WO2012016427A1 - 一种猪细胞培养基 - Google Patents

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李巍
梁颜
刘欢
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BGI ARK BIOTECHNOLOGY Co Ltd
BGI Shenzhen Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture

Definitions

  • the method for preparing the porcine cell culture medium of the present invention further comprises the following steps:
  • a further aspect of the invention relates to the use of fetal pig serum prepared as described above in porcine cell culture and/or in the preparation of porcine cell culture medium.
  • the pig cells include, but are not limited to, primary porcine fibroblasts, porcine kidney cells, porcine cardiomyocytes, porcine oocytes, porcine vascular endothelial cells, and the like.
  • the artificial medium 1 is dissolved in sterile purified water, and the fetal pig serum is added according to the formula ratio, and the sterile purified water is added to the required volume, and then the additive factor combination 1 is added.
  • the pig cell culture medium was thus prepared.
  • tissue block attachment method DMEM + 15% FBS + double antibody
  • the growth curve of the porcine cells cultured in the above three kinds of porcine cell culture medium for 10-16 days is as shown in Fig. 4, wherein the growth state optical density values of the cells cultured in the porcine cell culture medium A, B, and C by the MTT method are shown in Table 8. Shown.

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Description

一种猪细胞培养基 技术领域
本发明属于细胞生物学领域， 涉及一种猪细胞培养基， 其包括基 础培养基和胎猪血清。 本发明还涉及一种培养猪细胞的方法， 一种胎 猪血清以及所述胎猪血清在培养猪细胞或者制备猪细胞培养基中的用 途。 背景技术
培养基既是细胞培养中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础 物质， 也是细胞生长和繁殖的生存环境。 培养基的种类很多， 按其物 质状态分为半固体培养基和培养基两类； 按其来源分为合成培养基和 天然培养基。 目前主要使用的是在合成培养基中加入天然成分而成的 完全培养基。
完全培养基由基础培养基（如 MEM ) 和添加成分（如血清， 或对 于无血清的培养基， 使用激素及生长因子）组成。
基础培养基常常要添加血清， 血清终浓度多为 5%-20% ( v/v ) 。 特殊用途的血清来源须用经验确定， 广泛应用的血清种类有马血清与 胎牛血清。 胎牛血清中富含有丝分裂因子， 常选其作细胞增殖用， 也 用于细胞系和原代培养， 而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培 养。
目前， 猪细胞培养基主要是由基础培养基 DMEM和 /或 F12与胎牛 血清构成的完全培养基， 同时， 这种培养基也广泛应用于其它种类细 胞的培养。 胎牛血清来源较为容易， 产量较大， 是普遍使用的血清。 为有限， 细胞的传代次数也受到了很大的影响。 目前在猪的细胞培养 方面依然缺少较为理想合适的培养基。
对此，本发明人研制了一种猪细胞培养基，其中在基础培养基中加 入胎猪血清替代胎牛血清， 以排除使用胎牛血清导致的异种成分引起 的排斥现象。 本发明， 所述猪细胞中还可以加入选自如下至少一种的 添加因子： 表皮生长因子（EGF)、 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF) 、 人绒毛膜促性腺激素（HCG)、 孕马血清促性腺激素（ PMSG)。
采用本发明所述的猪细胞培养基可以显著改善猪细胞的培养状态 和提高猪细胞的增殖水平， 有利于用猪的细胞进行转基因克隆和诱导 性多能干细胞的相关研究和应用。 发明内容
本发明的一个方面涉及一种猪细胞培养基， 其包括基础培养基和 胎猪血清， 并且按照培养基的总体积， 所述胎猪血清的含量为 5% - 25% (v/v)。 在本发明的一个实施方案中， 猪细胞培养基中所述胎猪 血清的含量为 8-12% (v/v) 。 在本发明的又一个实施方案中， 猪细胞 培养基中所述胎猪血清的含量为 10-12% (v/v) 。
在本发明中， 猪细胞是指来源于猪个体的各种部位不同生长时期 的细胞。 本发明的猪细胞培养基适用于来自猪个体不同生长时期的各 种细胞， 包括但不限于： 原代猪成纤维细胞、 猪肾细胞、 猪心肌细胞、 猪卵母细胞、 猪血管内皮细胞等等。 其中， 所述 "猪细胞" 和 "胎猪 血清" 中的猪的品系并不特别限定， 常见的是家猪。
所述胎猪血清可以按照如下方法制得：
1 )血清分离： 将获自猪胎的血样进行离心， 获得血清；
2) 冷冻脱纤： 将步骤 1 ) 中离心分离得到的血清在 -20Ό下冷冻 脱纤 （即脱去纤维） ；
3)澄清过滤： 将步骤 2) 中得到样品使用蔡氏纤维素深度滤器进 行过滤；
4)血清透析： 将步骤 3)得到的样品用分子量 12000 - 14000的 透析膜在 0.15M NaCl 溶液中透析， 直至样品的葡萄糖含量 < 0.5 mg/mL;
5) γ射线照射： 将步骤 4)得到的样品进行 γ射线照射， 照射剂 量为 1.2 - 4 Gy， 得到粗制血清； 和 6 ) 除菌过滤： 先后使用 0.2 微米和 0.1 微米滤膜， 将步骤 5 ) 中得到的粗制血清再进行滤膜除菌过滤。
上述步骤 1 ) 中， 所述猪胎优选 3 - 4周龄的猪胎。
在本发明的一个实施方案中， 所述胎猪血清的制备方法还包括步 骤 7 ) 和 8 ) ：
7 ) 紫外线照射： 装瓶前用紫外线照射；
8 )封装保存： 将前面步骤 7 ) 制得的胎猪血清装瓶密封， -20 C 低温保存， 使用之前 41C过夜解冻。
在本发明的一个实施方案中， 所述猪细胞培养基中的基础培养基 为 DMEM、 或 F12、 或者是如下面的表 1所示组成的人工培养基：
表 O
1:人工培养基配方 o
化合物名称 含量 o
o o （mg/L)
O o
无水氯化钙 200.00 - 240.00
L-丝氨酸 o
o
L-色氨酸 o
O o o
o
L-苏氨酸
L -酪氨酸钠盐 104， 00 - 123· 00
硝酸铁
氯化钾 400. - 600.00 ί
L-缬氨酸
Figure imgf000004_0001
L -盐酸精氨酸 84.00 - 98.00
谷氨酰胺 584， 00 - 628.00
L -盐酸胱氨酸
L-亮氨酸
L -异亮氨酸 93.00- 105.00
L-盐酸组氨酸
L-盐酸赖氨酸 126.00 - 156.00
L -甲硫氨酸
L-苯^氨酸
无水硫酸镁 87.67 - 99.60
氯化钠 4400.00 - 6700.00
无水磷酸二氢钠
D -泛酸钙 2.00-6.00
氯化胆碱 2.00— 5.50
叶酸 肌醇
甘氨酸 20.00 - 40.00
烟酰胺
核黄素 0.20-0.60
盐酸硫胺 2.00-5.00
盐酸吡哆辛
葡萄糖 3500.00 - 5500.00
丙酮酸钠 100.00 - 120.00
酚红 在本发明的一个实施方案中，所述猪细胞培养基还包括添加因子。 在本发明中， 术语 "添加因子"是指选自如下的至少一种： 1 )表皮生 长因子（ EGF) , 例如鼠表皮生长因子 （如OO C C： Sigma E1257 ) ； 2)碱性 成纤维细胞生长因子 （bFGF) , 例如牛碱性 o成纤维细胞生长因子 （如 Sigma F5392 ) ； 人绒毛膜促性腺激素（ HCG) ( od如 Sigma C0684 ) 、 以 及孕马血清促性腺激素（ PMSG) (如 Sigma G4877 )
在本发明的一个实施方案中， 所述猪细胞培养基中添加因子的种 类与含量各自独立地如表 2所示。
表 2 添加因子的种类及其含量:
Figure imgf000005_0001
在本发明的一个实施方案中， 所述猪细胞培养基中添加因子的种 类与含量各自独立地如表 3所示。
表 3 添加因子的种类及其含量
Figure imgf000005_0002
在本发明中， 所述猪细胞可以是选自如下细胞中的一种： 原代猪 成纤维细胞、 猪腎细胞、 猪心肌细胞、 猪卵母细胞、 猪血管内皮细胞。 本发明的猪细胞培养基可以参照常规的细胞培养基（例如 DMEM 细胞培养基） 的方法进行配制， 例如可以参考下面的步骤：
1 ) 配制溶液
向基础培养基粉末（例如 DMEM培养基）， 加入所需水量（无菌超 纯水） 的一部分， 进行先行溶解， 然后按照最终的培养基的体积， 再 加入 5 % -25%的胎猪血清， 最后补足所需水量。
如果是液体 DMEM培养基， 直接向容器内加入终体积 5 % -25%的胎 猪血清， 混匀即可。 例如： 配置 l OOmL DMEM完全培养基， 可以在 90mL DMEM培养基中加入 10mL胎猪血清， 混匀。
然后按照培养基的终体积， 加入添加因子， 其选自如下物质中的 至少一种：
3 - 15 ng/ mL 表皮生长因子（ EGF)、 2 - 15 ng/ mL碱性成纤维 细胞生长因子 （FGF ) 、 4 - 30 IU/ mL 人绒毛膜促性腺激素（ HCG)、 2 - 28 IU/ mL孕马血清促性腺激素 （ PMSG ) ， 混匀。
2 )调节 pH值
用 pH试纸（或 pH电位计、 氢离子浓度比色计）测试培养基的 pH 值， 如不符合需要， 可用 10%HC1或 10%NaOH进行调节， 直到调节到配 方要求的 pH值为止， 一般在 6. 9-7. 5之间。
可选的， 本发明所述猪细胞培养基的配制方法还包括如下步骤：
3 ) 分装
对于配置好的培养基应按照实验具体需求情况进行分装， 一般分 装到 50mL离心管中。 分装后从每一离心管中抽取 lmL置于 35mm细胞 培养皿中， 将其放入细胞培养箱中培养两天观察是否有污染出现， 如 果没有， 即可使用； 如果出现污染， 需要重新配置。
4 )封口
用封口膜将装有培养基的 50mL离心管管口封闭。 本发明的另一个方面涉及一种培养猪细胞的方法， 其特征在于使 用本发明所述的猪细胞培养基。 其中， 所述猪细胞包括但不限于： 原 代猪成纤维细胞、 猪肾细胞、 猪心肌细胞、 猪卵母细胞、 猪血管内皮 细胞等。 本发明的再一个方面涉及一种按照如下方法制备的胎猪血清：
1)血清分离： 将获自猪胎的血样进行离心， 获得血清；
2) 冷冻脱纤： 将步骤 1) 中离心分离得到的血清在- 20Ό下冷冻 脱纤 （即脱去纤维） ；
3)澄清过滤： 将步骤 2) 中得到样品使用蔡氏纤维素深度滤器进 行过滤；
4)血清透析： 将步骤 3)得到的样品用分子量 12000 - 14000的 透析膜在 0.15M NaCl 溶液中透析， 直至样品的葡萄糖含量 < 0.5 mg/mL;
5) γ射线照射： 将步骤 4)得到的样品进行 γ射线照射， 照射剂 量为 1.2-4 Gy, 得到粗制血清； 和
6) 除菌过滤： 先后使用 0.2 微米和 0.1 微米滤膜， 将步骤 5) 中得到的粗制血清再进行滤膜除菌过滤。
在本发明的一个实施方案中， 所述胎猪血清的制备方法还包括步 骤 7) 和 8) ：
7) 紫外线照射： 装瓶前用紫外线照射；
8)封装保存： 将前面步骤 7) 制得的胎猪血清装瓶密封， - 20 低温保存， 使用之前 4 C过夜解冻。
在本发明中，所述猪胎是处死的猪胎，并且优选 3 - 4周龄的猪胎， 血样可以参照常规胎牛血清的采集方式收集。
本发明的还一方面涉及如上述方法制备的胎猪血清在猪细胞培养 和 /或制备猪细胞培养基中的用途。 其中， 所述猪细胞包括但不限于： 原代猪成纤维细胞、 猪腎细胞、 猪心肌细胞、 猪卵母细胞、 猪血管内 皮细胞等。 发明的有益效果
1 ) 改善细胞生长状态：
无论是否使用添加因子， 采用本发明所述猪细胞培养基（含有基 础培养基与胎猪血清）培养猪细胞， 猪细胞的生长形态明显优于采用 含有基础培养基与胎牛血清的传统培养基的情形。
2 )提高细胞增殖速度：
无论是否使用添加因子， 采用本发明所述猪细胞培养基（含有基 础培养基与胎猪血清）培养猪细胞， 猪细胞的增殖速度明显优于采用 含有基础培养基与胎牛血清的传统培养基的情形。
这说明本发明所述的猪细胞培养基在提高猪细胞的增殖速度方面 好于含有基础培养基与胎牛血清的传统统培养基。 附图说明
图 1: 培养基 A培养的原代猪成纤维细胞的形态图 （ 200 X ) 。 图 2: 培养基 B培养的原代猪成纤维细胞的形态图 （ 200 X ) 。 图 3: 培养基 C培养的原代猪成纤维细胞的形态图 （ 200 X ) 。 图 4: 培养基 A - C培养的原代猪成纤维细胞的生长曲线图。
图 5: 培养基 A培养的原代猪成纤维细胞的核型分析图 （ 200 X ) 图 6: 培养基 B培养的原代猪成纤维细胞的核型分析图 （ 200 X ) 图 7: 培养基 C培养的原代猪成纤维细胞的核型分析图 （ 200 X ) 图 8: 培养基 D - G培养的原代猪成纤维细胞的生长曲线图。 具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。 本领域技 术人员将会理解， 下面的实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定 本发明的范围。 实施例中未注明具体技术或条件者， 按照本领域内的 文献所描述的技术或条件（例如参考 J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译 的 《分子克隆实验指南》 ， 第三版， 科学出版社）或者按照产品说明 书进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得 的常规产品。 实施例 1 : 猪细胞培养基 A、 B、 C的配方
1 )猪细胞培养基 A的配方：
猪细胞培养基 A由人工培养基 1 (组分如表 4所示） 、 5 % ( v/v ) 胎猪血清和添加因子组合 1 (组分如表 5所示）组成。
表 4人工培养基 1配方：
Figure imgf000009_0001
盐酸吡哆辛 3. 00
葡萄糖 3500. 00
丙酮酸钠 100. 00
酚红 14. 00 表 5添加因子组合 1配方
Figure imgf000010_0001
根据说明书发明内容部分介绍的制备方法， 将人工培养基 1用无 菌纯净水溶解， 按照配方比例加入胎猪血清， 加入无菌纯净水至所需 体积后， 再加入添加因子組合 1。 如此制得猪细胞培养基人。
2 )猪细胞培养基 B的配方：
猪细胞培养基 B的组成与培养基 A基本相同， 只是其中使用相同 浓度的胎牛血清代替胎猪血清。
3 )猪细胞培养基 C的配方：
猪细胞培养基 C的配方与培养基 A基本相同， 只是其中不含有添 加因子 EGF、 bFGF, HCG、 和 PMSG。 实施例 2 : 猪细胞培养基 D、 E、 F、 G的配方
1)猪细胞培养基 D的配方：
猪细胞培养基 D由人工培养基 2 (组分如表 6所示）、 25 % ( v/v ) 胎猪血清和添加因子组合 2 (组分如表 7所示）组成。
表 6人工培养基 2配方：
化合物名称 含量 （mg/L)
无水氯化钙 240. 00
L-丝氨酸 55. 00
L-色氨酸 20. 00
L-苏氨酸 110. 00
L-酪氨酸钠盐 123. 00 硝酸铁 0. 40 氯化钾 600. 00
L-缬氨酸 112. 00
L-盐酸精氨酸 98. 00
L -谷氨酰胺 628. 00
L-盐酸胱氨酸 72. 00
L-亮氨酸 110. 00
L -异亮氨酸 105. 00
L-盐酸组氨酸 52. 00
L-盐酸赖氨酸 156. 00
L-甲硫氨酸 40. 00
L -苯 氨酸 78. 00 无水硫酸镁 99. 60 氯化钠 6700. 00 无水磷酸二氢钠 145. 00
D-泛酸钙 6. 00 氯化胆碱 5. 50 叶酸 5. 50 肌醇 8. 30 甘氨酸 40. 00 烟酰胺 5. 00 核黄素 0. 60 盐酸硫胺 5. 00 盐酸吡哆辛 6. 00 葡萄糖 5500. 00 丙酮酸钠 120. 00 酚红 16. 00 表 7添加因子组合 2配方
Figure imgf000011_0001
2 ) 培养基 E的配方: 培养基 E的配方与培养基 D基本相同， 只是其中使用相同浓度的 胎牛血清代替胎猪血清。
3 )培养基 F的配方：
培养基 F的配方与培养基 D基本相同， 只是其中不含有添加因子 EGF、 bFGF、 HCG、 和 PMSG。
4 )培养基 G的配方：
培养基 G的配方与培养基 F相同， 只是其中使用相同浓度的胎牛 血清代替胎猪血清。 实施例 3: 原代猪成纤维细胞的制备
原代猪成纤维细胞可以用传统的酶消化法制备， 步骤如下：
1) 将处死 （处死后 10小时内） 的猪胎， 快速用 70%的酒精擦洗 三遍， 放入 PBS+双抗溶液中；
2) 在超净工作台中将猪胎用 PBS 漂洗干净， 除去猪胎的头、 四 肢及内脏；
3) 在直径 60 mm 平皿中将步骤 2 ) 处理后的猪胎组织切碎， 转 移组织碎块至 50 mL 三角烧瓶中， 进一步剪碎成为 1 腿 3大小的碎块， 取少量组织碎块平铺于 100 mm 培养孤 ， 加入 10 mL 培养液
( DMEM+15%FBS+双抗） ， 放入 C02培养箱培养（组织块贴附法）； 其余 组织碎块加入 3-5 mL 39 " 预热的 0. 25%胰蛋白酶消化液， 放入 C02培 养箱消化 15 - 30 分钟， 每隔 5分钟取出搅拌， 并取少量于显微镜下 观察消化情况；
4) 消化完毕后加 15 mL DMEM+15%FBS+双抗终止消化， 1000 rpm, 离心 10 分钟，弃上清；
5) 用 DMEM 重悬消化下来的细胞和未消化的组织块；
6) 用 100目筛网或用二层无菌纱布过滤消化产物，收集过滤物于 50 mL 离心管中， 1000 rpm, 离心 5 分钟， 收集细胞；
7) 再用培养液（DMEM + 15 % FBS ) 离心洗涤一次， 稀释细胞至浓 度约为 107个细胞 /mL。 本实施例中， 所述双抗均指浓度 100 IU/mL 青霉素 + 100 mg/mL 链霉素。 实施例 4 : 猪细胞培养基 A、 B、 C培养的猪原代成纤维细胞的形 态、 生长曲线和核型分析
分别使用实施例 1中制备的培养基人、 B、 C培养实施例 3中制备 的原代猪成纤维细胞， 以相同接种密度将细胞接种到直径 100mm 的培 养 中， 置于 39 ， 5 % C02培养箱中培养。 除了培养基不同， 其它培 养条件均相同。
当猪细胞汇合至 80%后传代， 传代 15次， 并对各细胞系 （即分别 用培养基 、 B、 C培养的猪原代成纤维细胞） 进行形态、 生长曲线和 核型分析。
结论如下：
1 ) 形态分析：
培养结果显示： 在相同的培养条件下， 采用猪细胞培养基 A培养 的细胞密度高于传统培养基 B培养的细胞密度， 说明采用本发明所述 猪细胞培养基优于传统猪细胞培养基。 同时，采用猪细胞培养基 A培养的细胞呈长梭形， 贴壁能力较好， 生长状态明显好于采用猪细胞培养基 C培养的细胞， 说明采用胎猪血 清和添加因子的本发明猪细胞培养基的细胞效果好于只采用胎猪血清 的本发明猪细胞培养基（参见附图 1 - 3 ) 。
2 ) 生长曲线分析（MTT比色法检测） ：
对于采用上述三种猪细胞培养基培养猪细胞 Q - 16天的生长曲线 如附图 4所述， 其中 MTT法检测猪细胞培养基 A、 B、 C培养的细胞的生 长状态光密度值如表 8所示。
表 8: MTT法检测猪细胞培养基 A、 B、 C培养的细胞的生长状态光密 度值
第 2天 第 4天 第 6天 第 8天 第 10天 第 12天 第 14天 第 16天 培养基 A 0. 35 0. 46 0. 55 0. 46 0. 41 0. 43 0. 33 0. 36 培养基 B 0. 29 0. 39 0. 49 0. 37 0. 35 0. 36 0. 29 0. 29 培养基 c 0. 12 0. 28 0. 21 0. 22 0. 21 0. 23 0. 19 0. 23 备注： 从细胞培养开始每 2天检测一次， 共检测 8次。
由图 4可见：
采用猪细胞培养基 C培养的原代猪成纤维细胞， 其生长状态光密 度值均低于采用猪细胞培养基 、 B培养的细胞， 说明仅采用胎猪血清 而不采用添加因子的本发明所述猪细胞培养基， 其对猪细胞的生长效 果不如采用胎牛血清和添加因子的传统培养基；
而采用猪细胞培养基 A培养的细胞与猪细胞培养基 B培养的细胞 生长曲线的生长趋势虽然相似， 但采用猪细胞培养基 A培养的原代猪 成纤维细胞， 其生长状态光密度值均在相同的时间均高于培养基 B培 养的细胞（参见附图 4 ) 。 说明采用胎猪血清和添加因子的本发明所 述猪细胞培养基， 其对猪细胞的生长效果优于采用胎牛血清和添加因 子的传统培养基。
3 )核型分析：
采用猪细胞培养基 A、 B、 C培养的原代猪成纤维细胞， 其核型均 较为正常， 没有出现缩短、 粘连等现象（参见附图 5 - 7 ) 。
综上， 采用猪细胞培养基 A培养的细胞生长状态良好、 生长速度 较快、 贴壁率较高， 细胞染色体核型正常， 本发明所述猪细胞培养基 A是优于传统培养基的新型改良培养基。 实施例 5: 猪细胞培养基 D、 E、 F、 G培养的猪原代成纤维细胞的 形态、 生长曲线和核型分析
分别使用实施例 2中制备的培养基0、 E、 F、 G培养实施例 3中制 备的原代猪成纤维细胞， 除了培养基不同， 4 个细胞培养样品的其它 条件完全相同。 当细胞汇合至 80%后传代， 传代 15次， 并对各细胞系 进行形态、 生长曲线和核型分析。
实验步骤参考实施例 4， 除了所用培养基不同， 其余操作完全相 同。
结果如下表 9所示。 表 9: MTT法检测培养基 D、 E、 F、 G培养的细胞的生长状态光密度
Figure imgf000015_0001
备注： 从细胞培养开始每 2天检测一次， 共检测 8次。
在相同的培养条件下， 猪细胞培养基 D培养的细胞， 其生长状态 光密度值均高于培养基 E的细胞的生长曲线， 说明采用胎猪血清和添 加因子的本发明所述猪细胞培养基， 其对猪细胞的生长效果优于采用 胎牛血清和添加因子的传统培养基。
综上， 采用猪细胞培养基 D培养的细胞生长状态良好、 生长速度 较快 （参见附图 8 ) 、 贴壁率较高， 细胞染色体核型正常， 猪细胞培 养基 D是优于传统培养基的新型改良培养基。 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人 员将会理解。 根据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修 改和替换， 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

权 利 要 求
1. 一种猪细胞培养基，其包括基础培养基和胎猪血清， 并且按照 猪细胞培养基的总体积， 所述胎猪血清的含量为 5% - 25% (v/v) ； 具体地， 所述胎猪血清的含量为 8%- 12% (v/v)； 更具体地， 所述胎猪 血清的含量为 10%- 12% (v/v) 。
2. 根据权利要求 1所述的猪细胞培养基， 其中， 所述胎猪血清按 照如下方法制得：
1 )血清分离： 将获自猪胎的血样进行离心， 获得血清；
2 )冷冻脱纤： 将步骤 1 ) 中离心分离得到的血清在 -20*C下冷冻 脱纤；
3)澄清过滤： 将步骤 2)中得到样品使用蔡氏纤维素深度滤器进 行过滤；
4)血清透析： 将步骤 3)得到的样品用分子量 12000 - 14000的 透析膜在 0.15M NaCl 溶液中透析， 直至样品的葡萄糖含量 < 0.5 mg/mL;
5) γ射线照射： 将步骤 4)得到的样品进行 γ射线照射， 照射剂 量为 1.2 - 4 Gy， 得到粗制血清； 和
6) 除菌过滤： 先后使用 0.2 微米和 0.1 微米滤膜， 将步骤 5) 中得到的粗制血清再进行滤膜除菌过滤。
3. 根据权利要求 1所述的猪细胞培养基，其中， 所述基础培养基 为 DMEM、 或 F12、 或者是如下组成的人工培养基（mg/L) ：
无水氯化钙 200.00 -240.00
L-丝氨酸 42.00-55.00
L-色氨酸 16.00-20.00
L-苏氨酸 95.00-110.00
L -酪氨酸钠盐 104.00-123.00
硝酸铁 0.10-0.40 氯化钾 400. 00-600. 00
L-缬氨酸 94. 00-112. 00
L -盐酸精氨酸 84. 00-98. 00
L -谷氨酰胺 584. 00-628. 00
L -盐酸胱氨酸 63. 00-72. 00
L-亮氨酸 95. 00-110. 00
L-异亮氨酸 93. 00-105. 00
L-盐酸组氨酸 32. 00-52. 00
L-盐酸赖氨酸 126. 00-156. 00
L-甲硫氨酸 25. 00-40. 00
L -苯雨氨酸 46. 00-78. 00
无水硫酸镁 87. 67-99. 60
氯化钠 4400. 00-6700. 00
无水磚酸二氬钠 105. 00-145. 00
D-泛酸钙 2. 00-6. 00
氯化胆碱 2. 00-5. 50
叶酸 3. 00-5. 50
肌醇 5. 20-8. 30
甘氨酸 20. 00-40. 00
烟酰胺 3. 00-5. 00
核黄素 0. 20-0. 60
盐酸硫胺 2. 00-5. 00
盐酸吡哆辛 3. 00-6. 00
葡萄糖 3500. 00-5500. 00
丙酮酸钠 100. 00-120. 00 以及
酚红 14. 00-16. 00。
4. 根据权利要求 1所述的猪细胞培养基，其中，还含有如下添加 因子中的至少一种： 表皮生长因子、
碱性成纤维细胞生长因子、
人绒毛膜促性腺激素、 以及
孕马血清促性腺激素。
5. 根据权利要求 4所述的猪细胞培养基，其中，按照猪细胞培养 基的体积， 添加因子的含量各自独立地为：
表皮生长因子 3- 15 ng/ mL
碱性成纤维细胞生长因子 2-15 ng/ mL
人绒毛膜促性腺激素 4 - 30 IU/ mL
孕马血清促性腺激素 2 - 28 IU/ mL;
具体地， 添加因子的含量各自独立地为：
表皮生长因子 8.5-12.6 ng/ mL
碱性成纤维细胞生长因子 6.6-11.8 ng/ mL
人绒毛膜促性腺激素 16.7-23.4 IU/ mL
孕马血清促性腺激素 17.3-22.6 IU/ mL。
6. 一种培养猪细胞的方法， 其特征在于， 使用权利要求 1-5中 任一项所述的猪细胞培养基， 其中， 所述猪细胞选自： 原代猪成纤维 细胞、 猪肾细胞、 猪心肌细胞、 猪卵母细胞、 和猪血管内皮细胞。
7. 一种按照如下方法制备的胎猪血清：
1)血清分离： 将获自猪胎的血样进行离心， 获得血清；
2) 冷冻脱纤： 将步骤 1) 中离心分离得到的血清在- 20 下冷冻 脱纤；
3)澄清过滤： 将步骤 2) 中得到样品使用蔡氏纤维素深度滤器进 行过滤；
4)血清透析： 将步骤 3)得到的样品用分子量 12000 - 14000的 透析膜在 0.15M NaCl 溶液中透析， 直至样品的葡萄糖含量 < 0.5 mg/mL;
5) Y射线照射： 将步骤 4)得到的样品进行 γ射线照射， 照射剂 量为 1.2 - 4 Gy， 得到粗制血清； 和
6 ) 除菌过滤： 先后使用 0.2 微米和 0.1 微米滤膜， 将步骤 5 ) 中得到的粗制血清再进行滤膜除菌过滤。
8. 权利要求 7所述的胎猪血清在猪细胞培养和 /或制备猪细胞培 养基中的用途。
9. 根据权利要求 8所述的用途， 其中， 所述猪细胞选自： 原代猪 成纤维细胞、 猪肾细胞、 猪心肌细胞、 猪卵母细胞、 和猪血管内皮细 胞。
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