非アルコール由来のものに分けられる。前者を原因とする肝疾患をアルコール性肝障害、後者を原因とする肝疾患を非アルコール性脂肪性肝疾患(nonalcoholic fatty liver disease:NAFLD)と呼ぶ。NAFLDは肝障害を惹起するほどのアルコール摂取歴がなく(アルコール量として20g/日以下)、ウィルス性肝炎や自己免疫性肝炎など原因の明らかなものを排除した、肝へのアルコール性肝障害類似の脂肪沈着を認める疾患と定義される。
　NAFLDは、単純性脂肪肝及び非アルコール性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis:NASH)に大別される。単純性脂肪肝は、肝細胞に脂肪沈着のみを認める病態である。この病態に酸化ストレス、エンドトキシン、脂肪酸及び/又はサイトカイン等の肝細胞障害が加わることで、炎症、肝細胞壊死、風船様変化、線維化を伴う脂肪肝炎を発症する。NASHはNAFLDの重症型と考えられており、単純性脂肪肝の予後が良好と考えられているのに比べ、NASHは進行性であり、5-10年後には、NASH患者のうち5-20%が肝硬変へ進行すると報告されている。米国においては、全人口の20％以上がNAFLDに罹患しており、さらにNASHの罹患率は2-3％と言われている。我が国においてもNASHは全成人の1％以上と推定されている。肝硬変や肝機能不全への進行を防ぐためにも、早期にNAFLDあるいはNASHの治療が必要であると考えられている。
　NAFLDに対する治療の原則は、食事療法や運動療法などの生活習慣の改善であるが、確実に実行するのは難しく十分な効果が得られていない。多くの場合においてインスリン抵抗性、肥満、糖尿病及び高脂血症を伴っていることから、インスリン抵抗性改善薬であるチアゾリジン誘導体やビグアナイド薬、抗酸化剤であるビタミンE、脂質異常症治療薬であるフィブラート系薬剤での治療が試みられているが、十分な効果は得られず、NASHの治療薬として承認されているものはいまだ存在しない。また単純性脂肪肝の治療として上市されているポリエンフォスファチジルコリン(polyenylphosphatidylcholine:EPL)が挙げられるが、NASHに対する治療効果は明らかになっていない。
　以上のように、FLD、特にNASH又はNAFLDに対しては十分な治療方法が確立されていないのが現状であり、これらの疾患に対して有効性の高い治療剤の開発が望まれている。
　P2X7受容体はカチオンチャネル型プリン受容体の一種であり、主に単球、マクロファージ、マスト細胞等に発現する(Physiol.Rev.2002, 82, 1013-1067)。当該受容体はATPをリガンドとし、その活性化は炎症性サイトカインIL-1β及びIL-18の分泌をもたらし、種々の免疫及び炎症疾患の発症に関与する受容体として知られている(Immunity 2001, 15, 825-835)。更に、P2X7受容体阻害によるIL-1β及びIL-18等の炎症性サイトカインの産生抑制が確認されていることから、P2X7受容体阻害物質は炎症性疾患の治療に有効であることが示唆されている(非特許文献１)。
　P2X7受容体が関与する免疫/炎症疾患としては、例えば、関節性リウマチ及びその他の自己免疫疾患、変形性関節症、ブドウ膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患等が挙げられる。更にP2X7受容体は神経因性疼痛においてもその関与が報告され、P2X7受容体阻害物質は種々の神経因性疼痛及び関連疾患の予防又は治療剤としての有用性が記載されている(非特許文献２、非特許文献３)。
　特許文献1-8及び非特許文献1-3で示されるP2X7受容体阻害物質は、例えば特許文献１では、慢性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬、アレルギー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、気道の応答性亢進、敗血症性ショック、糸球体腎炎、過敏性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、アテローム性動脈硬化症、悪性細胞の増殖および転移、筋芽細胞白血病、糖尿病、アルツハイマー病、髄膜炎、骨粗鬆症、熱傷傷害、虚血性心疾患等の疾患に有用であることが知られている。
　また、特許文献9-11で示されるP2X7受容体阻害物質は、例えば特許文献９では、以下の疾患に有用であることが知られている。
呼吸管：
　閉塞性気道疾患：喘息(気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息、運動誘発性喘息、薬物誘発性喘息(アスピリン誘発性およびＮＳＡＩＤ誘発性を含む)、および塵埃誘発性喘息を含む)(断続性および持続性の両方を含み、全ての重篤度を含み、そして他の原因の気道過敏症を含む)；慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)；気管支炎(感染性および好酸球性気管支炎を含む)；肺気腫；気管支拡張症；嚢胞性線維症；サルコイドーシス等。
骨および関節：
　骨関節炎／骨関節症を伴うもしくは含む関節炎(原発性および続発性の両方を含む)(例えば先天性骨盤形成異常)；頸椎炎および腰椎炎、および腰痛および頚部痛；リウマチ性関節炎およびスティル病等。
疼痛および傷害(例えばスポーツ傷害)もしくは疾患による筋骨格障害の結合組織再構成：
　関節炎(例えばリウマチ性関節炎、骨関節炎、痛風、もしくは結晶関節症(crystal arthropathy))、他の関節疾患(例えば椎間板変性もしくは顎関節変性)、骨再構成疾患(例えば骨粗鬆症、パジェット病、もしくは骨壊死)、多発性軟骨炎、強皮症、混合結合組織疾患、脊椎関節症、または歯周病(例えば歯根膜炎)。
皮膚：
　乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、もしくは他の湿疹性皮膚疾患、および遅延型過敏反応；植物性および光線性皮膚炎等。
眼：
眼瞼炎；結膜炎(通年性および春季アレルギー性結膜炎を含む)；虹彩炎；前部および後部ブドウ膜炎等。
胃腸管：
舌炎、歯肉炎、歯周病；食道炎(逆流性を含む)；好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、大腸炎等。
腹部：
　肝炎(自己免疫性、アルコール性およびウイルス性を含む)；肝臓の線維症および肝硬変；胆嚢炎；膵炎(急性および慢性の両方を含む)；
尿生殖器：
　腎炎(間質性腎炎および糸球体腎炎を含む)；ネフローゼ症候群；膀胱炎(急性膀胱炎および慢性(間質性)膀胱炎を含む)およびHunner潰瘍；急性および慢性尿道炎、前立腺炎等。
同種移植片拒絶反応：
　例えば腎臓、心臓、肝臓、肺、骨髄、皮膚もしくは角膜の移植後の、または輸血後の急性および慢性拒絶反応等。
ＣＮＳ：
　アルツハイマー病および他の認知症となる疾患(ＣＪＤおよびｎｖＣＪＤを含む)；アミロイド症；多発性硬化症および他の脱髄性症候群；脳動脈硬化症および脈管炎等。
循環器：
冠血管および末梢循環に影響を及ぼすアテローム動脈硬化症；心外膜炎等。
腫瘍：
前立腺癌、乳癌、肺癌、子宮癌、膵臓癌、腸および結腸の癌等。
胃腸管：
セリアック病、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、潰瘍性大腸炎等。
　また、特許文献12-16で示されるP2X7受容体阻害物質は、例えば特許文献12では、以下の疾患に有用であることが知られている。
急性疼痛、慢性疼痛、慢性関節痛、筋骨格系疼痛、神経因性疼痛、炎症性疼痛等。
　慢性関節痛状態は、関節リウマチ、骨関節炎、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎および若年性関節炎。
　機能性腸障害に付随する疼痛は、非潰瘍性消化不良、非心臓性胸痛および過敏性腸症候群。
　神経因性疼痛症候群は、糖尿病性神経障害、坐骨神経痛、非特異性腰痛、三叉神経痛等。
　熱、炎症、免疫疾患、血小板機能異常疾患（例えば、血管閉塞性疾患）、インポテンスまたは勃起機能不全；異常な骨代謝または再吸収により特徴付けられる骨疾患；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ’ｓ）およびシクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）阻害剤の血行力学的副作用、循環器疾患；神経変性疾患および神経変性、外傷後の神経変性、耳鳴、依存誘発性物質、例えば、オピオイド（例えば、モルヒネ）、ＣＮＳ抑制薬（例えば、エタノール）、精神刺激剤（例えば、コカイン）およびニコチンへの依存；Ｉ型糖尿病の合併症、腎臓機能障害、肝機能障害（例えば、肝炎、肝硬変）、胃腸障害（例えば、下痢）等。
　炎症性状態は、皮膚状態（例えば、日焼け、熱傷、湿疹、皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、乾癬）、髄膜炎、眼疾患、例えば、緑内障、網膜炎、網膜症、ブドウ膜炎および眼組織への急性損傷（例えば、結膜炎）；炎症性肺障害（例えば、喘息、気管支炎、気腫、アレルギー性鼻炎、呼吸窮迫症候群、愛鳩家病、農夫肺、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気道過敏症）等。
　免疫疾患は、自己免疫疾患、免疫不全疾患または臓器移植。
　異常な骨代謝または再吸収により特徴付けられる骨疾患は、骨粗鬆症（特に、閉経後骨粗鬆症）、高カルシウム血症、副甲状腺機能高進症等。
　循環器疾患は、高血圧または心筋虚血；アテローム性動脈硬化症；機能性または器質性静脈不全等。
　神経変性疾患は、認知症、特に、変性認知症（老年性認知症、レヴィー小体に伴う認知症、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病およびクロイツフェルト－ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および運動ニューロン疾患を含む）等。
国際公開第WO2000/061569号パンフレット 国際公開第WO2001/044170号パンフレット 国際公開第WO2001/094338号パンフレット 国際公開第WO2004/058270号パンフレット 国際公開第WO2007/109192号パンフレット 国際公開第WO2008/112205号パンフレット 国際公開第WO2009/057827号パンフレット 国際公開第WO2008/114002号パンフレット 国際公開第WO2006/025783号パンフレット 国際公開第WO2006/059945号パンフレット 国際公開第WO2009/070116号パンフレット 国際公開第WO2007/141267号パンフレット 国際公開第WO2008/116814号パンフレット 国際公開第WO2008/119825号パンフレット 国際公開第WO2009/053459号パンフレット 国際公開第WO2009/077362号パンフレット
ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー誌(Journal of Medicinal Chemistry)、2007年、50巻、5882～5885頁 ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー誌(Journal of Medicinal Chemistry)、2006年、49巻、3659～3666頁 ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー誌(Journal of Medicinal Chemistry)、2009年、52巻、3366～3376頁
　本発明は、P2X7受容体阻害物質を有効成分とするFLD治療剤、好ましくはNAFLD、特にNASH治療剤を提供する。
　前記の特許文献9-16に記載されている肝炎は、上述の通り炎症性サイトカインとP2X7受容体との関連から推測される肝臓での単なる炎症を意図していると考えられる。
　また、これらの特許文献及び非特許文献にはP2X7受容体を介したFLDの治療については何ら報告は無く、これに関連する示唆もない。通常肝疾患では、血中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(ALT)及びアラニンアミノトランスフェラーゼ(AST)値を測定することで肝臓の状態を判断していくが、これらの文献は肝疾患に関連する薬理試験は開示されていない。これら文献記載の化合物の肝炎や肝機能障害の治療の可能性を、P2X7受容体に関連した多数の疾患治療の可能性とともに言及されたに過ぎない。
　かかる状況下、本発明者らは、FLD治療剤を創製すべく鋭意検討した結果、P2X7受容体阻害物質がFLD病態モデルにおいて、肝障害のマーカーである血漿中AST及びALTを用量依存的かつ有意に低下させ、脂肪肝の改善、肝臓線維化のマーカーであるハイドロキシプロリン含量の有意な低下、線維化面積率の有意な減少等の優れたin vivo薬理作用を有することを見い出した。さらに、初代培養細胞を用いて、P2X7受容体阻害物質がより直接的に肝実質細胞の細胞死抑制作用を有することを示した。これらのことにより、P2X7受容体阻害物質がFLDの予防又は治療剤となりうることを知見して本発明を完成した。
 即ち、本発明は以下の(1)－(7)に関する。
(1) P2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とするFLDの予防又は治療剤。
(2) P2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する、FLDの予防又は治療用医薬組成物。
(3)FLDの予防又は治療のためのP2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩の使用。
(4)FLDの予防又は治療剤の製造のためのP2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩の使用。
(5) P2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩の治療的に有効量を患者に投与することからなるFLDの予防又は治療方法。
(6) P2X7受容体に結合しこの受容体の機能を阻害する物質又はその製薬学的に許容される塩の治療的に有効な量を患者に投与することからなるFLDの予防又は治療方法。
(7) P2X7受容体に結合しこの受容体を発現する細胞へのカルシウム流入を抑制する機能を有する物質又はその製薬学的に許容される塩の治療的に有効な量を患者に投与することからなるFLDの予防又は治療方法。
　本発明は、P2X7受容体を阻害することによるFLDの予防又は治療剤を提供するものとして有用である。また、本発明は、この受容体を阻害することによるNAFLDの予防又は治療剤を提供するものとして有用である。また、本発明は、この受容体を阻害することによるNASHの予防又は治療剤を提供するものとして特に有用である。
実施例1における血漿中AST及びALTに対する作用を示す。*は、正常餌(Normal)群と高脂肪高コレステロール餌(Vehicle)群間でStudent's t-testを用いて、#は、高脂肪高コレステロール餌負荷での溶媒(Vehicle)群と化合物投与群間でDunnett's multiple range testを用いて行った結果、それぞれ危険率5%未満の有意な差があったことを示す。縦軸は、血漿中ASTおよびALT活性を示す。横軸は、被験化合物の量を示す。表中Normalは正常餌群を示す。Vehicleは高脂肪高コレステロール餌群を示す。 実施例1における肝臓重量、肝臓中性脂肪及びコレステロール含量に対する作用を示す。*は、正常餌(Normal)群と高脂肪高コレステロール餌(Vehicle)群間でStudent's t-testを用いて、#は、高脂肪高コレステロール餌負荷での溶媒(Vehicle)群と化合物投与群間でDunnett's multiple range testを用いて行った結果、それぞれ危険率5%未満の有意な差があったことを示す。縦軸は、肝臓重量（LV)、肝臓トリグリセリド量(HTC)及び肝臓コレステロール量(HCC)を示す。横軸は、被験化合物の量を示す。表中Normalは正常餌群を示す。Vehicleは高脂肪高コレステロール餌群を示す。 実施例1における肝臓ハイドロキシプロリン含量及び線維化面積率に対する作用を示す。*は、正常餌(Normal)群と高脂肪高コレステロール餌(Vehicle)群間でStudent's t-testを用いて、#は、高脂肪高コレステロール餌負荷での溶媒(Vehicle)群と化合物投与群間でDunnett's multiple range testを用いて行った結果、それぞれ危険率5%未満の有意な差があったことを示す。縦軸は、それぞれ肝臓ハイドロキシプロリン量（HHC)及び線維化面積率(FA)を示す。横軸は、被験化合物の量を示す。表中Normalは正常餌群を示す。Vehicleは高脂肪高コレステロール餌群を示す。ＸはNormal、●はVehicle、△は化合物1、■は化合物2における、各マウスの線維化面積率を示す。 実施例1における血漿中IL-1β、IL-6及びTNF-αに対する作用を示す。*は、それぞれ正常餌(Normal)群と高脂肪高コレステロール餌(Vehicle)群間でStudent's t-testを用いて、#は、高脂肪高コレステロール餌負荷での溶媒(Vehicle)群と化合物投与群間でDunnett's multiple range testを用いて行った結果、それぞれ危険率5%未満の有意な差があったことを示す。縦軸は、それぞれ血漿中IL-1β、IL-6及びTNF-α量を示す。横軸は、被験化合物の量を示す。表中Normalは正常餌群を示す。Vehicleは高脂肪高コレステロール餌群を示す。
　以下、本発明について詳述する。
　本明細書において、FLDとは、肝細胞に中性脂肪が沈着して、肝機能障害をきたす疾患の総称であり、臨床では一般に脂肪肝ともいう。FLDはその病因によって、患者の飲酒暦が病因として認められるアルコール性脂肪性肝疾患、並びに飲酒暦が病因と認められないNAFLDに分類することができる。本願では、FLDはアルコール性脂肪肝疾患及びNAFLDの両方を含む。また、FLDのある態様としてはNAFLDである。
　NAFLDとは、肝障害を惹起するほどのアルコール摂取歴がなく(アルコール量として20ｇ/日以下)、ウィルス性肝炎や自己免疫性肝炎など原因の明らかなものを排除した肝へのアルコール性肝障害類似の脂肪沈着を認める疾患である。NAFLDは非アルコール性の単純性脂肪肝及びNASHを含む概念である。
　NASHとは、飲酒暦が病因として認められないが肝組織で壊死、炎症、又は線維化を伴う脂肪性肝炎を症状として認める疾患である。
　このようにFLD、NAFLD、NASHにおける病態は、肝臓における炎症に基づくものだけでなく、酸化ストレス、エンドトキシン、脂肪酸又はサイトカイン等の種々の要因から引き起こされる肝細胞障害が加わることで、肝細胞壊死、風船様変化、線維化等を伴う状態のものを含む。
　P2X7受容体とは、正式名、purinergic receptor p2x, ligand-gated ion channel, 7を意味する。また、当該受容体の別名としては、p2x7、p2rx7、p2x7r、及びp2zが知られている。
　P2X7受容体阻害物質とは、上記P2X7受容体に対して、受容体親和性を示し受容体の機能を阻害する物質を意味する。P2X7受容体に結合して受容体の機能を阻害する化合物を含む。あるいは、特許文献3の32頁21行目-33頁22行目に記載の実験方法又は後述実施例５の実験方法若しくはこれらに準ずる当業者に自明な評価方法に準じて、P2X7受容体親和性を示し受容体の機能を阻害する活性がIC50値で100μM以下の化合物で、当該活性が50μM以下の化合物、又は、当該活性が10μM以下の化合物である。
　P2X7受容体に結合しこの受容体を発現する細胞へのカルシウム流入を抑制する機能を有する物質とは、例えば後記実施例5に記載の実験方法によりヒト細胞内へのカルシウム流入抑制作用を有する物質である。
　P2X7受容体阻害物質は、例えば、特許文献3の32頁21行目-33頁22行目に記載の実験方法、又は後述実施例５の実験方法若しくはこれらに準ずる当業者に自明な評価方法に従って、化合物のP2X7受容体阻害活性を評価し、P2X7受容体阻害活性が認められる化合物をスクリーニングすることにより取得することができる。この際、スクリーニングの手法としては当業者によく知られるHTS(High-throughput screening)が慣習的且つ効率的である。ここで、評価する化合物としては、新規合成化合物、市販されている化合物、コンビナトリアルケミストリーによって合成された化合物、及びこれらから成る化合物ライブラリーに登録されている化合物、或いは公知化合物等を用いることができる。更に、微生物或いは動植物から単離される種々の天然化合物とその誘導体を用いることができる。また更に、HTS評価により取得されたP2X7受容体阻害活性を有する化合物の周辺誘導体合成の展開により、更なるP2X7受容体阻害物質を取得することができる。
　
　　上記P2X7受容体阻害物質の具体例としては、例えば、以下文献に記載のP2X7受容体阻害物質が挙げられる。
国際公開第WO2001/094338号パンフレット、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー誌(Journal of Medicinal Chemistry)、2007年、50巻、5882～5885頁、国際公開第WO2000/061569号パンフレット、国際公開第WO2001/044170号パンフレット、国際公開第WO2008/114002号パンフレット、国際公開第WO2009/070116号パンフレット、国際公開第WO2004/058270号パンフレット、国際公開第WO2007/109192号パンフレット、国際公開第WO2008/112205号パンフレット、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー誌(Journal of Medicinal Chemistry)、2006年、49巻、3659～3666頁、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー誌(Journal of Medicinal Chemistry)、2009年、52巻、3366～3376頁、国際公開第WO2008/119825号パンフレット、国際公開第WO2007/141267号パンフレット、国際公開第WO2009/057827号パンフレット、国際公開第WO2006/025783号パンフレット、国際公開第WO2006/059945号パンフレット、国際公開第WO2008/116814号パンフレット、国際公開第WO2009/053459号パンフレット、国際公開第WO2009/077362号パンフレット、及びExpert Opin. Ther. Patens(2010), 20(5), 625-646。
　P2X7受容体阻害物質のある態様としては、例えば下記に示す化合物群から選択される化合物又はその製薬学的に許容される塩が挙げられる。
KN62として公知の4-[(2S)-2-[(イソキノリン-5-イルスルホニル)(メチル)アミノ]-3-オキソ-3-(4-フェニルピペラジン-1-イル)プロピル]フェニル イソキノリン-5-スルホネート、
MRS2306として公知のtert-butyl 4-[N,O-ビス(イソキノリン-5-イルスルホニル)-L-チロシル]ピペラジン-1-カルボキシレート、
3-[1-{[3'-(ニトロメチル)ビフェニル-4-イル]オキシ}-4-(ピリジン-4-イル)ブタン-2-イル]-1,3-チアゾリジン-2,4-ジオン、
A-759020として公知の2-(4-クロロフェニル)-N-{1-[N''-シアノ-N'-(2-メチルピリジン-3-イル)カルバムイミドアミド]-2,2-ジメチルプロピル}アセトアミド、
N-(1-アダマンチルメチル)-5-クロロ-2-[(ピペリジン-4-イルメチル)アミノ]イソニコチンアミド、
2-(アダマンタン-1-イル)-N-[2-メチル-5-(9-オキサ-3,7-ジアザビシクロ[3.3.1]ノン-3-イルカルボニル)フェニル]アセタミド、
N-(アダマンタン-1-イルメチル)-2-クロロ-5-(9-オキサ-3,7-ジアザビシクロ[3.3.1]ノン-3-イルメチル)ベンズアミド、
AZD9056として公知のN-(アダマンタン-1-イルメチル)-2-クロロ-5-{3-[(3-ヒドロキシプロピル)アミノ]プロピル}ベンズアミド、
N-(アダマンタン-1-イルメチル)-2,3-ジクロロベンズアミド、
6-クロロ-N-{[(1S,3S)-1-ヒドロキシ-3-メチルシクロへキシル]メチル}-2-[(3R)-3-ヒドロキシピロリジン-1-イル]キノリン-5-カルボキサミド、
6-クロロ-N-[(1-ヒドロキシシクロへプチル)メチル]-2-{(3S)-3-[(2-ヒドロキシエチル)アミノ]ピロリジン-1-イル}キノリン-5-カルボキサミド、
CE-224535として公知の2-クロロ-N-[(1-ヒドロキシシクロへプチル)メチル]-5-{4-[(2R)-2-ヒドロキシ-3-メトキシプロピル]-3,5-ジオキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-トリアジン-2(3H)-イル}ベンズアミド、
2-(4-クロロ-3-フルオロフェニル)-N-{2-[(2R)-1-ヒドロキシプロパン-2-イル]-1-オキソ-1,2-ジヒドロイソキノリン-5-イル}アセタミド、
N-{6-クロロ-2-[(2R)-1-ヒドロキシプロパン-2-イル]-1-オキソ-1,2-ジヒドロイソキノリン-5-イル}-2-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]アセトアミド、
2-[3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニル]-N-{2-[(2R)-1-ヒドロキシプロパン-2-イル]-6-メチル-1-オキソ-1,2-ジヒドロイソキノリン-5-イル}アセトアミド、
A-438079として公知の3-{[5-(2,3-ジクロロフェニル)-1H-テトラゾール-1-イル]メチル}ピリジン、
1-(2,6-ジクロロベンジル)-5-(2,3-ジクロロフェニル)-1H-テトラゾール、
2-(4-クロロフェニル)-N-{1-[N''-シアノ-N'-(キノリン-5-イル)カルバムイミダミド]-2,2-ジメチルプロピル}アセトアミド、
(4S)-N-(2-クロロ-4-フルオロベンジル)-3-エチル-1-メチル-2-オキソイミダゾリジン-4-カルボキサミド、
N-(2-クロロ-4-フルオロベンジル)-2-(3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-4-イル)アセトアミド、
Evotec AG社のEVT-401、GSK1482160、AFC-5128、及び
2-[5-クロロ-6-オキソ-4-{[(1R,2R,3R,5S)-2,6,6-トリメチルビシクロ[3.1.1]ヘプト-3-イル]アミノ}ピリダジン-1(6H)-イル]-N-[1-(3-クロロピリジン-4-イル)エチル]アセトアミド。
　
　　別の態様としては、N-(1-アダマンチルメチル)-5-クロロ-2-[(ピペリジン-4-イルメチル)アミノ]イソニコチンアミド、2-(アダマンタン-1-イル)-N-[2-メチル-5-(9-オキサ-3,7-ジアザビシクロ[3.3.1]ノン-3-イルカルボニル)フェニル]アセタミド、N-(アダマンタン-1-イルメチル)-2-クロロ-5-{3-[(3-ヒドロキシプロピル)アミノ]プロピル}ベンズアミド、2-クロロ-N-[(1-ヒドロキシシクロへプチル)メチル]-5-{4-[(2R)-2-ヒドロキシ-3-メトキシプロピル]-3,5-ジオキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-トリアジン-2(3H)-イル}ベンズアミド、3-{[5-(2,3-ジクロロフェニル)-1H-テトラゾール-1-イル]メチル}ピリジン、EVT-401、GSK1482160及びAFC-5128の化合物群から選択されるP2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩である。
　また別の態様として、N-(アダマンタン-1-イルメチル)-2-クロロ-5-{3-[(3-ヒドロキシプロピル)アミノ]プロピル}ベンズアミド、6-クロロ-N-{[(1S,3S)-1-ヒドロキシ-3-メチルシクロへキシル]メチル}-2-[(3R)-3-ヒドロキシピロリジン-1-イル]キノリン-5-カルボキサミド、2-クロロ-N-[(1-ヒドロキシシクロへプチル)メチル]-5-{4-[(2R)-2-ヒドロキシ-3-メトキシプロピル]-3,5-ジオキソ-4,5-ジヒドロ-1,2,4-トリアジン-2(3H)-イル}ベンズアミド及び3-{[5-(2,3-ジクロロフェニル)-1H-テトラゾール-1-イル]メチル}ピリジンの化合物群から選択されるP2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩である。
　　本発明において、FLDのある態様としてはNAFLDであり、別の態様としてはNASHである。
　　上記P2X7受容体阻害物質は、酸付加塩又は塩基との塩を形成する場合もあり、かかる塩が製薬学的に許容され得る塩である限りにおいて本発明に包含される。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マイレン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リジン、オルニチン等の有機塩基との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。また上記P2X7受容体阻害物質またはそれらの製薬学的に許容される塩は、各種の水和物や溶媒和物であってもよく、更に、それらの結晶多形の物質をも包含する。これらのP2X7受容体阻害物質の製薬学的に許容される塩は当業者が通常採用しうる造塩法によって製造することができる。
また、上記P2X7受容体阻害物質には、幾何異性体、互変異性体、光学異性体などの各種の立体異性体の混合物や単離されたものが含まれる。これらの異性体は、公知の方法、例えば、抽出、沈澱、分画クロマトグラフィー、分別結晶化、再結晶等により単離、精製することができる。また、光学異性体は適切な塩と再結晶する分別結晶化やカラムクロマトグラフィー等の常法により分割することができる。
また、上記P2X7受容体阻害物質は、薬理学的に許容されるプロドラッグも含まれる。薬理学的に許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解により又は生理学的条件下でP2X7受容体阻害物質へと変換される化合物である。プロドラッグを形成する基としては、「プログレス・イン・メディシン(Progress in Medicine)」1985年、5巻、p.2157-2161や「医薬品の開発」、廣川書店、1990年、第７巻、分子設計、p.163-198に記載の基が挙げられる。これらのP2X7受容体阻害物質のプロドラッグは当業者が通常採用しうる方法により容易に製造することができる。
P2X7受容体阻害物質を有効成分として含有する製剤は通常製剤化に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。
　
　　投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、あるいは静注、筋注等の注射剤、坐剤、経皮剤、経鼻剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。投与量は症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
　　通常経口投与の場合、1日の投与量は、体重当たり約0.001～100 
mg/kg、好ましくは0.1～30 
mg/kg、更に好ましくは0.1～10 
mg/kgが適当であり、これを1回であるいは2乃至4回に分けて投与する。静脈内投与される場合は、1日の投与量は、体重当たり約0.0001～10 
mg/kgが適当で、1日1回乃至複数回に分けて投与する。また、経粘膜剤としては、体重当たり約0.001～100 
mg/kgを1日1回乃至複数回に分けて投与する。
　　本願P2X7受容体阻害物質は、FLDに対して有効性を示すと考えられる他の予防又は治療剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、或いは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与製剤は、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。
本発明による経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な賦形剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えばステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等の崩壊剤、溶解剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性コーティング剤で被膜してもよい。
　経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な溶剤、例えば精製水、エタノールを含む。この組成物は不活性な溶剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁化剤のような補助剤、甘味剤、矯味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
　非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤を含む。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート80(商品名)等がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通すろ過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解、懸濁して使用することもできる。
　外用剤としては、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、パップ剤、噴霧剤、ローション剤、点眼剤、眼軟膏等を包含する。一般に用いられる軟膏基剤、ローション基剤、水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤等を含有する。例えば、軟膏又はローション基剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、白色ワセリン、サラシミツロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ラウロマクロゴール、セスキオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
　吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は固体、液体、半固体状のものが用いられ、従来公知の方法に従って製造することができる。例えば、ラクトースや澱粉のような賦形剤や、更に、pH調整剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は、適当な吸入又は吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば、計量投与吸入デバイス等の公知のデバイスや噴霧器を使用して、化合物を単独で又は処方された混合物の粉末として、もしくは医薬的に許容し得る担体と組み合わせて溶液又は懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は、単回又は多数回の投与用のものであってもよく、乾燥粉末又は粉末含有カプセルを利用することができる。あるいは、適当な駆出剤、例えば、クロロフルオロアルカン、ヒドロフルオロアルカン又は二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
　高脂肪高コレステロール食誘発マウス肝炎・線維化モデルにおける評価
　本試験はHepatology誌、2007年、46巻、1392-1403頁に示される試験方法に従い、具体的には以下の操作を行なった。
　被検化合物を精製水で溶解し、高脂肪高コレステロール粉末飼料(Research Diets社製D12336)に0.33 ml/gの割合で混和し、成型，凍結乾燥を行い、150、500、1500 ppm(18, 60, 180 mg/kg/day相当)の化合物含有餌を作製した。正常餌はCE-2(日本クレア社製)を用いた。雄性ICRマウス(6週齢，日本エスエルシー社製)は無作為群分け(各群5例)を行い、化合物非含有の正常餌、高脂肪高コレステロール餌、もしくは化合物含有高脂肪高コレステロール餌を4週間与えた。イソフルラン麻酔下に腹部大静脈から採血を行い、肝臓を摘出した。血液は遠心分離(3000 rpm, 10分)を行い、得られた上清血漿でALT及びASTをトランスアミナ－ゼC-II テストワコ－(和光純薬工業株式会社製)を用いて測定した。肝臓の一部はホルマリンに浸漬固定し、小片(100 mg程度)を脂質及びハイドロキシプロリン含量測定用に凍結保存した。ホルマリン固定サンプルより組織切片を作製し、シリウスレッド染色を行い、線維化面積率を画像解析装置を用いて算出した。脂質(中性脂肪及びコレステロール)はトリグリセライド Eテストワコ－及びコレステロール Eテストワコー(和光純薬工業株式会社製)を用いて測定した。ハイドロキシプロリン含量はクロラミン-T試薬を用いた定法に基づき測定した(G.K. Reddy and C.S. 
Enwemeka, A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological 
tissues, Clin Biochem 
29 
(1996), pp. 225-229
参照。）。血漿中各種サイトカイン濃度は、それぞれOPTEIA MS ELISA kit（日本ベクトン・ディッキンソン社製）を定法通り使用し、血漿中IL-1β、IL-6及びTNF-α濃度を測定した。統計解析は正常餌(Normal)群と高脂肪高コレステロール餌(Vehicle)群間でStudent's t-testを用いて、高脂肪高コレステロール餌負荷での溶媒(Vehicle)群と化合物投与群間でDunnett's multiple range testを用いて行った。危険率5%未満を有意な差とした。
　その結果、P2X7受容体阻害物質である化合物１及び化合物２は肝障害のマーカーである血漿中AST及びALTを用量依存的かつ有意に低下させることが示された(図１)。また、脂肪肝の改善(図２)、肝臓線維化のマーカーであるハイドロキシプロリン含量の有意な低下及び線維化面積率の有意な減少(図３)、及び炎症性サイトカイン(IL-1β、IL-6及びTNF-α)の低下が確認できた(図４)。以上より、P2X7受容体阻害物質である化合物1及び化合物2が高脂肪高コレステロール餌により誘発される脂肪肝炎及び線維化に対して改善作用を有し、両化合物がFLDの予防又は治療剤として有効であることが示唆された。
　なお、本実施例中化合物1は特許文献３のExample 5の化合物、N-(1-アダマンチルメチル)-5-クロロ-2-[(ピペリジン-4-イルメチル)アミノ]イソニコチンアミドの二塩酸塩、化合物2は非特許文献1のCompound 22の化合物、2-(アダマンタン-1-イル)-N-[2-メチル-5-(9-オキサ-3,7-ジアザビシクロ[3.3.1]ノン-3-イルカルボニル)フェニル]アセタミドの塩酸塩をそれぞれ示す。
実施例２
　高脂肪高コレステロール食誘発マウス肝炎モデルにおける評価
雄性ICRマウス(6週齢，日本エスエルシー社製)を無作為に群分け(各群5例)し、1群は正常食（CE-2、クレア社製）、その他の群は高脂肪高コレステロール餌(Research Diets社製D12336)を3日間負荷した。その後、高脂肪高コレステロール食負荷群については、vehicle群とする1群を残して、実施例１で作製した化合物含有の高脂肪高コレステロール食に置換し、3日間与えた。化合物負荷4日目に、イソフルラン麻酔下に腹部大静脈から採血を行い、遠心分離(3000 rpm, 10分)を行って、得られた上清血漿でALT及びASTをトランスアミナ－ゼC-II テストワコ－(和光純薬工業株式会社製)を用いて測定した。統計解析は正常餌(Normal)群と高脂肪高コレステロール餌(Vehicle)群間でStudent's t-testを用いて、高脂肪高コレステロール餌負荷での溶媒(Vehicle)群と化合物投与群間でDunnett's multiple range testを用いて行った。危険率5%未満を有意な差とした。その結果、化合物1は500ppmで、化合物2は1500ppmで有意に餌負荷によるALT/ASTの上昇を抑制した。摂餌量についてはいずれの群においても有意な変化は認められなかった。
実施例３
　高脂肪高コレステロール食誘発マウス肝炎モデルにおける評価
　正常餌はCE-2(日本クレア)を用いた。雄性ICRマウス(6週齢，日本エスエルシー社製)を無作為に群分け(各群5例)し、1群は正常食（CE-2、クレア社製）、その他の群は高脂肪高コレステロール餌(Research Diets社製D12336)を試験終了時まで負荷した。餌負荷4日目の朝から1日2回、0.5%MC溶液に懸濁した被検化合物を3日間経口投与した。正常食群および高脂肪高コレステロール食負荷の1群は対照に0.5%MC溶液のみを経口投与した。薬剤投与4日目に、朝に1回薬剤投与を行った1時間後、イソフルラン麻酔下に腹部大静脈から採血を行った。血液は遠心分離(3000 rpm, 10分)を行い、得られた上清血漿でALT及びASTをトランスアミナ－ゼC-II テストワコ－(和光純薬工業株式会社製)を用いて測定した。統計解析は正常餌(Normal)群と高脂肪高コレステロール餌(Vehicle)群間でStudent's t-testを用いて、高脂肪高コレステロール餌負荷での溶媒(Vehicle)群と化合物投与群間でDunnett's multiple range testを用いて行った。危険率5%未満を有意な差とした。その結果、前述のAZD-9056は30mg/kgで、前述のA-438079は10mg/kgで有意にALT/ASTの上昇を抑制した。
実施例４
ラット肝実質細胞の細胞死抑制評価
　NAFLDおよびNASHの状態の際には、多くの場合血漿中ALT/ASTが上昇する。ALTは特に肝実質細胞に特異性が高く、肝実質細胞が障害を受けると、細胞内に存在するALTが漏出し、血液中に流れ出す。ASTも肝実質細胞に多く存在することから、血漿中ALT/ASTの測定は肝障害マーカーとして広く臨床で利用されている。また、一般的に細胞実験においては、細胞培養上清中の乳酸脱水素酵素(LDH)活性を測定することで、培養細胞の細胞死の程度を評価することができることが知られている。
　このことから、肝実質細胞において、P2X7受容体阻害物質が細胞死を抑制するかどうかを培養上清中のLDHを測定することで検討した。更に培養上清中のALT/ASTを測定することで細胞死抑制につき検討できる。
　体重が400g-500gの正常雄性Wisterラット（チャールスリバー社製）から、定法に従い肝実質細胞を調製し、HepatoSTIM培地セット（BD社製）に懸濁してコラーゲンコート96 wellプレート（AGC社製）に1 wellあたり2万個の細胞を播種した。一昼夜CO2インキュベータで培養した後、HepatoSTIM培地セットとMEMalpha（invitrogen社製）を等量混合した培地80μlに培地交換した。被検化合物はDMSOを用いて系列希釈を行い、DMSO溶液として終濃度0.1%となるように細胞に添加した。その後最終濃度100μMになるように希釈した2′(3′)-O-(4-ベンゾイルベンゾイル)アデノシン 5′-三リン酸 トリエチルアンモニウム塩（シグマ社製）をリガンドとして添加し、6時間引き続きインキュベートした。その後肝実質細胞培養上清中のLDH活性を測定し、P2X7依存的な細胞死阻害活性を測定した。LDH活性は細胞傷害性検出キット（ロッシュ社製）を用いて取扱説明書に従い測定した。またALT及びASTをトランスアミナ－ゼC-II テストワコ－(和光純薬工業株式会社製)を用いて測定できる。当該リガンド非添加群を100％、当該リガンドを添加し被検化合物非添加群を0%として被検化合物による阻害度を計算し、IC50を算出した。化合物1、2、AZD-9056、A-438079のLDH阻害活性のIC50はそれぞれ、0.87、0.054、0.84、1.8μMであった。
実施例５
P2X7阻害に伴う細胞内カルシウム流入抑制評価
ヒトP2X7を発現する遺伝子を組み込んだpcDNA3.1プラスミド（invitrogen社）を用いてC6-15細胞にトランスフェクションし、GENETICIN（invitrogen社製）を用いた薬剤選択性によりヒトP2X7を安定発現する細胞hP2X7/C6-15細胞を構築した。本細胞をD-MEM培地(シグマ社製)、10％　FBS(Fetal bovine serum：牛血清)、1%　Pc./Sm(ペニシリン・ストレプトマイシン、Invitrogen社製)、GENETICIN（invitrogen社製）を用いて培養した。試験前日に細胞を384 well plate（ファルコン社製）に1 wellあたり5000個になるように播種し、CO2インキュベータで一晩培養した。試験当日に、カルシウム指示薬であるFLUO-4 AM（DOJINDO社製、試験最終濃度として200nM）とPluronic F-127（invitrogen社製）を等量混和した溶液を添加した、10mM HEPES、5mM KCl、10mM glucose、0.5mM CaCl2、140mM NaCl、2.5mM プロベネシドを含んだ試験用緩衝液30μlに置換し、1.5時間室温でインキュベートした。被検化合物は10mMを最高濃度として4倍公比でDMSOで懸濁、8用量を準備した。この化合物溶液1μlに対し、試験用緩衝液200μlを用いて希釈して準備した。試験直前に化合物希釈溶液を1 well当たり10μlずつ細胞に添加した。P2X7リガンド依存的カルシウム流入試験はFLIPR（Fluorometric Imaging Plate Reader；モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。細胞に、最終濃度80μMになるように試験用緩衝液で希釈した2′(3′)-O-(4-ベンゾイルベンゾイル)アデノシン 5′-三リン酸 トリエチルアンモニウム塩（シグマ社製）を10μl添加し、2秒ごとに2分間細胞内カルシウム濃度を追跡した。データは全試験時間のAUC値を用いて、リガンド非添加群を100％、リガンドを添加し被検化合物非添加群を0%として被検化合物による阻害度を計算し、各被検化合物濃度ごとにIC50値を算出し、被検化合物によるP2X7を介したカルシウム流入抑制作用を検討した。その結果、化合物1、2、AZD-9056、A-438079のIC50はそれぞれ、0.085、0.93、0.023、0.24μMであった。
実施例６
ヒトTHP-1細胞におけるIL-1β分泌阻害活性
　ヒトTHP-1細胞をRPMI1640(シグマ社製)、10％　FBS(Fetal bovine serum：牛血清)、1%　Pc./Sm(ペニシリン・ストレプトマイシン、Invitrogen社製)を用いて培養した。試験前日に細胞を100 ng/mlリポポリサッカライド(LPS、シグマ社製)および100 ng/mlヒトIFN-γ(ケミコン社製)を含んだ上記培地に懸濁し、96wellプレート(旭テクノグラス社製)に1 wellあたり1万個になるように播種し、分化・接着させた。試験当日に、培地を100 ng/mlのLPSを含んだ無血清のRPMI1640培地80 μlに交換した。2時間反応させたあと、DMSOに溶解した被検化合物を、DMSO最終濃度として0.1%となるように含んだ無血清のRPMI1640培地を10 μl添加し、10分間インキュベートした。その後最終濃度として250 μMとなるようにP2X7の特異的なアゴニストである2'(3')-O-(4-ベンゾイルベンゾイル)アデノシン 5'-トリフォスフェート トリエチルアンモニウム塩(シグマ社製)をリガンドとして10μl添加して、よく混和し、１時間反応させた。培養上清を回収し、マウス IL-1β ELISA ディベロップメントキット,マウス(R&D社製)を定法通り用いて、培養上清中に分泌されたIL-1βを評価した。各実験における被検化合物によるIL-1β分泌阻害活性は、DMSOのみを加えた時の値を100％、DMSOおよび、当該リガンドのみ加えた時を0％として、IC50値を算出した。
　例えば、下記化合物を用いて試験を行なった結果、化合物1、化合物2、AZD-9056、A-438079のIC50値はそれぞれ0.16 、2.2 、0.0015、0.28μMであった。
　上記P2X7受容体阻害物質が高脂肪高コレステロール食誘発マウス肝炎モデル等において、肝障害のマーカーである血漿中AST及びALTを用量依存的かつ有意に低下させ、脂肪肝の改善、肝臓線維化のマーカーであるハイドロキシプロリン含量の有意な低下、線維化面積率の有意な減少等の優れたin vivo薬理作用を有することを見い出し、FLDに対して改善作用を示した。さらに、初代培養細胞を用いて、P2X7受容体阻害物質がより直接的に肝実質細胞の細胞死抑制作用を有することを示したことから、P2X7受容体阻害物質はFLD、特にNAFLD及びNASHの予防又は治療剤として利用することができる。

Claims (12)

  1. P2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする脂肪性肝疾患の予防又は治療剤。
  2. P2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする非アルコール性脂肪性肝疾患の予防又は治療剤。
  3. P2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とする非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療剤。
  4. P2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する、脂肪性肝疾患の予防又は治療用医薬組成物。
  5. P2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する、非アルコール性脂肪性肝疾患の予防又は治療用医薬組成物。
  6. P2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する、非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療用医薬組成物。
  7. 脂肪性肝疾患の予防又は治療のためのP2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩の使用。
  8. 非アルコール性脂肪性肝疾患の予防又は治療のためのP2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩の使用。
  9. 非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療のためのP2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩の使用。
  10. P2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩の治療的に有効量を患者に投与することからなる脂肪性肝疾患の予防又は治療方法。
  11. P2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩の治療的に有効量を患者に投与することからなる非アルコール性脂肪性肝疾患の予防又は治療方法。
  12. P2X7受容体阻害物質又はその製薬学的に許容される塩の治療的に有効量を患者に投与することからなる非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療方法。
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