WO2011142310A1 - ｃＤＮＡの合成方法 - Google Patents

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WO2011142310A1
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dnase
endodeoxyribonuclease
dna
reaction
reverse transcriptase
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PCT/JP2011/060643
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祐子 中林
上森　隆司
向井　博之
浅田　起代蔵
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タカラバイオ株式会社
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a method useful for cDNA synthesis and a kit useful for cDNA synthesis.
  • RNA-dependent DNA polymerases that is, reverse transcriptases
  • reverse transcriptases have enabled reverse transcription reactions that synthesize cDNA using RNA as a template
  • the analysis of mRNA molecules has made great strides in the development of mRNA molecules using reverse transcriptase.
  • Analytical methods are now indispensable experimental methods in gene research.
  • a PCR method for amplifying a DNA fragment using cDNA synthesized by reverse transcription as a template is called RT-PCR method.
  • the RT-PCR method is useful not only for the cloning of mRNA-derived cDNA and the preparation of a cDNA library, but also as a method for examining the expression state of specific RNA.
  • DNA is mixed in the sample used for cDNA synthesis, the region or pseudogene on the DNA encoding RNA may be amplified, so only the DNA synthesized using RNA as a template It becomes difficult to get selectively.
  • a method using a nucleotide analog and a compound that lowers the Tm value during the reverse transcription reaction (Patent Document 1), or DNA in the sample is deoxyribonuclease I (hereinafter referred to as “DNA”).
  • DNA deoxyribonuclease I
  • a reverse transcription reaction is performed after degradation with endo-deoxyribonuclease (hereinafter sometimes referred to as endo-DNase).
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a cDNA synthesis method that can easily prevent the generation of DNA-derived amplification products mixed in a sample.
  • the present inventors have found that it is possible to prepare a reaction solution composition in which endo DNase does not show activity and reverse transcriptase shows activity, and further, based on this finding, synthesis of cDNA that can solve the above problems
  • the present invention regarding the method and kit for cDNA synthesis was completed.
  • the present invention [1] After degrading DNA in a sample containing RNA and DNA with endodeoxyribonuclease to give a treated sample, the treated sample and reverse transcriptase can be used without heat deactivation of endodeoxyribonuclease or removal of endodeoxyribonuclease.
  • a method for synthesizing cDNA comprising preparing a reaction solution containing no endodeoxyribonuclease and comprising a reaction mixture, and performing a reverse transcription reaction, [2] (a) obtaining a sample containing RNA and DNA and a composition containing endodeoxyribonuclease; (b) in a step (a) under conditions sufficient for endodeoxyribonuclease to degrade DNA in the sample. A step of treating the resulting composition; and (c) a reaction solution in which endodeoxyribonuclease does not exhibit activity is prepared by adding an additive and reverse transcriptase to the composition treated in step (b).
  • the method according to [1], comprising a step of performing a reverse transcription reaction with an enzyme, [3] The method according to [1], wherein the endodeoxyribonuclease is deoxyribonuclease I, [4] The method according to [1], wherein the reverse transcriptase is a Moloney murine leukemia virus-derived reverse transcriptase, [5] The method according to [2], wherein the additive is at least one selected from the group consisting of a reducing agent, a monovalent cation and a salt thereof.
  • [6] The method according to [5], wherein the monovalent cation is an ammonium ion
  • [7] A method for amplifying cDNA comprising a step of performing a gene amplification reaction using the cDNA synthesized by the method according to any one of [1] to [6] as a template, and [8] (A) End Addition for preparing a composition for a reverse transcription reaction in which deoxyribonuclease, (B) buffer, (C) reverse transcriptase, and (D) reverse transcriptase are active and endodeoxyribonuclease is not active
  • the present invention relates to a kit for the method according to any one of [1] to [7], comprising an agent.
  • the present invention it is possible to prevent the generation of DNA-derived amplification products mixed in a sample and to synthesize cDNA with excellent operability and quantitativeness.
  • FIG. 1 shows the results of agarose gel electrophoresis in Example 2.
  • FIG. 2 shows the results of real-time PCR in Example 8.
  • DNA in a sample containing RNA and DNA is digested with endodeoxyribonuclease to give a treated sample, and then the treatment is performed without heat deactivation of endodeoxyribonuclease or removal of endodeoxyribonuclease.
  • a reverse transcription reaction is carried out by preparing a reaction solution containing a sample and reverse transcriptase and in which endodeoxyribonuclease is not active.
  • thermo deactivation of endo-deoxyribonuclease means that a sample containing endo-DNase is heat-treated at 60 ° C.
  • endo-DNase endo-deoxyribonuclease
  • the sample used in the method of the present invention may be a sample containing RNA, for example, a sample containing RNA and DNA.
  • biological samples such as cells, tissues, blood, nucleic acid-containing samples obtained by treating them with known methods, samples that may contain organisms such as food, soil, and wastewater Is exemplified.
  • a nucleic acid-containing sample obtained by processing a biological sample by a known method include, for example, a cell lysate, a sample obtained by fractionating it, total RNA in the sample, or a specific RNA molecule group
  • a sample enriched with mRNA may be mentioned, and a sample in which DNA is mixed may be used.
  • endodeoxyribonuclease refers to an enzyme that cleaves a DNA strand into an endo-type.
  • Preferred examples of endo-DNase used in the present invention include double-stranded DNA-specific endo-DNase.
  • non-sequence-specific endonucleases such as DNase I and Shrim DNase and sequence-specific endonucleases such as restriction enzymes are more preferred. Is exemplified.
  • the treated sample obtained by degrading the DNA in the sample with endo-DNase is not particularly limited as long as the sample is maintained under conditions such that the DNA in the sample is degraded by endo-DNase. It can prepare suitably according to DNase and a sample.
  • the present invention is not particularly limited, when DNase I is used as the endo DNase, the holding conditions are preferably 20 ° C. to 45 ° C. for 10 seconds to 12 hours, more preferably 25 ° C. to 44 ° C. for 30 seconds. Examples are conditions of ⁇ 1 hour, more preferably 30 ° C. to 43 ° C. for 1 minute to 30 minutes.
  • the reverse transcriptase used in the present invention may be any enzyme having reverse transcription activity, that is, an activity that synthesizes DNA complementary to RNA using RNA as a template.
  • reverse transcriptase derived from Moloney murine leukemia virus (derived from MMLV) Reverse transcriptase) and avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase (AMV-derived reverse transcriptase) and other virus-derived reverse transcriptases, thermophilic Bacillus bacteria-derived DNA polymerases (Bca DNA polymerase, etc.), etc.
  • Examples thereof include reverse transcriptases derived from eubacteria and DNA polymerases (Tth DNA polymerase, etc.) having both reverse transcription activity derived from bacteria of the genus Thermus and DNA-dependent DNA polymerase activity.
  • virus-derived reverse transcriptase is preferably used, and MMLV-derived reverse transcriptase is more preferably used.
  • a reverse transcriptase either a naturally-derived enzyme or a recombinant enzyme can be used in the present invention, and a reverse transcriptase in which a naturally-occurring amino acid sequence is modified within a range having reverse transcription activity can also be used in the present invention.
  • reaction solution in which endo-deoxyribonuclease does not exhibit activity is “reaction solution in which endo-deoxyribonuclease does not exhibit DNA-decomposing activity”.
  • reaction solution in which endo-deoxyribonuclease does not exhibit DNA-decomposing activity 40 ⁇ g / mL of calf thymus DNA in the reaction solution A reaction solution in which the absorbance at 260 nm does not substantially change even if it is held at 25 ° C. for 10 minutes in the presence of 8 U / mL DNase I (Takara Bio Inc.) with the indicated titer on the product. To tell.
  • the reaction solution containing the treated sample and reverse transcriptase and in which endo DNase does not show activity is, for example, the reaction solution after the degradation of DNA in the sample by endo DNase shows that endo DNase exhibits DNA decomposing activity. It can be prepared by adding an additive, reverse transcriptase, and other components so as to obtain a composition that does not. That is, (a) obtaining a composition comprising a sample and endodeoxyribonuclease, (b) treating the composition obtained by step (a) under conditions sufficient for endodeoxyribonuclease to degrade the DNA in the sample.
  • step (c) a method in which an additive and reverse transcriptase are added to the composition treated in step (b) to prepare a reaction solution in which endodeoxyribonuclease does not exhibit activity, and a reverse transcription reaction is performed.
  • the composition containing the sample and endodeoxyribonuclease in the above step (a) further includes a buffer such as Tris-HCl, a divalent metal ion such as magnesium ion or manganese ion, and dithiothreitol (hereinafter referred to as “dithiothreitol”). It is preferred that a reducing agent such as DTT) is included.
  • a buffer such as Tris-HCl
  • a divalent metal ion such as magnesium ion or manganese ion
  • dithiothreitol dithiothreitol
  • a reducing agent such as DTT
  • the type and concentration of the buffer, divalent metal ion, and reducing agent are within the range where endo DNase exhibits the activity of degrading DNA in the sample in the next step (b), and the reaction characteristics and stability of endo DNase. It is preferable to set so that endo DNase exhibits high activity and high stability.
  • the type and concentration of the buffer may be set near the optimum pH of endo DNase by addition thereof.
  • the pH of the reaction solution can be adjusted to pH 5-10. Is preferable.
  • the type and concentration of the reducing agent may be set so that endo DNase exhibits high stability.
  • DNase I is used as endo DNase, 1 mM or more and less than 5 mM of DTT may be included in the composition. preferable.
  • the conditions sufficient for the endodeoxyribonuclease in step (b) to degrade the DNA in the sample are that the DNA-derived product in the sample is substantially confirmed in the subsequent reverse transcription reaction and the subsequent nucleic acid amplification reaction.
  • the conditions are such that the DNA is decomposed so that it can no longer be decomposed, and those skilled in the art can appropriately set according to the endo DNase and sample used.
  • the present invention is not particularly limited, when DNase I is used as the endo DNase, conditions of 20 seconds to 45 ° C. for 10 seconds to 12 hours are preferably exemplified, and 25 ° C. to 44 ° C. for 30 seconds to 1 hour.
  • the conditions are more preferably exemplified, and the conditions at 30 ° C. to 43 ° C. for 1 minute to 30 minutes are even more suitably exemplified.
  • Examples of the additive in the step (c) include at least one selected from the group consisting of a reducing agent, a monovalent cation and a salt thereof.
  • the additive can be used in the present invention, for example, in the form of an aqueous solution containing the additive, preferably a buffer solution containing the additive.
  • the type and concentration of the buffer used in the above buffer solution are not particularly limited as long as the reaction solution can be adjusted to a desired pH, but by adding the buffer agent, the concentration is close to the optimum pH of the reverse transcriptase used in the reverse transcription reaction. It is preferable that the pH of the reaction solution can be changed.
  • the buffering agent is not particularly limited, and a good buffer such as Tris-HCl is exemplified.
  • Examples of the reducing agent include thiol reducing agents such as DTT and 2-mercaptoethanol.
  • Examples of the monovalent cation include ammonium ions and alkali metal ions such as potassium ions, lithium ions, and sodium ions, and salts thereof such as ammonium sulfate and potassium chloride may be used.
  • the type and amount of the reducing agent, monovalent cation or salt thereof used is such that endo-DNase does not show activity in the composition to which the additive is added and the reverse transcriptase functions effectively. There is no particular limitation, and those skilled in the art can make an appropriate decision based on the disclosure of this specification.
  • the components contained in the composition in which endo DNase does not show activity and reverse transcriptase functions effectively include, for example, when endo DNase is DNase I, ammonium sulfate, DTT, and chloride.
  • An example is potassium.
  • the concentration of ammonium sulfate in the composition is preferably 5 mM or more, more preferably 10 mM to 30 mM, and further preferably 14 mM to 28 mM.
  • the DTT concentration is preferably 5 mM or more, more preferably 11 mM to 30 mM, and further preferably 12 mM to 20 mM.
  • the concentration of potassium chloride is preferably 1 mM or more, more preferably 3 mM to 30 mM, and further preferably 5 mM to 20 mM.
  • the final concentration in the composition preferably includes 5 mM or more ammonium sulfate, 5 mM or more DTT, and 1 mM or more potassium chloride, more preferably 10 mM to 30 mM ammonium sulfate, 11 mM to 30 mM DTT, And 3 mM to 30 mM potassium chloride, more preferably 14 mM to 28 mM ammonium sulfate, 11 mM to 30 mM DTT, and 5 mM to 20 mM potassium chloride, more preferably 14 mM to 28 mM ammonium sulfate, 12 mM to 20 mM.
  • the additive is formulated to contain DTT and 5-20 mM potassium chloride.
  • said additive can be used for this invention as a buffer solution for reverse transcription reaction liquid preparation mixed with components required for reverse transcription reactions, such as reverse transcriptase, a buffer agent, an oligonucleotide primer, and dNTP. .
  • components required for reverse transcription reactions such as reverse transcriptase, a buffer agent, an oligonucleotide primer, and dNTP.
  • the conditions for the reverse transcription reaction are not particularly limited as long as they are sufficient to synthesize a primer extension strand complementary to the template RNA.
  • the conditions sufficient for synthesizing the primer extension strand complementary to the template RNA are not particularly limited, but the temperature condition is preferably 25 to 60 ° C., more preferably 30 to 50 ° C. .
  • the reaction time is preferably 5 to 120 minutes, more preferably 15 to 60 minutes.
  • the reaction solution may be incubated under conditions that inactivate the reverse transcriptase. Examples of conditions for inactivating reverse transcriptase include conditions at 85 ° C. for 5 seconds.
  • the cDNA amplification method of the present invention includes a step of performing a gene amplification reaction using the cDNA synthesized by the cDNA synthesis method of the present invention as a template.
  • gene amplification methods well known in the art such as PCR method, ICAN method, LAMP method and SDA method can be used.
  • PCR when PCR is used for nucleic acid amplification, general PCR conditions can be applied, such as dissociation (denaturation) of double-stranded template DNA into single strands, annealing of primers into single-stranded template DNA, By a reaction consisting of three steps of complementary strand synthesis (extension) from a primer, or “shuttle PCR” [“PCR Method Front Line”, “Protein Nucleic Acid Enzyme”, separate volume, Vol. 41, No. 5, pages 425-428 Among the above-mentioned three-step reactions, called “page (1996)”, the primer annealing and extension steps are performed by a two-step reaction at the same temperature.
  • real-time PCR capable of monitoring nucleic acid amplification using an intercalating dye, a FRET labeled probe, or the like can also be used.
  • the kit of the present invention is a kit for use in the method of synthesizing the cDNA of the present invention or the method of amplifying the cDNA of the present invention.
  • A Endodeoxyribonuclease
  • B Buffer
  • C Reverse transcriptase
  • D an additive for preparing a composition for a reverse transcription reaction in which reverse transcriptase is active and endodeoxyribonuclease is not active.
  • the buffer (B) may contain a divalent metal ion necessary for endo DNase reaction.
  • the additive (D) may contain an oligonucleotide primer or dNTP necessary for the reverse transcription reaction by reverse transcriptase.
  • reaction solutions 1 to 5 Five types of 20 ⁇ L reaction solutions (reaction solutions 1 to 5) containing 5 U DNase I (Recombinant DNase I (RNase-free), Takara Bio Inc.), 200 ng of mouse genomic DNA, and the components shown in Table 1 were prepared. . Moreover, 5 types of reaction liquid 20microliter of the composition similar to the above was prepared except not containing DNaseI.
  • the reaction solution 1 is set so that each component has a concentration half that of the standard reaction solution composition of DNase I, and the reaction solution 2 has a pH near the optimum pH of reverse transcriptase and reverse transcriptase. It is set so as to include dNTP as a substrate.
  • reaction solutions were incubated at 37 ° C. for 15 minutes and then incubated at 85 ° C. for 5 seconds.
  • the amount of genomic DNA remaining in each reaction solution was quantified by real-time PCR using the Rsp18 gene region as a target sequence.
  • SYBR Premix ExTaq Perfect Real Time, Takara Bio Inc.
  • Table 2 shows the results of quantitative determination of genomic DNA by real-time PCR and the inhibition rate of genomic DNA degradation in each reaction solution composition.
  • the reaction solution 1 in which the genomic DNA in the reaction solution is completely decomposed the reaction solution added with KCl or (NH 4 ) 2 SO 4 or the reaction solution 3 to 5 with an increased DTT concentration Then, the suppression effect of DNA degradation was recognized.
  • the reaction solution 4 to which (NH 4 ) 2 SO 4 was added and the reaction solution 5 in which the concentration of DTT was increased a high DNA degradation inhibitory effect was observed.
  • disassembly was computed from the following formula
  • Inhibition rate (%) DNA amount of reaction solution containing DNase I / DNA amount of reaction solution not containing DNase I ⁇ 100
  • Example 2 Search for Reaction Composition that Suppresses End DNase Activity-2
  • 6 types of reaction solutions containing 5 U of DNase I (Takara Bio Inc.), 200 ng of mouse genomic DNA, and the components shown in Table 3 (reaction solution 1 6)
  • 6 types of reaction liquid 20microliter of the same composition was prepared except not containing DNaseI.
  • These reaction solutions were incubated at 37 ° C. for 15 minutes and then incubated at 85 ° C. for 5 seconds. Next, each reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, thereby confirming the degradation of mouse genomic DNA by DNaseI.
  • FIG. 1 The result of electrophoresis is shown in FIG.
  • the genomic DNA band disappeared completely by the action of DNase I.
  • the compositions of the reaction solutions 3 and 4 the genomic DNA band did not disappear completely even in the presence of DNase I, and a smear-like electrophoretic image could be confirmed. From this, it was confirmed that DNase I activity was suppressed in the reaction liquids 3 and 4. Moreover, since the degree of the suppression was larger in the reaction solution 4, it was confirmed that (NH 4 ) 2 SO 4 suppresses DNase I activity in a concentration-dependent manner.
  • the genomic DNA band did not change at all even in the presence of DNase I, so that it was confirmed that DNase I activity was completely suppressed in these reaction solutions.
  • DNase I activity can be further suppressed by adjusting the Mg concentration in addition to adding KCl, (NH 4 ) 2 SO 4 and increasing the DTT concentration.
  • DNase I can be activated by adding a separately prepared additive so that the final concentration becomes the composition of reaction solution 5 or 6 after DNA degradation with DNase I with the composition of reaction solution 1. It was suggested that another enzymatic reaction would not be possible.
  • Example 3 Confirmation of DNase activity Reaction solution having components described in Reaction Solution 2 of Table 2 in Example 2 in which degradation of genomic DNA by DNase I was confirmed and Table of Example 2 in which degradation of genomic DNA was not confirmed With respect to the reaction solution having the composition described in the reaction solution 5 in 3, the DNase activity of DNase I in these reaction solutions was measured.
  • the amount of enzyme that increases the absorbance of OD260 of the reaction solution by 0.001 per minute using calf thymus DNA as a substrate is 1 U.
  • the reaction solution having the components described in Reaction Solution 2 in Table 3 shows an activity approximately 8 times higher than the display titer of the product, whereas the reaction having the components described in Reaction Solution 5 in Table 3 is performed.
  • the activity was below the detection limit even when 30 times DNase I was used in the reaction measurement in the reaction liquid having the components described in reaction liquid 2 in Table 3. From this, it was confirmed that the activity of DNase I was completely suppressed in the reaction solution having the components described in the reaction solution 5 of Table 3.
  • Example 4 Reverse transcription reaction in the presence of DNase I in a reaction composition in which DNase I does not act-1
  • a reverse transcription reaction with a reverse transcriptase was performed in the reaction solution having the components described in the reaction solution 5 of Table 3 in Example 2 and the reaction solution having the components described in the reaction solution 6 of Table 3 in Example 2
  • the effect of DNaseI in the reaction solution on cDNA synthesis was verified by the following method.
  • the above solution containing reverse transcriptase is added to the mixed solution after DNase treatment, and the final concentrations other than reverse transcriptase, DNase I, RNase inhibitor and primer are set to the components described in Reaction Solution 5 in Table 3 or Table 3 The components described in Reaction 6 were used.
  • reverse transcriptase was inactivated at 85 ° C. for 5 seconds. The amount of cDNA synthesis after the reverse transcription reaction was evaluated by real-time PCR using the Rsp18 gene region as a target sequence.
  • SYBR Premix ExTaq Perfect Real Time, Takara Bio Inc.
  • SYBR Premix ExTaq Perfect Real Time, Takara Bio Inc.
  • Primers consisting of the nucleic acid sequence were used.
  • Table 4 shows the results of real-time PCR. As shown in Table 4, there was no difference in Ct values with and without DNaseI. From this result, in the reaction solution having the components described in Reaction Solution 5 in Table 3 and the reaction solution having the components described in Reaction Solution 6 in Table 3, DNase I does not affect the cDNA synthesis by reverse transcriptase. It could be confirmed.
  • Example 5 Reverse transcription reaction in the presence of DNase I in a reaction composition in which DNase I does not act-2 The amount of cDNA synthesized by reverse transcriptase in the presence of DNase I in a reaction composition in which DNase I does not act was compared with the amount of cDNA synthesized by a standard reverse transcription reaction composition not containing DNase I.
  • the standard reverse transcription reaction composition not containing DNase I is 1 ⁇ L of mouse liver total RNA solution diluted serially from 2 ⁇ g / ⁇ L to 20 pg / ⁇ L, 200 U PrimeScript® RTase (Takara Bio Inc.), 20 U RNase.
  • a total of 10 ⁇ L of a reaction solution containing Inhibitor (Takara Bio Inc.), 50 pmol OligodT primer, and 100 pmol Random 6mers, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, and 3 mM MgCl 2 was used.
  • a reverse transcription reaction was performed at 37 ° C. for 15 minutes, and then the reverse transcriptase was inactivated at 85 ° C. for 5 seconds.
  • the amount of cDNA synthesis after the reverse transcription reaction was evaluated by real-time PCR using the Rsp18 gene region as a target sequence.
  • SYBR Premix ExTaq Perfect Real Time, Takara Bio Inc.
  • Primers consisting of the nucleic acid sequence were used.
  • Table 5 shows the results of real-time PCR. As shown in Table 5, the Ct values obtained by real-time RT-PCR according to the method of the present invention almost coincided with the Ct values obtained by conventional standard real-time RT-PCR. As a result, it has been clarified that the method of the present invention can efficiently perform the reverse transcription reaction while completely suppressing the degradation of the cDNA synthesis product by DNase I.
  • Example 6 Reverse transcription reaction in the presence of DNase I in a reaction composition in which DNase I does not act-3
  • the amount of cDNA synthesis obtained by the cDNA synthesis method of the present invention was compared with the amount of cDNA synthesis obtained by a conventional cDNA synthesis method in which DNase I was thermally inactivated after degradation of DNA in a sample by DNase I.
  • 200 U PrimeScript® RTase (Takara Bio Inc.), 20 U RNase Inhibitor (Takara Bio Inc.), 50 pmol Oligo dT primer, 100 pmol Random 6mers, 100 mM Tris-HCl (pH 8.3) 10 ⁇ L of a solution containing 1 mL of KCl, 12 mM MgCl 2 , and 1 mM dNTP was mixed. That is, the above solution containing reverse transcriptase was added to the mixed solution after DNase treatment and DNase heat inactivation treatment to obtain a composition having a standard reverse transcription reaction solution composition. Next, after performing reverse transcription reaction at 37 ° C. for 15 minutes, reverse transcriptase was inactivated at 85 ° C. for 5 seconds.
  • the amount of cDNA synthesis after the reverse transcription reaction was evaluated by real-time PCR using the Rsp18 gene region as a target sequence.
  • SYBR Premix ExTaq Perfect Real Time, Takara Bio Inc.
  • Primers consisting of the nucleic acid sequence were used.
  • Table 6 shows the results of real-time PCR.
  • the Ct value in the case of using as a template the cDNA obtained by the conventional cDNA synthesis method in which DNase I is thermally inactivated after the DNA degradation in the sample is the real-time RT-PCR according to the method of the present invention.
  • a delay of about 2 cycles is recognized. This is considered to be caused by the degradation of RNA used as a template for cDNA synthesis upon heat inactivation of DNaseI.
  • This example demonstrates the usefulness of the cDNA synthesis method of the present invention that does not require DNase I heat inactivation.
  • Example 7 Decomposition of genomic DNA in the method of the present invention Decomposition of DNA in a sample by carrying out the cDNA synthesis method of the present invention was confirmed by the following method.
  • the remaining amount of mouse genomic DNA after the reaction was evaluated by real-time PCR of 40 cycles using the Rsp18 gene region as a target sequence.
  • SYBR Premix ExTaq Perfect Real Time, Takara Bio Inc.
  • SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was used for real-time PCR, and as a primer pair, a primer composed of the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and SEQ ID NO: 2 described in the sequence listing Primers consisting of the nucleic acid sequence were used.
  • the Ct value in the case of using the mixed solution not containing DNase I was 22.68, whereas in the case of using the mixed solution containing DNase I, no amplification product could be confirmed. From this result, it was confirmed that the cDNA synthesis method of the present invention can avoid the generation of amplification products derived from DNA mixed in the sample.
  • Example 8 Efficiency of cDNA synthesis by the method of the present invention The efficiency of cDNA synthesis by the method of the present invention was compared with the efficiency of cDNA synthesis by a method in which DNase I and reverse transcriptase were allowed to act simultaneously.
  • RNA As a template, genomic DNA was removed according to the standard protocol of total RNA extraction kit NucleoSpin (registered trademark) RNA II (Machalai Nagel), and the purified mouse liver total RNA solution was serially diluted from 2 ⁇ g / ⁇ L to 20 pg / ⁇ L. We used what we did.
  • NucleoSpin registered trademark
  • RNA II Machalai Nagel
  • the cDNA synthesis method and kit of the present invention are widely useful in the field of genetic engineering.
  • SEQ ID NO: 1 Primer to amplify the cDNA fragment of mouse Rsp18 gene.
  • SEQ ID NO: 2 Primer to amplify the cDNA fragment of mouse Rsp18 gene.

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Abstract

　ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中のＤＮＡをエンドデオキシリボヌクレアーゼにより分解し処理試料とした後、エンドデオキシリボヌクレアーゼの熱失活又はエンドデオキシリボヌクレアーゼの除去を行うことなく、当該処理試料及び逆転写酵素を含有し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写反応を行うことを特徴とする、ｃＤＮＡの合成方法。本発明のｃＤＮＡ合成方法及びキットは、広く遺伝子工学の分野に有用である。

Description

ｃＤＮＡの合成方法
　本発明は、ｃＤＮＡの合成に有用な方法及びｃＤＮＡの合成に有用なキットに関する。
　生命現象を解明するためには、様々な遺伝子のｍＲＮＡ分子の解析が非常に重要である。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、すなわち逆転写酵素の発見により、ＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成する逆転写反応が可能となり、ｍＲＮＡ分子の解析法は長足の進歩を遂げ、逆転写酵素を用いたｍＲＮＡ分子の解析法は現在、遺伝子に関する研究において必須の実験法となっている。逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲ法はＲＴ－ＰＣＲ法と呼ばれている。ＲＴ－ＰＣＲ法はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡのクローニングやｃＤＮＡライブラリーの作製に利用されるほか、特定のＲＮＡの発現状態を調べる方法としても有用である。
　しかし、ｃＤＮＡ合成に使用される試料中にＤＮＡが混在する場合には、ＲＮＡをコードしているＤＮＡ上の領域や偽遺伝子が増幅されることがあるため、ＲＮＡを鋳型として合成されたＤＮＡのみを選択的に取得することが難しくなる。試料中に混在したＤＮＡ由来の増幅産物の生成を防ぐために、逆転写反応時にヌクレオチドアナログとＴｍ値を低下させる化合物とを用いる方法（特許文献１）や、試料中のＤＮＡをデオキシリボヌクレアーゼＩ（以下、ＤＮａｓｅＩと称することがある）等のエンドデオキシリボヌクレアーゼ（以下、エンドＤＮａｓｅと称することがある）により分解した後に逆転写反応を行う方法等が採用されている。
　試料中のＤＮＡをＤＮａｓｅＩにより分解した後に逆転写反応を行う場合、ｃＤＮＡの分解を防ぐため、熱処理やフェノール／クロロホルム抽出等によりＤＮａｓｅＩを逆転写反応前に不活化又は除去するのが一般的である。しかしながら、フェノール／クロロホルム抽出は煩雑であり、また、ＤＮａｓｅＩの反応に必須な２価の金属イオンはその存在下での熱処理によりＲＮＡの加水分解を引き起こすことが知られている。ＤＮａｓｅＩと逆転写酵素とを同時に作用させる方法も提案されている（特許文献２、３）が、ＤＮａｓｅＩはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のＤＮＡをも分解するため、この方法で逆転写反応により合成されたｃＤＮＡはＤＮａｓｅＩによって分解を受ける。
国際公開第９９／０９２１３号パンフレット 特開２００５－３０４３９６号公報 国際公開第２００６／１０３０３９号パンフレット
　本発明が解決しようとする課題は、試料中に混在するＤＮＡ由来の増幅産物の生成を簡便に防ぐことが可能なｃＤＮＡ合成方法を提供することにある。
　本発明者らは、エンドＤＮａｓｅが活性を示さず、かつ逆転写酵素が活性を示す反応液組成を調製可能であることを見出し、さらにこの知見に基づいて上記の課題を解決可能なｃＤＮＡの合成方法及びｃＤＮＡ合成用キットに関する本発明を完成させた。
　即ち、本発明は、
［１］　ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中のＤＮＡをエンドデオキシリボヌクレアーゼにより分解し処理試料とした後、エンドデオキシリボヌクレアーゼの熱失活又はエンドデオキシリボヌクレアーゼの除去を行うことなく、当該処理試料及び逆転写酵素を含有し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写反応を行うことを特徴とする、ｃＤＮＡの合成方法、
［２］　（ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料ならびにエンドデオキシリボヌクレアーゼを含む組成物を得る工程、（ｂ）エンドデオキシリボヌクレアーゼが試料中のＤＮＡを分解するのに十分な条件で、工程（ａ）で得られた組成物を処理する工程、及び（ｃ）工程（ｂ）で処理された組成物に添加剤と逆転写酵素を加えてエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写酵素による逆転写反応を行う工程を含む、［１］に記載の方法、
［３］　エンドデオキシリボヌクレアーゼがデオキシリボヌクレアーゼＩである、［１］に記載の方法、
［４］　逆転写酵素がモロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素である、［１］に記載の方法、
［５］　添加剤が、還元剤、一価カチオン及びその塩からなる群より選択された少なくとも１種である、［２］に記載の方法、
［６］　一価カチオンがアンモニウムイオンである、［５］に記載の方法、
［７］　ｃＤＮＡの増幅方法であって、［１］～［６］いずれかに記載の方法により合成されたｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅反応を行う工程を含む方法、並びに
［８］　（Ａ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ、（Ｂ）緩衝剤、（Ｃ）逆転写酵素、及び（Ｄ）逆転写酵素が活性を示し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない逆転写反応用の組成物を調製するための添加剤を含む、［１］～［７］いずれかに記載の方法のためのキット
に関する。
　本発明により、試料中に混在するＤＮＡ由来の増幅産物の生成を防ぐことが可能で、かつ操作性や定量性等に優れたｃＤＮＡの合成が可能となる。
図１は、実施例２におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 図２は、実施例８におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
　本発明のｃＤＮＡ合成方法は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中のＤＮＡをエンドデオキシリボヌクレアーゼにより分解し処理試料とした後、エンドデオキシリボヌクレアーゼの熱失活又はエンドデオキシリボヌクレアーゼの除去を行うことなく、当該処理試料及び逆転写酵素を含有し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写反応を行うことを特徴とする。
　従来、試料中のＤＮＡをエンドＤＮａｓｅにより分解した後に逆転写反応を行う方法では、逆転写反応前にエンドＤＮａｓｅを熱失活するかエンドＤＮａｓｅを除去する必要があったが、本発明の方法ではこれらの操作は必要ない。すなわち、本発明によればエンドＤＮａｓｅによる試料中のＤＮＡの分解と逆転写反応の間に、６０℃以上の熱処理又は特定成分の分離操作を実施する必要はない。よって、本明細書において、「エンドデオキシリボヌクレアーゼ（エンドＤＮａｓｅ）の熱失活」とはエンドＤＮａｓｅを含む試料を６０℃以上で熱処理することを、「エンドデオキシリボヌクレアーゼ（エンドＤＮａｓｅ）の除去」とはエンドＤＮａｓｅを含む試料からエンドＤＮａｓｅを分離することを示し、「エンドデオキシリボヌクレアーゼの熱失活又はエンドデオキシリボヌクレアーゼの除去を行うことなく」とは前記のような操作を実施しないことである。
　本発明を特に限定するものではないが、本発明の方法に用いる試料としては、ＲＮＡを含む試料であればよく、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料が挙げられる。具体的には、細胞、組織、血液のような生体由来試料、これを公知の方法で処理することによって得られる核酸含有試料、食品、土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が例示される。生体由来試料を公知の方法で処理する事によって得られる核酸含有試料の例としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の全ＲＮＡ、あるいは特定のＲＮＡ分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が挙げられ、それらの中にＤＮＡが混在する試料であってもよい。
　本明細書においてエンドデオキシリボヌクレアーゼ（エンドＤＮａｓｅ）とは、ＤＮＡ鎖をエンド型に切断する酵素のことをいう。本発明に使用されるエンドＤＮａｓｅとしては二本鎖ＤＮＡ特異的エンドＤＮａｓｅが好適に例示され、例えばＤＮａｓｅＩやＳｈｒｉｍｐ　ＤＮａｓｅ等の配列非特異的エンドヌクレアーゼや制限酵素等の配列特異的エンドヌクレアーゼがより好適に例示される。
　試料中のＤＮＡをエンドＤＮａｓｅにより分解した処理試料としては、試料中のＤＮＡがエンドＤＮａｓｅにより分解されるような条件下に保持した試料であれば特に限定はなく、当業者であれば使用するエンドＤＮａｓｅや試料に応じて適宜調製することができる。本発明を特に限定する物ではないが、エンドＤＮａｓｅとしてＤＮａｓｅＩを用いる場合、保持する条件としては、好ましくは２０℃～４５℃で１０秒～１２時間、より好ましくは２５℃～４４℃で３０秒～１時間、さらに好ましくは３０℃～４３℃で１分～３０分の条件が例示される。
　本発明に使用される逆転写酵素は、逆転写活性、すなわちＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有する酵素であればよく、例えばモロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ由来逆転写酵素）やトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ由来逆転写酵素）等のウイルス由来の逆転写酵素、好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ　ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の逆転写酵素、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌由来の逆転写活性とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ等）が例示される。本発明には、ウイルス由来の逆転写酵素が好適に使用され、ＭＭＬＶ由来逆転写酵素がより好適に使用される。また、逆転写酵素は天然由来酵素又は組換体酵素のいずれも本発明に使用でき、逆転写活性を有する範囲で天然由来のアミノ酸配列に改変が施された逆転写酵素も本発明に使用できる。
　本明細書において「エンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液」とは、「エンドデオキシリボヌクレアーゼがＤＮＡ分解活性を示さない反応液」であり、例えば、当該反応液に４０μｇ／ｍＬの子牛胸腺ＤＮＡを含有させ、これを製品に表示の力価で８Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社）の存在下で２５℃、１０分間保持しても２６０ｎｍの吸光度が実質的に変化しない反応液のことを言う。
　当該処理試料及び逆転写酵素を含有し、かつエンドＤＮａｓｅが活性を示さない反応液は、例えばエンドＤＮａｓｅによる試料中のＤＮＡの分解を行った後の反応液に、エンドＤＮａｓｅがＤＮＡ分解活性を示さない組成となるように添加剤、逆転写酵素、その他の成分を加えることによって調製できる。すなわち、（ａ）試料及びエンドデオキシリボヌクレアーゼを含む組成物を得る工程、（ｂ）エンドデオキシリボヌクレアーゼが試料中のＤＮＡを分解するのに十分な条件で工程（ａ）により得られた組成物を処理する工程、ならびに（ｃ）工程（ｂ）で処理された組成物に添加剤と逆転写酵素を加えてエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写反応を行う工程を含む方法は、本発明の方法の好適な態様の一つである。
　上記の工程（ａ）における試料及びエンドデオキシリボヌクレアーゼを含む組成物には、さらにＴｒｉｓ－ＨＣｌ等の緩衝剤、マグネシウムイオンやマンガンイオン等の２価の金属イオン、及びジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、以下、ＤＴＴと称することがある）等の還元剤が含まれることが好ましい。緩衝剤、２価の金属イオン、及び還元剤の種類や濃度は、次の工程（ｂ）においてエンドＤＮａｓｅが試料中のＤＮＡを分解する活性を示す範囲内で、エンドＤＮａｓｅの反応特性や安定性等の酵素学的性質、あるいは実験に基づいて適宜選択可能であり、エンドＤＮａｓｅが高い活性を示し、かつ高い安定性を示すように設定することが好ましい。例えば、緩衝剤の種類や濃度は、その添加によりエンドＤＮａｓｅの至適ｐＨ付近に設定すればよく、例えば、エンドＤＮａｓｅとしてＤＮａｓｅＩを用いる場合、ｐＨ５～１０に反応液のｐＨを調整することが可能なものが好ましい。また、還元剤の種類や濃度は、エンドＤＮａｓｅが高い安定性を示すように設定すればよく、例えば、エンドＤＮａｓｅとしてＤＮａｓｅＩを用いる場合、１ｍＭ以上５ｍＭ未満のＤＴＴを組成物中に含有させることが好ましい。
　前記の工程（ｂ）におけるエンドデオキシリボヌクレアーゼが試料中のＤＮＡを分解するのに十分な条件は、後の逆転写反応やその後の核酸増幅反応において、試料中のＤＮＡ由来の産物が実質的に確認できなくなるようにＤＮＡの分解が行なわれる温度や時間の条件であれば特に限定はなく、当業者であれば使用するエンドＤＮａｓｅや試料に応じて適宜設定することができる。本発明を特に限定する物ではないが、エンドＤＮａｓｅとしてＤＮａｓｅＩを用いる場合、２０℃～４５℃で１０秒～１２時間の条件が好適に例示され、２５℃～４４℃で３０秒～１時間の条件がより好適に例示され、３０℃～４３℃で１分～３０分の条件がさらにより好適に例示される。
　前記の工程（ｃ）における添加剤としては、還元剤、一価のカチオン及びその塩からなる群より選択される少なくとも１種が例示される。添加剤は、例えば当該添加剤を含む水溶液、好ましくは当該添加剤を含む緩衝液の形状として本発明に使用することができる。上記の緩衝液に使用する緩衝剤の種類や濃度は、反応液を所望のｐＨにできるものであれば特に限定はないが、その添加により逆転写反応に使用する逆転写酵素の至適ｐＨ付近に反応液のｐＨを変化させることが可能なものが好ましい。上記の緩衝剤としては、本発明を特に限定するものではないが、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ等のグッドバッファーが例示される。上記の還元剤としては、例えばＤＴＴ等のチオール還元剤や２－メルカプトエタノールが例示される。また、上記の一価のカチオンとしては、アンモニウムイオン、並びにカリウムイオン、リチウムイオン、及びナトリウムイオン等のアルカリ金属イオン等が例示され、これらの塩、例えば硫酸アンモニウムや塩化カリウムを用いてもよい。還元剤や一価カチオン又はその塩の種類や使用量は、添加剤を添加した組成物においてエンドＤＮａｓｅが活性を示さず、かつ逆転写酵素が有効に機能する組成となるようなものであれば特に限定はなく、当業者であれば本明細書の開示に基づいて適宜決定することができる。特に本発明を限定するものではないが、エンドＤＮａｓｅが活性を示さず、かつ逆転写酵素が有効に機能する組成物に含まれる成分としては、例えばエンドＤＮａｓｅがＤＮａｓｅＩの場合、硫酸アンモニウム、ＤＴＴ及び塩化カリウムが例示される。硫酸アンモニウムの組成物中の濃度としては、５ｍＭ以上が好適に例示され、１０ｍＭ～３０ｍＭがより好適に例示され、１４ｍＭ～２８ｍＭがさらに好適に例示される。また、ＤＴＴの濃度としては、５ｍＭ以上が好適に例示され、１１ｍＭ～３０ｍＭがより好適に例示され、１２ｍＭ～２０ｍＭがさらに好適に例示される。また、塩化カリウムの濃度としては、１ｍＭ以上が好適に例示され、３ｍＭ～３０ｍＭがより好適に例示され、５ｍＭ～２０ｍＭがさらに好適に例示される。具体的には、組成物中の最終濃度として、好ましくは５ｍＭ以上の硫酸アンモニウム、５ｍＭ以上のＤＴＴ、及び１ｍＭ以上の塩化カリウムを含むよう、より好ましくは１０ｍＭ～３０ｍＭの硫酸アンモニウム、１１ｍＭ～３０ｍＭのＤＴＴ、及び３ｍＭ～３０ｍＭの塩化カリウムを含むよう、さらに好ましくは１４ｍＭ～２８ｍＭの硫酸アンモニウム、１１ｍＭ～３０ｍＭのＤＴＴ、及び５ｍＭ～２０ｍＭの塩化カリウムを含むよう、さらに好ましくは１４ｍＭ～２８ｍＭの硫酸アンモニウム、１２ｍＭ～２０ｍＭのＤＴＴ、及び５ｍＭ～２０ｍＭの塩化カリウムを含むよう、前記添加剤を配合する。
　また、上記の添加剤は、逆転写酵素、緩衝剤、オリゴヌクレオチドプライマー及びｄＮＴＰ等の逆転写反応に必要な成分と混合した逆転写反応液調製用の緩衝液として本発明に使用することができる。操作性と逆転写酵素の安定性を考慮すれば、逆転写酵素以外の逆転写反応に必要な成分はこの緩衝液に含有させ、逆転写酵素のみを別途加える態様が好適である。
　逆転写反応の条件は、鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー伸長鎖を合成するために十分な条件であれば特に限定はない。鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー伸長鎖を合成するために十分な条件とは、特に限定するものではないが、温度条件としては２５～６０℃が好適であり、３０～５０℃がより好適である。また、反応時間としては、５～１２０分が好適であり、１５～６０分がより好適である。また、逆転写反応後に、逆転写酵素が不活化する条件で反応液をインキュベートしてもよい。逆転写酵素を不活化する条件としては、例えば８５℃で５秒間の条件が例示される。
　本発明のｃＤＮＡの増幅方法は、本発明のｃＤＮＡの合成方法により合成されたｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅反応を行う工程を含む。ｃＤＮＡを鋳型とした核酸の増幅にはＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法等の当分野で周知の遺伝子増幅法が利用できる。例えば核酸の増幅にＰＣＲ法を用いる場合、一般的なＰＣＲの条件が適用でき、例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、又は「シャトルＰＣＲ」［『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質核酸  酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁～４２８頁（１９９６）］と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリング及び伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応により実施される。ＰＣＲ法としては、インターカレーティング色素やＦＲＥＴ標識プローブ等を用いて核酸の増幅をモニタリング可能なリアルタイムＰＣＲも利用できる。
　本発明のキットは、本発明のｃＤＮＡの合成方法又は本発明のｃＤＮＡの増幅方法に使用するためのキットであり、（Ａ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ、（Ｂ）緩衝剤、（Ｃ）逆転写酵素、及び（Ｄ）逆転写酵素が活性を示し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない逆転写反応用の組成物を調製するための添加剤を含む。上記（Ｂ）の緩衝剤には、エンドＤＮａｓｅの反応に必要な２価の金属イオン等が含まれていてもよい。また、（Ｄ）の添加剤には、逆転写酵素による逆転写反応に必要な、オリゴヌクレオチドプライマーやｄＮＴＰが含まれていてもよい。
　以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１　エンドＤＮａｓｅ活性を抑制する反応組成の探索－１
　５ＵのＤＮａｓｅＩ〔Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ）、タカラバイオ社〕、２００ｎｇのマウスゲノムＤＮＡ、及び表１に記載の成分を含有する２０μＬの反応液を５種類（反応液１～５）調製した。また、ＤＮａｓｅＩを含まない以外は上記と同様の組成の反応液２０μＬを５種類調製した。なお、反応液１は、各成分がＤＮａｓｅＩの標準的な反応液組成の半分の濃度となるように設定しており、反応液２は逆転写酵素の至適ｐＨ近辺のｐＨとなりかつ逆転写酵素の基質となるｄＮＴＰを含むように設定している。これらの反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、８５℃で５秒間インキュベートした。次に、Ｒｓｐ１８遺伝子領域を標的配列としたリアルタイムＰＣＲにより、各反応液中に残存するゲノムＤＮＡの量を定量した。なお、リアルタイムＰＣＲには、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ、タカラバイオ社）を用い、プライマー対としては、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるプライマー及び配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるプライマーを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　リアルタイムＰＣＲによるゲノムＤＮＡの定量結果、及び各反応液組成におけるゲノムＤＮＡの分解の抑制率を表２に示す。表２に示すように反応液中のゲノムＤＮＡが完全に分解される反応液１に対し、ＫＣｌや（ＮＨ４）２ＳＯ４を添加した反応液やＤＴＴの濃度を高めた反応液３～５では、ＤＮＡ分解の抑制効果が認められた。特に、（ＮＨ４）２ＳＯ４を添加した反応液４やＤＴＴの濃度を高めた反応液５では、高いＤＮＡ分解の抑制効果が認められた。なお、分解の抑制率は、以下の式より算出した。
　　　抑制率（％）＝ＤＮａｓｅＩを含む反応液のＤＮＡ量／ＤＮａｓｅＩを含まない反応液のＤＮＡ量×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例２　エンドＤＮａｓｅ活性を抑制する反応組成の探索－２
　エンドＤＮａｓｅ活性を完全に抑制する反応組成を構築するために、５ＵのＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社）、２００ｎｇのマウスゲノムＤＮＡ、及び表３に示す成分を含有する反応液２０μＬを６種類（反応液１～６）調製した。また、ＤＮａｓｅＩを含まない以外は同様の組成の反応液２０μＬを６種類調製した。これらの反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、８５℃で５秒間インキュベートした。次に、各反応液をアガロースゲル電気泳動に供することにより、マウスゲノムＤＮＡのＤＮａｓｅＩによる分解を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　電気泳動結果を図１に示す。図１に示すように、反応液１及び２の組成においてはＤＮａｓｅＩの作用によりゲノムＤＮＡのバンドは完全に消失した。一方、反応液３及び４の組成においては、ＤＮａｓｅＩ存在下でもゲノムＤＮＡのバンドは完全には消失せずスメア状の泳動像が確認できた。このことから、反応液３及び４ではＤＮａｓｅＩ活性が抑制されていることが確認できた。また、その抑制の程度は反応液４の方が大きいことから、（ＮＨ４）２ＳＯ４は濃度依存的にＤＮａｓｅＩの活性を抑制することが確認できた。さらに、反応液５及び６の組成においては、ゲノムＤＮＡのバンドはＤＮａｓｅＩ存在下でも全く変化しないことから、これらの反応液では完全にＤＮａｓｅＩ活性が抑制されていることが確認できた。このことから、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４の添加やＤＴＴ濃度を高めること以外に、Ｍｇ濃度を調整することによってＤＮａｓｅＩ活性をさらに抑制できることが示された。以上の結果から、例えば、反応液１の組成でＤＮａｓｅＩによるＤＮＡの分解を行った後、終濃度が反応液５あるいは６の組成になるように別途調製した添加剤を添加することでＤＮａｓｅＩが作用しない別の酵素反応が可能となることが示唆された。
実施例３　ＤＮａｓｅ活性の確認
　ＤＮａｓｅＩによるゲノムＤＮＡの分解が確認された実施例２の表３の反応液２に記載の成分を有する反応液とゲノムＤＮＡの分解が確認されなかった実施例２の表３の反応液５に記載の組成を有する反応液について、これらの反応液中でのＤＮａｓｅＩのＤＮａｓｅ活性を測定した。なお、以下に示すＤＮａｓｅの活性単位は、子牛胸腺ＤＮＡを基質として反応液のＯＤ２６０の吸光度を１分間に０．００１増加させる酵素量を１Ｕとしている。
　まず、表３の反応液２又は５に記載の成分、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社、製品に表示の力価＝５Ｕ／μＬ）の６０倍希釈溶液を１００μＬ、及び４０μｇの子牛胸腺ＤＮＡを含有する計１ｍＬの溶液を調製し、これを２５℃で１０分間保持しながら１分毎に吸光度（ＯＤ２６０）を測定した。その結果、表３の反応液２に記載の成分を有する反応液では、希釈前のＤＮａｓｅＩ（製品に表示の力価＝５Ｕ／μＬ）１μＬ当たり３９Ｕの活性が認められたのに対し、表３の反応液５に記載の組成においては吸光度の変化は認めらなかった。
　次に、表３の反応液５に記載の成分、ＤＮａｓｅＩ（５Ｕ／μＬ）を５０μＬ、及び４０μｇの子牛胸腺ＤＮＡを含有する１ｍＬの溶液を２５℃で１０分間保持しながら１分毎に吸光度（ＯＤ２６０）を測定した。その結果、表３の反応液５に記載の成分を有する反応液においては吸光度の変化は認められなかった。
　以上の通り、表３の反応液２に記載の成分を有する反応液においては製品の表示力価比べ約８倍の活性を示すのに対し、表３の反応液５に記載の成分を有する反応液においては、表３の反応液２に記載の成分を有する反応液における活性測定時の３０倍のＤＮａｓｅＩを用いても活性は検出限界以下であった。このことから、表３の反応液５に記載の成分を有する反応液では、ＤＮａｓｅＩの活性が完全に抑制されていることが確認できた。
実施例４　ＤＮａｓｅＩが作用しない反応組成におけるＤＮａｓｅＩ存在下の逆転写反応－１
　実施例２の表３の反応液５に記載の成分を有する反応液及び実施例２の表３の反応液６に記載の成分を有する反応液において、逆転写酵素による逆転写反応を行った場合に反応液中のＤＮａｓｅＩがｃＤＮＡ合成に及ぼす影響について、以下の方法で検証した。
　２μｇ／μＬから２０ｐｇ／μＬの段階希釈したマウス肝臓全ＲＮＡ溶液１μＬ、１０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、表３の反応液２に記載の成分、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含有する計１０μＬの混合液を調製した。また、ＤＮａｓｅＩを含まない以外は上記と同様の組成の混合液１０μＬも調製した。これらの混合液を４２℃で２分間インキュベートした後、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒと１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰ、２８ｍＭ又は５６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む溶液をそれぞれ１０μＬずつ添加混合した。すなわち、ＤＮａｓｅ処理後の混合液に逆転写酵素を含む上記溶液を添加し、逆転写酵素、ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅ阻害剤及びプライマー以外の終濃度を表３の反応液５に記載の成分又は表３の反応液６に記載の成分とした。次に、３７℃で１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃で５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。逆転写反応後のｃＤＮＡ合成量は、Ｒｓｐ１８遺伝子領域を標的配列としたリアルタイムＰＣＲにより評価した。なお、リアルタイムＰＣＲには、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ、タカラバイオ社）を用い、プライマー対としては、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるプライマー及び配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるプライマーを用いた。
　リアルタイムＰＣＲの結果を表４に示す。表４に示されるように、ＤＮａｓｅＩの有無ではＣｔ値に差がなかった。この結果から、表３の反応液５に記載の成分を有する反応液及び表３の反応液６に記載の成分を有する反応液において、逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成にＤＮａｓｅＩが影響を及ぼさないことが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例５　ＤＮａｓｅＩが作用しない反応組成におけるＤＮａｓｅＩ存在下の逆転写反応－２
　ＤＮａｓｅＩが作用しない反応組成におけるＤＮａｓｅＩ存在下の逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成量を、ＤＮａｓｅＩを含有しない標準的な逆転写反応組成によるｃＤＮＡ合成量と比較した。
　２μｇ／μＬから２０ｐｇ／μＬの段階希釈したマウス肝臓全ＲＮＡ溶液１μＬ、実施例２の表３の反応液２に記載の成分、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含有する計１０μＬの混合液を調製した。この混合液を４２℃で２分間インキュベートした後、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒと１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰ、２８ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む溶液を１０μＬ添加混合した。すなわち、ＤＮａｓｅ処理後の混合液に逆転写酵素を含む上記溶液を添加し、逆転写酵素、ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅ阻害剤及びプライマー以外の終濃度を実施例２の表３の反応液５に記載のものとした。次に、３７℃で１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃で５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。
　一方、ＤＮａｓｅＩを含有しない標準的な逆転写反応組成は、２μｇ／μＬから２０ｐｇ／μＬの段階希釈したマウス肝臓全ＲＮＡ溶液１μＬ、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏｄＴ　ｐｒｉｍｅｒ、及び１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、及び３ｍＭのＭｇＣｌ２を含む計１０μＬの反応液とした。この反応液を用いて３７℃で１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃で５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。
　逆転写反応後のｃＤＮＡ合成量は、Ｒｓｐ１８遺伝子領域を標的配列としたリアルタイムＰＣＲにより評価した。なお、リアルタイムＰＣＲには、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ、タカラバイオ社）を用い、プライマー対としては、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるプライマー及び配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるプライマーを用いた。
　リアルタイムＰＣＲの結果を表５に示す。表５に示されるように、本発明の方法によるリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより得られたＣｔ値と従来の標準的なリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより得られたＣｔ値とがほぼ一致した。これにより本発明の方法は、ＤＮａｓｅＩによるｃＤＮＡ合成産物の分解を完全に抑制しながら、効率良く逆転写反応を行うことが可能であることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例６　ＤＮａｓｅＩが作用しない反応組成におけるＤＮａｓｅＩ存在下の逆転写反応－３
　本発明のｃＤＮＡ合成方法により得られるｃＤＮＡ合成量を、試料中のＤＮＡのＤＮａｓｅＩによる分解の後にＤＮａｓｅＩを熱失活させる従来のｃＤＮＡ合成方法により得られるｃＤＮＡ合成量と比較した。
　２μｇ／μＬから２０ｐｇ／μＬの段階希釈したマウス肝臓全ＲＮＡ溶液１μＬ、実施例２の表３の反応液２に記載の成分、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含有する計１０μＬの混合液を調製した。この混合液を４２℃で２分間インキュベートした後、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒと１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰ、２８ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む溶液を１０μＬ添加混合した。すなわち、ＤＮａｓｅ処理後の混合液に逆転写酵素を含む上記溶液を添加し、逆転写酵素、ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅ阻害剤及びプライマー以外の終濃度を実施例２の表３の反応液５に記載のものとした。次に、３７℃で１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃で５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。
　一方、ＤＮａｓｅＩを熱失活させる従来のｃＤＮＡ合成方法では、２μｇ／μＬから２０ｐｇ／μＬの段階希釈したマウス肝臓全ＲＮＡ溶液１μＬ、実施例２の表３の反応液１に記載の成分、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含有する計１０μＬの混合液を調製し、これを４２℃で２分間インキュベートした後に９５℃で１０分間インキュベートし、ＤＮａｓｅＩを熱失活させた。ここに、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒ、１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓ、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３００ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのｄＮＴＰを含む溶液を１０μＬ添加混合した。すなわち、ＤＮａｓｅ処理、ＤＮａｓｅ熱失活処理後の混合液に逆転写酵素を含む上記溶液を添加し、標準的な逆転写反応液組成を有する組成物とした。次に、３７℃で１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃で５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。
　逆転写反応後のｃＤＮＡ合成量は、Ｒｓｐ１８遺伝子領域を標的配列としたリアルタイムＰＣＲにより評価した。なお、リアルタイムＰＣＲには、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ、タカラバイオ社）を用い、プライマー対としては、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるプライマー及び配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるプライマーを用いた。
　リアルタイムＰＣＲの結果を表６に示す。表６に示されるように、試料中のＤＮＡ分解の後にＤＮａｓｅＩを熱失活させる従来のｃＤＮＡ合成方法で得られたｃＤＮＡを鋳型とした場合のＣｔ値は、本発明の方法によるリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより得られたＣｔ値と比較して２サイクル程度の遅れが認められる。これは、ＤＮａｓｅＩの熱失活の際にｃＤＮＡ合成の鋳型となるＲＮＡが分解したことが原因と考えられる。本実施例により、ＤＮａｓｅＩの熱失活の必要がない本発明のｃＤＮＡ合成方法の有用性が示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例７　本発明の方法におけるゲノムＤＮＡの分解
　本発明のｃＤＮＡの合成方法を実施することによる試料中のＤＮＡの分解を下記の方法により確認した。
　まず、２００ｎｇ／μＬのマウスゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、１０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、表３の反応液２に記載の成分、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含有する計１０μＬの混合液を調製した。また、ＤＮａｓｅＩを含まない以外は上記と同様の組成の混合液１０μＬも調製した。これらの混合液を４２℃で２分間インキュベートした後、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒと１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰ、２８ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む溶液をそれぞれ１０μＬずつ添加混合した。すなわち、ＤＮａｓｅ処理後の混合液に上記溶液を添加し、ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅ阻害剤及びプライマー以外の終濃度を表３の反応液５に記載の成分とした。次に、３７℃で１５分間、８５℃で５秒間の反応を行った。反応後のマウスゲノムＤＮＡの残存量は、Ｒｓｐ１８遺伝子領域を標的配列とした４０　ｃｙｃｌｅｓのリアルタイムＰＣＲにより評価した。なお、リアルタイムＰＣＲには、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ、タカラバイオ社）を用い、プライマー対としては、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるプライマー及び配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるプライマーを用いた。
　リアルタイムＰＣＲの結果、ＤＮａｓｅＩを含まない混合液を用いた場合のＣｔ値が２２．６８であったのに対して、ＤＮａｓｅＩを含む混合液を用いた場合は増幅産物が一切確認できなかった。この結果から、本発明のｃＤＮＡの合成方法では、試料中に混在するＤＮＡに由来する増幅産物の生成を避けられることを確認した。
実施例８　本発明の方法によるｃＤＮＡ合成の効率
　本発明の方法によるｃＤＮＡ合成の効率を、ＤＮａｓｅＩと逆転写酵素とを同時に作用させる方法によるｃＤＮＡ合成の効率と比較した。
（１）鋳型ＲＮＡ
　鋳型としては、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出キット　ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ　ＩＩ（マッハライ・ナーゲル社）の標準プロトコルに従ってゲノムＤＮＡが除去され、精製されたマウス肝臓全ＲＮＡ溶液を２μｇ／μＬから２０ｐｇ／μＬに段階希釈したものを使用した。
（２）ＤＮａｓｅＩと逆転写酵素とを同時に作用させる方法によるｃＤＮＡ合成
　上記鋳型ＲＮＡ溶液を１μＬ、実施例２の表３の反応液１に記載の成分、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒ、１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓ、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含む計２０μＬの混合液を、鋳型ＲＮＡの濃度がそれぞれ異なる計６種類について調製した。また、鋳型ＲＮＡ溶液の代わりに滅菌蒸留水１μＬを添加した混合液も調製した。対照として、ＤＮａｓｅＩを含まない以外は上記と同様の組成の混合液２０μＬも調製した。こうして調製した各混合液について３７℃、１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃、５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。
（３）本発明の方法によるｃＤＮＡ合成
　上記（１）に記載の鋳型ＲＮＡ溶液を１μＬ、実施例２の表３の反応液２に記載の成分、及び５ＵのＤＮａｓｅＩを含有する計１０μＬの混合液を、鋳型ＲＮＡの濃度がそれぞれ異なる計６種類について調製した。また、鋳型ＲＮＡ溶液の代わりに滅菌蒸留水１μＬを添加した混合液も調製した。対照として、ＤＮａｓｅＩを含まない以外は上記と同様の組成の混合液１０μＬも調製した。こうして調製した混合液を４２℃で２分間インキュベートした後、２００ＵのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）　ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）、２０ＵのＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社）、５０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒと１００ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰ、２８ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む溶液を１０μＬ添加混合した。すなわち、ＤＮａｓｅ処理後の混合液に逆転写酵素を含む上記溶液を添加し、逆転写酵素、ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅ阻害剤及びプライマー以外の終濃度を実施例２の表３の反応液５に記載のものとした（反応液最終容量２０μＬ）。次に、３７℃で１５分間の条件で逆転写反応を行った後、８５℃で５秒間の条件で逆転写酵素を失活させた。
（４）リアルタイムＰＣＲによるｃＤＮＡ合成量の評価
　上記（２）、（３）により得られたｃＤＮＡの合成量を、Ｒｓｐ１８遺伝子領域を標的配列としたリアルタイムＰＣＲにより評価した。なお、リアルタイムＰＣＲには、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ、タカラバイオ社）を用い、プライマー対としては、配列表の配列番号１に記載の核酸配列からなるプライマー及び配列表の配列番号２に記載の核酸配列からなるプライマーを用いた。リアルタイムＰＣＲの結果を表７及び図２に示す。表７及び図２中「（３）」は上記（３）により得られたｃＤＮＡの合成量をリアルタイムＰＣＲにより評価した結果を、「（２）」は上記（２）により得られたｃＤＮＡの合成量をリアルタイムＰＣＲにより評価した結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７及び図２に示す通り、ＤＮａｓｅＩと逆転写酵素とを同時に作用させる方法、即ち、（２）方法のＤＮａｓｅ（＋）では、ＤＮａｓｅによってｃＤＮＡ合成量が低下し、Ｃｔ値が大きくなった。この原因としては、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡのＤＮａｓｅによる分解が挙げられる。一方、本発明の方法では、ＤＮａｓｅによるｃＤＮＡ合成への影響は認められなかった。
　本発明のｃＤＮＡ合成方法及びキットは、広く遺伝子工学の分野に有用である。
SEQ ID NO:1 ; Primer to amplify the cDNA fragment of mouse Rsp18 gene.
SEQ ID NO:2 ; Primer to amplify the cDNA fragment of mouse Rsp18 gene.

Claims (8)

  1. 　ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料中のＤＮＡをエンドデオキシリボヌクレアーゼにより分解し処理試料とした後、エンドデオキシリボヌクレアーゼの熱失活又はエンドデオキシリボヌクレアーゼの除去を行うことなく、当該処理試料及び逆転写酵素を含有し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写反応を行うことを特徴とする、ｃＤＮＡの合成方法。
  2. 　下記工程（ａ）～（ｃ）：
    （ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡを含む試料ならびにエンドデオキシリボヌクレアーゼを含む組成物を得る工程；
    （ｂ）エンドデオキシリボヌクレアーゼが試料中のＤＮＡを分解するのに十分な条件で、工程（ａ）で得られた組成物を処理する工程；及び
    （ｃ）工程（ｂ）で処理された組成物に添加剤と逆転写酵素を加えてエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない反応液を調製し、逆転写酵素による逆転写反応を行う工程
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　エンドデオキシリボヌクレアーゼがデオキシリボヌクレアーゼＩである、請求項１に記載の方法。
  4. 　逆転写酵素がモロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素である、請求項１に記載の方法。
  5. 　添加剤が、還元剤、一価カチオン及びその塩からなる群より選択された少なくとも１種である、請求項２に記載の方法。
  6. 　一価カチオンがアンモニウムイオンである、請求項５に記載の方法。
  7. 　ｃＤＮＡの増幅方法であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法により合成されたｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅反応を行う工程を含む方法。
  8. 　下記（Ａ）～（Ｄ）：
    （Ａ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ、
    （Ｂ）緩衝剤、
    （Ｃ）逆転写酵素、及び
    （Ｄ）逆転写酵素が活性を示し、かつエンドデオキシリボヌクレアーゼが活性を示さない逆転写反応用の組成物を調製するための添加剤
    を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法のためのキット。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111733213A (zh) * 2019-03-25 2020-10-02 天根生化科技（北京）有限公司 反转录反应液及制备cDNA的方法
CN110229809A (zh) * 2019-06-20 2019-09-13 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种Rochel反转录试剂及其制备方法
WO2021231706A1 (en) * 2020-05-13 2021-11-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for rapid testing for a target nucleic acid including viral nucleic acid

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999009213A1 (fr) 1997-08-14 1999-02-25 Takara Shuzo Co., Ltd. Methodes d'amplification d'adn et materiels afferents
JP2005304396A (ja) 2004-04-22 2005-11-04 Toyobo Co Ltd 偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、およびそれを用いたリボ核酸の増幅方法
WO2006103039A1 (de) 2005-04-01 2006-10-05 Qiagen Gmbh Reverse transkription und amplifikation von rna bei simultaner degradierung von dna

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7264932B2 (en) * 1999-09-24 2007-09-04 Applera Corporation Nuclease inhibitor cocktail
US20050053940A1 (en) * 2001-11-21 2005-03-10 Joh-E Ikeda Huntington's disease gene transcriptional factors
US20060223073A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-05 Boyes Barry E Methods of using a DNase I-like enzyme
EP1863908B1 (de) 2005-04-01 2010-11-17 Qiagen GmbH Reverse transkription und amplifikation von rna bei simultaner degradierung von dna
JP5073967B2 (ja) * 2006-05-30 2012-11-14 株式会社日立製作所 単一細胞の遺伝子発現定量方法
GB2474225A (en) * 2009-07-21 2011-04-13 Biotec Pharmacon Asa DNase for decontamination of reverse transcription and amplification reactions

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999009213A1 (fr) 1997-08-14 1999-02-25 Takara Shuzo Co., Ltd. Methodes d'amplification d'adn et materiels afferents
JP2005304396A (ja) 2004-04-22 2005-11-04 Toyobo Co Ltd 偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、およびそれを用いたリボ核酸の増幅方法
WO2006103039A1 (de) 2005-04-01 2006-10-05 Qiagen Gmbh Reverse transkription und amplifikation von rna bei simultaner degradierung von dna
JP2008533997A (ja) * 2005-04-01 2008-08-28 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｄｎａの同時分解を伴う逆転写及びｒｎａの増幅

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN J.Y. ET AL.: "Use of bacterially- expressed antigen for detection of antibodies to the EBV-specific deoxyribonuclease in sera from patients with nasopharyngeal carcinoma", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, vol. 45, 1993, pages 49 - 66, XP023624750 *
SILKIE S.S. ET AL.: "Reagent decontamination to eliminate false-positives in Escherichia coli qPCR", JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS, vol. 72, 2008, pages 275 - 282, XP022507103 *
TANPAKUSHITSU KAKUSAN KOSO, PROTEINS, NUCLEIC ACIDS AND ENZYMES, vol. 41, no. 5, 1996, pages 425 - 428

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